ES2676707T3 - Bacterias gram positivas modificadas y usos de las mismas - Google Patents

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Abstract

Una bacteria gram positiva seleccionada de una bacteria de ácido láctico y una Bifidobacteria, en la que dicha bacteria gram positiva carece de actividad de trehalosa-6-fosfato fosforilasa (TrePP) y actividad del componente IIC del sistema PTS específico a celobiosa (ptcC).

Description

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DESCRIPCIÓN
Bacterias gram positivas modificadas y usos de las mismas Campo de la invención
La presente invención se refiere a bacterias gram positivas, seleccionadas de una bacteria de ácido láctico y una Bifidobacteria, con resistencia al estrés mejorada y características de fabricación, procesamiento y almacenamiento mejoradas. Estas bacterias gram positivas modificadas genéticamente carecen de actividad de trehalosa-6-fosfato fosforilasa (TrePP) y del componente IIC del sistema PTS específico a celobiosa (ptcC) que permite acumulación y retención de trehalosa intracelular. La invención adicionalmente se refiere a usos de estas bacterias gram positivas en la tecnología de alimentos y las aplicaciones médicas.
Antecedentes de la invención
Las bacterias Gram-positivas se clasifican colectivamente ya que tienen una sola membrana plasmática de bicapa lipídica. Las bacterias Gram positivas incluyen una multitud de géneros bacterianos baciliformes y cocciformes, entre los que se encuentran las Bifidobacterias y un grupo de géneros conocidos colectivamente como bacterias del ácido láctico (LAB). Las LAB comprenden un clado de bacilos gram-positivos, de varilla o cocos bajos en GC, tolerantes al ácido, generalmente no esporulantes, que no respiran, que se asocian por sus características metabólicas y fisiológicas comunes. Estas bacterias, que usualmente se encuentran en plantas (en descomposición) y productos lácteos, producen ácido láctico como el principal producto metabólico de la fermentación de carbohidratos. Este rasgo, a lo largo de la historia, ha vinculado la LAB con fermentaciones de alimentos, ya que la acidificación inhibe el crecimiento de agentes de deterioro Un prototipo de LAB Lactococcus lactis es una bacteria de ácido láctico de fermentación mesófila y microaerófila. Mientras que la bacteria se utiliza ampliamente en fermentaciones alimenticias, especialmente en la industria láctea, existe un interés creciente por su uso en medicamentos y nutracéuticos, como medicamentos para tratar infecciones en cavidades corporales, como infecciones vaginales, o como vehículo para el suministro de moléculas activas biológicas. En todos esos casos, subsiste la necesidad de cultivos iniciadores altamente viables, o formulaciones farmacéuticas o nutracéuticas que comprendan una alta proporción de bacterias viables. Sin embargo, L. lactis tiende a perder viabilidad durante el almacenamiento, o durante el procesamiento (para la producción de una fórmula en polvo seco, formación de comprimidos, etc.). La caída en la viabilidad es aún más pronunciada cuando la bacteria después de liofilización se somete a un estrés adicional, como la alta acidez o la presencia de sales biliares.
Se han propuesto diversos métodos para superar este problema. El uso de trehalosa es de particular interés. La trehalosa (a-D-glucopiranosil-1,1-a-D-glucopiranósido) es un disacárido no reductor que se encuentra en una gran variedad de organismos, que varía desde bacterias hasta animales invertebrados. La trehalosa, a veces en combinación con dextrano, se utiliza a menudo como un crioconservante agregado externamente. La trehalosa agregada externamente funciona como una matriz de sacárido (Conrad et al., 2000), y ejerce su efecto protector especialmente durante el secado por congelación, en el que actúa como un formador de vidrio. Más aún, la trehalosa es bien reconocida como metabolito del estrés, y se ha estudiado ampliamente en hongos, especialmente en Saccharomyces cerevisiae. Las altas concentraciones de trehalosa interna mejoran la capacidad de almacenamiento y dan lugar a una mayor viabilidad con la crioconservación. Sin embargo, es importante señalar que la trehalosa agregada externamente rara vez conduce a la acumulación interna de trehalosa en los microorganismos, ya sea porque no se absorbe o se metaboliza rápidamente después de absorción.
Termont et al. (Appl Environ Microbiol 72: 7694; 2006) informaron que la trehalosa de novo sintetizada, a través de la expresión en exceso de plásmidos de otsA (trehalosa-6-fosfato sintasa) y otsB (trehalosa-6-fosfato fosfatasa) se acumula intracelularmente en L. lactis. La acumulación de trehalosa intracelular, pero no la trehalosa agregada exógenamente, protege a L. lactis de la lisis biliar y la muerte celular a través de secado por congelación. Como L. lactis es extremadamente sensible, la protección a la lisis biliar se puede utilizar como un excelente ensayo funcional de la acumulación intracelular de trehalosa.
Andersson et al. (J Biol Chem 276: 42707; 2001) han descrito una ruta novedosa para la utilización de trehalosa en L. lactis. Esta ruta emplea la actividad de trehalosa-6-fosfato fosforilasa (trePP), convirtiendo trehalosa-6-fosfato a p- glucosa 1-fosfato y glucosa 6-fosfato. Describen la inactivación por inserción de trePP en L. lactis, lo que resulta en la pérdida de capacidad para crecer en trehalosa.
Para la acumulación intracelular de trehalosa, Carvalho et al. (Appl Environ Microbiol 77: 4189; 2011) describen un método que hace uso de la sobreexpresión dirigida por plásmidos de trePP y p-fosfoglucomutasa (pgmB) de L. lactis. Según lo indicado por estos autores, dado que las bacterias carecen de trehalosa 6-fosfato fosfatasa, el gen respectivo, otsB, del organismo de calidad alimenticia P. freudenreichii se utilizó para proporcionar la actividad requerida. Las células resultantes mostraron una resistencia mejorada al choque frío, al choque térmico y a la acidez.
Aunque estos procesos ciertamente conducen a una mejora del almacenamiento, existe una necesidad adicional de métodos que puedan conducir a un almacenamiento mejorado de bacterias gram positivas, tales como LAB o Bifidobacteria, no solo en aquellos casos en que se utiliza la bacteria para el suministro de compuestos biológicamente activos en aplicaciones médicas, sino también cuando la bacteria se utiliza en la industria alimenticia, tal como la industria láctea.
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Resumen de la invención
La trehalosa intracelular puede proteger microorganismos tales como bacterias de ácido láctico (LAB), por ejemplo células de Lactococcus lactis, de diversos agentes o condiciones perjudiciales. Ejemplos son lisis de ácidos biliares, experimentados por LAB vivos durante el tránsito intestinal, o estrés de congelación y/o secado durante congelación, secado, secado por pulverización, secado por congelación, que se utiliza para la preservación de LAB.
Solo está disponible un número limitado de métodos que permiten la acumulación de trehalosa dentro de la célula. Estos hacen uso de la sobreexpresión dirigida por plásmidos de genes homólogos o heterólogos. Sin embargo, esta no es una configuración deseable para uso en productos farmacéuticos o alimenticios.
En este documento presentamos un método novedoso que permite la acumulación intracelular de trehalosa, solo con base en la ausencia de la trehalosa 6-fosfato fosforilasa (TrePP) y la actividad del componente IIS del sistema PTS específico a celobiosa (ptcC) en bacterias gram positivas, preferiblemente a través de hacer que el gen que codifica TrePP y/o ptcC endógeno se elimine, se interrumpa o se inactive parcial o completamente, de tal manera que sea incapaz de producir un producto trePP funcional y/o producto del gen de ptcC. En contraste con el presente método, los trabajos previos (documento WO 2006/018446) enseñaron a expresar la trehalosa 6-fosfato fosfatasa heteróloga tal como otsB para lograr la acumulación de trehalosa. Carvalho et al. 2011 (supra) incluso indicó la sobreexpresión de TrePP para obtener la acumulación intracelular de trehalosa. Más aún, aunque LAB tal como Lactococcus lactis puede ser capaz de utilizar trehalosa, hasta ahora no se ha descrito ninguna cepa de Lactococcus lactis que sintetice trehalosa. No se han identificado genes de trehalosa-6-fosfato sintasa y trehalosa-6-fosfato fosfatasa endógenos, que se consideran que son un requisito previo para la producción de trehalosa a partir de glucosa-6-fosfato, un metabolito presente en L. lactis.
En un aspecto, la invención se refiere a una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de trehalosa 6-fosfato fosforilasa (TrePP) y actividad del componente IIC del sistema PTS específico a celobiosa (ptcC). El otro aspecto, la invención se refiere a dicha bacteria gram positiva para uso como un medicamento. Un aspecto adicional proporciona una composición que comprende una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC. Dichas composiciones por ejemplo pueden abarcar composiciones farmacéuticas, cultivos iniciadores, aditivos para alimentos, o composiciones probióticas.
La composición que comprende una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC puede ser una composición probiótica o aditivo para alimentos, más específicamente como un probiótico no médico o aditivo para alimentos. Sin limitación, dicho aditivo para alimentos puede ser un cultivo iniciador, preferiblemente un cultivo iniciador para la preparación de un producto alimenticio. La composición que comprende una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC como un cultivo iniciador puede ser para la preparación de un producto alimenticio, más particularmente en el producto alimenticio es un producto alimenticio no medicinal.
Un aspecto adicional proporciona una composición probiótica o aditivo para alimentos, más específicamente una composición probiótica o aditivo para alimentos no medicinal, que comprende una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC. Sin limitación, dicho aditivo para alimentos puede ser un cultivo iniciador, preferiblemente un cultivo iniciador para la preparación de un producto alimenticio. Por lo tanto, un aspecto relacionado proporciona un cultivo iniciador, preferiblemente un cultivo iniciador para la preparación de un producto alimenticio, que comprende una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a dicha composición o composición farmacéutica para uso como un medicamento. También se proporciona mediante un aspecto de la invención un método para preparar un producto alimenticio, que comprende mezclar dicha composición probiótica, dicho aditivo para alimentos o dicho cultivo iniciador con un material de sustrato que es capaz de ser fermentado por la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria. En las realizaciones, dicho método puede comprender adicionalmente la etapa de fermentar dicho material de sustrato.
En este documento se describe un producto alimenticio que se puede obtener mediante cualquier dicho método. Un producto alimenticio puede abarcar sin limitación probióticos.
Otro aspecto proporciona un método para preparar un medicamento, tal como una formulación farmacéutica, nutracéutico, alimento médico o alimento funcional o probiótico, o para preparar una composición probiótica o aditivo para alimentos, más específicamente una composición probiótica o aditivo para alimentos no medicinal, o para preparar un cultivo iniciador, preferiblemente un cultivo iniciador para la preparación de un producto alimenticio, que comprende las etapas de: i) propagar una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC en un medio que comprende un material de sustrato capaz de ser fermentado por dicha bacteria gram positiva, y ii) formular la denominada bacteria gram positiva propagada, en, respectivamente, el medicamento o composición probiótica o aditivo para alimentos o cultivo iniciador. Por lo tanto, también se cubre el uso de una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y
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Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC para la preparación de un medicamento, tal como una formulación farmacéutica, nutracéutico, alimento médico o alimento funcional o probiótico, o para la preparación de una composición probiótica o aditivo para alimentos, más específicamente una composición probiótica o aditivo para alimentos no medicinal, o para la preparación de un cultivo iniciador, preferiblemente un cultivo iniciador para la preparación de un producto alimenticio.
Los inventores han descubierto que las bacterias gram positivas, tales como LAB o Bifidobacteria, como se describe en el presente documento no solo son capaces de acumulación de trehalosa intracelular, incluso independientemente de la fuente de carbono, sino también que la bacteria gram positiva muestra una resistencia enormemente aumentada a diversas condiciones de estrés y asociadas al almacenamiento. Por ejemplo, la bacteria gram positiva es más resistente a manipulaciones asociadas con almacenamiento, tales como secado, congelación, secado por pulverización o secado por congelación (liofilización). La bacteria gram positiva también muestra una mayor supervivencia, independiente de la alimentación o el estado de ayuno, en el sistema gastrointestinal, lo que indica una mejor resistencia a la acidez y la lisis biliar. El rendimiento de la bacteria gram positiva como se describe en el presente documento, ya sea en un entorno medicinal o en la industria alimenticia, es más reproducible que lo conocido previamente. Por lo tanto, la bacteria gram positiva que incorpora los principios de la invención proporciona una mayor resistencia al entorno así como también biorresistencia.
En un aspecto, la invención por lo tanto también se refiere a un método para acumular de forma interna trehalosa en una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, que comprende propagar una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC en un medio que comprende un material de sustrato capaz de ser fermentado por dicha bacteria gram positiva.
Se describe en este documento un método para mejorar la resistencia al estrés o las características de fabricación, procesamiento y/o almacenamiento de una bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, que comprende modificar la bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, de tal manera que carezca de actividad de TrePP. Preferiblemente, la resistencia al estrés o características de fabricación, procesamiento y/o almacenamiento pueden ser una o m {as seleccionadas del grupo que comprende resistencia a condiciones ácidas, resistencia a sales biliares, resistencia a calor, resistencia a sal, resistencia a secado, congelación, secado por pulverización, o secado por congelación, y resistencia osmótica.
Preferiblemente, en la bacteria gram positiva mencionada anteriormente, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC, el gen que codifica TrePP endógeno se ha eliminado, interrumpido o inactivado parcial o completamente de tal manera que es incapaz de producir producto génico de trePP funcional. Se apreciará que dicha eliminación, interrupción o inactivación pueden dirigir por ejemplo la secuencia de codificación del gen de trePP y/o el promotor del cual se expresa el trePP.
En realizaciones preferidas, la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC como se emplea en este documento no contiene trehalosa 6- fosfato fosfatasa heteróloga funcional. Como ya se explicó, la sobreexpresión de la trehalosa 6-fosfato fosfatasa heteróloga, tal como por ejemplo otsB de Escherichia coli o de Propionibacterium freudenreichii, anteriormente se suponía que era un requisito para lograr la acumulación de trehalosa en la bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria.
En algunas realizaciones, la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC como se emplea en este documento no contiene trehalosa 6- fosfato sintasa heteróloga funcional. Como ya se explicó, sobreexpresión de trehalosa 6- fosfato sintasa heteróloga, tal como por ejemplo otsA de Escherichia coli, se indicó anteriormente para lograr la acumulación de trehalosa en LAB. En otras realizaciones, la bacteria gram positiva no contiene trehalosa 6-fosfato fosfatasa heteróloga funcional y no contiene trehalosa 6- fosfato sintasa heteróloga funcional.
La bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, carece de actividad de TrePP y actividad de componente IIC del sistema PTS específico a celobiosa (ptcC). Preferiblemente, en dicha bacteria gram positiva, el gen que codifica ptcC endógeno se ha eliminado, interrumpido o inactivado parcial o completamente de tal manera que es incapaz de producir producto génico de ptcC funcional. Se apreciará que dicha eliminación, interrupción o inactivación puede dirigir por ejemplo la secuencia de codificación del gen de ptcC y/o el promotor del cual se expresa el gen de ptcC. Los inventores han observado inesperadamente que con el tiempo la trehalosa acumulada se escapa en cierta medida fuera de las células a través de un puerto de salida de trehalosa no anticipado y no identificado hasta ahora, por lo que la trehalosa se puede detectar en el sobrenadante. Sorprendentemente, encontraron que la inactivación de ptcC evita la liberación de trehalosa. Estos hallazgos son aún más inesperados, porque hasta ahora el ptcC nunca se ha asociado con el transporte de trehalosa, y no se ha sugerido como un puerto de salida de trehalosa responsable de la pérdida de trehalosa y su liberación en los entornos. También sorprendentemente, los transportadores de trehalosa conocidos y caracterizados no parecen ser responsables de este mecanismo de fuga de trehalosa.
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En realizaciones preferidas, la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC como se emplea en este documento puede sobreexpresar uno o más transportadores de trehalosa, preferiblemente transportadores de trehalosa endógena, tales como uno o más genes de sistema de fosfotransferasa comprendido en el operón de trehalosa. Los inventores han encontrado de forma sorprendente que dicha sobrexpresión, en contraste con la expresión inducida por trehalosa nativa, mejora adicionalmente la capacidad de la bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, para acumular y/o retener la trehalosa intracelular.
Para recapitular, en algunas realizaciones la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC como se emplea en este documento adicionalmente puede sobreexpresar uno o más transportadores de trehalosa.
En esta relación, un aspecto adicional de la presente invención es una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC y que exhibe adicionalmente la siguiente característica: sobreexpresa uno o más transportadores de trehalosa.
Un aspecto relacionado se refiere a un LAB que carece de actividad de TrePP y ptcC y que no contiene trehalosa 6- fosfato fosfatasa heteróloga funcional, y que exhibe adicionalmente la siguiente característica: sobreexpresa uno o más transportadores de trehalosa.
En realizaciones preferidas, la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se divulga o emplea en este documento pueden contener adicionalmente uno o más productos génicos heterólogos(s) en algunas realizaciones preferidas, particularmente en los que dicha bacteria gram positiva, esta destinada para un uso medicinal, dichos productos génicos pueden ser productos génicos profilácticos y/o terapéuticos o antígeno(s).
En esta relación, un aspecto adicional de la presente invención es una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC y que contiene adicionalmente uno o más productos génicos heterólogos, preferiblemente productos génicos profilácticos y/o terapéuticos. Esta bacteria gram positiva opcionalmente puede sobreexpresan adicionalmente uno o más transportadores de trehalosa.
Un aspecto relacionado es una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC y que no contiene trehalosa 6-fosfato fosfatasa heteróloga funcional y que contiene adicionalmente uno o más productos génicos heterólogos, preferiblemente productos génicos profilácticos y/o terapéuticos. Esta bacteria gram positiva opcionalmente puede sobreexpresar adicionalmente uno o más transportadores de trehalosa.
En ciertas realizaciones, se puede secar la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, o medicamento o aditivo para alimentos o composición probiótica o cultivo iniciador como se divulga o emplea en este documento se puede secar, congelar, secar por pulverización, o secar por congelación (liofilizar). De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, cualquiera de los métodos mencionados anteriormente para preparar un medicamento, o para preparar un aditivo para alimentos, o para preparar un cultivo iniciador, o para preparar composiciones probióticas, o para acumular de forma interna trehalosa en una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, o para mejorar resistencia al estrés o características de fabricación, procesamiento y/o almacenamiento de y bacteria gram positiva, puede comprender adicionalmente secado, secado por pulverización, congelación o secado por congelación (liofilización) la LAB, medicamento, aditivo para alimentos, composición probiótica, o cultivo iniciador.
En ciertas realizaciones del método mencionado anteriormente para preparar un medicamento, o para preparar un aditivo para alimentos, o para preparar un cultivo iniciador, o en ciertas realizaciones del método mencionado anteriormente para acumular de forma interna trehalosa en la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, el medio de cultivo puede comprender maltosa o glucosa o una combinación de maltosa y glucosa, como una fuente de carbono, preferiblemente como principal o incluso única fuente de carbono. En ciertas realizaciones, el medio de cultivo sustancialmente no contiene trehalosa agregada de forma externa (exógenamente). Los inventores han encontrado sorprendentemente que las bacterias gram positivas, tales como bacterias de ácido láctico (LAB) o Bifidobacterias, como se divulga en este documento han adquirido la capacidad de utilizar fuentes de carbono tales como maltosa o glucosa para acumular trehalosa dentro de las células. De acuerdo con lo anterior, las bacterias gram positivas de acuerdo con la invención de forma ventajosa se pueden hacer crecer sobre por ejemplo maltosa como la única fuente de carbono, que es más barato que trehalosa, todavía acumulará trehalosa intracelular. No obstante, se apreciará que en ciertas realizaciones, el medio de cultivo puede contener trehalosa agregada de forma externa (exógenamente).
Los aspectos anteriores y adicionales y las realizaciones preferidas de la invención se describen en las siguientes secciones y en las reivindicaciones adjuntas. La materia objeto de las reivindicaciones adjuntas por lo tanto se incorpora específicamente en esta especificación.
Breve descripción de las figuras
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Figura 1: La acumulación de trehalosa intracelular es posible luego de inactivación de trePP, luego de expresión otsB o una combinación de los mismos.
Figura 2: La acumulación de trehalosa exógena en células de L. lactis proporciona protección contra la lisis biliar. (A) supervivencia; y (B) contenido de trehalosa.
Figura 3: Acumulación y estabilidad de trehalosa intracelular. (A) liberación de trehalosa durante el tiempo; y (B) aumento de trehalosa en el sobrenadante.
Figura 4: Acumulación de trehalosa y liberación en diversas cepas descritas en la Tabla 2. Las cepas se complementaron con trehalosa 100 mM (A) o 500 mM (B).
Figura 5: La inactivación de ptcC evita (en sales M9, panel A) o retrasa (en 0.5% de oxgal, panel B) la liberación de trehalosa intracelular.
Figura 6: La acumulación de trehalosa exógena en células de L. lactis proporciona protección contra la lisis biliar. (A) liberación de trehalosa intracelular durante el tiempo; y (B) supervivencia durante el tiempo en 0.5% de oxgal
Figura 7: cepas KO de trePP (tanto ptcC en peso así como también KO ptcC) son capaces de convertir glucosa o maltosa a trehalosa intracelular
Figura 8: Supervivencia mejorada durante el pasaje intestinal a través del intestino de porcino, tanto cuando los cerdos estaban en ayuno durante 24 horas (A) así como también durante la disponibilidad de comida ad libitum (B).
Figura 9: Acumulación de trehalosa después de producción de biomasa.
Figura 10: Estimulación de la acumulación de trehalosa intracelular mediante maltosa.
Figura 11: Conversión de maltosa a trehalosa intracelular durante o después de producción de biomasa.
Descripción detallada de la invención
Como se utiliza en este documento, las formas singulares "un", "una", y "el" incluyen tanto el singular como el plural, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
Los términos "que comprende", "comprende" y "comprendido de” como se utilizan en este documento son sinónimos de "que incluye", "incluye" o "que contiene", "contiene", y son inclusivos o abiertos y no excluyen miembros, elementos o etapas del método adicionales, no mencionadas. Se apreciará que los términos "que comprende", "comprende" y "comprendido de” como se utilizan en este documento comprenden los términos "que consiste en", "consiste" y "consiste en", así como los términos "que consisten esencialmente en", "consiste esencialmente" y "consiste esencialmente en".
La enumeración de rangos numéricos por puntos finales incluye todos los números y fracciones subsumadas dentro de los rangos respectivos, así como los puntos finales enumerados.
El término "alrededor" o "aproximadamente" como se utiliza en el presente documento cuando se refiere a un valor medible tal como un parámetro, una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de +/- 20% o menos, preferiblemente +/- 10% o menos, más preferiblemente +/- 5% o menos, y aún más preferiblemente +/- 1% o menos de y desde el valor especificado, en la medida en que dichas variaciones sean apropiadas para ser realizadas en la invención divulgada. Se debe entender que el valor al que se refiere el modificador "alrededor de" o "aproximadamente" también se divulga específicamente, y preferiblemente.
Mientras que los términos "uno o más" o "por lo menos uno", tal como uno o más o por lo menos un miembro(s) de un grupo de miembros, es claro per se, por medio de una ejemplificación adicional, el término abarca, entre otros, una referencia a cualquiera de dichos miembros, o a dos o más de dichos miembros, tales como, por ejemplo, cualquiera de >3, >4, >5, >6 o >7 etc. de dichos miembros, y hasta a todos dichos miembros.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos utilizados en la divulgación de la invención, que incluyen los términos técnicos y científicos, tienen el significado que comúnmente entiende un experto común en la técnica a la que pertenece esta invención. Por medio de una guía adicional, se incluyen definiciones de términos para apreciar mejor las enseñanzas de la presente invención.
En los siguientes pasajes, diferentes aspectos de la invención se definen con más detalle. Cada aspecto definido de esta manera se puede combinar con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa se puede combinar con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas.
La referencia a lo largo de esta especificación a "una realización" o "una realización" significa que un rasgo, estructura o característica particular descrita en relación con la realización se incluye en por lo menos una realización de la presente
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invención. Por lo tanto, las apariencias de las frases "en una realización" o "en una realización" en diversos lugares a lo largo de esta especificación no necesariamente se refieren a la misma realización, pero pueden serlo. Adicionalmente, los rasgos, estructuras o características particulares se pueden combinar de cualquier manera adecuada, como sería evidente para un experto en la técnica a partir de esta descripción, en una o más realizaciones.
En la siguiente descripción detallada de la invención, se hace referencia a los dibujos adjuntos que forman parte de la misma, y en los que se muestran a modo de ilustración únicamente las realizaciones específicas en las que se puede poner en práctica la invención. La siguiente descripción detallada, por lo tanto, no se debe tomar en un sentido limitativo, y el alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.
Los trabajos de referencia estándar que exponen los principios generales de la tecnología de ADN recombinante incluyen Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (con actualizaciones periódicas) ("Ausubel et al. 1992"); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. General principles of microbiology como se establece por ejemplo en Davis, B. D. et al., Microbiology, 3rd edition, Harper & Row, publishers, Philadelphia, Pa. (1980).
Se divulga en este documento una bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, que carece de actividad de trehalosa 6-fosfato fosforilasa (TrePP).
En un aspecto, la bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, es para uso como un medicamento, es decir, para uso en el tratamiento. Un aspecto adicional proporciona un medicamento que comprende una bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP. También se divulga el uso de una bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP para la fabricación de un medicamento. Se puede proporcionar dicho medicamento, por ejemplo, como una formulación farmacéutica, nutracéutico, probiótico, alimento médico o funcional.
Otro aspecto proporciona el uso de una bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP como un probiótico o un aditivo para alimentos, más específicamente como un probiótico no médico o aditivo para alimentos. Un aspecto relacionado proporciona el uso de una bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP como un cultivo iniciador, preferiblemente un cultivo iniciador para la preparación de un producto alimenticio, más particularmente en el que el producto alimenticio es un producto alimenticio no medicinal.
Un aspecto adicional de esta manera proporciona un probiótico o aditivo para alimentos, más específicamente un probiótico no médico o aditivo para alimentos, que comprende una bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP. Un aspecto relacionado proporciona un cultivo iniciador, preferiblemente un cultivo iniciador para la preparación de un producto alimenticio, más particularmente en el que el producto alimenticio es un producto alimenticio no medicinal, dicho cultivo iniciador comprende una bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP.
Como se utiliza en este documento, el término "bacteria gram-positiva" tiene su significado común conocido en la técnica. Por medio de orientación adicional, una bacteria gram-positiva se puede identificar mediante tinción de Gram ya que retiene la tinción de cristal violeta.
En una realización preferida, la bacteria gram-positiva de acuerdo con la invención no es patógena en el sentido de que no provoca daño o no conduce a efectos perjudiciales cuando se administra a un sujeto deseado.
Como se utiliza en este documento, el término "bacterias de ácido láctico" o "LAB" se refiere a una bacteria gram- positiva que es no patógena en el sentido de que no provoca daño o no lleva a efectos perjudiciales cuando se administra a un sujeto destinado, y que preferiblemente pertenece a los géneros bacterianos de Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus, y Weisella. Más preferiblemente, la LAB puede ser una especie de Lactococcus, tal como, pero no limitada a Lactococcus lactis, Lactococcus garvieae, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum y Lactococcus raffinolactis, y cualesquier subespecies y cepas de las mismas. Aún más preferiblemente, la especie Lactococcus puede ser Lactococcus lactis, y cualesquier subespecies y cepa de las mismas, tal como sin limitación Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. hordniae, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. bv. diacetylactis. Adicional y preferiblemente, la Lactococcus lactis puede ser Lactococcus lactis ssp. cremoris o Lactococcus lactis ssp. lactis, más preferiblemente Lactococcus lactis ssp. cremoris, y cualesquier cepas de las mismas, tal como, por ejemplo, Lactococcus lactis ssp. cremoris SK11, Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363, o Lactococcus lactis ssp lactis IL1403. También preferiblemente, la LAB puede ser un Enterococcus sp., preferiblemente Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium y cualesquier subespecies y cepas de las mismas, tal como, sin limitación cepa LMG15709 de Enterococcus faecium.
La gifidobacteria es un género de bacterias gram-positivas, no móviles, a menudo ramificadas anaeróbicas. Las bifidobacterias como se utiliza en este documento pueden incluir B. adolescentis, B. angulatum, B. animalis, B.
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asteroides, B. bifidum, B. boum, B. breve, B. catenulatum, B. choerinum, B. coryneforme, B. cuniculi, B. denticolens, B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum, B. indicum, B. infantis, B. inopinatum, B. lactis, B. longum, B. magnum, B. merycicum, B. minimum, B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum, B. pullorum, B. ruminantium, B. saeculare, B. subtile, B. suis, B. thermacidophilum, B. thermophilum. Preferiblemente, la Bifidobacteria es B. adolescentis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. longum. Se debe entender que también se incluyen todas las subespecies y cepas de Bifidobacteria.
Como se utiliza en este documento, el término ''trehalosa 6-fosfato fosforilasa", "trePP", o "TrePP'' se refiere a una enzima que fosforila la trehalosa 6-fosfato, preferiblemente una enzima que cataliza la reacción, preferiblemente la reacción reversible, de a,a-trehalosa-6-fosfato con fosfato para producir glucosa-6-fosfato y p-D-glucosa-1-fosfato, o viceversa. Los sinónimos para trePP son por ejemplo trehalosa-6-fosfato:fosfato p-D-glucosiltransferasa y a,a- trehalosa-6-fosfato:fosfato p-D-glucosiltransferasa. Por medio de ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos y proteínas de trePP de Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363 se representa mediante las SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente
(que corresponden a números de acceso Genbank NC_009004.1 (región 449195-451504) y Yp_001031805.1,
respectivamente). En una realización, la trePP como se utiliza en este documento se refiere a un gen o proteína que tiene la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente, o que tiene un ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 2. En una realización adicional, la trePP como se utiliza en este documento se refiere a un gen o proteína que tiene la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a las SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente, tal como por ejemplo por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más % idéntica. En otra realización, la trePP como se utiliza en este documento codifica una proteína que es por lo menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 2, tal como por ejemplo por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más % idéntica. Preferiblemente, las secuencias descritas anteriormente se refieren a o codifican una proteína de trePP funcional. En otra realización, la trePP como se utiliza en este documento es una bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, ortóloga de las SEQ ID NOs: 1 y 2.
Los métodos para comparar secuencias y determinar la identidad de secuencia son bien conocidos en la técnica. Por medio de un ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia se refiere a un porcentaje de ácidos nucleicos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias después de las alineaciones de estas secuencias. Las alineaciones y los porcentajes de identidad se pueden realizar y calcular con diversos programas y algoritmos diferentes conocidos en la técnica. Los algoritmos de alineación preferidos incluyen BLAST (Altschul, 1990, disponible por ejemplo en el sitio web de NCBI) y Clustal (revisado en Chenna, 2003, disponible por ejemplo en el sitio web de EBI). Preferiblemente, se utiliza BLAST para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias, tal como el algoritmo de "secuencias Blast 2" descrito por Tatusova y Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250), por ejemplo, utilizando la configuración predeterminada publicada u otra configuración adecuada (tal como, por ejemplo, para el algoritmo BLASTN: coste para abrir un espacio = 5, coste para extender un espacio = 2, penalización para un emparejamiento incorrecto= -2, recompensa para un emparejamiento = 1, espacio x_ventana = 50, valor de expectativa = 10.0, tamaño de palabra = 28; o para el algoritmo BLASTP: matriz = Blosum62, coste para abrir un espacio = 11, coste para extender un espacio = 1, valor de expectativa = 10.0, tamaño de palabra = 3).
La actividad de trePP se puede medir directa o indirectamente. Una forma de determinar indirectamente la actividad es por medio de la secuencia genética. De esta forma, se pueden identificar fácilmente eliminaciones, interrupciones o mutaciones inactivantes parciales o completas. Una forma directa para determinar la actividad se puede basar, por ejemplo, en ensayos con extractos celulares en los que se mide el consumo de sustrato o la formación del producto de reacción (por ejemplo, el sustrato trehalosa 6-fosfato o los productos de reacción glucosa-6-fosfato y p-D-glucosa-1- fosfato), posiblemente combinado con un marcado metabólico previo. El sustrato y los productos también se pueden determinar fácilmente, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento (HPAEC), como se describe, por ejemplo, en Andersson et al. 2001 (supra).
Como se utiliza en este documento, el término "que carece de actividad de TrePP" significa que no está presente o sustancialmente no está presente la actividad de TrePP. Por medio de más orientación, la actividad de TrePP es menor de 20% de la actividad de TrePP de bacterias gram positivas tipo silvestre, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria. Por ejemplo, la actividad de TrePP es menor de 15%, preferiblemente menor de 10%, más preferiblemente menor de 5%, incluso más preferiblemente menor de 1% de actividad de TrePP tipo silvestre. Como se indicó anteriormente, aún más preferiblemente la actividad de TrePP es indetectable o sustancialmente o completamente ausente.
Como se utiliza en este documento, el término "medicamento" también abarca los términos "fármaco", "producto terapéutico" y otros términos que se utilizan en el campo de la medicina para indicar una preparación con efecto terapéutico o profiláctico.
Como se utiliza en este documento, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en el que el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado. Los términos "tratamiento", "tratar" y similares, como se utilizan en este documento también incluyen la mejora o eliminación de una enfermedad o afección desarrollada una vez que se ha establecido o el alivio de los síntomas característicos de dicha enfermedad o afección. Como se utiliza en el presente documento, estos términos también abarcan, dependiendo de la afección del paciente, prevenir la aparición de una enfermedad o afección o de síntomas asociados con una enfermedad o afección, que incluye la reducción de la gravedad de una enfermedad o
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afección o síntomas asociados con ella antes de la aflicción con dicha enfermedad o afección. Dicha prevención o reducción antes de la aflicción se refiere a la administración del compuesto o composición de la invención a un paciente que no está en el momento de la administración afectado por la enfermedad o afección. La "prevención" también abarca prevenir la recurrencia o la prevención de recaídas de una enfermedad o afección o de los síntomas asociados a la misma, por ejemplo después de un período de mejora.
Como se utiliza en este documento, los "nutracéuticos" generalmente abarcan alimentos o productos alimenticios que proporcionan beneficios médicos y de salud. Los nutracéuticos son comestibles y pueden ser consumidos directamente por humanos, pero preferiblemente se proporcionan a los humanos en forma de aditivos o suplementos nutricionales, por ejemplo, en forma de comprimidos del tipo que se venden en tiendas naturistas, o como ingredientes en sólidos comestibles, más preferiblemente productos alimenticios procesados tales como cereales, panes, tofu, galletas, helados, pasteles, papas fritas, pretzels, queso, etc., y en líquidos bebibles, por ejemplo, bebidas tales como leche, gaseosas, bebidas deportivas y jugos de frutas. Los procesos especialmente preferidos para producir nutracéuticos implican solo disolventes derivados naturalmente. Los nutracéuticos pueden contener preferiblemente niveles relativamente altos de sustancias potenciadoras de la salud. Los nutracéuticos pueden entremezclarse entre sí para aumentar sus efectos potenciadores de la salud.
En contraste con los nutracéuticos, los denominados "alimentos médicos" no están destinados a ser utilizados por el público en general y no están disponibles en tiendas o supermercados. Los alimentos médicos no son aquellos alimentos incluidos dentro de una dieta saludable para disminuir el riesgo de enfermedades, tales como los alimentos bajos en grasa o bajos en sodio, ni tampoco son productos para perder peso. Un médico prescribe un alimento médico cuando un paciente tiene necesidades nutricionales especiales con el fin de controlar una enfermedad o estado de salud, y el paciente está bajo la atención continua del médico. La marca indica que el producto está destinado a ser utilizado para manejar un trastorno o afección médica específica. Un ejemplo de un alimento médico es un alimento médico nutricionalmente diverso diseñado para proporcionar apoyo nutricional específico a pacientes con afecciones inflamatorias crónicas. Los compuestos activos de este producto son, por ejemplo, uno o más de los compuestos descritos en este documento. Los alimentos funcionales pueden abarcar aquellos alimentos incluidos dentro de una dieta saludable para disminuir el riesgo de enfermedades, tales como alimentos bajos en grasa o bajos en sodio, o productos para perder peso.
Como se utiliza en este documento, el término "probióticos" se refiere a bacterias que ayudan a mantener el equilibrio natural de microorganismos (microflora) en la cámara intestinal. También, el tracto digestivo humano normal contiene bacterias probióticas que reducen el crecimiento de bacterias dañinas y promueven un sistema digestivo saludable. El grupo más grande de bacterias probióticas en el intestino es LAB. Como se utiliza en el presente documento, una "composición probiótica" es una composición, preferiblemente una composición comestible, que comprende un probiótico. El término "composición probiótica" como se utiliza en el presente documento se puede utilizar indistintamente con "suplemento dietético". La composición probiótica como se define en este documento se puede utilizar como complemento de alimentos y bebidas, y como formulaciones farmacéuticas para aplicación enteral o parenteral que pueden ser formulaciones sólidas tales como cápsulas o comprimidos, o formulaciones líquidas, tales como soluciones o suspensiones. Dichas formulaciones pueden incluir, sin limitación, bebidas (por ejemplo, Actimel®, Yakult®, DanActive®...), bebidas de yogur, yogur, queso fresco, crema, crema agria, etc. Por lo tanto, se debe apreciar que un probiótico o composición probiótica puede ser para aplicaciones medicinales o no medicinales.
El término "cultivo iniciador" se refiere a un cultivo microbiológico que en realidad realiza la fermentación. Estos iniciadores generalmente consisten en un medio de cultivo, tal como granos, semillas o líquidos nutritivos que han sido bien colonizados por los microorganismos utilizados para la fermentación. Como se utiliza en este documento, el término cultivo iniciador preferiblemente se refiere a un cultivo iniciador de alta densidad. De acuerdo con lo anterior, un cultivo iniciador se puede referir a una composición que comprende microorganismos vivos que son capaces de iniciar o efectuar la fermentación de material orgánico, opcionalmente después de cultivarse en un medio iniciador separado para obtener un cultivo de alta densidad. Alternativamente, el cultivo iniciador se puede secar, secar por pulverización, congelar o secar por congelación.
Como se indicó anteriormente, los presentes inventores han encontrado de forma sorprendente que la sola ausencia de trePP es suficiente para la acumulación de trehalosa intracelular en la bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria. En contraste con esto, se ha pensado previamente que la presencia de una trehalosa 6-fosfato fosfatasa heteróloga y/o una trehalosa 6- fosfato sintasa heteróloga, tal como otsB y otsA, respectivamente, es esencial para la acumulación de trehalosa intracelular. De acuerdo con lo anterior, en una realización, la invención se refiere a la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria que carece de actividad de TrePP y ptcC, como se describe en este documento, que no contiene otsB heteróloga funcional, preferiblemente sin trehalosa 6-fosfato fosfatasa heteróloga funcional. En una realización adicional, la bacteria gram positiva, como se describe en este documento no contiene una otsA heteróloga funcional, preferiblemente sin trehalosa 6- fosfato sintasa heteróloga funcional. En aún otra realización, la bacteria gram positiva, como se describe en este documento no contiene una otsA heteróloga funcional y no contiene una otsB heteróloga funcional. En una realización adicional, la bacteria gram positiva, como se describe en este documento no contiene una trehalosa 6- fosfato sintasa heteróloga funcional y no contiene una trehalosa 6-fosfato fosfatasa heteróloga funcional. En aún una realización adicional, la bacteria gram positiva, como se describe en este documento no contiene un gen
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heterólogo funcional involucrado en el metabolismo (ya sea catabólico o anabólico) de trehalosa o trehalosa 6-fosfato. Dichos genes abarcan, sin limitación trehalasa, trehalosa fosforilasa, y trehalosa 6-fosfato hidrolasa.
Como se utiliza en este documento, el término "no contiene" o "que no contiene" preferiblemente se refiere a una bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, que no expresa un producto génico particular, es decir se produce proteína no funcional o activa en dicha bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria.
Como se utiliza en este documento, el término "trehalosa 6-fosfato fosfatasa" se refiere a una enzima que desfosforila la trehalosa 6-fosfato, preferiblemente una enzima que cataliza la reacción de trehalosa-6-fosfato para producir fosfato y trehalosa. La trehalosa 6-fosfato fosfatasa pertenece a la familia de Hidrolasas de Monoéster Fosfórico. Los sinónimos para trehalosa 6-fosfato fosfatasa son por ejemplo a,a-trehalosa-6-fosfato fosfohidrolasa, trehalosa- 6-fosfato fosfohidrolasa, y trehalosa 6-fosfatasa. Por medio del ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos y proteínas de trehalosa 6-fosfato fosfatasa de E. coli (es decir, otsB) se representa mediante las SEQ ID NOs: 3 y 4, respectivamente (que corresponden a números de acceso Genbank X69160.1 (posiciones de nucleótidos 675-1475) y P31678.2, respectivamente). En una realización, la trehalosa 6-fosfato fosfatasa como se utiliza en este documento se refiere a un gen o proteína que tiene la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de las SEQ ID NOs: 3 y 4, respectivamente, o que tiene un ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 4. En una realización adicional, la trehalosa 6-fosfato fosfatasa como se utiliza en este documento se refiere a un gen o proteína que tiene la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a las SEQ ID NOs: 3 y 4, respectivamente, tal como por ejemplo por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más % idéntica. En otra realización, la trehalosa 6-fosfato fosfatasa como se utiliza en este documento codifica una proteína que es por lo menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 4, tal como por ejemplo por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más % idéntica. Preferiblemente, las secuencias descritas anteriormente se refieren a o codifican una proteína de trehalosa 6-fosfato fosfatasa funcional. En otra realización, la trehalosa 6-fosfato fosfatasa como se utiliza en este documento es una bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, ortóloga de las SEQ ID NOs: 3 y 4.
Como se utiliza en este documento, el término "trehalosa 6-fosfato sintasa" se refiere a una enzima que desfosforila la trehalosa 6-fosfato, preferiblemente una enzima que cataliza la reacción de glucosa 6-fosfato con UDP-glucosa para producir trehalosa 6-fosfato. La trehalosa 6-fosfato sintasa pertenece a la familia de glucosiltransferasas. Los sinónimos para trehalosa 6-fosfato sintasa son por ejemplo difosfato de trehalosa fosfato-uridina glucosiltransferasa, difosfato de fosfotrehalosa-uridina transglucosilasa, uridina difosfoglucosa fosfato glucosiltransferasa, y a,a- trehalosa-6-fosfato sintasa. Por medio del ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos y proteínas de trehalosa 6-fosfato sintasa de E. coli (es decir otsA) se representa mediante las SEQ ID NOs: 5 y 6, respectivamente (que corresponden a números de acceso Genbank X69160.1 (posiciones de nucleótidos 1450-2874) y P31677.3, respectivamente). En una realización, la trehalosa 6- fosfato sintasa como se utiliza en este documento se refiere a un gen o proteína que tiene la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de las SEQ ID NOs: 5 y 6, respectivamente, o que tiene un ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 6. En una realización adicional, la trehalosa 6-fosfato sintasa como se utiliza en este documento se refiere a un gen o proteína que tiene la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a las SEQ ID NOs: 5 y 6, respectivamente, tal como por ejemplo por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más % idéntica. En otra realización, la trehalosa 6-fosfato sintasa como se utiliza en este documento codifica una proteína que es por lo menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 6, tal como por ejemplo por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más % idéntica. Preferiblemente, las secuencias descritas anteriormente se refieren a o codifican una proteína de trehalosa 6-fosfato sintasa funcional. En otra realización, la trehalosa 6-fosfato sintasa como se utiliza en este documento es una bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, ortóloga de las SEQ ID NOs: 5 y 6.
Se entiende que, como se utiliza en este documento, la ausencia de trehalosa 6-fosfasa fosfatasa o sintasa heteróloga funcional (o cualquier otra enzima metabólica relacionada con trehalosa) se refiere a la ausencia de cualquier o sustancialmente cualquier actividad de trehalosa 6-fosfasa fosfatasa o sintasa heteróloga actividad. Se puede determinar dicha actividad como se describe en este documento en otra parte. En una realización, la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se describe en este documento no expresa estas enzimas.
Los inventores han encontrado que la trehalosa en cierta medida se escapa desde las células a través de un puerto de salida de trehalosa hasta ahora no identificado o no anticipado y se puede recuperar en el sobrenadante. Sorprendentemente, los inventores encontraron que la interrupción de ptcC evita la liberación de trehalosa. De acuerdo con lo anterior, en una realización, la invención se refiere a una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se describe en este documento, que carece de actividad de TrePP y componente IIC del sistema PTS específico a celobiosa (ptcC).
"Componente IIC del sistema PTS específico a celobiosa" o "ptcC" como se utiliza en este documento se refiere a un componente del sistema fosfotransferasa. El sistema de fosfotransferasas está involucrado en la catalización de la transferencia del grupo fosforilo del fosfoenolpiruvato a los sustratos de azúcar entrantes concomitantes con su translocación a través de la membrana celular. El ptcC es el componente transmembrana de un sistema PTS específico a celobiosa. Hasta ahora, ptcC no ha estado implicado en el transporte de trehalosa, y mucho menos está involucrado en la pérdida de trehalosa de bacterias gram positivas, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o
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Bifidobacteria. Por medio del ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos y proteínas de ptcC de Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363 se representa mediante las SEQ ID NOs: 7 y 8, respectivamente (que corresponden a números de acceso Genbank NC_009004.1 (región 430271-431608) y YP_001031790.1, respectivamente). En una realización, el ptcC como se utiliza en este documento se refiere a un gen o proteína que tiene la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de las SEQ ID NOs: 7 y 8, respectivamente, o que tiene un ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 8. En una realización adicional, el ptcC como se utiliza en este documento se refiere a un gen o proteína que tiene la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a las SEQ ID NOs: 7 y 8, respectivamente, tal como por ejemplo por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más % idéntica. En otra realización, el ptcC como se utiliza en este documento codifica una proteína que es por lo menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 8, tal como por ejemplo por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más % idéntica. Preferiblemente, las secuencias descritas anteriormente se refieren a o codifican una proteína de ptcC funcional. En otra realización, el ptcC como se utiliza en este documento es una bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, ortóloga de las SEQ ID NOs: 7 y 8.
La bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC de acuerdo con la invención se puede obtener por cualquier medio conocido en la técnica, ya sea utilizando metodología de biología molecular u obtener a través de cribado de alto rendimiento de variantes naturales o variantes obtenidas a partir de mutagénesis aleatoria química o por irradiación. (El cribado de alto rendimiento para KO trePP se puede realizar mediante un método que utiliza la ausencia de crecimiento sobre trehalosa de la cepa defectuosa en trePP o mediante secuenciación de alto rendimiento y análisis bioinformático de ortólogos de trePP u otros métodos). (Para más información sobre técnicas recombinantes y manipulación genética de LAB véase, por ejemplo, " Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria", eds. Gasson & de Vos, Blackie Academic & Professional, 1994 y "Genetics of Lactic Acid Bacteria", eds. Wood & Warner, Springer, 2003) En una realización, en la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, de acuerdo con la invención, el gen que codifica TrePP endógeno y/o PtcC y/o los promotores a partir de los cuales se expresa trePP y/o ptcC se ha eliminado, interrumpido o inactivado parcial o completamente de tal manera que es incapaz de producir producto génico de trePP y/o ptcC funcional. Las técnicas para la interrupción de genes en general se conocen en el arte. Por medio del ejemplo, el gen de trePP y/o ptcC endógeno se puede inactivar mediante la eliminación completa o parcial de la región de codificación (inactivación) o, alternativamente, la eliminación o mutagénesis completa o parcial de la región promotora. Alternativamente, el gen trePP y/o ptcC SE puede inactivar insercionalmente (activación), interrumpiendo de esta manera la secuencia de codificación endógena. Por ejemplo, se pueden introducir codones de parada prematuros o mutaciones de desplazamiento de marco. El gen Trepp y/o PTCC también puede ser mutagenizado mediante la introducción de una o más mutaciones de sentido erróneo o sin sentido, siempre y cuando no se puedan producir más o sustancialmente no se puedan producir proteína de Trepp y/o ptcC funcional, es decir, la actividad de Trepp y/o ptcC está (sustancialmente) ausente. Se debe entender que también se cubren las mutaciones espontáneas
Los inventores han encontrado que sobreexpresar uno o más transportadores de trehalosa aumenta adicionalmente la acumulación de trehalosa intracelular y/o retención en la bacteria gram positiva.
De acuerdo con lo anterior, en una realización, la invención se refiere a una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se describe en este documento, sobreexpresar, preferiblemente sobreexpresar de forma constitutiva, uno o más genes que codifican un transportador de trehalosa. En una realización preferida, dichos transportadores de trehalosa son transportadores de trehalosa endógena de bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria. En una realización preferida adicional, los transportadores de trehalosa son transportadores de trehalosa endógena ubicados en el operón de trehalosa de bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria. En aún otra realización, los transportadores de trehalosa son transportadores de trehalosa endógena del sistema de fosfotransferasa (PTS) ubicado dentro del operón de trehalosa de bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria. En una realización preferida, la sobreexpresión de uno o más transportadores de trehalosa como se describe en este documento se acompaña por la inserción de un promotor 5’ a uno o más transportadores de tal manera que el promotor se une de forma operativa a la secuencia de transportadores. Unido de forma operativa se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes so descritos de esta manera están en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Una secuencia de promotores "unida de forma operativa" a una secuencia de codificación se une de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se alcanza bajo condiciones compatibles con la secuencia de promotores. En una realización, dicho promotor es un promotor fuerte. En una realización adicional, dicho promotor es un promotor constitutivo. En aún otra realización, dicho promotor es un promotor de bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria endógena. Los promotores adecuados se pueden encontrar en el documento WO 2008/084115. En particular, los promotores enumerados en la Tabla 12 del documento WO 2008/084115 son particularmente adecuados para sobreexpresar los transportadores como se describe en este documento. Aún más preferiblemente, el promotor es PhIIA (es decir el promotor de la proteína de unión a ADN similar a HU). De acuerdo con lo anterior, en una realización preferida el promotor de PhIIA se inserta corriente arriba de las regiones de codificación del transportador de trehalosa endógena ubicado en el operón de trehalosa de la bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria. En una realización, el promotor de PhIIA tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 13, que corresponde al promotor de PhIIA de Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363. En otra realización, el promotor de PhIIA tiene una secuencia que es por lo menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 13, tal como por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más idéntiva a la SEQ ID NO: 13. En una realización adicional, el PhIIA es una bacteria de ácido láctico (LAB) u ortólogo de Bifidobacteria de la SEQ ID NO: 13.
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Por medio del ejemplo, los transportadores de trehalosa mencionados en este documento se representan por la secuencia de ácidos nucleicos y aminoácidos de Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363 de las SEQ ID NOs: 9 y 10, respectivamente (que corresponden a números de acceso Genbank NC_009004.1 (región 446937-447422) y YP_001031803.1, respectivamente), y/o SEQ ID NOs: 11 y 12, respectivamente (que corresponden a números de acceso Genbank NC_009004.1 (región 447563-449128) y YP_001031804.1, respectivamente). En una realización, el transportador sobreexpresado como se utiliza en este documento se refiere a un gen o proteína que tiene la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de las SEQ ID NOs: 9 y 10, respectivamente, y/o SEQ ID NOs: 11 y 12, respectivamente, o que tiene un ácido nucleico que codifica la SEQ ID NO: 10 y/o SEQ ID NO: 12. En una realización adicional, el transportador sobreexpresado como se utiliza en este documento se refiere a un gen o proteína que tiene la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que es por lo menos 75% idéntica a las SEQ ID NOs: 9 y 10, respectivamente, y/o SEQ ID NOs: 11 y 12, respectivamente, tal como por ejemplo por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más % idéntica. En otra realización, el transportador sobreexpresado como se utiliza en este documento codifica una proteína que es por lo menos 75% idéntica a la SEQ ID NO: 10 y/o SEQ ID NO: 12, tal como por ejemplo por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más % idéntica. Preferiblemente, las secuencias descritas anteriormente se refieren a o codifican proteínas transportadoras funcionales sobreexpresadas, preferiblemente sobreexpresadas de forma constitutiva. En otra realización, los transportadores sobreexpresados (de forma constitutiva) como se utiliza en este documento son una bacteria de ácido láctico (LAB) u ortógolo de Bifidobacteria de las SEQ ID NOs: 9 y 10 y/o SEQ ID NOs: 11 y 12.
En una realización, la invención se refiere a una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC; y adicionalmente puede sobreeexpresar, preferiblemente sobreeexpresar de forma constitutiva, uno o más transportadores de trehalosa, en los que la bacteria gram positiva en adición contiene trehalosa 6-fosfato fosfatasa heteróloga funcional, tal como otsB y/o trehalosa 6- fosfato sintasa heteróloga funcional, tal como otsA, más preferiblemente en la que la bacteria gram positiva contiene por lo menos dicha trehalosa 6-fosfato fosfatasa heteróloga funcional, incluso más preferiblemente en la que la bacteria gram positiva contiene dicha trehalosa 6-fosfato fosfatasa heteróloga funcional pero no contiene dicha trehalosa 6- fosfato sintasa heteróloga funcional. Cada una de estas proteinas es como se describe en este documento en otra parte. Particularmente se prefiere una integración genómica de la trehalosa 6-fosfato fosfatasa, en la que la integración es preferiblemente como se divulga en las solicitudes de patente europea con los números de solicitud 11168495.7 y
11173588.2. Estas solicitudes se refieren a los sistemas de expresión de doble cistrón. La posición preferida de trehalosa 6-fosfato fosfatasa, preferiblemente otsB, como se utiliza aquí, es como un segundo cistrón detrás del gen usp45 endógeno.
La bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se describe en este documento muestra un aumento de tolerancia hacia diversos entornos y amenazas asociadas a almacenamiento o estrés, tales como un aumento de resistencia al secado, secado por pulverización, congelación o secado por congelación, así como también un aumento de resistencia hacia las condiciones severas en el tracto gastrointestinal (por ejemplo ácidos y sales biliares). La bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, de acuerdo con la invención por lo tanto es particularmente bien adecuada para ser administrada a un sujeto mientras que muestra un aumento en la tasa de supervivencia en el tracto gastrointestinal. Esta bacteria gram positiva, por lo tanto también se puede aplicar para suministrar proteínas a un sujeto. De acuerdo con lo anterior, en una realización, la invención se refiere a una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se describe en este documento, que contiene uno o más productos génicos heterólogos, preferiblemente uno o más productos génicos profilácticos y/o terapéuticos y/o antígeno. El suministro de polipéptidos activos biológicos por ejemplo se ha descrito en los documentos WO 97/14806, WO 00/23471, WO 01/02570, WO 02/090551, WO 2005/111194, WO 2007/025977, WO 2007/063075, WO 2007/128757, WO 2008/071751, WO 2008/090223, WO 2004/046346, y WO 2010/034844. Preferiblemente, los genes heterólogos como se describe en este documento se integran en el genoma bacteriano se integran en el genoma bacteriano. Una estrategia de integración particularmente preferida se divulga en las solicitudes de patentes europeas con los números de solicitud 11168495.7 y
11173588.2. En particular, los genes heterólogos se pueden insertarse policistrónicamente (por ejemplo, bi-, tri- o multiscistrónicamente) como un segundo gen (o adicional) en un locus nativo (endógeno), preferiblemente un operón. De esta forma, el gen heterólogo se expresa bajo el control de un promotor nativo (endógeno).
Como se utiliza en este documento, el término "antígeno" generalmente se refiere a una sustancia que evoca una respuesta inmunitaria, que incluye inmunidad humoral y/o respuesta de inmunidad celular, y que es capaz de unirse a un producto, por ejemplo, un anticuerpo o una célula T, de la respuesta inmunitaria. Un antígeno como se prevé en este documento puede, en una alternativa, ser de tal manera que induzca la inmunotolerancia, por ejemplo, puede ser un autoantígeno (que incluye auto y alo antígenos) o puede ser un alérgeno. Por lo tanto, en un ejemplo preferido, un antígeno requiere un sistema inmunitario funcional de un sujeto al que se administra para provocar una respuesta fisiológica de dicho sujeto. El "antígeno" como se pretende en este documento también abarca "autoantígenos" que no provocan una respuesta inmunitaria en un individuo sano, pero lo haría en una persona que padece una enfermedad autoinmunitaria, es decir, la falla de un organismo para reconocer su propio constituyente partes (hasta los niveles submoleculares) como "auto", que da como resultado una respuesta inmunitaria contra sus propias células y tejidos. Cualquier enfermedad que resulte de dicha respuesta inmunitaria tan aberrante se denomina enfermedad autoinmunitaria. De acuerdo con lo anterior, el "antígeno" como se pretende aquí también abarca una proteína (fisiológicamente activa) que no provocaría una respuesta inmunitaria en un individuo sano, sino que lo haría en una
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persona genéticamente deficiente en dicha proteína. Adicionalmente, el "antígeno" tal como se pretende aquí también abarca un alergeno que no provocaría una respuesta inmunitaria en un individuo sano pero lo haría en una persona que padece una enfermedad alérgica.
Un antígeno como se prevé en este documento se puede derivar de cualquier polipéptido al que una respuesta inmunitaria en un sujeto humano o animal sería terapéuticamente útil, por ejemplo, a partir de un patógeno, por ejemplo, de un patógeno viral, procariótico (por ejemplo, bacteriano) o eucariota, de una proteína no fisiológica (por ejemplo, una proteína derivada de tejido canceroso), de alérgeno (por ejemplo, para provocar tolerancia inmunitaria), etc. Un antígeno también podría ser un metabolito de una proteína. Como ejemplo, el antígeno podría ser un polisacárido, un lípido u otro. Los promotores fuertes como se describen aquí podrían dirigir la expresión de las enzimas necesarias para sintetizar o ensamblar dicho polisacárido, lípido u otro.
El término "un producto profiláctica y/o terapéuticamente génico", polipéptido o proteína se refiere generalmente a un péptido, polipéptido o proteína que, en un sujeto humano o animal al que se administra, no provoca una respuesta inmunitaria contra sí mismo (es decir, no es vaccinógeno) y puede lograr un efecto profiláctico y/o terapéutico. Por lo tanto, se esperaría que el efecto profiláctico y/o terapéutico de dicho péptido, polipéptido o proteína esté directamente relacionado con su propia función biológica natural por lo que puede lograr efectos particulares en un cuerpo de un sujeto; en lugar de producir un efecto profiláctico y/o terapéutico al actuar como un antígeno inmunogénico y/o inmunoprotector en el sujeto. Por lo tanto, el péptido, polipéptido o proteína profilácticamente y/o terapéuticamente activo no vaccinógeno debería ser biológicamente activo en su forma expresada o, por lo menos, debe convertirse en la forma biológicamente activa una vez liberado de la célula anfitriona que expresa. Preferiblemente, dicha forma biológicamente activa de dicho péptido, polipéptido o proteína puede mostrar una conformación secundaria y preferiblemente también terciaria que es la misma o muy similar a su configuración nativa.
Preferiblemente, el producto, polipéptido o proteína del gen profiláctico y/o terapéutico también es no tóxico y no patógeno. En una realización preferida, el producto, polipéptido o proteína profiláctica y/o terapéuticamente génico se puede derivar de un ser humano o animal, y preferiblemente puede corresponder al mismo taxón que el sujeto humano o animal al que se va a administrar.
Ejemplos no limitantes de productos, polipéptidos o proteínas profiláctica y/o terapéuticamente génicos adecuados incluyen aquellos que son capaces de funcionar localmente o sistémicamente, por ejemplo, son capaces de ejercer actividades endocrinas que afectan el metabolismo local o de todo el cuerpo y/o es capaz de regular las actividades de las células pertenecientes al sistema inmunohemopoyético y/o es capaz de afectar la viabilidad, el crecimiento y la diferenciación de una variedad de células normales o neoplásicas en el cuerpo o que afectan la regulación inmunitaria o inducción de respuestas inflamatorias de fase aguda a la lesión e infección y/o es capaz de potenciar o inducir resistencia a la infección de células y tejidos mediados por quimioquinas que actúan sobre sus receptores de células objetivo, o la proliferación de células epiteliales o la promoción de curación de heridas y/o es capaz de modular la expresión o producción de sustancias por las células del cuerpo. Ejemplos específicos de dichos péptidos, polipéptidos y proteínas incluyen, sin limitación, insulina, hormona del crecimiento, prolactina, calcitonina, hormona luteinizante, hormona paratiroidea, somatostatina, hormona estimulante de la tiroides, polipéptido intestinal vasoactivo, citoquinas tales como IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, cualquiera de IL-14 a IL-32, en particular IL- 27, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL, la familia de citoquinas TNF, por ejemplo, ligandos TNFa, TNFa, CD40, CD27 o FAS, Familia de citoquinas IL-1, familia de factores de crecimiento de fibroblastos, factores de crecimiento derivados de plaquetas, factores de crecimiento transformantes y factores de crecimiento nervioso, la familia de citoquinas relacionadas con el factor de crecimiento epidérmico, las citoquinas relacionadas con la insulina, etc. Alternativamente, el polipéptido profiláctico y/o terapéuticamente activo puede ser un receptor o antagonista para los polipéptidos profilácticamente y/o terapéuticamente activos como se definió anteriormente. Alternativamente, el polipéptido profiláctico y/o terapéuticamente activo puede ser un anticuerpo, tal como un anticuerpo neutralizante, o similares del mismo. Se enumeran ejemplos específicos adicionales de dichos polipéptidos adecuados, por ejemplo, en el documento WO 96/11277, página 14, líneas 1 - 30; en el documento WO 97/14806, página 12, línea 1 a página 13, línea 27; o el documento US 5,559,007, col. 8, línea 31 a col. 9, línea 9. En un ejemplo, dicho péptido, polipéptido o proteína profiláctica y/o terapéuticamente activa puede ser IL-10, más preferiblemente hIL-10, péptido-1 similar a glucagón (GLP-1), más preferiblemente hGLP-1, péptido-2 similar a glucagón (GLP-2), más preferiblemente hGLP-2, factores de trébol (TFF, por ejemplo, TFF1,2 y/o 3), o PYY, más preferiblemente hPYY.
Como se menciona, en las realizaciones, el polipéptido profiláctico y/o terapéuticamente activo puede ser un anticuerpo, tal como un anticuerpo neutralizante, o similares al mismo. El anticuerpo como se describe en este documento puede ser un anticuerpo de tamaño completo o un fragmento funcional del mismo tal como Fab, una proteína de fusión o una proteína multimérica. En una realización preferida, el uno o más genes heterólogos codifican un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo funcional. Como se utiliza en este documento, el término "funcional" se refiere a un fragmento de anticuerpo, que aún puede ejercer su función prevista, es decir, unión a antígeno. El término anticuerpo, como se utiliza aquí, incluye, pero no se limita a anticuerpos convencionales, anticuerpos quiméricos, dAb, anticuerpo biespecífico, anticuerpo triespecífico, anticuerpo multiespecífico, anticuerpo bivalente, anticuerpo trivalente, anticuerpo multivalente, VHH, nanocuerpo, Fab, Fab’, F (ab’)2 scFv, Fv, dAb, Fd, diacuerpo, triacuerpo, anticuerpo de cadena sencilla, anticuerpo de dominio simple, dominio variable de anticuerpo simple.
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En el presente contexto, el término "anticuerpo" se utiliza para describir una inmunoglobulina ya sea natural o parcial o totalmente modificada por ingeniería genética. Como los anticuerpos pueden modificarse de varias maneras, el término "anticuerpo" debe interpretarse como que cubre cualquier molécula de unión específica o sustancia que tiene un dominio de unión con la especificidad de unión requerida para el otro miembro del par de moléculas, es decir, la molécula objetivo, como se define supra. Por lo tanto, este término abarca fragmentos de anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, así como anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos bifuncionales, anticuerpos bivalentes, VHH, nanoanticuerpos, Fab, Fab’, F(ab')2, scFv, Fv, dAb, Fd, diacuerpos, triacuerpos y anticuerpos de camélidos, que incluyen cualquier polipéptido que comprenda un dominio de unión a inmunoglobulina, ya sea natural o totalmente modificado por ingeniería genética. Por lo tanto, se incluyen moléculas quiméricas que comprenden un dominio de unión a inmunoglobulina, o equivalente, fusionado a otro polipéptido. El término también abarca cualquier polipéptido o proteína que tenga un dominio de unión que sea, o sea homólogo a, un dominio de unión a anticuerpo, por ejemplo, imitadores de anticuerpo. Ejemplos de anticuerpos son los isotipos de inmunoglobulina y sus subclases isotípicas, que incluyen IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4), IgA, IgD, IgM e IgE. La persona en la técnica apreciará así que la presente invención también se refiere a fragmentos de anticuerpos, que comprenden un dominio de unión a antígeno tal como VHH, nanoanticuerpos Fab, scFv, Fv, dAb, Fd, diacuerpos y triacuerpos. En una realización, la invención se refiere a una bacteria grampositiva o un ácido nucleico recombinante como se describe en el presente documento, en el que un gen exógeno codifica la cadena ligera (VL) de un anticuerpo o de un fragmento funcional del mismo, y otro gen exógeno codifica la cadena pesada (Vh) del anticuerpo o de un fragmento funcional del mismo, más preferiblemente en el que el fragmento funcional es Fab. En una realización, el gen exógeno que codifica Vl o el fragmento funcional del mismo se acopla transcripcionalmente al extremo 3' del gen exógeno que codifica Vh o el fragmento funcional del mismo.
En una realización, el anticuerpo (neutralizante) como se describe en el presente documento por lo menos parcial o totalmente bloquea, inhibe o neutraliza una actividad biológica de una molécula objetivo, tal como una citoquina o quimioquina o una toxina. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "neutraliza" o "neutralización" significa la inhibición o reducción de una actividad biológica de una citoquina o toxina medida in vivo o in vitro, mediante métodos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, como se detalla en los ejemplos. En particular, la inhibición o reducción se puede medir al determinar la puntuación colítica o al determinar la molécula objetivo en un tejido o muestra de sangre. Como se utiliza en este documento, la expresión neutraliza" o "neutralización significa la inhibición o reducción de una actividad biológica de una citoquina o toxina medida in vivo o in vitro, en por lo menos 10% o más, preferiblemente en por lo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y aún más preferiblemente en 100%.
Preferiblemente, dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo inhibe el efecto biológico de las citoquinas seleccionadas de la lista de IL-1 p, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12 (o sus subunidades IL-12p35 y IL12p40), IL- 13, IL-15, IL-16, IL- 17, IL-18, IL-21, IL-23 (o su subunidad IL-23p19), IL-27, IL-32 (y sus variantes de corte y empalme), IFN (a, p, y) y TNFa. Alternativamente, estas citoquinas se pueden inhibir mediante moléculas de unión que no son anticuerpos. Preferiblemente, dichas moléculas de unión son receptores de citoquina solubles tales como gp130, o se unen a los receptores de dichas citoquinas, por ejemplo IL-2R (Cd25, CD122, CD132), IL-12R (beta1, beta2), IL15R, IL- 17R, IL-23R o IL-6R, sin desencadenar una señal inflamatoria. Preferiblemente, dichas moléculas de unión son quimioquinas neutralizantes elegidas de la lista de MIF, MIP-1a, MCP-1, RANTES y Eotaxina. Preferiblemente, dichas moléculas de unión están resolviendo el bloqueo de la activación inmunitaria mediante la unión a moléculas coestimulantes de la lista de CD3/CD28, HVEM, B7.1/B7.2, CD40/CD40L(CD154), ICOS/ICOSL, OX40/X40L, CD27/CD27L(CD70), CD30/CD30L(CD153) y 41BB/41BBL. Preferiblemente, dichas moléculas de unión están resolviendo el bloqueo de inflamación a través de la unión a moléculas de adhesión de la lista I-CAM1, a4 integrina y a4p7 integrina. Preferiblemente, dichas moléculas de unión tienen un efecto agonístico y coestimulatorio sobre CD3, CTLA4 y/o PD1. Preferiblemente, dichas moléculas de unión son células T neutralizantes o tienen actividad de célula B al dirigir CD25, CD20, CD52, CD95, BAFF, APRIL y/o IgE. Preferiblemente, dichas moléculas de unión están resolviendo el bloqueo de inflamación a través de la unión a enzimas de la familia MMP. Preferiblemente, dichas moléculas de unión afirman un efecto anti-angiogénico, tal como neutralizar la actividad de avp3/a5p1 e IL-8. En una realización preferida adicional dicha molécula de unión o anticuerpo (o fragmento funcional) es capaz de neutralizar el efecto biológico de TNFa, IL-12, IFNy, IL-23 o IL-17.
Ejemplos no limitantes de anticuerpos o moléculas de unión que se pueden utilizar como genes heterólogos en la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se describe en este documento incluyen:
- un anticuerpo anti-TNFa, fragmento de anticuerpo anti-TNFa, dominio variable de anticuerpo único de anti-TNFa, receptor de TNF soluble o variante negativa dominante de TNFa;
- anticuerpo anti-IL-12, fragmento de anticuerpo anti-IL-12, dominio variable de anticuerpo único anti-IL-12, receptor IL- 12 soluble, variante negativa dominante de IL-12 o IL-12 dAb;
- anticuerpo anti-IL-12p35, fragmento de anticuerpo anti-IL-12p35, dominio variable de anticuerpo único anti-IL-12p35, receptor IL- 12p35 soluble, variante negativa dominante de IL-12p35 o IL-12p35 dAb;
- anticuerpo anti-IL-12p40, fragmento de anticuerpo anti-IL-12p40, dominio variable de anticuerpo único anti-IL-12p40, receptor IL- 12p40 soluble, variante negativa dominante de IL-12p40 o IL-12p40 dAb;
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- anticuerpo anti-IL-23, anti-IL-23 fragmento de anticuerpo, anti-IL-23 dominio variable de anticuerpo único, receptor IL- 23 soluble, variante negativa dominante de IL-23 o IL-23 dAb;
- anticuerpo anti-IL-23p19, fragmento de anticuerpo anti-IL-23p19, dominio variable de anticuerpo único anti-IL-23p19, receptor IL- 23p19 soluble, variante negativa dominante de IL-23p19 o IL-23p19 dAb;
- un anticuerpo anti-IFNy, fragmento de anticuerpo anti-IFNy, dominio variable de anticuerpo único anti-IFNy, receptor IFNy soluble o variante negativa dominante de IFNy;
- anticuerpo anti-IL-17, fragmento de anticuerpo anti-IL-17, dominio variable de anticuerpo único anti-IL-17, receptor IL- 17 soluble, variante negativa dominante de IL-17 o IL-17 dAb; y
- anticuerpo anti-MCP-1, fragmento de anticuerpo anti-MCP-1, dominio variable de anticuerpo único anti-MCP-1, receptor iL-17 soluble, variante negativa dominante de MCP-1 o MCP-1 dAb.
En una realización preferida, dicho anticuerpo es un fragmento FAB (fragmento de unión a antígeno). Los fragmentos FAB se conocen bien en la técnica. Por medio de más orientación, un fragmento FAB es una región sobre un anticuerpo que se une a antígenos. Se compone de un dominio constante y un domino variable de cada una de de la cadena pesada y ligera.
En una realización, el Fab es cA2 anti-TNF Fab (del cual las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos del dominio variable de la cadena pesada y la cadena ligera se divulgan en el documento US 6,790,444 como la SEQ ID NO: 4 y 5 (cadena pesada) y SEQ ID NO: 2 y 3 (cadena ligera), respectivamente) o CDP870 anti-TNF Fab (del cual las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de la cadena pesada y la cadena ligera se divulgan en el documento WO 01/94585 como la SEQ ID NO: 114 y 115 (cadena pesada) y SEQ iD NO: 112 y 113 (cadena ligera), respectivamente).
El experto apreciará que los anticuerpos, que con fragmentos de anticuerpo funcionales, y en particular fragmentos FAB, se componen de diferentes polipéptidos individuales que se pueden unir de forma covalente mediante puentes de disulfuro. En particular, la cadena pesada y la cadena ligera se codifican mediante secuencias de codificación separadas individuales.
De acuerdo con lo anterior, en una realización el gen heterólogo divulgado en este documento codifica un antígeno y/o un anticuerpo (neutralizante) o fragmento funcional o variante del mismo y/o un péptido, polipéptido o proteína profiláctica y/o terapéuticamente activo,, en el que dicho antígeno es capaz de provocar una respuesta inmunitaria, preferiblemente respuesta inmunitaria protectora o respuesta de tolerancia inmunitaria, en un sujeto humano o animal, y/o dicho producto, polipéptido o proteína profiláctica y/o terapéuticamente génico, es capaz de producir un efecto profiláctico y/o terapéutico en un sujeto humano o animal.
En una realización, la invención se refiere a una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se describe en este documento o la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, para uso como se describe en este documento que se formula para almacenamiento. En particular, en una realización, la invención se refiere a una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se describe en este documento que se congela, seca, seca por congelación, seca por pulverización o se almacena en medio.
Como se explicó hasta ahora, la invención también se refiere a composiciones que comprenden la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se describe en este documento o que comprenden la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, para uso como un medicamento. Dicha composición puede ser una composición farmacéutica. En una realización adicional, la invención se refiere a una composición o una composición farmacéutica, para uso en el tratamiento o para uso como un medicamento, un nutracéutico, un alimento médico, un alimento funcional, una composición probiótica, un aditivo para alimentos o un cultivo iniciador. En aún otra realización, la invención se refiere al uso de dicha composición o composición farmacéutica como un medicamento, nutracéutico, alimento médico, alimento funcional, probiótico, aditivo para alimentos, cultivo iniciador, o para la preparación de un medicamento, nutracéutico, alimento médico, alimento funcional, composición probiótica, aditivo para alimentos, cultivo iniciador.
Como se utiliza en este documento, las composiciones médicas como se describe en este documento, tal como formulación farmacéutica, nutracéutico, alimento médico o funcional o probiótico, preferiblemente comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable, es decir, una o más sustancias de vehículo farmacéuticamente aceptables y/o aditivos, por ejemplo, tampones, vehículos, excipientes, estabilizantes, etc. El término "farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en este documento es consistente con la técnica y significa compatible con los otros ingredientes de una composición farmacéutica y no perjudiciales para el receptor de los mismos.
En una realización, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, como se describe en este documento. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de una sustancia terapéutica o composición efectiva para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, por ejemplo, humano o animal, es decir, para obtener un efecto y desempeño local o sistémico
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deseado. Por medio del ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de bacterias puede comprender por lo menos 1 bacteria, o por lo menos 10 bacterias, o por lo menos 102 bacterias, o por lo menos 103 bacterias, o por lo menos 104 bacterias, o por lo menos 105 bacterias, o por lo menos 106 bacterias, o por lo menos 107 bacterias, o por lo menos 108 bacterias, o por lo menos 109, o por lo menos 1010, o por lo menos 1011, o por lo menos 1012, o por lo menos 1013, o por lo menos 1014, o por lo menos 1015, o más células anfitrionas, por ejemplo, bacterias, por ejemplo, en una dosis única o repetida. La bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, de la presente invención se puede administrar sola o en combinación con uno o más compuestos activos. estos últimos se pueden administrar antes, después o de forma simultánea con la administración de la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, de acuerdo con la invención.
Preferiblemente la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se describe en este documento o composición que comprende esta bacteria gram positiva, se proporciona en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo un comprimido, cápsula, enema o dosis de aerosol medida, de tal manera que se administra una única dosis al sujeto, por ejemplo, un paciente humano o animal.
Los ingredientes activos se pueden administrar de 1 a 6 veces al día, suficientes para exhibir la actividad deseada. Estas dosis diarias se pueden administrar como una sola dosis una vez al día, o se pueden administrar como dos o más dosis más pequeñas a la misma o diferentes horas del día, que en total dan la dosis diaria especificada. Preferiblemente, el ingrediente activo se administra una o dos veces al día. Por ejemplo, una dosis puede tomarse por la mañana y una más tarde en el día.
En todos los aspectos de la invención, la dosis de mantenimiento diaria se puede administrar durante un período clínicamente deseable en el paciente, por ejemplo desde 1 día hasta varios años (por ejemplo, para toda la vida restante del mamífero); por ejemplo de aproximadamente (2 o 3 o 5 días, 1 o 2 semanas, o 1 mes) o más y/o por ejemplo hasta aproximadamente (5 años, 1 año, 6 meses, 1 mes, 1 semana o 3 o 5 días). La administración de la dosis de mantenimiento diaria durante aproximadamente 3 a aproximadamente 5 días o durante aproximadamente 1 semana a aproximadamente 1 año es típica. Otros constituyentes de las formulaciones líquidas pueden incluir conservantes, sales inorgánicas, ácidos, bases, tampones, nutrientes, vitaminas u otros productos farmacéuticos.
Los sujetos humanos o animales que se enseñan aquí pueden referirse a humanos o animales que necesitan terapia o tratamiento, que comprende administrar a dicho humano o animal una cantidad terapéuticamente efectiva de bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se enseña en este documento. El animal puede ser preferiblemente un animal de sangre caliente, más preferiblemente un vertebrado, incluso más preferiblemente un mamífero, tal como, por ejemplo, animales domésticos, animales de granja, animales de zoológico, animales de deporte, mascotas y animales de experimentación tales como perros, gatos, conejillos de indias conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas; primates tales como simios, monos, orangutanes y chimpancés; cánidos tales como perros y lobos; felinos como gatos, leones y tigres; equinos tales como caballos, burros y cebras; animales de alimento tales como vacas, cerdos y ovejas; ungulados tales como ciervos y jirafas; roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y conejillos de Indias; y así sucesivamente. Generalmente, el término "sujeto" o "paciente" se puede utilizar indistintamente y se refiere particularmente a animales, preferiblemente animales de sangre caliente, más preferiblemente vertebrados, incluso más preferiblemente mamíferos, aún más preferiblemente primates, y específicamente incluye pacientes humanos y animales no humanos, mamíferos y primates. Los pacientes preferidos pueden ser sujetos humanos.
Ejemplos no limitantes adicionales de los tipos de enfermedades tratables en humanos o animales mediante el suministro de bacterias gram positivas, seleccionadas de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se describe en el presente documento, que expresan opcionalmente péptidos polipéptidos o proteínas profilácticos y/o terapéuticos, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, enfermedades inflamatorias del intestino que incluyen enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa (tratable con, por ejemplo, IL-Ira o IL-10 o IL-27 o péptidos trébol); enfermedades autoinmunitarias, que incluyen, pero no se limitan a, diabetes tipo 1, psoriasis, artritis reumatoide, lupus eritematoso (tratable con, por ejemplo, IL-Ira o IL-10 o IL-27 o el autoantígeno relevante); enfermedades alérgicas que incluyen, pero no se limitan a, asma, alergias alimenticias (tratables con el alergeno relevante); enfermedad celíaca (tratable con alérgenos de gluten y/o IL-27); trastornos neurológicos que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y esclerosis lateral amiotrófica (tratable con, por ejemplo, factor neurotrópico derivado de cerebro y factor neurotrópico ciliar); cáncer (tratable con, por ejemplo, IL-1, factores estimulantes de colonias o interferón-W); osteoporosis (tratable con, por ejemplo, factor de crecimiento transformante f3); diabetes (tratable con, por ejemplo, insulina); enfermedad cardiovascular (tratable con, por ejemplo, activador del plasminógeno tisular); aterosclerosis (tratable con, por ejemplo, citoquinas y antagonistas de citoquinas); hemofilia (tratable con, por ejemplo, factores de coagulación); enfermedad hepática degenerativa (tratable con, por ejemplo, factor de crecimiento de hepatocitos o interferón a); enfermedades pulmonares tales como fibrosis quística (tratable con, por ejemplo, alfa antitripsina); obesidad; infecciones por patógenos, por ejemplo, infecciones víricas o bacterianas (tratables con cualquier número de las composiciones o antígenos mencionados anteriormente); etc.
La bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, de acuerdo con la invención también se puede utilizar para tratar enfermedades infecciosas. En una realización, se puede obtener inmunización pasiva contra enfermedad asociada a Clostridium, preferiblemente enfermedad asociada a Clostridium dificile (CDAD), con anticuerpos neutralizantes de toxina producidos localmente y secretados a través de la bacteria
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gram positiva, de acuerdo con la invención. La CDAD está mediada por dos exotoxinas, la toxina A (enterotoxina, véase, por ejemplo, Genbank NC_009089.1, región: 795843..803975 para la secuencia de ADN o YP_001087137.1 para la secuencia de la proteína) y la toxina B (citotoxina; véase, por ejemplo, Genbank NC_009089.1, región: 787393..794493 para secuencia de ADN o YP_001087135.1 para secuencia de proteína). Ambas son proteínas de alta masa molecular que se unen a la superficie de las células epiteliales intestinales, donde se internalizan y catalizan la glucosilación de las proteínas rho citoplásmicas, lo que lleva a la muerte celular, la inflamación y la diarrea. También han sido implicados en la promoción de la virulencia, colonización y quimiotaxis y activación de C. difficile. La bacteria en sí no es invasiva y no causa daño tisular. Al neutralizar las toxinas de C. difficile con anticuerpos, se bloquea el mecanismo patogénico del patógeno, se puede disminuir su capacidad para prosperar en el intestino y se puede minimizar el impacto sobre la ecología microbiana, permitiendo la recuperación de la microflora normal. La ventaja médica de este método podría incluir una recuperación más rápida, menos recaídas y alivio de la presión selectiva para la resistencia a los antibióticos en la flora intestinal normal. De acuerdo con lo anterior, en una realización preferida, la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se describe en el presente documento adicional contiene, expresa, produce y/o secreta anticuerpos neutralizantes contra Clostridium, preferiblemente Clostridium dificile, toxina A y/o toxina B, en la que cada una de estas toxinas tiene preferiblemente la secuencia como se indicó anteriormente. El lector experto comprenderá que, además de los anticuerpos de longitud completa, se pueden utilizar diversos fragmentos funcionales o anticuerpos modificados o variantes, como se describe en este documento en otra parte.
El lector experto apreciará que las enfermedades enumeradas específicamente en este documento son solo de ejemplo y su mención no pretende en modo alguno limitar el uso de la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se enseña en este documento. a estas enfermedades particulares En cambio, un lector experto entiende que la bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, divulgada en este documento, se puede utilizar para expresar en principio cualquier producto de expresión, preferiblemente polipéptidos, de interés, que puede ser de relevancia terapéutica no solo en los enumerados, sino también en varias otras enfermedades o afecciones de humanos y animales. En consecuencia, una vez que un producto de expresión adecuado, preferiblemente un polipéptido, por ejemplo, un antígeno y/o un producto, polipéptido o proteína profiláctica y/o terapéuticamente génico, se ha elegido o determinado para una dolencia determinada, un experto sería capaz de lograr su expresión, aislamiento y/o suministro utilizando los presentes reactivos.
La bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, de la invención puede suspenderse en una formulación farmacéutica para administración al humano o animal que tiene la enfermedad que se va a tratar. Dichas formulaciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, células anfitrionas vivas y un medio adecuado para la administración. Las células anfitrionas recombinantes pueden secarse en presencia de excipientes comunes tales como lactosa, otros azúcares, estearato carbonato y/o sulfato alcalino y/o alcalinotérreo, (por ejemplo, estearato de magnesio, carbonato de sodio y sulfato de sodio), caolín, sílice, sabores y aromas.
La bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, de acuerdo con la invención secada, se puede preparar en forma de cápsulas, comprimidos, granulados y polvos, cada uno de los cuales se puede administrar por la ruta oral.
Alternativamente, se puede preparar alguna bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como suspensiones acuosas en medios adecuados, o se pueden suspender bacterias secadas en un medio adecuado justo antes de su uso, dicho medio incluye excipientes a los que se hace referencia en el presente documento y otros excipientes tales como glucosa, glicina y sacarinato de sodio.
Para la administración oral, se pueden formular formas de dosificación oral gastrorresistentes, formas de dosificación que pueden incluir también compuestos que proporcionan una liberación controlada de la bacteria gram positiva, y de ese modo proporcionan una liberación controlada de la proteína deseada codificada en la misma. Por ejemplo, la forma de dosificación oral (que incluyen comprimidos, gránulos, granulados, polvos) se puede recubrir con una capa delgada de excipiente (usualmente polímeros, derivados celulósicos y/o materiales lipofílicos) que resiste la disolución o alteración en el estómago, pero no en el intestino, lo que permite el tránsito a través del estómago a favor de la desintegración, disolución y absorción en el intestino.
La forma de dosificación oral se puede diseñar para permitir la liberación lenta de la bacteria gram positiva (y opcionalmente del producto de gen profiláctico y/o terapéutico del mismo), por ejemplo, comprimidos o cápsulas de liberación controlada, liberación sostenida y liberación prolongada o de acción sostenida. Estas formas de dosificación contienen habitualmente excipientes convencionales y bien conocidos, tales como excipientes hinchables lipófilos, poliméricos, celulósicos, insolubles. Las formulaciones de liberación controlada también se pueden utilizar para cualquier otro sitio de suministro, que incluye el intestino, el colon, la bioadhesión o el suministro sublingual (es decir, suministro a la mucosa dental) y suministro bronquial. Cuando las composiciones de la invención se van a administrar por vía rectal o vaginal, las formulaciones farmacéuticas pueden incluir supositorios y cremas. En este caso, las células anfitrionas se suspenden en una mezcla de excipientes comunes que también incluyen lípidos. Cada una de las formulaciones mencionadas anteriormente son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en las siguientes referencias: Hansel et al. (1990, Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 5th edition, William and Wilkins); Chien 1992, Novel drug delivery system, 2nd edition, M. Dekker); Prescott et al. (1989, Novel drug delivery, J. Wiley & Sons); Cazzaniga et al., (1994, Oral delayed release system for colonic specific delivery, Int. J. Pharm.i08:7’).
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Preferiblemente, se puede utilizar una formulación de enema para administración rectal. El término "enema" se utiliza para cubrir preparaciones líquidas destinadas para uso rectal. El enema se puede suministrar generalmente en recipientes de dosis única y contiene una o más sustancias activas disueltas o dispersas en agua, glicerol o macrogoles u otros solventes adecuados.
Una realización preferida de la invención proporciona una cápsula recubierta entérica que comprende bacterias gram positivas viables estabilizada seca por congelación, seca, o seca por pulverización, como se describe en este documento caracterizada porque las bacterias gram positivas viables, se estabilizan utilizando un agente no higroscópico. Como se utiliza en este documento se entiende que un agente no higroscópico significa cualquier excipiente normalmente utilizado en la formulación de una composición farmacéutica y en la que dicho agente exhibe una absorción de humedad en equilibrio a ambiente 40% de RH de no más de aproximadamente 8% en peso, preferiblemente no más de aproximadamente 7% en peso, y más preferiblemente no más de aproximadamente 6% en peso, por ejemplo aproximadamente 1% en peso a aproximadamente 5% en peso, más en particular menos o igual a 2% en peso. El agente no higroscópico puede ser un poliol tal como por ejemplo manitol, maltitol, isomalta (azúcar de poliol) o una sal de fosfato tal como por ejemplo fosfato de calcio dibásico fosfato dibásico anhidro, hidrogenofosfato de calcio o, por ejemplo, un azúcar tal como sacarosa.
La cápsula utilizada en la formulación mencionada anteriormente normalmente se selecciona del grupo que consiste de una cáspsula de gelatina, una cápsula de almidón, una cápsula de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y similares; en particular una cápsula de HPMC. Para el suministro intestinal de bacterias viables, las cápsulas recubiertas entéricas de la presente invención deben estables a pH bajo (hasta pH 5.5) y tienen un perfil de disolución acelerado a un pH más alto (por encima de pH 5.5). La liberación óptima se realiza cuando las cápsulas se desintegran a un pH de aproximadamente 6.8 dentro de 1 hora. Por lo tanto, en una realización adicional de la presente invención las cápsulas se recubren con un polímero entérico para proporcionar una cápsula con recubrimiento entérico que es estable un pH hasta 5.5 y que es soluble a un pH por encima de 5.5; en particular a un pH por encima de 6.0; más en particular con un perfil de disolución rápida a un pH de aproximadamente 6.8.
El polímero entérico utilizado para el recubrimiento entérico normalmente consiste en una sustancia polimérica formadora de película, que es soluble a un pH por encima de 5.5, en particular a un pH por encima de 6.0. Los polímeros conformables en película útiles en las diferentes realizaciones de la presente invención usualmente se seleccionan del grupo que consiste de un derivado de celulosa, un copolímero acrílico, un copolímero maleico, un derivado de polivinilo, shellac y similares; en particular un copolímero acrílico seleccionado del grupo que consiste de copolímero de estireno-ácido acrílico, copolímero de acrilato de metilo-ácido acrílico, copolímero de acrilato de metilo- ácido metacrílico, copolímero de acrilato de butilo-estireno-ácido acrílico, copolímero de ácido metacrílico-metacrilato de metilo tal como Eudragit L100, Eudragit S o Eudragit S100 (cada nombre comercial está, disponible comercialmente de Rohm Pharma, Alemania), copolímero de ácido metacrílico-acrilato de etilo tal como Eudragit L100-55 (nombre comercial, disponible comercialmente de Rohm Pharma, Alemania), copolímero de acrilato de metilo-ácido metacrílico- acrilato de octilo, y similares; más en particular el polímero formador de película consiste de copolímero de ácido metacrílico-metacrilato de metilo.
También se agrega una combinación de diferentes compuestos de estabilización (crioprotectores) a la biomasa bacteriana antes de secado, secado por pulverización, o secado por congelación. Esta combinación de compuestos de estabilización, que comprende un hidrolisato de almidón y una sal de ácido glutámico y/o un poliol, resulta en supervivencia y estabilidad mejorada de bacterias gram positivas secas, secas por pulverización, o secas por congelación, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria.
Se pueden utilizar formulaciones y cápsulas como se describe en este documento como un medicamento, nutracéutico, aditivo para alimentos, alimento funcional, alimento médico, cultivo iniciador y/o composición probiótica.
Por lo tanto, de acuerdo con la invención, en una realización preferida, la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se describe en este documento, o las composiciones (farmacéuticas) que comprenden esta bacteria gram positiva, se pueden administrar al animal o el humano a través de la mucosa, por ejemplo, una ruta oral, nasal, rectal, vaginal o bronquial mediante cualquiera de las formulaciones del estado de la técnica aplicables a la ruta específica. Las dosificaciones de bacteria gram positiva, para administración variarán dependiendo de cualquier número de factores que incluyen el tipo de bacteria y el gen codificado por el mismo, el tipo y la gravedad de la enfermedad que se va a tratar y la ruta de administración que se utilizará. Por lo tanto, las dosificaciones precisas no se pueden definir para todas y cada una de las realizaciones de la invención, pero serán fácilmente evidentes para aquellos expertos en la técnica una vez que estén armadas con la presente invención. La dosificación se podría determinar de todos modos caso por caso al medir las concentraciones a nivel del suero de la proteína terapéutica y/o profiláctica después de la administración de cantidades predeterminadas de células, utilizando métodos bien conocidos, tales como aquellos conocidos como ELISA o Biacore (véase ejemplos ) El análisis del perfil cinético y la vida media de la proteína recombinante suministrada proporciona información suficiente para permitir la determinación de un rango de dosificación efectivo para la bacteria gram positiva.
En una realización, cuando la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, expresa un antígeno, por lo tanto también la invención puede proporcionar una vacuna. Preferiblemente, el antígeno puede ser capaz de provocar una respuesta inmunitaria en y ser utilizado como una vacuna en un humano o
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animal. El término "vacuna" identifica una composición farmacéuticamente aceptable que, cuando se administra en una cantidad eficaz a un sujeto animal o humano es capaz de inducir anticuerpos contra un inmunógeno comprendido en la vacuna y/o provoca inmunidad protectora en el sujeto. La vacuna de la invención comprendería la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, tal como se describe en este documento, opcionalmente transformada con los ácidos nucleicos o vectores que codifican el antígeno y adicionalmente opcionalmente un excipiente. Dichas vacunas también pueden comprender un adyuvante, es decir, un compuesto o composición que mejora la respuesta inmunitaria a un antígeno. Los adyuvantes incluyen, pero sin limitación, adyuvante de Freund completo, adyuvante de Freund incompleto, saponina, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias surfactantes tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite o hidrocarburo, y adyuvantes humanos potencialmente útiles farmacéuticamente aceptables tales como BCG (bacilo Calmetle-Guerin) y Corynebacterium parvum.
Se describe en este documento un método para tratamiento o para una terapia, que comprende administrar la bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, o composiciones, preferiblemente una composición farmacéutica terapéutica o profiláctica a un individuo en necesidad de la misma.
Como se describió anteriormente, la composición que comprende la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, de acuerdo con la invención puede ser un cultivo iniciador, una composición probiótica, o un aditivo para alimentos. De acuerdo con lo anterior, la invención en un aspecto se refiere a un cultivo iniciador, una composición probiótica, o un aditivo para alimentos que comprende la bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, como se describe en este documento.
Un cultivo iniciador puede ser, por ejemplo, un cultivo líquido, cultivo presurizado líquido, en forma congelada o seca, que incluye, por ejemplo, forma seca, seca por congelación y forma seca por pulverización/lecho fluido, o congelada o seca por congelación concentrada. De acuerdo con lo anterior, en una realización, la invención se refiere a un cultivo iniciador como se describe en este documento, que se seca, seca por pulverización, congela o seca por congelación. El cultivo se puede empacar al vacío, o bajo una atmósfera de, por ejemplo, N2, CO2 y similares. Por ejemplo, un cultivo inicial se puede producir y distribuir en recintos sellados, preferiblemente no pirogénicos, que pueden estar elaborados de un material plástico u otro material rígido, no flexible o flexible, en el lugar de fermentación y se pueden agregar al material orgánico para fermentarse, u opcionalmente cultivarse primero en un medio iniciador separado para obtener un cultivo de alta densidad.
Un cultivo iniciador también puede contener, adicionalmente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, de acuerdo con la invención, agentes tamponantes y nutrientes estimuladores del crecimiento (por ejemplo, un carbohidrato asimilable o una fuente de nitrógeno), o conservantes (por ejemplo, compuestos crioprotectores) u otros vehículos, si se desea, tal como leche en polvo o azúcares.
Un cultivo iniciador puede ser un cultivo puro, es decir, puede contener una biomasa de un aislado único de una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, de acuerdo con la invención, es decir un clon que en principio se origina de una célula. En otra realización, un cultivo iniciador puede ser un co-cultivo, es decir, puede comprender más de una cepa de una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, de la invención, opcionalmente que adicionalmente comprende microorganismos adicionales tales como bacterias o levaduras.
Se puede preferir que un cultivo iniciador o un cultivo de alta densidad contenga por lo menos 102 unidades formadoras de colonia (CFU) de una o más bacterias gram positivas, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, de la invención, tal como por lo menos 103 CFU/g, por lo menos 104 CFU/g, por ejemplo, por lo menos 105 CFU/g, por lo menos 106 CFU/g, por ejemplo, por lo menos 107 CFU/g, por lo menos 108 CFU/g, por ejemplo, por lo menos 109 CFU/g, por lo menos 1010 CFU/g, por ejemplo, por lo menos 1011 CFU/g, por lo menos 1012 CFU/g, o por lo menos 1013 CFU/g.
Normalmente, un cultivo iniciador o un cultivo de alta densidad se puede agregar a un medio iniciador o a material orgánico o sustrato que se va a fermentar en una concentración de células viables de una o más cepas bacterianas (y opcionalmente de una o más cepas de levadura) que tiene por lo menos 102 (CFU) de una o más cepas bacterianas (y opcionalmente de una o más cepas de levadura) de la invención, tal como por lo menos 103 CFU/g, por lo menos 104 CFU/g, por ejemplo, por lo menos 105 CFU/g, por lo menos 106 CFU/g, por ejemplo, por lo menos 107 CFU/g, por lo menos 108 CFU/g, por ejemplo, por lo menos 109 CFU/g, por lo menos 1010 CFU/g, por ejemplo, por lo menos 1011 CFU/g, por lo menos 1012 CFU/g, o por lo menos 1013 CFU/g del material orgánico, medio o sustrato.
En una realización, la invención se refiere a un cultivo iniciador como se define en este documento para la preparación de un producto alimenticio o se refiere a un aditivo para alimentos o una composición probiótica, que comprende una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, que carece de actividad de trehalosa 6-fosfato fosforilasa (TrePP) y ptcC. En una realización preferida el gen que codifica TrePP endógeno se ha eliminado, interrumpido o inactivado parcial o completamente de tal manera que es incapaz de producir producto génico de trePP funcional, como se describe en este documento en otra parte. En una realización adicional, la bacteria gram positiva, en el cultivo iniciador, la composición probiótica, o el aditivo para alimentos no contiene trehalosa 6-fosfato fosfatasa heteróloga funcional (por ejemplo otsB) y/o una trehalosa 6- fosfato sintasa heteróloga funcional (por ejemplo otsA), como se describe en este documento en otra parte. En aún una realización adicional, la bacteria gram positiva, en
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el cultivo iniciador, composición probiótica, o aditivo para alimentos como se describe en este documento no contiene un gen heterólogo funcional involucrado en el metabolismo (ya sea catabólico o anabólico) de trehalosa o trehalosa 6- fosfato. Dichos genes abarcan, sin limitación trehalasa, trehalosa fosforilasa, y trehalosa 6-fosfato hidrolasa.
La invención se refiere a un cultivo iniciador, composición probiótica, o aditivo para alimentos como se define en este documento, en el que la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, carece de actividad de TrePP y componente IIC de sistema PTS específico a celobiosa (ptcC). En una realización preferida, el gen que codifica ptcC endógeno se ha eliminado, interrumpido o inactivado parcial o completamente de tal manera que es incapaz de producir producto génico de ptcC funcional, como se describe en este documento en otra parte.
En una realización adicional, la invención se refiere a un cultivo iniciador, composición probiótica, o aditivo para alimentos como se describe en este documento, en el que la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, sobreexpresa, preferiblemente sobreexpresa de forma constitutiva, uno o más genes que codifican un transportador de trehalosa, preferiblemente un transportador de trehalosa endógeno, como se describe en este documento en otra parte.
En aún otra realización, la invención se refiere a un cultivo iniciador, composición probiótica, o aditivo para alimentos como se describe en este documento, en el que la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, expresa uno o más productos génicos heterólogos, preferiblemente uno o más productos génicos profilácticos y/o terapéuticos, como se describe en este documento en otra parte.
En una realización, el cultivo iniciador, composición probiótica, o aditivo para alimentos como se describe en este documento se seca, congela, seca por pulverización o seca por congelación.
Como se indicó anteriormente, en un aspecto, la invención se refiere al uso de la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se describe en este documento para la preparación de un cultivo iniciador, preferiblemente para uso como un aditivo para alimentos o composición probiótica o para uso en la preparación de un producto alimenticio. En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de un cultivo iniciador como un aditivo para alimentos, composición probiótica o para la preparación de un producto alimenticio.
Como se utiliza en este documento, el término "aditivo para alimentos" se refiere a una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, preferiblemente formulada en una composición, que se puede agregar a un alimento humano o animal o pienso, apto para el consumo sin modificaciones adicionales o alternativamente después de una modificación adicional, tal como la fermentación parcial del alimento o pienso o la fermentación total o parcial de uno o más componentes del alimento o pienso. Por medio del ejemplo, y sin limitación, la bacteria gram positiva, de acuerdo con la invención, o las composiciones de acuerdo con la invención, tal como los cultivos iniciadores se describen en este documento, se pueden utilizar en la industria de lácteos, en particular para la preparación de productos lácteos fermentados, también conocidos como alimentos lácteos cultivados, productos lácteos cultivados o productos de leche cultivados. El proceso de fermentación aumenta la vida útil del producto, además de aumentar el sabor y mejorar la digestibilidad de la leche. Ejemplos de productos alimenticios a los que se hace referencia en este documento incluyen, entre otros, queso, yogur, crema agria, suero de leche, leche acidófila.
En un aspecto, la invención también se refiere a un método para preparar un medicamento, un aditivo para alimentos, una composición probiótica, o un cultivo iniciador como se define en este documento, en el que dicho cultivo iniciador es preferiblemente un cultivo iniciador para la preparación de un producto alimenticio, que comprende las etapas de:
i) propagar bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se define en este documento en un medio que comprende un material de sustrato capaz de ser fermentado por dicha bacteria gram positiva; y
ii) formular la bacteria gram positiva propagada, como un medicamento, aditivo para alimentos, composición probiótica, o cultivo iniciador, respectivamente.
Los métodos para propagar bacterias gram positivas, así como también medios y sustratos capaces de ser fermentados por bacterias gram positivas, se conocen buen en la técnica. En una realización, la formulación como un medicamento, aditivo para alimentos, composición probiótica, o cultivo iniciador comprende la formulación como un cultivo líquido, cultivo presurizado líquido, forma congelada o seca, que incluye, por ejemplo, forma seca, forma seca por congelación y forma seca por pulverización/lecho fluido, o congelada o seca por congelación concentrada. Preferiblemente, la formulación comprende secado, secado por pulverización, congelación o secado por congelación.
En un aspecto adicional, la invención también se refiere a un método para preparar un producto alimenticio, que comprende la etapa de mezclar la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, como se define en este documento, el aditivo para alimentos como se define en este documento, la composición probiótica como se define en este documento, o el cultivo iniciador como se define en este documento con un material de sustrato capaz de ser fermentado por dicha bacteria gram positiva. El material de sustrato es normalmente una fuente de carbono, preferiblemente un carbohidrato o azúcar. Los carbohidratos capaces de ser fermentados por bacteria gram positiva, incluyen pero no se limitan a monosacáridos o disacáridos tales como glucosa,
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fructosa, galactosa, sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa, celobiosa. En una realización, el método para preparar un producto alimenticio comprende las etapas de:
i) proporcionar la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, aditivo para alimentos, composición probiótica, o el cultivo iniciador como se describe en este documento;
ii) proporcionar un material de sustrato o una composición, preferiblemente una composición no tóxica o una composición comestible, que comprende un material de sustrato que es capaz de ser fermentado por dicha bacteria gram positiva;
iii) mezclar la bacteria gram positiva, como se define en este documento, aditivo para alimentos como se define en este documento, la composición probiótica como se define en este documento, o el cultivo iniciador como se define en este documento con el material de sustrato o composición
iv) opcionalmente propagar dicha bacteria gram positiva, y/o fermentar dicho material de sustrato o composición con dicha bacteria gram positiva.
En este documento se describe un producto alimenticio directa o indirectamente obtenido o que se puede obtener mediante los métodos descritos en este documento.
Como se describió anteriormente, la bacteria gram positiva, de acuerdo con la invención acumula de forma ventajosa trehalosa intracelularmente. De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, la invención también se refiere a un método para acumular de forma interna trehalosa en una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, tal como trehalosa que está presente en el medio de crecimiento, o trehalosa agregada externa o exógenamente, que comprende la etapa de propagar bacteria gram positiva de acuerdo con la invención en un medio que comprende un material de sustrato capaz de ser fermentado por dicha bacteria gram positiva. En una realización, el método para acumular de forma interna trehalosa en una bacteria gram positiva, comprende las etapas de:
i) proporcionar la bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, o el cultivo iniciador como se describe en este documento;
ii) proporcionar un material de sustrato o una composición, preferiblemente una composición no tóxica o una composición comestible, que comprende un material de sustrato que es capaz de ser fermentado por dicha bacteria gram positiva;
iii) mezclar la bacteria gram positiva como se define en este documento, o el cultivo iniciador como se define en este documento con el material de sustrato o composición
iv) opcionalmente propagar dicha bacteria gram positiva, y/o fermentar dicho material de sustrato o composición con dicha bacteria gram positiva.
La bacteria gram positiva, seleccionada de y una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, de acuerdo con la invención muestra de forma ventajosa una resistencia mejorada a estrés así como también características de fabricación, procesamiento y/o almacenamiento mejoradas. De acuerdo con lo anterior, se describe en este documento un método para mejorar resistencia al estrés o características de fabricación, procesamiento y/o almacenamiento de una bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, que comprende modificar la bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, de tal manera que carezca de actividad de TrePP. En una realización, el gen que codifica TrePP endógeno se ha eliminado, interrumpido o inactivado parcial o completamente de tal manera que es incapaz de producir producto génico de trePP funcional. Preferiblemente la resistencia al estrés o características de fabricación, procesamiento y/o almacenamiento es una o más resistencias al estrés o características de fabricación, procesamiento y/o almacenamiento seleccionadas del grupo que comprende resistencia a condiciones ácidas, resistencia a sales biliares, resistencia a calor, resistencia a sal, resistencia a secado, secado por pulverización, congelación o secado por congelación, y resistencia osmótica.
En una realización, la invención se refiere a cualquiera de los métodos como se describe en este documento, en los que la bacteria gram positiva, no contiene trehalosa 6-fosfato fosfatasa heteróloga funcional (por ejemplo otsB) y/o una trehalosa 6- fosfato sintasa heteróloga funcional (por ejemplo otsA), como se describe en este documento en otra parte. En aún una realización adicional, la invención se refiere a cualquiera de los métodos como se describe en este documento, en los que la bacteria gram positiva, no contiene un gen heterólogo funcional involucrado en el metabolismo (ya sea catabólico o anabólico) de trehalosa o trehalosa 6- fosfato. Dichos genes abarcan, sin limitación trehalasa, trehalosa fosforilasa, y trehalosa 6-fosfato hidrolasa.
La bacteria gram positiva, carece de componente IIC del sistema PTS específico a celobiosa (ptcC) actividad. En una realización preferida el gen que codifica ptcC endógeno se ha eliminado, interrumpido o inactivado parcial o completamente de tal manera que es incapaz de producir producto génico de ptcC funcional, como se describe en este documento en otra parte.
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En una realización adicional, la invención se refiere a cualquiera de los métodos como se describe en este documento, en los que la bacteria gram positiva, sobreexpresa, preferiblemente sobreexpresa de forma constitutiva, uno o más genes que codifican un transportador de trehalosa, preferiblemente un transportador de trehalosa endógeno, como se describe en este documento en otra parte.
En aún otra realización, la invención se refiere a cualquiera de los métodos como se describe en este documento, en los que la bacteria gram positiva, expresa uno o más productos génicos heterólogos, preferiblemente uno o más producto génico profiláctico y/o terapéutico, como se describe en este documento en otra parte.
En una realización, la invención se refiere a cualquiera de los métodos como se describe en este documento, que adicionalmente comprende la etapa de secado, congelación, secado por pulverización, o secado por congelación de la bacteria gram positiva, medicamento, aditivo para alimentos, composición probiótica, o cultivo iniciador.
Los inventores han encontrado de forma sorprendente que la bacteria gram positiva, de acuerdo con la invención es capaz de acumular intracelularmente trehalosa sin la adición de trehalosa agregada externamente. De forma ventajosa, la bacteria gram positiva, de acuerdo con la invención se puede propagar en medio opcionalmente incluso sin la trehalosa agregada externamente pero aún acumula trehalosa internamente. De acuerdo con lo anterior, en una realización, la invención se refiere a los métodos como se describe en este documento, que comprende la etapa de mantener o propagar la bacteria gram positiva, como se describe en este documento en un medio que carece o que sustancialmente carece de trehalosa, o un medio que carece o que sustancialmente carece de trehalosa agregada externa o exógenamente. De forma ventajosa, dicho medio puede comprender otra fuente de carbono fermentable, tal como, pero sin limitación maltosa y/o glucosa.
De acuerdo con lo anterior, en una realización, la invención se refiere a cualquiera de los métodos como se describe en este documento, en los que la bacteria gram positiva, de acuerdo con la invención se mantiene o propaga en un medio que comprende un material de sustrato capaz de ser fermentado por dicha bacteria gram positiva, en el que dicho material de sustrato comprende menos (tal como subóptimo), no comprende o sustancialmente no comprende trehalosa. Alternativamente, la invención se refiere a cualquiera de los métodos como se describe en este documento, en los que la bacteria gram positiva, de acuerdo con la invención se mantiene o propaga en un medio que comprende un material de sustrato capaz de ser fermentado por dicha bacteria gram positiva, en el que dicho material de sustrato comprende maltosa. En una realización preferida, la invención se refiere a cualquiera de los métodos como se describe en este documento, en los que la bacteria gram positiva, de acuerdo con la invención se mantiene o propaga en un medio que comprende un material de sustrato capaz de ser fermentado por dicha bacteria gram positiva, en el que dicho material de sustrato comprende maltosa y en el que dicho material de sustrato comprende menos (tal como subóptimo), no comprende o sustancialmente no comprende trehalosa.
Como se utiliza en este documento, un medio que no comprende o sustancialmente no comprende trehalosa o no se agrega exógena o externamente trehalosa se refiere a un medio que no contiene trehalosa o que solo contiene pequeñas cantidades de trehalosa. Preferiblemente, la cantidad o concentración de trehalosa en dicho medio es muy baja para permitir que la bacteria sea capaz de utilizar una sola fuente de carbono. En una realización, el medio contiene menos de 100 mM, preferiblemente menos de 50 mM, más preferiblemente menos de 25 mM, tal como menos de 15 mM, menos de 10 mM, menos de 5 mM, menos de 2 mM, o menos de 1 mM. En una realización adicional, el medio contiene menos de 2% en p/p o menos de 2% en v/p de trehalosa, preferiblemente menos de 1% en p/p o menos de 1% en v/p de trehalosa, más preferiblemente menos de 0.5% en p/p o menos de 0.5% en v/p de trehalosa, tal como menos de 0.3, menos de 0.2, menos de 0.1, menos de 0.05, o menos de 0.01% en p/p o% en v/p de trehalosa. En otra realización, el medio contiene menos de 20% trehalosa de la cantidad total de fuente de carbono o carbohidrato fermentable, preferiblemente menos de 10%, más preferiblemente menos de 5%, tal como menos de 3%, menos de 2%, o menos de 1%.
En este documento se describe el uso de la bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, como se describe en este documento para acumular trehalosa intracelular en dicha bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria. También se describe en este documento el uso de la bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, como se describe en este documento para cumular trehalosa intracelular en dicha bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, en la ausencia o sustancial ausencia de trehalosa. Se describe en este documento adicionalmente el uso de la bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, como se describe en este documento para acumular trehalosa intracelular en dicha bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, cuando se mantiene o propaga sobre maltosa, preferiblemente como la única o sustancialmente única fuente de carbono.
Como se describió anteriormente, la bacteria gram positiva de acuerdo con la invención muestra una resistencia mejorada a una variedad de estrés ambiental así como también características de fabricación, procesamiento y/o almacenamiento mejoradas. De acuerdo con lo anterior, en este documento se describe el uso de la bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, como se describe en este documento para mejorar la resistencia al estrés o para mejorar las características de fabricación, procesamiento y/o almacenamiento en dicha bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria. También se describe en este documento un método para mejorar resistencia al estrés o para mejorar características de fabricación,
procesamiento y/o almacenamiento en la bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, que comprende generar la bacteria gram positiva, preferiblemente una bacteria de ácido láctico (LAB) o Bifidobacteria, como se describe en este documento.
La resistencia al estrés se puede seleccionar del grupo que comprende resistencia a condiciones ácidas, resistencia a 5 sales biliares, resistencia al calor, resistencia a la sal, resistencia al frío, resistencia osmótica, o se puede seleccionar de resistencia a condiciones ácidas o sales biliares, o resistencia a sales biliares. Las características de fabricación, procesamiento y/o almacenamiento se puede seleccionar del grupo que comprende secado, congelación, secado por congelación, secado por pulverización o almacenamiento en medio, preferiblemente congelación o secado por congelación, más preferiblemente secado por congelación.
10 El otro aspecto, la invención se refiere a una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC y que adicionalmente sobreexpresa, preferiblemente sobreexpresa de forma constitutiva, uno o más transportadores de trehalosa. La invención se refiere a una bacteria gram positiva, seleccionada de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y que carece de actividad de ptcC. En otra realización, la invención se refiere a una bacteria gram positiva, seleccionada 15 de una bacteria de ácido láctico (LAB) y Bifidobacteria, que carece de actividad de TrePP y ptcC y (de forma constitutiva) sobreexpresa uno o más transportadores de trehalosa. En una realización adicional, la invención se refiere a cualquiera de estas bacterias gram positivas, que no contienen trehalosa 6-fosfato fosfatasa heteróloga funcional y/o trehalosa 6- fosfato sintasa heteróloga funcional. En otra realización, la invención se refiere a cualquiera de estas bacterias gram positivas, que contienen trehalosa 6-fosfato fosfatasa heteróloga funcional y/o trehalosa 6- fosfato 20 sintasa heteróloga funcional. En una realización adicional, la invención se refiere a cualquiera de estas bacterias gram positivas, que contienen uno o más productos génicos heterólogos, preferiblemente productos génicos profilácticos y/o terapéuticos, preferiblemente que no contiene trehalosa 6-fosfato fosfatasa heteróloga funcional y/o trehalosa 6-sintasa heteróloga funcional.
Los aspectos y realizaciones de la invención se respaldan adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitantes.
25 EJEMPLOS
La Tabla 1 proporciona una descripción general de las medicaciones genéticas en las cepas descritas en este documento, excepto para las cepas utilizadas en la Figura 4 que se dan en la Tabla 2.
Tabla 1
cepa
a) operón de trehalosa b) ptcC c) otsB d) thyA e) Cargo
trehalosa PTS I/II
TrePP
sAGX0037
wt (Ptre>>PTS) wt wt - KO (reemplazo génico) PhIIA>>hTFF10 (sitio thyA)
sAGX0085
wt (Ptre>>PTS) wt wt - KO (reemplazo génico) PhIIA>>hTFF1 (sitio thyA)
sAGX0137
wt (Ptre>>PTS) wt wt usp45>> otsB mutante KO (reemplazo génico) PhIIA>>hIL-10 (sitio thyA)
sAGX0139
wt (Ptre>>PTS) wt wt usp45>>otsB KO (reemplazo génico) PhIIA>>hIL-10 (sitio thyA)
sAGX0147
wt (Ptre>>PTS) KO wt usp45>> otsB mutante KO (reemplazo génico) PhIIA>>hIL-10 (sitio thyA)
sAGX0148
wt (Ptre>>PTS) KO wt usp45>>otsB KO (reemplazo génico) PhIIA>>hIL-10 (sitio thyA)
sAGX0167
PhIIA>>PTS KO wt usp45>>otsB KO (reemplazo génico) PhIIA>>hIL-10 (sitio thyA)
sAGX0169
wt (Ptre>>PTS) KO wt - KO (reemplazo génico) PhIIA>>hTFF-1 (sitio thyA)
sAGX0248
wt (Ptre>>PTS) KO KO (codón de terminación) - wt -
sAGX0272
wt (Ptre>>PTS) KO wt - wt -
cepa
a) operón de trehalosa b) ptcC c) otsB d) thyA e) Cargo
trehalosa PTS I/II
TrePP
sAGX0309
PhIIA>>PTS KO wt - KO (eliminación de genes) usp45>>CDP870 anti-TNF
sAGX0319
KO KO wt - KO (eliminación de genes) usp45>>CDP870 anti-TNF
sAGX0346
PhIIA>>PTS KO KO (codón de terminación) usp45>>otsB KO (eliminación de genes) -
sAGX0347
PhIIA>>PTS KO KO (eliminación de genes) usp45>>otsB KO (eliminación de genes) -
sAGX0354
PhIIA>>PTS KO KO (codón de terminación) usp45>>otsB KO (eliminación de genes) gapB>>CDP870 anti-TNF
Resumen de las modificaciones genéticas en las cepas descritas en este documento. Se indica a) la estructura del operón de trehalosa: si el promotor nativo del operón de trehalosa (Ptre) precede a los transportadores PTS de trehalosa (Ptre >> PTS) y si el trePP se eliminó (KO) o no (tipo silvestre; wt); b) estructura del gen ptcC: tipo silvestre 5 (wt), inactivado (KO) por inserción de un codón de terminación o eliminación de genes; c) ausencia (-) o presencia de
otsB funcionalmente inactiva (mutante) o otsB de tipo silvestre, ya sea insertada en el sitio thyA siguiendo al promotor thyA (PthyA >> otsB) o insertada como un segundo cistrón siguiendo el gen usp45 (usp45 >> otsB); d) estructura del gen thyA: tipo silvestre (wt) o inactivado (KO) por eliminación génica o inserción de un gen cargo (reemplazo génico); e) ausencia (-) o naturaleza y estructura de genes de cargo uidA, hIL-10 o anti-TNF CDP870, insertados en el sitio thyA 10 bajo el control del promotor hIIA (PhIIA >>) o insertados corriente abajo de los genes usp45 o gapB ( usp45 >>; gapB >>). Todas las cepas se derivan de L. lactis MG1363.
Tabla 2
Cepa
Gen inactivado Gen inactivado ID Producto de proteína inactivado
sAGX0241
pmrB 4799106 bomba de eflujo de resistencia a múltiples fármacos
sAGX0242
celB 4796591 componente IIC del sistema PTS específico a celobiosa
sAGX0245
araJ 4796972 Permeasa de eflujo de arabinosa putativo
sAGX0246
ptcB 4797109 componente IIB del sistema PTS específico a celobiosa
sAGX0247
ptcA 4798642 componente IIA del sistema PTS específico a celobiosa
sAGX0248
ptcC 4796893 componente IIC del sistema PTS específico a celobiosa
sAGX0249
msmK 4797024 proteína de unión a ATP de transporte de unión a azúcar múltiple
sAGX0250
IImg_0453 4797778 enzima PTS IIABC específica a sacarosa (operón tre)
sAGX0251
IImg_0454 4797093 componente IIABC del sistema PTS específico de beta- glucósido (operón tre)
sAGX0252
IImg_0489 4796717 proteína permeasa de sistema de transporte de azúcar
sAGX0253
IImg_0490 4796719 proteína permeasa de sistema de transporte de azúcar
sAGX0255
malG 4798664 proteína malG permeasa de transportador maltosa ABC
sAGX0256
malF 4798442 Proteína malF permeasa de sistema de transporte de maltosa
sAGX0257
malE 4798313 proteína de unión al sustrato de transportador de maltosa ABC
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Cepa
Gen inactivado Gen inactivado ID Producto de proteína inactivado
sAGX0258
IplB 4798767 proteína de unión al sustrato del transportador ABC de azúcar
sAGX0259
IplC 4796680 permeasa del transportador de azúcar ABC
sAGX0260
IplA 4797636 proteína de unión al sustrato del transportador ABC de azúcar
sAGX0261
bglP 4797495 Sistema PTS, enzima específica de beta-glucósidos IIABC
sAGX0262
11 mg_1104 4798113 proteína de exportación de fármaco
sAGX0265
tagG 4798685 proteína permeasa de transportador ABC de ácido teicoico
Resumen de cepas construidas para identificar el puerto de salida de trehalosa. Se construyeron cepas que son deficientes en trePP para permitir la acumulación de trehalosa y en las que se inactiva una selección de genes, tomada de las categorías funcionales de COG de L. lactis, "transporte y metabolismo de carbohidratos"
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/cogtik.cgi? gi = 20494 & cog = G (de la cual se tomó la nomenclatura de genes y proteínas). Se indica la ID del gen de los genes inactivados, así como el producto proteico inactivado.
La inactivación génica se realizó por recombinación dirigida por oligonucleótidos, introduciendo los codones de terminación en el marco en los respectivos genes objetivo. Todas las cepas se derivan de L. lactis MG1363.
EJEMPLO 1: Acumulación de trehalosa intracelular después de inactivación de trePP.
Sección Experimental
Las cepas se cultivaron durante la noche (A) o durante 24 horas (B) en 50 ml de GM17T + trehalosa 500 mM a 30 0C, las células se recolectaron por centrifugación y se determinó el contenido de trehalosa: se lavaron 3 equivalentes de 10 ml de cultivo durante a noche con tampón de carbonato 0.25 M en el que se determinó después del peso del sedimento celular (peso húmedo). Las células se lisaron en 1 ml de tampón carbonato 0.25 M utilizando la matriz B de lisis y el dispositivo MP Fasprep-24 a 6 m/s durante 40 segundos (MP Biomedicals). El sobrenadante de las células lisadas se separó por centrifugación y se calentó durante 30 minutos a 99 0C. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación y el sobrenadante se ensayó para la concentración de trehalosa utilizando un kit de ensayo de trehalosa (K-TREH 010/10, Megazyme, Irlanda). Brevemente, la trehalosa en las muestras se hidroliza a D-glucosa por trehalasa, y la D- glucosa liberada se fosforila mediante la enzima hexoquinasa y adenosina-5'trifosfato (ATP) a glucosa-6-fosfato con la formación simultánea de adenosina-5' difosfato (ADP). En presencia de la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, la glucosa-6-fosfato se oxida con dinucleótido fosfato nicotinamida-adenina (NADP+) a gluconato-6-fosfato con la formación de dinucleótido fosfato nicotinamida-adenina reducido (NADPH). La cantidad de NADPH formada en esta reacción es estequiométrica con la cantidad de D-glucosa y, por lo tanto, con la cantidad de trehalosa. Es el NADPH el que se mide por el aumento en la absorbancia a 340 nm (en comparación con el OD340 antes de la adición de la trehalosa). Los valores de trehalosa se calcularon mediante el uso de una dilución en serie de un patrón de trehalosa y se expresaron en mg/g de peso de sedimentos de células húmedas (ww).
Resultados
La acumulación de trehalosa intracelular es posible después de la inactivación de trePP, siguiendo la expresión de otsB o una combinación de los mismos, como se indica en la Figura 1. La Figura 1 (A) representa cepas de trePP de tipo silvestre (sAGX0037 y sAGX0137) que no acumulan trehalosa. La inactivación de trePP en sAGX0137 (que contiene un otsB mutante no funcional), que conduce a sAGX0147, permite la acumulación de trehalosa. La inserción de otsB de tipo silvestre sAGX0037, que conduce a sAGX0139, permite la acumulación de trehalosa. La combinación de otsB y trePP KO conduce a un aumento moderado en la acumulación de trehalosa (sAGX0148) que se potencia en gran medida mediante la inserción del fuerte promotor constitutivo PhllA (que se divulga en el documento Wo 2008/084115) frente a ambos genes del sistema fosfotransferasa (PTS) del operón de trehalosa de k(sAGX0167). La Figura 1 (B) muestra que la cepa de tipo silvestre trePP sAGX0085 que no puede acumular trehalosa. La inactivación de trePP KO (sAGX0169) solo permite la acumulación de trehalosa.
A partir de la Figura 1, está claro que las cepas trePP de tipo silvestre no acumulan trehalosa. La alteración génica (eliminación del gen pero también mutación puntual) de trePP permite la acumulación intracelular de trehalosa exógena. En la cepa sAGX0147 está presente un gen mutante no funcional de otsB, mientras que las cepas sAGX0169, sAGX0309 y sAGX0319 no tienen genes otsB. La cepa sAGX0169 lleva, a excepción del gen de carga hTFF1 presente en el sitio thyA, ninguna otra alteración genética que la alteración de trePP. La acumulación de trehalosa en una cepa trePP KO es inesperada ya que, según la técnica anterior, se consideraría que es críticamente dependiente de una trehalosa-6-fosfato fosfatasa (OTB o análogo). Dicha función no se ha descrito en L. lactis y no se esperaría que
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estuviera presente, ya que contrarrestaría el metabolismo de la trehalosa por L. lactis al convertir la trehalosa-6-fosfato en la trehalosa intracelular inerte. Aquí observamos que, inesperadamente, esta función está presente en TrePP KO de L. lactis se puede realizarse por eliminación de genes, como se hizo aquí o por el establecimiento de un codón de terminación o mutación de cambio de marco o una mutación de promotor o la identificación de un mutante de trePP espontáneo no funcional. La acumulación de trehalosa es posible cuando otsB está presente como tal (sAGX0139) o combinado con trePP KO (sAGX0148) o incluso combinado adicionalmente con una inserción del promotor constitutivo fuerte PhllA posicionado delante de ambos genes del sistema fosfotransferasa (PTS) (PhIIA >> trePTC) del operón de trehalosa de L. lactis (sAGX0167). La posición preferida de otsB, como se utiliza en este documento, es como un segundo cistrón detrás del gen usp45 indígena en una configuración como las solicitudes de patente europea descritas con los números de solicitud 11168495.7 y 11173588.2 (usp45 >> rpmD >> otsB, en el que rpmD es la región intergénica que precede a rpmD).
EJEMPLO 2: La acumulación de trehalosa exógena proporciona protección frente a lisis biliar Sección Experimental
Las cepas se cultivaron durante la noche en 50 ml de GM17T o GM17T + trehalosa 500 mM a 30 °C, las células se recolectaron por centrifugación y se resuspendieron en 25 ml de NaCl al 0.9%. Se tomaron muestras y se determinaron las CFU al colocar las diluciones apropiadas (iniciales). En T0, se agregaron 25 ml de oxgal al 1% en NaCl al 0.9% y las suspensiones celulares se incubaron durante 8 ha 37 °C. Las muestras se tomaron en T0, 1, 2, 4, 6 y 8 h. Las CFU se determinaron al colocar las diluciones apropiadas (Figura 2 A), se determinó el contenido de trehalosa (Figura 2 B) esencialmente como se describe en el Ejemplo 1
Resultados
La trehalosa intracelular protege contra la lisis biliar y la pérdida de trehalosa intracelular coincide con una resistencia disminuida a la lisis biliar. Por lo tanto, la pérdida de trehalosa es problemática para la estabilidad a largo plazo en la bilis.
Indicado en la Figura 2 es que la acumulación de trehalosa exógena en células de L. lactis proporciona protección frente a la lisis biliar. La liberación de trehalosa intracelular limita el efecto protector de la trehalosa en el tiempo. Las células de L. lactis que han acumulado trehalosa (sAGX0167 + trehalosa, sAGX0309 + trehalosa y sAGX0319 + trehalosa), es decir, cultivadas en trehalosa 500 mM como se describe en (Figura 2 B) muestran una protección sustancial en el tiempo contra la lisis biliar, proporcional a la concentración de trehalosa intracelular en comparación con células de L. lactis sin trehalosa intracelular (sAGX0167, precultivadas sin trehalosa). La disminución de la supervivencia en oxgal al
0.5% (Figura 2 A) coincide con la liberación de trehalosa intracelular (Figura 2 B).
EJEMPLO 3: La acumulación de trehalosa exógena proporciona protección frente a lisis biliar
Sección Experimental
Las células se recolectaron por centrifugación y se resuspendieron en una solución de sales 1xM9. Se tomaron muestras y se determinaron las concentraciones de trehalosa a T0, 1, 2 y 4 horas, esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Los datos son de ejemplo para todas las cepas de ptcC wt.
Resultados
Después de la acumulación, la trehalosa en cierta medida se filtra desde las células a través de un puerto de salida de trehalosa hasta ahora no identificado o no anticipado y puede recuperarse en el sobrenadante.
La Figura 3A indica que la trehalosa puede acumularse intracelular por síntesis de novo así como también después de la absorción del medio de crecimiento (sAGX0167 crecido en trehalosa 500 mM, como se describe en la Figura 1). Tanto la síntesis de novo sintetizada como la trehalosa acumulada exógenamente se liberan de las células. La Figura 3B indica que la pérdida de trehalosa intracelular da como resultado un aumento de la trehalosa presente en el sobrenadante del cultivo (expresado aquí en mg de trehalosa/10 ml de cultivo para permitir la comparación entre la concentración de trehalosa intracelular y extracelular).
EJEMPLO 4: Acumulación y liberación de trehalosa en diversas cepas descritas en la Tabla 2 Sección Experimental
Las cepas descritas en la Tabla 2 se cultivaron en GM17 complementado con trehalosa 100 mM (Figura 4 A) o 500 mM (Figura 4 B). Las células se recolectaron y se resuspendieron en tampón M9 (Difco). El contenido intracelular de trehalosa se determinó a T0, 2, 4 y 8 h, esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Excepto por sAGX0248 (ptcC KO), todas las cepas muestran una liberación similar de trehalosa como se describe en la Figura 3.
Resultados
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Se seleccionaron 20 transportadores de oligosacáridos MG1363 de L. lactis de la base de datos COG (sección Transporte de carbohidratos y metabolismo) y sus genes se rompieron mediante recombinación dirigida por oligonucleótidos en un fondo de trePP KO (sAGX0272, requerido para la acumulación de trehalosa) (Tabla 2; Figura 4) Solo la alteración de ptcC evita la liberación de trehalosa.
Uno no puede predecir cuál de los genes enumerados en la Tabla 2 está implicado en la liberación de trehalosa. La alteración de cualquiera de los genes transportadores de PTS presentes en el operón de trehalosa (IImg_0453; IImg_0454) no tiene ningún efecto sobre la absorción o liberación de trehalosa. La alteración del gen ptcC (que codifica el componente ITS del sistema PTS específico celobiosa) resuelve la fuga de trehalosa acumulada, por lo tanto, el PtcC es el puerto de salida de trehalosa y esta proteína provoca una fuga de trehalosa. La alteración de celB (componente IIC del sistema PTS específico a celobiosa) no tiene ningún efecto sobre la absorción o liberación de trehalosa. La interrupción de ptcC en el fondo trePP KO previene toda liberación de trehalosa.
EJEMPLO 5: Acumulación y liberación de trehalosa en diversas cepas descritas en la tabla 2
Sección Experimental
Las cepas se cultivaron durante la noche en GM17T + trehalosa 500 mM a 30 0C, las células se recolectaron por centrifugación y se resuspendieron en un volumen igual 1 x M9 (Figura 5 A) o oxgal al 0.5% en NaCl al 0.9% (Figura 5 B) y se incubaron durante 24 horas a 37 0C. Las muestras se tomaron en T0, 1, 2, 4, 6, 8, 12 y 24 h. El contenido intracelular de trehalosa se determinó como se describe en el Ejemplo 1.
Resultados
La combinación de ptcC KO (inserción del codón de terminación así como eliminación del gen) y PhIIA >> trePTC (alta expresión constitutiva del transportador de trehalosa) permite una alta importación de trehalosa y retención intracelular completa.
La Figura 5 indica que la inactivación de ptcC previene (en sales de M9, panel A) o retrasa (en oxgal al 0.5%, panel B) la liberación de trehalosa intracelular. La presencia del promotor constitutivo de PhllA fuerte (como se divulga en el documento WO 2008/084115, que incorporó en este documento en su totalidad como referencia) frente a ambos genes PTS del operón de trehalosa de L. lactis restaura la capacidad de acumular trehalosa exógena a la de una referencia cepa (ver también la Figura 4).
EJEMPLO 6: La acumulación de trehalosa exógena proporciona protección frente a la lisis biliar.
Sección Experimental
Las cepas se cultivaron durante la noche en GM17T + trehalosa 500 mM a 30 0C, las células se recolectaron por centrifugación y se resuspendieron en medio volumen de NaCl al 0.9%. Se tomaron muestras y se determinaron las CFU al colocar las diluciones apropiadas (iniciales). En T0, se agregó medio volumen de oxgal al 1% en NaCl al 0.9% y se incubó durante 8 ha 37 0C. Las muestras se tomaron a T0, 1, 2, 4, 6, 8, 12 y 24 horas. Se determinó el contenido de trehalosa (Figura 6A, esencialmente como en el Ejemplo 1) y las CFU se determinaron al colocar (solo 0-8 horas) de diluciones apropiadas y se representaron gráficamente como% de los valores iniciales de T0 (Figura 6 B).
Resultados
La capacidad potenciada para retener la trehalosa intracelular conduce a una resistencia biliar mejorada.
La Figura 6 indica que la acumulación de trehalosa exógena en células de L. lactis proporciona protección frente a la lisis biliar. La liberación de trehalosa intracelular (A) coincide con una supervivencia decreciente en oxgal al 0.5% (B). La inactivación de ptcC extiende la presencia en el tiempo de la trehalosa intracelular y en consecuencia también mejora la resistencia en el tiempo hacia oxgal.
EJEMPLO 7: Las cepas trePP KO son capaces de convertir glucosa o maltosa en trehalosa intracelular. La maltosa estimula la absorción de trehalosa mediante cepas trePP KO
Sección Experimental
Las cepas se cultivaron durante la noche en los medios indicados. La trehalosa se determinó esencialmente como se describe en el Ejemplo 1.
Resultados
Las cepas trePP KO han adquirido la capacidad de utilizar fuentes de carbono tales como glucosa o maltosa para acumular trehalosa. Esto no se describe en la técnica anterior ya que la trehalosa puede acumularse dentro de las células en MM17T, es decir, con maltosa como única fuente de carbono.
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La Figura 7 indica que las cepas trePP KO (tanto ptcC wt como ptcC KO) son capaces de convertir glucosa o maltosa en trehalosa intracelular (columnas 1 y 2, columnas 5 - 8). La maltosa potencia la absorción y la acumulación de trehalosa extracelular del medio de crecimiento en las cepas trePP KO (columnas 9 y 10).
Las cepas TrePP KO acumulan trehalosa cuando crecen:
1. Con glucosa como fuente de carbono (GM17T, columnas 1 y 2)
2. Con glucosa como fuente de carbono y trehalosa extracelular (GM17T + trehalosa 500 mM, columnas 3 y 4)
3. Con maltosa como fuente de carbono (MM17T, columnas 5 y 6)
4. Con glucosa y maltosa como fuente de carbono (GM M17T, columnas 7 y 8)
5. Con maltosa como fuente de carbono y trehalosa extracelular (MM17T + 500) mM trehalosa; columnas 9 y 10)
EJEMPLO 8: Supervivencia después de la liofilización
Sección Experimental
Tabla 3 A: El cultivo de 200 L optimizado para crecimiento (medio de fermentación libre de proteína animal) se concentró 10 veces mediante ultrafiltración y diafiltración y resuspensión en una mezcla crioprotectora concentrada (como se describe en el documento WO 2010/124855). El conteo de CFU por ml se determinó para la suspensión bacteriana. La suspensión se cargo en bandejas analíticas y a granel, las bandejas se pesaron y se liofilizaron. Para la evaluación de viabilidad, se reconstituyeron porciones de peso apropiadas liofilizadas con volúmenes apropiados de agua purificada y se determinó el recuento de CFU por ml. El% de viabilidad se determinó a partir de la relación de CFU antes y después de la liofilización.
Tabla 3 B: El cultivo de de 20 L durante la noche (GM17T + trehalosa 500 mM) se concentró 100 veces por centrifugación y resuspensión en una mezcla crioprotectora concentrada (como se describe en el documento WO 2010/124855). El conteo de CFU por ml se determinó para la suspensión bacteriana. La suspensión se liofilizó a granel y en viales (volumen de carga de 2.5 ml). Para la evaluación de la viabilidad, se reconstituyeron viales de 2.5 ml liofilizados con 2.5 ml de agua purificada y se determinó el recuento de CFU por ml. El% de viabilidad se determinó a partir de la relación de CFU antes y después de la liofilización. 2 tandas de producción independientes (sAGX0167 y sAGX0309) producen> 100% de supervivencia después de la liofilización.
Ambos polvos (A) y (B) liofilizados se formularon adicionalmente con excipientes adecuados para estandarizar CFU/g. sAGX0037, sAGX0167 y sAGX0309 se cargaron en cápsulas de HPMC a un mínimo de 1.2 x 1011 CFU/cápsula. Las cápsulas se unieron con una película de celulosa y se recubrieron con copolímeros de ácido metacrílico- acrilato de etilo como una película de recubrimiento entérico, para el suministro dirigido al intestino delgado y al colon.
La trehalosa se determinó esencialmente como se describe en el Ejemplo 1.
Resultados
Como se indica en la Tabla 3, las cepas que pueden acumular trehalosa muestran una resistencia muy mejorada al estrés de secado como se experimenta durante el secado por congelación.
Tabla 3
Cepa
CFU/ml de biomasa formulada CFU/ml de torta seca por congelación Contenido de trehalosa supervivencia
sAGX0037 exp. 1
1.60 x 1011 1.26 x 1011 n/a 79 %
sAGX0037 exp. 2
1.50 x 1011 1.47 x 1011 n/a 98 %
sAGX0037 exp. 3
A 1.40 x 1011 1.02 x 1011 n/a 73 %
sAGX0037 exp. 4
1.50 x 1011 1.26 x 1011 n/a 84 %
sAGX0085 exp. 1
2.00 x 1011 1.40 x 1011 n/a 70 %
sAGX0085 exp.
1.60 x 1011 1.42 x 1011 n/a 89 %
2
sAGX0167 exp. 1
B 1.14 x 1011 1.21 x 1011 16.29 mg/g ww 106 %
sAGX0309 exp. 1
1.21 x 1011 1.45 x 1011 16.72 mg/g ww 120 %
EJEMPLO 9: Supervivencia durante el paso intestinal a través del intestino porcino Sección Experimental
Las cerdas (> 150 kg) se equiparon quirúrgicamente con cánulas en el duodeno proximal y el colon proximal. En la 5 cánula duodenal, se insertaron sAGX0037 y sAGX0167 encapsulados y secados por congelación. Se tomaron muestras de contenido colónico de la cánula de colon a las 0, 2, 4, 6, 8 y 10 horas después de la administración. El% de viabilidad se determinó como la relación entre L.lactis en vivo (conteo de CFU) y total (vivo y muerto, análisis Q-PCR) en las muestras. Los números se dan en la Tabla 4.
Resultados
10 Las cepas que pueden acumular trehalosa muestran una supervivencia muy mejorada, independientemente del estado de alimentación o ayuno, en un sistema intestinal grande (cerdo).
La Tabla 4 y la Figura 8 indican que cuando se compara sAGX0037 encapsulado y secado por congelación (Tabla 4 A), con sAGX0167 encapsulado y secado por congelación (precrecimiento para acumulación de trehalosa intracelular; Tabla 4 B) aumenta la supervivencia durante el paso por el intestino del intestino de porcino tanto cuando los cerdos 15 están en ayunas durante 24 horas (Figura 8 A) así como durante la disponibilidad de alimento ad libitum (Figura 8 B).
Tabla 4
Punto de tiempo sAGX0037 sAGX0167 Valor p
En ayuno
T0 - -
T2
8.5% 45.1% 0.033
T4
3.0% 30.9% 0.001
T6
4.5% 24.8% 0.044
T8
1.9% 10.7% 0.176
T10
0.0% 13.2%
alimentado
T0 - -
T2
- -
T4
0.0% 89% 0.001
T6
0.0% 66% 0.173
T8
0.0% 25% 0.203
EJEMPLO 10: La trehalosa se puede acumular después de la producción de biomasa.
Sección Experimental
20 Las cepas indicadas se cultivaron durante la noche en GM17T (16 horas a 30 °C) y se recolectaron por centrifugación (15 min a 4000 rpm). Los sedimentos bacterianos se resuspendieron en GM17T + trehalosa 500 mM fresca y se incubaron. El contenido de trehalosa intracelular se determinó a T = 0, 1,2 y 4 horas como se describe en el Ejemplo 1.
Resultados
Como se indica en la Figura 9A, la trehalosa se puede acumular después de la producción de biomasa, cuando las bacterias se incuban a lo largo del tiempo. Como se indica en la Figura 9b, esto solo se puede lograr en las cepas trePP KO (sAGX0090 frente a otras) y no requiere inserción o eliminación adicional de genes (sAGX0169). La presencia adicional de otsB (sAGX0167, sAGX0346, sAGX0354, sAGX0360) estimula la acumulación de trehalosa.
5 EJEMPLO 11: La maltosa puede estimular la acumulación de trehalosa intracelular
Sección Experimental
Las cepas indicadas se cultivaron durante la noche (ON; 16 horas a 30 0C) en GM17T, +/- trehalosa 500 mM, GM17T + maltosa al 0.5% (GMM17T) + trehalosa 500 mM o M17T + maltosa al 0.5% (MM17T) + Trehalosa 500 mM y se recolectaron por centrifugación (15 min a 4000 rpm). El contenido intracelular de trehalosa se determinó como se 10 describe en el Ejemplo 1.
Resultados
Como se indica en la Figura 10, la maltosa estimula la acumulación de trehalosa intracelular en cultivos que crecen durante la noche.
EJEMPLO 12: La maltosa se puede convertir en trehalosa intracelular durante o después de la producción de biomasa 15 Sección Experimental
Las cepas indicadas se cultivaron durante la noche (ON, 16 horas a 30 0C) en GM17T, las células se recolectaron por centrifugación (15 min a 4000 rpm), se resuspendieron en M17T + maltosa al 0.5% (MM17T) y se incubaron durante 8 horas (> 8h MM17T). Alternativamente, las cepas indicadas se cultivaron ON en MM17T. El contenido de trehalosa intracelular se determinó como se describe en el Ejemplo 1.
20 Resultados
Como se indica en la Figura 11, la maltosa puede convertirse en trehalosa intracelular durante o después de la producción de biomasa.
ABREVIATURAS
ADP
adenosina-5'difosfato
anti-TNF
Anticuerpo que reconoce el factor de necrosis tumoral
ATP
adenosina-5'trifosfato
celB
componente IIC del sistema PTS específico para celobiosa
CFU
Unidad formadora de colonias
COGs
Agrupaciones de ortólogos de grupos de proteínas
Eno
enolasa fosfopiuvato hidratasa) gen (Gen ID: 4797432)
gapB
Gen de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (Gen ID: 4797877)
Gen ID
Identificador genético
GM17
Oxoide M17 + glucosa al 0.5%
GM17T
Oxoide M17 + glucosa al 0.5% + timidina a 0.2 mM
GMM17T
Oxoide M17 + glucosa a 0.5% + maltosa al 0.5% + timidina a 0.2 mM
hIL-10
Interlequina humana-10
HPMC
Hidroxipropilmetilcelulosa
hTFF-1
factor-1 de trébol humano
KO
Inactivación; eliminación de genes, reemplazo de genes, interrupción de genes
M
maltosa al 0.5%
M17
Oxoide M17
M9
Sales M9 (Difco)
MM17
Oxoide M17 + maltosa al 0.5%
MM17T
Oxoide M17 + maltosa al 0.5% + timidina a 0.2 mM
n/a
no aplicable
NADP+
fosfato dinucleótido de nicotinamida-adenina
NADPH
fosfato dinucleótido de nicotinamida-adenina reducida
ODx
Densidad óptica a x nm de longitud de onda
otsA
síntesis de trehalosa osmorreguladora de Escherichia coli A; trehalosa-6-fosfato sintasa
otsB
síntesis de trehalosa osmorreguladora de Escherichia coli B; trehalosa-6-fosfato fosfatasa
otsBA
Unidad de expresión acoplada para otsB y otsA
pgmB
p-fosfoglucomutasa (ID de Gen: 4797271)
PhIIA
Promotor del gen de la proteína de unión al ADN similar a HU (ID de Gen: 4797353)
ptcC
Componente IIC del sistema de PTS específico a celobiosa
Ptre
promotor de operón de trehalosa
PTS
sistema de fosfotransferasa
rpmD
Región intergénica que precede a la 50 S proteína ribosómica del gen L30
T
timidina a 0.2 mM
thyA
gen de timidilato sintasa (ID del gen: 4798358)
TNF
Factor de necrosis tumoral
trePP
trehalosa-6-fosfato fosforilasa (ID de Gen: 4797140)
trePTC
Genes de fosfotransferasas putativos en el operón de trehalosa de L. lactis (IImg_0453 y IImg_0454; ID de gen: 4797778 e ID de gen: 4797093, respectivamente)
TX
Punto de tiempo X horas
uidA
gen beta-D-glucuronidasa de Escherichia coli
usp45
gen de proteína de 45 kDa secretada no identificada (ID de Gen: 4797218)
wt
tipo silvestre
ww
peso de sedimentos de células húmedas
LISTADO DE SECUENCIAS <110> Actogenix N.V.
<120> Bacterias gram positivas modificadas y usos de las mismas 5 <130> AGX-031-PCT
<150> 11182642.6 <151 > 2011-09-23 <160> 13
<170> PatentIn versión 3.3 <210> 1 <211 > 2310 <212> ADN
5 <213> Lactococcus lactis
<400> 1
atgactgata
aagafctggat gataaaatat gacaaacaag aagtagggaa gegttettat 60
gggcaagaat
ctttaatgtc attgggaaat ggttatttag ggettcgtgg ggcgcctttg 12 0
tgggcaactt
gttcggataa tcattatccg ggactctatg ttgcaggggt Ctttaatcac 180
acaagtacag
aagttgcagg fccafcgatgfcfc atcaacgaag atatggtcaa ttggccaaat £40
ccacaattga
ttaaggttta tattgataat gaattggttg acttcgaggc agcaattgag 300
aaaaattctt
cgattgattt caaaaatgga ttgeaaattg agagctataa tgtcagttta 360
gccaagggag
gtttgacttt agtgaccaca aaatttgttg atcccatcca ’fc’fc’fctcacgat 4£D
t-t-tggg-ttcg
ttggagaaat oategotgat ttttctggaa aattgegaat agaaactttt 4B0
attgatggtt
cggtattgaa tcaaaatgtt gaaegetatc gggcttttga cagcaaagaa 540
tttgaagtga
ctcaaattgc tgat ggactt ttggtggcaa aaactagaac gacggaaata 600
gaattagcag
ttgcgactaa aaottattta aatggtcagc eattgaaaa¿ agtagaatct 660
ggaaattctg
aaatt-tttaa agaatoeatt gaagttgatt tactaaaaaa ccaagaagtt 720
cagtttgs 3a
aatcgattgt tattgctagt tcttatgaaa ccaaaaaccc tgttgaattt 780
gtgctgacag
aactggcagc aaattatgtc agtaaaatte aggaaaataa tgcaaattat 840
tgggagaaag
tatggcagga tggcgatatt gtcatcgaat ctgatcatgc ggatttgcaa 300
agaatggtgc
gaatgaatat tttccatatt cgccaagcgg cacaacacgg tgctaatceg 960
tttttagatg
cgtccgtagg tfcagagfcgga fcfcgacfcggfcg aaggfcfcatcg aggaeatatt 102 0
ttctgggatg
aaatttttgt tatacettat tatgcggcga atgaac.eaga aacagcgegt 1080
gatttgcttt
tgtaccgaat caatcgattg actgctgcac aggaaaatgc aaaggttgat 1140
ggagaaatag
gggcaatgtt tccttggcaa tccggcfctaa ttggggatga acaggcacaa l£DD
tttgttcatt
tgaafeacagfc aaafcaafcgaa fcgggaaccag afcaafcagtcg ecgteaaaga 1260
catgtcagct
tagctattgt ttaaaatatg tggatttact tacagctgac agatgatgaa 1320
agtattttga
ctgacggtgg actggatttg ctegttgaaa ccacgaagtt ttggttaaac 1380
aaagcagaat
tgggaagtga tagcagctat. catatcgctg gt gt catggg ’tc.drtgatgaa 1440
tatcatgagg
cttatccagg gcaagaaggt. ggtafrttgcg ataatgctta tacgaatttg 1500
atgctgactt
ggcagttaaa ttggctgaea gagetgteag tgaaaggttt tgaaattcca 1560
gcagatttgc
ttgaagagtc acaaaaggtt cgggaaaatc tttatttags tattgatgsg 1620
a atggtgtga
ttgcccaata tgctaagtat tttgagctta aagaagttga tt’ttgcagct 1680
tatgaagcaa
aatatggcga tattaatagg attgaeagtt tgafegaaggc tgagggaatt 1740
tcgcctgaeg
aatatcaagt ggctaaaeaa getgataeet tgatgttaat gtacaatttg 1BQQ
ggtcatgaac
atgtgatcaa attggtcaaa caattaggtt atgagetace caaaaattgg 1860
ttgaaagtta
atcgtgatta ttatattgca cgaactgtcc atggttcaac gacatctcgt 1920
ccagtttttg
ctgggattga tgtcaaattg ggtgattttg atgaageget tgacttttta 13BD
atcactgcga
ttggaagtga ttaotatgat attcaaggcg gaaccacggc cgaaggggtt 2040
cacattgggg
tcatgggaga aacacttgaa gtgattcaaa atgaatttgc cggtttgaca 2100
ctacgcgatg
gatacttttc aattgctacg catttaccaa aaagttggac caaattgaaa 2160
ttcagtcaaa
ttttcaaagg ttgtcaagtg gaaattttga ttgaaaaagg tcaattatta 2220
ctgacagctt
cat-cegact-t- gctgettaaa gtt-tetgatg aggaagttca gttaaaagca 2280
ggagtacaag
ctaattttga tttaaaataa 2310
<210>2 <211> 769 <212> PRT
5 <213> Lactococcus lactis
<400>2

Claims (21)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Una bacteria gram positiva seleccionada de una bacteria de ácido láctico y una Bifidobacteria, en la que dicha bacteria gram positiva carece de actividad de trehalosa-6-fosfato fosforilasa (TrePP) y actividad del componente IIC del sistema PTS específico a celobiosa (ptcC).
  2. 2. La bacteria gram positiva de la reivindicación 1, en la que un gen que codifica TrePP endógeno se ha eliminado, interrumpido o inactivado parcial o completamente de tal manera que dicho gen que codifica TrePP endógeno es incapaz de producir un producto génico de trePP funcional.
  3. 3. La bacteria gram positiva de la reivindicación 1 o 2, en la que un gen que codifica ptcC endógeno se ha eliminado, interrumpido o inactivado parcial o completamente de tal manera que dicho gen que codifica ptcC endógeno es incapaz de producir un producto génico de ptcC funcional.
  4. 4. La bacteria gram positiva de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha bacteria gram positiva no comprende fosfatasa de trehalosa-6-fosfato heteróloga funcional.
  5. 5. La bacteria gram positiva de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha bacteria gram positiva comprende uno o más genes que codifican un transportador de trehalosa.
  6. 6. La bacteria gram positiva de la reivindicación 5, en la que dicho uno o más genes que codifican un transportador de trehalosa es endógeno a dicha bacteria gram positiva y se sobreexpresa en dicha bacteria gram positiva.
  7. 7. La bacteria gram positiva de la reivindicación 6, en la que dicho transportador de trehalosa sobreexpresado en dicha bacteria gram positiva se expresa de forma constitutiva.
  8. 8. La bacteria gram positiva de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha bacteria gram positiva comprende uno o más productos génicos heterólogos.
  9. 9. La bacteria gram positiva de la reivindicación 8, en la que dicho uno o más productos génicos heterólogos son uno o más productos génicos profilácticos y/o terapéuticos o antígenos.
  10. 10. La bacteria gram positiva de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicha bacteria gram positiva se seca, seca por pulverización, congela o seca por congelación.
  11. 11. La bacteria gram positiva de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicha bacteria gram positiva es una bacteria de ácido láctico que es Lactococcus lactis.
  12. 12. Una composición que comprende una bacteria gram positiva de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
  13. 13. La composición de la reivindicación 12, en la que dicha composición es una composición farmacéutica que adicionalmente comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  14. 14. La composición de la reivindicación 12, en la que dicha composición es un cultivo iniciador para la preparación de un producto alimenticio.
  15. 15. La composición de la reivindicación 12, en la que la composición es una composición probiótica.
  16. 16. La composición de la reivindicación 12, en la que la composición es un aditivo para alimentos.
  17. 17. La bacteria gram positiva de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o la composición de la reivindicación 12 o 13, para uso como un medicamento.
  18. 18. Un método para preparar un medicamento, un aditivo para alimentos, una composición probiótica, o un cultivo iniciador, que comprende:
    i) cultivar una bacteria gram positiva seleccionada de una bacteria de ácido láctico y una Bifidobacteria en un medio que comprende un material de sustrato capaz de ser fermentado por dicha bacteria gram positiva, formando de esta manera una bacteria gram positiva propagada; y
    ii) formular dicha bacteria gram positiva propagada en dicho medicamento, dicho aditivo para alimentos, dicha composición probiótica, o dicho cultivo iniciador,
    en el que dicha bacteria gram positiva carece de actividad de actividad de TrePP y ptcC.
  19. 19. Un método para acumular de forma interna trehalosa en una bacteria gram positiva seleccionada de una bacteria de ácido láctico y una Bifidobacteria, que comprende cultivar dicha bacteria gram positiva en un medio que comprende un sustrato capaz de ser fermentado por dicha bacteria gram positiva, en el que dicha bacteria gram positiva carece de actividad de actividad de TrePP y ptcC.
  20. 20. Un método para preparar un producto alimenticio, que comprende mezclar el aditivo para alimentos de la reivindicación 16, la composición probiótica de la reivindicación 15, o cultivo iniciador de la reivindicación 14 con un material de sustrato que es capaz de ser fermentado por dicha bacteria gram positiva, opcionalmente que adicionalmente comprende fermentar dicho material de sustrato.
    5 21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 18-20, en el que el medio de cultivo comprende, como una
    fuente de carbono, maltosa, glucosa, o una combinación de maltosa y glucosa.
  21. 22. El método de la reivindicación 21, en el que el medio de cultivo no contiene trehalosa agregada de forma externa.
    imagen1
    Supervivencia (%)
    A
    Supervivencia relativa en Oxgall al 0.5%
    160%
    140%
    120%
    100%
    80%
    60%
    40%
    20%
    0%
    □ sAGXOI 67 en GM17T ■ sAGX0167en GM17T + 500 mM detrehalosa
    imagen2
    FIGURA 2
    mg de trehalosa/g ww de células
    B
    Acumulación y estabilidad de trehalosa en Oxgal al 0.5%
    imagen3
    SAGX0167
    sAGXD167 + trehalosa _ú— sAGXD309 + trehalosa —0-SAGX5319+ trehalosa
    0,0
    Tiempo (h)
    FIGURA 2
    mg de trehalosa/10 mi de cultivo
    imagen4
    imagen5
    FIGURA 3
    en
    o
    O
    J3
    >
    4^
    imagen6
    FIGURA 4
    (continuación)
    mg de trehalosa/g ww de células
    en
    ro
    o
    ro
    en
    o
    o
    CL
    CD
    O
    en
    cu
    ■SAGX0272
    03
    SAGX0251
    sAG X0242
    SAGXQ245
    sAG X0247
    SAGX0248
    SAGX0249
    SAGX0250
    SAGX0250
    SAGX0251
    SAGXQ252
    SAGX0253
    sAGX0255
    SAGX0256
    SAGX0257
    SAGX0258
    SAGX0259
    SAGX0260
    SAGX0261
    SAGX0262
    SAGX0265
    SAGXQ272
    sA(jX0242
    SAGX0245.,,
    SAGX0247
    SAGXQ248
    SAGX0249
    SAGX0250
    SAGX025Q
    SAGXQ252
    SAGX0253
    SAGX0255
    SAGX0256
    SAGX0257
    SAGX0258
    SAGX0259
    SAGX0260
    SAGX0261
    SAGX0262
    SAGX0265
    O)
    ro
    FIGURA 4
    imagen7
    mg de trehalosa/g ww de células mg de trehalosa/g ww de células
    A
    Acumulación de trehalosa en GM17T + 500 mM de trehalosa y estabilidad en 1xM9 a 37 °C
    imagen8
    SAGXD167
    SAGXD346
    sAG>ü347
    SAGXD354
    Acumulación de trehalosa en GM17T + 500 mM de trehalosa y estabilidad en Oxgal al 0.5% a 37 °C
    imagen9
    SAGXD167
    SAGXD346
    SAGX0347
    SAGX)354
    FIGURAS
    A
    imagen10
    imagen11
    FIGURA 6
    mg de trehalosa/g ww de células
    Acumulación de trehalosa ¡ntracelular de SAGX0167 y SAGX0346 después de crecimiento ON en diferente medio
    imagen12
    GM17T
    GM17T + 500 mM de trehalosa
    MM17T
    GMM17T
    MM17T + 500 mM de trehalosa
    FIGURA 7
    SAGX0346
    imagen13
    FIGURA 9
    imagen14
    -i N3 n:
    o en o oí o en
    imagen15
    imagen16
    en
    co
    FIGURA 11
    imagen17
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103917639B (zh) 2011-09-23 2017-09-26 英特瑞克斯顿阿克图比奥帝克斯有限公司 经修饰的革兰氏阳性细菌及其用途
EP3735979A1 (en) 2014-12-23 2020-11-11 Ilya Pharma AB Methods for wound healing
RU2021135949A (ru) 2016-09-13 2022-04-14 Интрексон Актобиотикс Н.В. Мукоадгезивный микроорганизм
CN108410763B (zh) * 2018-03-14 2020-10-09 绍兴同创生物科技有限公司 长双歧杆菌tc01及其应用和应用其的产品
CN113481207B (zh) * 2021-07-15 2023-04-07 西南大学 家蚕卵滞育的必需基因Bmtret1及其应用

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9006400D0 (en) 1990-03-22 1990-05-23 Ciba Geigy Ag Bacterial vectors
US6277969B1 (en) 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
IT1270123B (it) 1994-10-05 1997-04-28 Dompe Spa Composizioni farmaceutiche contenenti microorganismi ingegnerizzati e loro uso per terapia
GB9521568D0 (en) 1995-10-20 1995-12-20 Lynxvale Ltd Delivery of biologically active polypeptides
US6033376A (en) 1998-09-30 2000-03-07 Allergan Sales, Inc. Wound shaper sleeve
ATE259829T1 (de) 1998-10-20 2004-03-15 Vlaams Interuniv Inst Biotech Verwendung eines zytokine-produzierenden lactococcus stammes zur behandlung von kolitis
US7220418B1 (en) 1999-07-05 2007-05-22 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Delivery of trefoil peptides
AT407730B (de) 2000-01-14 2001-05-25 Hoerbiger Hydraulik Betätigungsanordnung für schwenkbare teile an fahrzeugen
GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
WO2002090551A2 (en) 2001-05-03 2002-11-14 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Self-containing lactococcus strain
CA2506031A1 (en) 2002-11-15 2004-06-03 Vib Vzw Self-containing lactobacillus strain comprising a thya mutation and therapeutic applications thereof
PL1720974T5 (pl) 2004-02-24 2023-09-18 Chr. Hansen A/S Zamrożona kultura bakterii kwasu mlekowego w oddzielnych peletkach
AU2005243441A1 (en) 2004-05-18 2005-11-24 Universiteit Gent Self-containing lactobacillus strain
DK1789529T3 (da) 2004-08-20 2013-11-11 Actogenix Nv Fremgangsmåde til forbedring af konserveringen af lactococcus
WO2007025977A2 (en) 2005-08-30 2007-03-08 Actogenix Nv Anti-tnf alpha producing lactic acid bacteria for the treatment of chronic enterocolitis
JP5410759B2 (ja) 2005-11-29 2014-02-05 アクトジェニックス・エヌブイ 抗原に対する粘膜寛容の誘導
CA2649932A1 (en) 2006-05-02 2007-11-15 Actogenix Nv Microbial intestinal delivery of obesity related peptides
JP2010513245A (ja) 2006-12-14 2010-04-30 アクトジェニックス・エヌブイ 免疫調節を誘起するための結合分子の送達
KR101557509B1 (ko) 2007-01-12 2015-10-06 액토제닉스 엔.브이. 락토코커스 프로모터 및 그것의 용도
EP2774621B1 (en) * 2007-01-25 2018-01-24 Intrexon Actobiotics NV Treatment of immune disease by mucosal delivery of antigens
EP2344626B1 (en) 2008-09-29 2017-03-29 Intrexon Actobiotics NV Reduced colonization of microbes at the mucosa
CN102414310B (zh) 2009-04-30 2015-05-06 阿克图杰尼斯公司 用于冷冻干燥乳酸菌的冷冻保护剂
CN103917639B (zh) 2011-09-23 2017-09-26 英特瑞克斯顿阿克图比奥帝克斯有限公司 经修饰的革兰氏阳性细菌及其用途

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