KR20140060552A

KR20140060552A - 단백질 발현

Info

Publication number: KR20140060552A
Application number: KR1020147008224A
Authority: KR
Inventors: 롤란트 버이스; 토마스 푸르카르토퍼
Original assignee: 브이티유 홀딩 게엠베하
Priority date: 2011-08-31
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2014-05-20
Also published as: AU2012300885A1; TN2014000069A1; EP2681308A1; AU2012300885B2; EP2681308B1; CA2847061A1; CA2847061C; KR101971914B1; CN103906833A; BR112014004830B1; US20140212923A1; JP6085605B2; CN103906833B; EP2565262A1; US9206454B2; BR112014004830A2; WO2013030329A1; MA35440B1; SA112330816B1; JP2014525255A

Abstract

본 발명은 세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 재조합 프로모터(상기 하나 이상의 유전자는 유전적으로 개질되지 않은 야생형 효모 세포의 천연 게놈 유전자위에 위치하며, 여기서 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 천연 생성 프로모터는 상기 천연 생성 프로모터 내에서 하나 이상의 돌연변이에 의해 불활성화됨) 및 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 분비 카세트를 포함하는 유전적으로 개질된 효모 세포, 및 이러한 세포를 이용한 관심 재조합 단백질 또는 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

단백질 발현{PROTEIN EXPRESSION}

본 발명은 세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 하나 이상의 폴리펩티드 또는 단백질을 과발현할 수 있는 유전적으로 개질된 효모 세포에 관한 것이다.

샤페론들, 특히 단백질 디설피드 이성화효소(PDI)는 특히 진핵생물들의 소포체에서 생성되는 널리 공지된 효소들이다. 샤페론들은 세포들 내에서 단백질들 및 폴리펩티드들 같은 거대분자 구조들의 접기 또는 풀기 및 조립 또는 분해를 보조한다. 예를 들어 PDI는 단백질들 및 폴리펩티드들 내에서 시스테인 잔기들 간 디설피드 결합들의 형성, 절단 및 재배열을 촉매작용할 수 있다. 상기 효소는 진핵생물 세포들에서 발현되는 디설피드 가교들 함유 단백질들의 정확한 접기에 관여하므로, PDI는 단백질 발현에서 결정적 역할을 담당한다. 재조합 단백질 발현에 자주 이용되는 대장균을 포함하는 여러 원핵생물들은 PDI 활성이 없다.

디설피드 결합들을 포함하는 정확히 접힌 폴리펩티드들 및 단백질들을 발현하기 위해서, 당분야에서는 관심 폴리펩티드 또는 단백질에 이어서 PDI도 발현시킬 것이 제시된다. 재조합 숙주 세포에서 PDI의 공-발현은 정확히 접힌 산물들로 이어질 뿐만 아니라 PDI를 발현하지 않거나 PDI를 공동 발현하는 세포들에 비해 PDI를 더 소량 발현하는 세포들에 비해 더 높은 산물 수율에도 관여한다(예로 WO　94/08012 참고). 또한, Butz JA 등(Biotech Bioeng 84(2003):292-304)에서 보고된 바와 같이 예외들이 존재하기는 하지만, 자연적으로 PDI를 발현하는 진핵생물 세포들에서의 PDI의 형성 증가는 관심 단백질 또는 폴리펩티드의 크게 증가된 생합성을 일으키는 것으로 나타났다.

WO　93/25676에는 PDI를 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 카세트들을 숙주 세포, 특히 효모 세포의 게놈 내로 통합하는 것이 제시된다. 예를 들어, 이러한 발현 카세트들의 효모 세포들의 게놈 내로의 통합은 쉬운 것이 아니다. 통합 절차 과정에 걸쳐, 발현 카세트가 1회를 초과하여 그리고 잠재적으로는 상이한 부위들에서 게놈 내로 통합될 가능성이 높다. 따라서 동일한 특성들을 갖는 효모 세포들을 생성하는 것이 항상 가능한 것이 아니다. 또한 효모 세포의 게놈 내로 통합된 핵산 분자의 발현 효율은 통합 부위에 크게 의존한다는 것이 또한 당분야에 알려져 있다. 이는, 세포 내 하나의 유전자위에서의 발현 카세트의 통합이 게놈 내 또 다른 부위에서 발현 카세트가 통합된 세포들에 비해 상이한 결과들을 낼 가능성이 가장 높을 것임을 의미한다. 이러한 재조합 PDI 발현 카세트들을 포함하는 효모 세포들은 여전히 그 인코딩 유전자가 세포 내에서 자연적으로 확인될 수 있는 PDI를 생성한다. 따라서 이러한 세포들은 한 편으로는 발현 카세트로부터의 PDI를 그리고 다른 한 편으로는 세포의 유전자에 자연적으로 존재하는 PDI를 발현한다. 이는 배양 절차들 과정에서 세포 내에 다양한 PDI 수준으로 이어질 수 있다. 또한, 표적 단백질(들)의 생성은 전사 또는 번역을 위한 대사적 경쟁으로 인해 재조합 발현 카세트로부터의 PDI 과발현에 의해 부정적으로 영향 받을 수 있다(Butz JA 등, Biotech Bioeng 84(2003):292-304).

WO　93/25676에 제안된 바와 같은 재조합 발현 카세트들을 사용하는 중요한 추가적 단점은 PDI를 인코딩하는 유전자를 갖는 것 하나와 숙주 세포 내에서 발현될 하나 이상의 관심 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 또 하나의 둘 이상의 핵산 구축물들로 효모 세포를 공-형질전환해야 한다는 것이다(Gupta CS 등, J Mol Endocrin 22(1999):273-283). 공-형질전환은 실제로 종종 클론 선택 과정에서 위양성 클론들을 갖는 문제들로 이어지는, 한 번에 둘 이상의 상이한 선택 마커들의 제공을 필요로 한다. 대안적으로 분리된 형질전환들, 예로 PDI를 인코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 구축물의 첫 번째 형질전환, 및 숙주 세포 내에서 발현될 하나 이상의 관심 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 핵산 구축물의 두 번째 형질전환을 포함하는 일련의 형질전환 전략이 필요할 수 있다(Payne MS 등, Gene 194(1997):179-182). 따라서 클론별 편차들이 생기기 쉽다. PDI를 인코딩하는 유전자뿐만 아니라 숙주 세포 내에서 발현될 하나 이상의 관심 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 둘 다 포함하는 하나의 핵산 구축물의 형질전환은 실제로 핵산 구축물의 큰 분자량으로 인해 낮은 형질전환 효율들의 제약으로 이어진다. 또한, 잠재적인 플라스미드 불안정성들로 일어나는 어려움들이 통합된 또는 염색체외 형태에 존재한다(Finnis CJA 등, Microbial Cell Factories 9(2010):87).

Subramanian 등(PNAS 103(2006): 939-944)에서는 전사 부재의 영향 및 이에 따른 pbn1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 이용 가능성을 연구하기 위한 pbn1 유전자의 프로모터의 재배치를 보고한다. 저자들은 Pbn1p가 소포체에서 내강 단백질들의 분해를 위해 필요함을 확인하였다.

본 발명의 하나의 목적은 당분야에 공지된 방법들에 비해 더 높은 수율로 관심 폴리펩티드 또는 단백질을 합성할 수 있도록 하는 수단들 및 방법들을 제공하는 것이다.

따라서 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 재조합 관심 단백질 또는 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다:

- 하기를 포함하는 유전적으로 개질된 효모 세포를 제공하는 단계:

a) 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 분비 카세트 및

b) 상기 세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 재조합 프로모터(상기 하나 이상의 유전자는 유전적으로 개질되지 않은 야생형 효모 세포의 천연 게놈 유전자위에 위치하며, 여기서 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 천연 생성 프로모터는 상기 천연 생성 프로모터 내에서 하나 이상의 돌연변이에 의해 불활성화됨),

- 관심 단백질 또는 폴리펩티드 및 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 허용하는 조건들 하에 상기 유전적으로 개질된 효모 세포를 배양 배지 중에 배양하는 단계 및

- 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 배양 배지에서 단리하는 단계.

본 발명은 또한 하기를 포함하는 유전적으로 개질된 효모 세포에 관한 것이다:

- 상기 세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 재조합 프로모터(상기 하나 이상의 유전자는 유전적으로 개질되지 않은 야생형 효모 세포의 천연 게놈 유전자위에 위치하며, 여기서 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 천연 생성 프로모터는 상기 천연 생성 프로모터 내에서 하나 이상의 돌연변이에 의해 불활성화됨) 및

- 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 분비 카세트.

본 발명의 추가 측면은 상기 세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 재조합 프로모터를 포함하는 유전적으로 개질된 효모 세포에 관한 것으로, 상기 하나 이상의 유전자는 유전적으로 개질되지 않은 야생형 효모 세포의 천연 게놈 유전자위에 위치하며, 여기서 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 천연 생성 프로모터는 상기 천연 생성 프로모터 내에서 하나 이상의 돌연변이에 의해 불활성화된다.

놀랍게도 숙주 세포의 게놈에서 천연 생성되는 하나 이상의 유전자에 작동 가능하게 연결된 재조합 프로모터를 포함하고 상기 세포 내에서 재조합 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 세포들은 천연 생성 프로모터가 여전히 활성이 있는 경우(전사되고/되거나 번역된 유전자 산물을 측정하여 결정되는 그 천연 활성의 최대 10%, 바람직하게는 최대 5%, 더 바람직하게는 최대 2%, 보다 바람직하게는 최대 1% 이상) 또는 적어도 새로 도입된 프로모터 상류에 전장으로 존재하는 경우, 관심 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 생성할 수 없거나 또는 대등한 숙주 세포들에 비해 적어도 훨씬 더 적은 정도로 생성할 수 있는 것으로 나타났다. 따라서 천연 생성 프로모터는 상기 프로모터를 돌연변이화하여 불활성화하는 것이 필요하다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 이러한 불활성화는 여기에 자연적으로 연결된 유전자의 측정 불가능한 전사 및/또는 번역으로 이어진다. 그러나 "불활성화된"이란 용어에는 또한 그 천연 활성의 최대 10%, 바람직하게는 최대 5%, 더 바람직하게는 최대 2%, 보다 바람직하게는 최대 1% 이상의 잔여 프로모터 활성이 포함된다. 프로모터 활성은 당분야에 공지된 방법들을 이용하여 전사된 유전자 및/또는 번역된 유전자 산물의 측정에 의해 단순히 결정될 수 있다.

본 발명에 따르면, 효모 세포는 상기 세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 천연 생성 유전자들에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의, 바람직하게는 하나의 재조합 프로모터를 포함할 수 있다. 하나의 그리고 동일한 프로모터가 세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 둘 이상의(즉, 상이한) 천연 생성 유전자들에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다른 한 편으로는 하나의 동일한 프로모터의 하나를 초과하는 복제물이 여기에 작동 가능하게 연결된 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 천연 생성 유전자들을 포함하는 세포를 제공할 수도 있다. 이는 본 발명의 효모 세포가, 예로 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나의 유전자에 작동 가능하게 연결된 하나의 프로모터 그리고 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 또 다른 유전자에 대한 또 다른 프로모터를 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 물론, 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나를 초과하는 유전자에 하나의 특정 프로모터를 작동 가능하게 연결하는 것도 가능할 것이다.

"폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자"는 세포 내에서 폴리펩티드들 및 단백질들의 재조합 및/또는 천연 발현을 활발하게 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자이다. 상기 폴리펩티드 또는 단백질이 발현되지 않거나 기준 세포(예로 야생형 세포)에 비해 더 적은 정도로 발현되는 경우, 천연 및/또는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드는 이들의 발현 또는 분비 지지 폴리펩티드들 또는 단백질들이 정상 수준으로 세포 내에 존재하는 세포에 비해 전혀 발현 또는 분비되지 않거나 또는 훨씬 더 적은 정도로 발현 또는 분비된다.

본원에서 사용되는 "재조합 프로모터"라는 용어는 숙주 세포 내에서 재조합 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자의 상류 영역에서 상기 유전자의 전사를 조절하기 위해 게놈 내에서 천연 생성되지 않는 프로모터를 나타낸다. 재조합 프로모터는 재조합 프로모터가 숙주 세포 내에서 기능적인 한(즉, 여기에 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사를 조절할 수 있는 한) 동일하거나 또 다른 효모 세포에서 유래된 프로모터 또는 임의의 다른 원천에서 유래된 이종성 프로모터일 수 있다. 물론 "프로모터"라는 용어에는 야생형 프로모터의 단편들이 여기에 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사 속도를 조절할 수 있는 한, 야생형 프로모터의 단편들도 포함된다.

"천연 게놈 유전자위"란 천연 생성 게놈 서열을 나타낸다.

"작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 숙주 세포 내에서 숙주 세포의 작용에 의해 조절 요소들이 인코딩 서열의 발현을 지시할 수 있도록 하는 배치(들)로 코딩 서열에 대한 전사 및 임의의 번역 조절 요소들이 인코딩 서열에 공유 부착된 임의 구조를 나타낸다.

본원에서 사용되는 "카세트"라는 용어는 상기 유전자가 뉴클레오티드 서열에 존재하는 하나 이상의 조절 서열들에 작동 가능하게 연결되도록 삽입되는 경우 특정 유전자를 발현할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 따라서, 예를 들어 발현 카세트는 글루코오스 유도를 통해 발현되기 원하는 이종성 유전자를 포함할 수 있다. 따라서 본 발명의 발현 카세트들은 유도 시 임의 개수의 이종성 유전자들의 발현을 촉진하는 데 유용하다. 또한, 본 발명의 카세트는 신호 펩티드에 융합된 폴리펩티드 또는 단백질의 분비를 허용하는 신호 펩티드에 대해 인코딩하는 핵산 연신물을 함유한다. 이러한 카세트는 본 발명에 따르면 "분비 카세트"를 나타낸다. 분비 신호 서열은 효모 세포 내에서 분비 신호로 사용되거나 당분야에 통상적으로 공지된(예로 알파-인자 또는 알파 교배 인자") 임의 서열일 수 있다. 본 발명의 특정한 바람직한 구현예에 따르면, 상기 하나 이상의 재조합 프로모터는 유전적으로 개질된 효모 세포가 유전적으로 개질되지 않은 야생형 효모 세포에 비해 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질의 적어도 100% 초과, 바람직하게는 적어도 200% 초과, 더 바람직하게는 적어도 300% 초과를 생성하도록 할 수 있다.

상기 세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 재조합 프로모터는 유도성 또는 항시성 프로모터일 수 있다(효모 세포들에서). 각각의 프로모터들은 당분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 적합한 프로모터들은 세포가 상기 세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자에 연관된 천연 생성 프로모터를 포함하는 야생형 효모 세포로서 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 적어도 100%(200%, 300%, 400%, 500%, ...) 초과를 생성할 수 있도록 한다.

세포 내에서 특정 단백질 또는 폴리펩티드의 발현율을 확인하는 방법들은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 상기 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 세포들 및 항체들의 방해가 관여될 수 있다.

상기 정의된 바와 같은 핵산 분자들을 수반하는 본 발명의 효모 세포는 통상적인 그리고 확립된 영양 배지들을 이용하는 통상적 방법들을 이용하여 배양될 수 있다. 재조합 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 제조하기 위해, 세포들은 상기 폴리펩티드들 및 단백질들의 "발현을 허용하는 조건들 하에" 배양되어야 한다. 이는 배양 배지에 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질 및/또는 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자들에 작동 가능하게 연결된 프로모터들을 활성화하기 위해 물질들이 첨가되거나 제거될 수 있음을 의미한다(물질들의 제거는 배양 배지의 변경에 의해 일어날 수 있음).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 세포 내에서 (천연 및/또는 재조합) 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자는 샤페론이다.

본원에서 사용되는 "샤페론들"은 다른 거대분자 단백질성 구조들의 접기 또는 풀기 및 조립 또는 분해를 보조하지만 구조들이 접기 및/또는 조립 절차들을 완료하고 이들의 정상적 생물학적 기능들을 수행하는 경우 이들 구조들에서 일어나지 않는 폴리펩티드들 및 단백질들을 나타낸다. 샤페론들의 한 주요 기능은 새로 합성된 폴리펩티드쇄들 및 조립된 서브유닛들이 모두 비기능적 구조들로 응집하는 것을 방지하는 것이다. 본 발명에 따른 "샤페론들"에는 단백질 디설피드 이성화효소와 같은 "단백질 폴딩촉매효소들"이 또한 포함된다. 본 발명의 샤페론들은 바람직하게는 적절한 세포성 구획들(예로 분비된 재조합 단백질들에 대한 분비 경로를 따른 소포체(ER) 및/또는 골지체 및/또는 소포들)에 존재한다.

유리하게는 야생형 샤페론 프로모터뿐만 아니라 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 다른 프로모터들의 불활성화는 유전적으로 개질된 효모 세포의 생활성에 부정적으로 영향을 미치지 않는다. 상기 프로모터의 불활성화가 치명적이거나 숙주 세포의 생활성을 심각하게 감소시키는 경우, 샤페론 프로모터는 물론 본원에 기재된 방식으로 개질되어서는 안 된다.

"샤페론 프로모터가 불활성화된다"는 것은 야생형 샤페론 프로모터의 생체 내 활성이 야생형 숙주 세포의 프로모터 활성의 최대 10%, 바람직하게는 최대 5%, 더 바람직하게는 최대 2%로 감소된다는 것을 의미한다. 프로모터 활성의 결정 방법들은 당분야에 널리 공지되어 있고, 특정 마커 단백질들 또는 폴리펩티드들의 사용이 관여될 수 있다. 그러나 본 발명의 유전적으로 개질된 세포에서 야생형 샤페론 프로모터가 완전히 불활성화되어 세포 내에서 프로모터 활성을 확인할 수 없는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 샤페론은 단백질 디설피드 이성화효소, 결합 단백질 Kar2/BiP 및 칼넥신으로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 디설피드 이성화효소가 특히 바람직하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 재조합 프로모터는 유전적으로 개질된 또는 개질되지 않은 유도성 효모 프로모터이다.

효모 세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자, 바람직하게는 단백질 디설피드 이성화효소의 발현율을 조절하기 위해, 유도성 프로모터를 사용하는 것이 유리하다. 물론 프로모터가 효모 세포에서 이들에 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사를 조절할 수 있는 한 모든 종류의 프로모터를 사용할 수 있다. 그러나 효모 세포에서 유래된 프로모터를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 프로모터는 각각의 원천에서 직접 유래된 개질되지 않은 야생형 프로모터일 수 있다. 물론 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 프로모터들을 사용할 수도 있다. 이러한 프로모터들은 프로모터 내의 돌연변이들의 도입이 생체 내 전사 조절 활성을 개질하여 특정 배양 시점들에서 대응하는 야생형 프로모터에 비해 더 낮거나 더 높은 활성을 갖는 프로모터를 생성할 수 있게 한다는 이점을 갖는다. 따라서 본원에서 사용되는 "유전적으로 개질된 프로모터"는 당분야에 널리 공지된 임의의 적합한 통상적 또는 분자 생물학 방법에 의해, DNA 기법들에 의해, 예컨대 부위 지정 돌연변이화, 결실 또는 삽입에 의해, 또는 화학적 제제들 또는 조사를 이용하는 통상적 돌연변이화에 의해, 이어서 전사 기전이 개질된 세포들에 대한 스크리닝 또는 선택에 의해 개질된 프로모터를 나타낸다(예로 WO　2006/089329 참고).

대안적으로 물론 숙주 세포에서 항시적으로 작용하는 프로모터들을 사용할 수도 있다. 일부 경우들에서, 재조합 프로모터를 이용한 샤페론의 항시적 발현은 또한 관심 단백질 또는 폴리펩티드의 증가된 형성으로 이어진다. 효모 세포들에 대한 항시성 프로모터들은 당분야에 널리 공지되어 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자, 바람직하게는 PDI에 작동 가능하게 연결된 효모 프로모터는 AOX1 프로모터, GAL1 프로모터, PGK 프로모터, FDH 프로모터, FLD 프로모터, ADH 프로모터 및 HIS4 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된다.

돌연변이화되지 않은 또는 돌연변이화된 AOX1 프로모터의 사용이 특히 바람직하다.

프로모터, 특히 유도성 프로모터 내의 돌연변이들은 야생형 프로모터에 비해 변형된 특성들을 나타내는 유전적으로 개질된 프로모터로 이어질 수 있다. 특정 돌연변이들은 개질되지 않은 프로모터들에 비해 유도 조건들 하에서 더 높은 활성을 나타내는(즉, 이들에 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사 속도가 증가되는) 프로모터로 이어질 수 있다. 물론, 반대 효과를 나타내는 돌연변이들을 제공할 수도 있다. 유전적으로 개질될 AOX1 프로모터의 특히 바람직한 부분들은 Inan M 등(Biotechnol Bioeng 2006; 93: 771-778), 특히 WO　2006/089329(본원에 참조로 도입됨)에 나타난다.

본 발명에서 사용될 야생형 AOX1 프로모터(SEQ ID No. 1)의 바람직한 변이체들은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 부위들 및 뉴클레오티드 범위들 내에 하나 이상의 돌연변이(예로 결실, 삽입, 뉴클레오티드 교환)를 포함한다:

a) 전사 인자 결합 부위(TFBS),

b) Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 170 내지 235, 뉴클레오티드들 170 내지 191, 뉴클레오티드들 192 내지 213, 뉴클레오티드들 192 내지 210, 뉴클레오티드들 207 내지 209, 뉴클레오티드들 214 내지 235, 뉴클레오티드들 304 내지 350, 뉴클레오티드들 364 내지 393, 뉴클레오티드들 434 내지 508, 뉴클레오티드들 509 내지 551, 뉴클레오티드들 552 내지 560, 뉴클레오티드들 585 내지 617, 뉴클레오티드들 621 내지 660, 뉴클레오티드들 625 내지 683, 뉴클레오티드들 736 내지 741, 뉴클레오티드들 737 내지 738, 뉴클레오티드들 726 내지 755, 뉴클레오티드들 784 내지 800 또는 뉴클레오티드들 823 내지 861, 및 이들의 조합들(여기서, 상기 언급된 전사 인자 결합 부위들(TFBS)을 포함하는 프로모터 연신물들은 Seq ID No. 1의 Hap1 뉴클레오티드들 54 내지 58, Seq ID No. 1의 Hsf 뉴클레오티드들 142 내지 149 및 517 내지 524, Seq ID No. 1의 Hap234 뉴클레오티드들 196 내지 200, 206 내지 210 및 668 내지 672, Seq ID No. 1의 abaA 뉴클레오티드들 219 내지 224, Seq ID No. 1의 Stre 뉴클레오티드들 281 내지 285, Seq ID No. 1의 Rap1 뉴클레오티드들 335 내지 339, Seq ID No. 1의 Adr1 뉴클레오티드들 371 내지 377, Seq ID No. 1의 Mat1MC 뉴클레오티드들 683 내지 687, Seq ID No. 1의 Gcr1 뉴클레오티드들 702 내지 706 및 Seq ID No. 1의 QA-1F 뉴클레오티드들 747 내지 761을 포함함).

Seq ID No. 1: 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 AOX1 프로모터

효모 프로모터는 바람직하게는 Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 170 내지 235 또는 694 내지 723 또는 694 내지 723 및 737 내지 738 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 AOX1 프로모터이다.

Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 170 내지 235 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 AOX1 프로모터는 야생형 AOX1 프로모터에 비해 메탄올 유도 조건들 하에서 훨씬 더 높은 발현율을 나타낸다. Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 694 내지 723 또는 694 내지 723 및 737 내지 738 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 AOX1 프로모터는 야생형 AOX1 프로모터에 비해 억제제거 조건들 하에서 훨씬 더 높은 발현율을 나타낸다(예로 WO 2006/089329 참고).

AOX1 프로모터의 돌연변이는 바람직하게는 야생형 AOX1 프로모터의 상기 언급된 뉴클레오티드들 내에서의 결실, 치환, 삽입, 역위 및/또는 증가이다.

피치아 파스토리스의 야생형 AOX1 프로모터의 특징들을 개질하기 위해, 몇몇 돌연변이 유형들이 가능하다. 상기 언급된 영역들뿐만 아니라 Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 54 내지 58을 포함하는 Hap1, Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 142 내지 149 및 517 내지 524를 포함하는 Hsf, Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 196 내지 200, 206 내지 210 및 668 내지 672를 포함하는 Hap234, Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 219 내지 224를 포함하는 abaA, Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 281 내지 285를 포함하는 Stre, Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 335 내지 339를 포함하는 Rap1, Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 371 내지 377을 포함하는 Adr1, Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 683 내지 687을 포함하는 Mat1MC, Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 702 내지 706을 포함하는 Gcr1 및 Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 747 내지 761을 포함하는 QA-1F를 포함하는 하나 이상의 전사 인자 결합 부위들(TFBS)을 포함하는 프로모터 연신물들은 부분적으로 또는 완전히 결실되거나, 다른 뉴클레오티드들 또는 핵산 서열들로 부분적으로 또는 완전히 치환되거나, 단일 뉴클레오티드들 또는 핵산 서열들의 삽입에 의해 손상되거나, 부분적으로 또는 완전히 역전되거나 또는 증가될 수 있다. 모든 이들 돌연변이들은, 예로 전사 인자들에 대한 구조적 특징들 및/또는 인식/결합 부위들이 상기 돌연변이들에 의해 영향을 받기 때문에 프로모터 활성의 변경으로 이어진다. 그러나 이들 변경들은 야생형 프로모터에 비해 증가되거나 감소된 프로모터 활성으로 이어질 수 있다.

본 발명의 특별한 구현예에서, 효모 세포는 피치아 종들, 한세눌라 종들, 예컨대 한세눌라 폴리몰파(Hansenula polymorpha), 사카로마이세스 종들, 스키조사카로마이세스 종들, 야로위아 종들, 예컨대 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 종들 및 아스페르길러스 종들로 구성된 하기 군으로부터 선택된다.

본 발명의 특히 바람직한 구현예에 따르면, 효모 세포는 바람직하게는 피치아 속의 효모, 바람직하게는 피치아 파스토리스, 칸디다 보이디니(Candida boidinii) 및 한세눌라 폴리몰파로 구성된 군으로부터 선택된 메틸영양체 효모 세포이다.

생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 천연 생성 샤페론 프로모터의 하나 이상의 돌연변이는 바람직하게는 결실이다.

숙주 세포 내의 천연 생성 프로모터의 불활성화는 다양한 방식들로 일어날 수 있다. 예를 들어, 상기 프로모터 내에 점 돌연변이들을 도입할 수 있을 것이다. 적합한 돌연변이들은 잠재 돌연변이들을 상기 프로모터 내에 도입한 뒤 프로모터의 활성을 생체 내에서 평가하여 쉽게 확인될 수 있다. 그러나 숙주 세포 내에서 프로모터를 불활성화하는 가장 효율적인 방법은 프로모터의 적어도 일부의 결실이다. 따라서 숙주 세포에서 천연 생성되는 프로모터의 적어도 일부를 결실시키는 것이 특히 바람직하다. 결실은 프로모터의 임의 부분에서 일어날 수 있고, 이에 의해 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자의 시작 코돈(즉, 상기 유전자의 5' 영역) 다음에 나타나는 부분들을 결실시키는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 특히 바람직한 구현예에 따르면, 상기 세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 천연 생성 유전자, 바람직하게는 단백질 디설피드 이성화효소의 프로모터의 적어도 50개 뉴클레오티드들, 바람직하게는 적어도 100개 뉴클레오티드들, 더 바람직하게는 적어도 200개 뉴클레오티드들, 보다 바람직하게는 적어도 500개의 뉴클레오티드들이 결실된다.

생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자의 시작 코돈의 상류 영역(즉, 상기 유전자의 5' 말단)에서 적어도 최초 50개, 바람직하게는 적어도 최초 100개, 더 바람직하게는 적어도 최초 200개, 보다 바람직하게는 적어도 최초 500개의 연속 뉴클레오티드들을 결실시키는 것이 특히 바람직하다.

효모 세포에서 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하기 위해, 상기 세포는 프로모터, 바람직하게는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 추가로 포함한다.

생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 프로모터와 동일할 수 있다. 그러나 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자 및 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자가 상이한 프로모터들에 의해 조절되는 것이 바람직하다. 이러한 맥락에서, "상이한 프로모터들"이라는 용어는 프로모터들의 활성들이 서로 동일하지 않고 상이함을 의미한다. 따라서 상기 프로모터들을 포함하는 세포가 배양될 때 변경된 효과들을 나타내는 동일한 야생형 프로모터에서 유래된 개질된 그리고 개질되지 않은 프로모터들을 사용할 수 있을 것이다. 이는 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질 및 관심 단백질 또는 폴리펩티드의 발현을 독립적으로 조절할 수 있게 한다. 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질 및 관심 단백질 또는 폴리펩티드 발현의 독립적 조절은 이것이 관심 단백질 또는 폴리펩티드의 발현율을 최적화할 수 있게 하므로 유리하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 벡터의 일부이거나 또는 게놈 내로 통합된다.

관심 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 당분야 숙련자에게 널리 공지된 각각의 수단들 및 방법들을 이용하여 벡터의 일부가 되거나 게놈 내로 통합될 수 있다. 사용될 수단들 및 방법들은 또한 숙주 세포에 의존하며, 이에 따라 선택되어야 한다(예로 "Pichia Protocols" Cregg JM, Humana Press; 2nd edition (August 8, 2007) 참고).

본 발명의 핵산 분자는 또한 세포가 배양되는 배양 배지의 상청액 내로의 관심 단백질 또는 폴리펩티드의 분비를 허용하는 신호 서열들을 포함한다.

본원에서 사용되는 "신호 서열"이라는 용어는 생물학적으로 활성이 있는 분자의 분비를 지시하는 절편을 나타낸다. 본 발명에서 사용되는 신호 서열은 소포체(ER) 막을 통해 단백질 수송을 개시하는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 신호 서열의 비제한적 예들은 MFα(교배 인자 α 신호 서열), K1 킬러 독소 신호, 역전효소 분비 신호 펩티드, 클루이베로마이세스 락티스( Kluyveromyces lactis ) 킬러 독소 신호 서열, 피치아 아카시애( Pichia acaciae) 킬러 독소 신호 서열, 한세니아스포라 우바룸( Hanseniaspora uvarum ) 킬러 독소 신호 서열, 및 피치아(한세눌라) 아노말라( Pichia ( Hansenula ) anomala ) 킬러 독소 신호 서열이다. 본 발명의 바람직한 신호 서열은 MFα(교배 인자 α 신호 서열)이다. 바람직하게는 표적 단백질의 정확한 접기 및 전위를 위해, MFα 신호 펩티드가 도입된다. MFα는 α-인자로부터의 프리-프로 영역으로, 165개 아미노산들을 갖는 단백질 프리-프로-α 인자를 인코딩하며, 이는 19개 아미노산들의 신호 서열(프리 영역) 및 프로 영역, 이어서 성숙한 13개 아미노산 α 인자 서열의 4회 일렬 반복들을 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 신호 서열은 하기 아미노산 서열(SEQ ID No. 11)을 포함하거나 이로써 구성된다:

상기 신호 서열을 인코딩하는 핵산은 하기 뉴클레오티드 서열(SEQ ID No. 12)에 대해 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 100%의 동일성을 갖는다:

본원에서 사용되는 "벡터"라는 용어는 숙주 세포내로 도입되고 숙주 세포 게놈 내로 통합되거나 또는 에피솜 DNA로 자가 복제할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 벡터들에는 선형 핵산들, 플라스미드들, 파지미드들, 코스미드들, RNA 벡터들, 바이러스 벡터들 등이 포함된다. 적합한 발현 벡터는 발현 조절 인자들, 예컨대 프로모터, 시작 코돈, 정지 코돈, 폴리아데닐화 신호, 인핸서 및 선택 마커들을 포함할 수 있다.

효모 세포 내로의 본 발명의 핵산 분자들의 형질전환은 당분야의 공지된 방법들에 의해 수행될 수 있고, 이는 숙주 세포들에 따라 적합하게 선택될 수 있다. 이들 방법들에는 전기천공, 프로토플라스트 융합 방법, 인산칼슘 침전 및 염화칼슘 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 진탕, 그리고 PEG-, 황산덱스트란- 및 리포펙타민-매개 형질전환이 비제한적으로 포함된다.

본 발명의 또 다른 측면은 관심 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 제조하기 위한 본 발명에 따른 세포들의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 숙주 세포에서 하나 이상의 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법에 있어서, 상기 숙주 세포가 하나 이상의 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하며, 상기 숙주 세포에서 재조합 또는 천연 폴리펩티드들 또는 단백질들 또는 천연 생성 샤페론의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현이 야생형 숙주 세포에 비해 증가되는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 세포의 배양 단계를 포함하는 재조합 또는 천연 단백질 또는 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.

재조합 단백질들 또는 폴리펩티드들의 제조 방법들은 당분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명에 따른 유전적으로 개질된 효모 세포는 재조합 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질, 바람직하게는 샤페론, 더 바람직하게는 PDI뿐만 아니라 관심 단백질들 및 폴리펩티드들을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현율을 훨씬 더 효율적인 방식으로 조절할 수 있게 하므로 이러한 단백질들 및 폴리펩티드들을 발현하기에 특히 적합하다. 특히 다양한 배양 단계들에서 하나 이상의 샤페론, 바람직하게는 PDI의 발현율을 조절하고, 이어서 세포 내에서 하나 이상의 샤페론의 수준이 소정량에 도달할 때의 시점에 맞춰 결정할 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 단백질 또는 폴리펩티드가 세포로부터 분비되는 경우, 배양 배지의 상청액으로부터 관심 단백질 또는 폴리펩티드의 단리 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 세포들은 임의의 공지된 배양 방법, 예컨대 회분식 배양, 연속 배양 및 공급-회분식 배양으로 배양될 수 있다. 선택된 효모 균주들에 대해 적합한 배양 조건들은 당분야 숙련자에 의해 쉽게 조정될 수 있다. 전형적으로, 사용되는 배지는 세포들의 성장 및 생존에 필수적인 모든 영양소들을 함유해야 한다.

본 발명은 하기 도면들 및 실시예들에서 추가로 예시되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

도 1은 천연 단백질 디설피드 이성화효소(PDI) 프로모터 및 PDI 유전자 간에 특이적으로 돌연변이화된 AOX1 프로모터의 프로모터 통합 카세트를 위한 "기위(Flipper) 구축물"의 플라스미드 지도를 나타낸다.

도 2는 PDI 프로모터에 대한 프로모터 통합 전략의 그래프 도표를 나타낸다.

도 3은 특이적으로 돌연변이화된 AOX1 프로모터에 의한 천연 단백질 디설피드 이성화효소(PDI) 프로모터의 프로모터 대체 카세트를 위한 "기위 구축물"의 플라스미드 지도를 나타낸다.

도 4는 PDI 프로모터에 대한 프로모터 대체 전략의 그래프 도표를 나타낸다.

도 5는 각각 트랜스페린-발현 균주 CBS7435 muts(실선), 및 CBS7435 muts PDI 플랫폼(점선)의 (직접 적용된) 상청액의 전기영동도 오버레이(GXII, Caliper Life Sciences, USA)를 나타낸다.

도 6은 각각 비글리코실화-트랜스페린-발현 균주 CBS7435 muts(실선), 및 CBS7435 muts PDI 플랫폼(점선)의 (직접 적용된) 상청액의 전기영동도 오버레이(GXII, Caliper Life Sciences, USA)를 나타낸다.

도 7은 각각 HSA-인터페론(알파2a)-발현 균주들 CBS7435 muts(점선), 재조합 단백질 디설피드 이성화효소를 공발현하는 CBS7435 muts 균주(1개 복제수로 존재; 동일한 프로모터가 CBS7435 muts PDI 플랫폼 균주에서와 같이 사용됨)(실선), 및 CBS7435 muts PDI 플랫폼 균주(다이아몬드들과 함께 표시된 실선)의 (직접 적용된) 상청액의 전기영동도 오버레이(GXII, Caliper Life Sciences, USA)를 나타낸다.

도 8은 각각 Fab-발현 균주들 CBS7435 muts(실선), 재조합 Kar2를 공발현하는 CBS7435 muts 균주(1개 복제수로 존재; 동일한 프로모터가 CBS7435 muts Kar2 플랫폼 균주에서와 같이 사용됨)(점선), 및 CBS7435 muts Kar2 플랫폼 균주(원들과 함께 표시된 실선)의 (직접 적용된) 상청액의 전기영동도 오버레이(GXII, Caliper Life Sciences, USA)를 나타낸다.

실시예들:

전략:

하기 특정 구현예들에서 사용된 형질전환 DNA 구축물은 최초 700-1000bp의 상동성 프로모터 및 Flp 재조합효소의 발현을 유도하는 강하게 조절되고 특이적으로 돌연변이화된 AOX1 프로모터, 이어서 전사 종료자 및 내성 마커 카세트, 더 이어서 상이하게 조절되고 특이적으로 돌연변이화된 AOX1 프로모터 및 최초 500-1000bp의 상동성 유전자로 구성된다. 재조합효소 인식 부위들은 최초 100-300bp의 상동성 프로모터(천연 PDI 프로모터가 약 1000bp로 구성될 수 있다는 가정에 근거) 이후, 그리고 두 번째 특이적 AOX1 프로모터의 바로 상류(및 제한 마커 카세트의 하류)에 놓인다.

열거된 유전자위(상동성 인접 영역들에 의해 미리 결정됨)에서의 형질전환 구축물의 게놈 삽입 후, 콜로니들은 강한 유도성 프로모터 상류에 의해 조절되는 재조합효소 유전자의 전사를 유도하기 위해 메탄올 함유 배지로 처리된다. Flp 재조합효소가 Flp 재조합효소 인식 부위들 상에 작용하여 대부분의 상동성 프로모터, 강한 유도성 AOX1 프로모터 변이체뿐만 아니라 전체 내성 마커 카세트를 절제하고 상동성 프로모터 및 관심 상동성 유전자를 유도하는 상이하게 조절되고 특이적으로 돌연변이화된 AOX1 프로모터의 잔여분들을 남긴다.

상술된 전략으로 PDI 유전자 전사체 수준들의 상당한 증가를 확인하기 위해, 인간 혈청 트랜스페린에 대한 합성 유전자들뿐만 아니라 N-글리코실화 모티프들이 없는 돌연변이화된 변이체 비글리코실화-트랜스페린이 이상적인 모델 단백질들이었다; 재조합 발현 카세트부터 PDI의 공-발현 없이는, 두 단백질들이 분비될 수 없다. 그 이유는 분비되기 쉬울 온전한 단백질에 대해 형성될 19개의 디설피드 결합들의 많은 수가 천연 생성 ER-상주 PDI 단백질들에 의해서는 충분히 촉매될 수 없기 때문일 가능성이 가장 높다. 명백하게는, 이종성 과발현에 의한 추가 효소들의 공급 시, ER에서 트랜스페린 및 비글리코실화-트랜스페린의 번역 후 개질이 정확히 접힌 단백질들의 분비를 허용하는 정도까지 작용한다.

균주들

표준 분자 생물학 절차들을 [Ausubel, F.M. 등(2003) Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley & Sons, New York, US]에 따라 수행하였다.

대장균 DH5α(NEB, USA)를 모든 대장균 클로닝 실험들을 위해 사용하였다.

muts 표현형(Δaox1 유전형)을 갖는 피치아 파스토리스 균주 CBS7435를 모든 효모 실험들을 위한 숙주로 사용하였다(예로 [Cregg and Madden in Stewart, Russell, Klein and Hiebsch (Eds) Biological Research on Industrial Yeast, vol II (1987), CRC Press, pp 1-18] 참고).

화학제들 및 배지들

명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 모든 화학제들은 Carl Roth GmbH(Germany), 및 Becton, Dickinson and Company(USA)에서 각각 구매하였다. 멸균수는 Fresenius Kabi(Austria)에서 구매하였다.

구체적으로 언급되지 않는 한, 모든 배양 배지들 및 성분들은 피치아 단백질 발현 키트(Invitrogen, USA)의 프로토콜에 따라 제조하였다.

P. 파스토리스의 형질전환, 피치아 성장 조건들 및 양성 클론들에 대한 선택

P. 파스토리스를 "피치아 발현 키트"(Invitrogen)에 따른 표준 전기천공 프로토콜을 이용하여 형질전환하였다. 플라스미드 DNA(1-10㎍)를 P. 파스토리스의 게놈 내로의 발현 플라스미드의 추가를 위해 제한 효소, 예로 BglII 또는 SacI(둘 다 NEB, USA에서 구매)을 이용하여 선형화하고, 실온에서 60분 동안 멸균수에 대해 니트로셀룰로오스 필터들(0.0025㎛, Millipore, USA)을 이용하여 투석을 통해 탈염시켰다.

형질전환 후, 100㎕ 분취량들을 100㎍/ml 제오신이 보강된 YPD 한천 플레이트들 상에 접종하고 30℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다.

P. 파스토리스의 게놈 내 발현 카세트의 존재를 콜로니 PCR로 확인하였다. 제오신 내성 클론들을 콜로니 PCR 분석을 위해 비선택적 배지 상에 재접종하였다. 단일 콜로니를 100㎕ 멸균수 중에 재현탁하고, 5분 동안 95℃로 가열하고, 1분 동안 테이블탑 원심분리기에서 최고 속도로 원심분리하였다. 10㎕의 상청액들은 0.2mM dNTP들, 1x반응 완충액(Qiagen, Germany), 1.2U HotStar Taq 중합효소(Qiagen), 200nM의 각 프라이머들 PPDI5_for(5'-ccaaaaccaggtgtgtcaatc-3') 및 PDIgene_rev(5'-cgactggtctgagtgctagg-3')을 함유하는 50㎕ 반응액에 대한 주형으로 작용하였다. 하기 프로그램을 PCR에 이용하였다: 95℃에서 15분, 95℃에서 30초 30사이클, 61℃에서 1분 및 72℃에서 3.5분, 이어서 72℃에서 10분의 최종 연신 단계. 생성 PCR 산물들의 동일성을 DNA 서열분석으로 확인하였다.

효모 배양물들은 YPD 배지(1% w/v 효모 추출물, 2% w/v 펩톤 및 2% w/v 글루코오스), 최소 덱스트로오스(MD) 배지(1.34% 효모 질소 기재 YNB, 4 x 10-5% 바이오틴 및 1% 글루코오스), 최소 메탄올(MM) 배지(1.34% YNB, 4 x 10-5% 바이오틴 및 0.5% 메탄올), 완충 MD(BMD) 배지(200mM 인산나트륨 완충액 pH 6.0 함유) 또는 [Weis 등, FEMS YR 2004}에 따라 MM 대비 2-배(1% 메탄올 함유 BMM2) 또는 10배(5% 메탄올 함유 BMM10) 농도의 메탄올을 포함하는 완충 MM 배지 중에 성장시켰다. 플레이트들용 배지는 1.5%w/v의 한천 첨가로 고화시켰다.

스케일 업

피치아 파스토리스 발효들은 [Cino, J. High Yield Protein Production from Pichia pastoris Yeast: A Protocol for Benchtop Fermentation, New Brunswick Scientific, Edison, NJ]에 기재된 프로토콜들과 유사하게 수행하였다. 글리세롤 공급 말기에, 메탄올 농도(오프라인 메탄올 분석)를 1% 근처로 유지하려는 목적으로 공급 속도를 조정하여 메탄올 공급을 시작하였다. 대안적으로 메탄올 공급 대신에, 메탄올 유도 발효의 전통적인 글리세롤 공급 회분 기간에서와 동일한 속도로 전체 공정 시간 동안 글리세롤을 공급하였다. pH-값을 5.5로 설정하고 암모니아로 조절하였다. 용해된 산소를 주로 교반기 속도로 조절하고 에어레이션 속도로 백업하면서 30% 초과로 유지하였다. 온도를 20-28℃로 설정하였다. 세포 건조물 중량들을 [Whittaker, M.M. and Whittaker, J.M. (2000) Protein, Expr. Purif. 20, 105-111]에 기재된 바와 같이 결정하였다.

분비된 표적 단백질의 결정

각각 마이크로스케일 또는 바이오리액터들에서의 배양 후, 상청액 표본들(원심분리에 의한 세포들의 분리로 수득됨)을 제조업체의 지침들에 따라 마이크로유체 모세관 전기영동(GXII, Caliper Life Sciences, USA)으로 분석하였다. 내부뿐만 아니라 외부 표준들에 대한 표적 단백질 피크들의 대조로 배양 상청액 중에서 표적 단백질 수율들을 얻었다.

실시예 1: 천연 단백질 디설피드 이성화효소(PDI) 프로모터 및 PDI 유전자 간 특이적으로 돌연변이화된 AOX1 프로모터의 프로모터 공-통합 카세트의 구축

형질전환된 DNA 구축물은 최초 500bp의(3' 말단에서부터의) 상동성 PDI 프로모터(천연 PDI 프로모터가 약 1000bp로 구성될 수 있다는 가정에 근거), 및 Flp 재조합효소의 발현을 유도하는, 특이적으로 조절되며 돌연변이화된 AOX1 프로모터(WO　2006/089329; SEQ ID No. 1에서 유래됨), 이어서 CYC1 전사 종료자 및 제오신 내성 카세트(EM72 프로모터에 의해 대장균에서 그리고 ILV5 프로모터 및 AOD 전사 종료자에 의해 P. 파스토리스에서 기능함), 뒤이어 최초 500bp의 상동성 PDI 유전자로 구성될 수 있다. 재조합효소 인식 부위들은 특이적 AOX1 프로모터 뒤에, 그리고 상동성 PDI 유전자의 바로 상류에 놓인다(도 1). 상기 DNA 단편을 DNA2.0(Menlo Park, USA)으로 합성으로 생성된 DNA로 주문하였다.

실시예 2: CBS7435 muts로의 프로모터 통합 구축물의 형질전환, 게놈좌의 확인, 메탄올 배지 상에서의 증식 그리고 카세트 절제 및 확인

형질전환 및 한천-플레이트들 상에서의 선택 후, 정확한 게놈 방향으로 통합화된 형질전환 카세트를 수반하기 위해 콜로니 PCR로 20개 콜로니들을 확인하였다.

클론들을 총 3회 연속하여 5일 동안(큰 단일 콜로니들이 형성될 때까지) 최소 메탄올 한천 플레이트들로 옮겼다. 이후, FRT 부위들 간 DNA 영역(대부분의 상동성 프로모터 영역, 강한 유도성의 AOX1 프로모터 및 Flp 재조합효소, 내성 마커 카세트)의 절제를 선택 마커(제오신)를 함유하는 YPhyD 플레이트들 상에 역-재스트리킹하여 확인하였다: 양성 클론들, 즉 절제가 일어난 것들은 이들 플레이트들에서 성장할 수 없었다. 콜로니 PCR은 특이적으로 돌연변이화된 AOX1 프로모터 상류의 상동성 PDI 프로모터, 바로 뒤이은 나머지 FRT 부위 및 (온전한) PDI 유전자(도 2, SEQ ID No. 2)의 생성을 보였다.

SEQ ID No. 2: 게놈 PDI 유전자위에 대해 수득한 서열

진한 글씨체: 천연 PDI 프로모터 영역(개질되지 않은 균주에서 천연 PDI 유전자의 1000bp 상류)

이탤릭체: 돌연변이화된 AOX1 프로모터

일반 글씨체: 5'-코작 서열을 갖는 천연 PDI 유전자(최초 892개 염기들)

아래 첨자: FRT 부위

실시예 3: 마이크로스케일의 메탄올 유도 조건들 하에 상승된 수준의 상동성 PDI 를 갖는 균주에서 트랜스페린의 분비 생성

트랜스페린(SEQ ID No. 3)뿐만 아니라 비글리코실화-트랜스페린(SEQ ID No. 4; 두 N-글리코실화 모티프들을 돌연변이화하기 위한 이중-부위-지정 돌연변이화에 의해 생성된 비글리코실화 트랜스페린)을 인코딩하는 유전자들을 WO　2006/089329에서 확인된 바와 같은 Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 170 내지 235의 결실을 포함하는 특이적으로 돌연변이화된 AOX1 프로모터(WO　2006/089329)의 조절 하에 있는 미처리 숙주 CBS7435 muts 및 상술된 바와 같이 잠재적으로 상승된 수준의 상동성 PDI를 갖는 대응 균주의 게놈 내로 통합하였다. 두 트랜스페린 변이체들에 대한 유전 정보의 생성은 콜로니 PCR(PAOX1에 결합하는 전방 프라이머, 최초 80bp 내에서 두 트랜스페린 유전자들에 결합하는 후방 프라이머)로 입증되었다. 마이크로스케일로 배양 시, 기본 균주 CBS7435 muts 숙주 혹은 잠재적으로 상승된 수준의 상동성 PDI를 갖는 균주 중 어느 것도 트랜스페린을 어떤 형태로든 (마이크로유체 모세관 전기영동에 의해 검출 가능한 수준으로) 분비할 수 없었다.

프라이머 서열(SEQ ID No. 8)

SEQ ID No. 3: 트랜스페린

SEQ ID No. 4: 비글리코실화-트랜스페린

실시예 4: 특이적으로 돌연변이화된 AOX1 프로모터에 의한 천연 단백질 디설피드 이성화효소(PDI) 프로모터의 프로모터 대체 카세트의 구축

형질전환된 DNA 구축물은 최초 1000bp의 상동성 PDI 프로모터(천연 PDI 프로모터가 약 1000bp로 구성될 수 있다는 가정에 근거), 및 Flp 재조합효소의 발현을 유도하는, 특이적으로 조절되며 돌연변이화된 AOX1 프로모터(WO　2006/089329), 이어서 CYC1 전사 종료자 및 제오신 내성 카세트(EM72 프로모터에 의해 대장균에서 그리고 ILV5 프로모터 및 AOD 전사 종료자에 의해 P. 파스토리스에서 기능함), 또한 뒤이어 상이하게 조절되며 특이적으로 돌연변이화된 AOX1 프로모터(WO　2006/089329) 및 최초 500bp의 상동성 PDI 유전자로 구성된다. 재조합효소 인식 부위들은 최초 300bp의 상동성 프로모터의 뒤에, 그리고 두 번째 특이적 AOX1 프로모터의 바로 상류에 놓인다(도 3). 상기 DNA 단편을 DNA2.0(Menlo Park, USA)으로 합성으로 생성된 DNA로 주문하였다.

실시예 5: 구축물의 CBS7435 muts로의 형질전환, 게놈좌의 확인, 메탄올 배지 상에서의 증식 그리고 카세트 절제 및 확인

형질전환 및 한천-플레이트들 상에서의 선택 후, 정확한 게놈 방향으로 통합화된 형질전환 카세트를 수반하기 위해 콜로니 PCR에 의해 20개 콜로니들을 확인하였다.

클론들을 총 3회 연속하여 5일 동안(큰 단일 콜로니들이 형성될 때까지) 최소 메탄올 한천 플레이트들로 옮겼다. 이후, FRT 부위들 간 DNA 영역(대부분의 상동성 프로모터 영역, 강한 유도성 AOX1 프로모터 및 Flp 재조합효소, 내성 마커 카세트)의 절제를 선택 마커(제오신)를 함유하는 YPhyD 플레이트들 상에 역-재스트리킹하여 확인하였다: 양성 클론들, 즉 절제가 일어난 것들은 이들 플레이트들에서 성장할 수 없었다. 콜로니 PCR은 상동성 프로모터의 상류 부분만 그리고 인접한 특이적 AOX1 프로모터 및 상동성 PDI 유전자의 생성을 입증하였다(도 4, SEQ ID No. 5).

SEQ ID No. 5: 게놈 PDI 유전자위에 대해 수득한 서열

진한 글씨체: 절단된 천연 PDI 프로모터 영역(천연 PDI 유전자의 1000bp 상류 전방 위치의 염기로 시작), 333bp 남음

이탤릭체: 돌연변이화된 AOX1 프로모터

일반 글씨체: 5' 코작 서열을 갖는 천연 PDI 유전자(최초 892개 염기들)

아래 첨자: FRT 부위

내성 카세트의 절제에 의해, 상기 항생제에 대한 역선택으로 음성 성장 거동(즉, 항생제에 대한 내성 없음)에 의해 양성 균주들이 드러났다. 추가적으로 콜로니 PCR로 목적하는 게놈좌를 확인하였다. 양성 균주들 중 하나를 선택하고, CBS7435 muts PDI 플랫폼으로 명명하였다.

실시예 6: 마이크로스케일로 메탄올 유도 조건들 하에 상승된 수준의 상동성 PDI를 갖는 균주에서의 트랜스페린의 분비 생성

트랜스페린뿐만 아니라 비글리코실화-트랜스페린을 인코딩하는 유전자들(실시예 3 참고)을 특이적으로 돌연변이화된 AOX1 프로모터(WO　2006/089329)의 조절 하에 있는 미처리 숙주 CBS7435 muts 및 상술된 바와 같이 잠재적으로 상승된 수준의 상동성 PDI를 갖는 대응 균주의 게놈 내로 통합하였다. 두 트랜스페린들에 대한 유전 정보의 생성은 콜로니 PCR(PAOX1에 결합하는 전방 프라이머, 최초 80bp 내에서 두 트랜스페린 유전자들에 결합하는 후방 프라이머)로 입증되었다. 마이크로스케일로 배양 시, 기본 균주 CBS7435 muts 숙주는 트랜스페린을 어떤 형태로든 (마이크로유체 모세관 전기영동에 의해 검출 가능한 수준으로) 분비할 수 없던 반면 잠재적으로 상승된 수준의 상동성 PDI를 갖는 균주는 상청액 중에 검출 가능한 두 트랜스페린 유도체들을 생성하였다(표 1, 도들 5 및 6). 이는 특이적으로 돌연변이화된 PAOX1에 의한 PDI 활성의 증강이 기본 균주와는 대조적으로 두 트랜스페린 변이체들의 접기/분비를 촉진하기에 충분히 높다는 것을 시사하였다.

균주들 CBS7435 muts, 및 CBS7435 muts PDI 플랫폼 각각에 의해 생성된 트랜스페린 및 비글리코실화-트랜스페린에 대한 마이크로스케일 배양 상청액들 중 표적 단백질의 역가들

균주	트랜스페린 mg/L	비글리코실화-트랜스페린 mg/L
CBS7435 muts	0	0
CBS7435 muts PDI 플랫폼	20	40

실시예 7: 바이오리액터 배양들 중 메탄올-유도 조건들 하에 상승된 수준의 상동성 PDI 를 갖는 균주에서의 트랜스페린 및 비글리코실화 - 트랜스페린의 분비 생성

통합된 트랜스페린 및 비글리코실화-트랜스페린 발현 카세트들 및 입증된 분비 속도들을 갖는 CBS7435 muts PDI 플랫폼 균주들(비-분비 CBS7435 muts 균주들 대비)을 1L 바이오리액터들 중 조절되는 조건들 하에 배양하였다. 총 109시간의 공정 시간(90시간의 메탄올 유도) 후, 발효 상청액을 마이크로유체 모세관 전기영동으로 분석하였다. 연속 희석 그리고 내부 및 외부 표준들과의 대조 후, 고농도의 두 단백질들을 검출할 수 있었다(표 2).

CBS7435 muts PDI 플랫폼에 의해 생성된 트랜스페린 및 비글리코실화-트랜스페린에 대한 바이오리액터 배양 상청액들 중 표적 단백질의 추정 역가들

균주	트랜스페린 g/L	비글리코실화-트랜스페린 g/L
CBS7435 muts PDI 플랫폼	5.4	5.2

실시예 8: 기본 균주 CBS7435 muts 및 잠재적으로 상승된 수준의 상동성 PDI를 갖는 균주에서의 상동성 PDI 전사체 수준의 측정

전사체 수준(존재하는 mRNA에 혼성화하는 특이적 프라이머들 기준)을 회분상(글리세롤이 다량 존재함), 글리세롤 공급-회분상(글리세롤이 억제제거량으로 존재함) 및 메탄올 유도상 동안의 몇몇 시점들(재조합 단백질(들)에 대한 제조상)에서의 발효 표본들로부터 분석하였다(PlexPress, Helsinki, Finland). 동일 생물질량의 통합된 재조합 발현 카세트가 없는 CBS7435 muts 및 CBS7435 muts PDI 플랫폼. 대사적으로 활성이 있는 세포들에 관련시키기 위해 하우스키핑 유전자들의 발현 수준들에 대한 비교로 표준화를 더 수행하였다.

회분상(고글리세롤) 동안, 천연 PDI1 유전자의 mRNA 수준은 CBS7435 muts 균주에서 억제제거 조건들(글리세롤 공급-회분) 동안 증가되었으며(CBS7435 muts PDI 플랫폼 균주들에서 PDI1 유전자의 발현을 조절하는 특이적 AOX1 프로모터에 대한 글리세롤의 억제 효과들로 인해), 메탄올 유도의 모든 단계들(재조합 단백질(들)의 제조상) 동안 천연 PDI1 유전자의 mRNA 수준은 CBS7435 muts와 대조적으로 CBS7435 muts PDI 플랫폼 균주에서 60배 증가되었다.

실시예 9: 마이크로스케일에서 그리고 바이오리액터 조건들 하에서 메탄올 유도 조건들 하에 상승된 수준의 상동성 PDI를 갖는 균주에서의 인터류킨-2 및 인간 혈청 알부민(HSA)의 분비 생성.

트랜스페린 및 비글리코실화-트랜스페린에 대해 상술된 실시예들과 유사하게, 인터류킨-2(SEQ ID No. 6) 또는 HSA(SEQ ID No. 7)에 대한 발현 카세트를 특이적으로 돌연변이화된 AOX1 프로모터(WO　2006/089329)의 조절 하에 미처리 숙주 CBS7435 muts 그리고 상술된 바와 같이 상승된 수준의 상동성 PDI를 갖는 대응 균주의 게놈 내로 형질전환하였다. 두 유전자들에 대한 유전 정보의 생성은 콜로니 PCR(PAOX1에 결합하는 전방 프라이머, 최초 80bp 내에서 인터류킨-2 또는 HSA 유전자에 결합하는 후방 프라이머)로 입증되었다.

마이크로스케일로 배양 시, 두 균주들 모두(기본 균주 CBS7435 muts뿐만 아니라 상승된 수준의 상동성 PDI를 갖는 균주) 인터류킨-2 또는 HSA를 분비하였지만, 바이오리액터 조건들 하에서는 CBS7435 muts PDI 플랫폼 균주에 의해 HSA에 대해 거의 2배 그리고 인터류킨-2에 거의 4배 더 높은 수율들이 달성되었다.

프라이머 HSA(SEQ ID No. 9)

5' GGTCCTTGAATCTATGAG 3'

프라이머 IL2(SEQ ID No. 10)

5' CGTAGAAGAAGAGGTTGG 3'

SEQ ID No. 6 IL-2

SEQ ID No. 7 HSA

요약:

PDI 프로모터(5' 상동성) 및 PDI 유전자의 시작부(3' 상동성)에서 재조합 카세트의 정확한 이중 교차는 천연 PDI 프로모터 및 천연 PDI 유전자 사이에 재조합효소 발현 카세트, 내성 카세트 및 특이적 AOX1 프로모터 변이체의 삽입적 통합을 이끌었다. 글리세롤 또는 글루코오스 상에서의 연속 성장은 재조합효소의 발현을 유도하는 AOX1 프로모터 변이체로부터의 전사를 강하게 억제하였으므로, 이러한 조건들 하에서는 절제가 일어나지 않았다.

메탄올-함유 배지 상에서의 성장 시, 재조합효소 유전자의 전사가 시작되고 이어서 두 Flp 재조합효소 인식 부위들 사이 DNA 단편의 절제가 일어나서 대부분의 천연 PDI 프로모터, 재조합효소 발현 카세트뿐만 아니라 내성 카세트가 절제되고, 천연 PDI 유전자의 바로 상류에 특이적으로 돌연변이화된 AOX1 프로모터만 남게 되었다.

천연 PDI 프로모터 및 PDI 유전자 사이의 특이적으로 돌연변이화된 PAOX1의 직접 통합을 이용한 대안적 접근에서는 트랜스페린 및 비글리코실화-트랜스페린의 발현이 가능하지 않았다. 이는 천연 PDI 프로모터 상류에 의해 유발된 억제 효과 또는 돌연변이화된 AOX1 프로모터 및 PDI 유전자 사이에 남아 있는 FRT 부위로 야기되는 돌연변이화된 PAOX1로부터의 PDI 유전자의 비효율적인 전사에 기인할 수 있다.

내성 카세트의 절제로 인한 상기 항생제 상의 역-선택은 음성적 성장 거동(즉, 항생제에 대한 내성 없음)에 의해 양성 균주들을 드러내었다. 추가적으로 콜로니 PCR로 목적하는 게놈좌를 확인하였다. 양성 균주들 중 하나를 선택하여 CBS7435 muts PDI 플랫폼으로 명명하였다.

부모 균주 CBS7435 muts 및 새로 생성된 CBS7435 muts PDI 플랫폼의 배양물을 재조합 발현 카세트로부터 임의 표적 유전자의 이종성 발현 없이 1L 바이오리액터들에서 조절되는 전통적 메탄올 유도 조건들 하에 배양하였다. 상이한 시점들에서 배양물의 두 균주들에 있어서 천연 PDI에 대한 전사체 수준들은 글리세롤 회분 조건들 하에서 PDI1 유전자에 대한 mRNA의 생성이 CBS7435 muts PDI 플랫폼에 비해 부모 균주에서 더 높음을 드러내었다 저수준의 글리세롤 공급 시 그리고 메탄올 유도 조건들 하에서, CBS7435 muts에 비해 CBS7435 muts PDI 플랫폼 균주에서 훨씬 더 많은 mRNA(60-배)가 존재하였다.

트랜스페린 및/또는 비글리코실화-트랜스페린의 분비 발현을 위한 천연 PDI의 증가 수준의 필요량을 확인하기 위해, 두 유전자들을 (별도로) 두 균주들 CBS7435 muts 및 CBS7435 muts PDI 플랫폼 내로 형질전환하였다. 마이크로스케일 배양 후, 상청액들을 마이크로유체 모세관 전기영동으로 분석하였다. CBS7435 muts에서는 표적 단백질을 검출할 수 없었으나, CBS7435 muts PDI 플랫폼은 두 단백질들을 효율적으로 분비하기 충분한 천연 PDI를 뚜렷이 생성하였다(도입된 AOX1 프로모터 변이체의 전사 과조절에 의해)(도들 5 및 6). 조절되는 메탄올 유도 조건들 하의 바이오리액터 배양으로 고농도의 고도로 디설피드-결합된 두 표적 단백질들의 존재를 확인하였다.

무-메탄올 조건들 하에 트랜스페린 및 비글리코실화-트랜스페린의 증가된 생성을 위한 특이적 AOX1 프로모터 변이체들(WO　2006/089329)의 적용도 발현을 위한 CBS7435 muts PDI 플랫폼 균주를 이용하여 마이크로스케일 및 바이오리액터 조건들에서 효율적으로 작동하는 것으로 입증되었다.

CBS7435 muts 균주에 의해, 즉 천연 PDI의 증가 또는 이종성 PDI의 과생산 없이도 고수준으로 생성되는 표적 단백질들에 있어서, 예로 인간 혈청 알부민(HSA)에서와 같이, CBS7435 muts PDI 플랫폼 균주는 생산 수준의 증강 수단들을 역시 제공한다. CBS7435 muts로는 배양 상청액에서 8g/L의 HSA가 생성되었지만, CBS7435 muts PDI 플랫폼은 프로모터 사용, 통합된 복제수의 발현 카세트 및 배양 조건들에 있어서 동일한 조건들 하에 14g/L의 HSA를 분비하였다.

HSA는 17개의 디설피드 결합들의 형성을 필요로 하므로, 그 천연 접기에 있어서 1개의 디설피드 결합만이 형성될 것을 필요로 하는 추가 모델 단백질을 평가하였다. 인터류킨-2는 바이오리액터에서의 조절되는 조건들 하에 CBS7435 muts 균주에 비해 CBS7435 muts PDI 플랫폼 균주에서 4배 더 높은 수율로 발현되었다.

실시예 10: 마이크로스케일로 메탄올 유도 조건들 하에 상승된 수준의 상동성 PDI를 갖는 균주에서의 HSA-융합 단백질(HSA-인터페론(알파2a))의 분비 생성과 1개 복제수로 재조합 발현되는 "천연" PDI를 갖는 균주 및 개질이 없는 야생형 균주에서의 분비 생성의 직접 비교 .

상술된 실시예들과 유사하게, 특이적으로 돌연변이화된 AOX1 프로모터(WO　2006/089329)의 조절 하에서 HSA-인터페론(알파2a)(SEQ ID No. 16)에 대한 발현 카세트를 미처리 숙주 CBS7435 muts 및 상술된 바와 같이 상승된 수준의 상동성 PDI를 갖는 대응 균주의 게놈 내로 형질전환하였다. 추가적으로, 미처리 숙주 균주 CBS7435 muts를 HSA-인터페론(알파2a)에 대한 발현 카세트 및 상승된 수준의 상동성 PDI를 갖는 균주에서 천연 PDI 유전자의 발현을 조절하는 동일한 돌연변이화된 AOX1 프로모터의 조절 하 천연 PDI 유전자의 발현 카세트를 보유하는 상이한 플라스미드 둘 다로 형질전환하였다. 모든 도입 유전자들에 대한 유전 정보의 생성이 콜로니 PCR로 입증되었다(PAOX1에 결합하는 전방 프라이머, 최초 80bp 내에서 인터페론(알파2a) 또는 HSA 유전자에 결합하는 후방 프라이머). 재조합적으로 도입된 천연 PDI 유전자에 대한 유전 정보의 생성이 콜로니 PCR로 입증되었다(천연 PDI 유전자에 결합하는 전방 프라이머, 제네티신에 대한 내성 마커에 결합하는 후방 프라이머).

마이크로스케일로 배양 시, 모든 3 균주들(기본 균주 CBS7435 muts, 상승된 수준의 상동성 PDI를 갖는 균주, 및 재조합적으로 천연 PDI를 또한 공-발현하는 기본 균주)이 HSA-인터페론(알파2a)을 분비하였다. 재조합적인 천연 PDI 유전자의 공-발현은 기본 균주 CBS7435 muts에 비해 HSA-인터페론(알파2a)의 분비 수준을 ~60% 증가시킨 반면, 상승된 수준의 상동성 PDI를 갖는 균주는 재조합적으로 천연 PDI를 또한 공-발현하는 기본 균주에 비해 역가를 57% 추가 증강시켰다(도 7).

프라이머 인터페론(알파2a)(SEQ ID No. 13)

5' CTTGAACCCAATGAGTGTG 3'

프라이머 천연 PDI(SEQ ID No. 14)

5' GAAGCTGAAGAAGAAGCTG 3'

프라이머 내성 마커(SEQ ID No. 15)

5' GATTGTCGCACCTGATTGCC 3'

SEQ ID No. 16 HSA-인터페론(알파2a)

일반 글씨체: HSA

밑줄: 인터페론(알파2a)

실시예 11: 마이크로스케일로 메탄올 유도 조건들 하에 상승된 수준의 상동성 Kar2 를 갖는 균주에서의 Fab (항원-결합 단편) 분자의 분비 생성과 1개 복제수 로 재조합 발현되는 "천연" Kar를 갖는 균주 및 개질이 없는 야생형 균주에서의 분비 생성의 직접 비교.

상술된 실시예들과 유사하게, 특이적으로 돌연변이화된 AOX1 프로모터(WO　2006/089329)의 조절 하에서 Fab의 경쇄(SEQ ID No. 20) 및 Fab의 중쇄(SEQ ID No. 21)에 대한 발현 카세트를 미처리 숙주 CBS7435 muts 및 상승된 수준의 상동성 Kar2를 갖는 대응 균주의 게놈 내로 형질전환하였다. 추가적으로, 미처리 숙주 균주 CBS7435 muts를 경쇄 및 중쇄에 대한 발현 카세트들 및 상승된 수준의 상동성 Kar2를 갖는 균주에서 천연 Kar2 유전자의 발현을 조절하는 동일한 돌연변이화된 AOX1 프로모터의 조절 하 천연 Kar2 유전자의 발현 카세트를 보유하는 상이한 플라스미드 둘 다로 형질전환하였다. 모든 도입 유전자들에 대한 유전 정보의 생성이 콜로니 PCR로 입증되었다(PAOX1에 결합하는 전방 프라이머, 최초 80bp 내에서 경쇄 및 중쇄 유전자들에 결합하는 후방 프라이머). 재조합적으로 도입된 천연 Kar2 유전자에 대한 유전 정보의 생성이 콜로니 PCR로 입증되었다(천연 PDI 유전자에 결합하는 전방 프라이머, 제네티신에 대한 내성 마커에 결합하는 후방 프라이머).

마이크로스케일로 배양 시, 모든 3 균주들(기본 균주 CBS7435 muts, 상승된 수준의 상동성 Kar2를 갖는 균주, 및 재조합적으로 천연 Kar2를 또한 공-발현하는 기본 균주)이 Fab를 분비하였다. 재조합적인 천연 Kar2 유전자의 공-발현이 기본 균주 CBS7435 muts에 비해 Fab의 분비 수준을 ~47% 증가시켰지만, 상승된 수준의 상동성 Kar2를 갖는 균주는 재조합적으로 천연 Kar2를 또한 공-발현하는 기본 균주에 비해 역가를 27% 추가 증강시켰다(도 8).

프라이머 Fab 경쇄(SEQ ID No. 17)

5' CAGAAACGGAAGGAGGTTG 3'

프라이머 Fab 중쇄(SEQ ID No. 18)

5' CTGACTTCAGCTCCAGATTG 3'

프라이머 Kar2(SEQ ID No. 19)

5' GTACTCCACCTGGTGGTC 3'

SEQ ID No. 20 Fab 경쇄

SEQ ID No. 21 Fab 중쇄

SEQUENCE LISTING <110> VTU Holding GmbH <120> Protein Expression <130> R 62507 <150> EP 11179496.2 <151> 2011-08-31 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 953 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 ggtaccagat ctaacatcca aagacgaaag gttgaatgaa acctttttgc catccgacat 60 ccacaggtcc attctcacac ataagtgcca aacgcaacag gaggggatac actagcagca 120 gaccgttgca aacgcaggac ctccactcct cttctcctca acacccactt ttgccatcga 180 aaaaccagcc cagttattgg gcttgattgg agctcgctca ttccaattcc ttctattagg 240 ctactaacac catgacttta ttagcctgtc tatcctggcc cccctggcga ggttcatgtt 300 tgtttatttc cgaatgcaac aagctccgca ttacacccga acatcactcc agatgagggc 360 tttctgagtg tggggtcaaa tagtttcatg ttccccaaat ggcccaaaac tgacagttta 420 aacgctgtct tggaacctaa tatgacaaaa gcgtgatctc atccaagatg aactaagttt 480 ggttcgttga aatgctaacg gccagttggt caaaaagaaa cttccaaaag tcggcatacc 540 gtttgtcttg tttggtattg attgacgaat gctcaaaaat aatctcatta atgcttagcg 600 cagtctctct atcgcttctg aaccccggtg cacctgtgcc gaaacgcaaa 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Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala 85 <210> 12 <211> 265 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 12 atgagattcc catctatttt caccgctgtc ttgttcgctg cctcctctgc attggctgcc 60 cctgttaaca ctaccactga agacgagact gctcaaattc cagctgaagc agttatcggt 120 tactctacct tgagggtgat ttcgacgtcg ctgttttgcc tttctctaac tccactaaca 180 acggtttgtt gttcattaac accactatcg cttccattgc tgctaaggaa gagggtgtct 240 ctctcgagaa gaagaggccg aagct 265 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 13 cttgaaccca atgagtgtg 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 14 gaagctgaag aagaagctg 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 15 gattgtcgca cctgattgcc 20 <210> 16 <211> 2253 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 16 gatgcacaca aatcagaagt tgctcataga ttcaaggacc tcggagaaga gaacttcaag 60 gctcttgtcc ttatcgcttt cgctcaatac cttcagcaat gtccttttga ggaccacgtt 120 aagttggtga acgaagttac cgagttcgct aaaacttgcg tagctgacga atctgctgag 180 aactgtgaca agtcacttca cactcttttt ggtgacaagc tttgtactgt cgctaccctt 240 cgtgaaacct acggcgaaat ggccgattgc tgtgctaagc aggaacctga aagaaacgaa 300 tgtttcttgc agcacaagga cgataacccc aatcttcctc gtttggttcg tcctgaggtc 360 gacgttatgt gcaccgcttt tcatgacaac gaagagactt tcttaaagaa atacctttac 420 gaaatcgctc gtcgtcaccc atacttctac gctccagagc tgttgttctt cgcaaagaga 480 tataaggctg ctttcactga gtgttgccaa gctgctgaca aggcagcttg tctattgcct 540 aagcttgacg aattgcgaga tgagggtaaa gcatcttccg ccaagcagag attgaaatgc 600 gcttccttgc agaagtttgg tgagcgagct ttcaaagcct gggccgtggc taggttgagc 660 caacgttttc ctaaagctga gttcgctgaa gtttctaagt tggttactga tcttactaag 720 gtgcacactg aatgttgcca cggtgacctt ctggagtgtg ctgatgaccg tgcagatttg 780 gctaagtata tttgtgaaaa ccaagattct atttcttcta aactaaagga atgttgtgaa 840 aagccacttc ttgagaaaag tcactgtatc gctgaggtgg agaacgacga gatgccagct 900 gaccttccta gcctggctgc tgatttcgtt gaatctaagg acgtatgcaa gaattacgca 960 gaggccaagg atgttttcct tggcatgttt ttgtacgagt acgctagaag acaccctgac 1020 tactccgtag ttctcttgct gaggttggca aagacctacg agactaccct agagaagtgt 1080 tgcgccgcag ctgatcctca cgagtgttat gctaaagttt ttgatgagtt taaacctttg 1140 gttgaggagc cacaaaactt gattaagcag aactgcgagc ttttcgaaca attgggggaa 1200 tacaagttcc aaaatgcctt gctagtcagg tacaccaaaa aggtccctca ggtcagcacc 1260 ccaaccttag tcgaggtgtc cagaaatttg ggcaaagttg gttctaaatg ttgcaagcac 1320 ccagaagcta agaggatgcc atgtgccgaa gactaccttt ccgtcgttct gaaccaactc 1380 tgtgttttgc acgaaaagac tccagtctca gaccgtgtca cgaaatgttg taccgagtct 1440 ctggttaaca gaagaccttg tttctctgct ttggaagttg acgaaactta cgtcccaaag 1500 gagttcaacg cggagacttt caccttccac gccgacattt gtacactttc cgagaaggaa 1560 agacaaatca agaagcaaac cgcactagtt gaattggtta aacataagcc taaggctacc 1620 aaagaacaat tgaaagcagt tatggatgat tttgcggctt tcgtggaaaa gtgttgtaag 1680 gctgatgaca aggaaacctg tttcgccgaa gaaggtaaga agttagtcgc cgcctctcag 1740 gctgctcttg gactgtgcga cttgcctcaa acacactcat tgggttcaag acgtacttta 1800 atgcttctcg ctcagatgag aaagatttct ctgttctctt gtctaaagga ccgtcacgac 1860 ttcggttttc cacaagagga atttggaaac caattccaaa aagctgagac tattcccgtt 1920 ttacacgaaa tgatccaaca gattttcaac cttttctcta ctaaggattc ttccgctgca 1980 tgggacgaaa ctttgctcga caaattctac accgaacttt accaacagct taatgaccta 2040 gaagcctgcg tgatacaggg cgtcggtgtc acagaaacgc cattgatgaa ggaggatagc 2100 atcttggccg tgcgtaagta tttccaaaga attactttgt accttaagga aaagaaatac 2160 tctccttgtg cttgggaagt agtcagagct gaaattatga gatccttttc cctttctact 2220 aacttgcaag agtccttaag atcgaaggaa taa 2253 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 17 cagaaacgga aggaggttg 19 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 18 ctgacttcag ctccagattg 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 19 gtactccacc tggtggtc 18 <210> 20 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 20 caatccgtcc tgacccaacc tccttccgtt tctgctgctc ctggtcaaaa ggtcaccatt 60 tcctgttctg gatcttcatc taacattgga aagaattacg tttcctggta ccaacagtta 120 ccaggtgctg cacctaagtt acttatcttt gatgacactc aaagaccatc cggaatccca 180 gacagattct ctggttctaa gtctggtact tccgcaaccc tggccatcac cggattgcag 240 actggtgatg aggccgacta ctattgcggt acttgggact cttctctgtc tactggtcaa 300 cttttcggag gtggtaccaa attgaccgtt ttgggtcagc ctaaggctgc tccatctgtt 360 actctttttc ctccatcttc agaggaattg caggccaaca aggctactct tgtttgtttg 420 atttctgact tctaccctgg tgcagtcact gtggcatgga aagctgattc atctccagtc 480 aaagctggtg tggagactac cactccatct aagcaatcta acaacaaata cgcagcttca 540 tcctatttgt ctttgacccc agagcagtgg aagtcccacc gttcatactc ctgtcaagtt 600 acccatgagg gttctactgt tgaaaagact atggcccacg ctgaatgctc ctaa 654 <210> 21 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 21 caagtgcaag ttgttcaatc tggagctgaa gtcagaaagc caggagcttc tgttaaagtg 60 tcatgtaaag tttctggttt cactttgacc ggtttatcca ttcactgggt tagacaagca 120 cctggtaaag gtttggaatg gatgggtgga tttggtccag aggaaaatga gattatctat 180 gctcaaaagt tccagggtag agtctccatg accgaggaca cttccaccaa tactgcatac 240 atggaattgt cctctcttag atcagaagat actgctgtct actattgtgc tactggtggt 300 aactattaca acttgtggac tggttactac cctttagctt actggggtca gggtactctg 360 gttactgtct cttcagcctc tactaaggga ccatctgttt ttccacttgc tccttcctct 420 aagtccacct ctggtggaac cgctgcactg ggttgtttgg tcaaggatta cttcccagag 480 ccagttaccg tgtcttggaa ctctggtgcc cttacttctg gtgtccatac cttcccagcc 540 gttttgcagt catctggact ttactccctt tcctctgttg tcactgttcc ttcctcctct 600 ttgggaactc aaacctacat ctgcaacgtt aaccacaagc cttctaacac caaggttgac 660 aaaaaggtgg agcctaagtc ttgctaa 687

Claims

a) 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 분비 카세트 및
b) 세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 재조합 프로모터(상기 하나 이상의 유전자는 유전적으로 개질되지 않은 야생형 효모 세포의 천연 게놈 유전자위에 위치하며, 여기서 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 천연 생성 프로모터는 상기 천연 생성 프로모터 내에서 하나 이상의 돌연변이에 의해 불활성화됨)를 포함하는 유전적으로 개질된 효모 세포를 제공하는 단계;
상기 유전적으로 개질된 효모 세포를 관심 단백질 또는 폴리펩티드 및 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 허용하는 조건들 하에서 배양 배지 중에 배양하는 단계; 및
관심 단백질 또는 폴리펩티드를 배양 배지에서 단리하는 단계들을 포함하는 재조합 관심 단백질 또는 폴리펩티드의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 프로모터는 유전적으로 개질된 효모 세포가 유전적으로 개질되지 않은 야생형 효모 세포에 비해 적어도 100% 초과, 바람직하게는 적어도 200% 초과, 더 바람직하게는 적어도 300% 초과의 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 생성하도록 할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자가 샤페론인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 샤페론이 단백질 디설피드 이성화효소, 결합 단백질 Kar2/BiP 및 칼넥신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 프로모터가 유전적으로 개질된 또는 개질되지 않은 유도성 효모 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 효모 프로모터가 AOX1 프로모터, GAL1 프로모터, PGK 프로모터, ADH 프로모터, FDH 프로모터 및 FLD 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 효모 프로모터가 Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 170 내지 235 또는 694 내지 723 또는 694 내지 723 및 737 내지 738 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 AOX1 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 효모 세포가 바람직하게는 피치아속의 효모, 바람직하게는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 칸디다 보이디니(Candida boidinii) 및 한세눌라 폴리몰파(Hansenula polymorpha)로 구성된 군으로부터 선택되는 메틸영양체 효모 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 천연 생성 프로모터의 하나 이상의 돌연변이가 결실인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서, 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 천연 생성 프로모터의 적어도 50개 뉴클레오티드들, 바람직하게는 적어도 100개 뉴클레오티드들, 더 바람직하게는 적어도 200개 뉴클레오티드들, 보다 바람직하게는 적어도 500개의 뉴클레오티드들이 결실된 것을 특징으로 하는 방법.
세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 재조합 프로모터(상기 하나 이상의 유전자는 유전적으로 개질되지 않은 야생형 효모 세포의 천연 게놈 유전자위에 위치하며, 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 천연 생성 프로모터는 상기 천연 생성 프로모터 내에서 하나 이상의 돌연변이에 의해 불활성화됨) 및
관심 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 분비 카세트를 포함하는 유전적으로 개질된 효모 세포.
제 11항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 프로모터는 유전적으로 개질된 효모 세포가 유전적으로 개질되지 않은 야생형 효모 세포에 비해 적어도 100% 초과, 바람직하게는 적어도 200% 초과, 더 바람직하게는 적어도 300% 초과의 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 생성하도록 할 수 있는 것을 특징으로 하는 세포.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 세포 내에서 폴리펩티드들 또는 단백질들의 생합성을 지지하는 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자가 샤페론인 것을 특징으로 하는 세포.
제 13항에 있어서, 샤페론이 단백질 디설피드 이성화효소, 결합 단백질 Kar2/BiP 및 칼넥신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 프로모터가 유전적으로 개질된 또는 개질되지 않은 유도성 효모 프로모터인 것을 특징으로 하는 세포.
제 15항에 있어서, 효모 프로모터가 AOX1 프로모터, GAL1 프로모터, PGK 프로모터, ADH 프로모터, FDH 프로모터 및 FLD 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
제 16항에 있어서, 효모 프로모터가 Seq ID No. 1의 뉴클레오티드들 170 내지 235 또는 694 내지 723 또는 694 내지 723 및 737 내지 738 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 AOX1 프로모터인 것을 특징으로 하는 세포.
제 11항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 효모 세포가 바람직하게는 피치아속의 효모, 바람직하게는 피치아 파스토리스, 칸디다 보이디니 및 한세눌라 폴리몰파로 구성된 군으로부터 선택되는 메틸영양체 효모 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
제 11항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 천연 생성 프로모터의 하나 이상의 돌연변이가 결실인 것을 특징으로 하는 세포.
제 19항에 있어서, 생합성 지지 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자, 바람직하게는 디설피드 이성화효소의 천연 생성 프로모터의 적어도 50개 뉴클레오티드들, 바람직하게는 적어도 100개 뉴클레오티드들, 더 바람직하게는 적어도 200개 뉴클레오티드들, 보다 바람직하게는 적어도 500개의 뉴클레오티드들이 결실된 것을 특징으로 하는 세포.
제 11항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자가 벡터의 일부이거나 게놈 내로 통합되는 것을 특징으로 하는 세포.
재조합 단백질 또는 폴리펩티드의 제조를 위한 제 11항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 세포의 용도.