CN109055464A - 一种生产重组人脑利钠肽的培养基及发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生产重组人脑利钠肽的培养基及发酵工艺，所述培养基按每100mL的体积计算，包括如下质量的组分：酵母提取物1.0g～5.0g，干酪素1.0g～5.0g，氯化钠0.5g～2.0g，甘油0.4g～3.0g；本发明所提供的培养基，可以为重组人脑利钠肽工程菌提供更丰富的碳源和氮源，同时，利用该培养基进行实际生产重组人脑利钠肽时，其表达量可达40％以上，重组人脑利钠肽的产量可达到500mg/L，大大降低了生产成本，具有较大的应用前景和较高经济价值。

Description

一种生产重组人脑利钠肽的培养基及发酵工艺
技术领域
本发明属于发酵工程领域，涉及一种生产重组人脑利钠肽的培养基及发酵工艺。
背景技术
脑利钠肽(BNP)在1988年首先由Sudoh从猪脑组织中分离出来，是内源性利钠肽家庭的重要成员之一，主要由心脏分泌，其中60％～80％来自于心室肌细胞，具有利钠、利尿、扩张血管和抑制肾素固酮分泌等作用。人脑利钠肽的主要作用与血管和肾脏的血流动力学平衡有关。大量的国内外临床试验结果表明，人脑利钠肽并不直接增强心肌收缩力，它主要通过降低外周血管阻力，降低心脏前后负荷，通过利钠、利尿作用降低体液负荷，提高心排血量，综合改善心脏功能，并且在体内能抑制血液中肾上腺素-血管紧张素系统的激活，同时也抑制了由于血管扩张效应引起的反射性心率增加，避免心率失常的发生。因此，人脑利钠肽在综合改善心肌作用的同时，不增加心肌耗氧，也不存在许多化学药物的不良反应。
重组人脑利钠肽是通过基因工程技术制备的一种重组的人脑利钠肽，由32个氨基酸组成，其中10位和26位有一对二硫键相连。
目前在国内和国际上均有部分公司在进行该项目的研究，也有几个重组人脑利钠肽的产品在市场上销售，并且具有不错的市场反馈。但是根据公开资料显示，他们在生产重组人脑利钠肽时均使用传统的大肠杆菌培养基，即LB培养基或是TB培养基。由于该几种培养基均为传统的大肠杆菌的经典培养基，用其作为重组人脑利钠肽的生产培养基则显贫瘠，导致生产过程中菌浓度不高，从而产品重组人脑利钠肽产量不高，其表达量一般为30％以下，产量在200mg/L以下。
CN107177649A公开了一种提高重组人脑利钠肽融合蛋白表达量的发酵工艺，包括以下步骤：在发酵罐中，加入BHD培养基18～20L和甘油65～80mL，以及氨苄青霉素至其终浓度为100mg/L，接种，调节通气量使发酵液中的溶氧量为30％～50％，调节pH值为6.8～7.2，培养温度为37℃；当OD600为10～15时，加入异丙基硫代半乳糖苷至其终浓度为0.5～1.0mmol/L诱导，并向发酵罐内流加150～300mL/h的补料液A，3～6h后停止发酵培养，收获细菌，即可。此方法提供的发酵工艺，提高了rhBNP融合蛋白的表达水平，其表达量高达34.5％～38.3％，具有良好的商业开发价值并取得了商业上的极大成功；但是，此方法提供的发酵工艺，表达量仍需进一步提升。
CN1594581A公开了一种基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法。通过人工合成人脑利钠肽BNP活性部位32个氨基酸编码区相对应的基因与经突变改造的CMP-3-脱氧-D-甘露一辛酮糖酸合成酶基因3'端融合，中间含肠激酶识别切割位点，该融合基因克隆至甲酵营养型酵母Pichia表达载体获得该融合基因高效表达的工程酵母菌株，该工程菌经发酵后提取层析纯化制备融合蛋白，再经肠激酶切割后分离纯化获得重组人脑利钠肽。但是，此方法通过常规的发酵方法制备人脑利钠肽时，产量较低，不利于大规模生产。
CN103923937A公开了一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的方法和应用，包括以下步骤：获得重组基因：获得表达人脑利钠肽重组蛋白的重组基因rhBNP，所述重组基因rhBNP的序列包括5'至3'方向依次排列的纯化标签基因序列、分子伴侣蛋白基因序列、柔性连接肽基因序列、蛋白酶识别位点序列和人脑利钠肽基因序列；获得重组质粒：将上一步获得的重组基因rhBNP插入质粒，获得含有重组基因rhBNP的重组质粒；获得基因工程菌：将上一步获得的重组质粒转化宿主细胞获得基因工程菌；表达外源基因：基因工程菌发酵表达含有重组人脑利钠肽的融合蛋白；纯化目的蛋白：裂解菌体，收集融合蛋白，通过融合蛋白的酶切、纯化步骤获得重组人脑利钠肽重组蛋白。但是，这种方法在发酵时，采用的是TB培养基，导致表达量较低。
因此，开发一种重组人脑利钠肽的专用高效培养基，对于生产重组人脑利钠肽具有重要的价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于生产重组人脑利钠肽的培养基及使用这种培养基进行发酵的工艺，提高表达量，提升重组人脑利钠肽的产量。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供了一种生产重组人脑利钠肽的培养基，所述培养基按每100mL的体积计算，包括如下质量的组分：酵母提取物1.0g～5.0g(例如可以是1g、1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g或5g等)，干酪素1.0g～5.0g(例如可以是1g、1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g或5g等)，氯化钠0.5g～2.0g(例如可以是0.5g、0.8g、1g、1.2g、1.3g、1.5g、1.8g、1.9g或2g等)，甘油0.4g～3.0g(例如可以是0.4g、1g、1.5g、1.8g、2g、2.2g、2.3g、2.5g、2.8g或3g等)。
本发明提供的生产重组人脑利钠肽的培养基，可以为重组人脑利钠肽工程菌提供更丰富的碳源和氮源，有利于工程菌的生长，同时，该培养基中的干酪素可以提供更加丰富的氨基酸，有利于重组人脑利钠肽及其前体的合成，利用该培养基进行实际生产重组人脑利钠肽时，其表达量可达40％以上，重组人脑利钠肽的产量可达到500mg/L，相比于使用传统的LB培养基或TB培养基等仅有30％以下的表达量和200mg/L以下的产量，本发明提供的培养基使得表达量更高，产量提升，大大降低了生产成本。
在本发明中，配制培养基的溶剂为灭菌后的无菌水。
优选地，所述培养基的pH值为6.0～8.0，例如可以是6.0、6.2、6.5、6.8、6.9、7.0、7.1、7.5、7.8、7.9或8.0等。
优选地，所述培养基的pH值为6.2～7.8。
优选地，所述培养基的pH值为6.5～7.5。
优选地，所述酵母提取物的质量为1.5g～4.5g，进一步优选为2.0g～4.0g。
优选地，所述干酪素的质量为1.5g～4.5g，优选为2.0g～4.0g。
干酪素，又称酪蛋白，是一种从牛乳及其制品中提取的酪蛋白制品。干酪素是鲜乳经离心、脱脂、沉淀、干燥等方法生产加工的，颜色呈白色或微黄色的无臭味粉状或颗粒状物料，主要作为食品添加剂或品质改良剂被广泛应用于食品、医药、烟草、化妆品、皮革、轻纺、造纸等行业，是重要的食品、化工原料；而关于干酪素应用于微生物培养中，则鲜有报道。目前有公开的添加干酪素的培养基都为选择培养基，常用于产蛋白酶菌株筛选。
在本发明中，优选质量在2.0g～4.0g的干酪素，可以使得发酵生产的效果达到最佳。
优选地，所述氯化钠的质量为0.7g～1.8g，优选为1.0g～1.5g。
优选地，所述甘油的质量为1.0g～2.5g，优选为1.5g～2.0g。
作为优选技术方案，本发明提供的生产重组人脑利钠肽的培养基按每100mL体积计算，包括如下质量的组分：酵母提取物1.5g～4.5g，干酪素1.5g～4.5g，氯化钠1.0g～1.5g，甘油1.5g～2.0g。
作为优选技术方案，本发明提供的生产重组人脑利钠肽的培养基按每100mL的体积计算，包括如下质量的组分：酵母提取物2.0g～4.0g，干酪素2.0g～4.0g，氯化钠1.0g～1.5g，甘油1.5g～2.0g。
另一方面，本发明提供了一种生产重组人脑利钠肽的发酵工艺，所述发酵工艺包括如下步骤：将菌液接种至如上述的培养基中后，通气，流加干酪素和甘油，当菌液浓度OD600达到50以上后，使用IPTG诱导，继续发酵培养得到重组人脑利钠肽。
本发明提供的发酵工艺，通过不断流加干酪素和甘油，保证了重组人脑利钠肽的产量达到最高。
在本发明中，菌液中的细菌一般可以使用重组后的大肠杆菌、酵母等模式生物进行发酵生产重组人脑利钠肽。
优选地，所述培养基的温度为35℃～39℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃或39℃等。
优选地，所述通气为向培养基中的通气量为1～3vvm，例如可以是1vvm、1.2vvm、1.5vvm、1.8vvm、1.9vvm、2vvm、2.2vvm、2.5vvm、2.8vvm或3vvm等，优选1.5～2.5vvm，进一步优选为2vvm。
优选地，所述通气时，保持培养基的溶氧为30％～100％，例如可以是30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％等，优选为40％～100％。
优选地，所述流加干酪素和甘油的方法为：每2小时流加浓度为0.1％～0.3％(例如可以是0.1％、0.15％、0.2％、0.25％或0.3％等)的干酪素，优选为0.2％。
在本发明中，干酪素的流加量会影响菌的生长速度。如果干酪素的流加量过高，则菌体生长过快，培养基中的氧气含量无法满足菌体的生长；而如果干酪素的流加量过低，则菌体生长过于缓慢；因此，要控制干酪素流加的浓度。
优选地，每小时流加浓度为0.2％～0.5％(例如可以是0.2％、0.3％、0.4％或0.5％等)的甘油，优选为0.3％～0.4％。
优选地，所述IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)的浓度为0.005％～0.1％(例如可以是0.005％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.08％、0.095％或0.1％等)，优选0.01～0.05％。
优选地，所述发酵培养的时间为3～6h，例如可以是3h、4h、5h或6h等，优选为4～5h。
优选地，所述发酵工艺包括如下步骤：将菌液接种至上述的培养基中后，维持培养基的温度为35℃～39℃，保持通气量为1～3vvm，溶氧为30％～100％，控制培养基的pH值为6.0～8.0，每2小时流加浓度为0.1％～0.3％的干酪素，每小时流加浓度为0.2％～0.5％的甘油，当菌液浓度OD600达到50以上后，使用浓度为0.005％～0.1％的IPTG诱导，继续发酵培养3～6h得到重组人脑利钠肽。
在本发明的发酵工艺中所涉及到的浓度指的是，所添加的物质占整体培养基的质量百分比。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的生产重组人脑利钠肽的培养基，可以为重组人脑利钠肽工程菌提供更丰富的碳源和氮源，有利于工程菌的生长，同时，利用该培养基进行实际生产重组人脑利钠肽时，其表达量可达40％以上，重组人脑利钠肽的产量可达到500mg/L，相比于使用传统的LB培养基或TB培养基等仅有30％以下的表达量和200mg/L以下的产量，本发明提供的培养基使得表达量更高，产量提升，大大降低了生产成本，具有很高的经济价值。
附图说明
图1是本发明提供的凝胶电泳法检测表达量的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施通过以下方法，发酵生产重组人脑利钠肽，其中，培养基的配方为：酵母提取物3g，干酪素3g，氯化钠1g，甘油2g，无菌水100mL。
将重组大肠杆菌接种至培养基中后，维持培养基的温度为37℃，保持通气量为2vvm，溶氧为50％，控制pH值为7，保持每2小时流加浓度为0.2％的干酪素，每小时流加浓度为0.3％的甘油，当菌液浓度OD600达到50以上后，使用浓度为0.01％的IPTG诱导，继续发酵培养4h得到重组人脑利钠肽。
实施例2
本实施通过以下方法，发酵生产重组人脑利钠肽，其中，培养基的配方为：酵母提取物1.5g，干酪素1.5g，氯化钠1.0g，甘油1.5g，无菌水100mL。
将重组大肠杆菌接种至上述的培养基中后，维持培养基的温度为35℃，保持通气量为1vvm，溶氧为30％，控制pH值为6.2，保持每2小时流加浓度为0.1％的干酪素，每小时流加浓度为0.2％的甘油，当菌液浓度OD600达到50以上后，使用浓度为0.005％的IPTG诱导，继续发酵培养3h得到重组人脑利钠肽。
实施例3
本实施通过以下方法，发酵生产重组人脑利钠肽，其中，培养基的配方为：酵母提取物4.5g，干酪素4.5g，氯化钠1.5g，甘油2.0g，无菌水100mL。
将重组大肠杆菌接种至上述的培养基中后，维持培养基的温度为39℃，保持通气量为3vvm，溶氧为40％，控制pH值为7.8，每2小时流加浓度为0.3％的干酪素，每小时流加浓度为0.5％的甘油，当菌液浓度OD600达到50以上后，使用浓度为0.1％的IPTG诱导，继续发酵培养6h得到重组人脑利钠肽。
实施例4
本实施通过以下方法，发酵生产重组人脑利钠肽，其中，培养基的配方为：酵母提取物1.0g，干酪素1.0g，氯化钠0.5g，甘油0.4g，无菌水100mL。
将重组大肠杆菌接种至上述的培养基中后，维持培养基的温度为37℃，保持通气量为2.5vvm，溶氧为40％，控制pH值为8，每2小时流加浓度为0.15％的干酪素，每小时流加浓度为0.3％的甘油，当菌液浓度OD600达到50以上后，使用浓度为0.05％的IPTG诱导，继续发酵培养4h得到重组人脑利钠肽。
实施例5
本实施例与实施例1的区别仅在于，本实施例中每2小时流加浓度为0.3％的干酪素，其余均与实施例1相同，发酵培养得到重组人脑利钠肽。
对比例1
本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例中使用的培养基，不包括3g的干酪素，其余均与实施例1相同，发酵培养得到重组人脑利钠肽。
对比例2
本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例中不包括每2小时流加浓度为0.2％的干酪素的步骤，其余均与实施例1相同，发酵培养得到重组人脑利钠肽。
对比例3
本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例中培养基不包括3g的干酪素，同时不包括每2小时流加浓度为0.2％的干酪素的步骤，其余均与实施例1相同，发酵培养得到重组人脑利钠肽。
将上述实施例1-5与对比例1-3的样品表达量和重组人脑利钠肽的产量进行检测。其中，表达量采用SDS-PAGE凝胶电泳法(《中国药典》2015年版四部通则0542)进行检测(检测的表达结果如图1所示)；产量使用高效液相色谱法(检测标准为本公司自制纯化后的蛋白样品进行标定)进行检测。得到的数据如下表1所示：
表1
样品 表达量(％) 产量(mg/L)
实施例1 43 545
实施例2 41 523
实施例3 40 518
实施例4 41 508
实施例5 42 510
对比例1 28 108
对比例2 31 106
对比例3 30 125
通过以上实施例1-5与对比例1-3的实验结果可知，本发明通过使用干酪素配制得到的培养基，能够使得表达量达到最优的效果，重组人脑利钠肽的产量达到最高，并且相比于常用的LB、TB等培养基，产量提高幅度非常大，适于大规模生产。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的生产重组人脑利钠肽的培养基及发酵工艺，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种生产重组人脑利钠肽的培养基，其特征在于，所述培养基按每100mL的体积计算，包括如下质量的组分：酵母提取物1.0g～5.0g，干酪素1.0g～5.0g，氯化钠0.5g～2.0g，甘油0.4g～3.0g。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的pH值为6.0～8.0；
优选地，所述培养基的pH值为6.2～7.8；
优选地，所述培养基的pH值为6.5～7.5。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述酵母提取物的质量为1.5g～4.5g，优选为2.0g～4.0g。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的培养基，其特征在于，所述干酪素的质量为1.5g～4.5g，优选为2.0g～4.0g。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的培养基，其特征在于，所述氯化钠的质量为0.7g～1.8g，优选为1.0g～1.5g。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的培养基，其特征在于，所述甘油的质量为1.0g～2.5g，优选为1.5g～2.0g。
7.一种生产重组人脑利钠肽的发酵工艺，其特征在于，所述发酵工艺包括如下步骤：将菌液接种至如权利要求1-6中任一项所述的培养基中后，通气，流加干酪素和甘油，当菌液浓度OD600达到50以上后，使用IPTG诱导，继续发酵培养得到重组人脑利钠肽。
8.根据权利要求7所述的发酵工艺，其特征在于，所述培养基的温度为35℃～39℃；
优选地，所述通气为向培养基中的通气量为1～3vvm，优选1.5～2.5vvm，进一步优选为2vvm；
优选地，所述通气时，保持培养基的溶氧为30％～100％，优选为40％～100％。
9.根据权利要求7或8所述的发酵工艺，其特征在于，所述流加干酪素和甘油的方法为：每2小时流加浓度为0.1％～0.3％的干酪素，优选为0.2％；
优选地，每小时流加浓度为0.2％～0.5％的甘油，优选为0.3％～0.4％；
优选地，所述IPTG的浓度为0.005％～0.1％，优选0.01～0.05％；
优选地，所述发酵培养的时间为3～6h，优选为4～5h。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的发酵工艺，其特征在于，所述发酵工艺包括如下步骤：将菌液接种至如权利要求1-6中任一项所述的培养基中后，维持培养基的温度为35℃～39℃，保持通气量为1～3vvm，溶氧为30％～100％，控制培养基的pH值为6.0～8.0，每2小时流加浓度为0.1％～0.3％的干酪素，每小时流加浓度为0.2％～0.5％的甘油，当菌液浓度OD600达到50以上后，使用浓度为0.005％～0.1％的IPTG诱导，继续发酵培养3～6h得到重组人脑利钠肽。
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CN1594581A (zh) * 2004-07-16 2005-03-16 深圳大学 一种基因工程重组技术制备人脑利钠肽的方法
CN103923937A (zh) * 2014-04-09 2014-07-16 石家庄沃泰生物科技有限公司 一种可溶性表达人脑利钠肽重组蛋白的方法和应用
CN107177649A (zh) * 2017-06-22 2017-09-19 西藏诺迪康药业股份有限公司 一种提高重组人脑利钠肽融合蛋白表达量的发酵工艺

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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李季伦等: "《微生物生理学》", 31 December 1993, 北京农业大学出版社 *

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