CN114507631B - 一种降解尿酸的工程益生菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种降解尿酸的工程益生菌及其构建方法和应用，属于生物技术领域。本发明以益生菌Escherichia coli Nissle 1917作为原始出发菌株，通过基因工程技术在其基因组上导入外源基因进行改造，从而使其能够高效快速的降解尿酸，并且经试验证明，其同时能够在小鼠的肠道和血液中实现尿酸的快速降解，相比目前市面上存在的降解尿酸的乳酸菌，本发明构建的工程益生菌降解能力更强，治疗效果更好，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种降解尿酸的工程益生菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种降解尿酸的工程益生菌及其构建方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
尿酸，是一个咪唑环以及一个嘧啶环构成的杂环类化合物，是嘌呤代谢的一类中间产物。人类和灵长类动物体内缺乏代谢尿酸的尿酸氧化酶，所以尿酸只能作为嘌呤代谢的最终代谢产物被排出体外。而若体内的尿酸代谢失调，就会造成痛风。痛风，是一种比较常见的关节性炎症。当血尿酸浓度超过尿酸盐的溶解饱和度，使得尿酸盐在关节处析出，进而就会引发炎症。临床研究发现，肾病、心血管疾病以及糖尿病都和痛风有着密切的联系。随着生活水平的不断提高，痛风的发病率较之前有着明显的提高，而痛风的前期症状——高尿酸血症患病人数已达13.3％。目前，针对痛风和高尿酸血症的治疗主要有两种：一种是低嘌呤饮食，保证每日的嘌呤摄入量不能超过400mg；另一种是通过药物控制血尿酸浓度，例如别嘌呤醇，能够通过抑制黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenase)的活性抑制尿酸的生成。但是，目前的两种方法都存在各自的弊端，同时，对于痛风的治疗效果也相对有限。
人体内多余的尿酸主要通过两种方式排出，约有2/3通过肾脏排出，体内1/3的尿酸通过肠道排出。同时，切除肾脏的小鼠血尿酸浓度并没有明显的提高，并且肠道上一类转运蛋白：ABCG2，能将尿酸运送到肠道内，并且这类蛋白的活性对血尿酸浓度有着非常重要的影响。由此可见，肠道的尿酸代谢是一类非常重要的途径。人体的肠道中含有丰富的肠道菌群，早期的研究也通过同位素标记的方法，在人体内检测到了尿囊素、尿囊酸、CO2等尿酸代谢产物的存在，但是人体内缺乏尿酸氧化酶(urate oxidase)，不能将尿酸进一步代谢，所以可能是肠道菌群对尿酸进行了进一步代谢。并且人的肠道中并非传统认知的完全厌氧的环境，而是氧气浓度呈现梯度分布，距离小肠绒毛越近的地方，氧气浓度会越高，大约从40mmHg下降到<1％mmHg。
目前，已经有人通过口服乳酸菌、双歧杆菌等益生菌，检测到了血尿酸浓度有着一定程度的减少，但是减少的程度有限。而通过合成生物学的方法对肠道菌群进行改造逐渐成为医学研究的一类重要领域。Escherichia coli Nissle 1917也是一种益生菌，自1917年就一直被人类广泛应用于处理肠胃炎等肠胃问题。由于Nissle 1917不会破坏肠道菌群的结构，同时其也能够在肠道中快速定植，所以目前被作为工程治疗的一类重要菌株。有人通过Escherichia coli Nissle 1917构建工程菌，有效地代谢苯丙氨酸，并通过向小鼠以及猴子饲喂来缓解苯丙酮尿症，其中有一类重要的酶LAAD活性需要氧气，同时也在肠道中成功表达。说明构建的工程益生菌用于维持血尿酸浓度是有希望的，但是发明人发现，降解尿酸的重组益生菌目前尚缺乏相关应用。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供一种降解尿酸的工程益生菌及其构建方法和应用。本发明以益生菌Escherichia coli Nissle 1917作为原始出发菌株，通过基因工程技术在其基因组上导入外源基因进行改造，从而使其能够高效快速的降解尿酸，并且经试验证明，其同时能够在小鼠的肠道和血液中实现尿酸的快速降解，因此具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种降解尿酸的工程益生菌，其为大肠杆菌衍生菌，在基因组上整合外源尿酸氧化酶基因、尿酸转运蛋白基因、血红蛋白基因以及过氧化氢酶基因中的任意一种或多种。
其中，所述大肠杆菌衍生菌具体为大肠杆菌Nissle 1917的衍生菌；
所述尿酸氧化酶基因具体为PucLM和PucM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；二者共同作用，在本发明中，命名为PucLMM。
所述尿酸转运蛋白基因具体为YgfU，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述血红蛋白基因基因具体为Vhb，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述过氧化氢酶基因具体为KatG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的第二个方面，提供上述降解尿酸的工程益生菌的构建方法，所述构建方法包括：将上述外源尿酸氧化酶基因、尿酸转运蛋白基因、血红蛋白基因以及过氧化氢酶基因中的任意一种或多种导入大肠杆菌中获得。
本发明的第三个方面，提供上述工程益生菌在降解尿酸中的应用。
经试验证明，本发明的上述工程益生菌在氧气充足和欠氧(如氧气受限的肠道)环境中均表现出优异的降解尿酸性能，因此可作为尿酸过高引发的相关疾病(如痛风和高尿酸血症等)的治疗药物。
因此，本发明的第四个方面，提供一种药物，所述药物其活性成分包括上述工程益生菌。所述药物可用于治疗因尿酸过高引发的相关疾病(如痛风和高尿酸血症等)，与现有技术相比，其降解尿酸能力更强，治疗效果更佳。
其中，所述药物还可以包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
本发明的第五个方面，提供一种治疗尿酸过高相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的上述工程益生菌和/或药物。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：
上述技术方案是大肠杆菌Nissle 1917为出发菌株，通过基因工程技术导入外源基因包括尿酸氧化酶基因、尿酸转运蛋白基因、血红蛋白基因以及过氧化氢酶基因，从而构建得到一种能够高效降解尿酸的工程益生菌。相比目前市面上存在的降解尿酸的乳酸菌，本发明构建的工程益生菌降解能力更强，治疗效果更好，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明中用于高尿酸血症治疗的工程化EcN菌株示意图；
图2为本发明中构建的工程菌尿酸降解途径的优化；(A-B)在不同启动子的控制下，使用在不同质粒中表达PucLT的工程化EcN的粗酶(A)或全细胞(B)降解尿酸。(C)EcN全细胞与PucL、PucLT和PucLM降解尿酸。(D)EcN全细胞通过共表达ygfU降解尿酸。降解曲线在HEPES缓冲液(pH＝7.0)中测定，OD600＝1.0用于全细胞或用0.8mg/mL的蛋白质进行酶测定。以规定的时间间隔测定这些全细胞或粗酶的尿酸降解能力。执行三个平行实验以获得平均值并计算STDEV。单因素方差分析方法用于计算p值。计算Q值以获得错误发现率(FDR)。Q<0.05，“*”被标记，Q<0.01，“**”被标记，Q<0.001，“***”被标记。在四个小图中，仅显示了代表最快尿酸降解率的两组平均数据之间的Q值。
图3为本发明中构建的工程菌中VHb和KatG促进了重组EcN菌株在正常氧气或低氧条件下的尿酸降解；(A)EcN菌株在正常氧气条件下对尿酸的降解。正常氧条件下的尿酸降解是在摇瓶中进行的。还检测了ROS水平(B)和DO水平(C)。执行三个平行实验以获得平均值和STDEV。(D)EcN菌株在缺氧条件下降解尿酸，其中DO为培养基中正常氧含量的15％。缺氧条件下的尿酸降解在具有受控DO的生物反应器中进行。菌株在OD600＝1.0时被培养、诱导并重悬于HEPES缓冲液(50mM，pH＝7.0)中。测定了全细胞对尿酸的降解。对于生物反应器实验，误差条是根据三个不同批次的数据计算得出的。使用学生t检验方法计算尿酸降解曲线的p值。p<0.05，“*”标记；p<0.01,标记“**”；p<0.001，标记“***”；p<0.0001，标记“****”。
图4为本发明中构建的工程益生菌重组EcN菌株在小鼠空肠中降解尿酸。；在试验组中，优化后的工程化EcN菌株首先口服给药于小鼠(n＝6)。1小时后，将尿酸口服给予这些小鼠。阳性对照组仅口服尿酸。在阴性对照组中，尿酸和EcN均未使用。再过一小时，测量胃(A)、十二指肠(B)和空肠(C)中的尿酸水平。执行六个平行实验以获得平均值并计算STDEV。采用单因素方差分析法计算p值。计算Q值得到FDR。Q>0.05，“NS”标记；Q<0.0001，“****”标记。
图5为本发明中使用工程化EcN菌株通过口服给药对尿酸注射高尿酸血症小鼠的治疗效果；(A)静脉注射尿酸后小鼠血清尿酸浓度。它被命名为尿酸注入组。(B-D)2×1010CFU的指定工程EcN菌株含有或不含有vhb和katG的尿酸降解基因，每天一次口服给药，持续5天。然后在最后一次灌胃EcN菌株后1小时静脉注射尿酸。测定血清尿酸浓度(B-C)。测定H2O2的血清浓度(D)。执行六个平行实验以获得平均值并计算STDEV。在图B中，使用单因素ANOVA方法计算p值。计算Q值以获得FDR。Q>0.05，“ns”标记Q<0.0001，“****”标记。仅显示了代表最快尿酸降解率的两组平均数据之间的Q值。在小图C&D中，学生的t检验方法用于计算p值。p>0.05，“ns”标记；p<0.05，“*”标记；p<0.01，“**”标记；p<0.001，“***”标记。
图6为本发明中使用工程化EcN菌株在缓冲液、血清和小鼠血液样本中降解尿酸；(A)工程化EcN菌株在HEPES缓冲液(50mM,pH＝7.0)中降解尿酸。(B)小鼠血清中工程化EcN菌株对尿酸的降解。(C)工程化EcN菌株在幼鼠(6周龄，混合血样＝6)混合血中的降解能力，(D)工程化EcN菌株在老年小鼠(12周龄，混合血样＝6)混合血中的降解能力。添加指定的工程化EcN菌株以降解样品中的尿酸，然后分几轮添加尿酸。执行三个平行实验以获得平均值并计算STDEV。
图7为本发明中工程化EcN菌株通过静脉给药对注射尿酸的高尿酸血症小鼠的治疗效果。注射指定数量的工程化EcN菌株，然后使用尿酸注射法诱导小鼠的高尿酸血症。在规定时间间隔(A，D&E)检测不同组的血尿酸水平。还测定了血清中的H2O2的浓度(F)。注射工程菌株和注射尿酸之间间隔为0h(A)或10h(B、E&F)。(C)给出了注射两种不同数量的工程化EcN菌株的两组小鼠的存活曲线。(D)注射5×108CFU工程化EcN菌株或相同体积盐水(对照)的两组小鼠的体重。执行六个平行实验以获得平均值并计算STDEV。对于图A&B中的数据，使用单向方差分析方法计算p值。计算Q值以获得FDR。Q<0.05，“*”标记；Q<0.01，“**”标记；Q<0.001，“***”标记；Q<0.0001，“****”标记。对于图E&F中的数据，使用学生t检验方法计算p值。p>0.05，“ns”标记；p<0.05，“*”标记；p<0.01，“**”标记；p<0.001，“***”标记。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种降解尿酸的工程益生菌，其为大肠杆菌衍生菌，在基因组上整合外源尿酸氧化酶基因、尿酸转运蛋白基因、血红蛋白基因以及过氧化氢酶基因中的任意一种或多种。
其中，所述大肠杆菌衍生菌具体为大肠杆菌Nissle 1917的衍生菌；
所述尿酸氧化酶基因具体为PucLM和PucM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；二者共同作用，在本发明中，将二者统一命名为PucLMM。
所述尿酸转运蛋白基因具体为YgfU，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述血红蛋白基因基因具体为Vhb，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述过氧化氢酶基因具体为KatG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述工程益生菌的基因型为EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-vhb-ygfU-katG。
本发明的又一具体实施方式中，，提供上述降解尿酸的工程益生菌的构建方法，所述构建方法包括：将上述外源尿酸氧化酶基因、尿酸转运蛋白基因、血红蛋白基因以及过氧化氢酶基因中的任意一种或多种导入大肠杆菌中获得。
具体的，所述构建方法包括：构建重组表达载体，将重组表达载体转入大肠杆菌Nissle 1917中表达；
其中，所述重组表达载体通过上述基因中的任意一种或多种有效地连接到表达载体中获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体可包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体(BAC)、噬菌体P1衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)；优选为细菌质粒，在本发明的一个具体实施方式中，所述细菌质粒为pBBR1MCS-2；
所述尿酸氧化酶基因具体为PucLM和PucM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；二者共同作用，在本发明中，将二者统一命名为PucLMM。
所述尿酸转运蛋白基因具体为YgfU，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述血红蛋白基因基因具体为Vhb，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述过氧化氢酶基因具体为KatG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步的，使用Ptrc启动子表达上述基因，在本发明的一个具体实施方式中，所述重组表达载体可以为：pBBR1MCS-2-Ptrc-pucLM-pucM-ygfU-vhb-katG(序列如SEQ ID NO.6所示)。
转入方法包括生物学上可接受的直接转化法(包括基因枪法、电击法、超声波法、显微注射法、PEG法)或者间接转化法(包括DNA病毒载体介导法、农杆菌介导法)，优选的，利用电击法进行，在本发明的一个具体实施方式中，使用2.5kV脉冲用电击转化的方式转入宿主菌中。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述工程益生菌在降解尿酸中的应用。
经试验证明，本发明的上述工程益生菌在氧气充足和欠氧(如氧气受限的肠道)环境中均表现出优异的降解尿酸性能，因此可作为尿酸过高引发的相关疾病(如痛风和高尿酸血症等)的治疗药物。
因此，本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物，所述药物其活性成分包括上述工程益生菌。所述药物可用于治疗因尿酸过高引发的相关疾病(如痛风和高尿酸血症等)，与现有技术相比，其降解尿酸能力更强，治疗效果更佳。
其中，所述药物还可以包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物包含一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。所用辅料可为固态或液态。固态形式的制剂包括粉剂、片剂、分散颗粒、胶囊、药丸及栓剂。粉剂及片剂可包含约0.1％至约99.9％的活性成分。适当的固体辅料可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或者乳糖。片剂、粉剂、药丸及胶囊为适于口服用的固态剂型。液态形式的制剂包括溶液、悬浮液及乳液，其实施例为非经肠注射用水溶液或水-丙二醇溶液，或添加甜味剂及造影剂的口服溶液。此外，还可制成注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。同时，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。经本发明小鼠实验证明，无论采用静脉注射还是灌胃的方式，均可快速有效地降解尿酸。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物为片剂、分散片、肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗尿酸过高相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的上述工程益生菌和/或药物。
所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。所述“治疗有效量”是指包括本发明工程益生菌或药物的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。
必须认识到，本发明所述活性成分的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。
为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例
实验方法：
一、基因的获取
Bacillus subtilis中的pucL(Gene ID：936669)和pucM(Gene ID：937977)基因由华大基因公司(BGI，北京)合成并进行密码子优化，随后将PucL的214位的天冬氨酸(Asp)突变成缬氨酸(Val)，将438位的谷氨酰胺(Gln)突变为精氨酸(Arg)。突变后pucL被命名为pucLM，pucLM由华大基因公司(BGI，北京)合成并进行密码子优化。Vitreoscilla sp.C1中的vhb基因(Protein ID:WP_019959060.1)同样由华大基因公司(BGI，北京)合成并进行密码子优化。ygfU(Gene ID：949017)和katG(Gene ID：948431)基因从Escherichia coliMG1655基因组DNA中进行PCR扩增。
二、菌株和载体
质粒的构建采用大肠杆菌(Escherichia coli XL1-Blue MRF’)为宿主菌，选择pBBR1MCS-2质粒作为载体，以Ptrc启动子表达pucLM、pucM、ygfU、vhb、katG基因。随后将质粒pBBR1MCS-2-Ptrc-pucLM-pucM-ygfU-vhb-katG使用Eppendorf EporatorTM(BIO-RAD,Irvine,USA)使用2.5-kV脉冲用电转化的方式转入Escherichia coli Nissle 1917。
全质粒序列如SEQ ID NO.6所示。
三、试剂、酶及相关试剂盒：
抗生素(硫酸卡那霉素)购自于上海生工有限公司。
各种化学试剂均为分析纯，购自于上海Sigma公司。
各种限制性内切酶和DNA连接酶购自于Thermo公司。
DNA marker购自于北京TransGen公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自于Omega公司。
四、菌体生长情况的检测
采用UV-可见分光光度计(UV-1800，Shimadzu，日本)直接测定600nm处的吸光度。
五、工程菌的培养、诱导、收集与保存
将重组菌株接种在300ml三角瓶中，其中添加50mL新鲜的LB培养基，其中加入50μg/ml的硫酸卡那霉素，在37℃下振荡(200rpm)过夜。第二天，将生长好的工程菌接种在2L三角瓶中。其中添加500mL新鲜的LB培养基，起始接种OD600为0.05。在37℃下振荡(200rpm)。直到菌体培养物的OD600达到～0.6，加入2mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，工程化菌株在30℃下振荡(140rpm)进一步培养24小时。诱导后，通过在4℃下以6000rpm离心10分钟收集菌株，并用配制磷酸盐缓冲液(2.28g/L的KH2PO4，14.5g/L K2HPO4，15％甘油，pH7.5)洗涤1次，然后将菌株在配制缓冲液中以5×1010CFU/ml浓缩，并在-80℃下储存直至分析当天。
六、尿酸测定方法
四种方法用于确定不同情况下的尿酸浓度。
(1)在缓冲液中检测定尿酸用分光光度计测定，直接测量293nm处的吸光度。首先配制0、10μM、15μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM的尿酸标准液，绘制尿酸浓度标准曲线，得到曲线R2为0.9997。随后测定时进行适当的稀释，测定尿酸浓度。
(2)当在复合培养基中测定尿酸及其降解产物(S)-尿囊素时，采用HPLC方法。简而言之，使用C18反相HPLC柱(ODS-A，250×4.6×4.6mm，YMC)。流动相选用溶剂A(2.5mMNH4H2PO4用磷酸缓冲至pH 3.5)和溶剂B(5％溶剂A和95％甲醇)。首先用100％溶剂A和0％溶剂B预平衡C18柱。用以下梯度的溶剂B洗脱柱子：从0到3.5分钟使用0％；从3.5到11.5分钟使用40％–80％；从11.5到15.3分钟使用80％–100％；从15.3到18分钟使用100％-0％；从18到22分钟使用0％。流速为1.0mL/min。通过使用具有二极管阵列检测器(SPD-20A，Shimadzu，日本)的HPLC装置(LC-20AT，Shimadzu，日本)进行检测尿酸和尿囊素。检测吸光度为205nm。正常情况下，3.2min左右出现尿囊素吸收峰,9.8min左右出现尿酸吸收峰。配制100μM、200μM、500μM、750μM、1000μM、1500μM尿酸标准液，，以HPLC峰面积绘制尿酸标准曲线，标准曲线R2为0.9973；配制10μM、20μM、50μM、100μM、200μM、500μM、750μM、1000μM尿囊素标准液，以HPLC峰面积绘制尿囊素标准曲线，标准曲线R2为0.9999。
(3)血样中低浓度尿酸(小于等于180μM)测定时，使用尿酸检测试剂盒(Solarbio，北京)进行测定，具体操作方法参照使用说明书。
(4)当血样中尿酸浓度高于180μM时，使用尿酸仪PD-G001-3-P(BeneCheck，北京，中国)，操作简单，样品量小(<5μL)，操作方法参照说明书。
七、有氧条件下尿酸的检测
将重组菌株接种在300mL三角瓶中，其中添加50mL新鲜的LB培养基，其中加入50μg/ml的硫酸卡那霉素，起始接种OD600为0.05，在37℃下振荡(200rpm)。直到菌株培养物的OD600达到～0.6，加入2mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，菌株在30℃下振荡(200rpm)进一步培养24小时。4℃下以6000rpm离心10分钟收集菌株，在HEPES(pH7.0，50mM)缓冲液中洗涤一次。控制诱导后的工程菌的OD600为1.0。将20mL重悬的诱导后的工程菌直接转移到50mL离心管中。加入1mM的尿酸以引发反应，将试管在37℃下摇动(200rpm)孵育60分钟。每隔15分钟取样一次。13000rpm离心3min后，用分光光度法测定上清液中UA的浓度。
八、氧气受限条件下尿酸的检测
以与有氧条件下制备全菌株相同的方式培养和收获重组菌株。将整个菌株重新悬浮在20mL脑心浸液肉汤(HB8297-1，Hopebio)中。在1.4-L Multifors平行生物反应器(Infors HT,US)中加入700mL的脑心浸液肉汤，连同发酵罐进行高压灭菌。添加工程菌之前10mL胎牛血清(04-121-1A，Biological Industries)作为补充营养素添加到生物反应器中，随后添加2.0mM IPTG和50μg/mL卡那霉素，最后接种确定体积的EcN工程菌，控制初始OD600＝1.0。菌株再生长1小时，待其DO等于正常条件的15％。富营养脑心浸液肉汤和低氧均用于模拟肠道环境。在这种限氧条件下，将1mM的尿酸添加到生物反应器中以启动尿酸代谢。在规定的时间间隔取样。离心后取上清液10μL，采用HPLC法测定UA和尿囊素。
九、工程化EcN菌株在缓冲液、小鼠血清中的尿酸降解能力测定
缓冲液中：向HEPES缓冲液(50mM，pH 7.0)中加入工程化EcN菌株，调整全细胞的菌落数为1×109CFU/mL、1×108CFU/mL以及1×107CFU/mL。添加一定量的尿酸溶液，至体系尿酸的终浓度为500μM。37℃条件下反应一定时间，每隔一定时间取样，测定2小时内尿酸的变化情况。
小鼠血清中：(1)4—6周龄小鼠的用血清购买自YZYBIO生物技术公司(中国，河南)，向小鼠血清中加入工程化EcN菌株，调整全细胞的菌落数为1×109CFU/mL、1×108CFU/mL以及1×107CFU/mL。添加一定量的尿酸溶液，至体系尿酸的终浓度达到650μM。37℃条件下反应一定时间，每隔一定时间取样，测定2小时内尿酸的变化情况。
(2)取6周龄和12周龄小鼠的血清，添加尿酸模拟人体内尿酸浓度，添加1×108CFU/mL的工程化EcN菌株，37℃条件下反应一定时间，每隔一定时间取样，测定一段时间内尿酸的变化情况，待尿酸完全降解后，添加一定量的尿酸继续测定，以此重复两次。
十、小鼠饲养
选用的小鼠为五周龄的雄性昆明小鼠，体重约为20±2g。小鼠从河南思贝生物科技公司购买。将小鼠饲养在湿度为65％和24小时明暗循环的房间中(22±2℃)。给小鼠喂食标准饮食。在进行实验之前，首先让老鼠习惯一周，并且保证在实验开始时，小鼠的健康状况良好。后续实验中将小鼠随机分组(n＝6)。所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南(NIH出版物第8023号，1978年修订)，并经过山东大学动物伦理委员会批准。
十一、小鼠肠道中工程菌尿酸降解能力的检测
将18只6周龄的雄性昆明小鼠分为三组(n＝6)。试验组(test group)灌胃200μL的工程化EcN菌株(5×1010CFU/mL)。阳性对照组(model group)和阴性对照组(controlgroup)均灌胃等体积的磷酸盐缓冲液(2.28g/L的KH2PO4，14.5g/L K2HPO4，15％甘油，pH7.5)。1小时后，对试验组和阳性对照组小鼠灌胃1mL的20mM UA。阴性对照组小鼠给予等量生理盐水。30分钟后，使用乙醚麻醉，将小鼠处死。收集胃、十二指肠、空肠等小肠组织，取出的不同器官迅速在液氮中冷冻并储存在-80℃以供进一步分析。
将取得的三组的胃、十二指肠、空肠和回肠组织进行切割、称重。控制组织重量在0.1g左右，添加1mL PBS缓冲液(pH7.4)，并使用匀浆器(Tissueprep TP-24,Gering，北京，中国)进行组织匀浆，匀浆速度为4，时间5min。匀浆结束后，将裂解混合物离心(10分钟，10000rpm，4℃)。测定前将裂解混合物放置4℃待用，取上清液测定尿酸浓度，测定方法选用尿酸检测试剂盒。同时取上清液测定蛋白质浓度，测定方式选用微量分光光度计(KaiaoTech，Beijing，China)检测的OD280。测定结束后，按照尿酸/蛋白浓度换算肠道中的尿酸水平。
十二、新的构建小鼠高尿酸血症的方法
将12只6周龄雄性昆明小鼠分为三组(n＝6)。测试组尾静脉注射70mg/kg的尿酸溶液。尿酸注射液分别用于促进达到人的生理相关的血尿酸浓度(SUA)水平。对照组仅静脉注射生理盐水。尿酸浓度使用尿酸计进行测定。在规定的时间间隔从小鼠尾巴采集的血样测定。
十三、新的小鼠高尿酸血症方法下工程菌尿酸降解能力的测定
工程化的EcN菌株用于通过胃内或静脉内给药来治疗高尿酸血症小鼠。
(1)灌胃治疗，将18只6周龄雄性昆明小鼠分为三组：两个试验组和对照组(UA-injection group)。将确定量的工程化EcN菌株和具有空载体的EcN菌株灌胃给两个测试组的小鼠。对照组小鼠则灌胃等量的甘油-磷酸盐缓冲液。三组小鼠均静脉注射70mg/kg的UA溶液。灌胃组小鼠连续5天口服2×1010CFU两株EcN工程菌株，第5天最后一次细菌给药后1小时静脉注射UA溶液。
(2)静脉治疗。将18只6周雄性昆明小鼠分为三组：两个试验组和对照组(UA-injection group)。将确定量的工程化EcN菌株和具有空载体的EcN菌株注射给两个测试组的小鼠。对照组小鼠注射等量的甘油-磷酸盐缓冲液。静脉注射EcN的小鼠首先接受细菌注射，然后在细菌注射后10小时将尿酸溶液注射到小鼠体内。
以上两种处理方法，尿酸浓度是用尿酸计从小鼠尾巴的血液样本中以规定的时间间隔测定。
实验结果
一、在EcN中构建尿酸代谢途径
PucL的UriC结构域(PucLT)催化尿酸降解中的步骤1(图1)，步骤2和步骤3可以自发发生。在PucLT密码子优化后，测试了pBBR1MCS-2和pCL1920两个质粒和Ptrc和Plac两个启动子表达PucLT的能力。pBBR1MCS-2质粒骨架下Ptrc启动子控制编码pucLT基因的菌株EcN::pMCS2-Ptrc-pucLT其细胞提取物具有最高的尿酸降解能力(图2A)；然而在全细胞的测定中并未体现出相同的结果(图2B)
随后我们对完整的PucL和PucM进行了密码子优化，得到了菌株EcN::pMCS2-Ptrc-pucLM。进一步比较了EcN::pMCS2-Ptrc-pucLM和EcN::pMCS2-Ptrc-pucLT的尿酸降解能力，对于两个菌株的细胞提取物而言，两种系统的Vmax相似，但PucLM的Km大大降低(表1)，说明具有全通路的细胞可以在低浓度下有效利用尿酸。实际上，全细胞的尿酸降解能力大大增加(图2C)。PucLT的活性可以通过D44V和Q268R突变来提高，我们直接将完整的PucL(PucLM)中的两个位点直接突变，并在EcN(EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM)中与PucM共表达。使用细胞提取物测定，PucLMM的Vmax比PucLM增加了约1.8倍。然而，PucLMM的Km也增加了约2.0倍(表1)。由于Km的增加，当尿酸的浓度较低时，EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM全细胞的尿酸降解能力也有所减弱(图2C)。
表1
当大肠杆菌的尿酸转运蛋白YgfU与PucLMM共表达时，EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-ygfU整个细胞的尿酸降解能力提升(图2D)。出乎意料的是，YgfU的过表达大大减弱了EcN::pMCS2-Ptrc-pucLM-ygfU的降解能力(图2D)。因此，使用最快的UA降解菌株EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-ygfU进行下一步优化。
二、工程菌株在低氧或者缺氧条件下的尿酸降解能力以及降低氧化压力水平
编码大肠杆菌过氧化氢酶的katG基因用于将PucL产生的H2O2转化成O2，并使用了来自Vitreoscilla sp.C1的细菌血红蛋白Vhb。应用其以允许工程菌株在低O2水平下降解尿酸。因此，构建的EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-vhb-ygfU-katG在同一个菌中产生PucLMM、Vhb、YgfU和KatG。EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-vhb-ygfU-katG降解尿酸的速率比EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-ygfU在正常氧气条件下的降解速率稍慢(图3A)。但产生的ROS较少(图3B)。正如预期的那样，KatG和Vhb的存在也恢复了该系统中的氧气(图3C)。当培养基中的溶解氧被限制在正常溶解氧条件的15％左右时，菌株EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-vhb-ygfU-katG可以在短时间内降解更多的尿酸(图3D)。该修饰步骤促进了氧气的利用，并减轻了尿酸降解过程中副产物可能造成的损害。
三、EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-vhb-ygfU-katG定殖肠道中降低高尿酸血症小鼠血清中的尿酸水平
为了验证我们的工程菌株在肠道中是否能有效的降解尿酸，实验组灌胃尿酸和诱导后的工程EcN菌株，模型组仅灌胃尿酸，对照组灌胃生理盐水。30min后，实验组的胃和十二指肠中尿酸浓度三组间差异无统计学意义(图4A&B)，但模型组空肠尿酸水平远高于实验组和对照组(图4C)。
为了将小鼠的血清尿酸增加到与人类相当的水平，将尿酸溶液以70mg/kg的剂量注射到血管中。血清尿酸被提升至～1mM，并且浓度随着时间的推移逐渐降低(图5A)。这种处理下小鼠并不会死亡。这种方法被称为UA注入法。
EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-vhb-ygfU-katG用于治疗注射尿酸的高尿酸血症小鼠。向小鼠中灌胃工程化EcN菌株，相比灌胃含空质粒的EcN菌株和尿酸注射对照组，口服1×1011CFU含有尿酸降解基因的EcN菌株的小鼠组血尿酸水平明显下降(图5B)，我们还用EcN::pucLMM-vhb-ygfU-katG和EcN::pucLMM-ygfU在小鼠中测试了VHb和KatG的效果。证实了EcN中vhb和katG的过表达加速了尿酸注射高尿酸血症小鼠的尿酸降解和H2O2去除率(图5C&D)。
四、静脉注射EcN::pMCS2-Ptrc-pucLMM-vhb-ygfU-katG可缓解试验小鼠的高尿酸血症
EcN细胞已被静脉注射以治疗肿瘤。测试了将EcN::pucLMM-vhb-ygfU-katG细胞注射到血液中是否可以治疗高尿酸血症。首先，在HEPES缓冲液(pH＝7.0)(对照)和商业小鼠血清中加入尿酸(图6A&B)，诱导细胞快速降解。其次，将小鼠的全血样本按年龄分为两组：年轻组(6周龄)和老年组(12周龄)，并添加规定浓度的尿酸。当添加EcN::pucLMM-vhb-ygfU-katG细胞(1x108CFU/mL)时，它们在两组中都迅速降解了尿酸(图6C&D)。在全血样本中反复添加320μM尿酸，尿酸降解速率没有改变(图6C&D)。
第三，将100μL的5×108CFU和1×109CFU的诱导细胞同时释放到注射的高尿酸血症小鼠体内。治疗组的血尿酸水平比未治疗组下降的更快(图7A)。更多工程化的EcN提供了更快的尿酸降解(图7A)。然而，1×109CFU细胞不适合治疗高尿酸血症，因为注射高剂量的EcN细胞会增加小鼠24h内的死亡率(图7C)。100μL注射5×108CFU细胞的小鼠状况良好，没有小鼠死亡，即使在喂养7天后体重也没有下降(图7C&D)。第四，将5×108CFU工程化EcN菌株注射到小鼠静脉10h后，再以70mg/kg的剂量将尿酸溶液注入血管，诱发高尿酸血症。与没有EcN菌株的对照组相比，注射组的尿酸水平下降的更快(图7B)。第五，注射含有vhb和katG基因的EcN菌株也有助于菌株降解尿酸，同时比注射不含有含有vhb和katG基因的EcN菌株更快的去除H2O2(图7E&F)。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
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<120> 一种降解尿酸的工程益生菌及其构建方法和应用
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ctggcgagca ccgtgtttca tgaactggaa accccgagca ttcagaacct gatttatcat 1260
attggctgcc gcattctggc ccgctttccg cagttaaccg atgtgagctt tcgcagccag 1320
aaccatacct gggataccgt ggtggaagaa attccgggca gcaaaggcaa agtgtatacc 1380
gaaccgcgcc cgccgtatgg ctttcagcat tttaccgtga cccgcgaaga tgcggaaaaa 1440
gaaaaacaga aagcggcgga aaaatgccgc agcctgaaag cgtaa 1485
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<212> DNA
<213> pucM
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atgggcaaac tgaccaccca tattctggat ctgacctgcg gcaaaccggc ggcgaatgtg 60
aaaattggcc tgaaacgcct gggcgaaagc attatgaaag aagtgtatac caacaacgac 120
ggccgcgtgg atgtgccgtt actggcgggt gaagaattaa tgagcggcga atatgtgatg 180
gaatttcatg cgggcgatta ttttgcgagc aaaaacatga acgcggcgga tcagccgttt 240
ctgaccattg tgaccgtgcg ctttcagctg gcggatccgg atgcgcatta tcatattccg 300
ctgctgctga gcccgtttgg ctatcaggtg tatcgcggca gctaa 345
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<212> DNA
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atgagcgcca tagattccca acttccctca tcttctgggc aagaccgccc aactgatgag 60
gttgaccgca tattatcacc aggaaagctg atcatactcg gtctgcaaca cgtccttgtc 120
atgtacgcag gtgcagtcgc tgttcctctt atgattggtg accgactggg cctctcaaaa 180
gaagctattg cgatgctcat tagctcggat ctcttttgct gcgggatcgt cacattattg 240
caatgtatcg gtatcggccg ctttatgggg atccgcctgc cggtgattat gtcggtgacc 300
tttgctgctg taacaccaat gatagccatt gggatgaacc cggatatcgg cctgctgggg 360
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ttctttaatg gctatcagca tcatgctgac ctggtgaagg aatccgtctc tgataaagat 1380
ttaaaagtca ggacagtacg tatgtggctt ctgatgcgca agctgaagaa aaatgagcat 1440
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<212> DNA
<213> vhb
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atgctggatc agcagaccat taacattatt aaagccaccg ttccggttct gaaagaacac 60
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<212> DNA
<213> katG
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atgagcacgt cagacgatat ccataacacc acagccactg gcaaatgccc gttccatcag 60
ggcggtcacg accagagtgc gggggcgggc acaaccactc gcgactggtg gccaaatcaa 120
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gactaccgca aagaattcag caaattagat tactacggcc tgaaaaaaga tctgaaagcc 240
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tctagagatt aaagaggaga atactagatg ctggatcagc agaccattaa cattattaaa 60
gccaccgttc cggttctgaa agaacacggc gttaccatta ccaccacctt ttataaaaat 120
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gagcatggag aataactaga gaaagaggag aaatactaga tgagcacgtc agacgatatc 1980
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gaaatgactg cgctggtggg cggcatgcgt gtactgggtg gcaacttcga tggcagcaaa 3840
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acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc cgtttgtgat 8640
ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt ttttatgcat gcgccgacac 8700
catcgaatgg tgcaaaacct ttcgcggtat ggcatgatag cgcccggaag agagtcaatt 8760
cagggtggtg aatgtgaaac cagtaacgtt atacgatgtc gcagagtatg ccggtgtctc 8820
ttatcagacc gtttcccgcg tggtgaacca ggccagccac gtttctgcga aaacgcggga 8880
aaaagtggaa gcggcgatgg cggagctgaa ttacattccc aaccgcgtgg cacaacaact 8940
ggcgggcaaa cagtcgttgc tgattggcgt tgccacctcc agtctggccc tgcacgcgcc 9000
gtcgcaaatt gtcgcggcga ttaaatctcg cgccgatcaa ctgggtgcca gcgtggtggt 9060
gtcgatggta gaacgaagcg gcgtcgaagc ctgtaaagcg gcggtgcaca atcttctcgc 9120
gcaacgcgtc agtgggctga tcattaacta tccgctggat gaccaggatg ccattgctgt 9180
ggaagctgcc tgcactaatg ttccggcgtt atttcttgat gtctctgacc agacacccat 9240
caacagtatt attttctccc atgaagacgg tacgcgactg ggcgtggagc atctggtcgc 9300
attgggtcac cagcaaatcg cgctgttagc gggcccatta agttctgtct cggcgcgtct 9360
gcgtctggct ggctggcata aatatctcac tcgcaatcaa attcagccga tagcggaacg 9420
ggaaggcgac tggagtgcca tgtccggttt tcaacaaacc atgcaaatgc tgaatgaggg 9480
catcgttccc actgcgatgc tggttgccaa cgatcagatg gcgctgggcg caatgcgcgc 9540
cattaccgag tccgggctgc gcgttggtgc ggatatctcg gtagtgggat acgacgatac 9600
cgaagacagc tcatgttata tcccgccgtc aaccaccatc aaacaggatt ttcgcctgct 9660
ggggcaaacc agcgtggacc gcttgctgca actctctcag ggccaggcgg tgaagggcaa 9720
tcagctgttg cccgtctcac tggtgaaaag aaaaaccacc ctggcgccca atacgcaaac 9780
cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact 9840
ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gcgcgaattg atctggtttg 9900
acagcttatc atcgactgca cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag 9960
ctgtggtatg gctgtgcagg tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact 10020
cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa 10080
tgagctgttg acaattaatc atccggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca 10140
atttcacact ttaactttaa ggaggagata taccatgttt accatggatg atctgaacca 10200
gatggatacc cagaccctga ccgataccct gggcagcatt tttgaacata gcagctggat 10260
tgcggaacgc agcgcggcgt tacgtccttt tagcagcctg agcgatctgc atcgcaaaat 10320
gaccggcatt gtgaaagcgg cggatcgcga aacccagctg gatctgatta aaaagcatcc 10380
gcgcctgggc accaagaaaa ccatgagcga tgatagcgtg cgcgaacagc agaacgcggg 10440
cttaggcaaa ctggaacagc aggaatatga agaatttctg atgctgaacg aacattacta 10500
tgaccgcttt ggctttccgt ttattctggc ggtgaaaggc aaaaccaaac aggatattca 10560
tcaggcgctg ctggcccgcc tggaaagcga acgtgaaacc gaatttcagc aggcgctgat 10620
tgaaatttat cgcattgcgc gttttcgcct ggcggatatt attaccgaaa aaggcgaaac 10680
ccagatgaaa cgcaccatga gctatggcaa aggcaacgtg tttgcgtatc gcacctatct 10740
gaaaccgctg accggcgtga aacagattcc ggaaagcagc tttgcgggcc gcgataacac 10800
cgtggtgggc gttgttgtga cctgcgaaat tggcggcgaa gcgtttctgc cgagctttac 10860
cgatggcgat aacaccctgg tggtggcgac cgatagcatg aaaaacttta ttcagcgcca 10920
tctggcgagc tatgaaggca ccaccaccga aggctttctg cattatgtgg cgcatcgctt 10980
tctggatacc tatagccata tggataccat taccctgacc ggcgaagata ttccgtttga 11040
agcgatgccg gcgtatgaag aaaaagaact gagcaccagc cgcctggtgt ttcgccgctc 11100
acgtaatgaa cgtagccgta gcgttctgaa agcggaacgc agcggtaaca ccattaccat 11160
taccgaacag tatagcgaaa ttatggatct gcagctggtg aaagtgagcg gcaacagctt 11220
tgtgggcttt attcgcgatg aatataccac cctgccggaa gatggcaacc gcccgctgtt 11280
tgtgtatctg aacattagct ggcagtatga aaacaccaac gatagctatg cgagcgatcc 11340
ggcccgctat gtggcggcgg aacaagttcg tgatctggcg agcaccgtgt ttcatgaact 11400
ggaaaccccg agcattcaga acctgattta tcatattggc tgccgcattc tggcccgctt 11460
tccgcagtta accgatgtga gctttcgcag ccagaaccat acctgggata ccgtggtgga 11520
agaaattccg ggcagcaaag gcaaagtgta taccgaaccg cgcccgccgt atggctttca 11580
gcattttacc gtgacccgcg aagatgcgga aaaagaaaaa cagaaagcgg cggaaaaatg 11640
ccgcagcctg aaagcgtaat ttaactttaa ggaggagata taccatgggc aaactgacca 11700
cccatattct ggatctgacc tgcggcaaac cggcggcgaa tgtgaaaatt ggcctgaaac 11760
gcctgggcga aagcattatg aaagaagtgt ataccaacaa cgacggccgc gtggatgtgc 11820
cgttactggc gggtgaagaa ttaatgagcg gcgaatatgt gatggaattt catgcgggcg 11880
attattttgc gagcaaaaac atgaacgcgg cggatcagcc gtttctgacc attgtgaccg 11940
tgcgctttca gctggcggat ccggatgcgc attatcatat tccgctgctg ctgagcccgt 12000
ttggctatca ggtgtatcgc ggcagctaa 12029

Claims (10)

1.一种降解尿酸的工程益生菌，其特征在于，其为大肠杆菌衍生菌，在基因组上整合外源尿酸氧化酶基因、尿酸转运蛋白基因、血红蛋白基因以及过氧化氢酶基因；
所述大肠杆菌衍生菌为大肠杆菌Nissle1917的衍生菌；
所述尿酸氧化酶基因具体为PucLM和PucM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述尿酸转运蛋白基因具体为YgfU，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述血红蛋白基因具体为Vhb，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述过氧化氢酶基因具体为KatG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.权利要求1所述降解尿酸的工程益生菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将外源尿酸氧化酶基因、尿酸转运蛋白基因、血红蛋白基因以及过氧化氢酶基因导入大肠杆菌中获得。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：构建重组表达载体，将重组表达载体转入大肠杆菌Nissle1917中进行表达。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述重组表达载体通过上述四种基因有效地连接到表达载体中获得，所述表达载体为细菌质粒。
所述尿酸氧化酶基因具体为PucLM和PucM，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
所述尿酸转运蛋白基因具体为YgfU，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述血红蛋白基因具体为Vhb，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述过氧化氢酶基因具体为KatG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述细菌质粒为pBBR1MCS-2。
6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，使用Ptrc启动子表达上述四种基因。
7.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，转入方法为电击法。
8.权利要求1所述工程益生菌在降解尿酸中的应用。
9.一种药物，其特征在于，所述药物其活性成分包括权利要求1所述工程益生菌。
10.如权利要求9所述的一种药物，其特征在于，所述药物还包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
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