HUT51336A

HUT51336A - Process for construction of aspergillus strains by gene substitution

Info

Publication number: HUT51336A
Application number: HU894197A
Authority: HU
Inventors: Hartingsveldt Wim Van; Den Hondel Cees A Van; Annemarie E Veenstra; Den Berg Johannes A Van
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1988-08-16
Filing date: 1989-08-15
Publication date: 1990-04-28
Also published as: DE68929013D1; IL91309A0; JP2752714B2; DK175196B1; KR900003366A; JPH02174673A; EP0357127B1; DK399889A; DK399889D0; FI893818A0; DE68929013T2; PT91453B; ES2134754T3; PT91453A; AU636572B2; AU4002189A; EP0357127A1; IL91309A; GR3030901T3; FI893818A

Description

A felsorolt termékek esetében kulcskérdés az előállítás gazdaságossága. Ebből a szempontból igen lényeges tényezők a kivánt termék kifejeződésének szintje, a termelő szervezet genetikai stabilitása és a termék elválaszthatósága. Az utóbbi különösen fontos a gyógyszerként vagy élelmiszer-adalékként használt termékek esetében.

A sejtekben termelődő fehérjék vagy visszamaradnak a citoplazmában vagy kiválasztódnak a sejt környezetébe. A különböző szervezetek különböző fehérjéket termelnek és különböző mértékben választják ki azokat; a kiválasztás lehet indukálható is. A legtöbb esetben a kiválasztás előnyökkel is jár, mert a termék lényegében tisztán, az intracelluláris fehérjéktől és sejtmaradványoktól mentesen nyerhető ki a tápközegből. Ilyen esetekben az elválasztást csak a többi kiválasztott fehérjéktől és kis menynyiségű, a sejtek széteséséből származó más fehérjéktől kell megoldani. Emiatt különösen fontos olyan expressziós rendszereket létrehozni, amelyekben a kivánt termék hatékonyan kifejeződik és kiválasztódik a kinyeréshez alkalmas körülmények között.

A fonalas gombák transzformálásával számos szerző foglalkozott (Tilburn és mtsai, Gene 26 (-1983) 205-221 ; John és Pederby, Enzyme Microb. Technoi. 6_ (1984) 386-389 ; Ballance és Turner, Gene 36 (1985) 321-331; Van Hartingsveldt és mtsai, Mól. Gén. Génét. 206 (1987) 71-75; Goosen és mtsai, Curr. Génét. 11 (1987) 499-503, valamint ilyen eljárásokat tartalmaznak az EP-A-0134438 ,

EP-A-0238023 és PCT W086/06097 számú leírások is.

Másrészről számos gombafajt (pl. Aspergillus niger, A. oryzae, Mucor miehei, Trichoderma reesei) használnak széles körben különböző enzimek ipari léptékű előállítására (Strijkert, Leeuwenhoekia 53 (1987) 357-362. Ezen gombafajok alkalmazása enzimkiválasztó képességükön alapszik. Az A. nigert-t és A. oryzae-t használják a legnagyobb mértékben, következésképpen ezen két gombafaj fermentációs tenyésztése a legjobban kidolgozott. Génsebészeti technikákat is alkalmaztak kannapenészeken - Aspergilli - és a transzformánsok uj termékeket produkáltak (Cullen és mtsai, Bio/technology J5 (1987) 369-376; Gwynne és mtsai, Bio/technology _5 (1987) 713-719; Upshall és mtsai, Bio/technology ( 1987) 1301-1304). Ezekben az esetekben az uj fehérjék a gomba eredetileg is termelt fehérjéivel együtt jelentek meg, igy a terméket az utóbbiaktól el kellett választani.

Kannapenészeken - Aspergilli - végzett génhelyettesitésről többek között Miller és mtsai (Mol.Cell Bioi. 5· (1985) 1721) ,

Van Hartingsveldt és mtsai (id. mű), Goosen és mtsai (id. mű) és Wernars és mtsai (Mól. Gén. Génét. 209 (1987) 71-77) számoltak be. Az A. nidulans bioszintézis-utjai (pl. az aminosavak és nukleotidok szintézise) egyes enzimeinek génjeit különböző módszerekkel is ki lehet cserélni. Miller.és mtsai (id. mű) vagy egy egylépéses módszert alkalmaztak, amikor a TrpC gént cserélték ki egy módosított homológ gént tartalmazó restrikciós DNS-fragmentummal, vagy egy kétlépésest, amikor egy cirkuláris plazmidot használtak. Az egylépéses génhelyettesités két átkeresz4 teződés megtörténtét feltételezi (lásd a 7. ábrát), mig a kétlépéses folyamatban az első lépés egy egyszerű beépülés, amit olyan rekombinálódás követ, hogy az eredeti gén elveszik és a bevitt integrálódik a genomba. A második lépés bekövetkezését az uj tulajdonságot kifejező egyedek megjelenése jelzi.

Köztudott, hogy az aminosavak bioszintézisének enzimei, pl. a TrpC vagy az ArgB gének által kódolt enzimek a sejtek fehérjekészletének csak igen kis hányadát teszik ki. Ennek ellenére ezek a gének létfontosságúak, elvesztésük auxotrófiához, a hiányzó metabolit vagy aminosav igényéhez vezet. A jelenség segítségével mind a fenti két gén, mind a hasonló funkciójú gének helyettesítésével nyert transzformánsok könnyen izolálhatók (Esser és Mohr, Process. Biochem. (198-6) 153-159.)

Hasonló eredményekről számoltak be az A. niger esetében a pyrG gén helyettesítésével Van Hartingsveldt és mtsai, \alamint Goosen és mtsai (id. művek). A pyrG gén az uridin bioszintézisének egyik enzimét kódolja és a helyettesítésével nyert transzformánsok jól szelektálhatók.

z

Meg kell jegyeznünk, hogy az említett fehérjék egyike sem szerepel az A. niger vagy A. nidulans által kiválasztott fehérjék között. A gyakorlat olyan génhelyettesitési rendszert kíván, amelyben a kódolt fehérje a -sejt teljes fehérje-készletének többségét alkotja és ez a fehérje aktivan kiválasztódik a sejtből.

A fonalas gombákból létrehozott expressziós (fehérje-produkáló) rendszerek egy hatékony kiválasztásu befogadó szervezet5 bői és egy olyan génből állhatnak, amely a kívánt fehérjét kódolja és expressziós szintje magas. Ez a gén előnyösen a kicserélni kívánt gén 5' - és 3' - néma régióival végződik, ami elősegíti az integrálódását a befogadó szervezet genomjába. A létrejött transzformánsok magas szintű termelő képességgel és hatékony kiválasztással rendelkeznek. A rendszer tápközegéhez célszerűn proteáz-gátlószer is adható a kívánt termék lebontá sának megakadályozására.

Ábrák magyarázata

1. ábra. Az A. niger glukamiláz (AG) génjének izolálásához használt oligonukleotid bázissorrendje.

2. ábra. Az A. niger glukamiláz génjének térképe, a létrehozott szubklónok és a hibridizációs minta.

A pAB64-40 elkészítése.

3.	ábra.
4 .	ábra.
5.	ábra.
6.	ábra.
7.	ábra.

A pAN76-1 vázlatos felépítése.

Az mAB64-0 vázlatos felépítése.

A pAB64-72, a pAB64-73 és a pAB64-75 vázlatos felépítése.

A glukamiláz gén kicserlésének vázlata.

Fonalas gombákból ló) rendszerek hozhatók gel rendelkező befogadó hatékony expressziós (fehérje-produká létre. A rendszer egy kiválasztó-képesség szervezetből és a kifejezni kívánt gént hordozó DNS-szerkezetből áll. Az integrálódás érdekében ez a DNS-szerkezet a kifejezni kívánt gén mellett a kicserélni kívánt gén 5' - és 3' - néma régióit is hordozza. A kicserélni kívánt génnek szintén egy, a gazdaszervezet által kiválasztott fehérjét kell kódolnia. A létrehozott transzformánsok haté konyan termelik és választják ki a kívánt fehérjét, amit a ki cserélt gén termékének hiánya következtében egyszerűen lehet kinyerni a tápközegből.

A befogadó szervezetek azok a fonalas gombák lehetnek, amelyek nagy mennyiségben termelnek és választanak ki saját fehérjéket. Különösen fontosak e tekintetben az A. niger, oryzae és awamori ipari termelő törzsei, de felhasználhatók a T. reesei, a M. miehei és a kannapenészek általában (Aspergillaceae) , mint pl. az A. ficuum is.

A DNS-szerkezet tartalmazza a kívánt fehérje génjét, valamint egy olyan jelző szakaszt, amely működőképes a gazdaszervezetben és kiváltja a gén által kifejezett fehérje kiválasztását a gazdasejtből. A tökéletes integrálódás érdekében ez a jelző szakasz legyen homológ vagy közel homológ a kicserélni kívánt gén jelző szakaszával, bár ilyen funkciójú jelző szakaszok mesterségesen is létrehozhatók (van Heijne, Eur. J. Biochem 133 (1983) 17-21; Perlman és Halvorson, J. Mól. Bioi. 167 (1983) 391-409). A kifejezni kívánt termék vagy génje lehet homológ vagy heterológ a gazdaszervezet kicserélni kívánt génjével. A homológ kifejezés azt jelenti, hogy a termelődő fehérje azonos a gazdaszervezet vad törzse által termelt eredeti fehérjével, mig a heterológ azt, hogy a termelődő fehérje idegen a gazdaszervezettől, amely ez esetben olyan mutáns, ami a természetben nem fordul elő.

A kivánt termék génjéhez kapcsolódhat a saját jelző szakasza, a gazdaszervezeté, vagy egy mesterséges jelző szakasz; megválasztása a bevinni és kicserélni kivánt génektől függ.

Előnyös a kicserélni kívánt gén jelző szakaszát választani, mert ez homológ a gazdaszervezet genomjának megfelelő területével , igy biztosítja az integrálódást és a termék hatékony kiválasztását. A jelző szakaszt hordozó DNS-darab a fehérjét kódoló szakaszhoz a terminátor szakaszon keresztül vagy egy rövid, általában 10 kodonnál nem hosszabb áthidaló DNS-darabon keresztül kapcsolódhat.

A kívánt termék génjének 5'- végén található az iniciátor-szakasz. Ez bármely, a gazdasezrvezetben funkcióképes iniciátor lehet, de előnyös, ha ez a szakasz minél nagyobb mértékben homológ a kicserélni kívánt gén iniciátor-szakaszával. Ez hatással van az eredeti gén termékének a kívánt termékkel való helyettesítésére. A termék megfelelő szintű kifejezéséhez és kiválasztásához általában a kicserélni kívánt gén iniciátor-szakasza a megfelelő. Előfordulhat azonban, hogy más iniciátorral a vad génnél nagyobb fokú produkció érhető el vagy a kifejeződés megfelelő vegyülettel indukálhatóvá válik. Ezekben az esetekben az iniciátor-szakasz különbözik a kicserélni kívánt gén iniciátorától. Nagyszámú iniciátor-szakasz ismert a fonalas gombákból, pl. a glukamiláz, az alfa-amiláz, a savas foszfatáz, a GAPDH, az izopenicillin N-szintetáz, a savas proteáz, az aciltranszferáz és más enzimek, ill. a H2A hiszton génjeié, valamint a TrpC, AmdS, AlcA, Pyr4 és PyrG géneké.

A kicserélni kívánt gén előnyösen egy olyan fehérje génje, amelynek terméke legalább 0,1 g/1 koncentrációban van jelen a fermentációs eljárás végén. A fermentáció időtartama változó lehet és egyebek között magától a kívánt terméktől is függ.

Ilyen génre jó példa a glukamiláz (AG) génje, de a számításba vehető gének között van az alfa-amiláz, a savas foszfatáz, a proteáz, a savas proteáz, a lipáz, a fitáz és a cellobiohidroláz génje is.

Az eljárásban alkalmazott gén bármely olyan fehérje génje lehet, amely valamilyen célra felhasználható. Az ilyen fehérjék közül a kimozin, az interleukinok, a véralvadás-faktorok (pl. a VIII és IX), a foszfolipázok, a lipázok és a növényi sejtfalat bontó enzimek heterológok az Aspergillusokban, mig a fitázok, foszfatázok, xilanázok, béta-galaktozidázok, reninek, glükóz-oxidázok és amilázok a kannapenészek természetes enzim-készletéhez tartoznak.

A kifejezni kívánt gén terminátor-szakasza lehet a sajátja, a kicserélni kívánt géné vagy bármely más, kényelmesen használható DNS-szakasz. Ha a DNS-szerkezet járulékos szekvenciákat is tartalmaz a kifejezni kívánt fehérje strukturgénje és a terminátor-szakasz között, akkor a terminátor-szakasznak lényegesen kisebbnek kell lennie a homológ átfedő- (flanking-) szakasz hosszánál.

Általában egy szelekciós markert is használnak az eljárás során, ami lehet a DNS-szerkezet része, de lehet attól elkülönítve is. Az utóbbi esetben a marker génje más helyen is integrálódhat a gazdaszervezet genomjába, mint a kívánt termék génje. Mivel a találmány szerinti transzformáló DNS-szerkezeteket előnyösen iparban használt gazdaszervezetekbe juttatjuk be, a sze9 lekciós markerek előnyösen domináns jellegek lehetnek, azaz bevitelük nem okoz mutációt a gazdaszervezetben. Az ilyen markerekre példák azok, amelyek a transzformánsokat képessé teszik egy adott vegyület hasznosítására (pl. az A. nidulans AmdS génjének bevitele után az A. niger transzformáns törzse képes lesz az acetamidot egyedüli nitrogénforrásként hasznosítani) , vagy antibiotikum rezisztenciát okoznak (pl. a ble gén fleomicin-, a hph gén higromicin B- rezisztenciát okoz).

A szelekciós marker génjének saját iniciátor- és terminátor-szakaszának kell lennie, hogy a marker jelleg önállóan kifejeződhessen. A korábban leirt iniciátorok a marker génhez is felhasználhatók. Ha a marker jelleg antibiotikum-rezisztencia, úgy a szelektáláshoz használható antibiotikum-koncentráció a szertől függően változik, de általában 30-300 ug/ml között kell megválasztani.

Az említett, különböző funkciójú DNS-szekvenciák az ismert technikák bármelyikével összeépithetők a kívánt DNS-szerkezetté. Ilyen technikák lehetnek a restrikció, a komplementer restrikciós helyek összekapcsolása, tompa végek kialakítása és összekapcsolása az átfedő részek kitöltésével, Ba131 restrikció, elsődleges repair, in vitro mutagenezis és hasonlók. Polilinkerek és adapterek is használhatók szükség szerint, amelyek ismert technikákkal építhetők be vagy távolíthatók el. A DNS-szerkezet összeépítésének bármely lépése után a már elkészült fragmentum klónozható és analizálható restrikciós enzimekkel való bontással, szekvenálással, hibridizációval vagy hasonló technikákkal.

A klónozáshoz nagyszámú vektor közül lehet választani: a vektor megválasztása közömbös a találmány tárgyát képező eljárás szempontjából. A leggyakrabban használt vektor az Escherichia coli.

Az átfedő (flanking) területek a kicserélni kívánt gént határoló nyílt szekvenciáknak legalább egy részét tartalmazhatják, különösen a jelző szakaszokat, az 5' - és 3' - regulátor szakaszokat, de túl is nyúlhatnak azokon. Az átnyúló területek általában nem intakt gének, igy rajtuk nem fejeződnek ki funkcióképes fehérjék. Az átnyúló területek hossza legalább 100, előnyösen legalább 200 bázispár legyen, de lehet 500 vagy több is. Az átfedő szekvenciák úgy legyenek megválasztva, hogy károsítsák a kicserélni kívánt gént és megelőzzék a kifejeződését. Ez úgy érhető el, hogy a DNS-szerkezetet a kicserélni kívánt gén 5' - végéhez közel inzertáljuk és az utóbbi egészét vagy nagyobb részét helyettesítjük vele, vagy a DNS-szerkezetet a kicserélni kívánt gén iniciátor-szakasza és fehérje-kódoló szekvenciája közé illesztjük. Mint már említettük, ha a terminátor-szakasz homológ a kicserélni kívánt génével, úgy a 3' - átfedő területnek lényegesen nagyobbnak kell lennie a DNS-szerkezet terminátor-szakaszánál.

A DNS-szerkezet a gazdaszervezetbe vagy a klónozó vektorral együtt - akár cirkuláris, akár lineáris alakban - vihető be, vagy előzetesen el is távolítható a vektorból. A plazmidot általában linearizálni kell a DNS-szerkezet végétől számított 1000 bázispáron belül. A fonalas gombák transzformálására számos tecznika ismeretes, többek között a protoplaszt-fuzió vagy

-transzformáció, az elektroporáció vagy a sejtbe történő mikroinjektálás. Előnyösen a protoplaszt-transzformációt alkalmazhatjuk. A transzformálni kívánt gombatörzs micéliumából protoplasztokat készítünk enzimes emésztéssel ozmostabilizátor (pl. kálium-klorid vagy szorbitol) jelenlétében, majd a DNS felvételét kalcium-klorid és polietilén-glikol hozzáadásával segítjük elő. A tömény polietilén-glikol a protoplasztok aggregációját okozza, aminek során a DNS-szerkezetek az aggregátumhoz kötődnek és felvétetnek a protoplasztok által. Ezután a protoplasztokat ozmostabilizátort tartalmazó szilárd táptalajon való regeneráljuk. A táptalaj kívánt esetben - ha a transzformáló DNS-szerkezet rezisztenciát is kódol - szelektáló vegyületet is tartalmazhat.

A transzformánsok kiválogatása után a kívánt gén jelenléte számos módon ellenőrizhető. Ha az expresszió terméke heterológ a gazdaszervezetre nézve, antitestet használhatunk a kimutatásra, mig ellenkező esetben a Southern biot vagy Northern biot technikák használhatók az integrálódott gén vagy terméke kimutatására .

A transzformált sejtek szokványos tápközegekben tenyészthetők. Kis koncentrációban (1 jug/ml - 1 mg/ml) proteáz-gátlószerek, pl. fenilmetilszulfonil-fluorid, alfa-2 makroglobulinok, pepsztatin vagy hasonlók is adhatók a tenyészethez, de a proteáz gén(ek) is inaktiválható(k) a kívánt fehérje lebomlásának meggátlása vagy csökkentése céljából.

A kicserélendő gének célszerűen a glukamiláz génje az A.

niger és A. awamori esetében, az alfa-amiláz génje az A. oryzae, a cellobiohidroláz génje a T. reesei és a savas proteáz génje a M. miehei esetében.

A transzformánsok tenyészthetők szakaszosan működő vagy folyamatos bioreaktorokban (férméntorokban), ahol a tápközeg elkülöníthető és a kívánt termék kinyerhető belőle. A termék tisztítására számos módszer használható, mint a kromatográfiás módszerek (pl. nagynyomású folyadékkromatográfia vagy prepárativ vékonyréteg-kromatográfia), a folyadék-folyadék extrakció, az elektroforézis, az előbbiek kombinációi és hasonlók.

Az alábbi példák a találmány szerinti eljárás nem kizárólagos alkalmazásait mutatják be.

1. példa

A. módszerek

Az összes transzformáló DNS-szerkezetet szokványos molekulárbiológiai módszerekkel állítottuk elő (Maniatis és mtsai: Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

pAB6-1, pAB6-2A, pAB6-3 és pAB6-4 plazmidok készítése

Az A. niger glukamiláz-génjét plazmid-gyűjteményből izoláltuk és a kereskedelemben (pl. Boehringer Mannheim, NSZK) kapható pUC19 plazmidban a 3-4 kb EcoRI vagy a 13-15 kb HindlII fragmentumokkal együtt klónoztuk (Yanisch-Perron és mtsai, Gene 33 (1985) 103-119). Az izoláláshoz az 1. ábrán bemutatott oligonukleotidot használtuk, amit Boel és mtsai (EMBO J. .3 (1984) 1097-1102, Mól. Cell. Bioi. 4 (1984) 2306-2315) közleményei alapján készítettünk el. Az oligonukleotid az in trón-2-t.

körülvevő szekvenciából származik: a 42-mer az intron 3' végénél található és polaritása megegyezik az AG-mRNS polaritásával, mig a 24-mer az intron-2 fölött található és polaritása fordított. A pAB6-1 plazmid az AG-gént egy 14,5 kb hosszúságú HindlII fragmentumon tartalmazza. A pAB6-2A plazmidban a teljes AG-gén egy 3,4 kb méretű EcoRI fragmentumon helyezkedik el. A pAB6-3 plazmidban az 1,8 kb EcoRI fragmentum közvetlenül az AG-gén fölött helyezkedik el; ez a fragmentum valószínűleg regulátor-szekvenciákat tartalmaz és a pAB6-1 plazmidból lett szubklónozva. A pAB6-4 plazmid - a pAB6-1 másik szubklónja a 4,6 kb hosszúságú HindlII plusz Bglll fragmentumot tartalmazta, amely az AG-gén fölötti területet és a gén 5'- végének egy részét alkotta (2. ábra). Az összes fragmentumot a püC19-ben klónoztuk.

pAB64-40 plazmid készítése

A pAB6-2A plazmidot (2. ábra) Accl-gyel és T4 polimerázzal kezeltük, hogy tompa végű AccI fragmentumokat nyerjünk. Az 1,2 kb méretű fragmentumokat - amelyek az AG-gén 3'- átfedő szekvenciáit és terminátorát tartalmazták - izoláltuk. A kimozin cDNS-t tartalmazó pUR1524 plazmidot részlegesen emésztettük Sallés EcoRI-vel. A kimozin cDNS-t tartalmazó fragmentumot izoláltuk, a ragadós végeket T4-DNS-polimerázzál kitöltöttük és a tompa végű fragmentumot Sáli linkerrel kapcsoltuk össze. A fragmentumot Sall-gyel és HindlII-mal emésztettük és a pPA153-209 plazmidba beépítettük (van Putten és mtsai, J. Bacteriol. 168 (1986) 728-733),ami szintén a Sall-gyel és HindlII-mal volt emésztve. A keletkezett DNS-szerkezetet (pRCH4) BclI-gyel hasítottuk és T4 polimerázzal kezeltük, hogy tompa végeket kapjunk. Ezután az AGterminátort tartalmazó AccI fragmentumot a tompa véghez kapcsoltuk. Az igy nyert pAB64-10 plazmidban a betöltött Bell terület

- a kimozin gén 3'- végehelyre lett állítva.

Ezután a pAB6-3 plazmidot (2. ábra) részlegesen emésztettük EcoRI-gyel és T4 polimerázzal kezeltük. Ebbe a vektorba a pAB6-4 plazmid HindlII plusz EcoRI fragmentumát illesztettük újabb T4 polimerázos kezelés után. Az igy nyert szerkezet a pAB6-31, amely az AG-gén 3,6 kb hosszúságú felszálló szakaszát - közepén egy funkció-képtelen EcoRI fragmentummal - valamint az AG-génhez közel egy ép EcoRI szekvenciát tartalmaz. Az ép EcoRI részbe a PAB64-10-ből származó, a kimozin cDNS-t és az AG-terminátort hordozó, részlegesen emésztett EcoRI-t építettünk; az igy kapott szerkezet volt a pAb64-20. A terminátor és vektor közötti EcoRI-t részleges emésztéssel, T4 polimezáros kezeléssel és összekapcsolással tönkretettük. Az uj szerkezet a pAB64-40, amely az EcoRI részt az AG-gén felmenő szekvenciája és a kimozin cDNS összekapcsolódás! pontjánál tartalmazta (3. ábra).

pAN76-1 plazmid készítése

A pAN7-1 plazmidot (Punt és mtsai, Gene 56 (1987) 117-124), HindlII-mal emésztettük, majd erre a helyre a pAB-6-1 plazmidból nyert Sáli plusz HindlII fragmentumot (2. ábra) építettük be az AG-gén 3'- végénél. A Sáli szekvenciát T4 polimerázzal kitöltöttük. Az igy nyert pAN76-1 plazmidból (4. ábra) a HygB gént az AG-gén 3'- flanking szakaszával együtt izoláltuk és Stul plusz HindlII fragmentumként használtuk fel.

mAB64-0 fág készítése

A pAB6-2A plazmidból izoláltuk az AG-gén promoter- é,s regulátor-szekveniáit is hordozó EcoRI plusz Nrul fragmentumot és az M3mp11 fághoz (Messing és Vieira, Gene 19 (1982) 269-276; árulja a Pharmacia, Svédország) kapcsoltuk. A fágot az EcoRI és BamHI, valamint a kimozin cDNS-t tartalmazó, a pRCH4 plazmidból származó Sall plusz Bell fragmentumokkal emésztettük, majd a Sall helyen T4 polimerázzal kezeltük. Az eredményül kapott mAB64-0 fág egy fehérje-összeköttetést tartalmaz az AG- és a preprokimozingén között (5. ábra); ezt a szerkezetet használtuk az in vitro mutagene z i she z.

B. Specifikus expressziós szerkezetek

A kimozinhoz három expressziós szerkezetet készítettünk az mAB64-9 fágból. Mindhárom különböző kapcsoló szakaszt tartalmazott az AG-gén regulátor szakasza és a kimozin cDNS között.

Az alábbi három oligonukleotidot készítettük el:

(1)

5'- AT

TAC

ACC

TCA

GCA

ATG

AGG

TGT

CTC

GTG

3 ’

(2)

5'-TGC

ACA

GGG

TTG

GCA

GCT

GAG

ATC

ACC

AGG

ATC

CCT CT 3

(3)

5'-ACG

GAT

AAC

CCG

GAC

GCT

GAG

ATC

ACC

AGG

3 ’

Az (1) oligonukleotidot az AG-promoter és a preprokimozin, a (2)—t az AG-promoter és a prokimozin jelző peptidje összekapcsolására használtuk. A (3) felhasználásával egy fehérje-összeköttetést hoztunk létre az AG-gén 71. aminosava és a prokimozin között.

Az igy elkészített szerkezetek(mAB64-2, mAB64-3 és mAB64-5) azonosságát a rajtuk elkészített ssDNS szekvenciájának analízisével ellenőriztük, majd izoláltuk belülük a kívánt gént hordozó EcoRI fragmentumokat. Az utóbbiakat a pAB64-40 plazmidba inzertálva nyertük rendre a pAB64-42, pAB64-43 és pAB 64-45 plazmidokat. E három plazmidba a pAN76-1 plazmidból izolált Stul plusz HindlII fragmentumot építettük be; ez a fragmentum a HygB gént és az AG-gén 3'-átfedő területét hordozta. A kész szerkezetek (pAB64-72, pAB64-73, és pAB64-75) egy önálló HindlII részt tartalmaznak az expressziós szerkezet 3'-végénél és egy 3'-átfedő területet (6. ábra).

2. példa

Aspergillus niger transzformálása génhelyettesitéssel

Az A. niger találmány szerintitranszformálását van Hartingveldt és mtsai ill. Yelton és mtsai (id. művek) technikájával végeztük el.

Az A. niger DS2975 jelzésű törzsét(mintája 51388 szám alatt 1988. augusztus 10-én lett elhelyezve a CBS-nél) 24 órán át, szükség esetén hosszabb ideig tenyésztettük 34°C-on. A micéliumot steril nylonszöveten szűréssel összegyűjtöttük és 0,6 mólos magnézium-szulfát oldattal (max. 12,5 ml/100 ml tenyészet) mostuk. Ezután a micéliumot steril kémcsőbe helyeztük, tömegét megmértük és 5 ml/g ozmótikus oldatban felszuszpendáltuk (az ozmotikus oldat 10 mmol foszfáttal puffereit 1,2 molos magnézium-szulfát oldat, pH= 5,8). A protoplasztokat Novozym 234 (NOVO, Dánia; 20 mg/ml ozmotikus oldatban) és BSA (Sigma, Hollandia, 12 mg/ml ozmotikus oldatban) grammonként 1,0, illetve 0,5 ml-nek hozzáadásával készítettük. Az elegyet 50 f/perc frekvenciával rázógépen kevertük 25-27°C-on és a protoplasztok képződését rendszeres időközönként vett mintákban mikroszkóppal követtük nyomon. A folyamat befejeződése után a protoplaszt-szuszpenzió .15 ml-ét steril centrifugacsőbe pipettáztuk és 10 ml, ozmostabilizátorként 0,6 mól szorbitolt tartalmazó 100 mmolos trisz-HCl puffért (pH= 7,0) rétegeztünk fölé. A csöveket lengőrotorban 5000/perc fordulattal 15 percig centrifugáltuk 4°C hőmérsékleten, majd a protoplasztokat a határrétegből bő nyílású Pasteur-pipettával óvatosan kinyertük. Az elválasztást megismételtük, ha a csőben sok üledék volt: az üledéket ozmotikus oldatban felszuszpendáltuk és az egész eljárást újra elvégeztük. Az összegyűjtött protoplasztokat óvatosan mostuk hideg STC-oldatban (1,2 mól szorbitol és 50 mmol kalcium-klorid 10 mmolos trisz-HCl pufferben, pH = 7,5) felszuszpendálással, majd centrifugálással (3000/perc, 10 perc, 4°C) , amig minden szennyezést el nem távolítottunk. A tisztig tott protoplasztokból végül 10 /ml sűrűségű szuszpenziót készítettünk hideg STC-oldattal.

A protoplasztokat vagy azonnal, vagy 4°C-on tárolva másnap használtuk fel. Utóbbi esetben a protoplasztokat újra átmos tűk hideg STC-oldattal.

A transzformálás során 10 protoplasztot adtunk 10 pg DNS-hez 25 jul STC- vagy 10 ul TE-oldatban (a TE-oldat 1 mmol EDTA-t tartalmazott 10 mmolos Trisz-HCl pufferben, pH = 8,0). A génhelyettesités érdekében a pAB64-72, pAB64-73 és pAB64-75 plazmidszerkezeteket linearizáltuk a mindháromban közös HindlII restrikciós rész átvágásával közvetlenül a szelekciós marker és az AG-gén 3'- átfedő szakasza alatt (6. ábra).

A protoplasztok és a DNS keverékét szobahőmérsékleten inkubáltuk 25 percig, majd PEG-oldatot adtunk hozzá 200, 200 és 850 ul-es részletekben (a PEG-oldat 60 % polietilén-glikolt (Brocacef BDH, Anglia) és 50 mmol kalcium-kloridot tartalmaz 10 mmolos trisz-HCl pufferben oldva, pH = 5,7). A keveréket minden részlet hozzáadása után óvatosan homogenizáltuk és az utolsó részlet után 20 percen át inkubáltuk szobahőmérsékleten. A nagyobb plazmidok (> 18 kb) néha kicsapódtak: ezt a 60%-os helyett 25 %-os PEG-oldat használatával előztük meg.

A transzformált protoplasztokat 10-15 ml hideg STC-oldattal mostuk óvatos keveréssel és centrifugálással (5000/perc, 10 perc, 4°C). A kinyert protoplasztokat 100 yjl STC-oldatban újra felszuszpendáltuk és 200 pg/ml higromicin B-t (Sigma H 2638) tartalmazó szelektáló táptalajra helyeztük. A kitenyészett higromicin-rezisztens telepekből monospora-izolációval indított vonalakat vizsgáltuk tovább.

3. példa

A génhelyettesités kimutatása

A. Southern biot technika

Annak kimutatására, hogy a génhelyettesités megtörtént-e a transzformánsokban, a Southern biot technika alkalmazható, mert segítségével demonstrálható a kicserélni tervezett gluka19 miláz-gén jelenlétve vagy hiánya. Egy, a glukamiláz-génnel homológ DNS-fragmentumot radioizotóppal jelölve és hibridizáltatva a transzformánsokból kivont, elektroforézissel szétválasztott és nylon membránhoz rögzített kromoszomális DNS-sel, az esetleg jelenlévő homológ DNS-nek már igen kis mennyisége is kimutatható.

Mindhárom tipusu transzformánsokból számos vonalat vizsgáltunk meg. A micéliumot folyékony nitrogénben megfagyasztva eldörzsöltük és a DNS-t szokványos módon kivontuk belőle. A teljes genomot reprezentáló DNS-t EcoRI-gyel emésztettük, a fragmentumokat elektroforézissel szétválasztottuk és nylon membránhoz (Gene Screen Plus, DuPont, USA) rögzítettük. Első próbaként a foltokat radioaktív AG-specifikus DNS-sel (BamHI plusz BglII fragmentum; 2. ábra) hibridizáltuk. Azokat a transzformánsokat, amelyek ebben a vizsgálatban negatív eredményt adtak, azaz az AG-gén DNS-e nem volt kimutatható a genomjukban, tovább vizsgáltuk, hogy megbizonyosodjunk a gén kicserélődéséről. Ennek érdekében egyrészt radioaktív pAB64-75 plazmáddal végeztünk hibridizációt (ez a vizsgálat kimutathatja, hogy minden lényeges, plazmid-eredetü DNS jelen van-e a genomban), másrészt radioaktív pUC19-cel, hogy meggyőződjünk a klónozáshoz használt baktérium DNS-ének hiányáról. A kísérletek a 36 megvizsgált transzformánsból 7 esetben mutatták ki az összes plazmid-eredetü fragmentum - köztük a kívánt kimozin-cDNS jelenlétét és a baktérium-eredetű DNS hiányát. Az eredményes transzformánsok mindegyike csak egy kimozin-gént tartalmazott.

B. Western biot technika

Valamely szervezet egy kiválasztott génjének hiányát vagy jelenlétét a genomban számos módon lehet kimutatni. A Southern biot technika - mint az A. részben leírtuk - kiválóan alkalmas a gént alkotó DNS-szekvenciák hiányának közvetlen kimutatására. A gén hiányának kimutatását úgy is végezhetjük, hogy a gén termékének hiányát, jelen esetben a glukamiláz hiányát mutatjuk ki. Egy fehérje jelenlétének vagy hiányának kimutatására a Western biot technika az egyik legérzékenyebb módszer. A vizsgálat lényege az, hogy a nitrocellulóz membránra rögzített fehérjéhez arra specifikus antitestet kapcsolnak, majd az antitesthez egy második, az első antitestre specifikus antitestet. A második antitesthez egy enzim van konjugálva, ami a kapcsolat létrejöttekor felszabadul és egy színtelen szubsztrátból színes terméket hoz létre. Ha a membránon a kérdéses gén terméke jelen volt, úgy az színes esik alakjában tűnik fel a reakciósor végén.

A Southern blpt vizsgálat eredményeként kiválasztott transzformánsokat - amelyekben az AG-gén feltételezhetően kicserélődött a marha-kimozin génjére - keményítőt tartalmazó táptalajban neveltük, hogy a glukamiláz regulátor-területét indukáljuk. A fermentléből végeztük a Western biot vizsgálatokat; a transzformánsok eredményét az anyatörzsével hasonlítottuk össze. Egy vizsgálatban 20 /11 fermentlével végeztünk elektroforézist 7,5 %-os p^oliakrilamid-SDS gélen, majd az elválasz21 tott fehérjéket szokvávnyos módon, ugyancsak elektroforézissel vittük át egy nitrocellulóz membránra. A membránt ismételten mostuk, majd a glukamilázra specifikus poliklonális antiszérummal inkubáltuk (az utóbbit kereskedelmi készítményből tisztítottuk nagynyomású folyadékkromatográfiával). A második antiszérummal történt inkubáció után a transzformánsokon készült preparátumokon nem lépett fel elszineződés, míg az anyatörzs preparátumán megjelent a glukamilázt jelző színes fehérje-sáv. A vizsgálat megerősítette, hogy a transzformánsokban az AG-gén kicserélődött a kimozin génjére.

C. A génkicserélődés hatása a kiválasztott fehérjék mennyiségére A glukamiláz az A. níger által kiválasztott teljes fehérje-mennyiség tekintélyes hányadát adja (Cullen és mtsai, id. mü). Ennek megfelelően várható, hogy a glukamiláz génjét kicserélve megváltozik a kiválasztott fehérjék mennyisége is.

A fermentlé csökkent fehérje-tartalma egyszerűbbé teheti a kívánt termék tisztítását vagy továbbmenve - ha a sejt kiválasztó kapacitása korlátozott - a glukamiláz hiánya teret nyit más fehérjék kiválasztásának.

A fermentlevek fehérje-tartalmát szokványos módszerekkel mértül; az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.

1. táblázat

A fermentlé fehérje-tartalma

Törzs Fehérje-koncentráció (mg/ml)

A.	niger	DS	2975		0,143
A.	niger	DS	2975	+ pAB64-72	0,096
A.	niger	DS	2975	+ pAB64-73	0,082
A.	niger	DS	2975	+ pAB64-75	0,076
		A	vizsgálat eredményei	megerősítik, hogy a vizsgált

transzformánsokból hiányzik a glukamiláz génje.

4. példa

A marha-kimozin kifejeződése és kiválasztódása Aspergillus nigerben

A linearizált pAB64-72 és pAB64-73 plazmidokkal az A. niger-t a 2. példa szerint transzformáltuk és a génkicserélődés megtörténtét a 3. -példa szerint bizonyítottuk. A kiválasztott, monospóra-izolálással létrehozott vonalakat megvizsgáltuk a kimozin termelésére és kiválasztására is. A kimozin rendesen zimogén alakjában választódik ki: a zimogén (prokimozin) a kimozin inaktív alakja, amelyben az enzim N-terminálisához egy rövid peptid kapcsolódik. A zimogén aktiválódása a rövid peptid lehasadásának következménye, ami más enzimek segítségével vagy - a kimozin esetében - savas közeg hatására történhet meg. Vizsgálatainkban a kiválasztott prokimozint savas kezeléssel alakítottuk át mérhető aktivitású kimozinná.

A. A kicserélt génnel rendelkező A. niger transzformánsok fermentálása

100 ml folyékony előkulturát oltottunk be kb. 10^ spórával. A táptalaj összetétele a következő: Kh^PO^ 1 g/1, maltóz 30 g/1, élesztőkivonat 5 g/1, kazein-hidrolizátum 10 g/1, MgS0₄.7H₂0 0,5 g/1 és Tween-80 3 g/1. A tenyészeteket 34°Con 48 óráig neveltük, közben mintákat vettünk a kimozin-termelés vizsgálatára és a mRNS kimutatására. A kétnapos tenyészetek 10 ml-ével indítottuk a fermentációt 100 ml-ben; a táptalaj összetétele a következő: KI^PO^ 1 g/1, kukoricakeményitő 70 g/1, élesztőkivonat 12,5 g/1, kazein-hidrolizátum 25 g/1, K₂S0₄ 2 g/1, MgSI₄.7H₂0 0,5 g/1, ZnCl₂ 0,03 g/1, CaCl₂ 0,02 g/1,

MnS0₄.4H₂0 0,01 g/1 és F eS0₄ 0,3 g/1. A 34°C-on 48 órán át folytatott fermentálás során újra mintákat vettünk a kimozin-termelés és a mRNS mérésének céljából.

B. A mRNS mennyiségének meghatározása micéliumból

A mosott micélium-tömeget folyékony nitrogénben megfagyasztva RNáztól mentes mozsárban porrá törtük. A port 2 ml/g homogenizáló pufferben (4 mól guanidin izotiocianát, 0,1 mól béta-merkaptoetanol és 0,5 % N-lauroil-szarkozin Na-só (Sigma L-5125) 5 mmolos citrát-pufferben oldva, pH - 7,0) felvettük és 37°C-on 30 percig inkubáltuk, majd 5000/perc fordulattal 15 percig centrifugáltuk. A felülusz-óhoz 0,4 g/ml RNáz-mentes cézium-kloridot adtunk és óvatosan egy 5,7 mól cézium-kloridot tartalmazó 0,1 molos EDTA-oldatra rétegeztünk, majd 38000/perc fordulattal 20°C-on 17 órán át centrifugáltuk Ti

42.1 rotorban. A tiszta RNS-ből álló üledéket RNáz-mentes pufferben (5 mmol EDTA és 1 % nátrium- dodecilszulfonát 10 mmolos trisz-HCl pufferben, p H= 7,4) feloldottuk, egyenlő térfogatú kloroform:etanol = 4:1 keverékkel extraháltuk, az RNS-t nátrium-acetáttal és etanollal kicsaptuk, majd RMáz-mentes vízben újra feloldottuk.

Az RNs-minták elektroforetikus szeparálása és a Gene Screen Plus membrán hoz rögzítése a szokásos módszerekkel történt. A lemezeken a mintákat egy olyan oligonukleotiddal kíséreltük meg hibridizálni, amely mind az AG-, mind a kimozin-mRNS-sel homológ. Erre a célra azt a szekvenciát választottuk az AG-mRNS-ből, amely mind az AG-mRNS-ben, mind a kimozin-AG fúzióban jelen van; az expressziós szerkezetekben az AG-kimozin fúzió a transzláció kezdőpontjánál (pAB64-72) vagy azon túl (pAB64-73 és -75) helyezkedik el, s igy minden mRNS-nek tartalmaznia kell ezt a szakaszt.

A keményitő-tartalmu táptalajon nevelt micélium-minták mindegyikében kimutattuk a hibridizációra képes RNS-molekula jelenlétét; a legtöbbet a pAB64-73 transzformánsban találtuk. A kimutatott mRNS-ek hossza megfelelt a várakozásnak; az anyatörzsben az AG-mRNS, a transzformánsokban az expressziós szerkezeten képződött mRNS hosszával volt egyenlő. Az anyatörzs AG-mRNS-ének mennyisége megegyezett' a pAB64-73 transzformáns kimozin-mRNS-ének mennyiségével, jelezve, hogy az AG-lokusz helyén lévő hibrid gén az eredeti AG-gén hatékonyságával mű ködik .

C. A marha-kimozin kiválasztásának kimutatása

Az anyatörzs és a transzformánsok fermentlevéből vett mintákat 12,5^-03 poliakrilamid-SDS gélen elektroforézissel szétválasztottuk és standard módon nitrocellulőz membránhoz rögzítettük. A lemezen a kimozin kimutatását az enzimre specifikus monoklonális antitesttel végeztük; kontrolként tisztított kimozint használtunk.

Az összes, transzformánsokból ^származó mintákban a megfelelő helyen megjelent a kimozint jelző esik, míg ugyanez az anyatörzs mintájából hiányzott. A pAB64-73 transzformáns termelte a több kimozint a pAB64-72-höz képest, de az utóbbi termelő képessége is a gén működőképességére utal.

Az enzim alvasztóképességét standard eljárással, fölözött tejből készült tejpor (DIFCO) szubsztráton vizsgáltuk; kontrolként ismsert aktivitású borju-renint használtunk. A pAB64-73 enzim-hozama 18-45 MCU/ml, a pAB64-72 hozama 7-15 MCU/ml fermentlé között változott (1 MCU az a kimozin-mennyiség, amely 1 rrl tejet 35°C-on 40 perc alatt alvaszt meg.)

A fermentléből kinyert kimozin mennyisége meghaladta a 11,5 mg/l-t, ami lényegesen több, mint az A.nidulans-ról

- amely valószínűleg több expressziós szerkezetet is hordoz Cullen és mtsai közöltek (0,5-2,5 mg/1; id.mü; 0-7 mg/1;

EPA-0215594).

5. példa

A glukamiláz-prokimozin fúziós fehérje kifejeződése és kiválasztódása A. niger-ben

A linearizált pAB64-75 plazmiddal transzformált A. niger vonalakat az előző példákban leirt módszerekkel vizsgáltuk. A kimozinra jellemző mRNS mennyisége a mintákban a pAB64-72 és -73 szintje között volt. A kiválasztott kimozin jelenlétét Western biot technikával igazoltuk, mennyiségét alvasztási próbával mértük: az aktivitás 17-29 MCU/ml fermentlé között változott.

6. példa

Az AG-gén kifejeződésének szabályozása az anyatörzsben és a kimozin-féné a transzformánsokban

Az AG-promoter működőképességét egyedüli szénforrásként xilóz táptalajban nevelt micéliumban mértük. Ilyen körülmények között az AG-promoter nem indukálódik (Nurnberg és mtsai, Mól. Cell Bioi. £ (1984) 2306-2315) és sem az AG-gén, sem a kimozin-gén expressziója nem várható, mert az utóbbi a transzformánsokban az AG-promoter ellenőrzése alatt áll. Ezután a micéliumot keményítőt tartalmazó táptalajba oltottuk át, ahol az AG-promoter indukálódik (Nurnberg és mtsai, id.mü). A várt indukció bekövetkezését Northern biot technikával igazoltuk: a keményítővel indukált micéliumokból a megfelelő enzim (a glukamiláz az anyatörzsben és a kimozin a transzformánsokban) mRNS-ét kimutattuk. A xilózon növekedett micélium-mintákban ezek a mRNS-ek nem voltak jelen. Ugyanilyen eredményt adtak a kimozin közvetlen kimutatását célzó Western biot és alvasztási vizsgálatok is. A kísérletek egyértelműen bizonyították, hogy a kimozin-gén kifejeződésének szabályozása azonos az AG-génével és megfelel a glukamiláz-gén kifejeződéséről tudottaknak .

7. példa

A kimozin kifejeződése proteáz-gátlószerek jelenlétében

A kimozinnak az A. niger által termelt proteázokkal szembeni érzékenységét a transzformánsok proteáz-gátlószerek jelenlétében történt fermentálásával vizsgáltuk.

A pAB64-73 plazmiddal transzformált vonalakat (3. példa A) a 4. példában leirt módon fermentáltuk. A proteáz-gátlószereket nem tartalmazó tenyészeteket jelöltük, a pepsztatint és alfa-2-makroglobulint 1 és 5 ug/ml mennyiségben tartalmazó tenyészetek jele +, A mintákat a 3. példa B. alatt leirt módon vizsgáltuk; az eredményeket a 2. táblázat tartalmazza.

2. táblázat

A kimozin relatív mennyisége a gátlószereket nem tartalmazó és tartalmazó (+) tenyészetekben

Mintavétel időpontja (oltástól számított órák) +

0,5

0,3

0,2

Az adatok arra utalnak, hogy a kimozint a fermentlében található proteázok lebontják. E proteázok inaktiválása - ami a példában leirt módon is megvalósítható - magasabb kimozin-hozamot eredményez, mert biztosítja a kimozin megmaradását a fermentlében a proteázok jelenléte ellenére is.

A fenti eredményekből egyértelműen kitűnik, hogy a találmány tárgyát képező expressziós rendszer hatékonyan képes fehérjék termelésére.Bizonyítottnak tekinthető továbbá, hogy ha egy kívánt gént egy kiválasztódó fehérjét termelő gén helyére bejuttatunk, úgy a kívánt gén magas szinten fogja termelni a saját fehérjéjét. Ilyen módon a gazdasejt kiválasztó kapacitásának terhelése csökkenthető, ami a kívánt fehérje hatékony kiválasztását segíti elő. Megfelelő kiválasztóképességü gazdaszervezetek alkalmazásával a találmány tárgyát képekző rendszer különböző termékek, pl. gyógyszerek, ipari enzimek és hasonlók előállítására alkalmazható.

A leírásban idézett valamennyi publikációban és szabadalmi közleményben hivatkozott további publikációk és szabadalmi közlemények éppúgy idézettnek tekintendők, mintha külön-külön idéztük volna azokat.

Annak ellenére ,hogy a találmány tárgyát részletesen leírtuk és példákon keresztül kívántuk világosan érthetővé tenni, a tárgyban a tudomány mai szintjén járatos személyek számára magától értetődő, hogy a találmány tárgyát képező eljáráson számos változtatás és módosítás eszközölhető anélkül, hogy az érintené az igénypontok érvényességi körét.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Egy fonalas gomba gazdaszervezet, azzal jellemezve, hogy magában foglal: egy kromoszómát, amely tartalmaz egy in vitro rekombinációval készített expressziós DNS-szerkezetet, amely egy transzkripciós iniciátor-szakaszból, egy kiválasztódást előidéző jelző szakaszból, egy kivánt fehérje strukturgénjéből és egy transzkripciós terminátor-szakaszból áll, a nevezett regulátor-szakaszok a gazdaszervezetben funkcióképesek és a gazdaszervezetben van egy nem funkcionáló, kiválasztódó fehérjét kódoló gén is.
2. az 1. igénypont szerinti gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy a nem funkcionáló gén működésképtelenségét egy homológ szekvenciáju DNS-szerkezettel történt rekombináció váltja ki.
3. Egy fonalas gomba gazdaszervezet, azzal jellemezve, hogy magában foglal:

egy kromoszómát, amely tartalmaz egy expressziós DNS-szerkezetet, amely egy transzkripciós iniciátor-szakaszból, egy kiválasztódást előidéző jelző szakaszból, egy kivánt fehérje strukturgénjéből és egy transzkripciós terminátor-szakaszból áll és amely egy endogén, a gazdaszervezet genomjának részét képező, kiválasztódó fehérjét kódoló gén helyén helyezkedik el és meggátolja annak működését, mig a regulátor-szakaszok működőképesek.
4. A 3. igénypont szerinti fonalas gomba gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy az egy Aspergillus- (kannapenész-) faj.
5. A 4. igénypont szerinti fonalas gomba gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy az endogén gén a glukamiláz génje.
6. A 4. igénypont szerinti fonalas gomba gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy az Aspergillus-faj az A. niger.
7. A 3. igénypont szerinti fonalas gomba gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy az expressziős szerkezet egy markért is tartalmaz az ilyen markért hordozó gazdaszervezetek elkülönítése érdekében.
8. A 3. igénypont szerinti fonalas gomba gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy a kivánt fehérje strukturgénje a marha-kimozint vagy annak valamely prekurzor alakját kódolja.
9. A 3. igénypont szerinti fonalas gomba gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy a kiválasztódást előidéző jelző szakasz a glukamiláz jelző szakasza.
10. Egy Aspergillus-faj gazdaszervezet, azzal jellemezve, hogymagában foglal:

egy kromoszómát, amely egy transzkripciós iniciátor-szakaszból, a glukamiláz kiválasztódását előidéző jelző szakaszból, egy kivánt fehérje strukturgénjéből és egy transzkrip ciós terminátor-szakaszból áll és amely a glukamiláz gén helyén helyezkedik el és meggátolja annak működését, mig a nyílt regulator-szakaszok működőképesek.
11. A 10. igénypont szerinti fonalas gomba gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy az Aspergillus-faj az A. niger vagy A. awamori.
12. A 10. igénypont szerinti fonalas gomba gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy az expressziós szerkezet egy markért is tartalmaz az ilyen markért hordozó gazdaszervezetek elkülönítése érdekében.
13. A 10. igénypont szerinti fonalas gomba gazdaszervezet azzal jellemezve, hogy a kívánt fehérje strukturgénje a marha-kimozint vagy annak valamely prekurzor alakját kódolja.
14. Egy DNS-szerkezet, azzal jellemezve, hogy magában foglal:

egy DNS-szekvenciát, amely homológ egy endogén génnel, egy jelző szakaszból és egy, az endogén gén termékétől különböző fehérje strukturgénjéből áll, azzal jellemezve, hogy a strukturgén 5'- végén álló szakaszt egy, a fonalas gomba gazdaszervezetben működőképes transzkripciós iniciátor és egy jelző szakasz alkotja.
15. A 14. igénypont szerinti DNS-szerkezet azzal jellemezve, hogy a homológ DNS-szekvencia az endogén gén jelző szakasza és iniciátora közül legalább az egyiknek egy szegmensét tartalmazza .
16. A 14. igénypont szerinti DNS-szerkezet azzal jellemezve, hogy a strukturgén 5'- végén álló szakasz az endogén gén jelző szakasza és iniciátora közül legalább az egyiknek egy szegmensét tartalmazza.
17. A 14. igénypont szerinti DNS-szerkezet azzal jellemezve, hogy az endogén gén a glukamiláz génje.
18. A 14. igénypont szerinti DNS-szerkezet azzal jellemezve, hogy aa strukturgén a marha-kimozint vagy annak valamely prekurzor alakját kódolja.
19. A 14. igénypont szerinti DNS-szerkezet azzal jellemezve, hogy a homológ DNS-szekvencia az endogén gén 5'-iniciátor-szakaszát tartalmazza.
20. A 14. igénypont szerinti DNS-szerkezet azzal jellemezve, hogy a DNS-szerkezet egy markért is tartalmaz az ilyen markért hordozó gazdaszervezetek elkülönítése érdekében.
21. Eljárás egy kívánt fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy a következő lépésekből áll:

táptalajban fonalas gomba gazdaszervezet tenyésztése, amely tartalmaz:

egy kromoszómát, amely szintén tartalmaz egy in vitro rekombinációval készített expressziós DNS-szerkezetet, amely egy transzkripciós iniciátor-szakaszból, egy kiválasztódást előidéző jelző szakaszból, egy kívánt fehérje strukturgénjéből és egy transzkripciós terminátor-szakaszból áll, a nevezett regulator-szakaszok a gazdaszervezetben funkcióképesek és a gazdaszervezetben van egy nem funkcionáló, kiválasztódó fehérjét kódoló gén is, és ahol a kívánt fehérje gnje kifejeződik és terméke kiválasztódik; és a kívánt terméknek a táptalajból történő kinyerése.
22. A 21. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a nem funkcionáló gén működésképtelenségét egy homológ szekvenciáju DNS-szerkezettel történt rekombináció okozta.
23. Eljárás egy kívánt fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy a következő lépésekből áll:

táptalajban fonalas gomba gazdaszervezet tenyésztése, amely magában foglal:

egy kromoszómát, amely tartalmaz egy expressziós DNS-szerkezetet, amely egy transzkripciós iniciátor-szakaszból, egy kiválasztódást előidéző jelző szakaszból, egy kívánt fehérje strukturgénjébűl és egy transzkripciós terminátor-szakaszból áll és amely egy endogén, kiválasztódó fehérjét kódoló gén helyén helyezkedik el és meggátolja annak működését, mig a regulátor-szakaszok működőképesek és ahol a kívánt fehérje génje kifejeződik és terméke kiválasztódik; és a kívánt termék táptalajból történő kinyerése.
24. A 23. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az endogén gén a glukamiláz génje.
25. A 23. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fonalas gomba egy Aspergillus- (kannapenész-) faj.
26. A 25. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az Aspergillus-faj az A. n iger vagy A. awamori.
27. A 26. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kívánt fehérje génje a marha-kimozint vagy annak valamely prekurzor alakját kódolja.
28. A 26. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a DNS-szerkezet egy markért is hordoz és az eljárás magában foglalja a markért hordozó gazdaszervezetek szelektív körülmények között történő tenyésztését is.