EP1159452A1 - FRAGMENT NUCLEOTIDIQUE, SONDE, AMORCE, REACTIF ET PROCEDE DE DETECTION D'UNE SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DERIVEE DE L'ORIGINE DE REPLICATION DE pBR322 - Google Patents

FRAGMENT NUCLEOTIDIQUE, SONDE, AMORCE, REACTIF ET PROCEDE DE DETECTION D'UNE SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DERIVEE DE L'ORIGINE DE REPLICATION DE pBR322

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Publication number
EP1159452A1
EP1159452A1 EP00909424A EP00909424A EP1159452A1 EP 1159452 A1 EP1159452 A1 EP 1159452A1 EP 00909424 A EP00909424 A EP 00909424A EP 00909424 A EP00909424 A EP 00909424A EP 1159452 A1 EP1159452 A1 EP 1159452A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
sequence
nucleotide
fragment
probe
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00909424A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Didier Lamy
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Transgene SA
Original Assignee
Transgene SA
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Publication date
Application filed by Transgene SA filed Critical Transgene SA
Publication of EP1159452A1 publication Critical patent/EP1159452A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to the detection, using nucleotide probes, of nucleotide sequences derived from the origin of replication of the vector pBR322, present in gene therapy vectors.
  • Gene therapy is defined as the transfer of genetic information of therapeutic interest into a host cell or organism.
  • the first protocol applied to humans was initiated in the United States in September 1 990 on a genetically immunodeficient patient due to a mutation affecting the gene coding for Adenine Deaminase (ADA). It was a question of correcting or replacing the defective gene whose dysfunction is at the origin of a genetic disease by a functional gene. The relative success of this first experiment encouraged the development of this technology which has since been extended to the treatment of other diseases, both genetic and acquired (cancers, infectious diseases like AIDS ...) with the aim of delivering in situ therapeutic genes. Most strategies use vectors to convey the therapeutic gene to its cell target.
  • the aim of the present invention is to provide a reliable, sensitive detection test applicable to a large number of vectors used in gene therapy protocols.
  • Plasmid pBR322 (GenBank Accession Number 27-4902-01), derived from the wild-type plasmid ColE1, is commonly used as starting material for the preparation of many gene therapy vectors.
  • PBR322 is well characterized and has more than thirty unique restriction sites, which makes it particularly advantageous in the design of new vectors [F. Bolivar et al, Gene 2, 95 (1,977) and N. Watson, Gene, 70, 399 (1,988)].
  • the pBR322 region comprising its origin of replication has served as the basis for the construction of numerous gene therapy vectors.
  • a tool and a method for detecting a nucleotide sequence derived from the origin of replication of said vector applicable to any vector derived from pBR322.
  • a first object of the invention is a single-stranded nucleotide fragment comprising a sequence of at least twelve contiguous nucleotide motifs capable of hybridizing, under conditions of high stringency, to the sequence defined by SEQ ID NO: 1 or to its complementary sequence.
  • said sequence comprises at least twelve contiguous nucleotide motifs of a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 and its complement.
  • such a fragment preferably constitutes a probe.
  • sequence SEQ ID NO: 1 described at the end of the description in the sequence list corresponds to the complementary DNA sequence starting at nucleotide 2140 and ending at nucleotide 3145 of the sequence of the plasmid available in databases (GenBank, www .ncbi.nlm.nih.gov /) under the access number J01 749, and SEQ ID NO: 2 corresponds to that of the plasmid ColE1, for the same region (access number J01 566 in the same bank).
  • vector derived from pBR322 is intended to denote the constructs of recombinant nucleic acid of which at least the origin of replication is derived from pBR322.
  • a vector will consist of a plasmid, it being moreover understood that said vector may also comprise nucleic sequences heterologous to pBR322 and in particular nucleic sequences or constructs of nucleic acids of therapeutic interest.
  • the gene of therapeutic interest codes for a
  • Antisense RNA a ribozyme, or even a polypeptide of interest. It can come from a eukaryotic organism, a prokaryote from a parasite or a virus. It can be isolated by any conventional technique in the field of art (by cloning, PCR, chemical synthesis, etc.). It can be of genomic type (comprising all or part of all the introns), of complementary DNA type (cDNA, devoid of intron) or of mixed type (minigene). Furthermore, the polypeptide for which it codes can be (i) intracellular, (ii) incorporated into the membrane of the host cell or (iii) secreted. It may be a polypeptide as found in nature (native), a portion of it (truncated), a mutant having in particular biological properties improved or modified or of a chimeric polypeptide originating from the fusion of sequences of various origins.
  • chemokines MIP-1 a, MIP-1 b, RANTES, DC-CK1, MDC, MCP1 (monocyte chemoattraction protein), IP10, etc.
  • cytokines interferon a, b or g, interleukin (IL), in particular IL-2, IL-6, IL-10 or even IL-1 2, colony stimulating factor (GM-CSF , C-CSF, M-CSF)
  • cytokines interferon a, b or g, interleukin (IL), in particular IL-2, IL-6, IL-10 or even IL-1 2, colony stimulating factor (GM-CSF , C-CSF, M-CSF)
  • cellular receptors especially recognized by the HIV virus
  • receptor ligands receptor ligands
  • coagulation factors Factor VIII, Factor IX, thrombin, protein C
  • factors growth factors proangiogenic factors
  • FGF for Fibroblast Growth Factor
  • VEGF for Vascular Endotheli
  • a functional copy of the defective gene will be used, for example a gene coding for factor VIII or IX in the context of hemophilia A or B, dystrophin (or minidystrophin) in the framework of Duchenne and Becker's myopathies, insulin in the context of diabetes, CFTR protein (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) in the context of cystic fibrosis.
  • factor VIII or IX in the context of hemophilia A or B
  • dystrophin or minidystrophin
  • CFTR protein Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator
  • TK-HSV-1 thymidine kinase of virus simplex virus l herpes 1
  • ricin ricin
  • cholera toxin diphtheria
  • an immunoprotective polypeptide for example a CD4-immunoglobulin IgG hybrid; Capon et al., 1 989, Nature 337, 525-531; Byrn et al., 1 990, Nature 344, 667-670
  • an immunotoxin for example fusion of the antibody 2F5 or of the immunoadhesin CD4-2F5 to angiogenin; Kurachi et al., 1 985, Biochemistry 24, 5494-5499
  • a trans-dominant variant for example fusion of the antibody 2F5 or of the immunoadhesin CD4-2F5 to angiogenin
  • said vectors or nucleic acid construct usable in gene therapy can be in their naked form (Wolff et al., 1 990, Science 2, pages 1 465-1 468.), associated with liposomes, cationic lipids, cationic polymers, peptides, polypeptides.
  • the literature relating to vectors usable in gene therapy provides a large number of examples of such vectors (see for example Robbins et al, 1 988, Tibtech, 1 6, 34-40 and Rolland, 1 998, Therapeutic Drug Carrier Systems, 1 5, 143-1 98).
  • nucleotide sequence means a linear or circular, single-stranded or double-stranded DNA sequence
  • a "nucleotide fragment” and an “oligonucleotide” are two synonymous terms designating a chain of motifs nucleotides characterized by the informational sequence of natural (or possibly modified) nucleic acids and capable of hybridizing, like natural nucleic acids, with a complementary or substantially complementary nucleotide fragment, under predetermined conditions; the chain may contain nucleotide units with a structure different from that of natural nucleic acids; a nucleotide fragment (or oligonucleotide) generally contains at least 12 nucleotide motifs and can be obtained from a natural nucleic acid molecule and / or by genetic recombination and / or by chemical synthesis;
  • a nucleotide motif is derived from a monomer which may be a natural nucleotide of nucleic acid, the constituent elements of which are a sugar, a phosphate group and a nitrogenous base; in DNA the sugar is deoxy-2-ribose, in RNA the sugar is ribose; depending on whether it is DNA or RNA, the nitrogen base is chosen from adenine, guanine, uracil, cytosine, thymine; or the monomer is a nucleotide modified in at least one of the three constituent elements; for example, the modification may take place, either at the base level, with modified bases such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6 -purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base capable of hybridization, either at the sugar level, for example the replacement of at least one deoxyribose with a poly
  • information sequence means any ordered sequence of nucleotide type patterns, the chemical nature and order in a reference direction constitute information analogous to that given by the sequence of natural nucleic acids;
  • hybridization means the process during which, under appropriate conditions, two nucleotide fragments having sufficiently complementary sequences are capable of associating by stable and specific hydrogen bonds, to form a double strand; the hybridization conditions are determined by "stringency", that is to say the rigor of the operating conditions; hybridization is all the more more specific than it is performed at higher stringency; the stringency is a function in particular of the base composition of a probe / target duplex, as well as by the degree of mismatch between two nucleic acids; the stringency can also be a function of the parameters of the hybridization reaction, such as the concentration and the type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and the concentration of denaturing agents and / or the temperature of hybridization; the stringency of the conditions under which a hybridization reaction must be carried out depends in particular on the probes used; all these data are well known and the appropriate conditions can possibly be determined in each case by routine experiments; in general, depending on the length of the probes used, the conditions of high string
  • a “probe” is a nucleotide fragment comprising for example from 1 2 to 1 00 nucleotide units, in particular from 1 2 to 35 nucleotide units, having a specificity of hybridization under determined conditions to form a hybridization complex with an acid target nucleic acid comprising, in the present case, a nucleotide sequence derived from the origin of replication of the vector pBR322; a probe can in particular be used for diagnostic purposes, in the form in particular of a capture or detection probe;
  • a “capture probe” is immobilized or immobilizable on a solid support by any suitable means, for example by covalence, by adsorption, or by direct synthesis on a solid support; the latter is presented in any suitable form such as tube, cone, well, microtiter plate, sheet, soluble polymer; it consists of a natural, synthetic material, chemically modified or not and is, according to the technique chosen, chosen from polystyrenes, styrene-butadiene copolymers, styrene-butadiene copolymers in admixture with polystyrenes, polypropylenes, polycarbonates , polystyrene-acrylonitrile copolymers, styrene-methylmethacrylate copolymers methyl, among nylon and natural synthetic fibers, among polysaccharides and cellulose derivatives;
  • a “detection probe” can be marked by means of a marker chosen for example from radioactive isotopes, enzymes, in particular enzymes capable of acting on a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate (in particular a peroxidase or a phosphatase alkaline), chromophoric chemicals, chromogenic, fluorigenic or luminescent compounds, nucleotide base analogs, and ligands such as biotin;
  • a "primer” is a probe comprising for example from 1 2 to 1 00 nucleotide units and having a specificity of hybridization under conditions determined for the initiation of an enzymatic polymerization, for example in an amplification technique.
  • the probes according to the invention are used for diagnostic purposes, in the search for the presence or absence of a target nucleotide sequence in a sample, according to all the known hybridization techniques and in particular the point deposition techniques on filter, say “DOT-BLOT” (MANIATIS et al, Moiecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1 982), DNA transfer techniques called “SOUTHERN BLOT” [SOUTHERN. E.M., J. Mol.
  • the sandwich technique is advantageously used, with at least one capture probe and / or at least one detection probe; in the case where the two types of probes are used, at least one of said probes (generally the detection probe) is capable of hybridizing with a region of the target which is specific for the sought sequence, it being understood that the capture probe and the detection probe must have nucleotide sequences at least partially different so that said probes are capable of hybridizing with two different regions of the target nucleic acid.
  • the main stages of the so-called “sandwich” technique consist first of immobilizing a capture probe on a support, in particular by passive or covalent adsorption, bringing the immobilized probe (s) into contact with a sample, optionally pretreated, capable of containing at least one nucleotide sequence to be detected, called the target sequence, under conditions allowing hybridization of the or probes with a target sequence complementary to said probe (s), and detecting the hybridization complex formed therebetween.
  • the detection of the complex is carried out by bringing it into contact with a detection probe, labeled with a labeling agent, then direct or indirect detection in particular by revealing the labeling agent.
  • the detection probe can of course be present from the first step of the “sandwich” protocol.
  • the detection probe is not marked.
  • the detection of the target probe / nucleic acid complex can be achieved by the use of specific detection means for nucleic acids in their double-stranded form.
  • specific detection means for nucleic acids for nucleic acids in their double-stranded form.
  • a fragment of the invention comprises at least twelve nucleotide motifs capable of hybridizing to a region of SEQID NO: 1 or of its complement, under conditions of high stringency defined above.
  • Excluded from the invention are the fragments whose sequence is chosen from the sequence of the plasmid pBR322 available in GenBank under the access number J01 749 and SEQ ID NO: 44 to 47.
  • a preferred fragment of the invention comprises, or consists of, at least twelve contiguous nucleotide motifs belonging to SEQ ID NO: 1, and more advantageously still belonging to a sequence chosen from SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 43 and the complementary ones from SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 43.
  • a second object of the invention is a nucleotide probe for the capture and / or detection of a gene therapy vector or of degradation products of such a vector, and more particularly of a nucleotide sequence derived from the origin of replication of pBR322, which comprises or consists of a single-stranded nucleotide fragment comprising a sequence of at least twelve contiguous nucleotide motifs capable of hybridizing, under conditions of high stringency, to SEQ ID NO: 1 or its complement, and preferably in a fragment comprising or consisting of a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 43, and their complement.
  • a probe for the specific detection of a said nucleotide sequence is advantageously chosen from SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 43 and the complementary ones from SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 43.
  • capture probes have been defined according to the invention which preferably comprise or consist of a sequence chosen from SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 22 and the complementary ones of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 22, and the detection probes which preferably comprise or consist of a sequence chosen from SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 43 and the complementary ones of SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 43.
  • Another object of the invention is a primer for the enzymatic amplification, for example according to the principle of PCR, of at least one nucleotide sequence derived from the origin of replication of pBR322, characterized in that it comprises or it consists of a single-stranded nucleotide fragment comprising a sequence of at least twelve contiguous nucleotide motifs capable of hybridizing, under conditions of high stringency, to SEQ ID NO: 1 or to its complement, and preferably, a fragment comprising or consisting of a sequence chosen from SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 43, and their complementary.
  • it comprises or consists of a sequence chosen from SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 43 and the complementary ones from SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 43.
  • the invention also relates to a reagent for detecting and / or identifying and / or quantifying a nucleotide sequence derived from the origin of replication of pBR322 or a vector and / or a vector fragment comprising such a nucleotide sequence, comprising at least one probe. capture and at least one detection probe as defined above, and optionally at least one primer of the invention.
  • Another subject of the invention is a method for detecting and / or identifying and / or quantifying a nucleotide sequence derived from the origin of replication of pBR322 or a vector and / or a vector fragment comprising such a nucleotide sequence, in a sample biological, capable of containing at least one said nucleotide sequence. It includes the steps of:
  • the detection method is advantageously a technique
  • said sample is brought into contact with a first probe, namely a capture probe of the invention, and a second probe, namely a detection probe of the invention. It advantageously comprises a preliminary step of amplification of said nucleotide sequence, which is preferably carried out by bringing the sample into contact with a primer described above.
  • Step (b) can be carried out by means of an antibody, optionally coupled to a marker agent, directed against said hybridization complex.
  • the invention also relates to the use of a probe and / or a primer previously described, for determining the presence or absence of a nucleotide sequence derived from the origin of replication of pBR322 or a vector and / or a vector fragment comprising such a nucleotide sequence in a biological sample.
  • An appropriate biological sample is chosen in particular from a sample, of the fluid type (such as blood, urine), tissue or tissue fragment, mucus, organ or organ fragment, or culture supernatant obtained using one of the aforementioned direct debits.
  • such a biological sample comes from a patient previously treated by a gene therapy protocol using a vector as defined according to the present invention.
  • a sample consists of a blood sample but it is preferred in the context of the present invention to take samples of pulmonary or muscular origin. More specifically, such a sample is taken from the site of administration of the vector during the implementation of the gene therapy protocol.
  • the use according to the invention can also relate to the study of the dissemination of a vector derived from pBR322, in particular in the patient's organism, in the environment or even in biological products originating from a patient treated with genetical therapy.
  • the use according to the invention will make it possible to reliably determine whether the biological material donated by the patient contains or not a vector. derived from pBR322.
  • the use according to the invention thus responds to the ever increasing need for security when donating biological material.
  • GMOs genetically modified organisms
  • the invention is illustrated by the following example of detection of a vector derived from pBR322 by the “sandwich” technique, after amplification.
  • 293 cells are transfected with the plasmid pCH 1 04 (Hall et al., J. of Molecular and Applied Genetics, 1 983, 2, 1 01 -1 09) whose origin of replication is derived from pBR322 using the Calcium Phosphate Transfection System kit from GIBCO-BRL following the manufacturer's instructions.
  • the plamid DNA is extracted from the cells by the HIRT protocol, in which the cells are lysed with the following buffer: 24 ⁇ l of SDS 1 0%
  • Phenol / chloroform extraction is then carried out followed by precipitation with 100% ethanol. After centrifugation, the plasmid DNA pellet is taken up in an RB buffer. • PCR amplification
  • the primers used for the amplification reaction include the following sequences:
  • the amplification reaction is carried out under the conditions detailed below.
  • the total volume of the reaction is 1 00 ⁇ l. It comprises a 50 mM Tris-HCI buffer, pH 8.5, containing 4 mM of MgCl 2 , 1,00 ⁇ g / ml of BSA (bovine serum albumin), 1 ⁇ M of each primer, 200 ⁇ M of each dNTP and 1 U of Taq polymerase.
  • the reaction medium is then subjected to a first series of 5 cycles then to a second series of 30 amplification cycles.
  • the DNA is first denatured by incubating the samples at 94 ° C for 10 seconds, then at 55 ° C for 10 seconds, so that the primers can pair with the template DNA, and finally at 72 ° C for 30 seconds to allow extension of the primers.
  • the cycles are as follows: 94 ° C for 10 seconds, then 60 ° C for 10 seconds and 72 ° C for 30 seconds.
  • the capture and detection probes are chosen so as to be complementary to two non-overlapping regions in the amplified DNA nucleotide sequence.
  • the capture probe chosen is SEQ ID: 10 and the detection probe SEQ ID NO: 32
  • the latter is linked to an enzymatic peroxidase group which will make it possible to demonstrate the formation of the hybridization complexes. This marking is carried out according to the procedure described in PCR protocols: A guide to methods and application; Press Academy (1,990), 1 5, p451 3-4534.
  • the enzymatic activity is revealed by colorimetry.
  • the capture probe is fixed to the walls of the wells of the microplate. This can be done by adsorption (Cook et al, NAR, 1 6, 4077-4095, 1 988) or by covalent coupling (Rasmussen, et al, 1 991, Analytical Biochemistry, 1 98, 1 38-142).
  • the amplification reaction product is denatured in an NaOH / EDTA solution, then introduced by means of a hybridization buffer solution into the wells of the microplate at the same time as the detection probe.
  • a hybridization buffer solution 100 mM Tris, 3M NaCl, 1% Tween 20, pH 7.4
  • the peroxidase activity linked to the detection probe is detected by colorimetry. This detection is carried out using a solution of trisodium citrate and orthophenylenediamine (OPD).
  • OPD orthophenylenediamine

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Abstract

L'invention concerne un fragment nucléotidique monocaténaire comprenant une séquence d'au moins douze motifs nucléotidiques contigus susceptibles de s'hybrider, dans des conditions de forte stringence, à SEQ ID NO :1 ou à son complémentaire. Elle concerne aussi les utilisations d'un tel fragment comme sonde, amorce, dans un réactif et dans un procédé de détection d'une séquence nucléotidique dérivée de l'origine de réplication de pBR322, dans un échantillon biologique.

Description

FRAGMENT NUCLEOTIDIQUE, SONDE, AMORCE, REACTIF ET PROCEDE
DE DETECTION D'UNE SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DERIVEE DE
L'ORIGINE DE REPLICATION DE pBR322
La présente invention concerne la détection, à l'aide de sonde nucléotidiques, de séquences nucléotidiques dérivées de l'origine de replication du vecteur pBR322, présentes dans des vecteurs de thérapie génique.
La thérapie génique se définit comme le transfert d'information génétique d'intérêt thérapeutique dans une cellule ou un organisme hôte. Le premier protocole appliqué à l'homme a été initié aux Etats Unis en septembre 1 990 sur un patient génétiquement immunodéficient en raison d'une mutation affectant le gène codant pour l'Adénine Désaminase (ADA). Il s'agissait de corriger ou remplacer le gène défectueux dont le dysfonctionnement est à l'origine d'une maladie génétique par un gène fonctionnel. Le succès relatif de cette première expérimentation a encouragé le développement de cette technologie qui a été depuis étendue au traitement d'autres maladies aussi bien génétiques qu'acquises (cancers, maladies infectieuses comme le SIDA...) dans le but de délivrer in situ des gènes thérapeutiques. La plupart des stratégies utilisent des vecteurs pour véhiculer le gène thérapeutique vers sa cible cellulaire. De nombreux vecteurs tant viraux que synthétiques ont été développés au cours de ces dernières années et ont fait l'objet de nombreuses publications accessibles à l'homme du métier (voir par exemple Robbins et al, 1 988, Tibtech, 1 6, 34- 40 et Rolland, 1 998, Therapeutic Drug Carrier Systems, 1 5, 143-1 98) .
Dans le cadre du suivi d'une thérapie génique chez un patient, à qui un médicament sous forme de vecteur porteur d'un gène d'intérêt thérapeutique a été administré, il est important de surveiller différents paramètres et en particulier les suivants : la présence ou l'absence du vecteur voire de ses produits de dégradation et sa localisation.
La traçabilité du vecteur présente en effet de nombreux avantages :
- cliniques car la mise en évidence de la disparition du vecteur peut conduire le médecin à ajuster le traitement et à prescrire une nouvelle administration dudit vecteur, - réglementaires et éthiques car elle permet le suivi du devenir in vivo du vecteur médicament.
Il convient donc de disposer de tests de détection de la présence du vecteur administré, ou tout au moins de fragments de celui-ci. Actuellement, des tests de diagnostic sont pratiqués par certains laboratoires associés au lieu de traitement et par des sociétés de service en biotechnologie, selon des protocoles qui ne sont pas normalisés, ne sont pas spécifiques, ni optimisés, qui ne répondent pas aux conditions de bonne pratique de laboratoire et qui conduisent à des résultats peu reproductibles qui ne permettent pas leur utilisation systématique dans le cadre du suivi d'un traitement par thérapie génique ou plus particulièrement dans les cas de contrôles de dissémination in vivo et ex vivo de vecteurs ou dans les cas d'études précliniques et cliniques.
Pour satisfaire le besoin d'un test ne présentant pas les inconvénients précités, le but de la présente invention est de fournir un test de détection fiable, sensible, applicable à un grand nombre de vecteurs utilisés dans des protocoles de thérapie génique.
Le plasmide pBR322 (Numéro d'Accession à GenBank 27-4902-01 ), dérivé du plasmide sauvage ColE1 , est couramment utilisé comme matériel de départ pour la préparation de nombreux vecteurs de thérapie génique. PBR322 est bien caractérisé et possède plus de trente sites de restriction unique, ce qui le rend particulièrement avantageux dans la conception de nouveaux vecteurs [F. Bolivar et al, Gène 2, 95 (1 977) et N. Watson, Gène, 70, 399 (1 988)] . En particulier, la région de pBR322 comprenant son origine de replication, a servi de base à la construction de nombreux vecteurs de thérapie génique.
Selon l'invention on apporte un outil et un procédé de détection d'une séquence nucléotidique dérivée de l'origine de replication dudit vecteur, applicable à tout vecteur dérivé de pBR322.
Le plasmide ColE1 , dont dérive pBR322, étant omniprésent chez l'homme, il est en outre essentiel de pouvoir distinguer la forme modifiée de l'origine de replication, caractéristique de la présence d'un vecteur comprenant l'origine de replication de pBR322, de la forme sauvage de l'origine de replication, pour obtenir un test spécifique. La spécificité est un autre avantage du test proposé selon l'invention. Ainsi, un premier objet de l'invention est un fragment nucléotidique monocaténaire comprenant une séquence d'au moins douze motifs nucléotidiques contigus susceptibles de s'hybrider, dans des conditions de forte stringence, à la séquence définie par SEQ ID NO : 1 ou à sa séquence complémentaire. De préférence, ladite séquence comprend au moins douze motifs nucléotidiques contigus d'une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1 et son complémentaire. Dans le cadre de la présente invention, un tel fragment constitue de façon préférée une sonde.
La séquence SEQ ID NO : 1 décrite en fin de description dans la liste des séquences, correspond à la séquence d'ADN complémentaire commençant au nucleotide 2140 et terminant au nucleotide 3145 de la séquence du plasmide disponible dans les banques de données (GenBank, www.ncbi.nlm.nih.gov/) sous le numéro d'accès J01 749, et SEQ ID NO :2 correspond à celle du plasmide ColE1 , pour la même région (numéro d'accès J01 566 dans la même banque).
Avant d'exposer plus en détail l'invention, différents termes utilisés dans la description et les revendications sont définis ci-après :
- par « vecteur dérivé de pBR322 », on entend désigner les constructions d'acide nucléique recombinant dont au moins l'origine de replication est issue de pBR322. Selon un cas particulier de l'invention, un tel vecteur consistera en un plasmide, étant par ailleurs entendu que ledit vecteur peut en outre comporter des séquences nucléiques hétérologues à pBR322 et notamment des séquences nucléiques ou constructions d'acides nucléiques présentant un intérêt thérapeutique. Avantageusement, le gène d'intérêt thérapeutique code pour un
ARN anti-sens, un ribozyme, ou encore un polypeptide d'intérêt. Il peut être issu d'un organisme eucaryote, d'un procaryote d'un parasite ou d'un virus. Il peut être isolé par toute technique conventionnelle dans le domaine de l'art (par clonage, PCR, synthèse chimique....). Il peut être de type génomique (comportant tout ou partie de l'ensemble des introns), de type ADN complémentaire (ADNc, dépourvu d'intron) ou de type mixte (minigène). Par ailleurs, le polypeptide pour lequel il code peut être (i) intracellulaire, (ii) incorporé dans la membrane de la cellule hôte ou (iii) sécrété. Il peut s'agir d'un polypeptide tel que trouvé dans la nature (natif), d'une portion de celui- ci (tronqué), d'un mutant présentant notamment des propriétés biologiques améliorées ou modifiées ou encore d'un polypeptide chimère provenant de la fusion de séquences d'origines diverses.
Parmi les polypeptides d'intérêt utilisables, on peut citer plus particulièrement les chémokines (MIP-1 a, MIP-1 b, RANTES, DC-CK1 , MDC, MCP1 (protéine de chémoattraction des monocytes), IP10....), les cytokines (interféron a, b ou g, interleukine (IL), notamment l'IL-2, l'IL-6, l'IL-10 ou encore l'IL-1 2, facteur stimulateur de colonies (GM-CSF, C-CSF, M-CSF)...), les récepteurs cellulaires (notamment reconnus par le virus HIV), les ligands de récepteur, les facteurs de coagulation (Facteur VIII, Facteur IX, thrombine, protéine C), les facteurs de croissance, les facteurs proangiogéniques (FGF pour Fibroblast Growth Factor, VEGF pour Vascular Endothelial Growth Factor, SH/HGF pour scatter factor/Hepatocyte growth factor, TGF pour transforming growth factor, TNF pour facteur nécrosant des tumeurs, angiopoïétine), les enzymes (uréase, rénine, métalloprotéinase, nitric oxide synthétase NOS, SOD, catalase, lécithine cholestérol acyl transférase LCAT...), les inhibiteurs d'enzyme (a1 -antitrypsine, antithrombine III, inhibiteur de protéase virale, PAI-1 pour plasminogen activator inhibitor), les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I ou II ou polypeptides agissant sur l'expression des gènes correspondants, les antigènes (ou peptides antigéniques) capables de générer une réponse immunitaire, les polypeptides capables d'inhiber une infection virale, bactérienne ou parasitaire ou son développement, les polypeptides à effet antitumoral (produits d'expression des gènes suppresseurs de tumeurs, antigènes associés aux tumeurs, ...) les polypeptides agissant positivement ou négativement sur l'apoptose (Bax, Bcl2, BclX...), les agents cytostatiques (p21 , p 1 6, Rb), les immunoglobulines en totalité ou en partie (Fab, ScFv...), les toxines, les immunotoxines, les apolipoprotéines (ApoAl, ApoAIV, ApoE...), les produits cytotoxiques, les facteurs anti-angiogéniques (angiostatine, endostatine, PF-4...), les marqueurs (b-galactosidase, luciférase, green fluorescent protein) ou tout autre polypeptide ayant un effet thérapeutique pour l'affection ciblée.
Plus précisément, dans le but de traiter un dysfonctionnement héréditaire, on utilisera une copie fonctionnelle du gène défectueux, par exemple un gène codant pour le facteur VIII ou IX dans le cadre de l'hémophilie A ou B, la dystrophine (ou minidystrophine) dans le cadre des myopathies de Duchenne et Becker, l'insuline dans le cadre du diabète, la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) dans le cadre de la mucoviscidose. S'agissant d'inhiber l'initiation ou la progression de tumeurs ou cancers, on mettra de préférence en oeuvre un gène d'intérêt codant pour un ARN anti-sens, un ribozyme, un produit cytotoxique (thymidine kinase de virus simplex de l'herpès 1 (TK-HSV-1 ), ricine, toxine cholérique, diphtérique, produit des gènes de levure FCY1 et FUR1 codant pour l'uracyle phosphoribosyl transférase et la cytosine désaminase ), une immunoglobuline, un inhibiteur de la division cellulaire ou des signaux de transduction, un produit d'expression d'un gène suppresseur de tumeur (p53, Rb, p73, DCC....), un polypeptide stimulateur du système immunitaire, un antigène associé à une tumeur (MUC-1 , BRCA- 1 , antigènes précoces ou tardifs d'un virus à papillome), éventuellement en combinaison avec un gène de cytokine. Enfin, dans le cadre d'une thérapie anti-HIV, on peut avoir recours à un gène codant pour un polypeptide immunoprotecteur, un épitope antigénique, un anticorps (2F5; Buchacher et al., 1 992, Vaccines 92, 1 91 -1 95), le domaine extracellulaire du récepteur CD4 (sCD4 ; Traunecker et al., 1 988, Nature 331 , 84-86) une immunoadhésine (par exemple un hybride CD4-immunoglobuline IgG ; Capon et al., 1 989, Nature 337, 525-531 ; Byrn et al., 1 990, Nature 344, 667- 670), une immunotoxine (par exemple fusion de l'anticorps 2F5 ou de l'immunoadhésine CD4-2F5 à l'angiogénine ; Kurachi et al., 1 985, Biochemistry 24, 5494-5499), un variant trans-dominant (EP 061 4980, WO95/1 6780), un produit cytotoxique tel que l'un de ceux mentionné ci- dessus ou encore un IFNα ou β. Selon l'invention, lesdits vecteurs ou construction d'acide nucléique utilisables en thérapie génique, peuvent être sous leur forme nue (Wolff et al., 1 990, Science 2, page 1 465-1 468.), associés à des liposomes, lipides cationiques, polymères cationiques, peptides, polypeptides. La littérature relative aux vecteurs utilisables en thérapie génique fournit un nombre important d'exemples de tels vecteurs (voir par exemple Robbins et al, 1 988, Tibtech, 1 6, 34-40 et Rolland, 1 998, Therapeutic Drug Carrier Systems, 1 5, 143-1 98) .
- par « séquence nucléotidique », on entend une séquence d'ADN monocaténaire ou bicaténaire, linéaire ou circulaire ; - un « fragment nucléotidique », et un « oligonucléotide » sont deux termes synonymes désignant un enchaînement de motifs nucléotidiques caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels (ou éventuellement modifiés) et susceptibles de s'hybrider, comme les acides nucléiques naturels, avec un fragment nucléotidique complémentaire ou sensiblement complémentaire, dans des conditions prédéterminées ; l'enchaînement peut contenir des motifs nucléotidiques de structure différente de celle des acides nucléiques naturels ; un fragment nucléotidique (ou oligonucléotide) contient généralement au moins 1 2 motifs nucléotidiques et peut être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique ;
- un motif nucléotidique est dérivé d'un monomère qui peut être un nucleotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agit d'ADN ou d'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adenine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucleotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir, soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide [P.E. Nielsen et al, Science, 254, 1 497-1 500 ( 1 991 )], soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates ;
- par « séquence informationnelle », on entend toute suite ordonnée de motifs de type nucléotidique, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence constituent une information analogue à celle donnée par la séquence des acides nucléiques naturels ;
- par « hybridation », on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de s'associer par des liaisons hydrogène stables et spécifiques, pour former un double brin ; les conditions d'hybridation sont déterminées par la "stringence", c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires ; l'hybridation est d 'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence ; la stringence est fonction notamment de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques ; la stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction d'hybridation, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation ; la stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépend notamment des sondes utilisées ; toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent éventuellement être déterminées dans chaque cas par des expériences de routine ; en général, selon la longueur des sondes utilisées, les conditions de forte stringence sont les suivantes : la réaction d'hybridation est effectuée à une température comprise entre environ 20 et 65 °C, en particulier entre 35 et 65 °C, dans une solution saline à une concentration d'environ 0,3 à 1 M ; en particulier, dans les conditions d'hybridation selon la présente invention, on choisit une température de 37°C ± 1 °C, dans une solution saline PBS 3x (NaCI 0,45 M ; phosphate de sodium 0, 1 5 M) ;
- une « sonde » est un fragment nucléotidique comprenant par exemple de 1 2 à 1 00 motifs nucléotidiques, notamment de 1 2 à 35 motifs nucléotidiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible comprenant , dans le cas présent, une séquence nucléotidique dérivée de l'origine de replication du vecteur pBR322 ; une sonde peut en particulier être utilisée à des fins de diagnostic, sous la forme notamment d'une sonde de capture ou de détection ;
- une « sonde de capture » est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, par exemple par covalence, par adsorption, ou par synthèse directe sur un support solide ; ce dernier se présente sous toute forme appropriée telle que tube, cône, puits, plaque de microtitration, feuille, polymère soluble ; il est constitué par un matériau naturel, de synthèse, modifié chimiquement ou non et est, selon la technique retenue, choisi parmi les polystyrènes, les copolymères styrène- butadiène, les copolymères styrène-butadiène en mélange avec des polystyrènes, des polypropylènes, des polycarbonates, des copolymères polystyrène-acrylonitrile, des copolymères styrène-méthylméthacrylate de méthyle, parmi les fibres synthétiques Nylon et naturelles, parmi les polysaccharides et les dérivés de la cellulose ;
- une « sonde de détection » peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi par exemple parmi les isotopes radioactifs, des enzymes, en particulier des enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou une phosphatase alcaline), des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et des ligands tels que la biotine ; - une « amorce » est une sonde comprenant par exemple de 1 2 à 1 00 motifs nucléotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification.
Les sondes selon l'invention sont utilisées à des fins de diagnostic, dans la recherche de la présence ou de l'absence d'une séquence nucléotidique cible dans un échantillon, selon toutes les techniques d'hybridation connues et notamment les techniques de dépôt ponctuel sur filtre, dites « DOT-BLOT » (MANIATIS et al, Moiecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1 982), les techniques de transfert d'ADN dites "SOUTHERN BLOT" [SOUTHERN. E.M., J . Mol. Biol., 98, 503 (1 975)], ou les techniques dites "sandwich" [DUNN A.R., HASSEL J.A., Cell, J_2, 23 (1 977)] ; on utilise avantageusement la technique sandwich, avec au moins une sonde de capture et/ou au moins une sonde de détection ; dans le cas où les deux types de sondes sont mises en œuvre, l'une au moins desdites sondes (généralement la sonde de détection) est capable de s'hybrider avec une région de la cible qui est spécifique de la séquence recherchée, étant entendu que la sonde de capture et la sonde de détection doivent avoir des séquences nucléotidiques au moins partiellement différentes de façon à ce que lesdites sondes soient capables de s'hybrider avec deux régions différentes de l'acide nucléique cible.
Les étapes principales de la technique dite « sandwich » consistent d'abord à immobiliser une sonde de capture sur un support, notamment par adsorption passive ou covalence, à mettre en contact la ou les sonde(s) immobilisée(s) avec un échantillon, éventuellement prétraité, susceptible de contenir au moins une séquence nucléotidique à détecter, dite séquence cible, dans des conditions permettant l'hybridation de la ou des sonde(s) avec une séquence cible complémentaire de ladite ou desdites sonde(s), et à détecter le complexe d'hybridation formé entre ces dernières. La détection du complexe est effectuée par mise en contact de celui-ci avec une sonde de détection, marquée par un agent marqueur, puis détection directe ou indirecte notamment par révélation de l'agent marqueur. La sonde de détection peut bien entendu être présente dès la première étape du protocole « sandwich ».
Selon un cas particulier de l'invention, la sonde de détection n'est pas marquée. Dans ce cas la détection du complexe sonde/acide nucléique cible peut être réalisé par l'utilisation de moyens de détection spécifiques des acides nucléiques sous leur forme double brin. A cet effet et à titre d'exemple, il est possible d'utiliser des anticorps capables de reconnaître les structures double brin des acides nucléiques (WO-A- 97/32602). Les différents objets de l'invention et leurs variantes préférentielles sont ci-après exposés.
Comme mentionné précédemment, un fragment de l'invention comprend au moins douze motifs nucléotidiques capables de s'hybrider sur une région de SEQID NO : 1 ou de son complémentaire, dans des conditions de forte stringence définies ci-dessus.
Sont exclus de l'invention, les fragments dont la séquence est choisie parmi la séquence du plasmide pBR322 disponible dans GenBank sous le numéro d'accès J01 749 et SEQ ID NO :44 à 47.
Les séquences nucléotidiques dérivées de l'origine de replication de pBR322 étant bien conservées, un fragment préféré de l'invention comprend, ou consiste en, au moins douze motifs nucléotidiques contigus appartenant à SEQ ID NO : 1 , et plus avantageusement encore appartenant à une séquence choisie parmi SEQ ID NO :3 à SEQ ID NO :43 et les complémentaires de SEQ ID NO :3 à SEQ ID NO :43. Un second objet de l'invention est une sonde nucléotidique pour la capture et/ou la détection d'un vecteur de thérapie génique ou de produits de dégradation d'un tel vecteur, et plus particulièrement d'une séquence nucléotidique dérivée de l'origine de replication de pBR322, qui comprend ou qui consiste en un fragment nucléotidique monocaténaire comprenant une séquence d'au moins douze motifs nucléotidiques contigus susceptibles de s'hybrider, dans des conditions de forte stringence, à SEQ ID NO : 1 ou à son complémentaire, et de préférence, en un fragment comprenant ou consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO :3 à SEQ ID NO :43, et leurs complémentaires. Une sonde pour la détection spécifique d'une dite séquence nucléotidique est avantageusement choisie parmi SEQ ID NO :23 à SEQ ID NO :43 et les complémentaires de SEQ ID NO :23 à SEQ ID NO :43.
Pour la mise en œuvre de la technique de détection dite « sandwich » notamment, on a défini selon l'invention des sondes de capture qui de préférence comprennent ou consistent en une séquence choisie parmi SEQ ID NO :3 à SEQ ID NO :22 et les complémentaires de SEQ ID NO :3 à SEQ ID NO :22, et des sonde de détection qui de préférence comprennent ou consistent en une séquence choisie parmi SEQ ID NO :23 à SEQ ID NO :43 et les complémentaires de SEQ ID NO :23 à SEQ ID NO :43. Un autre objet de l'invention est une amorce pour l'amplification enzymatique, par exemple selon le principe de la PCR, d'au moins une séquence nucléotidique dérivée de l'origine de replication de pBR322, caractérisée en ce qu'elle comprend ou elle consiste en un fragment nucléotidique monocaténaire comprenant une séquence d'au moins douze motifs nucléotidiques contigus susceptibles de s'hybrider, dans des conditions de forte stringence, à SEQ ID NO : 1 ou à son complémentaire, et de préférence, en un fragment comprenant ou consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO :3 à SEQ ID NO :43, et leurs complémentaires. En particulier elle comprend ou consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO :23 à SEQ ID NO :43 et les complémentaires de SEQ ID NO :23 à SEQ ID NO :43.
L'invention concerne aussi un réactif pour détecter et/ou identifier et/ou quantifier une séquence nucléotidique dérivée de l'origine de replication de pBR322 ou un vecteur et/ou un fragment de vecteur comprenant une telle séquence nucléotidique, comprenant au moins une sonde de capture et au moins une sonde de détection telles que définies précédemment, et éventuellement au moins une amorce de l'invention.
Un autre objet de l'invention est un procédé pour détecter et/ou identifier et/ou quantifier une séquence nucléotidique dérivée de l'origine de replication de pBR322 ou un vecteur et/ou un fragment de vecteur comprenant une telle séquence nucléotidique, dans un échantillon biologique, susceptible de contenir au moins unedite séquence nucléotidique. Il comprend les étapes consistant :
(a) à mettre ledit échantillon en contact avec au moins une sonde de l'invention, dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation, et
(b) à détecter, par tout moyen approprié, la formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et ladite séquence nucléotidique. Le procédé de détection est avantageusement une technique
« sandwich ». Dans ce cas particulier, ledit échantillon est mis en contact avec une première sonde, à savoir une sonde de capture de l'invention, et une seconde sonde, à savoir une sonde de détection de l'invention. Il comprend favorablement une étape préliminaire d'amplification de ladite séquence nucléotidique, qui est de préférence réalisée par mise en contact de l'échantillon avec une amorce décrite ci-dessus.
L'étape (b) peut être réalisée au moyen d'un anticorps, éventuellement couplé à un agent marqueur, dirigé contre ledit complexe d'hybridation. L'invention concerne aussi l'utilisation d'une sonde et/ou d'une amorce précédemment décrites, pour déterminer la présence ou l'absence d'une séquence nucléotidique dérivée de l'origine de replication de pBR322 ou un vecteur et/ou un fragment de vecteur comprenant une telle séquence nucléotidique dans un échantillon biologique. Un échantillon biologique approprié est notamment choisi parmi un prélèvement, du type fluide (tel que sang, urine), tissu ou fragment de tissu, mucosité, organe ou fragment d'organe, ou surnageant de cultures obtenu à l'aide d'un des prélèvements précités. De façon préférée, un tel échantillon biologique est issu d'un patient préalablement traité par un protocole de thérapie génique mettant en œuvre un vecteur tel que défini selon la présente invention. Selon un cas particulier, un tel échantillon consiste en un prélèvement sanguin mais on préfère dans le cadre de la présente invention prélever des échantillons d'origine pulmonaire ou musculaire. Plus spécifiquement, un tel prélèvement est effectué sur le site d'administration du vecteur lors de la mise en œuvre du protocole de thérapie génique. Mais l'utilisation selon l'invention peut aussi concerner l'étude de la dissémination d'un vecteur dérivé de pBR322, notamment dans l'organisme du patient, dans l'environnement ou encore dans les produits biologiques issus d'un patient traité par thérapie génique. En particulier, lorsqu'un tel patient désirera procéder à un don de son sang ou d'un de ses organes, l'utilisation selon l'invention permettra de déterminer de façon fiable que le matériel biologique donné par le patient contient ou non un vecteur dérivé de pBR322. L'utilisation selon l'invention répond de cette manière au besoin toujours croissant de sécurité lors du don de matériel biologique.
Il est en outre possible d'envisager d'appliquer le procédé de détection de l'invention au domaine de l'agroalimentaire ou de la cosmétique. En effet, ces domaines font de plus en plus souvent appel pour la mise au point de leurs produits à l'utilisation d'organismes génétiquement modifiés (OGM), c'est à dire transformés à l'aide d'un vecteur recombinant. Le procédé de l'invention offre donc un moyen fiable et efficace pour déterminer si un produit alimentaire ou cosmétique a été élaboré à l'aide d'un OGM.
L'invention est illustrée par l'exemple suivant de détection d'un vecteur dérivé de pBR322 par la technique « sandwich », après amplification.
Exemple : Transfection de cellules par le plasmide pCH 104
Des cellules 293 sont transfectée par le plasmide pCH 1 04 (Hall et al., J. of Molecular and Applied Genetics, 1 983, 2, 1 01 -1 09) dont l'origine de replication dérive de pBR322 à l'aide du kit Calcium Phosphate Transfection System de GIBCO-BRL en suivant les indications du fabricant.
• Extraction de l'ADN
L'ADN plamidique est extrait des cellules par le protocole de HIRT, dans lequel les cellules sont lysées avec le tampon suivant : 24 μl de SDS 1 0 %
8 μl d'EDTA 0,5 M
8 μl de protéinase K à 1 0 mg/ml
1 60 μl de TE pH8
On réalise ensuite une extraction au phénol / chloroforme puis une précipitation à l'éthanol 1 00% . Après centrifugation, le culot d'ADN plasmidique est repris dans un tampon RB. • Amplification par PCR
Les amorces utilisées pour la réaction d 'amplification comprennent les séquences suivantes :
SEQ ID NO :26 SEQ ID NO :38
La réaction d 'amplification est réalisée dans les conditions détaillées ci-après. Le volume total de la réaction est de 1 00 μl. Il comprend un tampon 50 mM Tris-HCI pH 8,5, contenant 4 mM de MgCI2, 1 00 μg/ml de BSA (sérum albumine bovine), 1 μM de chaque amorce, 200 μM de chaque dNTP et 1 U de Taq polymerase. Le milieu réactionnel est ensuite soumis à une première série de 5 cycles puis à une deuxième série de 30 cycles d'amplification. Dans la première série, l'ADN est d'abord dénaturé en incubant les échantillons à 94°C pendant 1 0 secondes, puis à 55 °C pendant 1 0 secondes, de manière à ce que les amorces puissent s'apparier à la matrice d'ADN, et enfin à 72°C pendant 30 secondes afin de permettre l'extension des amorces. Dans la seconde série, les cycles sont les suivants : 94°C pendant 1 0 secondes, puis 60°C pendant 1 0 secondes et 72 °C pendant 30 secondes.
• Détection sur microplaque Les sondes de capture et de détection sont choisies de manière à être complémentaires de deux régions non chevauchantes dans la séquence nucléotidique d'ADN amplifiée. La sonde de capture choisie est SEQ ID : 10 et la sonde de détection SEQ ID NO :32 Cette dernière est liée à un groupement enzymatique peroxydase qui va permettre de mettre en évidence la formation des complexes d'hybridation. Ce marquage est réalisé selon la procédure décrite dans PCR protocols : A guide to methods and application ; Académie Press (1 990), 1 5, p451 3-4534. L'activité enzymatique est révélée par colorimétrie.
La sonde de capture est fixée sur les parois des puits de la microplaque. Cette opération peut se faire par adsorption (Cook et al, NAR, 1 6, 4077-4095, 1 988) ou par couplage covalent (Rasmussen, et al, 1 991 , Analytical Biochemistry, 1 98, 1 38-142).
Le produit de la réaction d'amplification est dénaturé dans une solution NaOH / EDTA, puis introduit au moyen d'une solution tampon d'hybridation dans les puits de la microplaque en même temps que la sonde de détection. Après une phase d'incubation (1 heure à 37 °C sous agitation) et une phase de lavage (100 mM Tris, 3M NaCI, 1 % Tween 20, pH 7,4), l'activité peroxydase liée à la sonde de détection est détectée par colorimétrie. Cette détection est réalisée au moyen d'une solution de citrate trisodique et d'orthophénylènediamine (OPD). Après incubation de 30 minutes à l'obscurité, une solution 4N H2SO4 est ajoutée afin de stopper la réaction. La densité optique est ensuite déterminée à 492 nm.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Fragment nucléotidique monocaténaire comprenant une séquence d'au moins douze motifs nucléotidiques contigus susceptibles de s'hybrider, dans des conditions de forte stringence, à SEQ ID NO : 1 ou à son complémentaire, à l'exclusion des fragments dont la séquence est choisie parmi la séquence du plasmide pBR322 disponible dans GenBank sous le numéro d'accès J01 749 et SEQ ID NO :44 à 47.
2. Fragment selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ladite séquence comprend au moins douze motifs nucléotidiques contigus d'une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1 et son complémentaire.
3. Fragment selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite séquence comprend au moins douze motifs nucléotidiques contigus d'une séquence choisie parmi SEQ ID NO :3 à SEQ ID NO :43 et les complémentaires de SEQ ID NO :3 à SEQ ID NO :43.
4. Fragment selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite séquence consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO :3 à SEQ ID NO :43 et les complémentaires de SEQ ID NO :3 à SEQ ID NO :43.
5. Sonde pour la capture et/ou la détection d'une séquence nucléotidique dérivée de l'origine de replication du vecteur pBR322, caractérisée en ce qu'elle comprend ou elle consiste en un fragment nucléotidique monocaténaire comprenant une séquence d'au moins douze motifs nucléotidiques contigus susceptibles de s'hybrider, dans des conditions de forte stringence, à SEQ ID NO : 1 ou à son complémentaire, et de préférence, en un fragment comprenant ou consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO :3 à SEQ ID NO :43, et leurs complémentaires.
6. Sonde pour la capture et/ou la détection d'un vecteur et/ou un fragment de vecteur comprenant une séquence nucléique dérivée de l'origine de replication de pBR322, caractérisée en ce qu'elle comprend ou elle consiste en un fragment nucléotidique monocaténaire comprenant une séquence d'au moins douze motifs nucléotidiques contigus susceptibles de s'hybrider, dans des conditions de forte stringence, à SEQ ID NO : 1 ou à son complémentaire, et de préférence, en un fragment comprenant ou consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO :3 à SEQ ID NO :43, et leurs complémentaires.
7. Sonde selon les revendications 5 et 6, caractérisée en ce qu'elle est une sonde de capture et en ce qu'elle comprend ou consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO :3 à SEQ ID NO :22 et les complémentaires de SEQ ID NO :3 à SEQ ID NO :22.
8. Sonde selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle est immobilisée sur un support solide.
9. Sonde pour la détection spécifique d'une séquence nucléotidique dérivée de l'origine de replication de pBR322 selon la revendication 5 ou d'un vecteur et/ou un fragment de vecteur selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comprend ou consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO :23 à SEQ ID NO :43 et les complémentaires de SEQ ID NO :23 à SEQ ID NO :43.
1 0. Sonde selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle est marquée par un agent marqueur, notamment choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes, en particulier des enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent telle qu'une peroxydase ou une phosphatase alcaline, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques et des ligands tels que la biotine.
1 1 . Amorce pour l'amplification enzymatique d'au moins une séquence nucléotidique dérivée de l'origine de replication de pBR322, caractérisée en ce qu'elle comprend ou consiste en un fragment nucléotidique monocaténaire comprenant une séquence d'au moins douze motifs nucléotidiques contigus susceptibles de s'hybrider, dans des conditions de forte stringence, à SEQ ID NO : 1 ou à son complémentaire, et de préférence, en un fragment comprenant ou consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO :3 à SEQ ID NO :43, et leurs complémentaires.
1 2. Amorce pour l'amplification enzymatique spécifique d'au moins une séquence nucléotidique dérivée de l'origine de replication de pBR322 selon la revendication 1 1 , caractérisée en ce qu'elle comprend ou consiste en une séquence choisie parmi SEQ ID NO :23 à SEQ ID NO :43 et les complémentaires de SEQ ID NO :23 à SEQ ID NO :43
1 3. Réactif pour détecter et/ou identifier et/ou quantifier une séquence nucléotidique dérivée de l'origine de replication de pBR322 ou d'un vecteur et/ou un fragment de vecteur renfermant unedite séquence nucléotidique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde de capture selon la revendication 6 ou 7 et au moins une sonde de détection selon la revendication 9 ou 1 0.
14. Réactif selon la revendication 1 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une amorce selon la revendication 1 1 ou 1 2.
1 5. Procédé pour détecter et/ou identifier et/ou quantifier une séquence nucléotidique dérivée de l'origine de replication de pBR322 ou d'un vecteur et/ou un fragment de vecteur renfermant unedite séquence nucléotidique, dans un échantillon biologique, susceptible de contenir au moins unedite séquence nucléotidique, ou undit vecteur et/ou undit fragment de vecteur caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant :
(a) à mettre ledit échantillon en contact avec au moins une sonde selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, dans des conditions permettant la formation d'un complexe d'hybridation, et
(b) à détecter, par tout moyen approprié, la formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et ladite séquence nucléotidique.
1 6. Procédé selon la revendication 1 5, caractérisé en ce qu'on met en contact ledit échantillon avec au moins une première sonde selon la revendication 6 ou 7, et au moins une seconde sonde selon la revendication 9 ou 10.
1 7. Procédé selon la revendication 1 5 ou 1 6, caractérisé en ce qu'il comprend une étape préliminaire d'amplification de ladite séquence nucléotidique.
1 8. Procédé selon la revendication 1 7, caractérisé en ce qu'on met en contact ledit échantillon avec au moins une amorce selon la revendication 1 1 ou 1 2.
1 9. Procédé selon la revendication 1 5, caractérisé en ce que l'étape (b) est réalisée au moyen d'un anticorps, éventuellement couplé à un agent marqueur, dirigé contre ledit complexe d'hybridation.
20. Utilisation d'une sonde selon l'une quelconque des revendications 5 à1 0 et/ou d'une amorce selon la revendication 1 1 ou 1 2, pour déterminer la présence ou l'absence d'une séquence nucléotidique dérivée de l'origine de replication de pBR322 d'un vecteur et/ou d'un fragment de vecteur comprenant unedite séquence nucléotidique, dans un échantillon biologique.
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