JPH025882A - 複製配列、その調製方法および利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ
且匹り旦■）の自律複製配列、その調製方法および遺伝
子組換を使用する方法における利用に関するものである
。

（従来の技術） 酵母プラスミドの複製の自律を与える配列の存在、役割
およびクローン化は、サッカロミセス・セレビシアエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
において研究されてきた（参考文献ｌ、２）。酵母標識
遺伝子（例えば星、鱈孤、い下転ＴＲＰＩ等のような生
合成酵素に対してコード番号をつけた遺伝子）をクロー
ンしたバクテリアプラスミド（タイプｐＢＲ３２２）は
、もっともしばしば遺伝子座の相同組み換えによって、
染色体中に僅かな頻度で組み込むことができる。この種
のプラスミドに一層１（自律複製配列）と呼ばれる配列
を導入する場合、形質転換は次の特性を与える。

−高い効力（ＤＮＡ１ｘ当り１００００個以上の形質転
換細胞）、 一プラスミドの染色体外複製、 一有糸核分裂の相対的不安定。

これらの配列凹は同種または異種のＤＮＡ配列である。

これらは染色体起源または染色体外起源（プラスミド、
ミトコンドリアなど）である。

しかし数人の著者によって書かれた前記文献（１，２）
は大抵の場合、異種ホスト中でａｒｓの性質を表示する
配列が、初期の構造ではこの特性を有しないことを明ら
かに示している。相同の関係では、最も一般に受は入れ
られた仮定は染色体から遊離したａｒｓが複製源に対応
することであり、酵母染色体につき平均２０ないし４０
Ｋｂの間隔があると見積もられている。

工業酵母ヤロウィア・リポリチカについては、組込形質
転換はサッカロミセス・セレビシアエのＬＹＳ２遺伝子
（３）およびヤロウィア・リポリチカのＬＥＵ２遺伝子
（４）で記載されている。この同じ遺伝子のプロモータ
ーは、１ｅｕ２遺伝子座で染色体中に組み込まれる異種
遺伝子（フレオマイシンとベータ・ガラクトシダーゼに
耐性）の発現を誘導するために用いられた（５）。また
、切断位置しか示さない制限酵素で形質転換するプラス
ミドを線状にするとき、１００の因子によって形質転換
の頻度が太き（なる（そのときＤＮＡ１ｕにつき１００
以下から１００００以上　の形質転換体となる）ことが
認められた（４）。すでにサッカロミセス・セレビシア
エで知られている制限酵素によって生産された結合性末
端を再組み換え効果は、ヤロウィア・リポリチカで一層
顕著である。

（発明が解決しようとする課題） ヤロウィア・リポリチカによる組込形質転換を用いる際
に相補性によって遺伝子をクローン化することが望まし
い場合、次に示す困難にぶつかる。

（ａ）ＤＮＡライブラリはρＢＲ３２２＋　ＬＢ皿タイ
プの組込みプラスミドにおいて実現されるので、唯−度
このプラスミドにおいて存在する制限部位がクローン化
フラグメントにおいて同様には存在しないかどうかは知
られていない。従って、ＤＮＡを線状にするため、形質
転換の効力が一層小さい局部制限を行う（そして種々の
酵素を用いてこの試験を行う）ことになる。

（ｂ）　　−度、相補性によってクローンが得られると
サザン法および放射能試験によって、クローン化されゲ
ノムに組み込まれたフラグメントの制限地図を細かく分
析する必要がある。この地図の研究は、連結反応後、大
腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）での形質転
換によって選択されるプラスミドを引き出すため、形質
転換体のＤＮＡ全体を切断できる酵素はどれを使用でき
るかを知ることができる。

凹配列を含む複製型プラスミドにＤＮＡライブラリを実
現できると、これら２つの不都合はなくなる。事実、そ
の結果、制限酵素によってプラスミドを切断することは
不用となり、染色体外に保持されたプラスミドは容易に
大腸菌で修復される。」圏配列の存在はまた、プラスミ
ドが一般に多数複製されるので、原則として遺伝子を増
強することができる。これらの理由はすべて、ヤロウィ
ア・リポリチカに対する皿の研究を正当化した。

多くの研究所において多くの選択が試みられ失敗したが
（６）、この酵母の細胞分裂法がこれに関係していると
いう仮説が発表された。実際に（第１図）ヤロウィア・
リポリチカは二形性であり、菌糸体と酵母状形態を生じ
る。」見プラスミドが分離に対した強い母性質を示す、
すなわちコピーの全体がブロックとして分離する傾向が
あり、系統的に娘細胞に変化しないことが、サッカロミ
セス・セレビシアエで示された（７）。娘細胞が酵母型
の細胞の芽であるとすれば、選択位置で分割することを
確実に止めるが、さらに母細胞は次に分割する間にプラ
スミドを伝える可能性を有している（サッカロミセス・
セレビシアエでは母細胞は約２０回分割する）。その代
わりに、菌糸体について問題にするならば、各細胞は一
個の娘細胞しか生成しない。プラスミドが分割する間に
伝えられないならば、コロニーは選択位置で分割するこ
とを停止する。この仮定に基づいて、菌糸体を形成する
ことができない突然変異体を選択し、ａｒｓ配列の研究
のために用いた。この種の配列は実際に分離されており
、菌糸体タイプの細胞にも作用することが明らかになっ
た。

（課題を解決するための手段） 本発明はヤロウィア・リポリチカにおいて有効なａｒｓ
配列並びにこのようなａｒｓ配列を有するＤＮＡ配列に
関するものである。特に、本発明は第８Ｂ図の制限地図
に示す２．２　Ｗｂの勿旧／勿旧ＤＮＡフラグメントに
よってもたらされるヤロウィア・リポリチカにおいて有
効なａｒｓ配列、およびこれらの配列を含むプラスミド
に関するものである。

さらに本発明は、特にヤロウィア・リポリチカで有効な
、特に次の方法で得られる皿配列を有するプラスミドに
関するものである。

ａ）　ヤロウィア・リポリチカのゲノムフラグメントラ
イブラリがヤロウィア・リポリチカの栄養要求体を補足
する組込みベクターにおいて形成され、ｂ）　前記組込
みベクターによって補足されることができる栄養要求体
を有するヤロウィア・リポリチカのホスト株が、前記ラ
イブラリのプラスミドで形質転換され、 Ｃ）　コロニーハイブリダイゼーションを、組込みベク
ターを検出するゾンデを用いて行い、最強の信号を有す
る形質転換体を選択し、 ｄ）　ベクタークローンの微小溶解物を調製し、染色体
外プラスミドを検出し、 ｅ）　これらのプラスミドはａｒｓ配列を有し、形質転
換力を試験して確認でき、元のベクターの形質転換力よ
りも少なくとも５倍である。

以下の実施例においては、ヤロウィア・リポリチカのコ
ロニーは、肉眼図で異なる形態を示すものであり、即ち
、いわゆる「縮れ」またはざらついているコロニーは、
皮膜を形成し寒天表面に毛で囲まれており、この形態は
細胞が不揃いであまり数多くない時に鮮明であるが、他
方、「縮れていない」コロニーはこれらの性質を示さな
い。

縮れている表現型は、ｒＦｉｌ＋」で示され、対応する
遺伝子型はｒｆｉｌ＋Ｊで示される。

実施例に示すように、受容体法がＦｉｌ−株である場合
、ｂとＣの段階で形質転換体の安定性を試験でき、さら
に安定性の小さい形質転換体を選択できる。実際に、こ
れは最初の皿配列を選択するため用いられた方法である
。しかし、Ｆｉｌ十株を用いる時、前記の方法を用いる
ことが好ましい。

勿論、この方法は、各場合において、凹配列を有するプ
ラスミドを選択しながら、多くの修飾を受けることがで
きる。

好適例では、本発明による方法は、次の方法で・行われ
る。

−ｐｌＮ＾６２タイプの組込みベクターにおいてヤロウ
ィア・リポリチカのゲノムフラグメントのライブラリの
形成； −Ｆｉｌ十株においてこのライブラリのスーパーコイル
化した円形プラスミドの形質転換：　ＬＥＩ３＋形質転
換体の選択（これは組込みプラスミドまたは複製型プラ
スミドを含むことができる）；−ｐＢＲ３２２ゾンデを
用いたコロニーハイブリダイゼーション：より強力な信
号がマルチコピー複製型形質転換体に見出される；潜在
ａｒｓクローンの単離； 一選択されたクローンの微小溶解物は非制限ＤＮＡのサ
ザン転写：　ｐＢＲ３２２ゾンデを用いた染色体外プラ
スミドの検出； 一徹小溶解物のＤＮＡを用い大腸菌の形質転換およびａ
ｒｓプラスミドの増幅； 一適当なところで、クローンの不安定性の特性化。

特に、前記方法は−ｐＩＮＡ６２のようなｐＢＲ３２２
から派生した特定のベクターの利用に対応する。

以下実施例に基づき本発明を説明するが、本発明はこれ
らの実施例によって制限されるものではない。

同様に、実施例において、ａｒｓ配列を有するプラスミ
ドから、この配列またはａｒｓ配列を有する一層大きい
配列を単離することができる。さらに単離されたこれら
の配列、または同様に単離されたプラスミドのフラグメ
ントは、これらの−酊１配列の存在によって前述のプラ
スミドを染色体外状態に維持され増幅できるので、表現
ベクトルプラスミドの生産のために用いられ、これは前
記プラスミドによって表された蛋白質の生産過剰に導か
れる。

幾つかの表現ベクターは既に、従来技術、特にヨーロッ
パ特許第０２２０８６４号、第０１３８５０８号および
第０１６６６５９号に記載されている。

これらの特許では、本質的にはいわゆる組み込みベクタ
ーを記載しており、その不利な点は先に記載した。しか
し、これらの組み込みベクターは前記」ｎ配列を結合す
るならば染色体外プラスミドに形質転換される。

表現ベクターの技術は詳細には記載しないが、この技術
は、ヤロウィア・リポリチカにおける遺伝子の表現要素
、特にヤロウィア・リポリチカのプロモーターであるプ
ロモーター、例えば凹またはＳＵＣ２遺伝子のプロモー
ターに関し、またクローン化できる遺伝子のタイプに関
して実際に前記特許に既に広範囲に記載されている。ク
ローン化できる遺伝子のなかで、例えばヨーロッパ特許
第２２９８６４号に記載されているようなプロレニンお
よびヒトアナフィラトキシンＣ５Ａに対してコードする
遺伝子、アルカリ性細胞外プロテアーゼ（八ＥＰ）、イ
ンベルターゼ、ボルシンインターヘエロンα、またはプ
ロキモシンを挙げる必要がある。

例として、本発明においては単に対応する」ｎ配列の効
力を示すためβ−ガラクトシダーゼの表現についてのみ
述べるが、ヨーロッパ特許第０２２０８６４号に記載さ
れたプラスミドを利用し、−徂１配列を結合することに
よって、同じタイプの組立てを行うことができることは
明らかである。

従って本発明は、またヤロウィア・リポリチカにおいて
有効なａｒｓ配列を有するＤＮＡ配列の他に、前記配列
を組み込むプラスミドと、特に工業的蛋白質を表現する
ためのプラスミドに関するものである。

ヤロウィア・リポリチカにおける工業的蛋白質の表現の
ためのこれらのプラスミドは、前記蛋白質に対してコー
ドする配列の他に、遺伝単位の集合体、特にプロモータ
ーを含む制御領域を含み、ヤロウィア・リポリチカにお
いて前記蛋白質の表現を確保でき、さらに」ｎ配列を有
する。

また、このタイプのｎ配列を有し、ヤロウィア・リポリ
チカを相補することができる組み込みプラスミドの提案
に関するものである。

さらに、本発明は前記の如くプラスミドによって形質転
換されるヤロウィア・リポリチカ株に関するもので、こ
の株はＦｉｌ÷またはＦｉｌ−とすることができる。

最後に、本発明は、その生長を確保する途中で本発明に
よるヤロウィア・リポリチカ株を培養することを特徴と
する工業的蛋白質の製造方法に関するものである。

（実施例） 以下、実施例に基づき本発明を説明する。

ス」１殊上 顕微鏡スケールの菌糸体の生成は、肉眼によると異なる
形態のコロニーによって表される。即ち、「縮れた」ま
たは粗いコロニーは、寒天の表面で皮膜を形成し、毛根
で囲まれている（第２図）。

この形態は１ケース当りの細胞の数はあまり多くなく　
（１００以下）、また細胞がグルコースの濃度が大きく
豊富な培地にある場合に一層鮮明である。

実際にＵＶ線でＩＮＡＧ３３１２２株（勤旦、に婬−３
５゜」肛２．　　ＩＹＳ２−５．　ａｄｅｌ）の培体を
６０％の生存率の線量で照射する。完全な培地における
相の発現後、細胞をＹＰＤ、。培地（抽出酵母１％、ペ
プトン１％、グルコース３０ｇ／　ｌ、寒天２０ｇ／　
ｉ　）　、または、ＹＰＤ　Ｉ。

培地（１０ｇ＃！のグルコースのみ）に広げた（約５０
０７ケース）。２８°Ｃで８日間培養後、不定型の形態
を示すコロニーを双眼ルビプで符号を付け、精製した。

その表現型を小さい密度のコロニーを顕微鏡で観察して
確認した。最後に７つの突然変異株が最初の６１０００
コロニーに保持され（頻度１．Ｉ　Ｘ　１０−’）、−
個だけが続く実験に対して充分純粋で安定な表現型を示
した。この表現型をＦｉｌ−と言い、遺伝子型をｆｉｌ
ｌ−１８で示す。この株の名はＩＮＡＧ３３１２９（ハ
旦、に婬−３５，」肛２．ｈ婬−５．閃１．旦旦−１８
）である。

った約２０のプラスミドについて評価した挿入部の平均
長さは、はぼ５．２ｋｂである。これらのプールのＤＮ
Ａは、エチジウムプロミドとセシウムクロリドの変化度
で抽出精製した。

突然変異する（非常に安定な）受容体株１ｅｕ２−３５
（デイ・エム・オグリチアクのＤＸ４６５−７Ｂ株の原
産、参考文献８）　、ｐＢＲ３２２の５ａｌＩ部位（第
４図）にクローン化したＬＥＵ２対立遺伝子を含むプラ
スミド−ｐＩＮＡ６２　（参考文献５）においてライブ
ラリを構成した。ヤロウィア・リポリチカの１５９０１
−４株（ハ側。

肛録−２１．ニー５１皿−５）のＤＮＡは、完全にＩＩ
Ｉ酵素によって消化され、ＢａｍｔｌＴによって予め切
断された−ｐＩＮＡ６２プラスミドに混合し、アルカリ
性ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。

ライブラリは完全にゲノムを切断せず、８９％がハイブ
リッドと呼ばれる全部で７０００クローンを示す４組（
またはプール）から構成された。無作意に取りロウイア
・リポリチカではａｒｓは比較的不安定であるという仮
定から、まずプールのＤＮＡを用いてＩＮＡＧ３３１２
９株を形質転換し、次に不安定なりローンを探した。プ
ールのＤＮＡは、染色体外複製で配列を直接選択するた
め、予め制限しなっかった。それでも、上Ｉ酵素（−ｐ
ＩＮＡ６２出発のプールにおいて単独の部位でＬＥＵ２
配列に位置する）によって部分的または全体的に切断さ
れたこのＤＮＡは、Ｊのような組み込みによって形質転
換することができる（たとえ後者よりも弱い頻度である
としても）。形質変換体の数、試験したクローンの数、
不安定のクーロンのパーセンテージ（はぼ１０％である
）は、表１に示した。

表土 不安定なりローンは、Ｌｅｕ−コロニーを有意に分離し
たクローンである。

９１−−と９３じ４生 プール番号 プール長さ（１） １２３４計 不安定なりローンの数　１０　　１２　　１　　０不安
定なりローンの％　１２　　１６　　２　　　＜８　　
１１（１）バクテリアクローンの数 形質転換体クローンの不安定性を試験するため、豊かな
培地で線を付け、生長後、最少培地（硫酸アンモニウム
のない酵母窒素塩基１．７ｇ／ｆｆｉ、窒素源リシ：／
１ｇ／ｊ！、アデニン−ＭＣＩ　１００ｍｇ／　１、グ
ルコース１０ｇ７Ｎ、寒天２０ｇ／ｆｆ１）およびＬ−
ロイシン（２００ｍｇ／　ｌ　）を補充した最少培地で
複製した。

不安定なコロニーは選択培地に保持し、全体のＤＮＡは
既に述べた（９）微小細胞溶解の方法で抽出した。この
ＤＮＡは、アガロースゲルで電気泳動させ、次にサザン
法（１０）によってナイロン膜（ビオデイン、ポールフ
ランス）で形質転換し、カップルの置換技術にツクトラ
ンスレーションキット、アメルシャムフランス）によっ
てｉｚｐで印したプラスミド−ｐＩＮＡ６２のＤＮＡで
交雑した。

この放射能プルーブ（ｐｒｏｂｅ）は、非常に複雑なバ
ンドの形で、染色体」町対立遺伝子に印をつけることが
でき、ＤＮＡは制限されてなく、染色体外バンドは形質
転換体プラスミド（ｐＩＮＡ６２＋挿入部）に相当する
。さらに多くは閉じられた円形（共有閉鎖円、ＣＣＣ）
に相当するプラスミドのハンド（第５図）の移動を区別
した後、少なくとも５つのプラスミドの切断を認めるこ
とができる。若千の穴（ｗｅｌｌ）の中に見られる他の
バンドは、同じ株に複数のプラスミドが存在し、あるい
は同じ分子の開放した円形（ＯＣ）に相当する。二つの
仮定を区別するため、アンピシリンに耐性のコロニー（
耐性のバクテリア遺伝子はｐＩＮＡ６２に存在する）を
選択することによって形質転換体から抽出したＤＮＡを
用いて大腸菌の８８１０１株（ｈｓｄＲ−＋　ｈｓｄＭ
−＋ｒｅｃＡ１３．　ｕ飢４４，１ａｃＺ４．圏ｕＢ６
＋　　朗２．並１゜Ｓｍ’　）を形質転換する。選定さ
れた酵母の各形質転換体に対して、プラスミドを抽出し
制限酵素によって分析した大腸菌のコロニーを得る。酵
母の各形質転換体が一個のタイプのプラスミドしか含ま
ないことを確証する。５個の選択プラスミドの制限地図
を第６図に示した。これらの地図の分析、並びにこれら
のプラスミドの制限とａｒｓ配列の一つ（−ｐＩＮＡ１
１９プラスミドのフラグメント）との間で実現されたハ
イブリダイゼーション（本文には記載されていない）の
結果は、クローン化したａｒｓフラグメントの３個は実
際に相同であることを示している。当該フラグメントは
、適切な場合（−ｐＩＮＡ１１９と−ｐＩＮＡＩ２６の
場合に）連結時に他のフラグメントを連結する４、５ｋ
ｂの同じＪＩＩ−ａｒｓＩ■フラグメントを含む、結論
として、３個の異なるａｒｓ配列が入手でき、これらは
ｐＩＮＡ１１９と−ｐＩＮＡ１２３と−ｐＩＮＡＩ２４
のプラスミドによって支持され、それぞれ５．２ｋｂ　
、　６．６ｋｂ　、　１７．８ｋｂのＤＮＡフラグメン
トに位置する。

尚第５図は不安定な形質転換体におけるプラスミドの検
出を示す図で、受容体株ｐｉ１−　（穴ＡとＫ）と種々
の形質転換体（六ＢないしＪ）の制限されないＤＮＡは
ｐＩＮＡ６２プラスミドによって構成された放射性プロ
ーブ（ｉｚｐで標識した）を用いて（ビオシンに移動し
移転した後）ハイブリダイゼーションさせた。

２組のゲルは、左側は形質転換体２−１８　（穴Ｂ）、
２−２６　（穴Ｃ）　、２−３９　Ｃ穴Ｄ）　、３−１
９　（穴Ｅ）および２−７５　（六Ｆ）を示し、右側は
形質転換体２−１８（穴Ｇ）　、１−６８　（穴）Ｉ）
　、１−７７　（穴■）および１２７（穴Ｊ）を示す。

形質転換体の名称において、第一の数字は開始点の「プ
ール」を示し、第二の数字は順位の番号である。染色体
ＤＮＡは複雑なバンド（ｄｉｆｆｕｓｅ　ｂａｎｄ）の
形でプローブＬＥ０２部分に表され（ＤＮＡは制限され
ない）、大部分の穴（特に唯一の信号を構成する受容体
株、穴ＡおよびＫ）に認められる。強度の差は実際、ゲ
ル上に付着したＤＮＡの変量を反映している。プラスミ
ドは少なくとも開口した円（ＯＣ）の形で示し、また複
数はＣＣＣの形で示す。図では、プラスミドの５箇所の
長さを区別することができ、順に第１（穴Ｄ）、第２（
穴Ｂ、　Ｃ，Ｆ、　Ｇ）　、第３（穴Ｈ）、第４（六Ｅ
）および（穴ＴおよびＪ）で増加する。

第６図は、第５図に定義した５種の形質転換体から単離
された５種のプラスミドの制限地図すなわち、 ｐＮＡ１１９は形質転換体２−１８に由来（クラス２）
、ｐＮΔ１２３は形質転換体１−６８に由来（クラス３
）、ｐ　ＮＡ１２４は形質転換体１−７７に由来（クラ
ス５）、ｐ　ＮＡ１２５は形質転換体２−３９に由来（
クラス１）、ｐ　ＮＡ１２６は形質転換体３−１９に由
来（クラス４）。

ｐＢＩ？３２２の部分は黒で示し、ＬＥＵ２遺伝子は点
線で示し、ａｒｓ配列を有する挿入部は空白で示した。

プラスミドはｐＢＲ３２２の５ａｌｌの位置で開口して
いるが、Ｓａｌ　Ｉの地図は挿入によって確立されない
。

制限部位を示すと、Ｂ＝Ｂ憇旧、Ｇ＝Ｂれ■、Ｅ＝」並
Ｒ１，，Ｈ＝肛閃■、Ｂ　／　Ｇ　＝Ｊｄ　ＩＩフラグ
メントのクローン化によって壊れたＢａｍＨ１部位であ
る。矢印は、その方向と共に（２個のＩｎ部位によって
限定された）相同領域を示す。

ヤロウィア・リポリチカにおいて染色体外分子として選
択したプラスミドが高い頻度でこの酵母を形質転換でき
ることを示すために、Ｆｉｌ−突然変異体株（ＩＮＡＧ
３３１２９）と、Ｆｉｌ十株（ＩＮＡＧ３３１２２）を
用いる。二つは−ｐＩＮＡ１１９によって高い頻度で形
質転換できることが明らかになった（表２、実験１．２
）。これらの結果から、組み込み（ここでは」匹Ｉによ
って制限された−ｐＩＮＡ６２と−ｐＩＮＡ１１９プラ
スミド）によるＩＮＡＧ３３１２９株の形質転換の最適
な状態は、制限されていない−ｐＩＮＡ１１９を用いて
得られた複製形質転換の最適な状態に対応しない（第１
の場合は実験３と、第２の場合は実験１と２と比較）こ
とがわかる。この最適な状態の生物学的決定は、未知で
あり、このことは、一方の実験が他方の実験に対してこ
れらの結果の非常に鮮明な定量的変動を説明している。

従って、この変動は、ｐＩＮＡ１１９プラスミドが常に
最初無傷のｐＩＮＡ６２プラスミドよりも２０ないし１
００倍多く形質転換する事実の理由とはならず、これは
皿の存在をよく証明している。

実験３では、−ｐＩＮＡ１１９を用いて一般のフラグメ
ントを有することが明らかになる−ｐＩＮＡ１２５とｐ
ＩＮＡ１２６プラスミドは、ＩＮＡＧ３３１２９株を殆
ど同じ頻度で形質転換する（ｐＩＮＡ１２５は少し少な
く形質転換する）。ｐＩＮＡ１２４の長さがｐｌＮ＾１
１９のほぼ二倍であることから、ｐｌＮ八１へ３と−ｐ
ＩＮＡ１２４は有効性が殆ど同じであると考えられる。

また、表２から与えられる組み合わせは、この実験にお
いてＦｉｌ−突然変異株よりも頻度が小さいにもかかわ
らず、Ｆｉｌ十株はａｒｓプラスミドによって同様に形
質転換できることを示している。これらのプラスミドは
、制限していない−ｐＩＮＡ６２よりも１００倍多いＩ
ＮＡＧ３３１２２株を形質転換する。この結果は、ａｒ
ｓの選択で細胞分裂の形を理由付ける最初の仮定からも
非常に驚くべきことである。従って、ａｒｓプラスミド
が同様にＦｉｌ−株において染色体外法を保持するかど
うかを見出す必要がある。

実施例４で述べたものと同様のサザンで移動した後、交
雑の実験は、Ｉ）ＩＮＡ１１９　　（示していない）に
よって得られたＦｉｌ十形質転換体の場合であることを
示している。この意外な状態を一層特徴づけるために、
形質転換体の安定性について調べる。

実Ｊｌｌ比 ５個の−ｐＩＮＡ１１９とｐＩＮＡ１２３ないし−ｐＩ
ＮＡ１２６のフ。

ラスミドの安定性を、液体選択培地（ロイシンを含まな
い）で、平行して最少培地、ロイシンの豊富な培地で、
５ないし１０世代後に評価した。各培地で数えたコロニ
ーの数に関して、表３Ａに示したような原栄養株のパー
センテージを与える。このパーセンテージは６５〜８４
％であり、ＩＮＡＧ３３１２２株における種々のａｒｓ
配列の安定性と有意差はなかった。その代わりに、サッ
カロミセス・セレビシアエ（２）でのａｒｓ配列の挙動
に対して、このパーセンテージがこんなに高いことは注
目すべきである。

この安定性を詳細に研究するに当り、ｐＩＮＡ１１９で
示されるａｒｓ配列について特に関心がもたれる。

Ｆｉｌ−株（ＩＮＡＧ３３１２９）、またはＦｉｌ十株
（ｒＮＡＧ３３１２２）で得られた形質転換体は選択培
地、非選択培地で約１０世代の間に培養し、栄養要求株
のパーセンテージかはそれぞれの場合について前記のよ
うに評価した。表３Ｂの結果は、ＩＮＡＧ３３１２９に
おいて選択培地の皿の相対的安定性を証明するが、Ｆｉ
ｌ＋株において安定性が一層大きいことを示している。

この結果を確認するため、菌糸体の生長の表現型が、−
層顕著であり１ｅｕ２−３５（Ｆｉｌ＋十と呼ぶ）を形
質転換し、この株において非常に高い絶対的な安定性を
確かめる。ｐＩＮＡ１１９のＤＮＡが常にハイブリダイ
ゼーションで染色体外バンドとして見分けられることが
証明される（示していない）。非選択培地の安定性は、
各場合において選択培地よりも低いが、同様にＦｉｔ−
／Ｆｉｌ十表現型の作用で同じように前進した。

表主 ＮＡ 原栄養株％ −ｐＩＮＡ１１９　−ｐＩＮＡ１２３　−ｐＩＮＡＩ２
４　−ｐＩＮＡＩ２５　ｐＩＮＡ１２６銖　　　　　表
現型　　　培地での原栄養株の％選択　　非選択 ＩＮＡＧ３３１２９　　Ｆｉｌ−６０〜７０１０〜１５
ＩＮＡＧ３３１２２　　Ｆｉｌ＋　　　　　７０〜８０
６０ＭＬＩＩ　　　　　Ｆｉｌ＋÷　　　８５〜１００
　８０〜９０従って、最初の仮定に反して、ａｒｓの単
離における失敗は、菌糸体における生長を妨げるこれら
配列の非常に大きい不安定性によるものではなく、不安
定なりローンを探すことによっては見出せないという事
である。実際に、Ｆｉｌ十株において、これらの配列は
組み込みのものと同様安定に見える。

これらの条件では、プラスミドは常に染色体外にあり、
安定性は組み込まれたコピーの存在によるものではない
ことを示す必要がある。このために、これらクローンの
安定性において変化があったかどうかじらへるように、
選択培地で５０世代の間にＩＮＡＧ３３１２２の３０の
形質転換体とＩＮＡＧ３３１２９の３０の形質転換体を
培養する。実験の詳細は以下の図と表４に示した。

表土 につ　５０　　　　の　　　　での （結果は与えられた種類の分離に属するクローン数とし
て表した（原栄養株の％））。実験はＦｉｌ＋株の３０
クローンとＦｉｌ−株の３０クローンとについて実施し
た。

非選択培地で２日経た後に得られた原栄養株のパーセン
テージとしての定性的評価は、５０世代前または後に、
株Ｆｉｌ＋または株Ｆｉｌ−の場合に、−層安定なプロ
フィルに形質転換しないことを示している（表４）。組
み込みの不在を示すため、５０世代を経る前と後にＦｉ
ｌ＋とＦｉｌ−の形質転換体からＤＮＡを抽出し、■■
と勿旧酵素によって制限する。制限されたＤＮＡと制限
されないＤＮＡを、アガロースゲル（８９ｍＭのトリス
緩衝液、８９ｍＭの硼酸、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ
８，３に対して０．７％）に移した後、ビオシンで形質
転換し、放射能ゾンデｐＢＲ３２２でハイブリダイゼー
ションした。結果は（示していない）はプラスミドバン
ドの存在と組み込みによるバンドの不在を示した。

サッカロミセス・セレビシアエにおいて、若干のａｒｓ
配列がゲノムに繰返され（特にテロマー末端の近くに見
出されるもの）、他のものは単一コピーに存在する（１
．２．１１）ことが知られている。この状態を、ｌＮＡ
１１９のａｒｓ配列に対して研究する。このため、実際
に挿入の全体を覆う４．６ｋｂのＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ
内的フラグメント（第７図）を精製し、アガロースゲル
に平行に移したゲノムとプラスミドのＤＮＡ制限移転に
対してゾンデとして用いる。既に第６図（また第７図）
に示したｐＩＮＡ１１９の制限図にてらして分析した結
果では、多分独特の配列（フラグメントｊｌＩＩ−Ｊｄ
ＩＩの間に正確に繰り返されるものより少なく）を示し
ている。２．　ｌｋｂのＢａｍＨＩの内バンドは、２．
３ｋｂの■屁ＩＩＩの内バンドと同様に、ゲノムと同じ
位置に再び認られる。ゾンデによるゲノムに現れる」し
Ｉ　１フラグメントは、−ｐＩＮＡ１１９におけるａｒ
ｓによりもたらされるクローン化したフラグメントと同
じである単一４．５ｋｂバンドに対応する（事実ｐＩＮ
Ａ１１９では、連結反応中に結合した二個のｌＩＩフラ
グメントがあり、ここでは当該フラグメントは２つの内
大きいもノテ、これは−ｐＩＮＡ１２５と−ｐＩＮＡＩ
２６　）挿入で相同である）。

尚第７図は、韮プラスミド−１】工ｕ１の制限地図であ
る。ａｒｓ配列をもつ部分に影線で示し、これは点線の
ＬＥＵ２を有する。寸法はキロベースの目盛である。使
用した酵素は、Ａ−」匣１．Ｂ＝」ユニ旧、Ｇ　＝　」
加↓ＩＩ、Ｅ＝　ＥｃｏＲＩ、Ｈ＝ＨｉｎｄｌｌＩ、Ｐ
＝　ＰｓｔｌＳＳ＝　Ｓ旦１、およびＸ＝Ｘｈｏｌであ
る。図の下には、ヤロウィア・リポリチカの１ｅｕ２−
３５株について（制限されていないＤＮＡと共に）、欠
失および実施された再クローンおよび高頻度での形質転
換の有効性を示している。２．２ｋｂの」憇旧−」憇旧
フラグメントを含有するプラスミドｐＩＮＡ１７１のみ
が有効である。

確かにこの寸法は（サッカロミセス・セレビシアエ（１
，２，１１）について記載された凹と比較することによ
り）ａｒｓ因子として必要な最少の配列のものよりも大
きいので、−ｐＩＮＡ１１９の挿入においてａｒｓを一
層正確に局限するために欠失と再クローンの実験を行う
。次の戦略は第７図に記載されており、結論として−ｐ
ＩＮＡ１７１に存在する２、２ｋｂの内フラグメントＢ
ａｍｔｌＩ−Ｂａｍ旧によってａｒｓが保持されるべき
であると結論することができる。

このプラスミドは、株Ｆｉｌ＋と株Ｆｉｌ−を高い頻度
で形質転換できる（表２）。染色体外法（示していない
）を保持でき、その安定性は−ｐＩＮＡ１１９のそれと
同じである（株ＩＮＡＧ３３１２９で選択培地で５世代
後の原栄養株は約６５％、ＩＮＡＧ３３１２２では８１
％）。

このプラスミドは遺伝子の増幅の目的で後から（る構造
の基礎として使用された。

なお、フラグメントＢａｍ１ｌｌ−Ｂａｍ旧はｃｏｌＥ
Ｉ型のバクテリアプラスミドとＭ１３ファージとの間の
ハイブリッドであるベクター「ブルースクリプトＭ１３
」に再クローンされた。このベクターはクローン北条部
位を有し、一方ではＢａｍｔ（Ｉ部位に皿を挿入し、他
方では５ａｌＩ部位と」■１部位（これは多部位のＸｈ
ｏＩ　と」…Ｉとの間でクローン化した）との間に含ま
れるＬＨＵ２の３ｋｂの最少コードの配列を許した。こ
の８．２ｋｂベクターは高い頻度でヤロウィア・リポリ
チカＩＮＡＧ３３１２９を形質転換でき、第８図に記載
したａｒｓの詳細地図の設定に関係した欠失と再クロー
ンの新しい組に対する基礎として使用された。

第８図は、ヤロウィア・リポリチカに対するミニベクタ
ーの構造を示す図で、 Ａ−この８．２ｋｂベクターは次のものを含む。

・２．２ｋｂ（ＢａｍＨＩ　−Ｂａｍ１ｌｌ　）　　ａ
ｒｓフラグメント、これはヤロウィア・リポリチカにお
いて複製を行う。

・ＬＥＵ２遺伝子（末端のないコード部分、５ａｌＩか
ら」匹■まで３ｋｂ）。

・複製ｃｏｌＥ１バクテリヤ源、これはＥ、ｃｏＶｉに
おいて増殖を行う。

・高収率でＲＮＡを作ることのできるバクテリオファー
ジＴ３とＴ７のプロモーター（従って、例えば極めて熱
いし放射能プローブを合成することができる）。

・配列行為を容易にするＭ１３配列（マルチサイトの双
方でのＤＮＡ鎖の相補的プライマー配列は商業的に入手
し得る）。

・例えばエキソヌクレアーゼｍまたは酵素」虹３１によ
って、遺伝子の後からのクローン化またはインヴイトロ
での欠失の開始を可能にするマルチサイト。

Ｂ−２，２ｋｂ　の−壜凪旧−」憇旧領域での凹フラグ
メントの詳細地図（縮尺図）。

この図では制限位置はＡ　＝　Ａ■Ｉ、Ｂ　＝　Ｂａｍ
１（Ｉ。

Ｃ＝　ＡｃｃＩ、　Ｈ＝ＨｉｎｄｌＩＩ、Ｎ＝ＮｏｔＩ
、Ｒ＝Ｒｓａ１、．５＝ＳａｌＩ、Ｔ＝　ＪＨＩ、Ｖ＝
ＥｃｏＲＶテ示した。

実ｌＩ津亀 遺伝子の増幅のためにｐＩＮＡ１１９上に存在するａｒ
ｓの有効性を示すため、次のプラスミドの構成を実施し
た。ベーターガラクトシダーゼに対してコードする大腸
菌の１ａｃＺ遺伝子を■皿のプロモーターの制御下にヤ
ロウィア・リポリチカで示すことができる（５）ので、
■皿を有する組み込みプラスミド−ｐＩＮＡ９８　（第
９図）とＬａｃＺの表現の構造で示される■■１部位に
おいて２．２ｋｂのフラグメントａｒｓ　　Ｂａｎ　Ｈ
Ｉ−Ｂａｎ旧をクローンする。新しいｐｌＮへ１３５プ
ラスミドは従って複製であり、ＩＮＡＧ３３１２２とＩ
ＮＡＧ３３１２９に導入される。

第９図は、ベータ・ガラクトシダーゼの表現で、組み込
みプラスミド−ｐＩＮＡ９８からプラスミド−ｐＩＮＡ
１３５を組み立てる説明図、ＬＥＵ２遺伝子をもつヤロ
ウィア・リポリチカのＤＮＡのＳａｌ　Ｉ　−Ｓａｔ　
Ｉフラグメントに存する２箇所の４ｍ部位の間のａｒｓ
のクローン化は、ＬＥＵ２遺伝子の表現について効果が
ない。これらの箇所が実際のコード配列の外にあるから
である。１　ａｃＺ遺伝子の上流にはＬＥＵ２プロモー
ターが認められる（　ＢａｍＨＩにクローン化した」ａ
ｕ３ａフラグメント、参考文献５）。

まず、ベーターガラクトシダーゼの表現はＸ−ｇａ１発
色基体を含む最少培地の皿で符号を付け、１分間トルエ
ン化の後、皿を３７°Ｃで装置し複製型形質転換体によ
って発現した着色強度がモノコピー形質転換体のそれよ
りもすぐれていることを観察する。この事実を定量化す
るため、形質転換体の粗製抽出物をつ（す、ミラー（１
２）の方法によってベーターガラクトシダーゼ活性を測
定し、プラトフォード法（１３）によって計算した蛋白
質量に関係させる。このベーターガラクトシダーゼの比
活性を、細胞を粉砕した場合に培地の中に原栄養体細胞
のパーセンテージによって修正する。このパーセンテー
ジは選択培地と非選択培地に平行培養で評価する。表５
に示した活性の結果は、ａｒｓで得られた増幅が２〜９
の因子で変化し株Ｆｉｌ＋および株Ｆｉｌ−で同様であ
ることを示している。

粗抽出物のベーターガラクトシダーゼの比活性の測定。

抽出時の細胞の密度は、ｄ当りの細胞の数で表わし、比
活性は国際単位（１単位は３７°Ｃでオルトニトロフェ
ノール−ガラクトシダーゼを１分間当り１０−９モル加
水分解する酵素量として定義される）であり、培地中の
原栄養株のパーセンテージを考慮して修正する。１の水
準は、任意にｐｌＮ＾９８（組み込みプラスミド）によ
って形質転換したクローンで得られた２つの測定値の平
均とする。０の水準は−ｐＩＮＡ１７１（ＬａｃＺのな
いＬＥＵ２＋　　ａｒｓ）によって形質転換された株に
相当する。株Ｆｉｌ＋または株Ｆｉｌ−においてｐＩＮ
Ａ１３５　　（第９図に記載した複製型プラスミド）を
用いた結果の異なる線は、独立した形質転換体に相当す
る。

ヤロウィア・リポリチカに対して存効なａｒｓ配列の単
離が株Ｆｉｌ−（形態突然変異体）に依存しないことを
確認するために、既にａｒｓ配列を有するプラスミドが
株Ｆｉｌ＋において複製できることを示した。さて本発
明者等は遺伝子のライブラリで株Ｆｉｌ＋を直接形質転
換することによりａｒｓを見つけることができることを
示すように努めた。まず、同じライブラリを用いて（「
プール２」）、形質転換体Ｌｅｕ＋の中から不安定であ
った若干のものを選択した（表６参照）。存在するプラ
スミドを酵母の形質転換体の全ＤＮＡのミニ調製で大腸
菌の形質転換によって単離した。この同じ「プール」か
ら株Ｆｉｌ−において予め単離したａｒｓ１８を有する
クローンを見つけた。しかし、ライブラリの構成の際に
（フラグメントはＩＩＩによって野生株のＤＮＡを完全
に制限することから得られ、−ｐＩＮＡ６２の」短冊部
位に挿入される）一つの、同じプラスミドにおいて複数
の」旦ＩＩフラグメントの再連結反応を行うことができ
ることから、これらのクローンは始めに記載したｐＩＮ
Ａ１１９プラスミドと厳密には同一ではない。

本発明者等は配列ＡＧＡＴＣＴ　（ＪＩＩ部位）がヤロ
ウィア・リポリチカに対して可能な’ａｒｓ共通配列の
部分を形成することができるかは無視して、同様に５ａ
ｕ３Ａによって野生株（Ｗ２９）のゲノムを部分消化し
、大きいが約１０〜１５ｋｂのフラグメントを選択し、
同じ−ｐＩＮＡ６２プラスミドのＢａｎ旧部位にクロー
ンすることによって構成される他のライブラリを用いる
ことを決定した。後記参考文献（１４）に記載されてい
るこのライブラリはヤロウィア・リポリチカゲノムで代
表され、なお染色体に導がれた組み込みによって３個の
ヤロウィア・リポリチカ遺伝子を得ることができる。株
Ｆｉｌ＋と株Ｆｉｌ−を形質転換するためにこのライブ
ラリの制限しないＤＮＡを使用した。この場合、本発明
者等はＬｅｕ十原栄養株に対して不安定であったクロー
ンを同定した。このため、ロイシンを補充した固体最少
培地で２回続けて形質転換体を培養し、この同じ培地に
線をつけて、ロイシンを含む最少培地と含まない最少培
地で複製によって分類する単離されたコロニーを得た。

また、分析の過程で２個の新しい」胆形質転換体を得た
。対応する配列は、表６に」工１で示した。ＤＮＡの２
個のライブラリで実現された形質転換の結果も示した。

表６：異なるゲノムライブラリによって形質転換された
株Ｆｉｌ＋と株Ｆｉｌ−における韮配列の取得。

見出された凹配列の名前を示した（特性化の過程での配
列に対すしａｒｓ”　）。最後の欄は、所定の実験に対
して試験したクローンの数で見出される個々のａｒｓの
数の割合によって示した。

単離した実際に異なるａｒｓ配列を考慮すると、使用し
たライブラリの型に関係なく、これはＦｉｌの関係では
２．５％程度でＦｉｌ÷の関係では０．６％程度の頻度
で選択されることがわかる（表７）。

表１ 工で知られたものよりも著しく小さく、極く僅かな配列
がヤロウィア・リポリチカで自動複製を支持できること
を示している。これらの結果は、この種類のすべての株
におけるａｒｓ配列の単離法の一般を明らかにする。

また、当業者にはヤロウィア・リポリチカで有効なａｒ
ｓ配列を単離するため使用した方法は、何れかの起源の
ＤＮＡを用いて複製できることは明らかである。例とし
て、バクテリオファージλのＤＮＡがこのような有効な
配列を含むことを示すことができた（４４９７２ｂｐと
４８５０２ｂｐの位置間、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　　長、　ｒ１８９〜ｒ２１７）。

表６に示した４つのすべての実験で、２つのゲノムライ
ブラリで得られたヤロウイア・リポリチカの形質転換体
の間で異なるａｒｓ配列を有するＬｅｕ＋クローンのパ
ーセンテージ。

これらの数字は、サツカロミセス・セレビシア前記配列
を更に良く特徴づけるために、種々のプラスミド−ｐＩ
ＮＡ１７１　、ｐＴＮ八１へ３　、ＰＩＮ八１へ４（第
６図と７図参照）の副クローンと欠失で実施した。

最後の２つのプラスミドからの構成を第１０図に示すが
、それぞれ２．７ｋｂと２．４ｋｂのフラグメントにつ
いて２個のａｒｓ６８とａｒｓ７７の有効部分を局在化
できることがわかる。これはａｒｓベクターを築くため
に必要なりＮＡの長さを非常に短縮することを示してい
る。実際に、ヤロウィア・リポリチカのＤＮＡの挿入は
、最初プラスミドｐＩＮＡ１２３と−ｐＩＮＡ１２４に
おいてそれぞれ６．６ｋｂと１７．８ｋｂであった。

また、同じタイプの手段でａｒｓ１８配列を分析した。

プラスミドの構成は前記プラスミドｐｌＮΔ１７１を使
用するか、あるいは第８Ａ図のミニベクターであるＩ］
ｌＮＡ１４７を使用して実施した。これらの２つのベク
ターはａｒｓ活性を持つ２．２ｋｂの同じフラグメント
」短冊を含み、同じ印の遺伝子ＬＥＵ２（ｐＩＮＡ１４
７の場合には２．０ｋｂのフラグメント韮１−５ａｔ　
Ｉ　、　−ｐＩＮＡ１７１の場合には、やはりプラスミ
ドｐＩＮＡ６２　（第４図）に認められる５、３ｋｂの
フラグメント５ａｌｔ−３ａｔ　Ｉ）を含む。これはｐ
ＩＮＡ１４７に対してブルースクリプトから（ストラタ
ジーン、３７７０タンシイストリート、サンジエゴ、Ｃ
Ａ９２１２１）、１Ｎ＾１７１に対してｐＢＲ３２２か
ら構成されたバクテリア部分において異なる。

プラスミドの構成は全て、ｐｌＮ＾２１１の場合は別と
して、第１１図に示した制限部位を用いた欠失または再
クローンによって行った。このｐＩＮＡ２１１プラスミ
ドは、サッカロミセス・セレビシアエで観察されるイン
・ヴイヴオの欠失の記載（１５，１６）から感得した次
の方法で得られ：　ｐＩＮＡ１４７プラスミドを酵素」
圏Ｉによって連結し、この部位はａｒｓの上流で若干塩
基性のブルースクリプト部分に認められ；酵母をこのよ
うにして線状にしたプラスミドで形質転換し；表現型Ｌ
ｅｕ＋に対して安定なりローンを同定し、含まれている
プラスミドを抽出した。酵母ヤロウィア・リポリチカが
それ自体とこのプラスミドを次に円形の分子の状態で増
殖するように再連結する前に、このプラスミドは、イン
・ヴイヴオで酵母ヤロウイア・リポリチカにより実現す
る塩基の約７０対の欠失を含むことが確認される。

また、第１１図に示したように、高い頻度の形質転換と
染色体外復製とによる配列は、隣合った２つの領域に物
理的に局在化できることを示すことができた。２つの因
子を確認するため、プラスミド−ｐＩＮＡ１７６に示さ
れる１、３ｋｂのフラグメントを使用することを決定し
た。このフラグメントａｒｓは、ベクターの」短冊部位
に右側の５ａｕ３Ａ部位が連結されてＢａｍ１１１部位
が再形成されるので、２個のＢａｍ旧部位によって境界
を限定される。このフラグメントは、従ってｐＢ１１３
２２に基づく他のベクターに、テトラサイクリン（ｐＩ
ＮＡ２３２）に耐性のためコードする遺伝子に存在する
」印旧部位において、あるいはＬＥＵ２（ｐＩＮＡ２３
７と−ｐＩＮＡ２３７°）の配列の末端部分に存在する
ＪＬＬＩＩ部位において、あるいはベクター（ｐＴＮＡ
２４０とｐＴＮＡ２４０’　）のＰｖｕｌｌ＠Ｂ（立に
挿入されるクローン化の多部位のａｒｓＩＩ部位におい
て挿入できる。これらのベクター−ｐＩＮＡ２３７、ｐ
ｌＮ八２へ０　、ｐｌＮ八２へ０゛、−ｐＩＮＡ２４０
’が特に適するが、これはａｒｓの挿入がｊ７１１部位
に生じた場合、挿入のＢａｍ１１１部位が消失している
からである。

これらのベクターはその結果、 一遺伝子ＬＥＵ２を表現できる２ｋｂ配列。

−１，３ｋｂに滅じたａｒｓ１８の配列。

アンピシリンとテトラサイクリンの抗生物質に耐性の２
個の遺伝子。

一テトラサイクリンに敏感なのでハイブリッドクローン
の符号を付けて（特にこの種の複製プラスミドについて
ゲノムライブラリを構成するため５ａｕ３Ａによって部
分消化から出たフラグメントの）クローン化することで
きる単一の」短冊部位。

プラスミド−ｐＩＮＡ１７６　、　ｐｌＮ八２へ２　、
ＰＩＮ八２八ツ３７ｌＮＡ２３７’、−ｐＩＮＡ２４０
　、　−ｐＩＮＡ２４０’の地図は、第１２図に記載し
た。全部、株Ｆｉｌ＋ＩＮＡＧ３３１２２を形質転換す
る能力について試験し、制限されていないＤＮＡμｇ当
り、５０００以上の形質転換体を得ることができた。

尚第１１図はａｒｓ１Ｂ配列の縮減図で、左側にその名
称を示したプラスミドは中央に下線を引いたａｒｓ１８
の部分とヤロウィア・リポリチカの■皿遺伝子を含み、
場合によってバクテリアベクターｐＢＲ３２２（ｐ　Ｉ
ＮＡ　１２２、ｐＩＮＡ１２０　、ｐＩＮＡ２３２）ま
たはブルースクリプト（−ｐＩＮＡ１４７、−ｐＩＮＡ
１７３　、−ｐＩＮＡ１７４、−ｐＩＮＡ１７５　、−
ｐＩＮＡ１７６　、ｐＩＮＡ２１１）の１つまたはその
他に存在する。その構成を本文中に説明したｐＩＮＡ２
１１の構成を除いて、上に示した制限部位を用いて欠失
または再クローン化によってすべて組み立てられる。基
本的な２つの領域、一つは高頻度の形質転換、他の一つ
は自動複製能に対する領域は中央に下線を引いた。

注直１）形質転換の頻度は＋＋（ＤＮＡＩμｇ当たり５
０００以上の形質転換体）　、＋（ＤＮＡＩ　Ｉ！ｇ当
たり２００〜５００以下の形質転換体）、または−（Ｄ
ＮＡＩμｇ当たり２００未満の形態転換体）によって示
した。

（２）　　Ｌｅｕ十表視表現型安定性は＋（不安定）ま
たは−（安定）によって示した。

第１２図はａｒｓ１８配列を有する種々の大腸菌−ヤロ
ウイア・リポリチカシャトルプラスミドを示す図で、す
べて、酵母におけるＬｅｕ十表視表現型て選択できる。

プラスミドｐＩＮＡ２３２は」し工欠失によって第６図
に記載したプラスミド１ぴＡ月１−から派生する。従っ
て、ａｒｓ機能に必要でない領域を単一Ｂａｍ１ｌＩ部
位の上流に有する。５つの他のプラスミドは第１１図に
定義した１、３ｋｂの最少の韮領域を有する。バクテリ
ア部分はｐＩＮＡ１７６の場合はブルースクリプトから
成り、他のプラスミドの場合にはｐＢＲ３２２から成る
。２つのベクター−ｐＩＮＡ２３７とｐＩＮＡ２３７’
は、ｐＩＮＡ６２の部分消化によって得られる国遺伝子
を有する２２９８ｂｐフラグメントを単一ＥｃｏＲＩ部
位で挿入したｐＢＲ３２２プラスミドから導く。

次に、ａｒｓ１８を有する１、３ｋｂの■旧フラグメン
トは国に並ぶ」烈■の２つの部位の間に２方向に挿入し
た。−ｐＩＮＡ２４０とｐＩＮ＾２４０′のプラスミド
は、ａｒｓ１８を有する一Ｂａｍｌｌｌフラグメントの
２方向に導入できる」紅ＩＩリンカ−（ベーリンガー参
照番号９０９７３４）を単一Ｐｖｕ　Ｕの部位で挿入し
たｐＢＲ３２２プラスミドから導く。ＬＥ０２遺伝子は
得られたプラスミドに上記のように導入された。

さらに、ａｒｓ１８の１．３ｋｂのフラグメントは、二
つのストランドについて、ジデオキシヌクレオチドのサ
ンガー法によって確立されたヌクレオチド配列によって
更に特徴づけられた。第１３図は、ＡＴ　（６７，５％
）に富み、１０〜１３の塩基の内繰り返しで、順方向で
、あるいは逆の方向で複雑なプロフイルを特徴づける１
３０５のヌクレオチド配列を示した。さらに意味のある
ことは下線を引いた。これらのうちの大部分は、上記の
本発明者等が自己複製に重要であることを示した配列の
部分に示されているので、この働きの役割が重要か否か
示すことができる。

尚第１３図はａｒｓ１８の配列図で、第１１図に述べた
制御部位を、配列の上方に示した。少なくとも１０個の
塩基を有する順方向（Ａ−ｆ：、）と逆方向（８〜Ｍ）
の反復は下線を引き、塩基の数はハイフンの後に示した
。特に反復にはＤに含まれ、配列Ｅはパリンドロームそ
のものである。同様に順方向の著しい反復・Ａ−Ｂ−Ｃ
に注意を要する（１０７５〜１１２１と１１４７〜１１
８３）。更に、ＡＴ交代（５００〜５２０と１２２０〜
１２５０領域）並びにＡ　（１５０〜１８０領域）また
はＴ　（３４０〜３７０領域）の反復が見出された。最
後に、囲まれた配列はサッカロミセス・セレビシアエ酵
素で定義された（コンセンサスＷＴＴＴＡＴＰＴＴＴＷ
を有する１１に対して９または１０の相同塩基、ＷはＡ
またはＴ、ＰはＡまたはＧを示す、参考文献２６）ａｒ
ｓコンセンサスをもつ不完全な相同体に相当する。

ａｒｓ　　　について　　　の　　と 予め、大腸菌の遺伝子ＬａｃＺを増幅するため−ｐＩＮ
Ａ１１９について存在するａｒｓ１８の有用性を示した
。

ここで、このａｒｓ１８配列は細胞外アルカリ性プロテ
アーゼまたはＡＥＰ（１７）に対してコードするヤロウ
ィア・リポリチカのＸＰＲ２相同遺伝子、インベルター
ゼに対してコードするサッカロミセス・セレビシアエの
ＳＵＣ２非対応遺伝子（１８）　、インターフェロンα
１に対してコードする豚のプロＩＮＦα１遺伝子（１９
）　、および生キモシンに対してコードするプローＲＥ
Ｎ遺伝子（同文献）の増幅を可能にすることを示す。こ
れらの遺伝子の増幅は、対応する蛋白質の生産と分泌の
増加を可能にした。使用したプラスミドと株の組み合わ
せは第１４図と表８に示した。

第１４−１〜４図は、遺伝子増幅に用いられる組込みと
複製のプラスミドの構造の説明図で、７１えヱ ａ）　　−ｐＩＮＡＬ５７−この分裂ベクターは、ｕ図
遺伝子を有するρｌＮＡ１２８　　（参考文献１４）の
ＩＩＩフラグメン）　（６，９ｋｂ）による遺伝子凹の
内部ｊｌｌＩフラグメント（０，９ｋｂ）の置換によっ
て生成された。

ｂ）　　ｐＩＮＡ１３６−この複製型ベクターは選択マ
ーカー」罠とａｒｓ１８を含む複製型ベクターｐｌＮへ
１７１にＸＰＲ２遺伝子を含む−ｐＩＮＡ１５２のＣ１
ａ　Ｉフラグメント（４，５ｋｂ）を挿入して生成され
た。

麩捜肥遺孤ヱ ａ）　　ｐＩＮ八１へ９−興票マーカーと狸録プロモー
ター（第１７図）の制御の下にＳＵＣ２遺伝子を含む組
込みベクター。このベクターは株ＪＭ５５においてＸＰ
Ｒ２位置に組み込まれる。

ｂ）　　−ｐＩＮＡ１８１−複製型ベクターｐＩＮへ１
７６（第１２図）の５ａｉｌとＣ１ａｌとの部位の間に
挿入したｐｌＮ＾１６９の３．９ｋｂのＣ１ａ　Ｉ　−
Ｓａｌ　Ｉフラグメントの形で、肌遺伝子を含む複製型
ベクター３）ブローＩＮＦ−α１゛云 ａ）　　ｐＩＮＡ１８７−−ｐＩＮＡ１５６に由来する
ヤロウィア・リポリチカＵＲＡ３マーカーと−ｐＩＮＡ
１８　（第１９図）のブローＩＮＦ−α、遺伝子を含む
組込みベクター。

このベクターは株ＪＭ７７においてＸＰＲ２部位に組込
まれる。

ｂ）　　ｐＩＮＡ２５０−ｐＩＮ＾１８６のＣ１ａ　Ｉ
　−Ｐｓｔ　Ｉフラグメント（４，２ｋｂ）　　と複製
型ベクターｐＩＮ＾２３７（第１２図）のＣ１ａ　Ｉ　
−Ｐｓｔ　Ｉフラグメント（４，４ｋｂ）の連結反応に
よって構成されたブローＩＮＦ−α１遺伝子を含む複製
型ベクター ｕ１旦」Ｕ遺猛ヱ ａ）　　ｐＬＸ３４−ウシプロレニン（参考文献２０）
に対してコードする遺伝子を含む組込みベクター。

ｂ）　　ｐＩＮ＾１８４−プロＲＥＮ遺伝子を含む複製
型遺伝子。プ町１暉遺伝子とＬＥＵ２マーカーの双方を
有するｐＬＸ３４のＣ１ａ　Ｉ　−Ｐｖｕ　Ｉフラグメ
ント（５，９ｋｂ）をａｒｓ１８を含むｐＩＮＡ１３０
のＣ１ａ　Ｉ　−Ｐｖｕ　Ｉフラグメント（５，９ｋｂ
）　と連結し、これによってマーカー遺伝子をアンピシ
リンに耐性に改質する。

凹相同遺伝子およびＳＵＣ２非対応遺伝子、ブローＩＮ
Ｆα１およびブロー」遺伝子の増幅に対して使用した組
込みと複製ベクターの名称。種々の活性のアッセイに対
して選択された受容体株と形質転換体の名称は、最後の
二個に認られる。

アルカリ性細胞外プロテアーゼ（ＡＲＰ）に対しコード
するヤロウィア・リポリチカのＸＰＲ２遺伝子を、複製
プラスミドに挿入し、次にヤロウィア・リポリチカに導
入した。本発明者等は次の我々の収集した株によって分
泌したアルカリ性細胞外プロテアーゼの生産と比較した
。

ＪＭ１２　（ＭａｔＢ、　Ｉｅｕ２−３５　、ＬＹＳ５
−１２　、ｕｒａ３４８、秤皿）は、第１４図に示した
プラスミドｐＩＮＡ１５７を使用して破壊した。この破
壊は、予め制限酵素Ｍｌｕｌ　とＥｃｏＲＩで制限した
プラスミドｐＩＮＡ１５７を用いて株ＪＭ１２の形質転
換により得られる。第１５図に示した原理によれば、二
重交差によってＬＹＳ５遺伝子に対しＸＰＲ２遺伝子の
置換が得られた。得られた株ＪＭ２３は、従ってマーカ
ーｐと破壊された遺伝子凹を除いて、株ＪＭ１２と同質
遺伝子型である。

この株は、アルカリ性細胞外プロテアーゼを生産しない
が、蛋白質の生産には良い受容体である。

ＪＭ１２と同質遺伝子であるこの株を複製型プラスミド
ｐｌＮへ１３６で形質転換した。ＪＭ６９とＪＭ７０は
、複製型プラスミドｐＩＮＡ１３６で形質転換した株Ｊ
Ｍ２３に相当する。

第１５図は、株ＪＭ２３の構造の概略図で、株ＪＭ１２
のＸＰＲ２遺伝子座（Ｃ）の染色体制限地図と分裂プラ
スミド−ｐＩＮＡ１５７の制限地図を示す。分裂プラス
ミドは前以って制限酵素Ｍｌｕ　ＴとＥｃｏＲＩによっ
て制限された。相同領域ＭｌｕＩ−Ｂれ■と」れＩＩ−
Ｅ匹Ｒ１における二重の「交叉」によってＸＰＲ２遺伝
子を二遺伝子によって置換した。

株ＪＭ１２、ＪＭ２３、ＪＭ６９とＪＭ７０によって分
泌されたＡＲＰの分量の比較を第９図に示した。これは
、因子３．４ないし５．６によって修正増幅がａｒｓ１
８で得られることを示している。この修正増幅因子は、
既にβ−ガラクトシダーゼのアッセイに対し既に説明し
たように、アッセイの際に培地内のＬｅｕ十細胞のパー
センテージを考慮に入れる。

ＪＭ１２　　　　無し 破壊された株ＪＭ２３、ＸＰＲ２遺伝子の染色体コピー
を有する株ＪＭ１２および複製型プラスミドに囲遺伝子
を有する形質転換体ＪＭ６９とＪＭ７０によって分泌さ
れたプロテアーゼ活性の生産の比較。培養は、２８°Ｃ
でＧＰＰ培地（グリセロール６．７ｇ＃！、硫酸アンモ
ニウムを含まない酵母窒素塩基１．７ｇ／４．５０ｍＭ
リン酸塩緩衝液ｐＨ６，８）で実施した。培地を１０ク
リット単位で接種し、上澄みを接種後２３時間で引き出
した。プロテアーゼ活性をドニーらの方法（２７）によ
って測定し、ここでは任意の単位で示す。Ｌｅｕ十細胞
のパーセンテージは、ロイシンで補充した培地で培養部
分を培養して、次にロイシンを用いない培地および用い
た培地で複製して決定する。修正した増幅はＬｅｕ十細
胞のパーセンテージによって修正した活性を用いて計算
する。

ＸＰＲ２遺伝子のプロモーターは複雑な規則を持ってい
る（２１）。生成物の動態と水準は培地と培養条件に依
存する。従って、株ＪＭ１２と株ＪＭ７０の生成の動態
を、誘導しないＹＮＢ培地（硫酸アンモニウムを含まな
い酵母窒素塩基１．７ｇ＃！、グルタミン酸ナトリウム
１ｇ／２、グルコースＬｏｇ／　ｌ　、　５０ｍＭリン
酸塩緩衝液、ｐｌ＋６．８）と、二つの誘導培地ＹＮＢ
ｐｐ（プロテアーゼペプトン１．７８／ｆにつきＹＮＢ
を添加する）およびＹＰＤｍ　（酵母抽出物１ｇ／！、
プロテアーゼペプトン５０ｇ／　１、グルコース１０ｇ
／　Ｉ！、’）において比較した。プロテアーゼ活性は
、基質（５０ｍＭトリスで１０ｍｇ　／　ｍｌ　、、ｐ
Ｈ８）としてアゾコール（シグマＡ３１４３）を用いて
測定し、３０分間３０°Ｃで培養した後、５２０ｎｍで
の吸収増加を測定した。

結果を第１６図と表１０に示す。

ＪＭ１２　　−　　染色体型　ＹＮＢ　　Ｏ，０８１０
０１ＪＭ１２　　　＝　　染色体型　ＹＮＢｐｐ４．２
　１００　　１ＪＭ１２　　−　　染色体型　ＹＰＤｍ
　１２．２　１００　　１ＪＭ７０　ｐｌＮｌＮＡ１５
１複製型　　ＹＮＢ　　３．４　　Ｂ１．６　５２ＪＭ
７０　−ｐＩＮＡ１３６　　複製型　　ＹＮＢｐｐ　１
２　　８４．６３．４ＪＭ７０　ｐＩＮＡ１３６　　複
製型　　ＹＰＤｍ　　６０．２　８３．６５．９接種後
４０時間で得られた活性値。プロテアーゼ活性は任意の
単位である。

接種後４０時間で得られた増幅は、誘導培地で調製され
た培地に対して３．４〜５．９で変化する。これに対し
て、抑圧培地（ＹＮＢ）では、制御の回避は複製型形質
転換体の場合に行われ、これによって５０の因子による
増幅を説明できる。この現象は、制御分子を同定できる
ことが、まだ説明されておらず、従って未だ殆ど活用さ
れずに残っている表現の増幅の他の可能性があることを
示唆している。

実去ｌ吐Ｕ インベルターゼ（１８）に対しコードするサッカロミセ
ス・セレビシアエのＳＵＣ２遺伝子を、ＸＰＲ２プロテ
アーゼの制御下に置き、アルカリ性細胞外プロテアーゼ
（第１７図参照）の信号配列に融合した。

第１７図は、プレーＸＰＲ２−５ＩＩＣ２融合体を有す
るプラスミドｐＩＮＡ１６９の構造の説明図で、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントによって支持される
凹プロモーターの上流領域は、ｐＢＲ３２２（−ｐＩＮ
Ａ１５０）に挿入された。次にＣ１ａ　Ｉ欠失はｌ１ｉ
ｎｄ　Ｉ［［（ｐＩＮＡ１５１）部位を除去することが
できる。さらに、突然変異誘発によってプロテアーゼの
信号配列をコードする領域の後に旧ｎｄｌＩ［部位を生
じさせたこのために、ＡＴＧの周囲領域を被う５５３ｂ
Ｐ　Ｘｈｏ　　Ｉ　−ｈＬＩ［７ラグメントを有するフ
ァージＭ１３ｍｐｌＢ−Ｘ４に、突然変異誘発物質のオ
リゴヌクレオチド： （５’　ＣＡＧＣＡＴＣＡＧ＾八ＧＣＴＴＣＴＧＣへＧ
ＧＧＧＣＧ３’　）によって突然変異を誘発した。突然
変異フラグメントはＢａｍｆｌＩ−Ｓａｌ　！制限の後
で精製され、プラスミドｐＩＮＡ１６５を生成するため
ｌＮＡ１５１に導かれた。

」ｃｏＲＶ欠失によって−ｐＩＮＡ１６６において■弗
発令（−ｐＩＮＡ６２の５．３ｋｂのフラグメント）と
狂Ｒ２プロモーターを有するプラスミドｐＩＮＡ１６６
を商事させた。

最後に、Ｉ）ＲＢ５８　　（参考文献１８）の２ｋｂの
肛画■フラグメントから派生したサッカロミセス・セレ
ビシアエの５ｕｃ２遺伝子を挿入し最終プラスミドｐＩ
ＮＡ１６９を生じさせた。

次の二つの株のインへルターゼの生産を比較したニーＪ
Ｍ５５、ＸＰＲ２部位で組み込まれた組込みプラスミド
−ｐＩＮＡ１６９で形質転換した株ＪＭ２３に対応する
。

組込みは、単一の切断部位が凹領域である制限酵素Ｎｈ
ｅＩで制限酵素ρｌＮＡ１６９を予め制限したので、凹
部位に向けられる。

Ｐｌ、これは複製型プラスミド−ｐＩＮＡ１８１で形質
転換された株ＪＭ２３に対応する。

インベルターゼ活性を、ウニルナ−ら（２２）の方法に
よって測定した。インベルターゼ生産の増幅を、誘導Ｙ
ＰＤｍ培地で測定した。これは炭素源がスクロース（１
０ｇ／　ｆｆｉ　）またはグルコース（ｌｏｇ／　Ｑ　
）である。結果を、第１８図に示す。培養４０時間後、
グルコースまたはスクロースで２〜２．９の未修正増幅
因子（即ち、全細胞が生産力を存する）が得られた。こ
の構成はヤロウィア・リポリチカを炭素源としてスクロ
ースを含む培地で生長させることができ、従ってこの有
機体に対して新規の基質を示すことができることを示し
ている。

第１８図は、組込まれたＳＵＣ２遺伝子（Ｉ）を有する
株ＪＭ５８と−ｐＩＮＡ１８１複製型ベクター（Ｒ）に
針皿遺伝子を存する株１’ｌによって、２８°ＣでＹＰ
Ｄｍサッカロース（＾）とＹＰＤｍグルコース（Ｂ）の
培地で、生長過程でのインベルターゼ活性の生成を比較
する曲線図である。

非ウィルス性活性を有するインターフェロンα１に対し
コードする豚プローＩＮＦ−α１を、ＸＰ１１２プロモ
ーターの制御下に置き、ＡＥＰ　　（構成について、第
１９図参照）の「プレプロ」部位に融合した。複製型プ
ラスミド（−ｐＩＮＡ２５０）に遺伝子を有する肛毀部
位で組み込まれた遺伝子のコピーを有する株によって生
産されたインターフェロンの生産を比較したニ 一株ＪＭ７７は、単一切断部位がＸＰＲ２領域である制
限酵素肚１で予め制限されたプラスミド−ｐＩＮＡ１８
７を用いて形質転換された株ＪＭ２３に対応し；株ＪＭ
８５、ＪＭ８６およびＪＭ８７は、複製型プラスミドｐ
ＩＮ＾２５０を用いて形質転換された株ＪＭ２３に対応
する。

尚第１９図は、プレプロＸＰＲ２−ＩＦＮ−α１融合体
を有するプラスミドｐＩＮＡ１８７の構造の説明図で、
ブタのインターフェロンα１をコードするブロー−ＩＦ
Ｎ−α１遺伝子を含むｐＬＤ６７ベクターが知られてい
る（参考文献１９）。Ｘｂａ　Ｉおよび」μＵの酵素に
よって開き、次にオリゴクレオチドＡ　（５６ｍｅｒ）
とＢ　（４８ｍａｒ）を用いて連結した。後者はプロテ
アーゼの「プレープロ」領域を伴う過程でｌｙｓ　−Ａ
ｒｇ部位（下線）を生成してＸｂａ　Ｉ　−Ａｐａ　Ｉ
アダプターを形成することができ、成熟インターフェロ
ン（−ｐＩＮＡ１８５）をコードする配列に続く。

Ａ　　：　　ＣＴＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＧＡＴＧＴＧＡ
ＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣ
ＣＡＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣ Ｂ　　：　　ＴＡＧＡＴＴＣＧＴＴＡＣＡＣＴＧＧＡＣ
ＧＧＧＧＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＡＣＣＧＧＧＴＧＴ
ＧＧＴＣ ハイブリダイゼーション遺伝子は、ＸＰＲ２プロモータ
ーを再形成する１、９ｋｂの」圏Ｉ−Ｘ画Ｉフラグメン
トの挿入によって生成され、ＡＥＰのブレーフロ部位を
コードする配列は、インターフェロン（ｐｌＮ＾１８６
）をコードする配列に続く。組込みベクター−ｐＩＮＡ
１８７は、ｐＴＮＡ１５６に由来する。１．７ｋｂのフ
ラグメントＥｃｏＲＩ−）１ｉｎｄＩ［［によって支持
されたｔｌＲＡ３選択マーカーを有する。

第１１表に示した結果は、３．７５ないし８．２の因子
によって修正された増幅がａｒｓ１８で得られることを
示している。

衷Ｕ 株　　ブラスミＦ　　　特　性　培地ＩＮＦα　ＬＥＤ
′−修正活性　　χ　増幅 ＪＭ７７　　ｐｌＮｌＮ八ツ８７組込型　ＹＰＤｍ　　
１００　　１００　１ＪＭ８５　　−ｐＩＮＡ２５０　
　複製型　ＹＰＤｍ　　３００　　　４９　６．ＩＪＭ
８６　　ｐＩＮＡ２５０　　複製型　ＹＰＤｍ　３００
〜２２５　３６８．２〜６．２ＪＭ８８　　−ｐＩＮＡ
２５０　　複製型　ＹＰＤｍ　　２２５　　　６０　３
．７５ハイブリッド遺伝子ＸＰＲ２−ＩＮＦα１の染色
体コピーを有する株ＪＭ７？、複製プラスミドにＸＰＲ
２−ＩＮＦα１遺伝子を有する形質転換体ＪＫ８５、Ｊ
Ｍ８６、ＪＭ８７によって分泌された抗ウイルス性活性
の生成の比較。

培養は、２０″ＣでＹＰＤｍ培地（酵母抽出物１ｇ＃！
、プロテアーゼペプトン５０ｇ／　ｌ、グルコースＬｏ
ｇ／　Ｑ　）で行った。培地を１０久リット単位で接種
し、上澄みを接種後４８時間および５３時間で引き出し
た。抗ウィルス活性をボンナルシールおよびラウデによ
る方法（２８）によって測定し、ここでは任意の単位で
示す。

実画ｌ吐則 ヤロウィア・リポリチカによるプロキモシンの生産は、
既に参考文献（２３）の特許およびフラングらによる組
込みプラスミドＬＥＵ２−プロＲＥＮが記載されている
文献（２０）で実証されている。このプラスミドは、ｐ
ＬＸ３４と呼ばれ、第１４図に示した。これはヤロウィ
ア・リポリチカのＬＥＵ２遺伝子のプロモーターの制御
の下にプロＲＥＮ遺伝子を有する。

キモシンの生産を比較するニ 一株０Ｌ２４９　、これはＩ？、ｌ−ゲノム遺伝子座で
組み込まれたｐＬＸ３４に宿を貸す； 株ＤＬ１１８　、これはプラスミドｐＩＮ＾１８４と同
質遺伝子型であり、これによって形質転換される。後者
はａｒｓ１８　（第１４図参照）の付加によってｐＬＸ
３４から誘導される。プロキモシンを生産し不安定なＬ
ｅｕ十表視表現型する形質転換体は、２３°Ｃで液体培
地で選択され培養された。

第１２表は、ＹＮＩＩＳ最少培地（酵素窒素塩基６．７
ｇ／ｌ、グルコースＬｏｇ／　ｉ！、　）で６０時間の
培養の後、キモシン生産が複製形質転換体において組込
型制御におけるよりも１゜３倍高いことを示している。

キモシン活性のアッセイは、ヤロウィア・リポリチカの
異なる形質転換体の培地上澄みに存在する。活性は任意
の単位で示した。アッセイに対し、参考文献（２０）に
記載の方法は次の通りであった：細胞を遠心分離後、上
澄みを２０分間、酵素前駆体を活性キモシンに転換する
ため、約ｐＨ２（塩酸を用いた）にて処理して活性化し
た。後者の活性は、３７°Ｃにて乳１　ｄ　（ｐ１６．
５で４１．５ｍＭの酢酸ナトリウム、１３．６ｍＭの塩
化カルシウム中に１２％デイフコスキムミルク）を凝固
する容量によって、市販のレンニン（シグマＲ４８７９
）の標準系と比較して、測定した。

この生産は最少培地（７０％の平均値）にプラスミドを
有する細胞を対象とする場合、増幅因子１．７７が認ら
れる。

同じ実験を、上記の株ＩＮＡＧ３３１２２　（Ｆｉｌ　
”）を同じプラスミドｐＬＸ３４　（酵素Ｘｈｏｌでプ
ラスミドの線形化によって■肥ゲノム遺伝子座に向けら
れた組込み）とｐｔＮ八１へ４（複製型プラスミド）で
形質転換によって行った。形質転換体をＹＥＰＣ完全培
地（酵母抽出物０．１％、ペプトン５％ニゲルコース１
％）で培養した。２３°Ｃで５０時間培養後、培地中の
キモシン生産物は、複製形質転換体では組込み形質転換
体の場合の如く３倍高いことを見出した。この段階の培
養で観察されたＬｅｕ十細胞のパーセンテージ（４５％
）によって補正後、生成した増幅は２．８倍である。Ｉ
ＮＦ−α、遺伝子と抗体は、クロード・う・ボンナルジ
ェル、アンスチテユ・ナシオナル・ド・う・ルシエルシ
エ・アグロノミク、ジュイアンージョサから伝えられ、
ＩＦＮの生物学的投薬は、前記研究所で行われた。

ＳＵＣ２、ＩＮＦ−α１およびプロテアーゼはジャンー
マルク・ニコードの協力で実施した。

次の株は１９８８年１月２１日に、アンスチテユ・パス
ツールのコレクシオン・ナシオナル・ド・タルチュール
・ド・ミクロオーガニズム、２８　　リュド　ドクテル
ールー７５７２４パリ　セデクス１５、にて寄託された
： エシエルシ７・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｔ）　：　ＩＮＡＧ２０　５８０ノ−ｐＩＮＡ１２３ 第１−７２４号 一ヤロウイア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　１ｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ）　　：ＩＮＡＧ　３３　１２９ 第１−７２５号 一ヤロウイア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｉｎｉａ　１ｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａ）　　：ＩＮＡＧ　３３４６２／−ｐ
ＩＮＡ１１９　第１−７２６号皇ｊＬ訪吠 １、ウィリアム・デイ・エイチ：イースト、１９８５゜
上（１〜２）、１〜１４゜ ２、キールシイ・ニス：バイオ・エッセイズ：１（４）
、　１５７〜１６１゜ ３、ゲイタルディン・シー、リベット・エイ・エムとへ
スロット・エイチ：　Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　＋　
１９８５＋刊、４９〜５８゜ ４、ダヴイドウ、エル・ニス、アポストラコス・デイ、
オドンネル・エム・エム、ブロクトル・エイ・アール、
オグリチアク・デイ・エム、ウィング・アール・エイ、
スタスコ・アイ、ド・レーク・ジェヘ・アール：　Ｃｕ
ｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　、　１９８５．１０．３９〜４
８゜ ５、ゲイタルジン・シー、リベット・エイ・エムＣｕｒ
ｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　、　１９８７．１１．　３６９〜
３７５゜６、ウィング・アール・エイ、オグリジアク・
デイ−・エム；糸状菌の分子遺伝学、テンパーレーク・
ダプリュ・イー（著）、ＵＣＬＡシンボジア３４巻、１
９８５．３６７〜３８２゜ ７、ムレイ・エイ・ダブリュ及びツオスタク・ジェイ・
ダブリユニセル　１９８３．３４．９６１〜９７０゜８
、ダヴイドウ、エル・ニスおよびレーク・ジエイ・アー
ル：ヨーロッパ特許第０１３８，５０Ｂ−Ａｌ、　１９
８４゜９、フォアニール・ピー、ガイタルジン・シー・
ベルシイ・エム・エイ、フルートライク・ジエイ、およ
びヴアン・ヘーリクハイツェン・エイチ：Ｇｅｎｅ、　
１９８６．４２．２７３〜２８２）。

１０、サザン・イー・エム：　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ
ｌ、、　１９７５゜餞、　５０３） １１、チャン・シー・ニス・エム、タイ・ビーケイ：、
Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１９８３．　１６８．
５０５〜５２３１２、ミラー・ジエイ・エイチ：分子遺
伝学におけル実験にて、コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−１
９７１゜ １３、フ゛ラドフォード・エイチ・エム、八ｎａ１．　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９７６、７２．２４８゜１４、
クスアン・ジェー、フルニール・ビーおよびガイタルジ
ン・シー：ターゲット組込みによる酵素ヤロウィア・リ
ポリチカからの皿遺伝子をコードするサツカロピンデヒ
ドロゲナーゼのクローニング、Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ
、　１４　　：　１５〜２１（１９８８）。

１５、オル・ライ−バー・ティ、ツォスタク・ジェイ：
酵母組み換え：ダブルストランド・ギャップ修復と交差
との組み合せ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、。

８０　：　４４１７〜４４２１　（１９８３）。

１６、クネス・ニス・ホトスティンおよびフォックス・
エム：逆位ダイマーと組み換えプラスミド生成物の酵母
線状イヒＤＮＡ形成の形質転換、Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、　１８４〜３８７　（１９８７）。

１７、　タビドウ・エル、オドンネル・エム、カツマレ
ク・エフ、ペレイラ・デイ、ド・レーク・ジ工左のアル
カリ性細胞外プロテアーゼ遺伝子のクローニングと配列
、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９　：　４６２１
〜４６２９　（１９８７））。

１８、タウジグ・アールとカールソン・エム：インベル
ターゼに対する酵母ＳＵＣ２遺伝子のヌクレオチド配列
、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１　：　
１９４３〜１９５４（１９８３）。

１９、レフニブル・エフおよびカールソン・エム：生物
学的に活性なブタインターフェロンをコードする遺伝子
の分子クローニングと配列、ジャーナル・オン・インタ
ーフェロン・リサーチ、６：３４９〜３６０　（１９８
６）　’）。

２０、フランテ・エイ、カツマレク・エフ、アイゼンハ
ード・エム、ゲオゲガン・ケイ、ダンレイ・デイ、ドジ
ーウ・シヱイ、オートンネル・エム、ゴラヘル・エムお
よびランス・ニス；ヤロウィア・リポリチカにおけるウ
シプロキモシンの表現と分泌、インダストリアル・ミク
ロビオロジイ、２９：４３〜５７　（１９８Ｂ）　） ２１、オリトチアク・デイ、ドメイン・エイおよびタン
ネンバウム・ニス：カン−イ　゛・１ボ１チカの細胞外
プロテアーゼ生産の制御、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐ
ｈ。

Ａｃｔａ　４９７　：　５２５〜５３８　（１９７７）
。

２２、ウニルナ−・ダブリュ、レイ・エイチおよびライ
リンガ−・エイチ・ゼ・ント：へｎａｌｙｔ、　Ｃｈｅ
ｍ。

２５２　　：　２２４　（１９７０）。

２３、ダヴイドウ・エル、フランク・エイおよびジーウ
・ジエイ：ヤロウィア・リポリチカによる非対応蛋白質
の表現と分泌、ヨーロッパ特許出ｒ９Ｍ８６−３０７８
３９．１９８６゜ ２４、キクチ・ワイ：酵母プラスミドは、その安定性を
維持するためにシス作用遺伝子座と二個のプラスミド蛋
白質を必要とする、Ｃｅ１ｌ　３５　　：　４８７〜４
９３　（１９８３）。

２５、ウォルフーデイトリッヒ・エイチ、シピツキ・エ
ムおよびコーリ・ジェイ：シゾサッカロミセス・ポンプ
におけるプラスミドの複製：新規な遺伝子エレメントに
よる対称分離の改良、Ｍｏｌ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　６　　：　８０〜８９　（１９８６）　。

２６、ウィリアムソン・ディー：酵母ＡＩ？Ｓエレメン
ト、シラスフ　イヤーズ　オン：プログレス　レポト、
イースト１：１〜１４　（１９８５）　。

２７、ドニーら：プラスミンに対する基質としてのＩＣ
メチル化βカゼインおよび乳蛋白質形質転換体の研究へ
のその応用、Ｂ、　Ｂ、八、　６２６　：　１１７〜１
２６（１９８０）　。

２８、う・ボンナルシールおよびラウデ・エイチ：実験
的に誘発したウィルス腸炎の間の新生のブタ腸における
高いインターフェロンのタイターＩｎｆｅｃｔ、　Ｉｍ
ｍｕｎ、３２　：　２８〜３１　（１９８１）　。

【図面の簡単な説明】

第１図は、菌糸体の生長細胞または酵母型細胞において
、母性分離に関する性質を示す染色体外プラスミドの伝
達（播種）図で、生長（Ｃ）または生長停止（Ａ）は選
択遺伝子をもつプラスミド（Ｏ印）の存否による。核は
・印で示し、第２図は、親株Ｆｉ１＋（ＩＮＡＧ３３１
２２）と突然変異体Ｆｉｌ−（ＩＮＡＧ３３１２９）の
コロニーの形態を上（Ａ）、下（Ｂ）に示した倍率５〜
１０倍の拡大図、第３図は、光学顕微鏡（倍率４００倍
）で観察した株Ｆｉｌ＋（Ａ）と突然変異体Ｆｉｌ−（
Ｂ）の細胞の形態を示す顕微鏡写真図、 第４図は、このプラスミドのホーＢａｍ１ｌ１位での１
ｍフラグメント（黒）のライブラリ構造の計画を示すｐ
ｌＮ＾６２の組み込みベクター地図で、影線部分はアン
ピシリンに耐性のｂｌａｉｊｉ伝子であり、点線部分は
ヤロウィア・リポリチカのＬＥＵ２遺伝子であり、」亘
はプラスミドの複製のバクテリヤ源を示し、 第５図は不安定な形質転換体におけるプラスミドの検出
を示す図、 第６図は、第５図に定義した５種の形質転換体から単離
された５種のプラスミドの制限地図、第７図は、ａｒｓ
プラスミド」用紅旦の制限地図、第８図は、ヤロウィア
・リポリチカに対するミニベクターの構造を示す説明図
、 第９図は、ベータ・ガラクトシダーゼの表現で、組み込
みプラスミドｐｌＮ＾９８からプラスミド蛋白質八１３
５を組み立てる説明図、 第１０図は、ａｒｓ６Ｂとａｒｓ７７を有するフラグメ
ントの縮減図で、派生的プラスミドに存在する部分のみ
を示しており、これらのすべてが形質転換マーカーとし
てＬＥＵ２遺伝子を含み、 第１１図はａｒｓ１８配列の縮減図、 第１２図はａｒｓ１Ｂ配列を有する種々の大腸菌−ヤロ
ウイア・リポリチカシャトルプラスミドを示す説明図、 第１３図はａｒｓ１８の配列図、 第１４−１〜４図は、遺伝子増幅に用いられる組込みと
複製のプラスミドの構造の説明図、第１５図は、株ＪＭ
２３の構造の概略図、第１６図は、組込まれたＸＰＲ２
遺伝子（１）を有する株ＪＭ１２と、複製型ベクター−
ｐＩＮＡ１３６（Ｔｌ）に狸録遺伝子を有する株ＪＭ７
０による生長過程で生産されたプロテアーゼ活性の発生
の比較を示す曲線図で、２８゛ＣにてＹＮＢ　（Ａ）、
ＹＮＢｐｐ　（Ｂ）およびＹＰＤｍ　（Ｃ）で培養し、
プロテアーゼ活性は任意単位で示し、 第１７図は、プレーＸＰＲ２−ＳＵＣ２融合体を有する
プラスミド−ｐＩＮＡ１６９の構造の説明図、第１８図
は、組込まれたＳＵＣ２遺伝子（Ｉ）を有する株ＪＭ５
ＢとｐＩＮＡ１８１複製型ベクター（Ｒ）に銭別遺伝子
を有する株Ｐ１によって、２８°ＣでＹＰＤｍサッカロ
ース（Ａ）とＹＰＤｍグルコース（Ｂ）の培地で、生長
過程でのインベルターゼ活性の生成を比較する曲線図、
第１９図は、プレプロＸＰＲ２−ＩＦＮ−α１融合体を
有するプラスミド−ｐＩＮＡ１８７の構造の説明図であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヤロウィア・リポリチカにおいて効能のある自律複
   製配列。 ２、第８Ｂ図の制限地図を有する２．２Ｋｂ（￥Ｂａｍ
   ￥ＨＩ／￥Ｂａｍ￥ＨＩ）ＤＮＡフラグメントによって
   支持され請求項１記載の自律複製配列。 ３、第１３図に示した配列の有効部分に相当する請求項
   １記載の自律複製配列。 ４、￥ａｒｓ￥６８または￥ａｒｓ￥７７配列である請
   求項１記載の自律複製配列。 ５、請求項１ないし４のいずれか一つの項に記載の自律
   複製配列を有するＤＮＡ。 ６、請求項１ないし４のいずれか一つの項に記載の自律
   複製配列を有するプラスミド。 ７、請求項１ないし４のいずれか一つの項に記載のヤロ
   ウィア・リポリチカに効能のある自律複製配列を有し、
   特に、次の方法： ａ）ヤロウィア・リポリチカのゲノムフラグメントのラ
   イブラリがヤロウィア・リポリチカの栄養要求体を補足
   する組込みベクターにおいて形成され、 ｂ）前記組込みベクターによって補足されることができ
   る栄養要求体を有するヤロウィア・リポリチカのホスト
   株が、前記ライブラリのプラスミドで形質転換され、 ｃ）コロニーハイブリダイゼーションを、組込みベクタ
   ーを検出するプローブを用いて行い、最強の信号を有す
   る形質転換体を選択し、 ｄ）ベクタークローンの微小溶解物を調製し、染色体外
   プラスミドを検出する ことにより得られ、これらのプラスミドは ￥ａｒｓ￥配列を有し、この配列は形質転換力を試験し
   て確認でき、元のベクターの形質転換力の少なくとも５
   倍である、 ことを特徴とするプラスミド。 ８、次の工程： −ｐＩＮＡ６２タイプの組込みベクターにおいてヤロウ
   ィア・リポリチカのゲノムフラグメントのライブラリの
   形成； Ｆｉｌ＋株においてこのライブラリのスーパ −コイル化した円形プラスミドの形質転換、ＬＥＵ＋形
   質転換体（これは組込みプラスミドまたは複製型プラス
   ミドを含むことができる）の選択； −ｐＢＲ３２２プローブを用いたコロニーハイブリダイ
   ゼーション：より強力な信号がマルチコピー複製型形質
   転換体に見出されることが期待され；潜在自律複製配列
   クローンの単離； −選択されたクローンの微小溶解物は非制限ＤＮＡのサ
   ザン転写：ｐＢＲ３２２プローブを用いた染色体外プラ
   スミドの検出； −微小溶解物のＤＮＡを用い大腸菌の形質転換および自
   律複製配列プラスミドの増幅； −適当な場合、クローンの不安定性の特性化 から成る工程を含む方法で得られた請求項７記載のプラ
   スミド。 ９、Ｆｉｌ−ホスト株に対し形質転換体の不安定性を試
   験し、さらに最低の不安定性を有する形質転換体を選択
   する請求項８記載のプラスミド。 １０、請求項８または９に記載のプラスミドから得られ
   る自律複製配列を有するＤＮＡ配列。 １１、ヤロウィア・リポリチカにおいて効能のある自律
   複製配列を含むヤロウィア・リポリチカの栄養要求体を
   補足する組込みベクターを含むプラスミド。 １２、ヤロウィア・リポリチカにおける工業的蛋白質の
   表現を確保する全要素を含み、自律複製配列を含むヤロ
   ウィア・リポリチカにおける前記蛋白質の表現のための
   プラスミド。 １３、ヤロウィア・リポリチカ蛋白質の制御下に前記蛋
   白質に対しコードする配列を含む請求項１２記載のプラ
   スミド。 １４、プロモーターが￥ＸＰＲ２￥または￥ＬＥＵ２￥
   プロモーターである請求項１記載のプラスミド。 １５、蛋白質がＡＥＰ、インベルターゼ、ポルシンイン
   ターフェロン−α＿１およびプロキモシンから選ばれる
   請求項１４記載のプラスミド。 １６、ヤロウィア・リポリチカの￥ＸＰＲ２￥遺伝子を
   含む請求項１５記載のプラスミド。 １７、￥ＸＰＲ２￥プロモーターの制御下にサッカロミ
   セス・セレビシアエの￥ＳＵＣ２￥遺伝子を含む請求項
   １５記載のプラスミド。 １８、￥ＳＵＣ２￥遺伝子をアルカリ性染色体外プロテ
   アーゼの信号配列に融合する請求項１７記載のプラスミ
   ド。 １９、プロ￥ＲＥＮ￥遺伝子がヤロウィア・リポリチカ
   の￥ＬＥＵ２￥遺伝子のプロモーターの制御下にある請
   求項１５記載のプラスミド。 ２０、請求項６乃至９および１１ないし１９のいずれか
   一つの項に記載のプラスミドによって形質転換されたヤ
   ロウィア・リポリチカの株。 ２１、プラスミドが少なくとも一つの非対応配列を含む
   請求項２０記載の株。 ２２、Ｆｉｌ＋株である請求項２０または２１記載の株
   。 ２３、Ｆｉｌ−株である請求項２０または２１記載の株
   。 ２４、請求項２０ないし２３のいずれか一つの項に記載
   のヤロウィア・リポリチカの株を、その生長を確保する
   培地で培養する産業的蛋白質の調製方法。 ２５、請求項２４記載の方法により得られた蛋白質。