PT91453B

PT91453B - Processo para a preparacao de fungos filamentosos transformados, de construcoes de adn utilizadas para essa transformacao e de proteinas por expressao dessas construcoes

Info

Publication number: PT91453B
Application number: PT91453A
Authority: PT
Inventors: Annemarie Eveline Veenstra; Wim Van Hartingsveldt; Cees A M J J Van Den Hondel; Johannes A Van Den Berg
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1988-08-16
Filing date: 1989-08-16
Publication date: 1995-05-31
Also published as: JPH02174673A; DE68929013T2; FI893818A; ES2134754T3; JP2752714B2; PT91453A; DK175196B1; HUT51336A; DE68929013D1; GR3030901T3; EP0357127B1; IL91309A; DK399889D0; KR900003366A; CA1341226C; AU636572B2; FI110693B; EP0357127A1; ATE181111T1; IL91309A0

Description

DESCRIÇÃO

INTRODUÇÃO

Domínio técnico

A presente invenção refere-se à transformação e à expressão empregando transformantes de fungos filamentosos .

Antecedentes

A possibilidade de transformar células viáveis com ADN capaz de expressão abriu numerosas averri das a produtos novos e melhorados. Esta capacidade permitiu a produ

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ção de um grande número de proteínas de mamífero que de outra forma não eram acessíveis com facilidade. Noutros casos, parti cularmente em proteínas do sangue, a necessidade de se utilizarem origens naturais para a produção destas proteínas foi-se tornando cada vez mais inaceitável com a expansão do problema da hepatite e da SIDA. Para além das proteínas de mamífero para uso como produtos farmacêuticos existem várias outras proteí nas, particularmente enzimas, que são aplicáveis em vários processos comerciais. A quimosina podem ser utilizada na produção de queijo, as lipases são empregues, entre outras utilizações, nas reacções de transesterificação, as proteases são empregues entre outras utilizações, em aplicações alimentares e médicas e outras semelhantes.

Na obtenção destes variados produtos existe um forte interesse no aspecto económico da produção do produto. 0 primeiro aspecto de preocupação é o grau de expre£ são do produto desejado. Uma segunda preocupação é a estabilidade do produto no hospedeiro particular. Uma terceira preocupação refere-se ao isolamento e à purificação do produto, em particular quando o produto pode ser um produto farmacêutico ou um aditivo alimentar.

Na obtenção de um produto proteico , dependendo de uma sequência de sinal funcional, o produto pode ser retido no citoplasma ou pode ser segregado para o meio de cultura. Os diferentes hospedeiros possuem diferentes produtos de secreção bem como vários níveis de secreção conforme a secreção for indutível ou não indutível. Na maior parte das situações a secreção oferece muitas vantagens uma vez que o produto pode ser isolado do meio de cultura substancialmente isen to de proteínas intracelulares e de detritos celulares. Assim a separação apenas terá de ser realizada em relação a outras proteínas segregadas pelo hospedeiro e a pequenas quantidades de proteína que podem resultar da lise ou de degradação celular. Por isso á de interesse considerável proporcionar sistemas que tenham como resultado uma expressão eficaz de produtos de interesse sob condições de fácil isolamento e purificação.

- 2 Literatura relevante

A transformação de fungos filamentosos foi descrita por vários autores (Tilburn et al., Gene 26 (1983? 205-221; John e Peberdy, Enzyme Microb. Technol. 6 (1984) 386-389; Ballance e Turner, Gene 36 (1985) 321-331; VanHartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 206 (1987) 71-75; Goosen et al,, Ourr. Genet. 11 (1987) 499-503); na EP-A-0134438 e 0238028 e no pedido de patente internacional (PCT) WO 86/06097«

As espécies de fungos tais como

Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor miehei e Trichoderma reesei são largamente utilizados na produção industrial de enzimas, p.ex. para uso na industria alimentar (ver por exemplo Strijkert, Antonie van Leeuwenhoek 55 (1987) 35^-362). 0 seu uso é baseado na capacidade de segregação destes microorganismos. A «niger e A. oryzae são utilizados em grandes quantidades e numa escala comercial para esta produção e são, por consequência, microorganismos bem caracterizados no que respeita ao seu comportamento na fermentação. Têm sido aplicadas a Aspergilli técnicas de engenharia genética e têm sido obtidos transformantes que sintetizam produtos adicionais úteis (Gulien et ai., Bio/technology 5 (1987) 269-376; Gwynne et al., Bio/technology 5 (1987) 713-719; Upshall et al., Bio/technology 5 (1987) 1301-1304). Nestes casos a proteína seleccionada tem sido expressa em conjunto com as proteínas segregadas normalmente pelo hospedeiro e em consequência a proteína seleccionada precisa de ser separada das outras.

A substituição de genes encontra-se documentada para Aspergilli (p.es. Miller et al., Mol. Cell. BÍ0I..5 (1985) 1721; van Hartingsveldt et al., vide supra;

Goosen et al., Curr. Genet. 11 (1987) 499-503; Wernars et al. , Mol. Gen. Genet. 209 (1987) 71-77)· Para A. nidulans, para genes que codificam para enzimas que formam parte das vias biossin téticas , p.ex. para ácidos aminados e nucleótidos, têm sido empregues variados métodos. Miller et al. , (vide supra) usa uma

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substituição de gene de uma única fase do gene TrpG com um fra£ mento de restrição que contém apenas um gene homólogo modificado , ou então um processo de duas fases utilizando úm plasmídeo circular. A substituição de genes de uma fase requer a ocorrência de dois acontecimentos de cruzamento numa única substituição de gene (cf. Figura 7); num processo de duas fases, a primeira fase é um acontecimento de integração simples, seguida de uma recombinação que deixa a cópia do gene integrada e remove o gene nativo (segunda fase). A ocorrência da segunda fase tem sido seleccionada por busca do fenótipo na cópia do gene integrada.

É sabido que o nível de expressão natural de muitos genes na via metabólica dos ácidos aminados, p.ex. TrpC e ArgB, ocorre apenas num nível moderado. As enzimas codificadas por estes genes formam çpenas uma fracção muito pequena do total da proteína celular. No entanto estes genes gão essenciais uma vez que a sua perda tem como resultado a auxotrofia e a necessidade de fornecer o metabolito ou o ácido aminado ao meio de crescimento. Por isso ambas as substituições de genes bem como outras substituições de genes análogos são facilmente conseguidas e os transformantes podem ser facilmente isolados (esser e Líohr, Process Biochemistry (1986) 153-159).

Para A. niger foram relatados resultados semelhantes por via Hartingsveldt et al., vide supra e Goosen et al., vide supra para o local pyrQ-. 0 gene pyrG codific^ para uma enzima da via biossintética que conduz à uridina. Nes tes exemplos a substituição de genes foi novamente efectuada num gene facilmente seleccionável, isto é, o gene foi utilizado como um marcador de selecção na transformação.

Deve-se notar que nenhuma das proteinas obtidas descritas nas referências acima mencionadas foi segregada, nem por A. nidulans nem por A. niger.

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Existe por isso a necessidade de propor cionar sistemas de substituição de genes para locais genéticos que são activamente expressos e que codificam para proteínas que formam a maior parte da proteína celular total e para locais genéticos que codificam para proteínas que são segregadas activamente pelas células.

SUMÁRIO DA PRESENTE INVENÇÃO

São proporcionados sistemas de expressão para fungos filamentosos empregando hospedeiros eficazes na segregação com blocos integrados (cassettes) projectados para recombinação homóloga num local de uma sequência que codifica para uma proteína altamente empressa e segregada.

A integração pode incluir de modo conveniente uma proteína de marcação quando o bloco integrado de expressão se encontra bordeado pelas regiões 5' e 5' não codifi cantes do gene visado. 0 transformante proporciona altos níveqs de expressão e uma secreção eficiente. Em opção, mantém-se um inibidor de protease no meio de cultura para prevenir a proteólise do produto pretendido.

BREVE DE30RIQÃQ DOS OESEEHQS

A Figura 1

A Figura 2

A Figura 3

A Figura 4

A Figura 5

A Figura 6 mostra os oligonucleótidos utilizados para isolar o gene da glucoamilase de A. niger (AG);

é um mapa do gene da glucoamilase de A. niger (AG) de subclones que foram construídos e de uma sonda de hibridação utilizada nas experiências; descreve a construção de pAB64-40;

é uma representação esquemática de pAn?6-l; é uma representação esquemática de mAB64-0;

descreve a construção de pAB64-72, pAB64~73 e PAB64-75; e

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A Figura 7 é una representação esquemática do gene de substituição no local de glucoamilase.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE CONCRETIZAÇÃO ESPECIFICA

São proporcionados de expressão eficien tes empregando fungos filamentosos. Os sistemas empregam hospedeiros que segregam os produtos para integração das construções de expressão. As construções de expressão compreendem o gene de interesse, os quais para uma recombinação homóloga são bordejados por regiões 5' θ 3' não codificantes do local visado, para integração. 0 local visado compreenderá um gene que codifica para uma proteína que è segregada. 0 crescimento e a indução do hospedeiro transformante têm como resultado uma expressão eficaz e secreção do produto pretendido bem como a facilidade de isolamento devido à ausência do produto de expres são do locai visado no meio de cultura.

Os hospedeiros de interesse são os fungos filamentosos que possuem níveis de secreção eficazes das suas proteínas endógenas. São de especial interesse as estirpes de Aspergillus para produção industrial, particularmente niger, awamori ou oryzae. Em alternativa podem ser empregues Trichoderma reesei, M. miehei e Aspergilli tal como A. ficuiim.

A construção de expressão compreenderá o gene de interesse tendo normalmente uma sequência de sinal que é fiincional o hospedeiro e que proporciona a secreção do produto de expressão. Para a maior parte para recombinação homóloga a sequência de sinal será homóloga ou substancialmente homóloga da sequência de sinal do gene do local visado.

No entanto as sequências de sinal podem ser projectadas para proporcionar a secreção. Por exemplo ver von Heijne, Eur. J. Biochem. 133 (1983) 17-21; e Perlman e Halvorson, J. Mol. Biol. 167 (1983) 391-409· 0 produto de expressão ou gene de interesse pode ser homólogo ou herterólogo em relação ao hospedeiro.

Por homólogo compreende-se uma proteína nativa do hospedeiro de tipo selvagem, enquanto que por heterólogo se compreende uma proteína que é estranha ao hospedeiro e inclui mutantes que não se encontram na natureza.

gene de interesse pode ter a sua pró pria sequência de sinal ou ser ligado a uma sequência de sinal do hospedeiro ou a uma sequência de sinal sintética conforme for apropriado. A sequência de sinal particular que foi escolhida pode variar dependendo do gene de interesse e do local visado. É de particular interesse o empregado da sequência de sinal no local visado o que proporciona uma região adicional de homologia para integração nesse ponto e que se sabe permiti: uma secreção eficaz. A sequência de ADN que c.odifica para a sequência de sinal pode ser ligada directamente através da sequência que codifica para o sinal de processamento (local de reconhecimento de cisão) para a sequência de codificação da proteína madura ou através de uma curta ponte normalmente com menos de dez codões.

A região em 5¹ em relação ao quadro d' leitura aberto para o gene de interesse compreenderá o início de transcrição da região reguladora. Qualquer região funcional no hospedeiro pode ser empregue . No entanto, na maioria dos casos, a região que é empregue será homologa em relação à região do local visado. Esta ciscunstãncia possui o efeito de substituir o produto de expressão do local visado pelo produto de expressão de interesse. Na medida em que o nível de ex* pressão e de secreção da proteína endógena é suficiente para proporcionar uma produção eficaz, esta região reguladora de início de transcrição será normalmente julgada como sendo satisfatória. No entanto em alguns casos pode-se desejar níveis de transcrição mais elevados do que o gene de tipo selvagem ou pode-se desejar ter uma expressão indutível empregando um agen te de indução particular. Nestes casos será empregue uma região reguladora de início de transcrição que é diferente da região no local visado. É conhecido um largo número de regiões

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fungos filamentosos. Estas regiões incluem os genes que codif. cam para a glucoamilase , amilase fúgica, fosfatase ácida,

GAPDH , TrpC , AmdS, AlcA, AldA, H2A histona, Pyr4, PyrG , sintetase de isopenicilina,N, PGK, protease ácida, acil-transferase e semelhantes.

local visado codificará de preferência um gene de proteína com um alto grau de expressão, isto é, um gene cujo produto de expressão ê segregado a uma concentração de pelo menos cerca de 0,1 g/1 no fim do processo de fermentação . A duração deste processo pode variar dependendo em· tre outros factores do produto proteico pretendido. Como exem pio de um destes genes, o gene que codifica para a glucoamilase (AG) serve de ilustração. Outros genes de interesses incluem cX-amilase fúngica, fosfatase ácida, protease, protease ácida, lipase , fitase e celobio-hidrolase.

gene de interesse pode ser qualquer gene que possa ter alguma aplicação intencional. As proteínas selecionadas, heterólogas em relação a Aspergillus, são p.ex. quimosina, interleuquinasg factores de coagulação do sangue, como factor VIII ou IX, fosfolipases, lipases e enzimas de degradação de parede celular (enzimas capazes de separar os polissacarídeos presentes em paredes de células vegetais). Como exemplos de proteínas homólogas em relação a Aspergillus podem-se referir fitases, fosfatases, xilanases, β-galactosidases, reninas, oxidases de glucose e amilases.

A região reguladora de terminação de transcrição pode ser do gene de interesse, o local visado, ou qualquer outra sequência conveniente. Quando a construção inclui mais outras sequências de interesse a juzante na direçção de transcrição a partir do gene de interesse, a região regulado ra de terminação de tnamacrição, se for homóloga em relação ao local visado, deve ser substancialmente mais pequena que a região flanquaadora homóloga.

Normalmente emprega-se um marcador de selecçao, o qual pode ser parte da construção de expressão ou pode ser separado da construção de expressão de maneira que pode ser integrado num local diferente do gene de interesse. Uma vez que as moléculas recombinantes da presente invenção são de preferência transformadas numa estirpe hospedeira que pode ser utilizada para produção industrial, os marcadores de selecçao para monitorizar a transformação são de preferência u marcadores de selecção dominantes, isto é, não têm de ser introduzidas mutações na estirpe hospedeira para estar apta a us os marcadores de selecção. São exemplos os marcadores que per mitem que os transformantes cresçam em fontes nutrientes definidas (p.ex. o gene de A. nidulans amds permite que os transformantes de A. niger cresçam em acetamida como fonte única de nitrogénio) ou marcadores que conferem resistência a antibióticos (p.ex. o gene ble confere resistência a fleomicina ou o gene hpfr confere resistência a higromicina 3).

gene de selecção terá as suas próprias regiões reguladoras de início ou terminação de transcrição e de tradução para permitir uma expressão independente do marcador. São conhecidas numerosas regiões reguladoras de início de transcrição cal como descritas acima e podem ser utilizadas em conjunto com o gene marcador. Quando se emprega uma resistência a um antibiótico, a concentração do antibiótico para selecção variará dependendo do antibiótico mas rondando em geral de cerca de 50 até 500 ;ug/ml do antibiótico.

As diversas sequências podem ser juntas de acordo com técnicas conhecidas tais como restrição, jun ção de locais de restrição complementares e ligação, terminação em extremidades alinhadas por preenchimento das saliências e ligação das extremidades alinhadas, ressecção Bal51, reparação por iniciador, mutagénese in vitro ou semelhantes. Podem ser empregues poliligadores e adaptadores conforme for apropria do. Estes podem ser introduzidos ou removidos por técnicas conhecidas para permitir a facilidade da montagem da construção

de expressão. Em cada fase da síntese da construção o fragmen to pode ser clonado, analisado por digestão com enzimas de res tricção, sequenciação ou hibridação ou semelhantes. Um grande número de vectores estão disponíveis para clonagem e a escolha particular não é crítica para a presente invenção. Normalmente a clonagem ocorrerá em E. coli.

As regiões de flanco podem incluir pelo menos parte do quadro de leitura aberto do local visado, em par ticular a sequência de sinal e as regiões reguladoras 5’ θ 5' do gene do local visado, ou pode estender para lá das regiões reguladoras. As proteínas da região de flanco que compreende o quadro de leitura aberto não codificará normalmente um gene intacto capaz de expressão de um produto funcional. Normalmente uma região de flanco terá pelo menos 100 pb, normalmente pelo menos 200 pb e pode ter 500 pb ou mais. As regiões de flanco são seleccionadas de maneira a romper o gene visado e prevenir a sua expressão. Isto pode ser conseguido através de inser ção do bloco integrado de expressão no quadro de leitura aberto próximo da região 5’, através da substituição de todo ou de apo nas uma porção do gene visado pela construção de expressão ou tendo a construção de expressão situada entre a região reguladó ra de início de transcrição no local visado e o quadro de leiti. ra aberto. Tal como já foi indicado, quando a região reguladora de terminação é homóloga da região no local visado, a região de flanco 3’ deve ser substancialmente maior do que uma região reguladora de terminação presente na construção.

A construção pode ser utilizada para transformação do hospedeiro como um vector de clonagem linear ou circular ou pode ser removida do vector de clonagem se tal for pretendido. 0 plasmídeo será normalmente linearizado dentro de cerca de 1 kpb do fim da construção de expressão. Existem várias técnicas para a transformação de fungos filamentosos. Estas técnicas incluem fusão ou transformação de protoplé,. tos, electroporação e microprojécteis disparados para dentro das células. Descobriu-se que a transformação protoplastos tem

BAD sucesso e pode ser utilizada com vantagem. 0 micélio da estir pe de fungo de interesse é em primeiro lugar convertido em pro toplastos por digestão enzimática das paredes das células na presença de um estabilizador osmótico tal como KC1 ou sorbitol A absorção do ADN pelos protoplastos é auxiliada pela adição d CaCl2 e de uma solução concentrada de polietileno-glicol; esta última substância provoca a agregação dos protoplastos e por este processo o ADN transformante é incluído nos agregados e é absorvido pelos protoplastos. 3ubsequentemente deixou-se os protoplastos regenerarem-se em meio sólido que contem um estabilizador osmótico e, quando apropriado, um agente selecti· vo para o qual é codificada uma resistência pelo ADN transformante.

Após selecção dos transformantes a presença de genes de interesse pode ser determinada de várias maneiras. Empregando anticorpos onde o produto de expressão é heterólogo em relação ao hospedeiro, pode-se detectar a presença de expressão do gene de interesse. Em alternativa, podem-se utilizar as manchas de Northern ou de Southern para detectar a presença do gene integrado ou do seu produto de transcrição.

As células podem então ser cultivadas num meio de cultura conveniente. Podem ser utilizadas baixas concentrações de um inibidor de protease tal como fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 2-macroglobulinas, pepstatina ou semelhantes. Normalmente a concentração situar-se-á numa gama desde cerca de ug/ml até 1 mg/ml. 0(s) gene(s) de protease po de(m) ser inactivado(s) de modo a evitar-se ou a reduzir-se a degradação da proteína pretendida.

Os locais visados que podem ser utilizados com vantagem são o gene de glucoamilase de A.niger ou de A. awamori, o gene da amilase fúngica de A. oryzae, os genes de celobio-hidrolase de T.reesei ou o gene de protease ácida de liucor miehei .

Γ' pA

Os transformantes podem ser cultivados em reactores descontínuos ou contínuos, sendo o meio de cultura isolado e o produto pretendido extraído. Podem ser empregues vários métodos para a purificação do produto conforma for necessário, tais como cromatografia, p.ex. HPLC ou cromatografia em camada fina preparativa, extracção solvente-solvente, electroforese, combinação destes métodos ou outros semelhantes,

Os exemplos que se seguem são apresentados como ilustração e não como limitação.

PARTE EXPERIMENTAL

Exemplo 1

Construção de vários blocos integrados de expressão.

A. Metodologia

Todas as construções foram preparadas utilizando procedimentos normais da biologia molecular, tal como descritos em Maniatis et al., (1932) molecular Cloning,

A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. Plasmídeos ρΑΒβ-l, pA36-2A, pAB6-3 θ pA36-4 gene da glucoamilase de A-niger foi isolado a partir de bibliotecas de plasmídeos contendo fragmen tos EcoRI de 3 a 4 kb ou fragmentos HindIII de 13 a 15 kb em pUC19 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985) 103-119, obtenível p.ex. de Boehringer Mannheim, Alemanha) , utilizando sondas oligonucleotídicas (Fig. 1) baseadas na sequência de nucleétidos puplicada para A« niger (Boel et al., EMBO J. 3 (1984) 1097-H02; Boel et al. , Mol. and Cell. Biol. 4 (1984) 2306-2315) · As sondas oligonucleotídicas foram derivadas da sequência que envolve o intrão 2; o oligómero de 42 bases localiza-se em 3* em relação ao nitrão e possui uma polaridade idêntica ao ARNm de AG. 0 oligómero de 24 bases encontra—se a montante do intrão 2 e é escolhido antiparalelo ao ARNm.

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plasmídeo ρΑΒ6-1 contém ο gene de AG num fragmento HindIII de 14,5 kb. No plasmídeo pAB6-2A está presente todo o gene de AG num fragmento EcoRI de 3 »4 kb . 0 plasmídeo pAB6-3 contém o fragmento EcoRI de 1,8 kb que está presente imediatamente a montante do gene de AG; este fragmento contém provavelmente as sequências reguladoras e foi subclonado de pA36-l. 0 plasmídeo pAB6-4, outro subclone de pAB6-l, contém um fragmento HindIII-BglII de 4,6 kb que compreende a região a montante do gene de AG e parte da extremidade 5' do gene (ver o mapa da figura 2). Todos os fragmentos foram clonados em pUC19♦

Plasmídeo pAB64-40 plasmídeo pAB6-2A (Fig· 2) foi tratado com Accl e polimerase T4 para gerar fragmentos Accl com pontas alinhadas. 0 fragmento de 1,2 kb que contêm as sequências de flanco 3' do gene de AG, incluindo o terminador, foi isolado, 0 plasmídeo pUR1524 que contém o ADNc de quimosina de bovino (ver EP-A-077109) foi parcialmente digerido com Sall e EcoRI. 0 fragmento que contém o ADNc de quimosina foi isolado, as extremidades coesivas foram preenchidas com polimerase de ADN T4 e o fragmento de extremidades alinhadas foi ligai com ligantes de Sall. 0 fragmento foi digerido com Sall e com

HindIII e foi ligado a pPA153^-2O9 (Van Putten et al., J. Bacte riol. 168 (1986) 728-733) que tinha sido digerido com Sall e

HindIII. A construção resultante, pRCH4, foi cortada com Bell e tratada com polimerase T4 para gerar extremidades alinhadas. Subsequentemente o fragmento Accl que contém o terminador de AG foi ligado neste local, dando origem ao plasmídeo pAB64-10, Nesta construção é restaurado o local Bell preenchido, em 3’ do gene de quimosina.

Em seguida, o plasmídeo pAB6-3 (Fig. 2 foi parcialmente digerido com EcoRI e tratado com polimerase T4. Ligou-se neste vector o fragmento HindIII e o fragmento EcoRI do plasmídeo pAB6—4, de novo após tratamento com polime— rase T4. A construção resultante é o plasmídeo pAB6-31; esta

- 13 cad original )

construção contém um fragmento de 3,6 kb a montante do gene de AG- com um local EcoRI destruído situado ao meio de um único local EcoRI perto do gene de AG. Neste local EcoRI único foi ligado um fragmento EcoRI de pAB64-10 parcialmente digerido contendo o ADNc de quimosina e o terminador de AG; a construção resultante é o plasmídeo pAB64-20, 0 local EcoRI presente entre o terminador e o vector foi destruído por digestão parcial com EcoRI seguida de tratamento com polimerase T4 e ligação. A nova construção é o plasmídeo pAB64-40; esta construção contém novamente um único local EcoRI, agora presente na junção de sequências a montante de Ag, e ADNc de quimosina (Fig. 3).

Plasmídeo pAN76-l plasmídeo pAN7-l (Punt et al., Gene 56 (1987) 117-124) foi digerido com HindIII. Neste local ligou-se o fragmento Sall e o fragmento HindIII de pAB-6-1 (figura 2) que está presente em 3' úo gene de AG, após preenchimento do local Sall com polimerase T4, A partir desta construção, pAn76-l (Figura 4), isolou-se o gene HygB e o fragmen to de AG de flanco 3’ sob a forma de um fragmento StuI e HindlXl

Pago mAB64-0 pequeno fragmento EcoRI e NruI do plasmídeo pAB6-2A, que contém o promotor de AG e as sequências reguladoras, foi isolado e ligado no fago M13mpll (Messing e Vieira, Gene 19 (1982) 269-276, obtenível de p.ex. Pharmacia, Suécia) , digerido com EcoRI e BamHI juntamente com o fragmento Sall e Bell do plasmídeo pRCH4 que contém ADNc de quimosina de bovino e tratado no local Sall com polimerase J4. A construção resultante, fago mA364-0, contém uma proteína de fusão entre AG e prê-proquimosina (Fig. 5)5 esta construção foi sujeita a mutagenese in vitro .

BAD ORIGINAL

B. 31ocos integrados de expressão específicos

Três blocos integrados de expressão para auimosina de bovino foram construídos a partir de mAB-64-0, contendo cada um um local de fusão diferente entre a região reguladora de AG e o ADNc de quimosia de bovino.

Para este fim foram projectados os três oligonucleótidos seguintes:

N° .

1 :

5’- AT

TAC

ACG

TCA

GGA

ATG

AGG

TGT

CTC

GTG

GTG 3'

N° .

2:

5'-TGC

ACA

GGG

TTG

GGA

GGT

GAG

ATG

AGG

ATG GGT

N° .

3:

5’-AGG

GAT

AAG

GGG

GAG

GCT

GAG

ATG

AGG

3'

Estes oligonucleótidos foram utilizados para juntar o promotor de AG à pré-proquimosina (N2. 1) ou o promotor de AG e o peptídeo de sinal para a proquimosina (N2. 2). Utilizando o olignucleótido NS. 3 é feita uma proteí na de fusão entre o ácido aminado 71 do gene de AG maduro e a proquimosina.

A identidade destas construções foi estabelecida por análise sequencial de ADNcs das construções resultantes (mAB64-2, mAB64-3- e mAB64-5). A partir destas construções isolaram-se os fragmentos EcoPI contendo as fusões de genes pretendidas e inseriram-se em pA364-40 para se obter pAB64-42, pAB64-43 e pAB64-45 respectivamente . Inseriu-se nestes plasmídeos pAB64-42, pAB64-43 e pAB64-45 fragmento StuI e HindiII isolados a partir de pAN 76-1, cujo fragmento continha o gene HygB mais um elemento de flanco 3^f do gene de AG.

As construções finais são pAB64-72, pA364-73 e pA364-75, Estas construções contêm um único local HindIII em 3’ em relação ao bloco integrado de expressão e à região de flanco 3' (figura 6j.

BAD ORIGINAL ’’

- 15 sjy

Exemplo 2

Transformação de Aspergillus niger para se obter substutuição âe genes

A transformação âe A. niger âe acorâo com a presente invenção foi levada a cabo com técnicas tal como descritas por Van Hartingsvelât et al., (vide supra) e Yelton et al. , (vide supra) .

A estirpe A. niger D8 29⁷5 (uma amostra desta estirpe foi depositada na CBS sob ο N2. 5^3 « -88 a 10 de Agosto de 1988) foi cultivada durante 24 h, ou mais se necessário, a 54°G . 0 micélio foi colhido por filtração através de um tecido de nylon estéril e foi lavado com MgSO^ 0,6 M (máx. 12,5 ml por 100 ml de cultura). 0 micélio foi subsequen temente transferido para um tubo estéril, pesado e ressuspenso em 5 ml de meio osmótico (MgSO^ 1,2 wí, tamponado com fosfato 10 mM, pH 5,8) por grama de peso húmido. Após adição de Novozym 254- (NOVO Dinamarca; 20 mg/ml em meio osmótico) a 1 ml por grama de peso húmido e BSA (Sigma, Holanda; 12 mg/ml em meio osmótico) a 0,5 ml por grama de peso húmido, deixaram-se formar protoplastos com agitação suave (50 rpm) a uma temperatura de 25 a 27°C. A formação de protoplastos foi seguida por inspecção ao microscópio a intervalos regulares. Após a formação de protoplastos estar completa foram transferidos 15 ml da solução de protoplastos para um tubo de Oorex estéril de 30 ml e por cima da suspensão de protoplastos foi cuidadosamente depositado uma camada superior de 10 ml de tampão de aprisionamento (sorbitol 0,6 M, Tris/HCl 100 mM, pH 7,0). Os tubos foram centrifugados a 5000 rpm., 4°C durante 15 min. num rotor de tubos oscilantes. Os protoplastos foram cuidadosamente recolhidos da interfase com uma pipeta de Pasteur estéril com uma abertura larga para se evitar qualquer esforço de corte sobre os protoplastos. A separação de fase foi repetida quando após centrifugação se verificou o aparecimento de um agregado sólido de grandes dimensões; neste caso o agregado foi

- 16 BAD

ORIGINAL

Mj

ressuspenso cuidadosamente em meio osmótico, aplicou-se uma nova camada de tampão de aprisionamento e repetiu-se a cantri. fugação. Os protoplastos foram recolhidos e lavados cuidadosamente por ressuspensão dos protoplastos em STC frio (sorbitol 1,2 M; de Tris/HCl 10 mM a pH 7,5; CaCl₂ 50 mM) e centrifugação a 3000 rpm, 4°C durante 10 min. A lavagem foi repeti | da até se ter obtido uma preparação de protoplastos isenta de partículas contaminantes. 0 agregado de protoplastos foi res suspenso em STC frio numa concentração final de 1 x 10 protoplastos (pps)/ml.

Os protoplastos foram utilizados imediatamente ou então armazenados de um dia para o outro a 4°C. Quando se usam os protoplastos do dia anterior, lavam-se no dia seguinte novamente com STC frio.

Para a transformação, adicionaram-se 107 protoplastos a 10 /il de STC ou em 10 ;ul de TE (TE contém Tris/HCl 10 mM; e EDTA 1 mM a pH 8,0). Para se obterem substi tuições de genes, as construções plasmídicas pAB64-72, pAB64-73 e pAB64-75 foram linearizadas por corte no único local de resticção do HindIII que está presente em todas as três construções imediatamente a juzante do marcador de selecção e da região de flancos 3’ do gene de AG (figura 6).

A mistura de protoplastos e ADN foi incubada à temperatura ambiente durante 25 min. Em seguida adicionou-se solução PEG (60 % de polietilenoglicol 4000 , Brocacef/BDH; Tris/HCl 10 mM a pH 5»7; CaCl₂ 50 mM) em porções de 200 /il, 200 jil e 850 jil. A mistura foi cuidadosamente homo geneizada após adição de cada porção de PEG e incubada à temperatura ambiente durante 20 min após adição da última porção de PEG. Ocorreu por vezes a precipitação de plasmídeos grandes (>18 kb); esta precipitação foi evitada por substituição da solução de PEG a 60% por solução de PEG a 25%.

^— Os protoplastos transformados foram lavados com 10 a 15 ml de STC frio por meio de mistura suave e centrifugação a 5000 rpm, à temperatura de 4°C durante 10 min. Os protoplastos foram ressuspensos em 100 ;ul de STO e inoculados cuidadosamente em placas selectivas contendo 200 _pg/ml de hidromicina B (Sigma H 2658). As colónias resistentes à hidromicina foram submetidas a uma análise mais profunda, começando em esporos simples isolados.

Exemplo 5

Demonstração da substituição de genes

A. Mancha de Southern

Para se determinar se a substituição de genes nos transformantes realmente teve lugar utilizou-se a técnica da mancha de Southern para demonstrar a ausência de ADN específico de glucoamilase dos transformantes. Um fragmento de ADN homólogo do gene da glucoamilase é tornado radioactivo e é hidridado com ADN dos transformantes após separação do ADN por electroforese e fixação do ADN cromossomal numa membrana de nylon. Podem ser detectadas quantidades muito pequenas de ADN homólogo por este método. 0 ADN foi isolado a partir dos diversos transformantes de cada uma das três construções utilizadas para transformação. 0 ADN foi isolado apósose ter triturado o micélio em nitrogénio líquido utilizando procedimentos normais. 0 ADN genómico foi digerido com EcoRI , separado por electroforese e depositado sobre uma membrana de nylon Gene Screen Plus (TM) (Dupont, USA). Em primeiro lugar as manchas foram hibridadas com uma sonda radioactiva específica para AG: o fragmento BamHI e BglII interno de AG (figura a). Os transformantes que não mostravam qualquer sinal de hidridação utilizando esta sonda (é esperado um fragmento EcoRI de 3,4 kb se o gene de AG estiver ainda presente nos transformantes) foram seleccionados com outras sondas para confirmar a ocorrência da substituição do gene. Para • este fim os produtos digeridos com EcoRI foram hidridados com «

- 18 BAD

pA364-radioactivoç para confirmar a presença de todos os fragmentos essenciais derivados de piasmídeo, e com pU019 radioactivo para confirmar a ausência de ADN bacteriano. Os resultados destas experiências mostraram a presença de todos os fragmentos derivados de plasmídeos esperados incluindo o ADNc de quimosina de bovino e a ausência de ADN bacteriano em 7 dos 56 transformantes analisados inicialmente. Todos os transformantes seleccionados contém um único bloco integrado de expressão de quimosina.

3. Líancha de Western

A ausência de um gene seleccionado a partir do genoma de um organismo pode ser determinada de várias maneiras. A hibridação por mancha de Southern tal como descrito acima no parágrafo À é um meio poderoso para determinar a ausência de material genético que é homólogo da sonda utilizada. Outra forma de demonstrar a ausência de um gene específico é demonstrando a ausência do produto do gene de interesse neste caso o gene de glucoamilase. Uma técnica muito sensível para demonstrar a presença ou ausência de uma proteína numa preparação é a análise por mancha de Western. Nesta técnica são utilizados anticorpos específicos , desenvolvidos contra a proteína de interesse, para demonstrar a presença ou a ausência dessa proteína específica. Estes anticorpos ligam-se à proteína que tinha sido fixada sobre uma membrana de nitrocelulose. Em seguida utiliza-se uma segunda preparação de anticorpos desenvolvida contra a primeira preparação de anticorpos Esta segunda preparação de anticorpos é conjugada com uma enzima que está apta para processar um substrato incolor transformando-o num produto colorido. Aparecerá uma banda colorida nos pontos em que está presente material imunogénico que pode reagir com a primeira preparação de anticorpos.

Os transformantes que foram seleccionados a partir dos resultados da mancha de Southern como tendo o gena de AG substituído pelo gene da quimosina de bovino foram

- 19 BAD ORIGINAL cultivados na presença de amido para induzir a região reguladora de AC- e os sobrenadantes da fermentação foram analisados por análise de mancha de Western e comparados com o sobrenadante da fermentação da estirpe hospedeira. Foram depositados 20 yul de cada sobrenadante sobre gel de poliacrilamida a 7,5 % em 3DS e as bandas de proteína foram separadas por electroforese. 0 gel foi depositado por eleotroforese sobre uma membrana de nitrocelulose utilizando os protocolos normais.

A membrana de nitrocelulose foi incubada após diversas fases de lavagem com um anti-soro policlonal desenvolvido contra glucoamilase que fora purificada a partir de uma preparação comercial por cromatografia em coluna de HPLC . Por tratamento da membrana com a segunda preparação conjugada de anticorpos não foram reveladas quaisquer bandas coloridas na preparação de transformantes enquanto que na preparação de hospedeiros estava presente uma banda de dimensão aproximada da glucoamilase. Esta experiência demonstra que nos transformantes seleccionados não é sintetizado qualquer material que possa reagir com o soro anti-AG e daqui se conclui que o gene de AG foi substituído pelo gene de quimosina de bovino.

C. Influência da substituição de genes na quantidade de proteína segregada

A glucoamilase forma uma parte substancial da quantidade da proteína total que é segregada por A. niger (p.ex. Cullen et al., vide supra). Por conseguinte, a substituição do gene de glucoamilase por outro gene de proteína pode influenciar a quantidade de proteína segregada por transformantes de A. niger; um decréscimo no conteúdo proteico do caldo de fermentação pode facilitar a purificação de outras proteínas segregadas. Além disso, se a capacidade da via de secreção é limitada, a remoção da glucoamilase da célula deixará a via de secreção livre para outras proteínas.

Para investigar o efeito da substituição de genes na quantidade de proteína segregada, o conteúdo de

proteína dos sobrenadantes de fermentação foi determinado por métodos normais e foi comparado com os dados do hospedeiro.

Quadro 1 sintetiza os resultados obtidos.

Ouadro 1

- — —

Conteúdo proteico dos caldos de fermentação (cf. Exemplo 4).

Estirpe (Concentração proteica , (mg/ml)

A. niger	DS	2975		I	0 .143
A. niger	DS	2975	+	pAB64-^r?2 \|	0 .096
A. niger	DS	2975	+	pA364-73 \|	0 .082
A. niger	DS	2975		PA354-75 1	0 .076

Os resultados obtidos nesta experiência estão de acordo com a ausência do gene de glucoamilase altamente expresso nos transformantes analisados.

Exemplo 4

Expressão e secreção de quimosina de bovino por A. niger utilizando o peptídeo de sinal de quimosina e de AG

Transformou-se A. niger com pA3S4-72 e pA364-73 linearizados tal como descrito no exemplo 2. A ocor rência da substituição de genes nos transformantes foi estabe lecida tal como se descreve no Exemplo J. Os transformantes seleccionados foram analisados para verificar a produção e a secreção de quimosina, com início em preparações isoladas de esporos simples. A quimosina é normalmente segregada sob a forma de zimogénio: a enzima segregada está inactiva devido bad original u —21 à presença de um pequeno peptídeo N-terminal (proquimosina). Este zimogénio é activado pela remoção do pequeno peptídeo N-terminal p.ex. por cisão enzimática ou, no caso da quimosina, por incubação a baixo pH. Por conseguinte, para se medir com precisão a actividade da quimosina segregada toda a proquimosina segregada é convertida na sua forma activa por tratamento a pH baixo.

A. Fermentação de transformantes de A. niger contendo uma substituição de genes no gene de AG

Cerca de 10 esporos de transfo rmantes seleccionados foram inoculados nos balões deErlenmeyer contendo 100 ml de meio de pré-cultura líquido contendo KH^O^ (1 g/1), maltose (50 g/1), extracto de levedura (5 g/1) caseína hidrolisada (10 g/1), IvígSO^.7^0 (0,5 g/1) θ Tween 80 (5 g/1)· Estas culturas foram cultivadas a 34-°C durante 48 horas. Collhe ram-se amostras para análise da produção de quimosina e para isolamento de ARNm; 10 ml desta cultura foram inoculados em 100 ml de meio de cultura contendo KH-PO^ (1 g/1), amido de milho (70 g/1), extracto de levedura (12,5 g/1), caseína hidro lisada (10 g/1), K₂S0₄ (2 g/1), iígSO^.TH^ (0,5 g/1), Zn01₂(0,03 g/1), 0aCl₂ (0,02 g/1), LíelSO^.4H₂0 (0,01 g/1), FeSO^ (0 ,3 g/1)· Estas culturas foram incubadas durante 48 horas a 34°0; foram novamente colhidas amostras para a análise da produção de quimosina e para o isolamento do ARNm.

B. Determinação dos níveis de ARNm em amostras de micélio micélio foi recolhido, lavado com água destilada e reduzido a um pé fino sob nitrogénio líquido utilizando um almofariz e um pilão isentos de RNase. 0 pé foi dissolvido em 2 ml/g de tampão de homogeneização (isocianato de guanidina 4 M; citrato de Na 5 a pH 7,0; β-mercaptoetanol 0,1 M; 0,5 % (p/v) de sal de sódio de N-lauroíl-sarcosina (Sigma L-5125)) e incubou-se a 37°C durante 30 min. Adi cionou-se ao sobrenadante da centrifugação durante 15 min a

BAD ORIGINAL

5000 rpm de 0,4 g/ml de CsCl isento de RNase. Esta solução foi depositada cuidadosamente sobre uma camada de amortecimento de CsCl 5,7 M em EDTA 0,1 B; submeteu-se a centrifugação durante 17 h a 38000 rpm a 20 °G num rotor Ti 42.1.0 agregado límpido de ARN foi dissolvido num tampão isento de RNase (Tris -HCl 10 mM a pH 7,4·; EDTA 5 mií; 1 % de 3DS) após remoção da solução de isocianato de guanidina. Após extracção com uma mistura de igual volume de clorofórmio/butanol (4:1) o ASE foi precipitado com acetato de Na e etanol e dissolvido em água isenta de RNase.

As amostras de ARN foram submetidas a elec troforese e depositadas sobre Gene Screen Plus (TLi) utilizando técnicas normais. As manchas foram hibridadas utilizando uma sonda oligonucleotídica. homóloga tanto em relação ao ARNm de AG como ao de quimosina; para este fim a sequência oligonucleo tídica foi seieccionada a partir do guia de AG que está presen te no ARNm de AG e no ARNm de fusão de quimosina de AG (em todas as construções a fusão AG-quimosina está no início da tradução (pA364-72) ou para lá do início da tradução (pAB64-73 e 75), e em consequência todas as transcrições contêm o guia de À<X ) ·

Após cultura do micélio em meios contendo amido, as moléculas de ARN hidridadas podem ser detectadas em todas as amostras; os rendimentos foram máximos para pAB64-?3. No hospedeiro, o ARNm hibridado foi do comprimento esperado para 0 ARNm de AG; os ARNm¹s hibridados nos transformantes foram do comprimento esperado para os diversos blocos integrados de expressão. 0 nível· de ARNm para o AG no hospedeiro foi igual ao nível de quimosina de ARNm nos transformantes de pAB64-73 indicando que o gene hídrico no local de AG nestes transformantes é transcrito com uma eficiência igual à do gene de AG original.

0. Demonstração da secreção de quimosina de bovino por A. nige.

bad original i

- 23 As amostras de caldos de fermentação dos transformantes e do hospedeiro foram submetidas a electroforese num gel de poliacrilamida SD3 a 12,5 %; o gel foi subsequen temente depositado sobre nitrocelulose utilizando os protocolos normais. Um anticorpo monoclonal desenvolvido contra cuimosina purificada foi utilizado para a detecção imunológica da quimosina.

Gomo amostra de comparação, submeteu-se quimosina purificada também a electroforese e depositou-se na mesma experiência. A presença de uma banda do comprimento correcto em todas as amostras de transformantes mas não na amostra do hospedeiro indica expressão e secreção da quimosina de bovino utilizando qualquer das duas construções testadas.

maior rendimento de quimosina foi obtido utilizando construções de pAB64-?3 mas a secreção de quimosina por transformantes pAB64-72 também indica que o peptídeo de sinal da quimosina está funcional em A. niger.

As actividades de coagulação foram determinadas por protocolos normais utilizando leite em pó desnatado desidratado (DIFCO) como substrato e coalho de vitelo de potência conhecida como padrão. Para o plasmídeo pA354-73 os rendimentos alcançaram entre 18 a 45 LICU/ml; para ρΑΒ64-72 os rendimentos foram entre 7 e 15 LICU/ml. (1 LIGU é a quantidade de quimosina que causa a coagulação de 1 ml de leite a 35°G em 40 minutos).

As quantidades de quimosina obtidas no caldo de fermentação foram até 11,5 mg/1, o que é substancialmente mais do que tem sido relatado para transf ormantes de A. nidulars, que provavelmente contém um maior número de cópias de blocos integrados de expressão de quimosina similares (0,5 a 2,5 mg/1: Gullen et al., (vide supra) e 0 a 7 mg/1: EP-A-0215594).

Exemplo 5

BAD ORIGINAL

Expressão e secreção de uma proteína de fusão AG-proquimosina de A. niger pAB64-75 linearizado foi utilizado para transformação de A. niger. Os transformantes seleccionados foram analisados tal como descrito nos exemplos anteriores.

A presença de ARNm específico de quimosina foi demonstrada nos transformantes com um nível de expressão intermédio entre o de pA364-72 e de pAB64~73· A secreção de quimosina por estes transformantes foi demonstrada pela mancha de Western e por análises de coagulação; as actividades alcançaram entre 17 e 29 MOU/ml.

Exemplo 6

Regulação de expressão do gene de AG no hospedeiro e da expres são de quimosina em transformantes

A funcionalidade do promotor de AG foi ana lisado no hospedeiro e nos transformantes seleccionados por cultura do micélio num meio contendo xilose como única fonte de carbono. Neste caso o promotor de AG não é induzido (Nunberg et al. , Mol. Gell. Biol. 4 (1984) 2306-2315) e não é esperada expressão do gene de AG nem do gene da quimosina de bovino, a qual é colocada sob regulação do promotor de AG.

Em seguida o micélio é inoculado em meio contendo amido onde se sabe que a indução do promotor de AG ocorre (Nunberg et. al. , vide supra). A indução prevista foi demonstrada em experiências de mancha de Northern pela presença de ARNm específico de AG no hospedeiro e de ARNm específico de quimosina em transformantes quando desenvolvidos em amido, em contraste com a ausência do ARNm específico em micélio desenvolvido em xilose . Também a secreção de quimosina em condições induzidas é demonstrada por análise de mancha imunológica dos caldos de fermentação ou através da medição da actividade de coagulação do caldo de fermentação. Em culturas desenvolvidas em xilose

- 25 BAD ORIGINAL não foi possível demonstrar qualquer actividade de quimosina pelas análises de coagulação; também os resultados da análise de mancha de Western foram neste caso negativos. Estas experiências demonstram que a regulação de expressão do gene de quimosina de bovino é similar à do gene de AG e é consistente com os conhecimentos correntes sobre expressão do gene de glucoamilase.

Exemplo 7

Expressão de quimosina em presença de inibidores de protease

A sensibilidade da quimosina para protease segregada por A. niger foi estabelecida através da cultura de transformantes na presença e na ausência de inibidores de pro Ό Θ 3.3 β ·

Para este fim os transformantes da estirpe hospedeira DS 2975 com a construção pAB54-73 x(Exemplo qA) foram cultivados tal como descritos no Exemplo 4. Não foram adicionados ao meio de cultura quaisquer inibidores de protease ou em alternativa foram adicionadas peostatina e o( 2-macroglobulina (+) na concentração final de 1 jug/ml e de 5 /ig/ml, respeotivamente, Foram colhidas amostras após diversos intervalos de tempo e a quantidade de quimosina foi analisada por análise de mancha de V/estern tal como descrito no Exem pio 3B. Os resultados são apresentados no Quadro 2.

BAD ORlGlNM·

Qtiad.ro 2

Quantidades relativas de quimosina em cultura sem e com (+) inibidores de protease

_r Tempo de aiàostragem (hrs após inoculação) 1	ⁿ— ⁿ	1 11 + »1 1
7 '	—	I
24 1	1	1 5
52 \|	1 1	3 1
48 \|	0,5 \|	5 1
⁷² 1	°,3	⁴ 1
98 ' 1	0,2	έ.

Os dados indicam que a quimosina é sensível s degradação por protease presdnte no caldo de fermenta ção. A inactivação destas proteases, exemplificada pela adição de inibidores de proteasa, conduziu a um rendimento superior de quimosina e também a uma estabilidade aumentada, como se conclui a partir da presença prolongada da quimosina no caldo de fermentação na presença de protease.

É evidente a partir dos resultados acima apresentados que o sistema de expressão da presente invenção proporciona uma produção eficaz de proteínas. Além disso, através da introdução do gene de interesse num local que contém um gene que exprime uma proteína de secreção, a qual é produzida a altos níveis, pode-se conseguir a produção do gene de interesse em alto nível. Deste modo reduz-se a carga de secreção da célula hospedeira de maneira a permitir uma secreção eficaz do produto pretendido. Através do emprego

ORIGINAL

- 27 ^SS®£S$3sngKaB=B.

inicial de hospedeiros eficazes na secreção o sistema da presente invenção pode ser utilizado para a produção comercial de produtos de interesse tais como produtos farmacêuticos, enzi© mas comerciais e semelhantes.

Todas as publicações e pedidos de patentes citadas na presente memória descritiva são dados como aqui reproduzidos como se cada publicação ou cada pedido de patente individual fosse especifica e individualmente indicado como sendo dado como reproduzido.

Apesar da presente invenção ter sido descrita com algum pormenor por meio de ilustração e de exemplos com objectivos de clareza e de compreensão, será evidente aos possuidores de uma formação normal na especialidade â luz dos ensinamentos da presente invenção que é possível introduzir certas alterações e modificações sem se afastar do espírito e do âmbito das reivindicações anexas.

Claims

- lê Processo para a preparação de um fungo filamentoso transformado, caracterizado por se utilizar para a transformação de um vector apropriado que contém:

um bloco integrado (cassette) de expressão de ADR proveniente de recombinação in vitro e contendo uma região de regulação de início de transcrição, um quadro de leitura livre que codifica para uma sequência de sinal para a secreção em concordância de quadro de leitura com um gene estrutural de interesse e uma região de regulação de terminação de transcrição , de modo a serem integrados num cromossoma do referido fungo filamentoso, sendo as referidas regiões de regulação funcionais nos ή

bad original referidos hospedeiros e sendo o referido hospefeiro ainda caracterizado por ter um gene de secreção não funcional·.

- 2<â Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido gene de secreção não funcional não ser funcional devido a recombinação homóloga com uma cons trução de ADN contendo uma sequência de ADN homóloga do referido gene de secreção.

- 3ã _

Processo para a preparação de um fungo filamenroso transformado, caracterizado por se utilizar para a transformação um vector apropriado que contêm:

um bloco integrado (cassette) de expressão de ADN contendo uma região de regulação de início de transcrição, um quadro de leitura livre que codifica para uma sequência de sinal para a secreção em concordância de quadro de leitura com um gene estrutural de interesse e uma região de regulação de terminação de transcrição, estando o referido bloco integrado localizado num local de um gene endógeno oue codifica para um produto proteico segregado e que inibe a expressão do referido produto proteico endógeno, sendo as referidas regiões de regulação funcionais no referido hospedeiro, de modo a serem integrados num cromossoma do referido fungo filamentoso.

- hâ Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido hospedeiro ser Aspergillus.

ORIGINAL

- 5& Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido gene endógeno ser o gene da glucoamilaso.

- 6ã Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido Aspergillus ser A. niger.

- Processo de acordo com a reivindicação 3 ·> caracterizado por o referido bloco integrado de expressão con ter adicionalmente uma selaçção marcadora dos hospedeiros que contem o referido marcador.

- 8â Processo de acordo com a reivindicação 3i caracterizado por o referido quadro de leitura livre codificar para a quimosina.

- _

Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a referida sequência de sinal ser a sequência de sinal de glucoamilase.

- 10fi Processo para a preparação de um fungo filamentoso transformado Aspergillus, caracterizado por se utili zar para a transformação um vector apropriado que contém:

um bloco integrado (cassette) de expressão de ADN contendo uma região de regulação de inicio de transcrição, um

BAD qriginalJ

- 30 quadro de leitura livre que codifica para uma sequência de sinal de glucoamilase para a secreção em concordância de quadro de leitura com um gene estrutural de interesse e uma região de regulação de terminação de transcrição, estando o referido blo co integrado localizado no local do gene da glucoamilase e ini bindo a expressão do referido produto do gene, de modo a serem integrados num cromossoma do referido fungo filamentoso, sendo as referidas regiões de regulação funcionais no referido hospedeiro.

- llâ Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o referido Aspergillus ser A. niger ou

A. awamort.

- 12ã Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o referido bloco integrado de expressão conter adicionalmente um marcador para selecção dos hospedeiros que contêm o referido marcador.

- 13ã Processo de acordo com a reivindicação 10 , caracterizado por o referido quadro de leitura livre codificar para a quimosina ou uma das suas formas precursoas .

- 14â Processo para a preparação de uma construção de ADN caracterizado por se integrar: uma sequência de ADN homóloga com o local de um gene endógeno que contém uma sequên

- 31 - , BAD ORIGINAL cia de sinal e que codifica para uma proteína de secreção de um fungo filamentoso e um quadro de leitura livre que codifica para uma proteína de interesse diferente da do referido gene endógeno, em que o referido quadro de leitura livre é ladeado em 5' pov uma região em que a referida região homóloga e a referida região 5' contêm uma çegião de regulação do inicio de transcrição funcionai num fungo filamentoso hospedeiro e a referida sequência de sÈnal está em concordância de quadro de leitura com o referido quadro de leitura livre .

- 15a Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a referida sequência homóloga conter um segmento de pelo menos uma das referidas seguências de sinal e a referida região de regulação de início do referido gene endógeno.

Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a referida região 5' conter pelo menos um segmento de pelo menos uma das referidas sequências de sinal e a referida região de regulação de início do feferido gene endógeno.

- l?â Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o referido gene endógeno ser um gene da glucoamilase .

- 18§ Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o referido quadro de leitura livre codificar para a quimosina, ou uma das suas formas precursoras.

Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a referida sequência homóloga conter uma sequência 5' da região de regulação de início de transcrição do referido gene endógeno.

- 20& Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a referida construção conter adicionalmente um marcador para seleccção dos hospedeiros que contêm o referido marcador.

- 21ã Processo para a preparação de uma proteína de interesse caracterizado por compreender as fases de:

cultivar num meio nutriente um fungo filamentoso que contém:

um cromossoma contendo um bloco integrado (cassetfce) de expressão de ADN proveniente de recombinação in vitro e contendo uma região de regulação de início de transcrição, um quadro de leitura livre que codifica para uma sequência' de sinal para a secreção em concordância de quadro de leitura com um gene estrutural de interesse e uma região de regulação de terminação de transcrição, sendo as referidas regiões de regulação funcionais no referido hospedeiro e sendo o referido hospedeiro ainda caracterizado por ter um gene de secreção não funcional; sendo o referido gene de interesse expresso e segregado; e isolar o referido produto a partir do feferido meio nutriente .

- 53 BAD ORIGINAL

Processo para a preparação de uma proteína de interesse de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o referido gene de secreção não funcional não ser funcional devido a recombinação homóloga com uma construção de ADN contendo uma sequência de ADN homóloga do referido gene de secreção.

-23^ Processo para a preparação de uma proteína de interesse, caracterizado por compreender as fases de:

cultivar num meio nutriente um fungo filamentoso hospedeiro que contêm:

um cromossoma contendo um bloco integrado (cassette) de expressão de ADN contendo uma região de regulação de início de transcrição, um quadro de leitura livre que codifica para uma sequência de sinal para a secreção em concordância de quadro de leitura com um gene estrutural de interesse e uma região de regulação de terminação de transcrição, estando o referido bloco integrado localizado nua local de um gene endógeno que codifica para um produto proteico segregado e que inibe a expressão do referido produto proteico endógeno, sendo as referidas regiões de regulaçao funcionais no referido hospedeiro; sendo o referido gene de interesse expresso e segregado; e isolar o referido produto a partir do referido meio nutriente.

— 24ê —

Processo de acordo com a reivindicação 23 , caracterizado por o referido gene endógeno ser um gene da glucoamilase .

bad original

- 34 - 25& Processo de acordo com a reivindicação 23 caracterizado por o referido fungo filamentoso ser Aspergilles

- 26ã Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o referido Aspergillus ser A. niger ou

A. awamori.

- 2t& Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por o referido gene de interesse ser o gene que codifica para a quimosina ou uma das duas formas precursoras.

- 282 Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por a referida construção conter um marcador e por compreender uma fase de cultivar o referido hospedeiro sob condições de selecção.

A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente europeia apresentado em 16 de Agosto de 1988, sob ο N2. 88201743.7.