BR112014004830B1 - Célula de levedura geneticamente modificada, seu uso e método para produzir uma proteína ou polipeptídio recombinante de interesse - Google Patents

Abstract

EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS. A presente invenção refere-se a uma célula de levedura geneticamente modificada compreendendo: - pelo menos um promotor recombinante operacionalmente ligado a pelo menos um gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas no interior da referida célula, o referido pelo menos um gene estando localizado no locos genômico nativo da célula de levedura de tipo selvagem não modificada geneticamente, onde o promotor de ocorrência natural do pelo menos um gene codificando o polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese é inativado por pelo menos uma mutação no interior do referido promotor de ocorrência natural e, - um cassete de secreção compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante codificando uma proteína ou polipeptídio de interesse e um método para produzir uma proteína ou polipeptídio recombinante de interesse usando tal célula.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a uma célula de levedura geneticamente modificada capaz de superexpressar pelo menos um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas no interior da referida célula.

[0002] Chaperonas, em particular dissulfeto isomerase proteica (PDI), são enzimas bastante conhecidas que ocorrem em particular no retículo endoplasmático de eucariotas. As chaperonas assistem o enrolamento ou desenrolamento e a montagem ou desmontagem de estruturas macromoleculares como proteínas e polipeptídios nas células. A PDI, por exemplo, é capaz de catalisar a formação, a ruptura e o rearranjo de ligações dissulfeto entre resíduos cisteína no interior de proteínas e polipeptídios. A PDI desempenha um papel crucial na expressão de proteínas uma vez que esta enzima é responsável pelo enrolamento correto de proteínas contendo pontes dissulfeto expressas em células eucarióticas. Muitos procariotas, que incluem E. coli, que são regularmente usados na expressão de proteínas recombinantes não possuem atividade de PDI.

[0003] Para expressar polipeptídios e proteínas corretamente enrolados compreendendo ligações dissulfeto foi sugerido na literatura expressar também PDI perto do polipeptídio ou proteína de interesse. A coexpressão de PDI em uma célula hospedeira recombinante leva não apenas a produtos corretamente enrolados, mas também é responsável por um rendimento mais alto do produto em comparação com células que não expressam PDI ou que expressam PDI em uma quantidade mais baixa em comparação com aquelas células que coexpressam PDI (vide por exemplo, o documento WO 94/08012). Além disso, foi constatado que uma formação aumentada de PDI em células eucarióticas que expressam naturalmente PDI resulta em uma biossíntese significativamente aumentada de uma proteína ou polipeptídio de interesse, embora haja exceções, conforme relatado por Butz JA et al. (Biotech Bioeng 84 (2003) :292-304).

[0004] No documento WO 93/25676 foi sugerido integrar cassetes de expressão recombinantes compreendendo um gene codificando PDI no genoma de uma célula hospedeira, em particular da célula de levedura. A integração de tais cassetes de expressão no genoma de células de levedura, por exemplo, não é simples. No curso do processo de integração é altamente provável que o cassete de expressão seja integrado no genoma mais de uma vez e potencialmente em sítios diferentes. Por conseguinte, nem sempre é possível gerar células de levedura tendo as mesmas propriedades. Além disso, também se sabe na literatura que a eficiência de expressão de uma molécula de ácido nucleico integrada no genoma de uma célula de levedura depende bastante do sítio de integração. Isto quer dizer que a integração de um cassete de expressão em um locos no interior de uma célula provavelmente dará resultados diferentes em comparação com células nas quais o cassete de expressão é integrado em um outro sítio no interior do genoma. Células de levedura compreendendo tais cassetes de expressão de PDI recombinantes ainda produzem PDI cujos gene codificadores podem ser naturalmente encontrados na célula. Portanto, tais células expressam de um lado PDI proveniente do cassete de expressão e por outro lado o PDI nativamente presente no gene da célula. Isto pode levar a níveis de PDI variáveis no interior da célula no curso de processos de cultivo. Além disso, a produção de proteínas alvo pode ser negativamente afetada pela superexpressão de PDI proveniente de um cassete de expressão recombinante devido à competição metabólica pela transcrição ou translação (Butz JA et al., Biotech Bioeng 84 (2003) :292-304).

[0005] Uma outra e importante desvantagem do uso de cassetes de expressão recombinantes como aqueles propostos no documento WO 93/25676 é que é necessário cotransformar a célula de levedura com pelo menos duas construções de ácido nucleico, uma ancorando o gene codificando PDI e a outra compreendendo pelo menos um gene codificando a pelo menos uma proteína de interesse a ser expressa na célula hospedeira (Gupta CS et al., J Mol Endocrin 22 (1999) : 273-283). A cotransformação requer a apresentação de pelo menos dois marcadores de seleção diferentes de uma só vez, o que na prática geralmente a problemas com clones falsos positivos no curso da seleção de clones. Alternativamente, uma estratégia de transformação em ‘serie poderia ser necessária, com transformações separadas de por exemplo, uma primeira transformação de uma construção de ácido nucleico ancorando o gene codificando PDI, e uma segunda transformação de uma construção de ácido nucleico ancorando pelo menos um gene codificando a pelo menos uma proteína de interesse a ser expressa em uma célula hospedeira (Payne MS et al., Gene 194 (1997) : 179-182). Assim sendo, variações clonais estão propensas. A transformação de uma construção de ácido nucleico ancorando tanto o gene codificando PDI assim como pelo menos um gene codificando a pelo menos uma proteína de interesse a ser expressa em uma célula hospedeira na prática leva à restrição de baixas eficiências de transformação devido ao alto peso molecular da construção de ácido nucleico. Além disso, surgem dificuldades resultantes das potenciais instabilidades do plasmídio, esteja ele na forma integrada ou extracromossômica (Finnis CJA et al., Microbial Cell Factories 9(2010) :87).

[0006] Subramanian et al. (PNAS 103(2006): 939-944) falam sobre a substituição do promotor do gene pbn1 a fim de estudar as consequências de uma falta de transcrição e consequentemente disponibilidade da proteína codificada por esse gene. Os autores descobriram que Pbn1p é necessário para a degradação de proteínas lumenais no retículo endoplasmático.

[0007] Constitui um objetivo da presente invenção oferecer meios e métodos que permitam sintetizar um polipeptídio ou proteína de interesse com um rendimento muito mais alto em comparação com os métodos conhecidos na literatura.

[0008] Assim sendo a presente invenção refere-se a um método para produzir uma proteína ou polipeptídio recombinante de interesse compreendendo as etapas de:- oferecer uma célula de levedura geneticamente modificada compreendendo

[0009] um cassete de secreção compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante codificando uma proteína ou polipeptídio de interesse e

[00010] pelo menos um promotor recombinante operacionalmente ligado a pelo menos um gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas no interior da referida célula, o referido pelo menos um gene estando localizado no locus genômico nativo da célula de levedura de tipo selvagem não modificada geneticamente, onde o promotor de ocorrência natural do pelo menos um gene codificando o polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese é inativado por pelo menos uma mutação no interior do referido promotor de ocorrência natural, - cultivar a referida célula de levedura geneticamente modificada em um meio de cultura em condições que permitem a expressão da proteína ou polipeptídio de interesse e do pelo menos um gene codificando o polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese e - isolar a proteína ou polipeptídio de interesse do meio de cultura.

[00011] A presente invenção também se refere a uma célula de levedura geneticamente modificada compreendendo

[00012] - pelo menos um promotor recombinante operacionalmente ligado a pelo menos um gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas no interior da referida célula, o referido pelo menos um gene estando localizado no locus genômico nativo da célula de levedura de tipo selvagem não modificada geneticamente, onde o promotor de ocorrência natural do pelo menos um gene codificando o polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese é inativado por pelo menos uma mutação no interior do referido promotor de ocorrência natural e- um cassete de secreção compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante codificando uma proteína ou polipeptídio de interesse.

[00013] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a uma célula de levedura geneticamente modificada compreendendo pelo menos um promotor recombinante operacionalmente ligado a pelo menos um gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas no interior da referida célula, o referido pelo menos um gene estando localizado no locos genômico nativo da célula de levedura de tipo selvagem não modificada geneticamente, onde o promotor de ocorrência natural do pelo menos um gene codificando o polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese é inativado por pelo menos uma mutação no interior do referido promotor de ocorrência natural.

[00014] Surpreendentemente, foi verificado que células compreendendo um promotor recombinante operacionalmente ligado a pelo menos um gene de ocorrência natural no genoma da célula hospedeira e codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas recombinantes no interior da referida célula não são capazes de produzir uma proteína ou polipeptídio recombinante de interesse ou pelo menos em menor extensão do que células hospedeiras equiparáveis se o promotor de ocorrência natural ainda estiver ativo (a um máximo de 10%, de preferência a um máximo de 5%, mais preferivelmente a um máximo de 2%, ainda mais preferivelmente a um máximo de pelo menos 1%, de sua atividade nativa determinada medindo-se o produto gênico transcrito e/ou transladado) ou pelo menos presente em seu comprimento total a montante do promotor recém-introduzido. Portanto é necessário que o promotor de ocorrência natural seja inativado por mutação do referido promotor. Tal inativação não leva, na modalidade mais preferida da presente invenção, a qualquer transcrição e/ou translação mensurável do gene naturalmente ao mesmo. No entanto, o termo "inativado" inclui também uma atividade residual do promotor de um máximo de 10%, de preferência de um máximo de 5%, mais preferivelmente de um máximo de 2%, ainda mais preferivelmente de um máximo de pelo menos 1%, de sua atividade nativa. A atividade do promotor pode ser simplesmente determinada medindo-se o gene transcrito e/ou o gene transladado usando-se métodos conhecidos na literatura.

[00015] De acordo com a presente invenção a célula de levedura pode compreende um ou mais, de preferência um, promotores recombinantes operacionalmente ligados a um ou mais genes de ocorrência natural codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas no interior da referida célula. Um único e mesmo promotor pode ser operacionalmente ligado a mais de um gene (diferente) de ocorrência natural codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas no interior da célula. Por outro lado também é possível oferecer uma célula que compreende um ou mais genes de ocorrência natural codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas à qual mais de uma cópia de um e mesmo promotor está operacionalmente ligada à mesma. Isto significa que uma célula de levedura da presente invenção pode compreender por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas e um outro promotor a um outro gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas. Naturalmente, também seria possível ligar operacionalmente um promotor específico a mais de um gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas.

[00016] Um "gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas" é um gene que codifica um polipeptídio ou proteína que suporta ativamente a expressão recombinante e/ou nativa de polipeptídios e proteínas no interior de uma célula. Se o referido polipeptídio ou proteína não for expresso ou for expresso em menor extensão em comparação com uma célula de referência (por exemplo, uma célula de tipo selvagem) a proteína ou polipeptídio nativo e/ou recombinante ou não é expresso nem secretado de forma alguma ou expresso ou secretado em menor extensão em comparação com uma célula na qual esses polipeptídios ou proteínas de suporte de expressão ou secreção estão presentes no interior da célula em níveis normais.

[00017] O termo "promotor recombinante", conforme usado neste relatório, refere-se a um promotor que não ocorre naturalmente no genoma na região a montante do gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas recombinantes no interior de uma célula hospedeira para controlar a transcrição do referido gene. O promotor recombinante pode ser um promotor derivado da mesma célula de levedura ou de uma célula de levedura diferente ou um promotor heterólogo sendo derivado de qualquer outra fonte contanto que o promotor recombinante seja funcional (i.e., seja capaz de controlar a transcrição do gene operacionalmente ligado ao mesmo) na célula hospedeira. Naturalmente o termo "promotor" inclui também fragmentos de um promotor de tipo selvagem, contanto que os referidos fragmentos sejam capazes de controlar a taxa de transcrição de um gene ao qual o referido fragmento de promotor está operacionalmente ligado.

[00018] Por "locos genômico nativo" entende-se uma sequência genômica de ocorrência natural.

[00019] O termo "operacionalmente ligado" refere-se a qualquer configuração na qual os elementos reguladores transcricionais e qualquer elemento regulador translacional estão covalentemente presos à sequência codificadora em tais disposições, em relação à sequência codificadora, que em e pela ação da célula hospedeira, os elementos reguladores podem direcionar a expressão da sequência codificadora.

[00020] Conforme usado neste relatório, o termo "cassete" refere-se a uma sequência nucleotídica capaz de expressar um gene particular se o referido gene for inserido de maneira a ser operacionalmente ligado a uma ou mais sequências reguladoras presentes na a sequência nucleotídica. Assim, por exemplo, o cassete de expressão pode compreender um gene heterólogo que se deseja expressar através da indução de glicose. Os cassetes de expressão da presente invenção são, portanto, úteis para promover a expressão de qualquer número de genes heterólogos mediante indução. Além disso, o cassete da presente invenção contém um trecho de ácidos nucleicos que codifica para um peptídio sinal que permite a secreção do polipeptídio ou proteína fundido ao mesmo. Tal cassete é de acordo com a presente invenção destinado a ser um "cassete de secreção". A sequência sinal de secreção pode ser qualquer sequência que é usada como o sinal de secreção na célula de levedura ou é convencionalmente conhecida na literatura (por exemplo, fator alfa ou fator de acoplamento alfa ("alpha mating factor")). De acordo com uma modalidade preferida particular da presente invenção o referido pelo menos um promotor recombinante permite que a célula de levedura geneticamente modificada produza pelo menos 100% mais, de preferência pelo menos 200% mais, mais preferivelmente pelo menos 300% mais, do polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas em comparação com a célula de levedura de tipo selvagem não modificada geneticamente.

[00021] O pelo menos um promotor recombinante operacionalmente ligado a pelo menos um gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas no interior da referida célula pode ser um promotor induzível ou constitutivo (em células de levedura). Os respectivos promotores são bastante conhecidos na literatura. Promotores adequados que podem ser usados de acordo com a presente invenção permitem que a célula produza pelo menos 100% (200%, 300%, 400%, 500%,...) mais do referido polipeptídio ou proteína que a célula de levedura de tipo selvagem compreendendo o promotor de ocorrência natural associado ao pelo menos um gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas no interior da referida célula.

[00022] Métodos para identificar a taxa de expressão de uma proteína ou polipeptídio específico no interior da célula são bastante conhecidos na literatura e podem envolver a ruptura das células e anticorpos que se ligam especificamente à referida pelo menos uma proteína ou polipeptídio.

[00023] A célula de levedura da presente invenção carregando as moléculas de ácido nucleico definida acima pode ser cultivada usando- se métodos convencionais que utilizam meios nutrientes convencionais e consolidados. Para produzir a proteína ou polipeptídio recombinante de interesse as células precisam ser cultivadas "em condições que permitem a expressão" dos referidos polipeptídios e proteínas. Isto significa que ao meio de cultura podem ser acrescentadas ou removidas substâncias (a remoção de substâncias pode ocorrer trocando-se o meio de cultura) para ativar os promotores operacionalmente ligados aos genes codificando o polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas e/ou a proteína ou polipeptídio de interesse.

[00024] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção o pelo menos um gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas (nativas e/ou recombinantes) no interior da referida célula é uma chaperona.

[00025] "Chaperonas" conforme usado neste relatório refere-se a polipeptídios e proteínas que assistem o enrolamento ou desenro- lamento e a montagem ou desmontagem de outras estruturas protenaáceas macromoleculares, mas que não ocorrem nessas estruturas quando as estruturas estão desempenhando suas funções biológicas normais tendo completado os processos de enrolamento e/ou montagem. Uma função principal das chaperonas é impedir que cadeias polipeptídicas recém-sintetizadas e subunidades montadas se agreguem formando estruturas não-funcionais. "Chaperonas" de acordo com a presente invenção também incluem "foldases proteicas" tais como dissulfeto isomerase proteica. As chaperonas da presente invenção estão de preferência presentes em compartimentos celulares apropriados (por exemplo, retículo endoplasmático (ER) e/ou aparelho de Golgi e/ou vesículas ao longo da via secretora para proteínas recombinantes secretadas).

[00026] Vantajosamente a inativação do promotor de chaperona de tipo selvagem assim como outros promotores de pelo menos um gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas não afeta negativamente a viabilidade da célula de levedura geneticamente modificada. Se a inativação do referido promotor for letal ou reduzir significativamente a viabilidade da célula hospedeira, o promotor de chaperona naturalmente não deve ser modificado da maneira descrita nesta invenção.

[00027] "O promotor de chaperona é inativado" significa que a atividade in vivo do promotor de chaperona do tipo selvagem é reduzida em um máximo de 10%, de preferência em um máximo de 5%, mais preferivelmente em um máximo de 2%, da atividade do promotor da célula hospedeira de tipo selvagem. Métodos para determinar a atividade de promotor são bastante conhecidos na literatura e podem envolver o uso de proteínas ou polipeptídios marcadores específicos. No entanto, é particularmente preferido que o promotor de chaperona de tipo selvagem na célula geneticamente modificada da presente invenção seja completamente inativado, de modo que nenhuma atividade de promotor pode ser determinada na célula.

[00028] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção a chaperona é selecionada do grupo que consiste em dissulfeto isomerase proteica, proteína de ligação Kar2/BiP e calnexina, sendo que dissulfeto isomerase é particularmente preferida.

[00029] De acordo com uma outra modalidade preferida da presente invenção o promotor recombinante é um promotor de levedura induzível geneticamente modificado ou não modificado.

[00030] Para controlar a taxa de expressão do pelo menos um gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas, de preferência dissulfeto isomerase proteica, na célula de levedura é vantajoso usar um promotor induzível. Naturalmente é possível usar qualquer tipo de promotor contanto que o promotor seja capaz de controlar a transcrição de um gene operacionalmente ligado ao mesmo em uma célula de levedura.

[00031] No entanto, é particularmente preferido usar um promotor que seja derivado de uma célula de levedura.

[00032] O promotor usado na presente invenção pode ser um promotor de tipo selvagem não modificado que é diretamente derivado de uma fonte respectiva. Naturalmente também é possível usar promotores que compreendam pelo menos uma mutação. Tais promotores têm a vantagem de que a introdução de mutações no promotor permite modificar a atividade de regulação de transcrição in vivo resultando em promotor com atividade mais baixa ou mais alta em comparação com o respectivo promotor de tipo selvagem em pontos de cultura específicos. "Promotor geneticamente modificado", conforme usado neste relatório, refere-se, portanto, a um promotor que fora modificado por qualquer método convencional ou da biologia molecular bastante conhecido na literatura, por técnicas de DNA, tais como por mutagênese sítio-dirigida, deleção ou inserção, ou por mutagênese convencional usando agentes químicos ou radiação, seguida por rastreamento ou seleção de células modificadas no mecanismo transcricional (vide por exemplo, o documento WO 2006/089329).

[00033] Alternativamente também é possível, naturalmente, usar promotores que agem constitutivamente na célula hospedeira. Em alguns casos a expressão constitutiva de uma chaperona usando um promotor recombinante também leva a uma formação aumentada de uma proteína ou polipeptídio de interesse. Promotores constitutivos para células de levedura são bastante conhecidos na literatura.

[00034] De acordo com uma outra modalidade preferida da presente invenção o promotor de levedura a ser operacionalmente ligado ao pelo menos um gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas no interior da referida célula, de preferência PDI, é selecionado do grupo que consiste em promotor AOX1, promotor GAL1, promotor PGK, promotor FDH, promotor FLD, promotor ADH e promotor HIS4.

[00035] Particularmente preferido é o uso de um promotor AOX1 não mutado ou mutado.

[00036] Mutações em um promotor, em particular de um promotor induzível, podem resultar em um promotor geneticamente modificado exibindo propriedades alteradas em comparação com o promotor de tipo selvagem. Mutações específicas podem levar a um promotor mostrando, em condições de indução, uma atividade mais alta (i.e., a taxa de transcrição do gene operacionalmente ligado ao mesmo é aumentada) que promotores não modificados. Naturalmente, também é possível prover mutações que mostram o efeito oposto. Partes particularmente preferidos do promotor AOX1 a serem geneticamente modificados estão mostradas em Inan M et al. (Biotechnol Bioeng 2006; 93: 771-778) e em particular no documento WO 2006/089329 (aqui incorporado a título de referência).

[00037] Variantes preferidos do promotor AOX1 de tipo selvagem (SEQ ID N° 1) a serem usadas na presente invenção compreendem pelo menos uma mutação (por exemplo, deleção, inserção, troca de nucleotídeo) nos sítios e faixas de nucleotídeos selecionados do grupo que consiste em:

[00038] um sítio de ligação do fator de transcrição (TFBS),

[00039] nucleotídeos 170 a 235, nucleotídeos 170 a 191,nucleotídeos 192 a 213, nucleotídeos 192 a 210, nucleotídeos 207 a 209, nucleotídeos 214 a 235, nucleotídeos 304 a 350, nucleotídeos 364 a 393, nucleotídeos 434 a 508, nucleotídeos 509 a 551, nucleotídeos 552 a 560, nucleotídeos 585 a 617, nucleotídeos 621 a 660, nucleotídeos 625 a 683, nucleotídeos 736 a 741, nucleotídeos 737 a 738, nucleotídeos 726 a 755, nucleotídeos 784 a 800 ou nucleotídeos 823 a 861 da SEQ ID N° 1, e combinações dos mesmos, onde os trechos de promotor compreendendo os sítios de ligação do fator de transcrição (TFBS) mencionados acima compreendem os nucleotídeos Hap1 54 a 58 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos Hsf 142 a 149 e 517 a 524 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos Hap234 196 a 200, 206 a 210 e 668 a 672 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos abaA 219 a 224 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos Stre 281 a 285 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos Rap1 335 a 339 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos Adr1 371 a 377 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos Mat1MC 683 a 687 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos Gcr1 702 a 706 da SEQ ID N° 1 e nucleotídeos QA-1F 747 a 761 da SEQ ID N° 1.

[00040] SEQ ID N° 1: promotor AOX1 de Pichia pastoris

[00041] ggtaccagatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatcc gacatccacaggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagca gcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaa accagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacacca tgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaag tccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgt tccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtg atctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaac ttccaaaagtcggcataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaa tgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatgggga aacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatact gctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaac agaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagcttactttcataattgcgactgg ttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaa ttattgaaagaattcaacc

[00042] O promotor de levedura é de preferência um promotor AOX1 compreendendo pelo menos uma mutação nos nucleotídeos 170 a 235 ou 694 a 723 ou 694 a 723 e 737 a 738 da SEQ ID N° 1.

[00043] Um promotor AOX1 compreendendo pelo menos uma mutação nos nucleotídeos 170 a 235 da SEQ ID N° 1 mostra uma taxa de expressão muito mais alta em condições de indução com metanol em comparação com o promotor AOX1 de tipo selvagem. Um promotor AOX1 compreendendo pelo menos uma mutação nos nucleotídeos 694 a 723 ou 694 a 723 e 737 a 738 da SEQ ID N° 1 mostra uma taxa de expressão muito mais alta em condições de desrepressão em comparação com o promotor AOX1 de tipo selvagem (vide por exemplo, o documento WO 2006/089329).

[00044] A mutação do promotor AOX1 é de preferência uma deleção, uma substituição, uma inserção, uma inversão e/ou uma multiplicação nos nucleotídeos acima mencionados do promotor AOX1 de tipo selvagem.

[00045] Para modificar as características do promotor AOX1 de tipo selvagem de Pichia pastoris vários tipos de mutação são possíveis. Os trechos de promotor compreendendo as regiões mencionadas acima assim como um ou mais dos sítios de ligação de fator transcrição (TFBS) os compreendendo nucleotídeos Hap1 54 a 58 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos Hsf 142 a 149 e 517 a 524 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos Hap234 196 a 200, 206 a 210 e 668 a 672 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos abaA 219 a 224 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos Stre 281 a 285 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos Rap1 335 a 339 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos Adr1 371 a 377 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos Mat1MC 683 a 687 da SEQ ID N° 1, nucleotídeos Gcr1 702 a 706 da SEQ ID N° 1 e nucleotídeos QA-1F 747 a 761 da SEQ ID N° 1 podem ser parcialmente ou completamente deletados, parcialmente ou completamente substituídos por outros nucleotídeos ou sequências de ácidos nucleicos, rompidos por inserção de nucleotídeos ou sequências de ácidos nucleicos simples, parcialmente ou completamente invertidos ou multiplicados. Todas essas alterações levam a uma alteração na atividade do promotor, porque aspectos estruturais e/ou sítios de reconhecimento/ligação para por exemplo, fatores de transcrição são afetados pelas referidas mutações. No entanto, essas alterações podem levar a uma atividade aumentada ou reduzida do promotor em comparação com o promotor de tipo selvagem.

[00046] Em uma modalidade especial da presente invenção a célula de levedura é selecionada do seguinte grupo que consiste na espécie Pichia, na espécie Hansenula tal como Hansenula polymorpha, na espécie Saccharomyces, na espécie Schizosaccharomyces, na espécie Yarrowia tal como Yarrowia lipolytica, na espécie Kluyveromyces e na espécie Aspergillus.

[00047] De acordo com uma modalidade particularmente preferida da presente invenção a célula de levedura é uma célula de levedura metilotrófica, de preferência selecionada do grupo que consiste em uma levedura do gênero da Pichia, de preferência Pichia pastoris, Candida boidinii e Hansenula polymorpha.

[00048] A pelo menos uma mutação do promotor de chaperona de ocorrência natural do pelo menos um gene codificando o polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese é de preferência uma deleção.

[00049] A inativação do promotor de ocorrência natural na célula hospedeira pode ocorrer de várias maneiras. Por exemplo, seria possível introduzir mutações pontuais no referido promotor. Mutações adequadas podem ser facilmente identificadas introduzindo-se mutações potenciais no referido promotor e em seguida testando-se in vivo a atividade do promotor. No entanto, a maneira mais eficiente de inativar um promotor na célula hospedeira é uma deleção de pelo menos uma parte do promotor. Portanto é particularmente preferido deletar pelo menos o promotor de ocorrência natural na célula hospedeira. A deleção pode ocorrer em qualquer parte do promotor, sendo particularmente preferido deletar aquelas partes são encontradas perto do códon de início do codificando o polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese (i.e., a região 5' do referido gene).

[00050] De acordo com uma modalidade particularmente preferida da presente invenção pelo menos 50 nucleotídeos, de preferência pelo menos 100 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 200 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente pelo menos 500 nucleotídeos, do promotor do pelo menos um gene de ocorrência natural codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas no interior da referida célula, de preferência dissulfeto isomerase proteica, é deletado.

[00051] É particularmente preferido deletar pelo menos os 50 primeiros, de preferência pelo menos os 100 primeiros, mais preferivelmente pelo menos os 200 primeiros, ainda mais preferivelmente pelo menos os 550 primeiros, nucleotídeos consecutivos na região a montante do códon de início do gene codificando o polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese (i.e., a extremidade 5’ do referido gene).

[00052] Para expressar uma proteína ou polipeptídio de interesse na célula de levedura a referida célula compreende ainda uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína ou polipeptídio de interesse operacionalmente ligado a um promotor, de preferência um promotor induzível.

[00053] O promotor operacionalmente ligado ao gene codificando o polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese pode ser o mesmo que o promotor operacionalmente ligado a uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína ou polipeptídio de interesse. No entanto, é preferível que o pelo menos um gene codificando o polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese e o gene codificando uma proteína ou polipeptídio de interesse sejam controlados por promotores diferentes. Neste contexto, o termo "promotores diferentes" significa que as atividades dos promotores não são idênticas e sim que diferem uma da outra. Portanto seria possível usar promotores modificados e não modificados derivados do mesmo promotor de tipo selvagem exibindo efeitos alterados quando a célula compreendendo os referidos promotores é cultivada. Isto permite regular independentemente a expressão do polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese e de uma proteína ou polipeptídio de interesse. A regulação independente da expressão do polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese e de uma proteína ou polipeptídio de interesse é vantajosa porque permite otimizar as taxas de expressão da proteína ou polipeptídio de interesse.

[00054] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção a molécula de ácido nucleico codificando uma proteína ou polipeptídio de interesse faz parte de um vetor ou é integrado no genoma.

[00055] A molécula de ácido nucleico codificando a proteína ou polipeptídio de interesse pode fazer parte de um vetor ou ser integrado no genoma usando-se meios e métodos respectivos que são bastante conhecidos pelo especialista na técnica. Os meios e métodos a serem usados também dependem da célula hospedeira e precisam ser selecionados de forma correspondente (vide por exemplo "Pichia Protocols", Cregg JM, Humana Press; 2nd edition (August 8, 2007).

[00056] A molécula de ácido nucleico da presente invenção também compreende sequências sinal que permitem a secreção da proteína ou polipeptídio de interesse no sobrenadante do meio de cultura em que as células são cultivadas.

[00057] O termo "sequência sinal" conforme usado neste relatório refere-se a um segmento que dirige a secreção da molécula biologicamente ativa. A sequência sinal usada na presente invenção pode ser um polinucleotídeo que codifica uma sequência aminoacídica iniciando o transporte de uma proteína através da membrana do retículo endoplasmático (ER). Exemplos não limitativos da sequência sinal são MFα (sequência sinal do fator de acoplamento α), sinal da toxina exterminadora K1, peptídio sinal da secreção de invertase, toxina exterminadora da sequência sinal de Kluyveromyces lactis, toxina exterminadora da sequência sinal de Pichia acaciae, toxina exterminadora da sequência sinal de Hanseniaspora uvarum, e toxina exterminadora da sequência sinal de Pichia (Hansenula) anomala. A sequência sinal preferida da presente invenção é MFa (sequência sinal do fator de acoplamento a). De preferência, para enrolamento e translocação corretos de uma proteína alvo, é introduzido o peptídio sinal MFa. MFa é uma região pre-pro do fator a, e codifica uma proteína tendo 165 aminoácidos, pre-pro-fator a, que compreende uma sequência sinal de 19 aminoácidos (a região pre) e uma região pro, seguida por quatro repetições em tandem da sequência madura de 13 aminoácidos do fator a. Em uma modalidade particularmente preferida a sequência sinal compreende ou consiste na seguinte sequência aminoacídica (SEQ ID N° 11) :

[00058] MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGY SDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA

[00059] O anticorpo codificando a referida sequência sinal tem uma identidade de pelo menos 95%, de preferência de pelo menos 98%, ainda mais preferivelmente de 100%, com a seguinte sequência nucleotídica (SEQ ID N° 12):

[00060] atgagattcccatctattttcaccgctgtcttgttcgctgcctcctctgcattggctgccc ctgttaacactaccactgaagacgagactgctcaaattccagctgaagcagttatcggttactctac cttgagggtgatttcgacgtcgctgttttgcctttctctaactccactaacaacggtttgttgttcattaaca ccactatcgcttccattgctgctaaggaagagggtgtctctctcgagaagaagaggccgaagct

[00061] Conforme usado neste relatório, entende-se pelo termo "vetor" qualquer molécula de ácido nucleico incluindo uma sequência nucleotídica competente para ser incorporada em uma célula hospedeira e integrada no genoma da célula hospedeira, ou para replicar de forma autônoma como um DNA epissômico. Tais vetores incluem ácidos nucleicos lineares, plasmídios, fagomídios, cosmídios, vetores de RNA, vetores virais, entre outros. Um vetor de expressão adequado pode compreender fatores reguladores de expressão tais como um promotor, um códon de início, um códon de término, um sinal de poliadenilação, um potencializador e marcadores de seleção.

[00062] A transformação das moléculas de ácido nucleico da presente invenção na célula de levedura pode ser conduzida por métodos conhecidos na literatura, que pode ser adequadamente selecionados dependendo das células hospedeiras. Esses métodos incluem, porém sem limitação, eletroporação, método de fusão de protoplasto, precipitação em fosfato de cálcio e precipitação em cloreto de cálcio, agitação com fibra de carboneto de silício, e transformação mediada por PEG, sulfato de dextrana e lipofectamina.

[00063] Um outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso das células de acordo com a presente invenção para produzir uma proteína ou polipeptídio recombinante de interesse.

[00064] Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para produzir pelo menos uma proteína ou polipeptídio recombinante em uma célula hospedeira da presente invenção, onde a referida célula hospedeira compreende pelo menos um gene codificando a pelo menos uma proteína ou polipeptídio recombinante, onde a expressão do pelo menos um gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas recombinantes ou nativos ou chaperona de ocorrência natural na referida célula hospedeira é aumentada em comparação com uma célula hospedeira de tipo selvagem.

[00065] Ainda um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para produzir uma proteína ou polipeptídio recombinante ou nativo compreendendo a etapa de cultivar uma célula de acordo com a presente invenção.

[00066] Métodos para produzir proteínas ou polipeptídios recombinantes são bastante conhecidos na literatura. A célula de levedura geneticamente modificada de acordo com a presente invenção é particularmente adequada para expressar tais proteínas e polipeptídios porque ela permite controlar a taxa de expressão de pelo menos um gene codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas recombinantes, de preferência chaperona, mais preferivelmente PDI, assim como proteínas e polipeptídios de interesse de uma maneira muito mais eficiente. Em particular é possível controlar a taxa de expressão de pelo menos uma chaperona, de preferência PDI, em vários estágios de cultura e consequentemente determinar o ponto no tempo em que o nível da pelo menos uma chaperona na célula atinge uma quantidade predeterminada.

[00067] O método da presente invenção também pode compreender uma etapa de isolamento da proteína ou polipeptídio de interesse do sobrenadante do meio de cultura se a proteína ou polipeptídio for secretado da célula.

[00068] As células da presente invenção podem ser cultivadas por qualquer método de cultura conhecido tal como cultura intermitente, cultura contínua e cultura de alimentação intermitente. As condições de cultura adequadas para as cepas de levedura selecionadas podem ser facilmente ajustadas pelos especialistas na técnica. Tipicamente, o meio usado deve conter todos os nutrientes essenciais para o crescimento e a sobrevivência das células.

[00069] A presente invenção está ainda ilustrada nas figuras e exemplos que se seguem, sem contudo estar restrita aos mesmos.

[00070] A Fig. 1 mostra um mapa de plasmídios da "construção Flipper" para o cassete de integração de promotor do promotor AOX1 especificamente mutado entre o promotor nativo da dissulfeto isomerase proteica (PDI) e o gene PDI.

[00071] A Fig. 2 mostra uma representação gráfica da estratégia de integração de promotor para o promotor PDI.

[00072] A Fig. 3 mostra um mapa de plasmídios da "construção Flipper" para o cassete de substituição de promotor do promotor nativo da dissulfeto isomerase proteica (PDI) por um promotor AOX1 especificamente mutado.

[00073] A Fig. 4 mostra uma representação gráfica da estratégia de substituição de promotor para o promotor PDI.

[00074] A Fig. 5 mostra uma sobreposição de eletroferogramas (GXII, Caliper Life Sciences, EUA) do sobrenadante (diretamente aplicado) da cepa CBS7435 muts expressando transferrina (linha cheia), e da cepa CBS7435 muts PDI platform (linha tracejada), respectivamente.

[00075] A Fig. 6 mostra uma sobreposição de eletroferogramas (GXII, Caliper Life Sciences, EUA) do sobrenadante (diretamente aplicado) da cepa expressando transferrina não glicosilada CBS7435 muts (linha cheia) e da cepa CBS7435 muts PDI platform (linha tracejada), respectivamente.

[00076] A Fig. 7 mostra uma sobreposição de eletroferogramas (GXII, Caliper Life Sciences, EUA) do sobrenadante (diretamente aplicado) das cepas CBS7435 muts expressando HSA-Interferon (alfa2a) (linha pontilhada), da cepa CBS7435 muts coexpressando a dissulfeto isomerase proteica recombinante (presente em 1 cópia; foi usado o mesmo promotor que aquele usando na cepa CBS7435 muts PDI platform) (linha cheia), e da cepa CBS7435 muts PDI platform (linha cheia com losangos), respectivamente.

[00077] A Fig. 8 mostra uma sobreposição de eletroferogramas (GXII, Caliper Life Sciences, EUA) do sobrenadante (diretamente aplicado) das cepas CBS7435 muts expressando Fab (linha cheia), da cepa CBS7435 muts coexpressando Kar2 recombinante (presente em 1 cópia; foi usado o mesmo promotor que aquele usando na cepa CBS7435 muts com plataforma de Kar2) (linha pontilhada), e da cepa CBS7435 Kar2 plataform (linha cheia com círculos), respectivamente.

EXEMPLOS: Estratégia

[00078] A construção de DNA transformado usada nos exemplos específicos que se seguem consiste nos primeiros 700-1000 pb do promotor homólogo e um promotor AOX1 especificamente mutado e fortemente regulado induzindo a expressão da recombinase Flp, seguido por um terminador de transcrição e um cassete de marcador de resistência, seguido ainda por um promotor AOX1 especificamente mutado e regulado de forma diferente e os primeiros 500-1000 pb do gene homólogo. Os sítios de reconhecimento da recombinase são colocados atrás dos primeiros 100-300 pb do promotor homólogo (com base na suposição de que o promotor PDI nativo pode consistir em aproximadamente 1000 pb), e diretamente a montante do segundo promotor AOX1 específico (e a jusante do cassete de marcador de restrição).

[00079] Depois da inserção genômica da construção de transformação no locus considerado (que é predeterminado pelas regiões flanqueadoras homólogas), colônias são submetidas a um meio contendo metanol a fim de induzir a transcrição do gene da recombinase regulado pelo promotor induzível forte a montante. A recombinase Flp age nos sítios de reconhecimento de recombinase Flp e assim excisa a maior parte do promotor homólogo, da variante do promotor AOX1 induzível forte assim como do cassete de marcador de resistência, deixando para trás frações residuais do promotor homólogo e do promotor AOX1 especificamente mutado e regulado de forma diferente induzindo o gene de interesse homólogo.

[00080] Para verificação de um aumento significativo nos níveis de transcrição do gene PDI com a estratégia descrita acima, os genes sintéticos para transferrina sérica humana assim como a variante mutada sem motivos de N-glicosilação transferrina não glicolisada foram proteínas modelo ideais: sem a coexpressão de PDI de um cassete de expressão recombinante, ambas as proteínas não podem ser secretadas. O motivo mais provável para isto é o imenso número de 19 ligações dissulfeto a serem formadas para uma proteína intacta que seria passível para secreção, que não podem ser suficientemente catalisadas pelas proteínas PDI residentes no ER nativo. Aparentemente, com o fornecimento de enzimas adicionais por superexpressão heteróloga, a modificação pós-translacional da transferrina e da transferrina não glicosilada no ER funciona até um ponto que permite a secreção de proteínas enroladas corretamente.

Cepas

[00081] Procedimentos tradicionais da biologia molecular biology foram realizados de acordo com Ausubel, F.M., et al. (2003) Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley & Sons, New York, EUA).

[00082] E. coli DH5α (NEB, EUA) foi usada para todas as experiências de clonagem de E. coli.

[00083] A cepa CBS7435 Pichia pastoris com fenótipo muts (genótipo Δaox1) foi usada como hospedeiro para todas as experiências com levedura (vide por exemplo, Cregg & Madden em Stewart, Russell, Klein and Hiebsch (Eds) Biological Research on Industrial Yeast, vol II (1987), CRC Press, págs. 1-18).

Produtos químicos e Meios

[00084] A menos que de outra forma explicitamente mencionado, todos os produtos químicos foram adquiridos na Carl Roth GmbH (Alemanha), e na Becton, Dickinson and Company (EUA), respectivamente. Água estéril foi adquirida na Fresenius Kabi (Áustria).

[00085] A menos que especificamente mencionado, todos os meios de cultura e ingredientes foram preparados de acordo com o protocolo do kit de expressão de proteínas de Pichia (Invitrogen, EUA).

Transformação de P. pastoris, condições de crescimento da Pichia e seleção de clones positivos

[00086] P. pastoris foi transformada usando-se o protocolo de eletroporação tradicional de acordo com o "Pichia Expression Kit" (Invitrogen). DNA de plasmídio (1-10 μg) foi linearizado usando-se uma enzima de restrição, por exemplo, Bglll ou Sacl (ambas adquiridas na NEB, EUA) para adição do plasmídio de expressão no genoma de P. pastoris e dessalinizado via diálise usando filtros de nitrocelulose (0,0025 μm, Millipore, EUA) contra água estéril por 60 minutos à temperatura ambiente.

[00087] Depois da transformação, alíquotas de 100 μl foram plaqueadas em placas de ágar YPD suplementadas com 100 μg/ml de zeocina e incubadas por 2 dias a 30°C.

[00088] A presença do cassete de expressão no genoma de P. pastoris foi confirmada por PCR da colônia. Clones resistantes à zeocina foram plaqueados em meio não-seletivo para análise da colônia por PCR. Uma única colônia foi ressuspena em 100 μl de água estéril, aquecida até 95°C por 5 minutos e centrifugada à velocidade máxima em uma centrífuga de bancada por 1 minuto. 10 μl dos sobrenadantes serviram de gabarito para uma reação de 50 μl, contendo 0,2 mM de dNTPs, 1x de tampão de reação (Qiagen, Alemanha), 1,2 U de HotStar Taq polimerase (Qiagen), 200 nM de cada um dos iniciadores PPDI5_for (5'-ccaaaaccaggtgtgtcaatc-3') e PDIgene_rev (5'-cgactggtctg agtgctagg- 3 '). O seguinte programa foi usado para PCR: 15 min a 95°C, 30 ciclos com 30 s a 95°C, 1 min a 61°C e 3,5 min a 72°C, seguido por uma etapa de extensão final de 10 min a 72°C. A identidade dos produtos de PCR resultantes foi verificada por sequenciamento de DNA.

[00089] Culturas de levedura foram cultivadas seja no meio YPD (1% p/v de extrato de levedura, 2% p/v de peptona e 2% p/v de glicose), meio de dextrose mínima (MD) (1,34% de base nitrogenada de levedura YNB, 4 x 10-5% de biotina e 1% de glicose), meio de metanol mínimo (MM) (1,34% de YNB, 4 x 10-5% biotina e 0,5% de metanol), meio MD tamponado (BMD) (contendo 200 mM de tampão fosfato de sódio pH 6,0) ou meio MM tamponado com concentração dobrada (BMM2 contendo 1% de metanol) ou decuplicada (BMM10 contendo 5% de metanol) de metanol em comparação com o MM, de acordo com (Weis et al., FEMS YR 2004). Os meios para as placas foram solidificados por adição de ágar a 1,5% p/v.

Ampliação ("scale-up")

[00090] Fermentações de Pichia pastoris foram realizadas de maneira similar aos protocolos descritos em Cino, J. High Yield Protein Production from Pichia pastoris Yeast: A Protocol for Benchtop Fermentation, New Brunswick Scientific, Edison, NJ. No final da alimentação com glicerol, uma alimentação com metanol foi iniciada com o objetivo de manter a concentração de metanol (análise de metanol off-line) em torno de 1% por ajuste da taxa de alimentação. Alternativamente, no lugar da alimentação com metanol, glicerol foi alimentado durante todo o processo à mesma taxa que no período de alimentação intermitente com glicerol clássica de uma fermentação induzida por metanol. O valor do pH foi ajustado em 5,5 e controlado com amônia. O oxigênio dissolvido foi mantido acima de 30%, principalmente controlado pela velocidade do agitador, e reforçado pela taxa de aeração. A temperatura foi ajustada em 20-28°C. Os pesos secos das células foram determinados da maneira descrita em Whittaker, M.M. & Whittaker, J.M. (2000) Protein, Expr. Purif. 20, 105-111.

Determinação da proteína alvo secretada

[00091] Depois de cultura em microescala ou biorreatores, respectivamente, amostras do sobrenadante (obtidas por separação das células por centrifugação) foram analisadas por eletroforese capilar microfluida (GXII, Caliper Life Sciences, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Comparação dos picos da proteína-alvo com padrões tanto interno quanto externo resultou em rendimentos da proteína alvo no sobrenadante da cultura.

Exemplo 1: Construção de cassete de cointegração de promotor de um promotor AOX1 especificamente mutado entre o promotor de dissulfeto isomerase proteica (PDI) e o gene PDI

[00092] A construção de DNA transformado consiste nos primeiros 500 pb (a partir da extremidade 3') do promotor PDI homólogo (com base na suposição de que o promotor PDI nativo pode consistir em aproximadamente 1000 pb), e um promotor AOX1 especificamente mutado e regulado (WO 2006/089329; derivado da SEQ ID N° 1) induzindo a expressão da recombinase Flp, seguido pelo terminador de transcrição CYC1 e um cassete de resistência à zeocina (funcional em E. coli pelo promotor EM72, e em P. pastoris pelo promotor ILV5 e o terminador de transcrição AOD), seguido ainda pelos primeiros 500 pb do gene PDI homólogo. Os sítios de reconhecimento de recombinase são colocados depois do promotor AOX1 específico, e diretamente a montante do gene PDI homólogo (Fig. 1). Este fragmento de DNA foi classificado como DNA DNA gerado sinteticamente com DNA2.0 (Menlo Park, EUA).

Exemplo 2: Transformação da construção de integração de promotor em CBS7435 muts, confirmação da constelação genômica, propagação no meio com metanol e excisão e confirmação do cassete

[00093] Depois de transformação e seleção em placas de ágar, foi confirmado por PCR que 20 colônias carregavam o cassete de transformação integrado na orientação genômica correta.

[00094] Clones foram transferidos para placas de ágar com metanol mínimo por 5 dias (até grandes colônias simples fossem formadas), no total de 3 vezes consecutivas. Depois disso, a excisão da região do DNA entre os sítios FRT (a maior parte da região de promotor homóloga, promotor AOX1 induzível forte e recombinase Flp, cassete de marcador de resistência) foi verificada por contra-remarcação ("counterrestreaking") em placas de YPhyD contendo marcador de seleção (zeocina) : clones positivos, i.e., aqueles onde ocorreu excisão, não foram capazes de crescer nessas placas. A PCR de colônias comprovou a ocorrência do promotor PDI homólogo a montante do promotor AOX1 especificamente mutado, diretamente seguido pelo sítio FRT remanescente e pelo gene PDI (intacto) (Fig. 2, SEQ ID N° 2).

[00095] SEQ ID N° 2: sequência obtida para o locos genômico de PDI

[00096] Negrito: região do promotor PDI nativo (1000 pb a montante do gene PDI nativo na cepa não modificada)

[00097] Itálico: promotor AOX1 mutado

[00098] Normal: gene PDI nativo (primeiras 892 bases) com sequência 5' kozak Subscrito: sítio FRT

[00099] aagggagacatattcggctattgtttactttgcgcccacagtagcgttaaga aacattgtttgttcgatttattgggctgttgataaattcaattgattacgttcgcatactagctat cataaactaagcaccaccttacaccactttctcactgaagattttcgacatcaaatttctctt ggatcaccatcaaccttgtgtctacatgtccttgtctttgaacctaaatcagatagccgtgc gggttgtgggcatattgcctcgtattccggagattcacattgccattcctaatatttttcagcg acgcaccgaagcttctacagagactcacgatcctcgcatactagagctgatagaaaatct acaggatgccgaggttcctccattcttcattgataacggtatacttaaagcagcaccaaaa aagaaggtttctcatatgaaaagacgccagaaattatatggtccaggaaaaaaacaact ctctttactacaaaatttgaacaggtgtcctgcctgcggaaactacaaacgatcacacacc ctctgcatgcattgcgtaggacaaatcaggagacattggaacgactctgttcctcaacag gaggcatttcgtgaagagtttgttaatcctttggatgagaagattctttatccaggaaagaaa gaactgcccgatgaacgaactttacgtaagaaggagtggctgaagagaagaccccga acactccctgttgaatagaacacgaacactgtaaatagaataaaagaaaacttggatagt agaacttcaatgtagtgtttctattgtcttacgcggctctttagattgcaatccccagaatgg aatcgtccatctttctcaacccactcaaagataatctaccagacatacctacgccctccat cccagcaccacgtcgcgatcacccctaaaacttcaataattgaacacg

[000100] tactgatttccaaaccttcttcttcttcctatctataagaagatctaacatccaaa gacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgc aaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcct cttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgc tcattccaattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctgg cgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagat gagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaa acgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttg aaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcggcataccgt

[000101] ttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgca gtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgcttt ttggatgattatgcattgtctccacactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaa cccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcatt attagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacgacaa cttgagaagatcaaaaaacaactaattattgaaagaagttcctatactttctagagaataggaac ttccgaaacgatgcaattcaactggaatattaaaactgtggcaagtattttgtccgctctcacactag cacaagcaagtgatcaggaggctattgctccagaggactctcatgtcgtcaaattgactgaagc cacttttgagtctttcatcaccagtaatcctcacgttttggcagagttttttgccccttggtgtggtcact gtaagaagttgggccctgaacttgtttctgctgccgagatcttaaaggacaatgagcaggttaaga ttgctcaaattgattgtacggaggagaaggaattatgtcaaggctacgaaattaaagggtatccta ctttgaaggtgttccatggtgaggttgaggtcccaagtgactatcaaggtcaaagacagagccaa agcattgtcagctatatgctaaagcagagtttaccccctgtcagtgaaatcaatgcaaccaaagat ttagacgacacaatcgccgaggcaaaagagcccgtgattgtgcaagtactaccggaagatgca tccaacttggaatctaacaccacattttacggagttgccggtactctcagagagaaattcacttttgt ctccactaagtctactgattatgccaaaaaatacactagcgactcgactcctgcctatttgcttgtca gacctggcgaggaacctagtgtttactctggtgaggagttagatgagactcatttggtgcactgga ttgatattgagtccaaacctctatttggagacattgacggatccaccttcaaatcatatgctgaagct aacatccctttagcctactatttctatgagaacgaagaacaacgtgctgctgctgccgatattattaa accttttgctaaagagcaac gtggcaaaattaact

Exemplo 3: Produção secretora de transferrina na cepa com níveis elevados de PDI homólogo sub condições indutoras de metanol em microescala

[000102] Os genes codificando transferrina (SEQ ID N° 3) assim como transferrina não glicosilada (SEQ ID N° 4; transferrina não glicosilada gerada por mutagênese dupla sítio-dirigida para mutar ambos os motivos de N-glicosilação) foram integrados no genoma do hospedeiro não tratado CBS7435 muts sob o controle de um promotor AOX1 especificamente mutado (WO 2006/089329) compreendendo uma deleção dos nucleotídeos 170 a 235 da SEQ ID N° 1 identificados no documento WO 2006/089329 e a cepa correspondente com níveis potencialmente elevados de PDI homólogo como descrito acima. A ocorrência de informação genéticas para ambas as variantes de transferrina foi comprovada por PCR de colônia (iniciador normal ligando-se ao PAOX1, iniciador invertido ligando-se a ambos os genes de transferrina nos primeiros 80 pb). Com o cultivo em microescala, nem o hospedeiro da cepa básica CBS7435 muts nem a cepa com níveis potencialmente elevados de PDI homólogo foi capaz de secretar transferrina de forma alguma (em níveis detectáveis por eletroforese capilar microfluida).Sequência de iniciador (SEQ ID N° 8)

[000103] 5' CAGCACACCATCTAACAG 3'

[000104] SEQ ID N° 3: Transferrina

[000105] gttccagataagactgttagatggtgtgctgtttcagagcatgaggctactaaatgt caatcttttagagatcacatgaagtctgtcatcccatctgatggtccatccgtggcttgtgtgaagaa agcttcttaccttgattgtatccgggccatcgctgctaacgaagctgacgcagtcaccttggacgc gggtttagtgtacgacgcatatctagccccaaacaacttaaagccagttgtcgctgagttttacggt agcaaggaagatccacagacattctactacgccgtcgctgttgtgaaaaaggactccggttttca aatgaaccagcttagagggaagaagtcatgtcataccggacttggaagatcagctggttggaac attccaatcggtttgctgtattgcgatcttccagagccacggaagcctttggagaaggctgttgctaa tttcttttctggttcatgtgctccctgtgccgacggtaccgactttccacagttgtgccagctgtgtccag gctgcggttgttcaacattaaaccaatacttcggttactccggtgcgttcaagtgccttaaggacgg tgctggtgatgttgcgtttgttaaacattccactattttcgagaacctggcaaataaagcagatagag atcaatacgaactgttatgcctagataacactagaaaacctgttgacgagtacaaggactgtcac cttgcccaagtgccatctcacactgttgttgccagatcgatgggtggtaaagaggaccttatttggg agttgctgaaccaagctcaagaacacttcggaaaggacaagtcaaaggaatttcaattgttttctt ctcctcacggaaaggatttgctttttaaggattctgctcatggtttcttgaaggtcccaccaagaatg gatgcaaaaatgtaccttggttacgagtacgtaactgcgattagaaatttaagagaaggtacgtgt ccagaagccccaactgatgaatgtaagccagttaaatggtgtgcattgtctcaccacgaaagatt gaagtgtgacgaatggtctgtgaactcagttggtaaaattgagtgtgtgtcggccgaaactacgg aagattgtattgcaaagatcatgaacggagaagcagatgccatgtcactcgacggaggtttcgt gtatattgccggtaagtgtggccttgttccagttttggcagagaactacaacaaatccgataactgt gaagacactcctgaggctggctacttcgcagttgctgttgttaaaaagtctgcttcggacctaacc tgggacaacctgaagggtaagaagtcttgtcacaccgcagtcgggagaaccgcaggatggaa catcccaatgggtcttctttacaataagatcaaccactgtaggtttgacgagttcttttctgaaggttgt gctcctggatctaagaaggactcctctctttgtaaactgtgtatgggatctggtttgaacttgtgcgag ccaaacaacaaggaaggttattacggttacaccggagcttttagatgtttggttgaaaagggaga cgttgccttcgtcaaacaccaaactgtgcctcagaacactggtggtaagaaccccgatccttggg caaagaatttgaacgagaaggattacgagttattatgtttggacggtacccgtaaaccagttgaag aatacgccaattgtcacttggctagagcaccaaaccacgccgtcgtgactagaaaagataagg aggcttgtgttcacaagattttgcgtcaacaacaacatttgtttggatctaacgttactgattgttctgg taacttctgtttgttccgtagcgagactaaggatctgttatttagggacgacaccgtttgcctggcca agttgcacgaccgtaacacttacgagaagtatttaggagaggaatacgtgaaggccgttggca atttgagaaagtgctctacctcttctcttttagaagcctgtacctttagaagaccttaa SEQ ID N° 4: Transferrina não glicosilada

[000106] gttccagataagactgttagatggtgtgctgtttcagagcatgaggctactaaatgt caatcttttagagatcacatgaagtctgtcatcccatctgatggtccatccgtggcttgtgtgaagaa agcttcttaccttgattgtatccgggccatcgctgctaacgaagctgacgcagtcaccttggacgc gggtttagtgtacgacgcatatctagccccaaacaacttaaagccagttgtcgctgagttttacgg tagcaaggaagatccacagacattctactacgccgtcgctgttgtgaaaaaggactccggttttc aaatgaaccagcttagagggaagaagtcatgtcataccggacttggaagatcagctggttgg aacattccaatcggtttgctgtattgcgatcttccagagccacggaagcctttggagaaggctg ttgctaatttcttttctggttcatgtgctccctgtgccgacggtaccgactttccacagttgtgccagc tgtgtccaggctgcggttgttcaacattaaaccaatacttcggttactccggtgcgttcaagtgcc ttaaggacggtgctggtgatgttgcgtttgttaaacattccactattttcgagaacctggcaaataa agcagatagagatcaatacgaactgttatgcctagataacactagaaaacctgttgacgag tacaaggactgtcaccttgcccaagtgccatctcacactgttgttgccagatcgatgggtggta aagaggaccttatttgggagttgctgaaccaagctcaagaacacttcggaaaggacaagtc aaaggaatttcaattgttttcttctcctcacggaaaggatttgctttttaaggattctgctcatggtttctt gaaggtcccaccaagaatggatgcaaaaatgtaccttggttacgagtacgtaactgcgattag aaatttaagagaaggtacgtgtccagaagccccaactgatgaatgtaagccagttaaatggt gtgcattgtctcaccacgaaagattgaagtgtgacgaatggtctgtgaactcagttggtaaaatt gagtgtgtgtcggccgaaactacggaagattgtattgcaaagatcatgaacggagaagcagat gccatgtcactcgacggaggtttcgtgtatattgccggtaagtgtggccttgttccagttttggcaga gaactaccaaaaatccgataactgtgaagacactcctgaggctggctacttcgcagttgctgtt gttaaaaagtctgcttcggacctaacctgggacaacctgaagggtaagaagtcttgtcacacc gcagtcgggagaaccgcaggatggaacatcccaatgggtcttctttacaataagatcaaccac tgtaggtttgacgagttcttttctgaaggttgtgctcctggatctaagaaggactcctctctttgtaaact gtgtatgggatctggtttgaacttgtgcgagccaaacaacaaggaaggttattacggttacaccg gagcttttagatgtttggttgaaaagggagacgttgccttcgtcaaacaccaaactgtgcctcaga acactggtggtaagaaccccgatccttgggcaaagaatttgaacgagaaggattacgagttatta tgtttggacggtacccgtaaaccagttgaagaatacgccaattgtcacttggctagagcaccaaa ccacgccgtcgtgactagaaaagataaggaggcttgtgttcacaagattttgcgtcaacaacaac atttgtttggatctcaagttactgattgttctggtaacttctgtttgttccgtagcgagactaaggatctgtt antttagggacgacaccgtttgcctggccaagttgcacgaccgtaacacttacgagaagtattta ggagaggaatacgtgaaggccgttggcaatttgagaaagtgctctacctcttctcttttagaagcc tgtacctttagaagaccttaa

Exemplo 4: Construção de cassete de substituição de promotor do promotor da dissulfeto isomerase proteica (PDI) nativa pelo promotor AOX1 especificamente mutado

[000107] A construção de DNA transformado consiste nos primeiros 1000 pb do promotor PDI homólogo (com base na suposição de que o promotor PDI nativo pode consistir em aproximadamente 1000 pb), e um promotor AOX1 especificamente regulado e mutado (WO 2006/089329) induzindo a expressão da recombinase Flp, seguido pelo terminador de transcrição CYC1 e um cassete de resistência à zeocina (funcional em E. coli pelo promotor EM72, e em P. pastoris pelo promotor ILV5 e o terminador de transcrição AOD), seguido ainda por um promotor AOX1 especificamente mutado e regulado de forma diferente (WO 2006/089329) e os primeiros 500 pb do gene PDI homólogo. Os sítios de reconhecimento da recombinase são colocados depois dos primeiros 300 pb do promotor homólogo, e diretamente a montante do segundo promotor AOX1 específico (Fig. 3). Este fragmento de DNA foi classificado como DNA sinteticamente gerado com DNA2.0 (Menlo Park, EUA).

Exemplo 5: Transformação da construção em CBS7435 muts, confirmação da constelação genômica, propagação no meio com metanol e excisão e confirmação do cassete

[000108] Depois de transformação e seleção em placas de ágar, foi confirmado por PCR que 20 colônias carregavam o cassete de transformação integrado na orientação genômica correta.

[000109] Clones foram transferidos para placas de ágar com metanol mínimo por 5 dias (até que grandes colônias simples fossem formadas), no total de 3 vezes consecutivas. Depois disso, a excisão da região do DNA entre os sítios FRT (a maior parte da região de promotor homóloga, promotor AOX1 induzível forte e recombinase Flp, cassete de marcador de resistência) foi verificada por contra-remarcação ("counterrestreaking") em placas de YPhyD contendo marcador de seleção (zeocina) : clones positivos, i.e., aqueles onde ocorreu excisão, não conseguiram crescer nessas placas. A PCR de colônias comprovou a ocorrência da parte a montante do promotor homólogo apenas, e promotor AOX1 específico adjacente e gene PDI homólogo (Fig. 4, SEQ ID N° 5).SEQ ID N° 5: sequência obtida para o locos genômico de PDI

[000110] Negrito: região truncada do promotor PDI nativo (a partir da base na posição anterior 1000 pb a montante do gene PDI nativo), sobram 333 pb Itálico: promotor AOX1 mutado

[000111] Normal: gene PDI nativo (primeiras 892 bases) com sequência 5' kozak Subscrito: sítio FRT

[000112] aagggagacatattcggctattgtttactttgcgcccacagtagcgttaaga aacattgtttgttcgatttattgggctgttgataaattcaattgattacgttcgcatactagcta tcataaactaagcaccaccttacaccactttctcactgaagattttcgacatcaaatttctct tggatcaccatcaaccttgtgtctacatgtccttgtctttgaacctaaatcagatagccgtgc gggttgtgggcatattgcctcgtattccggagattcacattgccattcctaatatttttcagcg acgcaccgaagcttctacagagactcgaagttcctatactttctagagaataggaacttcagat ctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctc acacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcag gacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttg attggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcct ggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaaca tcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaac tgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaa gtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcggcataccgt ttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcg cttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgatta tgcattgtctccacactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttg acagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagctta ctttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacgacaacttgagaa gatcaaaaaacaactaattattgaattccgaaacqatqcaattcaactggaatattaaaactgtg gcaagtattttgtccgctctcacactagcacaagcaagtgatcaggaggctattgctccagagg actctcatgtcgtcaaattgactgaagccacttttgagtctttcatcaccagtaatcctcacgttttggc agagttttttgccccttggtgtggtcactgtaagaagttgggccctgaacttgtttctgctgccgagatt ttaaaggacaatgagcaggttaagattgctcaaattgattgtacggaggagaaggaattatgtca aggctacgaaattaaagggtatcctactttgaaggtgttccatggtgaggttgaggtcccaagtga ctatcaaggtcaaagacagagccaaagcattgtcagctatatgctaaagcagagtttaccccctg tcagtgaaatcaatgcaaccaaagatttagacgacacaatcgccgaggcaaaagagcccgtg attgtgcaagtactacctgcagcggaagatgcatccaacttggaatctaacaccacattttacgga gttgccggtactctcagagagaaattcacttttgtctccactaagtctactgattatgccaaaaaata cactagcgactcgactcct

[000113] gcctatttgcttgtcagacctggcgaggaacctagtgtttactctggtgaggagtt agatgagactcatttggtgcactggattgatattgagtccaaacctctatttggagacattgacgga tccaccttcaaatcatatgctgaagctaacatccctttagcctactatttctatgagaacgaagaac aa cgtgctgctgctgccgatattattaaaccttttgctaaagagcaacgtggcaaaattaactt

[000114] Por excisão do cassete de resistência, uma contrasseleção nesse antibiótico revelou cepas positivas por um comportamento de crescimento negativo (i.e., sem resistência ao antibiótico). Adicionalmente, PCR de colônias confirmou a constelação genômica pretendida. Uma das cepas positivas foi selecionada e denominada CBS7435 muts PDI platform.

Exemplo 6: Produção secretora de transferrina na cepa com níveis elevados de PDI homólogo em condições indutoras de metanol em microescala

[000115] Os genes codificando transferrina assim como transferrina não glicosilada (vide Exemplo 3) foram integrados no genoma da cepa hospedeira CBS7435 muts não tratada sob o controle de um promotor AOX1 especificamente mutado (WO 2006/089329) e da cepa correspondente com níveis potencialmente elevados de PDI homólogo como descrito acima. A ocorrência de informações genéticas para as duas transferrinas foi comprovada por PCR de colônia (iniciador normal ligando-se ao PAOX1, iniciador invertido ligando-se a ambos os genes de transferrina nos primeiros 80 pb). Com cultura em microescala, a cepa hospedeira básica CBS7435 não foi capaz de secretar transferrina de forma alguma (em níveis detectáveis por eletroforese capilar microfluida), embora a cepa com níveis potencialmente elevados de PDI homólogo tenha produzidos as duas variantes de transferrina detectáveis no sobrenadante (Tabela 1, Figuras 5 e 6). Isto foi indicativo do aumento da atividade de PDI pelo PAOX1 especificamente mutado suficientemente alta para promover o enrolamento/secreção das duas variantes de transferrina, ao contrário da cepa básica.

Tabela 1: Títulos da proteína alvo nos sobrenadantes de culturas em microescala para transferrina e transferrina não glicosilada produzidas pelas cepas CBS7435 muts, e CBS7435 muts PDI platform, respectivamente.

Exemplo 7: Produção secretora de transferrina e transferrina não glicosilada na cepa com níveis elevados de PDI homólogo em condições indutoras de metanol em culturas em bioreactor

[000116] Cepas CBS7435 muts PDI platform com cassetes de expressão de transferrina e transferrina não glicosilada integrados e taxas de secreção comprovadas (em comparação com cepas CBS7435 muts não secretoras) foram cultivadas sob condições controladas em biorreatores de 1 L. Depois de um tempo de processo total de 109 horas (90 horas de indução com metanol), o sobrenadante de fermentação foi analisado por eletroforese capilar microfluida. Depois de uma série de diluições e comparação com padrões interno e externo, concentrações elevadas das duas proteínas foram detectáveis (Tabela 2).

Tabela 2: Títulos estimados da proteína alvo em cultura em biorreatores para transferrina e transferrina não glicosilada produzidas pela cepa CBS7435 muts PDI platform.

Exemplo 8: Medição dos níveis de transcritos de PDI homólogo na cepa básica CBS7435 muts e na cepa com níveis potencialmente elevados de PDI homólogo

[000117] Os níveis de transcritos (com base em iniciadores hibridizados específicos para apresentar mRNA) foram analisados em amostras de fermentação em fase intermitente (glicerol presente em grandes quantidades), em fase intermitente com alimentação de glicerol (glicerol presente em quantidades desrepressoras ("derepressive") e vários pontos no tempo durante a fase de indução com metanol (fase de produção para proteínas recombinantes) (PlexPress, Helsinki, Finlândia). Quantidades iguais de biomassa de CBS7435 muts e CBS7435 muts PDI platform sem cassete de expressão recombinante integrado. A normalização foi feita por comparação com os níveis de expressão de genes zeladores a fim de relacionar as células metabolicamente ativas.

[000118] Embora durante a fase intermitente (glicerol elevado) os níveis de mRNA do gene PDI1 nativo fossem elevados na cepa CBS7435 muts (devido aos efeitos repressores de glicerol no promotor AOX1 específico que regula a expressão do gene PDI1 nas cepas CBS7435 muts PDI platform), em condições desrepressoras (fase intermitente com alimentação de glicerol) e durante todas as etapas de indução com metanol (fase de produção para proteínas recombinantes) os níveis de mRNA do gene PDI1 nativo foram aumentados em 60 vezes na cepa CBS7435 muts PDI platform ao contrário da CBS7435 muts.

Exemplo 9: Produção secretora de interleucina-2 e albumina sérica humana (HSA) na cepa com níveis elevados de PDI homólogo em condições indutoras de metanol em microescala e em condições de biorreator.

[000119] Por analogia com os exemplos descritos acima para transferrina e transferrina não glicosilada, o cassete de expressão para interleucina-2 (SEQ ID N° 6) ou HSA (SEQ ID N° 7) foi transformado no genoma do hospedeiro CBS7435 muts não tratado sob o controle de um promotor AOX1 especificamente mutado (WO 2006/089329) e da cepa correspondente com níveis elevados de PDI homólogo como descrito acima. A ocorrência de informações genéticas para os ambos genes foi comprovada por PCR de colônia (iniciador normal ligando-se ao PAOX1, iniciador invertido ligando-se ao gene de interleucina-2 ou HSA nos primeiros 80 pb).

[000120] Com cultura em microescala, ambas as cepas (a cepa básica CBS7435 muts assim como a cepa com níveis elevados de PDI homólogo) secretaram interleucina-2 ou HSA, mas em condições de biorreator rendimentos quase 2 vezes mais altos para HSA e rendimentos 4 vezes mais altos para interleucina-2 foram obtidos pela cepa CBS7435 muts PDI platform.

[000121] Iniciador HSA (SEQ ID N° 9)

[000122] 5' GGTCCTTGAATCTATGAG 3'

[000123] Iniciador IL2 (SEQ ID N° 10)

[000124] 5' CGTAGAAGAAGAGGTTGG 3'

[000125] SEQ ID N° 6 IL-2

[000126] gcaccaacctcttcttctacgaaaaagactcagcttcaattggagcaccttttctgg cttgcaaatgatcctgaacggtatcaacaactacaaaaaccctaaacttactagaatgtgacctc agttttacatgccaaagaaggctaccgaattgaagcacttgcaatgtctggaggaggagttgaa cattggaagaagttttgaacttggcacagtcgaagaacttccaccttagacctagagacttgatttc aaatcaacgtcatcgtcctggagcttaaggggtccgagactactttcatgtgtgagtacgctgaca gcagcgactattgtcgagttcttgaatagatggatcactttcgcccaatccatt atctccaccttaacctaa

[000127] SEQ ID N° 7 HSA

[000128] gatgcacacaaatcagaagttgctcatagattcaaggacctcggagaagagaa cttcaaggctcttgtccttatcgctttcgctcaataccttcagcaatgtccttttgaggaccacgttaagt tggtgaacgaagttaccgagttcgctaaaacttgcgtagctgacgaatctgctgagaactgtgaca agtcacttcacactctttttggtgacaagctttgtactgtcgctacccttcgtgaaacctacggcgaaa tggccgattgctgtgctaagcaggaacctgaaagaaacgaatgtttcttgcagcacaaggacgat aaccccaatcttcctcgtttggttcgtcctgaggtcgacgttatgtgcaccgcttttcatgacaacgaa gagactttcttaaagaaatacctttacgaaatcgctcgtcgtcacccatacttctacgctccagagct gttgttcttcgcaaagagatataaggctgctttcactgagtgttgccaagctgctgacaaggcagctt gtctattgcctaagcttgacgaattgcgagatgagggtaaagcatcttccgccaagcagagattga aatgcgcttccttgcagaagtttggtgagcgagctttcaaagcctgggccgtggctaggttgagcc aacgttttcctaaagctgagttcgctgaagtttctaagttggttactgatcttactaaggtgcacactga atgttgccacggtgaccttctggagtgtgctgatgaccgtgcagatttggctaagtatatttgtgaaa accaagattctatttcttctaaactaaaggaatgttgtgaaaagccacttcttgagaaaagtcactg tatcgctgaggtggagaacgacgagatgccagctgaccttcctagcctggctgctgatttcgttga atctaaggacgtatgcaagaattacgcagaggccaaggatgttttccttggcatgtttttgtacga gtacgctagaagacaccctgactactccgtagttctcttgctgaggttggcaaagacctacgagac taccctagagaagtgttgcgccgcagctgatcctcacgagtgttatgctaaagtttttgatgagttta aacctttggttgaggagccacaaaacttgattaagcagaactgcgagcttttcgaacaattggggg aatacaagttccaaaatgccttgctagtcaggtacaccaaaaaggtccctcaggtcagcacccc aaccttagtcgaggtgtccagaaatttgggcaaagttggttctaaatgttgcaagcacccagaag ctaagaggatgccatgtgccgaagactacctttccgtcgttctgaaccaactctgtgttttgcacga aaagactccagtctcagaccgtgtcacgaaatgttgtaccgagtctctggttaacagaagaccttg tttctctgctttggaagttgacgaaacttacgtcccaaaggagttcaacgcggagactttcaccttcc acgccgacatttgtacactttccgagaaggaaagacaaatcaagaagcaaaccgcactagtt gaattggttaaacataagcctaaggctaccaaagaacaattgaaagcagttatggatgattttgc ggctttcgtggaaaagtgttgtaaggctgatgacaaggaaacctgtttcgccgaagaaggtaag aagttagtc gccgcctctcaggctgctcttggactgtaa

Sumário:

[000129] Um cruzamento duplo correto do cassete de recombinação no promotor PDI (homologia 5’) e do início do gene PDI (homologia 3’) levou a uma integração insercional do cassete de expressão de recombinase, do cassete de resistência e da variante do promotor AOX1 específico entre o promotor PDI nativo e o gene PDI nativo. O crescimento contínuo em glicerol ou glicose reprimiu bastante a transcrição da variante do promotor AOX1 induzindo a expressão da recombinase, e por conseguinte, nenhuma excisão ocorreu nessas condições.

[000130] Com o crescimento em meio contendo metanol, a transcrição do gene da recombinase teve início e subsequentemente resultou na excisão do fragmento de DNA entre os dois sítios de reconhecimento da recombinase Flp, excisando assim grandes partes do promotor PDI nativo, do cassete de expressão de recombinase assim como do cassete de resistência, deixando apenas o promotor AOX1 especificamente mutado diretamente a montante do gene PDI nativo.

[000131] Em uma abordagem alternativa com uma integração direta do promotor PAOX1 especificamente mutado entre o promotor PDI nativo e o gene PDI, a expressão de transferrina e transferrina não glicosilada não foi possível. Isto pode ser devido aos efeitos de repressão desencadeados pelo promotor PDI nativo a montante, ou pela transcrição ineficiente do gene PDI a partir do PAOX1 mutado causada pelo sítio FRT remanescente entre o promotor AOX1 mutado e o gene PDI.

[000132] Por excisão do cassete de resistência, uma contrasseleção nesse antibiótico revelou cepas positivas por um comportamento de crescimento negativo (i.e., sem resistência ao antibiótico). Adicionalmente, PCR de colônia confirmou a constelação genômica pretendida. Uma das cepas positivas foi selecionada e denominada CBS7435 muts PDI platform.

[000133] Culturas da cepa parental CBS7435 muts e da cepa recém- gerada CBS7435 muts PDI platform foram cultivadas em condições indutoras de metanol clássicas e controladas em biorreatores de 1 L, sem a expressão heteróloga de qualquer gene alvo a partir de um cassete de expressão recombinante. Os níveis de transcritos para a PDI nativa para ambas as cepas em diferentes momentos do tempo de cultura revelaram que em condições intermitentes com glicerol, a ocorrência de mRNA para o gene PDI1 foi maior na cepa parental do que na cepa CBS7435 muts PDI platform. Com o fornecimento de baixos níveis de glicerol assim como em condições indutoras de metanol, significativamente mais mRNA (60 vezes) estava presente na cepa CBS7435 muts PDI platform em comparação com a cepa CBS7435 muts.

[000134] Para verificar a quantidade necessária de níveis aumentados de PDI nativo para expressão secretora de transferrina e/ou transferrina não glicosilada, ambos os genes foram (separadamente) transformados nas duas cepas, CBS7435 muts e CBS7435 muts PDI platform. Depois de cultura em microescala, os sobrenadantes foram analisados por eletroforese capilar microfluida. Embora na cepa CBS7435 muts nenhuma proteína-alvo fosse detectável, a cepa CBS7435 muts PDI platform obviamente produziu bastante PDI nativa (por suprarregulação transcricional da variante do promotor AOX1 introduzida) para secretar eficientemente ambas as proteínas (figuras 5 e 6). A cultura em biorreator em condições indutoras de metanol controladas confirmou a presença das duas proteínas-alvo altamente ligadas a dissulfeto em concentrações elevadas.

[000135] A aplicação de variantes específicas do promotor AOX1 (WO 2006/089329) para produção aumentada de transferrina e transferrina não glicosilada em condições livres de metanol também mostrou funcionar de forma eficiente em condições em microescala e de biorreator, usando a cepa CBS7435 muts PDI platform para expressão.

[000136] Para proteínas alvo que também são produzidas em níveis elevados pela cepa CBS7435 muts, i.e., sem um aumento de PDI nativa ou superprodução de PDI heteróloga, como por exemplo, albumina sérica humana (HSA), a cepa CBS7435 muts PDI platform também proporciona um meio de aumentar os níveis de produção. Apesar de a cepa CBS7435 ter produzido 8g/L de HSA no sobrenadante da cultura, a cepa CBS7435 muts PDI platform secretou 14g/L de HSA em condições idênticas com o uso do promotor, números de cópias integradas de cassete de expressão e condições de cultura.

[000137] Como a HSA requer a formação de 17 ligações dissulfeto, foi testado um outro modelo de proteína que precisa de apenas 1 ligação dissulfeto para ser formada por seu grupo nativo. A interleucina-2 foi expressa com um rendimento 4 vezes mais alto a partir da cepa CBS7435 muts PDI platform em comparação com a cepa CBS7435 muts em condições controladas em um biorreator.

Exemplo 10: Produção secretora de uma proteína de fusão com HSA (HSA-Interferon (alfa2a) ) na cepa com níveis elevados de PDI homólogo em condições indutoras de metanol em microescala em comparação direta com a produção secretora na cepa com PDI "nativa" expressa recombinantemente em uma cópia, e na cepa de tipo selvagem sem qualquer modificação.

[000138] Por analogia com os exemplos descritos acima, o cassete de expressão para HSA-Interferon (alfa2a) (SEQ ID N° 16) sob o controle de um promotor AOX1 especificamente mutado (WO 2006/ 089329) foi transformado no genoma da cepa hospedeira host CBS7435 muts não tratada e da cepa correspondente com níveis elevados de PDI homólogo como descrito acima. Adicionalmente, a cepa hospedeira CBS7435 muts não tratada foi transformada tanto o cassete de expressão para HSA-Interferon (alfa2a) como com um plasmídio diferente ancorando um cassete de expressão do gene PDI nativo sob o controle do mesmo promotor AOX1 mutado que está controlando a expressão do gene PDI nativo na cepa com níveis elevados de PDI homólogo. A ocorrência de informações genéticas para todos os genes introduzidos foi comprovada por PCR de colônia (iniciador normal ligando-se ao PAOX1, iniciador invertido ligando-se ao interferon (alfa2a) ou gene HSA nos primeiros 80 pb). A ocorrência de informações genéticas para o gene PDI nativo introduzido de forma recombinante foi comprovada por PCR de colônia (iniciador normal ligando-se ao gene PDI nativo, iniciador invertido ligando-se ao marcador de resistência contra geneticina).

[000139] Com cultura em microescala, todas as 3 cepas (cepa básica CBS7435 muts, cepa com níveis elevados de PDI homólogo, e cepa básica coexpressando o PDI nativo também de forma recombinante) secretaram HSA-Interferon (alfa2a). Embora a coexpressão do gene PDI nativo de forma recombinante tenha aumentado os níveis secretados de HSA-Interferon (alfa2a) em ~ 60% em comparação com a cepa básica CBS7435 muts, a cepa com níveis elevados de PDI homólogo aumentou ainda os títulos em 57% em comparação com a cepa básica coexpressando o PDI nativo também de forma recombinante (Fig. 7) Iniciador Interferon (alfa2a) (SEQ ID N° 13)

[000140] 5' CTTGAACCCAATGAGTGTG 3' Iniciador nativo PDI (SEQ ID N° 14)

[000141] 5' GAAGCTGAAGAAGAAGCTG 3' Iniciador marcador de resistência (SEQ ID N° 15)

[000142] 5' GATTGTCGCACCTGATTGCC 3'

[000143] SEQ ID N° 16 HSA-Interferon (alfa2a)

[000144] normal: HSA

[000145] sublinhado: interferon (alfa2a)

[000146] gatgcacacaaatcagaagttgctcatagattcaaggacctcggagaagagaa cttcaaggctcttgtccttatcgctttcgctcaataccttcagcaatgtccttttgaggaccacgttaagt tggtgaacgaagttaccgagttcgctaaaacttgcgtagctgacgaatctgctgagaactgtgac aagtcacttcacactctttttggtgacaagctttgtactgtcgctacccttcgtgaaacctacggcgaa atggccgattgctgtgctaagcaggaacctgaaagaaacgaatgtttcttgcagcacaaggacg ataaccccaatcttcctcgtttggttcgtcctgaggtcgacgttatgtgcaccgcttttcatgacaacg aagagactttcttaaagaaatacctttacgaaatcgctcgtcgtcacccatacttctacgctccaga gctgttgttcttcgcaaagagatataaggctgctttcactgagtgttgccaagctgctgacaaggca gcttgtctattgcctaagcttgacgaattgcgagatgagggtaaagcatcttccgccaagcagag attgaaatgcgcttccttgcagaagtttggtgagcgagctttcaaagcctgggccgtggctaggtt gagccaacgttttcctaaagctgagttcgctgaagtttctaagttggttactgatcttactaaggtgc acactgaatgttgccacggtgaccttctggagtgtgctgatgaccgtgcagatttggctaagtata tttgtgaaaaccaagattctatttcttctaaactaaaggaatgttgtgaaaagccacttcttgagaaa agtcactgtatcgctgaggtggagaacgacgagatgccagctgaccttcctagcctggctgctg atttcgttgaatctaaggacgtatgcaagaattacgcagaggccaaggatgttttccttggcatgttt ttgtacgagtacgctagaagacaccctgactactccgtagttctcttgctgaggttggcaaagacc tacgagactaccctagagaagtgttgcgccgcagctgatcctcacgagtgttatgctaaagttttt gatgagtttaaacctttggttgaggagccacaaaacttgattaagcagaactgcgagcttttcgaac aattgggggaatacaagttccaaaatgccttgctagtcaggtacaccaaaaaggtccctcaggt cagcaccccaaccttagtcgaggtgtccagaaatttgggcaaagttggttctaaatgttgcaagc acccagaagctaagaggatgccatgtgccgaagactacctttccgtcgttctgaaccaactctg tgttttgcacgaaaagactccagtctcagaccgtgtcacgaaatgttgtaccgagtctctggttaa cagaagaccttgtttctctgctttggaagttgacgaaacttacgtcccaaaggagttcaacgcgga gactttcaccttccacgccgacatttgtacactttccgagaaggaaagacaaatcaagaagcaa accgcactagttgaattggttaaacataagcctaaggctaccaaagaacaattgaaagcagttat ggatgattttgcggctttcgtggaaaagtgttgtaaggctgatgacaaggaaacctgtttcgccgaa gaaggtaagaagttagtcgccgcctctcaggctgctcttggactgtgcgacttgcctcaaacacac tcattgggtteaagacgtactttaatgcttctcgctcagatgagaaagatttctctgttctcttgtctaaa ggaccgtcacgacttcggttttccacaagaggaatttggaaaccaattccaaaaagctgagacta ttcccgttttacacgaaatgatccaacagattttcaaccttttctctactaaggattcttccgctgcatgg gacgaaactttgctcgacaaattctacaccgaactttaccaacagcttaatgacctagaagcctg cgtgatacagggcgtcggtgtcacagaaacgccattgatgaaggaggatagcatcttggccgtg cgtaagtatttccaaagaattactttgtaccttaaggaaaagaaatactctccttgtgcttgggaag tagtcagagctgaaattatgagatccttttccctttctactaacttgcaagagtccttaagatcgaagg aataa

Exemplo 11: Produção secretora de uma molécula de Fab (fragmento de ligação a antígeno) na cepa com níveis elevados de Kar2 homólogo em condições indutoras de metanol em microescala em comparação direta com a produção secretora na cepa com Kar "nativo" expresso recombinantemente em uma cópia, e na cepa de tipo selvagem sem qualquer modificação.

[000147] Por analogia com os exemplos descritos acima, os cassetes de expressão para a cadeia leve de Fab (SEQ ID N° 20) e para a cadeia pesada de Fab (SEQ ID N° 21) sob o controle de um promotor AOX1 especificamente mutado (WO 2006/089329) foram transformados no genoma da cepa hospedeira CBS7435 não tratada e da cepa correspondente com níveis elevados de Kar2 homólogo. Adicionalmente, a cepa hospedeira CBS7435 muts não tratada foi transformada com os cassetes de expressão para a cadeia leve e para a cadeia pesada e um plasmífio diferentes ancorando um cassete de expressão do gene Kar2 nativo sob o controle do mesmo promotor AOX1 mutado que está controlando a expressão do gene Kar2 nativo na cepa com níveis elevados de Kar2 homólogo. A ocorrência de informações genéticas para todos os genes introduzidos foi comprovada por PCR de colônia (iniciador normal ligando-se ao PAOX1, iniciador invertido ligando-se aos genes das cadeias leve e pesada nos primeiros 80 pb). A ocorrência de informações genéticas para o gene Kar2 nativo introduzido de forma recombinante foi comprovada por PCR de colônia (iniciador normal ligando-se ao gene PDI nativo, iniciador invertido ligando-se ao marcador de resistência contra geneticina).

[000148] Com cultura em microescala, todas as 3 cepas (cepa básica CBS7435 muts, cepa com níveis elevados de Kar2 homólogo, e cepa básica coexpressando o Kar2 nativo também de forma recombinante) secretaram Fab. Embora a coexpressão do gene Kar2 nativo de forma recombinante tenham aumentado os níveis secretados de Fab em ~ 47 % em comparação com a cepa básica CBS7435 muts, a cepa com níveis elevados de Kar2 homólogo aumentou ainda os títulos em 27% em comparação com a cepa básica coexpressando o Kar2 nativo também de forma recombinante (Fig. 8) Iniciador cadeia leve de Fab (SEQ ID N° 17)

[000149] 5' CAGAAACGGAAGGAGGTTG 3' Iniciador cadeia pesada de Fab (SEQ ID N° 18)

[000150] 5' CTGACTTCAGCTCCAGATTG 3 ' Iniciador Kar2 (SEQ ID N° 19)

[000151] 5' GTACTCCACCTGGTGGTC 3'

[000152] SEQ ID N° 20 cadeia leve de Fab

[000153] caatccgtcctgacccaacctccttccgtttctgctgctcctggtcaaaaggtcacc atttcctgttctggatcttcatctaacattggaaagaattacgtttcctggtaccaacagttaccaggtg ctgcacctaagttacttatctttgatgacactcaaagaccatccggaatcccagacagattctctgg ttctaagtctggtacttccgcaaccctggccatcaccggattgcagactggtgatgaggccgact actattgcggtacttgggactcttctctgtctactggtcaacttttcggaggtggtaccaaattgaccg ttttgggtcagcctaaggctgctccatctgttactctttttcctccatcttcagaggaattgcaggcca acaaggctactcttgtttgtttgatttctgacttctaccctggtgcagtcactgtggcatggaaagctga ttcatctccagtcaaagctggtgtggagactaccactccatctaagcaatctaacaacaaatacg cagcttcatcctatttgtctttgaccccagagcagtggaagtcccaccgtteatactcctgtcaagtta cccatgagggttctactgttgaaaagactatggcccacgctgaatgctcctaa

[000154] SEQ ID N° 21 cadeia pesada de Fab

[000155] caagtgcaagttgttcaatctggagctgaagtcagaaagccaggagcttctgttaa agtgtcatgtaaagtttctggtttcactttgaccggtttatccattcactgggttagacaagcacctggt aaaggtttggaatggatgggtggatttggtccagaggaaaatgagattatctatgctcaaaagttc cagggtagagtctccatgaccgaggacacttccaccaatactgcatacatggaattgtcctctc ttagatcagaagatactgctgtctactattgtgctactggtggtaactattacaacttgtggactggt tactaccctttagcttactggggtcagggtactctggttactgtctcttcagcctctactaagggacca tctgtttttccacttgctccttcctctaagtccacctctggtggaaccgctgcactgggttgtttggtca aggattacttcccagagccagttaccgtgtcttggaactctggtgcccttacttctggtgtccatacct tcccagccgttttgcagtcatctggactttactccctttcctctgttgtcactgttccttcctcctctttggg aactcaaacctacatctgcaacgttaaccacaagccttctaacaccaaggttgacaaaaaggtg gagcctaagtcttgctaa

Claims (9)

1. Célula de levedura geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que compreende - pelo menos um promotor recombinante operacionalmente ligado a pelo menos um gene de ocorrência natural no genoma da célula de levedura e codificando um polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas na referida célula, o referido pelo menos um gene estando localizado no locus genômico nativo do referido pelo menos um gene da célula de levedura de tipo selvagem não modificada geneticamente, onde o promotor de ocorrência natural do pelo menos um gene codificando o polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese é inativado por pelo menos uma mutação no interior do referido promotor de ocorrência natural e - um cassete de expressão de secreção compreendendo uma molécula de ácido nucleico recombinante codificando uma proteína ou polipeptídio de interesse, em que o pelo menos um gene que codifica um polipeptídeo ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídeos ou proteínas dentro da referida célula é um gene selecionado do grupo que consiste em pdi, kar2 e canx e o promotor de levedura é selecionado do grupo consistindo no promotor A0X1, promotor GAL1, promotor PGK, promotor ADH, promotor FDH e promotor FLD e em que a pelo menos uma mutação do promotor de ocorrência natural do pelo menos um gene que codifica o polipeptídeo ou proteína que suporta a biossíntese é uma deleção.

2. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido pelo menos um promotor recombinante permite que a célula de levedura geneticamente modificada produza pelo menos 100% mais, ou pelo menos 200% mais, ou pelo menos 300% mais, do polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese de polipeptídios ou proteínas em comparação com a célula de levedura de tipo selvagem não modificada geneticamente.

3. Célula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o promotor recombinante é um promotor de levedura induzível geneticamente modificado ou um promotor de levedura induzível não modificado geneticamente.

4. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o promotor de levedura é um promotor AOX1 compreendendo pelo menos uma mutação nos nucleotídeos 170 a 235 ou 694 a 723 ou 694 a 723 e 737 a 738 da SEQ ID N° 1.

5. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a célula de levedura é uma célula de levedura metilotrófica, selecionada do grupo que consiste em uma levedura do gênero da Pichia, de preferência Pichia pastoris, Candida boidinii e Hansenula polymorpha.

6. Célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos 50 nucleotídeos, ou pelo menos 100 nucleotídeos, ou pelo menos 200 nucleotídeos, ou pelo menos 500 nucleotídeos, do promotor de ocorrência natural do pelo menos um gene codificando o polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese, de dissulfeto isomerase, é deletado.

7. Célula, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico codificando uma proteína ou polipeptídio de interesse faz parte de um vetor ou é integrada no genoma.

8. Método para produzir uma proteína ou polipeptídio recom- binante de interesse, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - oferecer uma célula de levedura geneticamente modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 - cultivar a referida célula de levedura geneticamente modificada em um meio de cultura em condições que permitem a expressão da proteína ou polipeptídio de interesse e do pelo menos um gene codificando o polipeptídio ou proteína que suporta a biossíntese e - isolar a proteína ou polipeptídio de interesse do meio de cultura.

9. Uso de uma célula, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é para produzir uma proteína ou polipeptídio recombinante.

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