CN103773744A - 一种黄斑蓝子鱼l-氨基酸氧化酶在毕赤酵母的表达方法及其应用 - Google Patents

一种黄斑蓝子鱼l-氨基酸氧化酶在毕赤酵母的表达方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103773744A
CN103773744A CN201410073275.8A CN201410073275A CN103773744A CN 103773744 A CN103773744 A CN 103773744A CN 201410073275 A CN201410073275 A CN 201410073275A CN 103773744 A CN103773744 A CN 103773744A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
acid oxidase
yellow spot
expression
spot fish
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410073275.8A
Other languages
English (en)
Inventor
黎睿君
李安兴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sun Yat Sen University
National Sun Yat Sen University
Original Assignee
National Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Sun Yat Sen University filed Critical National Sun Yat Sen University
Priority to CN201410073275.8A priority Critical patent/CN103773744A/zh
Publication of CN103773744A publication Critical patent/CN103773744A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/03—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C12Y104/03002—L-Amino-acid oxidase (1.4.3.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

本发明公开了一种毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法，它采用基因重组技术将黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因克隆到表达载体上，构建成表达重组质粒，并转化进入毕赤酵母，组建成表达工程菌，经发酵和表达上清浓缩，获得由毕赤酵母表达的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液，该粗酶液对鱼类革兰氏阳性病原菌(无乳链球菌)和革兰氏阴性病原菌(温和气单胞杆菌)具有抑菌作用，可用于后续抗菌制剂的开发。

Description

一种黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶在毕赤酵母的表达方法及其应用
技术领域
本发明属于生物防治技术领域，具体涉及基因重组技术，指采用基因重组技术将黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的基因克隆到表达载体上，构建表达重组质粒，并转化入毕赤酵母，组建表达工程菌。经发酵、表达上清浓缩，获得由毕赤酵母表达的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液，该粗酶液对鱼类革兰氏阳性病原菌(无乳链球菌)和革兰氏阴性病原菌(温和气单胞杆菌)具有抑菌作用。
背景技术
在之前的研究中，我们从黄斑蓝子鱼血清中分离纯化了一种抗微生物活性蛋白，通过对该活性蛋白N端测序，质谱测序分析，设计兼并引物进行PCR，利用RACE技术最终获得了该活性蛋白基因全长序列，并确认该活性蛋白是一种黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶(发明专利号：ZL201010577872.6)。
L-氨基酸氧化酶(LAAO)是一种以FAD或FMN为辅基的黄素蛋白酶，在有氧条件下，能催化L-氨基酸的氧化脱氨反应，产生相应的α-酮酸、氨和H2O2。LAAO在生物体内(如细菌、真菌、藻类、动植物体)有广泛的分布并可参与L-氨基酸的代谢过程。该酶在细胞凋亡、细胞毒性、浮肿、溶血、出血、血小板凝集、杀寄生虫和抗微生物等方面都具有活性。该蛋白家族中的蛇毒L-氨基酸氧化酶(SV-LAAO)在蝰科、响尾蛇科及眼镜蛇科中具有广泛分布，并因其含量高、酶活性强、易于纯化，成为该类酶中研究最多的一类。
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和温和气单胞杆菌(Aeromonas sobria)分别为养殖鱼类常见并具有代表性的革兰氏阳性病原菌和革兰氏阴性病原菌。近年来，由于我国水产养殖的超负荷发展，养殖环境的恶化，鱼类细菌病已经成为大范围、经常性爆发的一类疾病，给我国渔业造成了非常严重的危害，抗生素和违禁药品的大量使用，这给食品安全造成严重威胁，因此开发新型药物迫在眉睫。
发明内容
本发明提供一种黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶在毕赤酵母的表达方法，具体如下(见实施例一)和通过该方法诱导表达的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液的应用(见实施例二)。
本发明是以黄斑蓝子鱼脾脏总cDNA为模板，通过PCR技术获得带有限制性酶切位点(Xho I、Not I)，α-factor信号肽核苷酸序列，翻译起始密码子ATG以及切除信号肽的黄斑蓝子鱼LAAO基因的核苷酸序列，将该黄斑蓝子鱼LAAO基因的核苷酸序列克隆到pMD18-T载体上，进行DNA序列测定，然后从pMD18-T载体上切下，克隆到表达载体pPICZαA上，建成表达重组质粒pPICZαA-LAAO，将此构建的黄斑蓝子鱼LAAO重组质粒转入宿主菌毕赤酵母GS115内，组成工程菌，通过诱导工程菌发酵、发酵液浓缩，获得诱导表达的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液(见实施例一)。
本发明提供的方法制备的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液，通过实验证明，对鱼类革兰氏阳性病原菌(无乳链球菌)和革兰氏阴性病原菌(温和气单胞杆菌)具有抑菌作用(见实施例二)。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
附图说明：
图1.黄斑蓝子鱼LAAO基因DNA片段制备的PCR扩增引物。
A：正向引物；B：反向引物。
图2.PCR检测酵母工程菌基因组插入LAAO基因电泳图(1：酵母工程菌基因组提取电泳图；2：LAAO基因特异引物PCR结果电泳图)。
M：DNA maker；1，3：转入pPICZαA载体的毕赤酵母工程菌；2，4：转入
pPICZαA-LAAO载体的毕赤酵母工程菌。
图3.表达产物Western Blotting检测(1：SDS-PAGE电泳图；2：Western blotting杂交分析)。
M：蛋白Maker；1：毕赤酵母菌株诱导表达上清浓缩产物；2：转入pPICZαA
载体的毕赤酵母工程菌诱导表达上清浓缩产物；3：转入pPICZαA-LAAO载体的毕赤酵母工程菌诱导表达上清浓缩产物。
图4.黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶毕赤酵母表达粗酶液的琼脂孔穴平板扩散抑菌结果(1：温和气单胞杆菌；2：无乳链球菌)。
A：转入pPICZαA载体的毕赤酵母工程菌诱导表达上清浓缩产物；B：转入pPICZαA-LAAO载体的毕赤酵母工程菌诱导表达上清浓缩产物；C：氟苯尼考；D：PBS。
具体实施方式
实施例一：黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶在毕赤酵母的表达方法
1.材料
(1)T4DNA Ligase，高保真酶PrimeSTARTM HS DNA Polymerase，PrimixTaq，限制性内切酶Xho I和Not I购自Takara公司。
(2)菌株与质粒：DH5、Pichiapastori GS115菌株为本实验室保存，pMD18-T载体购自Takara公司，pPICZαA表达载体购自Invitrogen公司。
(3)试剂盒：重组质粒DNA的小量抽提试剂盒购自北京天根公司，PCR产物回收试剂盒购自Takara公司，E.Z.N.ATM Gel Extraction kit购自OMEGA公司，NBT显色试剂盒购自北京中杉金桥公司。
(4)试剂：TEMED、Zeocin购自Invitrogen公司，SDS-PAGE分子量标准购自MBI Fermentas公司，2×Loading buffer购自北京普博欣公司，碱性磷酶标记的山羊抗小鼠酶标二抗购自北京中杉金桥公司，抗黄斑蓝子鱼LAAO小鼠多克隆抗体为本实验室制备。
(5)PCR扩增引物合成和DNA序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成。
2.方法
(1)黄斑蓝子鱼LAAO基因DNA片段制备
A.根据黄斑蓝子鱼LAAO成熟肽基因序列和载体pPICZαA的多克隆位点设计1对扩增引物(见图1)，上游引物中引入Xho I限制性酶切位点，α-factor信号肽和翻译起始密码子ATG，下游引物中引入Not I限制性酶切位点和6个组氨酸序列，以黄斑蓝子鱼脾脏总cDNA为模板，扩增LAAO成熟肽基因序列，采用的高保真酶PrimeSTARTMHS DNA Polymerase扩增体系和反应体系如下：
PCR扩增体系
PCR反应体系
Figure BSA0000101539650000042
B.将PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的DNA片段，使用OMEGA公司E.Z.N.ATMGel Extraction kit胶回收试剂盒进行纯化，方法参见该试剂盒说明书。
(2)表达载体pPICZαA-LAAO的构建及工程菌组建
A.分别以两种限制性内切酶Xho I、Not I对成熟肽基因序列和pPICZαA序列进行双酶切，37℃处理过夜，双酶切体系如下：
Figure BSA0000101539650000051
B.使用T4DNA Ligase，在灭菌的0.5mL EP管中，将经双酶切的DNA insert及pPICZαA的胶回收产物进行连接，反应条件为16℃水浴过夜，反应体系如下：
Figure BSA0000101539650000052
C.将5μL连接产物加入到100-200μL，E.coli感受态细胞DH5α中，轻轻旋转离心管混匀内容物，冰上静置30min；42℃水浴热激转化90s，立即于冰上放置5min；每管加入500μL，LB培养基(室温放置)，37℃，160-180rpm振荡培养45-60min；在含有Zeocin的选择性平板上加入100μL菌液，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀；将培养皿正放，37℃培养60min后，倒置平板继续培养10-16h，将通过双酶切及菌液PCR筛选的阳性克隆，进行测序，将测序鉴定正确的质粒经过Sal I酶切线性化，电转化至Pichiapastoris GS115酵母感受态细胞，将菌液涂布到含有300μg/mL Zeocin的YPDS平板上，28℃倒置培养2-3d，获得重组转化子；组建成黄斑蓝子鱼LAAO重组蛋白的表达工程菌。
D.将黄斑蓝子鱼LAAO重组蛋白的表达工程菌提取酵母基因组，用LAAO基因特异引物(laao F，laao R)进行PCR，扩增体系和反应体系如下：
PCR扩增体系
Figure BSA0000101539650000053
PCR反应体系
Figure BSA0000101539650000061
(3)黄斑蓝子鱼LAAO重组蛋白表达工程菌的发酵
取鉴定正确的新鲜重组菌落接种于25mL BMGY(pH6.0)培养基中，28℃，250r/min培养48h，至OD600为2-6，于室温2000r/min离心5min，收集菌体；将菌体转移至200mL BMMY培养基中，28℃，250r/min培养，每隔24h补加一次为培养基体积0.5％的甲醇，诱导表达72h。
(4)黄斑蓝子鱼LAAO重组蛋白表达工程菌诱导表达的上清液浓缩
在冰浴下，将工程菌的发酵上清液加入80％硫酸铵，用磁力搅拌器缓慢搅拌10-30min，于4℃10000r/min，离心30min，弃去上清，将沉淀悬浮于2倍沉淀物体积的缓冲液中，通过透析除盐，获得黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液。
(5)黄斑蓝子鱼LAAO重组蛋白的检测
将制备的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液进行SDS-PAGE电泳，将电泳结束的胶片小心剥下，放置于转移装置中，100mA恒流转膜1h，转膜结束后，将NC膜转移至封闭液(10％脱脂奶粉，溶剂为TBS/T)，4℃振摇过夜。用TBS/T振摇漂洗NC膜3次，加入经稀释1000倍的I抗(抗黄斑蓝子鱼LAAO小鼠多克隆抗体)，室温脱色摇床孵育2h；TBS/T振摇漂洗NC膜3次，每次15min。加入经稀释2000倍的II抗，室温脱色摇床孵育2h；TBS/T振摇漂洗NC膜3次，每次15min。将NC膜置于配制好的NBT溶液中，轻轻摇动，显色10-15min，用ddH2O漂洗终止显色反应；最后将NC膜转移至PBS溶液中，拍照。
3.结果
(1)PCR检测酵母基因组LAAO基因插入
将黄斑蓝子鱼LAAO重组蛋白的表达工程菌提取酵母基因组，用LAAO基因特异引物(laao F，laao R)进行PCR，得到约1600bp大小的目的片段，与LAAO基因大小一致(见图2)
(2)Western Blotting检测表达产物
表达产物经SDS-PAGE转移至NC膜上进行Western Blotting检测，检测结果在分子量72kD处的电泳蛋白条带被小鼠抗黄斑蓝子鱼LAAO多克隆抗体所反应，证明表达产物是黄斑蓝子鱼LAAO重组蛋白。(见图3)
实施例二：黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶毕赤酵母表达的粗酶液对无乳链球菌和温和气单胞杆菌的抑菌作用
1.方法
吸取培养好的菌液30μl加入到含有100ml经融解并冷却至45-50℃的BHI固体培养基的锥形瓶中，使菌液终浓度为1×105CFU/ml，迅速振荡摇匀，使菌体均匀分散，随即倒入直径为90mm×90mm的一次性培养皿中，凝固后用直径为0.532cm的打孔器在平板上均匀打孔。孔中各加入30μl诱导表达的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液。置于28℃温箱中培养24-48h。实验同时用50μg/ml氟苯尼考抗生素作为阳性对照，用转入空载体的毕赤酵母诱导表达上清浓缩产物作为阴性对照。
2.结果
黄斑蓝子鱼的L-氨基酸氧化酶毕赤酵母表达粗酶液对养殖鱼类代表性革兰氏阳性病原菌一无乳链球菌和革兰氏阴性病原菌一温和气单胞杆菌均具有抑菌活性(见图4)。

Claims (7)

1.一种利用毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于工艺步骤为：
(1)根据黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因的ORF核苷酸序列和表达载体pPICZαA的核苷酸序列设计引物；
(2)通过PCR技术获得带有限制性酶切位点和切除信号肽的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因的核苷酸序列；
(3)将上述获得的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因的核苷酸序列克隆到pMD18-T载体上，进行DNA序列测定，然后从pMD18-T载体上切下，克隆到表达载体pPICZαA上，建成表达重组质粒pPICZαA-LAAO；
(4)将构建重组质粒pPICZαA-LAAO，经过Sal I酶切线性化，电转化至Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，将菌液涂布到含有300μg/mLZeocin的YPDS平板上，28℃倒置培养2-3d，获得重组转化子；
(5)提取转化子基因组，通过特异PCR的方法鉴定获得已经正确插入目的基因的重组子；
(6)接种鉴定验证正确的重组转化子于25mL BMGY(pH6.0)培养基中，28℃，250r/min培养48h，至OD600为2-6，于室温离心2000r/min，5min，收集菌体；将菌体转移至200mL BMMY培养基中，28℃，250r/min培养，每隔24h补加一次为培养基体积0.5％的甲醇，诱导表达24-96h；
(7)所得上清液即为表达的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液。
2.根据权利要求1所述一种利用毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于表达载体pPICZαA含有α-factor核苷酸序列，Zeocin抗性基因的核苷酸序列，AOX1TT基因的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述一种利用毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于采用PCR技术制备黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的DNA序列的5’端带有Xho I限制性核酸内切酶对应酶切的核苷酸序列，α-factor信号肽对应的核苷酸序列和翻译起始密码子ATG核苷酸序列，3’端带有Not I限制性核酸内切酶对应酶切的核苷酸序列和6个组氨酸对应的核苷酸序列；将黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的DNA序列亚克隆到pMD18-T载体上，经过转化、提取质粒、酶切鉴定、DNA测序，将正确的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶DNA片段经Xho I和Not I限制性核酸内切酶消化，从pMD18-T载体上切下，同时将表达载体pPICZoA按同样的方式酶切，按一定方式拼接构建重组表达载体pPICZαA-LAAO。
4.根据权利要求1所述一种利用毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于重组表达载体pPICZαA-LAAO转化进入毕赤酵母GS115受体菌中组成黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶重组蛋白表达工程菌，所得工程菌发酵培养。
5.根据权利要求1所述一种利用毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于诱导表达时间为72h。
6.根据权利要求1所述一种利用毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法，其特征在于诱导表达的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液经过80％饱和硫酸铵浓缩。
7.一种权利如要求1所述的一种利用毕赤酵母表达黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的方法制备的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶粗酶液在制备抗无乳链球菌和温和气单胞杆菌的制剂中的应用。
CN201410073275.8A 2014-02-27 2014-02-27 一种黄斑蓝子鱼l-氨基酸氧化酶在毕赤酵母的表达方法及其应用 Pending CN103773744A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410073275.8A CN103773744A (zh) 2014-02-27 2014-02-27 一种黄斑蓝子鱼l-氨基酸氧化酶在毕赤酵母的表达方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410073275.8A CN103773744A (zh) 2014-02-27 2014-02-27 一种黄斑蓝子鱼l-氨基酸氧化酶在毕赤酵母的表达方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103773744A true CN103773744A (zh) 2014-05-07

Family

ID=50566511

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410073275.8A Pending CN103773744A (zh) 2014-02-27 2014-02-27 一种黄斑蓝子鱼l-氨基酸氧化酶在毕赤酵母的表达方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103773744A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107602686A (zh) * 2017-11-03 2018-01-19 宁波大学 一种对革兰氏阳性菌具有抗性的多肽

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994025574A1 (en) * 1993-04-30 1994-11-10 Novo Nordisk A/S L-amino acid oxidase
CN1834237A (zh) * 2006-04-10 2006-09-20 中国农业大学 β－甘露聚糖酶及其表达方法与专用工程菌
CN102121020A (zh) * 2010-12-07 2011-07-13 中山大学 一种黄斑蓝子鱼l-氨基酸氧化酶的基因全序列及其用途
CN102168080A (zh) * 2010-12-15 2011-08-31 广东省农业科学院作物研究所 一种绿色木霉碱性蛋白酶及其真核表达方法与应用
CN103031290A (zh) * 2012-12-14 2013-04-10 南京林业大学 一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4及其表达基因和应用
CN103320405A (zh) * 2013-05-27 2013-09-25 中山大学 一种黄斑蓝子鱼l-氨基酸氧化酶重组蛋白的制备方法及其用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994025574A1 (en) * 1993-04-30 1994-11-10 Novo Nordisk A/S L-amino acid oxidase
CN1834237A (zh) * 2006-04-10 2006-09-20 中国农业大学 β－甘露聚糖酶及其表达方法与专用工程菌
CN102121020A (zh) * 2010-12-07 2011-07-13 中山大学 一种黄斑蓝子鱼l-氨基酸氧化酶的基因全序列及其用途
CN102168080A (zh) * 2010-12-15 2011-08-31 广东省农业科学院作物研究所 一种绿色木霉碱性蛋白酶及其真核表达方法与应用
CN103031290A (zh) * 2012-12-14 2013-04-10 南京林业大学 一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶Bgl4及其表达基因和应用
CN103320405A (zh) * 2013-05-27 2013-09-25 中山大学 一种黄斑蓝子鱼l-氨基酸氧化酶重组蛋白的制备方法及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FANGHUA WANG等: "The serum of rabbitfish (Siganus oramin) has antimicrobial activity to some pathogenic organisms and a novel serum L-amino acid oxidase is isolated", 《FISH & SHELLFISH IMMUNOLOGY》, 17 February 2011 (2011-02-17) *
闫晓梅等: "江浙蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒的抑菌作用及其抑菌组分L-氨基酸氧化酶的分离纯化", 《实验生物学报》, vol. 33, no. 4, 31 December 2000 (2000-12-31) *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107602686A (zh) * 2017-11-03 2018-01-19 宁波大学 一种对革兰氏阳性菌具有抗性的多肽
CN107602686B (zh) * 2017-11-03 2020-09-15 宁波大学 一种对革兰氏阳性菌具有抗性的多肽

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105238722B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其菌粉制剂的制备方法和应用
CN106148455B (zh) 一种诱导剂及其应用
CN106957805B (zh) 一种具有抑菌效果的芽孢杆菌GBacillus-9菌株及其分离方法和应用
CN103789317A (zh) 拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因克隆及编码蛋白重组和用途
CN103450355B (zh) 重组牛alpha干扰素及其应用
CN105859863B (zh) 凡纳滨对虾抗菌肽-CrustinB基因及其重组蛋白的制备与应用
CN103773744A (zh) 一种黄斑蓝子鱼l-氨基酸氧化酶在毕赤酵母的表达方法及其应用
CN102676568A (zh) 一种生产重组粉尘螨变应原Der f1和Der f2融合蛋白的方法
Ji et al. Cloning, expression, invasion, and immunological reactivity of a mammalian cell entry protein encoded by the mce1 operon of Nocardia farcinica
CN104212779B (zh) 一种新型核糖核酸酶a及其纯化生产工艺
CN104232643B (zh) RNAi干扰片段、干扰载体、制备方法及其应用
CN107136302A (zh) 可增重和降低料肉比的水禽饲养用生物复方制剂及制备方法
CN104403968B (zh) 一种坚强芽孢杆菌gy‑49及其筛选方法和应用
CN108041319B (zh) 一种含鸡α干扰素复合益生菌剂及其制备方法
CN1904036B (zh) 基因工程菌混合培养生产三种人α防御素的方法
CN105779354A (zh) 一种大肠杆菌培养基
CN102604993A (zh) 免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法
CN113621055B (zh) 一种抗菌和抗病毒的猪血红蛋白β链C端片段、表达该片段的枯草芽孢杆菌、制剂以及应用
CN115747075A (zh) 一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻构建方法
CN103468769B (zh) 含硒重组人血白蛋白的制备方法
CN105713908A (zh) 一种重组家蚕葛佬素及其制备方法和用途
CN113430220A (zh) 一种表达可溶性猫ω干扰素的基因工程菌合成方法、构建方法及应用
CN102286530A (zh) 一步法引入外源基因的四膜虫表达载体及构建方法和应用
CN101402954A (zh) 一种用毕赤嗜甲醇酵母表达重组猪乳铁蛋白n叶的方法
CN107893059B (zh) 一种罗非鱼抗病免疫基因重组蛋白的制备与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140507