CN1594581A - 一种基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法。通过人工合成人脑利钠肽BNP活性部位32个氨基酸编码区相对应的基因与经突变改造的CMP-3-脱氧-D-甘露一辛酮糖酸合成酶基因3′端融合,中间含肠激酶识别切割位点,该融合基因克隆至甲酵营养型酵母Pichia表达载体获得该融合基因高效表达的工程酵母菌株,该工程菌经发酵后提取层析纯化制备融合蛋白,再经肠激酶切割后分离纯化获得重组人脑利钠肽。该重组肽经体外试验表明具备人脑利钠肽BNP生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域,具体地说是一种重组技术制备人脑利钠肽的方法。
背景技术
心脑血管疾病是世界公认的人类健康的“第一杀手”。在我国每年所有死亡人数中心脑血管疾病死亡占20%左右。心脑血管疾病种类繁多,其中心力衰竭是许多心脏疾病的终结阶段。
心力衰竭是一组临床上较为常见的心血管综合症,是多数器质性心脏病人几乎不可避免的结局。高血压性心脏病、冠心病、心肌梗塞、风湿性心脏病、肺源性心脏病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、心肌炎、心动过速心肌病、糖尿病性心肌病、甲亢性心脏病、酒精性心肌病、克山病、先天性心脏病等心血管疾病,发展到一定阶段,均可出现心力衰竭。
心力衰竭具有较高的死亡率,和恶性肿瘤相近。研究表明心衰的2年死亡率达20%,5年死亡率达40%,重度心衰的死亡率更高。更为严峻的是心衰不仅死亡率高,而且发病率也远远高于恶性肿瘤。据WHO测算全世界心衰发病率将近2%。在美国有470万慢性心衰患者,并且每年有55万新诊断的心衰患者。美国每年用于治疗心衰的费用达到210亿美元,包括158亿美元的住院治疗费用。这一疾病的医药开支费用远远超过所有恶性肿瘤治疗费用的总和。我国心衰患者目前已达到500万人以上。随着我国人口老年化和高血压、高血脂、糖尿病和冠心病等患者的人数不断增加,在未来五年我国心衰患者将达到700万人以上。
在我国临床上治疗心力衰竭的药物有强心剂、利尿剂、扩张血管剂、血管紧张素酶抑制剂、肾上腺素阻滞剂等几大类药物。但存在剂量不稳定、毒副作用大等缺点。因此开发一种效果优良、剂量稳定、毒副作用小的新药是非常迫切和必要的。
鉴于充血性心力衰竭是严重威胁人类健康及生命的疾病之一,美国FDA于2001年批准了SCIOS公司基因工程重组人脑利钠肽(BNP)上市,用于治疗急性充血性心衰。人脑利钠肽(BNP,human brainnatriuretic peptide)是人体的一种内源性激素,活性部位含32个氨基酸,其序列为Ser Pro Lys Met Val Glu Gly Ser Gly Cys Phe GlyArg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys ValLeu Arg Arg His,内含一对二硫键。SCIOS公司是通过大肠杆菌基因重组表达生产的,每支含1.5毫克,分子量为3464,商品名为Natrecor。BNP具有显著的疗效和很大的市场潜力。SCIOS公司的BNP上市后的第二年(2002年)就销售了1亿七百三十万美元。
人脑利钠肽(BNP)在1988年首先由Sudoh从猪脑组织中分离出来,是内源性利钠肽家族的重要成员之一,主要由心脏分泌,其中60%-80%来自于心室肌细胞,具有利钠、利尿、扩张血管和抑制肾素、醛固酮分泌等作用。人脑利钠肽的主要作用与血管和肾脏的血流动力学平衡有关。大量的国内外临床试验结果表明,人脑利钠肽并不直接增强心肌收缩力,它主要通过降低外周血管阻力,降低心脏前后负荷,通过利钠、利尿作用降低体液负荷,提高心排血量,综合改善心脏功能,并且在体内能抑制血液中肾上腺素-血管紧张素系统的激活,同时也抑制了由于血管扩张效应引起的反射性心率增加,避免心率失常的发生。因此,人脑利钠肽在综合改善心肌作用的同时,不增加心肌耗氧,也不存在许多化学药物的不良反应。
Scios公司生产人脑利钠肽采用的是大肠杆菌基因表达的技术。大肠杆菌基因表达容易形成包涵体,其空间结构杂乱无章,没有生物学活性,必须经体外变性、复性分离而得到有活性产物。一方面,大肠杆菌表达分离的产物残留热原往往会引起发热等副反应,另一方面,包涵体体外变性、复性分离得到的重组蛋白由于构象折叠很难完全恢复到天然结构并且有变性剂等苛刻分离条件的使用会引起一些氨基酸细微结构的变化从而影响药品的疗效和副反应。
我们所采用的酵母真核基因工程表达可溶性、具有生物活性的人脑利钠肽,在技术上避免了大肠杆菌原核表达易形成包涵体的缺点,具有生产过程简单、回收率高、生产成本低的优点,同时避免了大肠杆菌内毒素热原的污染、克服了大肠杆菌包涵体的变复性过程对目的蛋白活性的影响等缺点。国内外尚没有正式报道用酵母真核基因工程表达具有生物活性的人脑利钠肽。
发明内容
本发明的目的就是为了克服目前人脑利钠肽的大肠杆菌重组表达生产工艺复杂、回收率低、成本高等缺点,提供了一种新型基因工程技术制备人脑利钠肽的方法。
本发明采用了CKS突变体融合表达技术。CKS为CMP-3-脱氧D-甘露-辛酮酸合成酶(CTP:CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonatecytidylyltransferase简称CKS),仅见于革兰氏阴性细菌,由Kds B基因编码,CKS基因编码248个氨基酸。将CKS基因克隆在带Lac启动子和合成核糖体结合位点的载体上,在大肠杆菌中可得到高达细胞总量70%的表达量,在高表达状态20小时后,蛋白仍然稳定,且在此高表达水平下,蛋白不形成包涵体并均匀分布于整个胞质,也不影响宿主细胞的生长,是目前基因工程中获得的表达量最高的蛋白之一。
1990年Bolling首次采用CKS(去样3’端30nt)为N端融合伴侣,构建了带lac启动子和合成核糖体结合位点的表达载体,CKS与外源蛋白之间用Asp-Pro连接,便于酸解去除CKS,以此载体高效地表达了许多基因,如HIV-1 gp120-41,HIV-2 gp36,HSVI I gE2,tPA,HCVc33c等,并且表达CKS融合蛋白可作为有效的免疫检测用抗原。国内外尚没有报将CKS用作融合伴侣在酵母中表达。本发明申请人于2004年3月10日向中国国家知识产权局申请的发明专利《一种基因工程重组技术制备HIV融合抑制肽的方法》(申请号为200410026438.3)也采用了此项发明技术。
本发明在国内外首次将CKS突变体(CKS C端最后一个Met突变为Thr,计算机分析表明突变后C端亲水性增加有利于融合表达)用作融合伴侣在甲醇营养型酵母Pichia中进行融合表达,获得高稳定高表达的工程酵母菌株。甲醇营养型酵母Pichia表达系统具有一些特殊的优点,如(1)应用Aox启动子,转录效率高,易于诱导调控;(2)表达的目的基因易于整合到染色体上,不易丢失,适于高密度发酵,产量高;(3)具备真核生物翻译加工的能力等等。
本发明提供了一种基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法。本发明采用酵母真核重组基因工程技术,较之大肠杆菌原核基因工程的技术,生产过程缩短,生产工艺更简单,成本大大降低。
本发明包括以下步骤:通过人工合成BNP活性区的32个氨基酸编码区相对应的基因(序列附后)与经突变改造的CMP-3-脱氧-D-甘露一辛酮糖酸合成酶基因3′端融合,中间含肠激酶识别切割位点,该融合基因克隆至酵母表达载体获得该融合基因高效表达的工程酵母菌株,该工程菌经发酵后提取层析纯化制备融合蛋白,再经肠激酶切割后分离纯化获得重组人脑利钠肽。
上述重组人脑利钠肽体外试验表明具备人脑利钠肽(BNP)生物活性。
具体实施方式
本发明的内容,通过以下的实施例作具体说明:
实施例1:
CKSmut/BNP融合基因的构建
以下实验方法参照金冬雁等译《分子克隆实验指南》(1995年,科学出版社)。CKS基因由深圳大学生命科学学院微生物基因工程实验室按genebank序列从E.coli K12菌株中克隆,经序列分析与Genebank报道的E.coli K12株Kds B基因序列一致。通过定点突变将CKS C端最后一个Met密码子ATG突变为Thr密码子ATC,获得CKSmut基因。选择BNP活性部位32个氨基酸编码区如下:
Ser Pro Lys Met Val Glu Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys MetAsp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg ArgHis
根据酵母常见密码子合成该段编码区基因。再将CKSmut和BNP活性部位人工合成基因用重叠PCR将两者连接,其5’端添加6His-tag,3’端添加终止密码TAG,中间添加肠激酶识别位点的基因,拼接后进行DNA序列分析,其结果如说明书后的SEQ ID NO.1。
实施例2:
CKSmut/BNP融合基因酵母表达的构建及工程酵母菌的筛选
用PCR将上述CKSmut/BNP融合基因5’端添加EcoRI 3’添加NotI位点,克隆至甲醇酵母Pichia分泌表达载体pPIC9 EcoRI-Not I之间,构建甲醇酵母分泌表达载体pPIC CKS/BNP(方法参照金冬雁等译《分子克隆实验指南》1995年,科学出版社)。
参照Faber(1994年)方法进行酵母转化。取GS115单菌落接种于2.0ml YEPD,28-30℃培养过夜后转接于200ml YEPD继续培养5hr,6000g×5min离心收集,菌体悬浮于含25mM DTT的25mM磷酸钠盐缓冲液(pH7.0),置30℃保温15min,离心收菌,以200ml含270mM蔗糖的10mM Tris-Cl(STM,pH7.0)洗涤菌体2次,所获菌体悬于0.5mlSTM后置-20℃保存备用。取60μl上述感受态酵母加进电激杯,加入线性化5-10μl DNA,置冰浴30min后用BioRad电激仪以1.5kv电激转化GS115,转化细胞涂于平皿上,30℃孵箱培养2天,筛选生长的His+阳性克隆子。采用PCR技术鉴定重组子。
将PCR筛选阳性的His+克隆子接种于5ml YPD培养基中,30℃培养至OD 600达4时离心弃上清,细胞沉淀中加入1.5ml YPD培养基中继续培养3天,并于每24h补充甲醇,使其终浓度为0.5%。诱导结束后取1ml菌液离心,细胞沉淀中加入0.2ml含1%蜗牛酶的消化液,37℃消化3h,将菌液离心上清和细胞沉淀消化液分别通过SDS-PAGE电泳检测,筛选出表达量高的菌株。
实施例3:
含CKSmut/BNP融合基因工程酵母菌发酵及产物纯化
生长培养基(g/L):酵母氮源13.4,生物素4×10-4,蛋白胨20,酵母提取物10,pH6.0,发酵培养基(g/L):酵母氮源13.4,生物素4×10-4,蛋白胨20,酵母提取物10,微量元素混合物5ml。
100ml生长培养基装于500ml三角瓶中,接种后在200r/min28℃振荡培养。种子液OD600达到4.0后,再转种进5升自控式发酵罐中进行发酵。发酵罐采用发酵培养基,200-300r/min,28℃培养,以氨水控制pH值在6.0。通过观察溶氧来监测菌体生长情况,控制溶氧在25%之间。溶氧上升则添加2%的甘油,在培养大约48h后停加甘油,让菌体将剩余甘油消耗净,等溶氧上升到75%以后开始添加2%的甲醇诱导外源蛋白的表达,控制溶氧在25%之间。诱导48h之后停加甲醇,待诱导再次上升时表示甲醇已经消耗完全,离心,收获发酵液上清。进行SDS-PAGE分析,发现40KD左右有表达蛋白,约占上清总蛋白的30%,用6His-Tag单抗做免疫印迹试验证明是带6His-Tag表达的融合蛋白SEQ ID NO.2。
发酵液上清离心后,用0.2μm膜过滤后,调pH至8.0用Ni2+-Chelating Big Beads吸附后,用咪唑洗脱后硫酸铵沉淀后,透析至20mM TrisHCl(pH8.0),用牛肠激酶或人肠激酶切割后,过Superdex 30,收集各个峰,进行SDS-PAGE分析,选择4KD左右的多肽。该多肽再经反相HPLC纯化后冻干,总回收率达60%。
实施例4
该多肽经分析鉴定其氨基酸组成与BNP活性部位32个氨基酸序列一致。冻干多肽产品用PBS溶解后做采用离体动脉条测定法做体外活性试验,其测定方法如下:
取兔离体动脉条剪成约1.5cm长、2-3mm宽的螺旋环,悬挂于含10ml通氧的37℃台氏液(取8.0g NaCl、0.2g KCl、0.2g CaCl2、0.05gNaH2PO4、0.1g MgSO4·7H2O、1.0g NaHCO3、1.0g葡萄糖用蒸馏水稀释成1000ml的溶液,置于玻璃或塑料瓶中,调pH值至7.4)的麦氏浴槽中,加1g负荷,稳定1h,期间每20min换1次台氏液。连接多导记录仪,调节灵敏度,记录血管的张力变化。待张力曲线基线稳定后,加入0.05ml去甲肾上腺素溶液于麦氏浴槽中使其终浓度为6.25×10-2mg/ml,曲线升至最高并稳定后,开始按累计浓度给药法[曲线稳定后对倍增加样品浓度为:(6.25×10-4)~(8.0×10-2)RU/ml]加入重组人脑利钠肽对照品,记录血管的张力变化。完成上述给药后,洗脱并稳定1h,期间每20min换1次台氏液。待基线稳定后,按测定对照品的方法测定待测样品,记录测定结果。计算对照品和各实验样品的半效稀释倍数,按下式计算样品效价:样品效价对照品效价×样品半效稀释倍数/对照品半效稀释倍数(RU/ml)。本发明的人脑利钠肽比活性为600RU/mg。
实际上,除本发明的上述实施例2外,含CKSmut与BNP融合蛋白经合适的酶切纯化后,及含有SEQ ID NO.1的DNA序列的任何表达载体经表达、分离、酶切、纯化后,均可用于制备本发明的人脑利钠肽。
核苷酸和氨基酸序列表
<110>深圳大学
<120>一种基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法
<160>2
<210>1
<211>861
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<400>1
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagttttg tggtcattat tcccgcgcgc 60
tacgcgtcca cgcgtctgcc cggtaaacca ttggttgata ttaacggcaa acccatgatt 120
gttcatgttc ttgaacgcgc gcgtgaatca ggtgccgagc gcatcatcgt ggcaaccgat 180
catgaggatg ttgcccgcgc cgttgaagcc gctggcggtg aagtatgtat gacgcgcgcc 240
gatcatcagt caggaacaga acgtctggcg gaagttgtcg aaaaatgcgc attcagcgac 300
gacacggtga tcgttaatgt gcagggtgat gaaccgatga tccctgcgac aatcatccgt 360
caggttgctg ataacctcgc tcagcgtcag gtgggtatgg cgactctggc ggtgccaatc 420
cacaatgcgg aagaagcgtt taacccgaat gcggtgaaag tggttctcga cgctgaaggg 480
tatgcactgt acttctctcg cgccaccatt ccttgggatc gtgatcgttt tgcagaaggc 540
cttgaaaccg ttggcgataa cttcctgcgt catcttggta tttatggcta ccgtgcaggc 600
tttatccgtc gttacgtcaa ctggcagcca agtccgttag aacacatcga aacgttagag 660
cagcttcgtg ttctgtggta cggcgaaaaa atccatgttg ctgttgctca ggaagttcct 720
ggcacaggtg tggatacccc tgaggacgat gatgacaagt ctcctaagat ggttcaaggt 780
agtggttgtt tcggtaggaa gatggatagg atctcttctt cttctggttt gggctgcaag 840
gtcctgagaa gacactagta 861
<210>2
<211>285
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>DOMAIN
<400>2
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Phe Val Val
1 5 10 15
Ile Ile Pro Ala Arg Tyr Ala Ser Thr Arg Leu Pro Gly Lys Pro
20 25 30
Leu Val Asp Ile Asn Gly Prs Pro Met Ile Val His Val Leu Glu
35 40 45
Arg Ala Arg Glu Ser Gly Ala Glu Arg Ile Ile Val Ala Thr Asp
50 55 60
His Glu Asp Val Ala Arg Ala Val Glu Ala Ala Gly Gly Glu Val
65 70 75
Cys Met Thr Arg Ala Asp His Gln Ser Gly Thr Glu Arg Leu Ala
80 85 90
Glu Val Val Glu Lys Cys Ala Phe Ser Asp Asp Thr Val Ile Val
95 100 105
Asn Val Gln Gly Asp Glu Pro Met Ile Pro Ala Thr Ile Ile Arg
110 115 120
Gln Val Ala Asp Asn Leu Ala Gln Arg Gln Val Gly Met Ala Thr
125 130 135
Leu Ala Val Pro Ile His Asn Ala Glu Glu Ala Phe Asn Pro Asn
140 145 150
Ala Val Lys Val Val Leu Asp Ala Glu Gly Tyr Ala Leu Tyr Phe
155 160 165
Ser Arg Ala Thr Ile Pro Trp Asp Asp Asp Ahe Phe Ala Glu Gly
170 175 180
Leu Glu Thr Val Gly Asp Asn Phe Leu Arg His Leu Gly Ile Tyr
185 190 195
Gly Tyr Arg Ala Gly Phe Ile Arg Arg Tyr Val Asn Trp Gln Pro
200 205 210
Ser Pro Leu Glu His Ile Glu Thr Leu Glu Gln Len Arg Val Leu
215 220 225
Trp Tyr Gly Glu Lys Ile His Val Ala Val Ala Gln Glu Val Pro
230 235 240
Gly Thr Gly Val Asp Thr Pro Glu Asp Asp Asp Asp Lys Ser Pro
245 250 255
Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg
260 265 270
Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His
275 280 285
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一种基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法
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275 280 285
Claims (6)
1、一种基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法,包括以下步骤:通过人工合成人脑利钠肽BNP活性部位的32个氨基酸编码区相对应的基因与经突变改造的CMP-3-脱氧-D-甘露一辛酮糖酸合成酶基因3′端融合,中间含肠激酶识别切割位点,该融合基因克隆至酵母表达载体获得该融合基因高效表达的工程酵母菌株,该工程菌经发酵后提取层析纯化制备融合蛋白,再经肠激酶切割后分离纯化获得重组人脑利钠肽。
2、根据权利要求1所述的基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法,其特征在于融合基因序列为SEQ ID NO.1。
3、根据权利要求1所述的基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法,其特征在于突变改造的CMP-3-脱氧-D-甘露-六酮糖酸合成酶CKS,突变位点在于SEQ ID NO.2中的氨基酸序列219位由原甲硫氨酸Met突变为苏氨酸Thr。
4、根据权利要求1所述的基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法,其特征在于融合蛋白为SEQ ID NO.2。
5、根据权利要求1所述的基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法,其特征在于表达载体为含有SEQ ID NO.1序列的表达载体。
6、根据权利要求1或5所述的基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法,其特征在于表达载体为甲酵营养型宿主酵母Pichia。
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2004
- 2004-07-16 CN CN 200410028107 patent/CN1594581A/zh active Pending
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