JP2014526266A - 改変されたグラム陽性菌及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、増大したストレス抵抗性及び／又は改善された製造特性、加工特性及び／又は保存特性を有するグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌に関する。特に、本発明は細胞内トレハロースを蓄積させるグラム陽性菌に関する。本発明によるグラム陽性菌は、トレハロース６−リン酸ホスホリラーゼ（ＴｒｅＰＰ）活性を欠いている。本グラム陽性菌は、更にセロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（ｐｔｃＣ）活性を欠いていてもよい。本グラム陽性菌は更にトレハローストランスポーターを過剰発現し得る。本発明は、かかるグラム陽性菌を含む組成物並びにその方法及び使用に更に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、改善されたストレス抵抗性並びに改善された製造特性、加工特性及び保存特性を有するグラム陽性菌等の微生物に関する。本発明は特に、細胞内トレハロースを蓄積させる遺伝子組み換え微生物に関する。本発明は、食品技術及び医学的用途におけるこれらの微生物の使用に更に関する。
グラム陽性菌は、単一の脂質二重層細胞膜を有するものとしてまとめて分類される。グラム陽性菌は多数の桿状及び球状の（cocciform）細菌属、とりわけビフィズス菌及び乳酸菌（ＬＡＢ）としてまとめて知られる属の群を含む。ＬＡＢは、共通の代謝特性及び生理的特性によって関連付けられるグラム陽性、低ＧＣ、酸耐性の、概して非芽胞形成性、非呼吸性の桿菌又は球菌の分岐群である。通常は（腐敗した）植物及び乳製品中に見られるこれらの細菌は、炭水化物発酵の主要代謝最終産物として乳酸を産生する。酸性化によって腐敗物質の成長が阻害されるため、この特質から、歴史を通して、ＬＡＢと食品発酵とが関連付けられている。原型ＬＡＢのラクトコッカス・ラクティス（Lactococcuslactis）は中温性かつ微好気性の発酵性乳酸菌である。この細菌はとりわけ酪農業における食品発酵に広く用いられているが、膣感染等の体腔の感染を治療する医薬又は生物学的に活性な分子の送達用の担体としての薬剤及び栄養補助食品におけるその使用への関心が高まっている。これら全ての場合において、生存能力の高いスターター培養物又は高比率の生菌を含む医薬品配合物若しくは栄養補助食品配合物が必要とされている。しかしながら、ラクトコッカス・ラクティス（L. lactis）は、保存中又は加工（例えば（for a.o）乾燥粉末処方の作製、錠剤の形成）中に生存能力を失う傾向がある。生存能力の低下は、凍結乾燥後の細菌が強酸性又は胆汁塩の存在等の付加的なストレスを受けた場合に更に顕著である。
この問題を克服するために幾つかの方法が提案されている。トレハロースの使用への関心が特に高い。トレハロース（α−Ｄ−グルコピラノシル−１，１−α−Ｄ−グルコピラノシド）は、細菌から無脊椎動物まで多様な生物に見られる非還元性二糖類である。トレハロースは、場合によってはデキストランと組み合わせて、外部から添加される凍結保存剤（cryopreservant）として使用されることが多い。外部から添加されたトレハロースはサッカリド基質として機能し（非特許文献１）、とりわけフリーズドライ時にガラス形成剤として作用し、保護効果を発揮する。さらに、トレハロースはストレス代謝産物としてよく認められており、真菌、とりわけサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）において広く研究されている。高濃度の内部トレハロースは保存能力を改善し、凍結保存時により高い生存能力をもたらす。しかしながら、外部から添加されたトレハロースは取り込まれないか又は取込み後急速に代謝されるため、微生物において内部トレハロース蓄積を殆どもたらさないことに留意しなくてはならない。
Termont et al.（非特許文献２）は、デノボ合成されたトレハロースが、ｏｔｓＡ（トレハロース−６−リン酸シンターゼ）及びｏｔｓＢ（トレハロース−６−リン酸ホスファターゼ）のプラスミド誘導過剰発現によって、ラクトコッカス・ラクティスにおいて細胞内に蓄積することを報告している。外生的に添加されたトレハロースではない細胞内トレハロースの蓄積は、ラクトコッカス・ラクティスを胆汁溶解及びフリーズドライによる細胞死から保護する。ラクトコッカス・ラクティスは極めて影響を受け易いため、胆汁溶解に対する保護を細胞内トレハロース蓄積の優れた機能的なアッセイとして用いることができる。
Andersson et al.（非特許文献３）は、ラクトコッカス・ラクティスにおけるトレハロース利用の新規の経路を記載している。この経路は、トレハロース−６−リン酸をβ−グルコース１−リン酸及びグルコース６−リン酸へと変換するトレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ（ｔｒｅＰＰ）の活性を用いるものである。Andersson et al.は、トレハロースで成長する能力の喪失をもたらすラクトコッカス・ラクティスにおけるｔｒｅＰＰの挿入不活性化を記載している。
トレハロースの細胞内蓄積について、Carvalho et al.（非特許文献４）は、ラクトコッカス・ラクティスｔｒｅＰＰ及びβ−ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍＢ）のプラスミド誘導過剰発現を利用する方法を記載している。Carvalho et al.によって示されるように、細菌がトレハロース６−リン酸ホスファターゼを欠いている場合に、食品等級生物プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（P. freudenreichii）に由来するそれぞれの遺伝子ｏｔｓＢを用いて所要の活性が得られた。得られる細胞は低温ショック、熱ショック及び酸性に対する抵抗性の改善を示した。
これらのプロセスは確かに保存の改善をもたらすが、細菌を医学的用途で生物学的に活性な化合物の送達に用いる場合だけでなく、細菌を酪農業等の食品産業に用いる場合にも、ＬＡＢ又はビフィズス菌等のグラム陽性菌の保存の改善をもたらすことのできる方法が更に必要とされている。
Conrad et al., 2000 Appl Environ Microbiol 72:7694; 2006 J Biol Chem 276:42707; 2001 Appl Environ Microbiol 77:4189; 2011
細胞内トレハロースは、乳酸菌（ＬＡＢ）等の微生物、例えばラクトコッカス・ラクティス細胞を様々な有害な物質又は条件から保護することができる。例としては、腸通過時に生ＬＡＢに起こる胆汁酸溶解、又はＬＡＢの保存に用いられる凍結、乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥の際の凍結ストレス及び／又は乾燥ストレスがある。
細胞内でのトレハロースの蓄積を可能にする利用可能なアプローチは限られている。これらは相同遺伝子又は異種遺伝子のプラスミド誘導過剰発現を利用するものである。しかしながら、これは医薬品又は食品に用いるのに望ましい形態ではない。
ここで、好ましくは内因性ＴｒｅＰＰをコードする遺伝子を、機能的なｔｒｅＰＰ遺伝子産物を産生することが不可能なように部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化させることによる、グラム陽性菌におけるトレハロース６−リン酸ホスホリラーゼ（ＴｒｅＰＰ）活性の欠如のみに基づくトレハロースの細胞内蓄積を可能にする新規のアプローチを報告する。本アプローチとは対照的に、以前の研究（国際公開第２００６／０１８４４６号）では、トレハロース蓄積を達成するためにｏｔｓＢ等の異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを発現させることが教示されている。非特許文献４では、細胞内トレハロース蓄積を得るためにＴｒｅＰＰを過剰発現することも指示されている。さらに、ラクトコッカス・ラクティス等のＬＡＢはトレハロースを利用することが可能であり得るが、トレハロース合成ラクトコッカス・ラクティス株はこれまで記載されていなかった。ラクトコッカス・ラクティス中に存在する代謝産物であるグルコース−６−リン酸から開始するトレハロース産生に必須であると考えられていた、内因性トレハロース−６−リン酸シンターゼ及びトレハロース−６−リン酸ホスファターゼ遺伝子は同定されていない。
一態様では、本発明は、トレハロース６−リン酸ホスホリラーゼ（ＴｒｅＰＰ）活性を欠き、薬剤として使用されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌に関する。
更なる態様は、ＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を含む薬剤を提供する。かかる薬剤は、例えば医薬品配合物、栄養補助食品、メディカルフード若しくは機能性食品、又はプロバイオティクスを包含し得る。
別の態様では、本発明は、プロバイオティクス又は食品添加物、より具体的には非薬物的プロバイオティクス又は食品添加物としてのＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の使用を提供する。限定されるものではないが、かかる食品添加物はスターター培養物、好ましくは食品の調製用のスターター培養物であり得る。したがって、関連の態様は、スターター培養物、好ましくは食品の調製用の、より具体的には非薬物的食品である食品の調製用のスターター培養物としてのＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の使用を提供する。
更なる態様は、ＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を含むプロバイオティック組成物又は食品添加物、より具体的には非薬物的プロバイオティック組成物又は食品添加物を提供する。限定されるものではないが、かかる食品添加物はスターター培養物、好ましくは食品の調製用のスターター培養物であり得る。したがって、関連の態様は、ＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を含むスターター培養物、好ましくは食品の調製用のスターター培養物を提供する。
ＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌、又は上記食品添加物若しくは上記スターター培養物と、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌によって発酵させることが可能な基質材料とを混合することを含む、食品を調製する方法も本発明の一態様によって提供される。実施の形態では、かかる方法は上記基質材料を発酵させる工程を更に含み得る。このため、任意のかかる方法によって得ることができる食品が更に提供される。食品はプロバイオティクスを包含し得るが、これに限定されない。
別の態様は、医薬品配合物、栄養補助食品、メディカルフード若しくは機能性食品、若しくはプロバイオティクス等の薬剤を調製する、又はプロバイオティック組成物若しくは食品添加物、より具体的には非薬物的プロバイオティック組成物若しくは食品添加物を調製する、又はスターター培養物、好ましくは食品の調製用のスターター培養物を調製する方法であって、ｉ）ＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を、該グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌によって発酵させることが可能な基質材料を含む培地中で増殖させる工程と、ｉｉ）そのようにして増殖させたグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を、薬剤又はプロバイオティック組成物又は食品添加物又はスターター培養物のそれぞれに配合する工程と、を含む、方法を提供する。したがって、医薬品配合物、栄養補助食品、メディカルフード若しくは機能性食品、若しくはプロバイオティクス等の薬剤の調製、又はプロバイオティック組成物若しくは食品添加物、より具体的には非薬物的プロバイオティック組成物若しくは食品添加物の調製、又はスターター培養物、好ましくは食品の調製用のスターター培養物の調製へのＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の使用も包含される。
本発明者らは、本明細書に記載されるＬＡＢ又はビフィズス菌等のグラム陽性菌が、炭素源とは無関係に細胞内トレハロース蓄積が可能であるだけでなく、該グラム陽性菌が、様々なストレス及び保存に関連する条件に対して大幅に向上した抵抗性も示すことを見出した。例えば、グラム陽性菌は乾燥、凍結、噴霧乾燥又はフリーズドライ（凍結乾燥）等の保存に関連する操作に対してより高い抵抗性を示す。グラム陽性菌は、飼養状態又は絶食状態とは無関係に胃腸系における生存の向上も示し、酸性及び胆汁溶解に対する抵抗性の改善が示される。本明細書に記載されるグラム陽性菌の性能は、医療状況又は食品産業に関わらず、以前に知られているよりも再現性が高い。したがって、本発明の原理を具体化するグラム陽性菌は、よりロバストな環境抵抗性及び生物学的抵抗性をもたらす。
このため、一態様では、本発明はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌においてトレハロースを内因的に蓄積させる方法であって、ＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を、該グラム陽性菌によって発酵させることが可能な基質材料を含む培地中で増殖させることを含む、方法にも関する。
更なる態様では、本発明はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌のストレス抵抗性又は製造特性、加工特性及び／又は保存特性を改善する方法であって、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を、ＴｒｅＰＰ活性を欠くように改変することを含む、方法に関する。好ましくは、ストレス抵抗性又は製造特性、加工特性及び／又は保存特性は、酸性条件に対する抵抗性、胆汁塩に対する抵抗性、熱に対する抵抗性、塩に対する抵抗性、乾燥、凍結、噴霧乾燥又はフリーズドライに対する抵抗性、及び浸透圧抵抗性を含む群から選択される１つ又は複数であり得る。
上述のＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌において、内因性ＴｒｅＰＰをコードする遺伝子が、機能的なｔｒｅＰＰ遺伝子産物を産生することが不可能なように部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されていることが好ましい。かかる欠失、破壊又は不活性化が例えばｔｒｅＰＰ遺伝子のコード配列及び／又はｔｒｅＰＰが発現されるプロモーターを標的とし得ることが理解されよう。
好ましい実施の形態では、本明細書で採用されるＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有しない。既に説明したように、異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼ、例えば大腸菌（Escherichia coli）又はプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Propionibacteriumfreudenreichii）に由来するｏｔｓＢの過剰発現は、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌におけるトレハロース蓄積の達成に不可欠であることが以前に推定されている。
好ましい実施の形態では、本明細書で採用されるＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、機能的な異種トレハロース６−リン酸シンターゼを含有しない。既に説明したように、異種トレハロース６−リン酸シンターゼ、例えば大腸菌に由来するｏｔｓＡの過剰発現は、ＬＡＢにおいてトレハロース蓄積を達成することが以前に示されている。
好ましい実施の形態では、本明細書で採用されるＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有せず、機能的な異種トレハロース６−リン酸シンターゼを含有しない。
好ましい実施の形態では、本明細書で採用されるＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩ Ｃコンポーネント（ｐｔｃＣ）活性を欠いていてもよい。ｐｔｃＣ活性も欠くかかるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌において、機能的なｐｔｃＣ遺伝子産物を産生することが不可能なように内因性ｐｔｃＣをコードする遺伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されていることが好ましい。かかる欠失、破壊又は不活性化が例えばｐｔｃＣ遺伝子のコード配列及び／又はｐｔｃＣが発現されるプロモーターを標的とし得ることが理解されよう。本発明者らは、蓄積トレハロースが、これまで予期及び同定されていないトレハロース出口を介して経時的に細胞から或る程度漏出し、トレハロースが上清中で検出され得ることを予想外に観察した。驚くべきことに、ｐｔｃＣの不活性化がトレハロースの放出を防ぐことが見出された。これらの発見は、ｐｔｃＣがこれまでトレハロース輸送と関連付けられておらず、周囲へのトレハロースの漏出及び放出に関与するトレハロース出口として示唆されていなかったため、なおさら予想外である。また驚くべきことに、既知の特徴付けられたトレハローストランスポーターは、このトレハロース漏出機構に関与しないようである。
好ましい実施の形態では、本明細書で採用されるＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、１つ又は複数のトレハローストランスポーター、好ましくは内因性トレハローストランスポーター、例えばトレハロースオペロンに含まれる１つ又は複数のホスホトランスフェラーゼ系遺伝子を過剰発現し得る。本発明者らは驚くべきことに、かかる過剰発現が天然トレハロース誘導性発現とは対照的に、細胞内トレハロースを蓄積及び／又は保持するグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の能力を更に向上させることを見出した。
要点をまとめると、一部の実施の形態では、本明細書で採用されるＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は以下の特性のいずれか１つ、いずれか２つ又は３つ全てを付加的に示し得る：（ａ）グラム陽性菌が機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有しない；（ｂ）グラム陽性菌がｐｔｃＣ活性を欠いている；（ｃ）グラム陽性菌が１つ又は複数のトレハローストランスポーターを過剰発現する。好ましい実施の形態では、ＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌は、特性（ａ）を付加的に示し得るか、又はより好ましくは特性（ａ）及び（ｂ）を付加的に示し得るか、又は更により好ましくは特性（ｂ）及び（ｃ）を付加的に示し得るか、又は非常に好ましくは特性（ａ）及び（ｂ）及び（ｃ）を付加的に示し得る。
これに関連して、本発明の更なる態様は、ＴｒｅＰＰ活性を欠き、以下の特性のいずれか一方又は好ましくは両方を更に示すグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌である：（ｉ）グラム陽性菌がｐｔｃＣ活性を欠いている；（ｉｉ）グラム陽性菌が１つ又は複数のトレハローストランスポーターを過剰発現する。
関連の態様は、ＴｒｅＰＰ活性を欠き、機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有せず、以下の特性のいずれか一方又は好ましくは両方を更に示すＬＡＢに関する：（ｉ）ＬＡＢがｐｔｃＣ活性を欠いている；（ｉｉ）ＬＡＢが１つ又は複数のトレハローストランスポーターを過剰発現する。
好ましい実施の形態では、本明細書で開示又は採用されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、１つ又は複数の異種遺伝子産物を付加的に含有し得る。とりわけグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌が医薬品用途を目的とする一部の好ましい実施の形態では、かかる遺伝子産物（複数の場合もあり）は予防的及び／又は治療的な遺伝子産物（複数の場合もあり）又は抗原（複数の場合もあり）であり得る。
これに関連して、本発明の更なる態様は、ＴｒｅＰＰ活性を欠き、１つ又は複数の異種遺伝子産物、好ましくは予防的及び／又は治療的な遺伝子産物を付加的に含有するグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌である。このグラム陽性菌は、以下の特性のいずれか一方又は好ましくは両方を更に任意に示し得る：（ｉ）グラム陽性菌がｐｔｃＣ活性を欠いている；（ｉｉ）グラム陽性菌が１つ又は複数のトレハローストランスポーターを過剰発現する。
関連の態様は、ＴｒｅＰＰ活性を欠き、機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有せず、１つ又は複数の異種遺伝子産物、好ましくは予防的及び／又は治療的な遺伝子産物を付加的に含有するグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌である。このグラム陽性菌は、以下の特性のいずれか一方又は好ましくは両方を更に任意に示し得る：（ｉ）グラム陽性菌がｐｔｃＣ活性を欠いている；（ｉｉ）グラム陽性菌が１つ又は複数のトレハローストランスポーターを過剰発現する。
或る特定の実施の形態では、本明細書で開示又は採用されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌、又は薬剤若しくは食品添加物若しくはプロバイオティック組成物若しくはスターター培養物は乾燥、凍結、噴霧乾燥又はフリーズドライ（凍結乾燥）させてもよい。したがって、一部の実施の形態では、薬剤を調製する、又は食品添加物を調製する、又はスターター培養物を調製する、又はプロバイオティック組成物を調製する、又はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌においてトレハロースを内因的に蓄積させる、又はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌のストレス抵抗性若しくは製造特性、加工特性及び／又は保存特性を改善する上述の方法のいずれも、ＬＡＢ、薬剤、食品添加物、プロバイオティック組成物又はスターター培養物の乾燥、噴霧乾燥、凍結又はフリーズドライ（凍結乾燥）を更に含み得る。
薬剤を調製する若しくは食品添加物を調製する若しくはスターター培養物を調製する上述の方法の或る特定の実施の形態、又はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌においてトレハロースを内因的に蓄積させる上述の方法の或る特定の実施の形態では、培養培地は炭素源、好ましくは主要な又は更には唯一の炭素源としてマルトース若しくはグルコース又はマルトースとグルコースとの組合せを含み得る。或る特定の実施の形態では、培養培地は外部から（外生的に）添加されたトレハロースを実質的に含有しない。本発明者らは驚くべきことに、本明細書で開示される乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌等のグラム陽性菌が、細胞内へのトレハロースの蓄積にマルトース又はグルコース等の炭素源を利用する能力を獲得していることを見出した。したがって、本発明によるグラム陽性菌は、例えばトレハロースよりも安価なマルトースを唯一の炭素源として有利に成長し、更には細胞内トレハロースを蓄積させることができる。とは言え、或る特定の実施の形態では、培養培地が外部から（外生的に）添加されたトレハロースを含有していてもよいことが理解されよう。
本発明の上記の及び更なる態様並びに好ましい実施の形態は、以下のセクション及び添付の特許請求の範囲において記載される。添付の特許請求の範囲の主題は、具体的に引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
細胞内トレハロース蓄積がｔｒｅＰＰ不活性化後、ｏｔｓＢ発現後又はそれらの組合せで可能であることを示す図である。 ラクトコッカス・ラクティス細胞における外因性トレハロースの蓄積が胆汁溶解に対する保護をもたらすことを示す図である。（Ａ）生存及び（Ｂ）トレハロース含量。 細胞内トレハロースの蓄積及び安定性を示す図である。（Ａ）経時的なトレハロース放出及び（Ｂ）上清中のトレハロース増加。 表２に記載の様々な株におけるトレハロースの蓄積及び放出を示す図である。株に１００ｍＭ（Ａ）又は５００ｍＭ（Ｂ）のトレハロースを添加した。 ｐｔｃＣの不活性化が細胞内トレハロースの放出を防ぐ（Ｍ９塩中、パネルＡ）又は遅らせる（０．５％ｏｘｇａｌ中、パネルＢ）ことを示す図である。 ラクトコッカス・ラクティス細胞における外因性トレハロースの蓄積が胆汁溶解に対する保護をもたらすことを示す図である。（Ａ）経時的な細胞内トレハロースの放出及び（Ｂ）０．５％ｏｘｇａｌにおける経時的な生存。 ｔｒｅＰＰ ＫＯ株（ｐｔｃＣ ｗｔ及びｐｔｃＣ ＫＯの両方）がグルコース又はマルトースを細胞内トレハロースへと変換することが可能であることを示す図である。 ブタを２４時間絶食させた場合（Ａ）及び不断給餌の場合（Ｂ）の両方でブタの腸における腸通過時の生存が向上したことを示す図である。 バイオマス産生後のトレハロース蓄積を示す図である。 マルトースによる細胞内トレハロースの蓄積の刺激を示す図である。 バイオマス産生中又はその後のマルトースから細胞内トレハロースへの変換を示す図である。
本明細書中で使用される場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈上他に明確な指示のない限り、単数及び複数の両方の指示対象を含む。
本明細書中で使用される場合、「含む（comprising）」、「含む（comprises）」及び「含む（comprised of）」という用語は、「含む（including）」、「含む（includes）」、又は「含有する（containing）」、「含有する（contains）」と同義であり、包括的又は無制限であり、付加的な、記載されていない成員、要素又は方法工程を除外するものではない。本明細書中で使用される場合、「含む（comprising）」、「含む（comprises）」及び「含む（comprised of）」という用語は、「からなる（consisting of）」、「なる（consists）」及び「からなる（consists of）」という用語、並びに「から本質的になる（consisting essentially of）」、「本質的になる（consistsessentially）」及び「から本質的になる（consists essentially of）」という用語を含むことを理解されたい。
端点による数値範囲の記載は、それぞれの範囲内に含まれる全ての数及び分数、並びに記載された端点を含む。
本明細書中で使用される場合、「約（about）」又は「およそ（approximately）」という用語は、パラメータ、量、時間幅（temporal duration）等の測定可能な値を表す場合には、特定の値の、及び特定の値から±２０％以下、好ましくは±１０％以下、より好ましくは±５％以下、更により好ましくは±１％以下の変動を、開示する発明において実施するのにこのような変動が適切である限りにおいて、包含することを意味する。修飾語「約」又は「およそ」が表す値自体も、具体的にかつ好ましく開示されると理解すべきである。
成員の群の１つ若しくは複数又は少なくとも１つの成員のような「１つ又は複数」又は「少なくとも１つ」という用語はそれ自体明らかであるが、更なる例示を用いると、この用語は、とりわけ上記成員のいずれか１つ又は上記成員のいずれか２つ以上、例えば上記成員のいずれか３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上又は７つ以上等、最大で上記成員の全てへの言及を包含する。
本明細書で引用される全ての参考文献は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。特に、本明細書で具体的に言及される全ての参考文献の教示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
別途定義されない限り、本発明の開示において使用される技術用語及び科学用語を包含する全ての用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解される意味を有する。更なる指標により、本発明の教示をよりよく理解するための用語の定義が包含される。
以下の節では、本発明の種々の態様を更に詳細に規定する。そこで規定された各々の態様は、そうではないことが明確に示されていない限り、他の任意の態様（単数又は複数）と組み合わせてもよい。特に、好適又は有利であると示される任意の特徴を、好適又は有利であると示される他の任意の特徴（単数又は複数）と組み合わせてもよい。
本明細書全体を通して、「一実施形態（"oneembodiment" or "an embodiment"）」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造又は特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。このため、本明細書全体を通して様々な場所での「一実施形態では（"in oneembodiment" or "in an embodiment"）という表現の登場は、必ずしも全てが同じ実施形態に言及するものではないが、そうであってもよい。さらに、本開示から当業者に明らかであり得るように、特定の特徴、構造又は特性を１つ又は複数の実施形態において任意の好適な方法で組み合わせてもよい。さらに、当業者に理解され得るように、本明細書に記載の一部の実施形態は他の実施形態に含まれる一部の特徴を含むが他の特徴を含まず、異なる実施形態の特徴の組合せが本発明の範囲内に含まれ、種々の実施形態を形成することを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態のいずれも任意の組合せで用いることができる。
本発明の以下の詳細な説明において、本発明の一部を形成し、本発明を実施することのできる具体的な実施形態の例示としてのみ示される添付の図面に言及する。他の実施形態を用いてもよく、本発明の範囲を逸脱することなく構造的又は論理的変化を加えることができることを理解されたい。したがって、以下の詳細な説明は限定的な意味に取られず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定される。
組み換えＤＮＡ技術の一般原則を説明する標準的な参考資料は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、１〜３巻、Sambrook et al.編、Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；CurrentProtocols in Molecular Biology、Ausubel et al.編、Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992（定期的な改訂あり）（"Ausubel et al. 1992"）；Innis etal., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Academic Press: San Diego, 1990を含む。微生物学の一般原則は、例えば、Davis, B. D. et al., Microbiology、第３版、Harper& Row, publishers、Philadelphia, Pa (1980)中で説明される。
トレハロース６−リン酸ホスホリラーゼ（ＴｒｅＰＰ）活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌が本明細書で開示される。
一態様では、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は薬剤として使用される、すなわち治療に使用される。更なる態様は、ＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を含む薬剤を提供する。薬剤の製造へのＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の使用も開示される。かかる薬剤は例えば医薬品配合物、栄養補助食品、プロバイオティクス、メディカルフード又は機能性食品として提供され得る。
別の態様は、プロバイオティクス又は食品添加物、より具体的には非薬物的プロバイオティクス又は食品添加物としてのＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の使用を提供する。関連の態様は、スターター培養物、好ましくは食品の調製用の、より具体的には非薬物的食品である食品の調製用のスターター培養物としてのＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の使用を提供する。
このため、更なる態様は、ＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を含むプロバイオティクス又は食品添加物、より具体的には非薬物的プロバイオティクス又は食品添加物を提供する。関連の態様は、ＴｒｅＰＰ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を含むスターター培養物、好ましくは食品の調製用の、より具体的には非薬物的食品である食品の調製用のスターター培養物を提供する。
本明細書で使用される場合、「グラム陽性菌」という用語は当該技術分野で既知のその一般的な意味を有する。更なる指針を用いると、グラム陽性菌を、クリスタルバイオレット染料を保持するグラム染色によって同定することができる。
好ましい実施形態では、本発明によるグラム陽性菌は、対象とする被験体に投与した場合に害を及ぼさないか又は有害な影響をもたらさないという意味で非病原性である。
本明細書で使用される場合、「乳酸菌」又は（or）「ＬＡＢ」という用語は、対象とする被験体に投与した場合に害を及ぼさないか又は有害な影響をもたらさないという意味で非病原性であり、好ましくはラクトコッカス、ラクトバシラス、リューコノストック、ペディオコッカス、ストレプトコッカス、アエロコッカス、カルノバクテリウム、エンテロコッカス、オエノコッカス、スポロラクトバチルス、テトラジェノコッカス、バゴコッカス及びワイセラ（Weissella）の細菌属に属するグラム陽性菌に関する。より好ましくは、ＬＡＢはラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）、ラクトコッカス・ピシウム（Lactococcuspiscium）、ラクトコッカス・プランタラム（Lactococcus plantarum）及びラクトコッカス・ラフィノラクチス（Lactococcus raffinolactis）、並びにそれらの任意の亜種及び株等であるが、これらに限定されないラクトコッカス種であり得る。最も好ましくは、ラクトコッカス種はラクトコッカス・ラクティス、並びにその任意の亜種及び株、例えば限定されるものではないが、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Lactococcus lactis ssp. cremoris）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ（Lactococcus lactis ssp. hordniae）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Lactococcus lactis ssp. lactis）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ｂｖ．ジアセチラクティス（Lactococcus lactis ssp. bv. diacetylactis）であり得る。更に好ましくは、ラクトコッカス・ラクティスはラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス又はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスであってもよく、それらの任意の株、例えばラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスＳＫ１１、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスＭＧ１３６３又はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスＩＬ１４０３を包含する。また好ましくは、ＬＡＢはエンテロコッカス種、好ましくはエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcusfaecium）、並びにそれらの任意の亜種及び株、例えば限定されるものではないが、エンテロコッカス・フェシウムＬＭＧ１５７０９株であり得る。
ビフィズス菌はグラム陽性、非運動性の、多くの場合分岐した嫌気性の細菌属である。本明細書で使用されるビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（B. adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アンギュラータム（B.angulatum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）、ビフィドバクテリウム・アステロイデス（B. asteroides）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・ボウム（B. boum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（B. catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ケリナム（B. choerinum）、ビフィドバクテリウム・コリネフォーム（B. coryneforme）、ビフィドバクテリウム・クニクリ（B. cuniculi）、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス（B. denticolens）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（B. dentium）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（B. gallicum）、ビフィドバクテリウム・ガリナラム（B. gallinarum）、ビフィドバクテリウム・インディカム（B. indicum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B. infantis）、ビフィドバクテリウム・イノピナタム（B. inopinatum）、ビフィドバクテリウム・ラクチス（B. lactis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・マグナム（B. magnum）、ビフィドバクテリウム・メリシカム（B. merycicum）、ビフィドバクテリウム・ミニマム（B. minimum）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム（B. pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（B.pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・プロルム（B. pullorum）、ビフィドバクテリウム・ルミナンティウム（B. ruminantium）、ビフィドバクテリウム・サーキュラーレ（B.saeculare）、ビフィドバクテリウム・ズブチル（B. subtile）、ビフィドバクテリウム・ズイス（B. suis）、ビフィドバクテリウム・サームアシドフィルム（B.thermacidophilum）、ビフィドバクテリウム・サーモフィルム（B. thermophilum）を含み得る。ビフィズス菌はビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ロンガムであるのが好ましい。ビフィズス菌の全ての亜種及び株も含まれることを理解されたい。
本明細書で使用される場合、「トレハロース６−リン酸ホスホリラーゼ」、「ｔｒｅＰＰ」又は「ＴｒｅＰＰ」という用語は、トレハロース６−リン酸をリン酸化する酵素、好ましくはグルコース−６−リン酸及びβ−Ｄ−グルコース−１−リン酸を生じるα，α−トレハロース−６−リン酸とリン酸との反応、好ましくは可逆反応又はその逆を触媒する酵素に関する。ｔｒｅＰＰの同義語は、例えばトレハロース−６−リン酸：リン酸β−Ｄ−グルコシルトランスフェラーゼ及びα，α−トレハロース−６−リン酸：リン酸β−Ｄ−グルコシルトランスフェラーゼであり得る。例としては、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスＭＧ１３６３のｔｒｅＰＰの核酸配列及びタンパク質配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２（それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００９００４．１（領域４４９１９５〜４５１５０４）及びＹＰ＿００１０３１８０５．１に対応する）によって表される。一実施形態では、本明細書で使用されるｔｒｅＰＰは、それぞれ配列番号１及び配列番号２の核酸配列若しくはアミノ酸配列を有するか、又は配列番号２をコードする核酸を有する遺伝子又はタンパク質に関する。更なる実施形態では、本明細書で使用されるｔｒｅＰＰは、それぞれ配列番号１及び配列番号２に少なくとも７５％同一な、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の％で同一な核酸配列又はアミノ酸配列を有する遺伝子又はタンパク質に関する。別の実施形態では、本明細書で使用されるｔｒｅＰＰは、配列番号２に少なくとも７５％同一な、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の％で同一なタンパク質をコードする。上記の配列が機能的なｔｒｅＰＰタンパク質に関するか又は機能的なｔｒｅＰＰタンパク質をコードするのが好ましい。別の実施形態では、本明細書で使用されるｔｒｅＰＰはグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌、配列番号１及び配列番号２のオーソログである。
配列を比較する方法及び配列同一性を決定する方法は当該技術分野で既知である。例としては、配列同一性のパーセンテージは、２つの配列間で配列のアラインメント後に同一な核酸又はアミノ酸のパーセンテージを指す。アラインメント及び同一性のパーセンテージは、当該技術分野で既知の様々な異なるプログラム及びアルゴリズムを用いて行い、算出することができる。好ましいアラインメントアルゴリズムとしては、ＢＬＡＳＴ（Altschul, 1990；例えばＮＣＢＩのウェブサイトで利用可能である）及びＣｌｕｓｔａｌ（Chenna, 2003に概説されている；例えばＥＢＩのウェブサイトで利用可能である）が挙げられる。例えばTatusova and Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250)によって記載される「Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」アルゴリズム等のＢＬＡＳＴを使用し、例えば公表済みのデフォルト設定又は他の好適な設定（例えば、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムについては、ギャップ開始コスト（cost to open a gap）＝５、ギャップ伸長コスト（cost to extend a gap）＝２、ミスマッチペナルティ＝−２、マッチ報酬（reward for a match）＝１、ギャップｘ＿ドロップオフ＝５０、期待値＝１０．０、ワードサイズ＝２８；又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムについては、マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップ開始コスト＝１１、ギャップ伸張コスト＝１、期待値＝１０．０、ワードサイズ＝３）を用いて２つの配列間の同一性のパーセンテージを算出するのが好ましい。
ｔｒｅＰＰの活性は直接的又は間接的に測定することができる。活性を間接的に決定する一方法は遺伝子シークエンシングを用いるものである。このようにして、部分的又は完全な欠失、破壊又は不活性化突然変異を容易に同定することができる。活性を決定する直接的な方法は例えば、場合によっては事前の代謝標識と組み合わせた、基質消費又は反応生成物形成（例えば、基質のトレハロース６−リン酸又は反応生成物のグルコース−６−リン酸及びβ−Ｄ−グルコース−１−リン酸）を測定する、細胞抽出物を用いたアッセイに基づくものであり得る。例えば、基質及び生成物は、例えば非特許文献３に記載の高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によっても容易に決定することができる。
本明細書で使用される場合、「ｔｒｅＰＰ活性を欠く」という用語は、ｔｒｅＰＰ活性がない又は実質的にないことを意味する。更なる指針を用いると、ｔｒｅＰＰ活性は野生型のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌のｔｒｅＰＰ活性の２０％未満である。例えば、ｔｒｅＰＰ活性は野生型ｔｒｅＰＰ活性の１５％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、更により好ましくは１％未満である。前述したように、最も好ましくは、ｔｒｅＰＰ活性は検出不能であるか、又は実質的若しくは完全に失われている。
本明細書で使用される場合、「薬剤」という用語は、「薬物」、「治療剤」という用語、及び治療的又は予防的な効果を有する調製物を示すために医療分野で使用される他の用語も包含する。
本明細書で使用される場合、「治療する」又は「治療」という用語は、望ましくない生理的変化又は障害を予防するか又は遅らせる（減少させる）ことを目的とする治療的な治療及び予防的な（prophylactic or preventative）手段の両方を指す。本明細書で使用される「治療」、「治療する」等の用語は、発症した疾患若しくは病態の罹患後の改善若しくは除去、又はかかる疾患若しくは病態の特徴的な症状の緩和も含む。本明細書で使用される場合、これらの用語は、患者の状態に応じて、疾患若しくは病態又はそれと関連する症状の重症度を上記疾患又は病態に罹患する前に低減することを含む、疾患若しくは病態又は疾患若しくは病態と関連する症状の発症の予防も包含する。かかる罹患前の予防又は低減は、投与時に疾患又は病態に罹患していない患者への本発明の化合物又は組成物の投与を指す。「予防する」とは、例えば改善期間後の疾患若しくは病態又はそれと関連する症状の再発又は再燃の予防も包含する。
本明細書で使用される場合、「栄養補助食品」は概して、健康及び医学的な利益をもたらす食品又は食製品を包含する。栄養補助食品は食用であり、ヒトが直接食することができるが、好ましくは健康食品店で販売される種類の添加剤又は栄養補給剤の形態、例えば錠剤の形態で、又は食用固形物、より好ましくはシリアル、パン、豆腐、クッキー、アイスクリーム、ケーキ、ポテトチップス、プレッツェル、チーズ等の加工食品、並びに飲用液体、例えば牛乳、炭酸飲料、スポーツドリンク及びフルーツジュース等の飲料中の成分としてヒトに与えられる。栄養補助食品の製造にとりわけ好ましいプロセスは、天然由来の溶媒しか含まない。栄養補助食品は、好ましくは比較的高レベルの健康増進物質を含有し得る。栄養補助食品同士を混合して、健康増進効果を増大させることができる。
栄養補助食品とは対照的に、いわゆる「メディカルフード」は一般に使用されることを意図されず、商店又はスーパーマーケットでは入手不可能なものである。メディカルフードは、疾患のリスクを低下させる低脂肪食品又は低塩食品等の健康食に含まれる食品ではなく、減量製品でもない。医師は、患者が疾患又は健康条件を管理するために特別な栄養素を必要とし、患者が医師の長期継続ケア下にある場合にメディカルフードを処方する。ラベルには製品が特定の医学的障害又は病態の管理への使用を意図することが記載されている。メディカルフードの一例は、慢性炎症状態の患者を標的とする栄養サポートを提供するように設計された栄養的に多様なメディカルフードである。この製品の活性化合物は例えば本明細書に記載の１つ又は複数の化合物である。機能性食品は、疾患のリスクを低下させる低脂肪食品若しくは低塩食品等の健康食に含まれる食品又は減量製品を包含し得る。
本明細書で使用される場合、「プロバイオティクス」という用語は、腸カメラ内の微生物（微生物叢）の自然平衡の維持を助ける細菌を指す。また、正常なヒト消化管は有害な細菌の成長を低減し、健康な消化系を促進するプロバイオティクス細菌を含有する。腸内の最大のプロバイオティクス細菌群はＬＡＢである。本明細書で使用される場合、「プロバイオティック組成物」は、プロバイオティクスを含む組成物、好ましくは食用組成物である。本明細書で使用される「プロバイオティック組成物」という用語は、「健康補助食品」と同義で使用することができる。本明細書で規定されるプロバイオティック組成物は、腸内適用又は非経口適用用の医薬品配合物として使用することができるものであり、食品及び飲料の補助、並びにカプセル若しくは錠剤等の固体配合物、又は溶液若しくは懸濁液等の液体配合物とすることができる。かかる配合物としては、飲料（例えばＡｃｔｉｍｅｌ（商標）、Ｙａｋｕｌｔ（商標）、ＤａｎＡｃｔｉｖｅ（商標）等）、ヨーグルト飲料、ヨーグルト、フレッシュチーズ、クリーム、サワークリーム等を挙げることができるが、これらに限定されない。したがって、プロバイオティクス又はプロバイオティック組成物は薬物的又は非薬物的に適用され得ることが理解されよう。
「スターター培養物」という用語は、実際に発酵を行う微生物培養物を指す。これらのスターターは、通常は発酵に使用される微生物が良好にコロニー形成した穀類、種子又は液体栄養素等の培養媒体からなる。本明細書で使用される場合、「スターター培養物」という用語は、高密度スターター培養物を指すのが好ましい。したがって、スターター培養物は、任意に高密度培養物を得るための別個のスターター培地中で培養した後に有機材料の発酵を開始又は達成することが可能な生微生物を含む組成物を指し得る。代替的には、スターター培養物は乾燥、噴霧乾燥、凍結又はフリーズドライしてもよい。
先述のように、本発明者らは驚くべきことに、単なるｔｒｅＰＰの欠如がグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌における細胞内トレハロース蓄積に十分であることを見出した。これとは対照的に、それぞれｏｔｓＢ及びｏｔｓＡ等の異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼ及び／又は異種トレハロース６−リン酸シンターゼの存在が、細胞内トレハロース蓄積に必須であると以前は考えられていた。したがって、一実施形態では、本発明は機能的な異種ｏｔｓＢ、好ましくは機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有しない、本明細書に記載されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌に関する。更なる実施形態では、本明細書に記載されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、機能的な異種ｏｔｓＡ、好ましくは機能的な異種トレハロース６−リン酸シンターゼを含有しない。また別の実施形態では、本明細書に記載されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は機能的な異種ｏｔｓＡを含有せず、機能的な異種ｏｔｓＢを含有しない。更なる実施形態では、本明細書に記載されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、機能的な異種トレハロース６−リン酸シンターゼを含有せず、機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有しない。また更なる実施形態では、本明細書に記載されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、トレハロース又はトレハロース６−リン酸の代謝（異化又は同化）に関与する機能的な異種遺伝子を含有しない。かかる遺伝子はトレハラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ及びトレハロース６−リン酸ヒドロラーゼを包含するが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「含有しない（"does notcontain" or "not containing"）」という用語は、特定の遺伝子産物を発現しない、すなわち機能的又は活性なタンパク質がグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌において産生されないグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌に関するのが好ましい。
本明細書で使用される場合、「トレハロース６−リン酸ホスファターゼ」という用語は、トレハロース６−リン酸を脱リン酸化する酵素、好ましくはトレハロース−６−リン酸のリン酸及びトレハロースを生じる反応を触媒する酵素に関する。トレハロース６−リン酸ホスファターゼは、リン酸モノエステルヒドロラーゼファミリーに属する。トレハロース６−リン酸ホスファターゼの同義語は、例えばα，α−トレハロース−６−リン酸ホスホヒドロラーゼ、トレハロース−６−リン酸ホスホヒドロラーゼ及びトレハロース６−ホスファターゼである。例としては、大腸菌（E. coli）のトレハロース６−リン酸ホスファターゼ（すなわちｏｔｓＢ）の核酸配列及びタンパク質配列は、それぞれ配列番号３及び配列番号４（それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ６９１６０．１（ヌクレオチド位置６７５〜１４７５）及びＰ３１６７８．２に対応する）によって表される。一実施形態では、本明細書で使用されるトレハロース６−リン酸ホスファターゼは、それぞれ配列番号３及び配列番号４の核酸配列若しくはアミノ酸配列を有するか、又は配列番号４をコードする核酸を有する遺伝子又はタンパク質に関する。更なる実施形態では、本明細書で使用されるトレハロース６−リン酸ホスファターゼは、それぞれ配列番号３及び配列番号４に少なくとも７５％同一な、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の％で同一な核酸配列又はアミノ酸配列を有する遺伝子又はタンパク質に関する。別の実施形態では、本明細書で使用されるトレハロース６−リン酸ホスファターゼは、配列番号４に少なくとも７５％同一な、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の％で同一なタンパク質をコードする。上記の配列が機能的なトレハロース６−リン酸ホスファターゼタンパク質に関する又はそれをコードするのが好ましい。別の実施形態では、本明細書で使用されるトレハロース６−リン酸ホスファターゼはグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌、配列番号３及び配列番号４のオーソログである。
本明細書で使用される場合、「トレハロース６−リン酸シンターゼ」という用語は、トレハロース６−リン酸を脱リン酸化する酵素、好ましくはグルコース６−リン酸とＵＤＰ−グルコースとのトレハロース６−リン酸を生じる反応を触媒する酵素に関する。トレハロース６−リン酸シンターゼは、グリコシルトランスフェラーゼファミリーに属する。トレハロース６−リン酸シンターゼの同義語は、例えばトレハロースリン酸−ウリジン二リン酸グルコシルトランスフェラーゼ、ホスホトレハロース−ウリジン二リン酸トランスグルコシラーゼ、ウリジンジホスホグルコースリン酸グルコシルトランスフェラーゼ及びα,α−トレハロース−６−リン酸シンターゼである。例としては、大腸菌のトレハロース６−リン酸シンターゼ（すなわちｏｔｓＡ）の核酸配列及びタンパク質配列は、それぞれ配列番号５及び配列番号６（それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ６９１６０．１（ヌクレオチド位置１４５０〜２８７４）及びＰ３１６７７．３に対応する）によって表される。一実施形態では、本明細書で使用されるトレハロース６−リン酸シンターゼは、それぞれ配列番号５及び配列番号６の核酸配列若しくはアミノ酸配列を有するか、又は配列番号６をコードする核酸を有する遺伝子又はタンパク質に関する。更なる実施形態では、本明細書で使用されるトレハロース６−リン酸シンターゼは、それぞれ配列番号５及び配列番号６に少なくとも７５％同一な、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の％で同一な核酸配列又はアミノ酸配列を有する遺伝子又はタンパク質に関する。別の実施形態では、本明細書で使用されるトレハロース６−リン酸シンターゼは、配列番号６に少なくとも７５％同一な、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の％で同一なタンパク質をコードする。上記の配列が機能的なトレハロース６−リン酸シンターゼタンパク質に関する又はそれをコードするのが好ましい。別の実施形態では、本明細書で使用されるトレハロース６−リン酸シンターゼはグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌、配列番号５及び配列番号６のオーソログである。
本明細書で使用される場合、機能的な異種トレハロース６−リン酸（phosphate）ホスファターゼ又はシンターゼ（又は任意の他のトレハロース関連の代謝酵素）の欠如は、任意又は実質的に任意の異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼ又はシンターゼ活性の欠如に関することを理解されたい。かかる活性は本明細書の他の部分に記載されるように決定することができる。一実施形態では、本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌はこれらの酵素を発現しない。
本発明者らは、トレハロースが、これまで同定又は予期されていないトレハロース出口を介して細胞から或る程度漏出し、上清中で回収され得ることを見出した。驚くべきことに、本発明者らはｐｔｃＣの破壊によってトレハロースの放出が回避されることを見出した。したがって、一実施形態では、本発明は、セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（ｐｔｃＣ）活性を欠く本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌に関する。
本明細書で使用される「セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント」又は「ｐｔｃＣ」は、ホスホトランスフェラーゼ系コンポーネントを指す。ホスホトランスフェラーゼ系は、細胞膜を介した転移と同時に起こるホスホエノールピルビン酸塩から流入糖基質へのホスホリル基の移動の触媒に関与する。ｐｔｃＣはセロビオース特異的ＰＴＳ系の膜貫通コンポーネントである。ｐｔｃＣは、これまでトレハロース輸送に関連付けられておらず、ましてやグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌からのトレハロース漏出に関連付けられてもいなかった。例としては、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスＭＧ１３６３のｐｔｃＣの核酸配列及びタンパク質配列は、それぞれ配列番号７及び配列番号８（それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００９００４．１（領域４３０２７１〜４３１６０８）及びＹＰ＿００１０３１７９０．１に対応する）によって表される。一実施形態では、本明細書で使用されるｐｔｃＣは、それぞれ配列番号７及び配列番号８の核酸配列若しくはアミノ酸配列を有するか、又は配列番号８をコードする核酸を有する遺伝子又はタンパク質に関する。更なる実施形態では、本明細書で使用されるｐｔｃＣは、それぞれ配列番号７及び配列番号８に少なくとも７５％同一な、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の％で同一な核酸配列又はアミノ酸配列を有する遺伝子又はタンパク質に関する。別の実施形態では、本明細書で使用されるｐｔｃＣは、配列番号８に少なくとも７５％同一な、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の％で同一なタンパク質をコードする。上記の配列が機能的なｐｔｃＣタンパク質に関する又はそれをコードするのが好ましい。別の実施形態では、本明細書で使用されるｐｔｃＣはグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌、配列番号７及び配列番号８のオーソログである。
本発明によるｔｒｅＰＰ及び／又はｐｔｃＣ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、分子生物学的方法を用いる当該技術分野で既知の任意の手段によって得るか、又は自然変異体、若しくはランダム化学的若しくは照射突然変異誘発によって得られる変異体のハイスループットスクリーニングによって得ることができる（ｔｒｅＰＰ ＫＯのハイスループットスクリーニングは、ｔｒｅＰＰ欠損株のトレハロースでの成長の欠如を用いた方法、又はｔｒｅＰＰオーソログのハイスループットシークエンシング及びバイオインフォマティクス分析、又は他の方法によって行うことができる）（ＬＡＢの組換え技法及び遺伝子操作に関するバックグラウンドについては、例えば"Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria", eds.Gasson & de Vos, Blackie Academic & Professional, 1994及び"Genetics of Lactic Acid Bacteria", eds. Wood &Warner, Springer, 2003を参照されたい）。一実施形態では、本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌において、内因性ＴｒｅＰＰ及び／又はＰｔｃＣをコードする遺伝子、及び／又はｔｒｅＰＰ及び／又はｐｔｃＣが発現されるプロモーターは、機能的なｔｒｅＰＰ及び／又はｐｔｃＣ遺伝子産物を産生することが不可能なように部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されている。遺伝子破壊の技法は概して当該技術分野で既知である。例としては、内因性ｔｒｅＰＰ及び／又はｐｔｃＣ遺伝子を、コード領域の完全若しくは部分的な除去（ノックアウト）又は代替的にはプロモーター領域の完全若しくは部分的な除去、若しくは突然変異誘発によって不活性化することができる。代替的には、ｔｒｅＰＰ遺伝子及び／又はｐｔｃＣ遺伝子を挿入不活性化し（ノックイン）、それにより内因性コード配列を破壊してもよい。例えば、未成熟終止コドン又はフレームシフト突然変異を導入することができる。機能的なｔｒｅＰＰタンパク質及び／又はｐｔｃＣタンパク質がそれ以上全く又は実質的に産生され得ない、すなわちｔｒｅＰＰ及び／又はｐｔｃＣ活性が（実質的に）欠如している限り、ｔｒｅＰＰ遺伝子及び／又はｐｔｃＣ遺伝子を、１つ又は複数のミスセンス突然変異又はナンセンス突然変異の導入によって突然変異させてもよい。自然突然変異も包含されることを理解されたい。
本発明者らは、１つ又は複数のトレハローストランスポーターの過剰発現が、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌における細胞内トレハロース蓄積及び／又は保持を更に増大させることを更に見出した。したがって、一実施形態では、本発明は、トレハローストランスポーターをコードする１つ又は複数の遺伝子を過剰発現する、好ましくは構成的に過剰発現する本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌に関する。好ましい実施形態では、上記トレハローストランスポーターは、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の内因性トレハローストランスポーターである。更に好ましい実施形態では、トレハローストランスポーターはグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌のトレハロースオペロンに位置する内因性トレハローストランスポーターである。また別の実施形態では、トレハローストランスポーターは、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌のトレハロースオペロン内に位置するホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の内因性トレハローストランスポーターである。好ましい実施形態では、本明細書に記載の１つ又は複数のトレハローストランスポーターの過剰発現は、プロモーターがトランスポーター配列（複数の場合もあり）に操作可能に連結するように、１つ又は複数のトランスポーターの５’側にプロモーターを挿入することによって達成される。「操作可能に連結する」とは、そのように記載されるコンポーネントが、それらが対象とする様式で機能することを可能にする関係となる並置を指す。コード配列に「操作可能に連結する」プロモーター配列は、コード配列の発現がプロモーター配列に適合する条件下で達成されるように結合する。一実施形態では、上記プロモーターは強力プロモーターである。更なる実施形態では、上記プロモーターは構成的プロモーターである。また別の実施形態では、上記プロモーターは内因性グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌のプロモーターである。好適なプロモーターは例えば国際公開第２００８／０８４１１５号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に見ることができる。特に、国際公開第２００８／０８４１１５号の表１２に挙げられるプロモーターは、本明細書に記載のトランスポーターの過剰発現にとりわけ好適である。最も好ましくは、プロモーターはＰｈｌｌＡ（すなわち、ＨＵ様ＤＮＡ結合タンパク質のプロモーター）である。したがって、好ましい実施形態では、ＰｈｌｌＡプロモーターはグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌のトレハロースオペロンに位置する内因性トレハローストランスポーター（複数の場合もあり）のコード領域の上流に挿入される。一実施形態では、ＰｈｌｌＡプロモーターは、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスＭＧ１３６３のＰｈｌｌＡプロモーターに対応する配列番号１３の配列を有する。別の実施形態では、ＰｈｌｌＡプロモーターは配列番号１３に少なくとも７５％同一な、例えば配列番号１３に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上同一な配列を有する。更なる実施形態では、ＰｈｌｌＡはグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌、配列番号１３のオーソログである。
例としては、本明細書で言及されるトレハローストランスポーターは、それぞれ配列番号９及び配列番号１０（それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００９００４．１（領域４４６９３７〜４４７４２２）及びＹＰ＿００１０３１８０３．１に対応する）、及び／又はそれぞれ配列番号１１及び配列番号１２（それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００９００４．１（領域４４７５６３〜４４９１２８）及びＹＰ＿００１０３１８０４．１に対応する）のラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスＭＧ１３６３の核酸配列及びアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、本明細書で使用される過剰発現されたトランスポーター（複数の場合もあり）は、それぞれ配列番号９及び配列番号１０及び／又はそれぞれ配列番号１１及び配列番号１２の核酸配列又はアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１０及び／又は配列番号１２をコードする核酸を有する遺伝子又はタンパク質に関する。更なる実施形態では、本明細書で使用される過剰発現されたトランスポーター（複数の場合もあり）は、それぞれ配列番号９及び配列番号１０及び／又はそれぞれ配列番号１１及び配列番号１２に少なくとも７５％同一な、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の％で同一な核酸配列又はアミノ酸配列を有する遺伝子又はタンパク質に関する。別の実施形態では、本明細書で使用される過剰発現されたトランスポーター（複数の場合もあり）は、配列番号１０及び／又は配列番号１２に少なくとも７５％同一な、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の％で同一なタンパク質をコードする。好ましくは、上記の配列は、（ａ）機能的な過剰発現された、好ましくは構成的に過剰発現されたトランスポーター（複数の場合もあり）、タンパク質（複数の場合もあり）に関する又はそれをコードする。別の実施形態では、本明細書で使用される（構成的に）過剰発現されたトランスポーター（複数の場合もあり）は、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌、配列番号９及び配列番号１０及び／又は配列番号１１及び配列番号１２のオーソログ（複数の場合もあり）である。
一実施形態では、本発明は、ｔｒｅＰＰを欠いており、以下の特性のいずれか一方又は好ましくは両方を更に示すグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌に関する：（ｉ）グラム陽性菌がｐｔｃＣ活性を欠いている；（ｉｉ）グラム陽性菌が１つ又は複数のトレハローストランスポーターを過剰発現、好ましくは構成的に過剰発現し、グラム陽性菌がｏｔｓＢ等の機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼ及び／又はｏｔｓＡ等の機能的な異種トレハロース６−リン酸シンターゼを更に含有し、より好ましくはグラム陽性菌が少なくとも上記機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有し、更により好ましくはグラム陽性菌が上記機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有するが、上記機能的な異種トレハロース６−リン酸シンターゼを含有しない。これらのタンパク質は各々本明細書の他の部分に記載される。トレハロース６−リン酸ホスファターゼのゲノム組込みが特に好ましく、組込みは好ましくは欧州特許出願公開第１１１６８４９５．７号及び同第１１１７３５８８．２号に開示されている。これらの出願は二重シストロン発現系に関し、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。トレハロース６−リン酸ホスファターゼ、好ましくはｏｔｓＢの好ましい位置は、本明細書で使用される場合、内因性ｕｓｐ４５遺伝子の後の２番目のシストロンである。
本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、様々な環境及び保存に関連する傷害又はストレスに対する耐性の増大、乾燥、噴霧乾燥、凍結又はフリーズドライへの抵抗性の増大、及び胃腸管での厳しい条件（例えば酸及び胆汁塩）に対する抵抗性の増大を示す。したがって、本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、被験体への投与にとりわけ好適である一方で、胃腸管における生存率の増大を示す。したがって、これらのグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、タンパク質の被験体への送達に適用することができる。したがって、一実施形態では、本発明は１つ又は複数の異種遺伝子産物、好ましくは１つ又は複数の予防的及び／又は治療的な遺伝子産物及び／又は抗原を含有する、本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌に関する。生物学的に活性なポリペプチドの送達は、例えば国際公開第９７／１４８０６号、国際公開第００／２３４７１号、国際公開第０１／０２５７０号、国際公開第０２／０９０５５１号、国際公開第２００５／１１１１９４号、国際公開第２００７／０２５９７７号、国際公開第２００７／０６３０７５号、国際公開第２００７／１２８７５７号、国際公開第２００８／０７１７５１号、国際公開第２００８／０９０２２３号、国際公開第２００４／０４６３４６号及び国際公開第２０１０／０３４８４４号に記載されている。本明細書に記載の異種遺伝子は細菌ゲノムに組み込まれているのが好ましい。とりわけ好ましい組込み戦略は、欧州特許出願公開第１１１６８４９５．７号及び同第１１１７３５８８．２号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている。特に、異種遺伝子は天然（内因性）遺伝子座、好ましくはオペロン内の第２の（又は更なる）遺伝子としてポリシストロン性（例えば二シストロン性、三シストロン性又は多シストロン性）挿入することができる。このようにして、異種遺伝子は天然（内因性）プロモーターの制御下で発現される。
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は概して、液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を含む免疫応答を惹起し、免疫応答の産物、例えば抗体又はＴ細胞と結合することが可能な物質を指す。本明細書で対象とする抗原は、代替的には免疫寛容を誘導するようなもの、例えば自己抗原（自己抗原及び同種抗原を含む）又はアレルゲンであり得る。したがって、好ましい例では、抗原はそれを投与する被験体からの生理的応答を引き起こす、かかる被験体の機能的な免疫系を必要とする。本明細書で対象とする「抗原」は、健常個体においては免疫応答を誘発しないが、自己免疫疾患を患う、すなわち生物が自身の構成部分（分子下レベルまで下がった）を「自己」として認識することができず、自身の細胞及び組織に対する免疫応答を引き起こす個体では誘発し得る「自己抗原」も包含する。かかる異常な免疫応答に起因する任意の疾患は自己免疫疾患と呼ばれる。したがって、本明細書で対象とする「抗原」は、健常個体では免疫応答を誘発しないが、上記タンパク質が遺伝子欠損した個体では誘発し得る（生理的に活性な）タンパク質も包含する。加えて、本明細書で対象とする「抗原」は、健常個体では免疫応答を誘発しないが、アレルギー性疾患を患う個体では誘発し得るアレルゲンも包含する。
本明細書で対象とする抗原は、ヒト又は動物の被験体における免疫応答が治療的に有用であり得る任意のポリペプチド、例えば病原体、例えばウイルス病原体、原核生物（例えば細菌）病原体又は真核生物病原体、非生理的タンパク質（例えば、がん組織に由来するタンパク質）、アレルゲン（例えば免疫寛容を引き起こす）等に由来し得る。抗原はタンパク質の代謝産物であってもよい。一例としては、抗原は多糖、脂質等であり得る。本明細書に記載の強力プロモーターは、上記多糖、脂質等を合成又は構築するのに必要とされる酵素の発現を誘導し得る。
「予防的及び／又は治療的に活性な遺伝子産物、ポリペプチド又はタンパク質」という用語は概して、それを投与するヒト又は動物の被験体においてそれに対して免疫応答を引き起こさず（すなわち非ワクチン原性である）、予防的及び／又は治療的な効果を達成することが可能であるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を指す。したがって、かかるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の予防的及び／又は治療的な効果は、被験体において免疫原性抗原及び／又は免疫保護抗原として作用することによって予防的及び／又は治療的な効果をもたらすのではなく、自身の自然生物学的機能と直接的関連し、被験体の体内で特定の効果を達成することができると期待され得る。したがって、非ワクチン原性の予防的及び／又は治療的に活性なペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、その発現形態で生物学的に活性であるか、又は少なくとも発現宿主細胞から放出されて生物学的に活性な形態へと変換されるものとする。上記ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のかかる生物学的に活性な形態は、その天然構成に同じ又は極めて類似した二次立体構造及び好ましくは同様に三次立体構造を示し得るのが好ましい。
予防的及び／又は治療的な遺伝子産物、ポリペプチド又はタンパク質は非毒性及び非病原性であるのも好ましい。好ましい実施形態では、予防的及び／又は治療的に活性な遺伝子産物、ポリペプチド又はタンパク質はヒト又は動物に由来し、好ましくはそれを投与するヒト又は動物の被験体と同じ分類群に対応し得る。
好適な予防的及び／又は治療的に活性な遺伝子産物、ポリペプチド又はタンパク質の非限定的な例としては、局所的又は全身的に機能することが可能であり、例えば局所代謝又は全身代謝に影響を及ぼす内分泌活性を示すことが可能であり、及び／又は免疫造血（immunohaemopoietic）系に属する細胞の活性を調節することが可能であり、及び／又は体内の様々な正常細胞又は腫瘍性細胞の生存能力、成長及び分化に影響を及ぼすか、若しくは免疫調節若しくは傷害及び感染に対する急性免疫応答の誘導に影響を及ぼすことが可能であり、及び／又は標的細胞受容体に作用するケモカインによって媒介される細胞及び組織の感染に対する抵抗性、若しくは上皮細胞の増殖若しくは創傷治癒の促進を増進若しくは誘導することが可能であり、及び／又は体内の細胞による物質の発現若しくは産生を調節することが可能であるものが挙げられる。かかるペプチド、ポリペプチド及びタンパク質の具体例としては、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管活性腸管ポリペプチド、サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４〜ＩＬ−３２のいずれか、特にＩＬ−２７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＦＮ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＧＨ、ＰＲＬ、サイトカインのＴＮＦファミリー、例えばＴＮＦα、ＴＮＦα、ＣＤ４０、ＣＤ２７又はＦＡＳリガンド、サイトカインのＩＬ−１ファミリー、サイトカインの線維芽細胞成長因子ファミリー、血小板由来成長因子ファミリー、形質転換成長因子ファミリー及び神経成長因子ファミリー、上皮成長因子ファミリー、インスリン関連サイトカイン等が挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、予防的及び／又は治療的に活性なポリペプチドは、上で規定される予防的及び／又は治療的に活性なポリペプチドに対する受容体又は拮抗薬であり得る。代替的には、予防的及び／又は治療的に活性なポリペプチドは抗体、例えば中和抗体又はそのようなものであり得る。かかる好適なポリペプチドの更なる具体例は、例えば国際公開第９６／１１２７７号の１４頁１行目〜３０行目（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）、国際公開第９７／１４８０６号の１２頁１行目〜１３頁２７行目（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）、又は米国特許第５，５５９，００７号の第８欄３１行目〜第９欄９行目（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に挙げられている。一例では、上記予防的及び／又は治療的に活性なペプチド、ポリペプチド又はタンパク質はＩＬ−１０、より好ましくはｈＩＬ−１０、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、より好ましくはｈＧＬＰ−１、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、より好ましくはｈＧＬＰ−２、トレフォイル因子（ＴＦＦ、例えばＴＦＦ１、ＴＦＦ２及び／又はＴＦＦ３）又はＰＹＹ、より好ましくはｈＰＹＹであり得る。
言及したように、実施形態では、予防的及び／又は治療的に活性なポリペプチドは抗体、例えば中和抗体又はそのようなものであり得る。本明細書に記載の抗体はフルサイズ抗体若しくはＦａｂ等のその機能的なフラグメント、融合タンパク質又は多量体タンパク質であり得る。好ましい実施形態では、１つ又は複数の異種遺伝子が抗体又は機能的な抗体フラグメントをコードする。本明細書で使用される場合、「機能的な」という用語は、依然として対象の機能、すなわち抗原結合を発揮することができる抗体フラグメントを指す。本明細書で使用される「抗体」という用語は、従来の抗体、キメラ抗体、ｄＡｂ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、多重特異性抗体、二価抗体、三価抗体、多価抗体、ＶＨＨ、ナノボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、単一抗体可変領域を含むが、これらに限定されない。
本文脈において、「抗体」という用語は、天然の又は部分的若しくは完全に操作した免疫グロブリンを記載するために用いられる。抗体は多数の方法で改変することができ、「抗体」という用語は、上に規定されるように、分子対の他の成員、すなわち標的分子に対して所要の結合特異性を有する結合ドメインを有する任意の特異的な結合分子又は物質を包含すると解釈されるものとする。このため、この用語は、天然の又は完全若しくは部分的に操作した免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体フラグメント、誘導体、抗体の機能的な同等物及びホモログ、並びに一本鎖抗体、二官能性抗体、二価抗体、ＶＨＨ、ナノボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、ダイアボディ、トリアボディ及びラクダ抗体を包含する。したがって、別のポリペプチドに融合する免疫グロブリン結合ドメイン又は同等物を含むキメラ分子が含まれる。この用語は、抗体結合ドメイン、例えば抗体模倣体であるか又はそれに相同な結合ドメインを有する任意のポリペプチド又はタンパク質も包含する。抗体の例は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ及びＩｇＥを含む免疫グロブリンアイソタイプ及びその同形サブクラスである。このため、当業者であれば、本発明が、抗原結合ドメインを含む抗体フラグメント、例えばＶＨＨ、ナノボディ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、ダイアボディ及びトリアボディにも関することを理解するであろう。一実施形態では、本発明は、或る外因性遺伝子が抗体又はその機能的なフラグメントの軽鎖（ＶＬ）をコードし、別の外因性遺伝子が抗体又はその機能的なフラグメントの重鎖（ＶＨ）をコードし、より好ましくは機能的なフラグメントがＦａｂである、本明細書に記載のグラム陽性菌又は組み換え核酸に関する。一実施形態では、ＶＬをコードする外因性遺伝子又はその機能的なフラグメントは、ＶＨをコードする外因性遺伝子又はその機能的なフラグメントの３’末端に転写結合する。
一実施形態では、本明細書に記載の（中和）抗体は、サイトカイン又はケモカイン又は毒素等の標的分子の生物学的活性を少なくとも部分的又は完全に遮断、阻害又は中和する。本明細書で使用される場合、「中和する」又は「中和」という表現は、例えば実施例に詳述されるように、当該技術分野で既知の方法によってｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで測定される、サイトカイン又は毒素の生物学的活性の阻害又は低減を意味する。特に、阻害又は低減は、大腸炎（colitis）スコアを決定するか、又は組織又は血液サンプル中の標的分子を決定することによって測定することができる。本明細書で使用される場合、「中和する」又は「中和」という表現は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで測定される、サイトカイン又は毒素の生物学的活性の少なくとも１０％以上、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、更により好ましくは１００％の阻害又は低減を意味する。
好ましくは、上記抗体又はその機能的なフラグメントは、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１２（又はそのサブユニットＩＬ−１２ｐ３５及びＩＬ１２ｐ４０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３（又はそのサブユニットＩＬ−２３ｐ１９）、ＩＬ−２７、ＩＬ−３２（及びそのスプライス変異体）、ＩＦＮ（α、β、γ）及びＴＮＦαのリストから選ばれるサイトカインの生物学的効果を阻害する。代替的には、これらのサイトカインは抗体ではない結合分子によって阻害され得る。上記結合分子がｇｐ１３０等の可溶性サイトカイン受容体であるか、又は炎症シグナルを引き起こすことなく上記サイトカインの受容体、例えばＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２）、ＩＬ−１２Ｒ（β１、β２）、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−２３Ｒ又はＩＬ−６Ｒと結合するのが好ましい。上記結合分子はＭＩＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ及びエオタキシンのリストから選ばれる中和ケモカインであるのが好ましい。上記結合分子はＣＤ３／ＣＤ２８、ＨＶＥＭ、Ｂ７．１／Ｂ７．２、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬ、ＯＸ４０／Ｘ４０Ｌ、ＣＤ２７／ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）、ＣＤ３０／ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３）及び４１ＢＢ／４１ＢＢＬのリストからの副刺激分子と結合することによって免疫活性化の遮断を解くのが好ましい。上記結合分子はＩ−ＣＡＭ１、α４インテグリン及びα４β７インテグリンのリストからの接着分子と結合することによって炎症の遮断を解くのが好ましい。上記結合分子はＣＤ３、ＣＴＬＡ４及び／又はＰＤ１に対して副刺激効果及びアゴニスト効果を有するのが好ましい。上記結合分子はＣＤ２５、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ９５、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ及び／又はＩｇＥを標的とすることによってＴ細胞活性又はＢ細胞活性を中和するのが好ましい。上記結合分子はＭＭＰファミリーの酵素と結合することによって炎症の遮断を解くのが好ましい。上記結合分子は抗血管新生効果を示す、例えばαｖβ３／α５β１及びＩＬ−８活性を中和するのが好ましい。更に好ましい実施形態では、上記結合分子又は抗体（又は機能的なフラグメント）はＴＮＦα、ＩＬ−１２、ＩＦＮγ、ＩＬ−２３又はＩＬ−１７の生物学的効果を中和することが可能である。
本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌において異種遺伝子として使用することができる抗体又は結合分子の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：
抗ＴＮＦα抗体、抗ＴＮＦα抗体フラグメント、抗ＴＮＦα単一抗体可変領域、可溶性ＴＮＦ受容体、又はＴＮＦαのドミナントネガティブ変異体；
抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＬ−１２抗体フラグメント、抗ＩＬ−１２単一抗体可変領域、可溶性ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１２又はＩＬ−１２ ｄＡｂのドミナントネガティブ変異体；
抗ＩＬ−１２ｐ３５抗体、抗ＩＬ−１２ｐ３５抗体フラグメント、抗ＩＬ−１２ｐ３５単一抗体可変領域、可溶性ＩＬ−１２ｐ３５受容体、ＩＬ−１２ｐ３５又はＩＬ−１２ｐ３５ ｄＡｂのドミナントネガティブ変異体；
抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体、抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体フラグメント、抗ＩＬ−１２ｐ４０単一抗体可変領域、可溶性ＩＬ−１２ｐ４０受容体、ＩＬ−１２ｐ４０又はＩＬ−１２ｐ４０ ｄＡｂのドミナントネガティブ変異体；
抗ＩＬ−２３抗体、抗ＩＬ−２３抗体フラグメント、抗ＩＬ−２３単一抗体可変領域、可溶性ＩＬ−２３受容体、ＩＬ−２３又はＩＬ−２３ ｄＡｂのドミナントネガティブ変異体；
抗ＩＬ−２３ｐ１９抗体、抗ＩＬ−２３ｐ１９抗体フラグメント、抗ＩＬ−２３ｐ１９単一抗体可変領域、可溶性ＩＬ−２３ｐ１９受容体、ＩＬ−２３ｐ１９又はＩＬ−２３ｐ１９ ｄＡｂのドミナントネガティブ変異体；
抗ＩＦＮγ抗体、抗ＩＦＮγ抗体フラグメント、抗ＩＦＮγ単一抗体可変領域、可溶性ＩＦＮγ受容体、又はＩＦＮγのドミナントネガティブ変異体；
抗ＩＬ−１７抗体、抗ＩＬ−１７抗体フラグメント、抗ＩＬ−１７単一抗体可変領域、可溶性ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１７又はＩＬ−１７ ｄＡｂのドミナントネガティブ変異体；及び、
抗ＭＣＰ−１抗体、抗ＭＣＰ−１抗体フラグメント、抗ＭＣＰ−１単一抗体可変領域、可溶性ＩＬ−１７受容体、ＭＣＰ−１又はＭＣＰ−１ ｄＡｂのドミナントネガティブ変異体。
好ましい実施形態では、上記抗体はＦａｂフラグメント（抗原結合フラグメント）である。Ｆａｂフラグメントは当該技術分野で既知である。更なる指針を用いると、Ｆａｂフラグメントは抗原と結合する抗体上の領域である。Ｆａｂフラグメントは、重鎖及び軽鎖の各々の１つの定常領域と１つの可変領域とから構成される。
一実施形態では、ＦａｂはｃＡ２抗ＴＮＦ Ｆａｂ（重鎖及び軽鎖の可変領域のポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号４及び配列番号５（重鎖）並びに配列番号２及び配列番号３（軽鎖）として米国特許第６，７９０，４４４号に開示されている）又はＣＤＰ８７０抗ＴＮＦ Ｆａｂ（重鎖及び軽鎖のポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列は、それぞれ配列番号１１４及び配列番号１１５（重鎖）並びに配列番号１１２及び配列番号１１３（軽鎖）として国際公開第０１／９４５８５号に開示されている）である。
当業者であれば、抗体が、機能的な抗体フラグメント、特にＦａｂフラグメントと同様に、ジスルフィド架橋によって共有結合し得る異なる個々のポリペプチドから構成されることを理解するであろう。特に、重鎖及び軽鎖は別個の個々のコード配列によってコードされる。
したがって、一実施形態では、本明細書で開示される異種遺伝子は抗原及び／又は（中和）抗体、又はその機能的なフラグメント若しくは変異体、及び／又は予防的及び／又は治療的に活性なペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードし、上記抗原はヒト又は動物の被験体において免疫応答、好ましくは防御免疫応答又は免疫寛容応答を引き起こすことが可能であり、及び／又は上記予防的及び／又は治療的に活性な遺伝子産物、ポリペプチド又はタンパク質はヒト又は動物の被験体において予防的及び／又は治療的な効果を生じることが可能である。
一実施形態では、本発明は、保存のために配合される本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌、又は本明細書に記載のように使用されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌に関する。特に、一実施形態では、本発明は凍結、乾燥、フリーズドライ、噴霧乾燥される又は培地中で保存される本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌に関する。
これまで説明したように、本発明は、本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌を含むか、又は本明細書に記載のように使用されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌を含む組成物にも関する。かかる組成物は医薬品組成物であり得る。更なる実施形態では、本発明は治療に使用されるか、又は薬剤、栄養補助食品、メディカルフード、機能性食品、プロバイオティック組成物、食品添加物若しくはスターター培養物として使用される組成物又は医薬品組成物に関する。また別の実施形態では、本発明は薬剤、栄養補助食品、メディカルフード、機能性食品、プロバイオティクス、食品添加物、スターター培養物としての、又は薬剤、栄養補助食品、メディカルフード、機能性食品、プロバイオティック組成物、食品添加物、スターター培養物の調製へのかかる組成物又は医薬品組成物の使用に関する。
本明細書で使用される場合、医薬品配合物、栄養補助食品、メディカルフード若しくは機能性食品、又はプロバイオティクス等の本明細書に記載の薬用組成物は、治療的に有効な量の本発明のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌と、薬学的に許容可能な担体、すなわち１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体物質及び／又は添加剤、例えば緩衝剤、担体、賦形剤、安定化剤等とを含むのが好ましい。本明細書で使用される「薬学的に許容可能」という用語は、医薬品組成物の他の成分に適合し、そのレシピエントに有害でない技術及び手段と一致する。
一実施形態では、医薬品組成物は本明細書に記載の治療的に有効な量のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を含む。「治療的に有効な量」という用語は被験体、例えばヒト又は動物において疾患又は障害を治療する、すなわち所望の局所的又は全身的な効果及び性能を得るのに効果的な治療物質又は組成物の量を指す。例としては、治療的に有効な量の細菌は、例えば単回投与又は反復投与において少なくとも１個の細菌、又は少なくとも１０個の細菌、又は少なくとも１０２個の細菌、又は少なくとも１０３個の細菌、又は少なくとも１０４個の細菌、又は少なくとも１０５個の細菌、又は少なくとも１０６個の細菌、又は少なくとも１０７個の細菌、又は少なくとも１０８個の細菌、又は少なくとも１０９個若しくは少なくとも１０１０個若しくは少なくとも１０１１個若しくは少なくとも１０１２個若しくは少なくとも１０１３個若しくは少なくとも１０１４個若しくは少なくとも１０１５個個若しくはそれ以上の宿主細胞、例えば細菌を含み得る。本発明のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、単独で又は１つ若しくは複数の活性な化合物と組み合わせて投与することができる。この化合物は本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の投与の前、後又はそれと同時に投与することができる。
本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌、又はこれらのグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌を含む組成物は、単回用量が被験体、例えばヒト又は動物の患者に投与されるように単位投与形態、例えば錠剤、カプセル、浣腸剤又は定量エアロゾルで提供されるのが好ましい。
活性成分は、所望の活性を示すのに十分な１日１回〜６回で投与され得る。これらの１日用量は１日１回の単回用量として与えるか、又は１日の同じ若しくは異なる時点に全体として特定の１日用量を与える２回以上のより少量の用量で与えることができる。好ましくは、活性成分は１日１回又は２回投与される。例えば、或る用量を朝に摂取し、或る用量をその日の遅い時間に摂取することができる。
本発明の全ての態様において、１日維持用量を患者において臨床的に望ましい期間、例えば１日から最大数年まで（例えば哺乳動物の余寿命にわたって）、例えば約（２日間若しくは３日間若しくは５日間、１週間若しくは２週間、又は１ヶ月）以上及び／又は例えば最大約（５年間、１年間、６ヶ月、１ヶ月、１週間、又は３日間若しくは５日間）与えることができる。約３日間〜約５日間又は約１週間〜約１年間の１日維持用量の投与が典型的である。液体配合物の他の構成物質は保存料、無機塩、酸、塩基、緩衝剤、栄養素、ビタミン又は他の医薬品を含み得る。
本明細書で教示されるヒト又は動物の被験体は、該ヒト又は動物に治療的に有効な量の本明細書で教示されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を投与することを含む療法又は治療を必要とするヒト又は動物を指し得る。動物は好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、更により好ましくは哺乳動物、例えば家畜、産業動物、動物園の動物、スポーツ用の動物、ペット及び実験動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛（cattle）、ウシ（cows）；類人猿、サル、オランウータン及びチンパンジー等の霊長類；イヌ及びオオカミ等のイヌ科動物；ネコ、ライオン及びトラ等のネコ科動物；ウマ、ロバ及びシマウマ等のウマ科動物；ウシ、ブタ及びヒツジ等の食用動物；シカ及びキリン等の有蹄動物；マウス、ラット、ハムスター及びモルモット等の齧歯動物等であり得る。概して、「被験体」又は「患者」という用語は同義で用いることができ、とりわけ動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、更により好ましくは哺乳動物、更により好ましくは霊長類を指し、具体的にはヒト患者及び非ヒト動物、哺乳動物並びに霊長類を含む。好ましい患者はヒト被験体であり得る。
予防的及び／又は治療的なペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を任意に発現する本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の送達によってヒト又は動物において治療可能な疾患のタイプの更なる非限定的な例としては、例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患（例えば、ＩＬ−１ｒａ若しくはＩＬ−１０若しくはＩＬ−２７、又はトレフォイルペプチドを用いて治療可能）；１型糖尿病、乾癬、関節リウマチ、エリテマトーデスを含むが、これらに限定されない自己免疫疾患（例えば、ＩＬ−１ｒａ若しくはＩＬ−１０若しくはＩＬ−２７、又は関連自己抗原を用いて治療可能）；喘息、食物アレルギーを含むが、これらに限定されないアレルギー性疾患（関連アレルゲンを用いて治療可能）；セリアック病（グルテンアレルゲン及び／又はＩＬ−２７を用いて治療可能）；アルツハイマー病、パーキンソン病及び筋萎縮性側索硬化症を含むが、これらに限定されない神経障害（例えば、脳由来（derived）神経向性因子及び毛様体神経向性因子を用いて治療可能）；がん（例えばＩＬ−１、コロニー刺激因子又はインターフェロン−Ｗを用いて治療可能）；骨粗鬆症（例えば形質転換成長因子ｆ３を用いて治療可能）；糖尿病（例えばインスリンを用いて治療可能）；心血管疾患（例えば組織プラスミノゲン活性化因子を用いて治療可能）；アテローム性動脈硬化症（例えば、サイトカイン及びサイトカイン拮抗薬を用いて治療可能）；血友病（例えば凝固因子を用いて治療可能）；変性肝疾患（例えば、肝細胞増殖因子又はインターフェロンａを用いて治療可能）；嚢胞性線維症等の肺疾患（例えばαアンチトリプシンを用いて治療可能）；肥満；病原体感染、例えばウイルス感染又は細菌感染（上述の種々の組成物又は抗原を用いて治療可能）等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、感染性疾患の治療に使用することもできる。一実施形態では、本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌によって局所的に産生及び分泌される毒素中和抗体によるクロストリジウム関連疾患、好ましくはクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridiumdifficile）関連疾患（ＣＤＡＤ）に対する受動免疫を得ることができる。ＣＤＡＤは２つの外毒素、毒素Ａ（エンテロトキシン；例えばＤＮＡ配列についてはＧｅｎｂａｎｋ ＮＣ＿００９０８９．１、領域：７９５８４３．．８０３９７５、又はタンパク質配列についてはＹＰ＿００１０８７１３７．１を参照されたい）及び毒素Ｂ（細胞毒素；例えばＤＮＡ配列についてはＧｅｎｂａｎｋ ＮＣ＿００９０８９．１、領域：７８７３９３．．７９４４９３、又はタンパク質配列についてはＹＰ＿００１０８７１３５．１を参照されたい）によって媒介される。どちらも腸上皮細胞の表面に結合する高分子量タンパク質であり、内在化し、細胞質ｒｈｏタンパク質のグルコシル化を触媒し、細胞死、炎症及び下痢をもたらす。それらはクロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）の病原性、コロニー形成、並びに好中球の走化性及び活性化の促進と関連付けられている。この細菌自体は侵襲性ではなく、組織損傷を引き起こさない。クロストリジウム・ディフィシレ毒素を抗体で中和することによって、病原体の病理学的機構が遮断され、その腸内で繁殖する能力を減少させることができ、微生物生態に対する影響を最小限に抑えることができ、正常な微生物叢の回復が可能となる。このアプローチの医学的利点は、より急速な回復、再発の減少、及び正常な腸内菌叢における抗生物質抵抗性の選択圧の軽減を含み得る。したがって、好ましい実施形態では、本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌はクロストリジウム、好ましくはクロストリジウム・ディフィシレの毒素Ａ及び／又は毒素Ｂに対する中和抗体を更に含有、発現、産生及び／又は分泌し、これらの毒素は各々上記の配列を有するのが好ましい。当業者であれば、本明細書の他の部分に記載されるように、完全長抗体に加えて、様々な機能的なフラグメント、又は改変抗体若しくは変異体抗体を使用することができることを理解するであろう。
当業者であれば、本明細書で具体的に列挙される疾患が単に例示的なものであり、その列挙が本明細書で教示されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の使用をこれら特定の疾患に限定することを何ら意図するものではないことを理解するであろう。それどころか、本明細書で開示されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を、列挙されるものだけでなく、ヒト及び動物の様々な更なる疾患又は病態にも治療的に関連し得る、対象の原則として任意の発現産物、好ましくはポリペプチドの発現に使用することができることが当業者には理解される。結果として、好適な発現産物、好ましくはポリペプチド、例えば抗原、及び／又は予防的及び／又は治療的に活性な遺伝子産物、ポリペプチド又はタンパク質を所与の病気について選んだ又は決定した後、当業者はその発現、単離及び／又は送達を本試薬の使用により達成することが可能であり得る。
本発明のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、治療対象の疾患を有するヒト又は動物への投与のために医薬品配合物中に懸濁され得る。このような医薬品配合物としては、生宿主細胞及び投与に適した媒質が挙げられるが、これらに限定されない。組換え宿主細胞は、一般的賦形剤、例えばラクトース、他の糖類、アルカリ及び／又はアルカリ土類ステアリン酸塩、炭酸塩及び／又は硫酸塩（例えばステアリン酸マグネシウム、炭酸ナトリウム及び硫酸ナトリウム）、カオリン、シリカ、風味剤及び芳香剤の存在下で凍結乾燥され得る。
そのように凍結乾燥された本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌はカプセル、錠剤、顆粒及び粉末の形態で調製することができ、各々経口経路で投与することができる。
代替的には、いくつかのグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、好適な媒質中の水性懸濁液として調製され得るか、又は凍結乾燥細菌は、使用直前に好適な媒質中に懸濁され得るが、このような媒質は、本明細書中で言及される賦形剤並びに他の賦形剤、例えばグルコース、グリシン及びサッカリン酸ナトリウムを含む。
経口投与のために、耐酸性（gastroresistant：耐胃性）経口剤形が処方されるが、この剤形は、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の制御放出を提供して、それによりその中でコードされた所望のタンパク質の制御放出を提供する化合物も含み得る。例えば、経口剤形（錠剤、ペレット、顆粒、粉末を含む）は、胃中での溶解又は崩壊に耐性があるが、小腸中では耐性がない賦形剤（通常はポリマー、セルロース誘導体及び／又は親油性物質）の薄層で被覆されて、それにより小腸中での崩壊、溶解及び吸収に好都合であるよう胃を通過させ得る。
経口剤形は、例えば制御放出、持続性放出、延長放出、持続性作用錠剤又はカプセルのように、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌はカプセル（任意でその治療的及び／又は予防的な（prophylactic）遺伝子産物）の徐放を可能にするよう設計され得る。これらの剤形は通常は、従来のそして既知の賦形剤、例えば親油性、高分子性、セルロース性、不溶性、膨潤性賦形剤を含有する。制御放出配合物は、小腸、結腸、生体付着又は舌下送達（すなわち、歯粘膜送達）、及び気管支送達を含む任意の他の送達部位にも用いられ得る。本発明の組成物が直腸又は膣投与されるべきものである場合、医薬品配合物としては座薬及びクリームが挙げられる。この場合、宿主細胞は、脂質も含む一般的賦形剤の混合物中に懸濁される。上記配合物の各々は当該技術分野でよく知られており、例えば以下の参考文献に記載されている：Hansel et al.（1990, Pharmaceutical dosageforms and drug delivery systems, 5th edition, William and Wilkins）、Chien 1992, Novel drug delivery system, 2nd edition, M. Dekker)、Prescott et al.（1989, Novel drug delivery,J. Wiley & Sons）、Cazzaniga et al.,（1994, Oral delayed release system for colonic specific delivery,Int. J. Pharm.i08:7'）。
好ましくは、浣腸剤配合物は、直腸投与に用いられ得る。「浣腸剤」という用語は、直腸使用を意図した液体製剤を包含するように用いられる。浣腸剤は、通常は単一用量容器で供給され、そして水、グリセロール若しくはマクロゴール又は他の好適な溶媒中に溶解又は分散された１つ又は複数の活性物質を含有する。
本発明の好ましい実施形態は、生グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌が非吸湿剤を用いて安定化されていることを特徴とする、本明細書に記載の安定化したフリーズドライ、乾燥又は噴霧乾燥された生グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を含む腸溶性カプセルを提供する。本明細書で使用される場合、非吸湿剤は、医薬品組成物の配合に通常使用される任意の賦形剤を含むことを意図し、上記薬剤は周囲４０％ＲＨで約８ｗｔ％以下、好ましくは約７ｗｔ％以下、より好ましくは約６ｗｔ％以下、例えば約１ｗｔ％〜約５ｗｔ％、より具体的には２ｗｔ％以下の平衡水分取込みを示す。非吸湿剤はポリオール、例えばマンニトール、マルチトール、イソマルト（ポリオール糖）、又はリン酸塩、例えば無水リン酸二カルシウム、第二リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、又は例えばスクロース等の糖であり得る。
上述の配合物に使用されるカプセルは、通常はゼラチンカプセル、デンプンカプセル、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）カプセル等、特にＨＰＭＣカプセルからなる群から選択される。生菌の腸送達については、本発明の腸溶性カプセルは低ｐＨ（ｐＨ５．５まで）で安定であり、より高いｐＨ（５．５を超えるｐＨ）で加速された溶解プロファイルを有するものとする。最適な放出はカプセルが約６．８のｐＨで１時間以内に崩壊する（disintegrate）場合に実現される。このため、本発明の更なる実施形態では、カプセルは腸溶ポリマーでコーティングされ、５．５までのｐＨで安定であり、５．５を超えるｐＨ、特に６．０を超えるｐＨで可溶性であり、より具体的には約６．８のｐＨで高速の溶解プロファイルを有する腸溶性カプセルが提供される。
腸溶コーティングに使用される腸溶ポリマーは、通常は５．５を超えるｐＨ、特に６．０を超えるｐＨで可溶性の成膜性ポリマー物質からなる。本発明の種々の実施形態に有用な成膜性ポリマーは、通常はセルロース誘導体、アクリル酸共重合体、マレイン酸共重合体、ポリビニル誘導体、セラック等からなる群、特にスチレン−アクリル酸共重合体、アクリル酸メチル−アクリル酸共重合体、アクリル酸メチル−メタクリル酸共重合体、アクリル酸ブチル−スチレン−アクリル酸共重合体、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ１００、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｓ又はＥｕｄｒａｇｉｔ Ｓ１００（いずれも商品名であり、RoehmPharma（Germany）から市販されている）等のメタクリル酸−メタクリル酸メチル共重合体、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ１００−５５（商品名、RoehmPharma（Germany）から市販されている）等のメタクリル酸−アクリル酸エチル共重合体、アクリル酸メチル−メタクリル酸−アクリル酸オクチル共重合体等からなる群から選択されるアクリル酸共重合体から選択され、より具体的には成膜性ポリマーはメタクリル酸−メタクリル酸メチル共重合体からなる。
また、異なる安定化化合物（抗凍結剤）の組合せが、乾燥、噴霧乾燥又はフリーズドライの前に細菌バイオマスに添加される。デンプン加水分解物及びグルタミン酸塩及び／又はポリオールを含むこの安定化化合物の組合せは、乾燥、噴霧乾燥又はフリーズドライされたグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の生存及び安定性の改善をもたらす。
本明細書に記載の配合物及びカプセルは、薬剤、栄養補助食品、食品添加物、機能性食品、メディカルフード、スターター培養物及び／又はプロバイオティック組成物として使用することができる。
このため、本発明によると、好ましい実施形態では、本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌、又はこれらのグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌を含む（医薬品）組成物は、特定の経路に適用可能な現行の技術水準の配合物のいずれか１つによって動物又はヒトに粘膜経路、例えば経口経路、経鼻経路、直腸経路、膣内経路又は気管支経路で投与することができる。投与されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の投与量は、細菌のタイプ及びそれによりコードされる遺伝子、治療する疾患のタイプ及び重症度、並びに使用される投与経路を含む様々な因子に応じて異なる。このため、本発明のあらゆる実施形態について正確な投与量を規定することはできないが、本発明に携わる当業者には容易に明らかである。いずれにせよ、投与量は、所定の数の細胞の投与後に、治療的及び／又は予防的なタンパク質の血清レベル濃度を既知の方法、例えばＥＬＩＳＡ又はＢｉａｃｏｒｅとして知られる方法（実施例を参照されたい）を用いて測定することによって個別的に決定することができる。送達された組み換えタンパク質の動態プロファイル及び半減期の分析によって、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の効果的な投与量範囲の決定に十分な情報が得られる。
一実施形態では、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌が抗原を発現する場合、本発明はワクチンも提供する。好ましくは、抗原はヒト又は動物において免疫応答を引き起こし、ワクチンとして使用することが可能であり得る。「ワクチン」という用語は、有効量で動物又はヒトの被験体に投与した場合に、ワクチンに含まれる免疫源に対する抗体を誘導することが可能であり、及び／又は被験体において防御免疫を引き起こす薬学的に許容可能な組成物とみなされる。本発明のワクチンは、抗原をコードする核酸又はベクターによって任意に形質転換された、本明細書で教示されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌、更には任意に賦形剤を含み得る。かかるワクチンは、アジュバント、すなわち抗原に対する免疫応答を向上させる化合物又は組成物も含み得る。アジュバントとしては、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウム等の鉱物ゲル、リゾレシチン等の界面活性物質、ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油又は炭化水素エマルション、並びにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌（bacille Calmetle-Guerin））及びコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）等の潜在的に有用な薬学的に許容可能なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。
一態様では、本発明はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌、又は組成物、好ましくは治療的及び／又は予防的な医薬品組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む治療方法又は療法に関する。
上記のように、本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を含む組成物はスターター培養物、プロバイオティック組成物又は食品添加物であり得る。したがって、本発明は、一態様では、本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を含むスターター培養物、プロバイオティック組成物又は食品添加物に関する。
スターター培養物は例えば液体培養物、加圧液体培養物、例えば乾燥形態、フリーズドライ形態及び噴霧／流動層乾燥形態、又は凍結濃縮形態若しくはフリーズドライ濃縮形態を含む凍結形態又は乾燥形態であり得る。したがって、一実施形態では、本発明は乾燥、噴霧乾燥、凍結又はフリーズドライされた本明細書に記載のスターター培養物に関する。培養物は真空で又は例えばＮ２、ＣＯ２等の雰囲気下で包装することができる。例えば、スターター培養物を製造し、剛性、非柔軟性又は柔軟性の好適なプラスチック又は他の材料で作製され得る、好ましくは発熱物質を含まない密封容器に入れて発酵場所に分配することができ、発酵させる有機材料に添加するか、又は任意に別個のスターター培地中で初めに培養して高密度培養物を得ることができる。
スターター培養物は、本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌に加えて、緩衝化剤及び成長刺激栄養素（例えば同化炭水化物又は窒素源）若しくは保存料（例えば凍結防止化合物）、又は必要に応じて粉乳若しくは糖等の他の担体も含有し得る。
スターター培養物は純粋培養物であり得る、すなわち本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の或る単一の分離株のバイオマス、すなわち原則として１つの細胞に由来するクローンを含有し得る。別の実施形態では、スターター培養物は共培養物であり得る、すなわち本発明のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の２つ以上の株を含み、任意に細菌又は酵母等の付加的な微生物を更に含み得る。
スターター培養物又は高密度培養物が、少なくとも１０２コロニー形成単位（ＣＦＵ）の、例えば少なくとも１０３ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１０４ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０５ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１０６ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０７ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１０８ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０９ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１０１０ＣＦＵ／ｇ、例えば少なくとも１０１１ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１０１２ＣＦＵ／ｇ又は少なくとも１０１３ＣＦＵ／ｇの本発明の１つ又は複数のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を含有することが好ましい場合もある。
通常、スターター培養物又は高密度培養物は、少なくとも１０２（ＣＦＵ）、例えば有機材料、培地又は基質１ｇ当たり少なくとも１０３ＣＦＵ、少なくとも１０４ＣＦＵ、例えば少なくとも１０５ＣＦＵ、少なくとも１０６ＣＦＵ、例えば少なくとも１０７ＣＦＵ、少なくとも１０８ＣＦＵ、例えば少なくとも１０９ＣＦＵ、少なくとも１０１０ＣＦＵ、例えば少なくとも１０１１ＣＦＵ、少なくとも１０１２ＣＦＵ又は少なくとも１０１３ＣＦＵの本発明の１つ又は複数の細菌株（任意に１つ又は複数の酵母株）という１つ又は複数の細菌株（任意に１つ又は複数の酵母株）の生細胞の濃度でスターター培地、又は発酵させる有機材料若しくは基質に添加され得る。
一実施形態では、本発明は、本明細書で規定される食品の調製用のスターター培養物に関するか、又はトレハロース６−リン酸ホスホリラーゼ（phosphorylase）（ＴｒｅＰＰ）活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌を含む食品添加物若しくはプロバイオティック組成物に関する。好ましい実施形態では、本明細書の他の部分に記載されるように、内因性ＴｒｅＰＰをコードする遺伝子は、機能的なｔｒｅＰＰ遺伝子産物を産生することが不可能なように部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されている。更なる実施形態では、スターター培養物、プロバイオティック組成物又は食品添加物中のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、本明細書の他の部分に記載されるように、機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼ（例えばｏｔｓＢ）及び／又は機能的な異種トレハロース６−リン酸シンターゼ（例えばｏｔｓＡ）を含有しない。また更なる実施形態では、本明細書に記載のスターター培養物、プロバイオティック組成物又は食品添加物中のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、トレハロース又はトレハロース６−リン酸の代謝（異化又は同化）に関与する機能的な異種遺伝子を含有しない。かかる遺伝子はトレハラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ及びトレハロース６−リン酸ヒドロラーゼを包含するが、これらに限定されない。
別の実施形態では、本発明はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌がセロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（ｐｔｃＣ）活性を欠いている、本明細書で規定されるスターター培養物、プロバイオティック組成物又は食品添加物に関する。好ましい実施形態では、本明細書の他の部分に記載されるように、内因性ｐｔｃＣをコードする遺伝子は、機能的なｐｔｃＣ遺伝子産物を産生することが不可能なように部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されている。
更なる実施形態では、本発明はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌が、本明細書の他の部分に記載されるように、トレハローストランスポーター、好ましくは内因性トレハローストランスポーターをコードする１つ又は複数の遺伝子を過剰発現、好ましくは構成的に過剰発現する、本明細書に記載のスターター培養物、プロバイオティック組成物又は食品添加物に関する。
また別の実施形態では、本発明はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌が、本明細書の他の部分に記載されるように、１つ又は複数の異種遺伝子産物、好ましくは１つ又は複数の予防的及び／又は治療的な遺伝子産物を発現する、本明細書に記載のスターター培養物、プロバイオティック組成物又は食品添加物に関する。
一実施形態では、本明細書に記載のスターター培養物、プロバイオティック組成物又は食品添加物を乾燥、凍結、噴霧乾燥又はフリーズドライする。
上で示したように、一態様では、本発明は、好ましくは食品添加物若しくはプロバイオティック組成物として使用される、又は食品の調製に使用されるスターター培養物の調製への本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の使用に関する。更なる態様では、本発明は食品添加物、プロバイオティック組成物としての又は食品の調製へのスターター培養物の使用に関する。
本明細書で使用される場合、「食品添加物」という用語は、更に改変することなく、又は代替的には更なる改変、例えば食品若しくは飼料の完全若しくは部分的な発酵、若しくは食品若しくは飼料の１つ若しくは複数のコンポーネントの完全若しくは部分的な発酵の後に消費するのに適した、好ましくはヒト又は動物の食品又は飼料に添加することができる組成物中に配合されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を指す。例としては、限定されるものではないが、本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌、又は本発明による組成物、例えば本明細書に記載のスターター培養物を、酪農業において特に培養酪農食品、培養乳製品又は培養牛乳製品としても知られる発酵牛乳製品の調製に使用することができる。発酵プロセスによって製品の保存期間が増加し、味が向上し、牛乳の消化率が改善される。本明細書で言及される食品の例には、チーズ、ヨーグルト、サワークリーム、バターミルク、乳酸菌牛乳等が含まれるが、これらに限定されない。
一態様では、本発明は、本明細書で規定される薬剤、食品添加物、プロバイオティック組成物又はスターター培養物を調製する方法であって、該スターター培養物が好ましくは食品の調製用のスターター培養物であり、
ｉ）本明細書で規定されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を、該グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌によって発酵させることが可能な基質材料を含む培地中で増殖させる工程と、
ｉｉ）そのようにして増殖させたグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を、薬剤、食品添加物、プロバイオティック組成物又はスターター培養物のそれぞれに配合する工程と、
を含む、方法にも関する。
グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を増殖させる方法、並びにグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌によって発酵させることが可能な培地及び基質は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、薬剤、食品添加物、プロバイオティック組成物又はスターター培養物としての配合は、液体培養物、加圧液体培養物、例えば乾燥形態、フリーズドライ形態及び噴霧／流動層乾燥形態、又は凍結濃縮形態若しくはフリーズドライ濃縮形態を含む凍結形態又は乾燥形態としての配合を含む。配合が乾燥、噴霧乾燥、凍結又はフリーズドライを含むのが好ましい。
更なる態様では、本発明は、食品を調製する方法であって、本明細書で規定されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌、本明細書で規定される食品添加物、本明細書で規定されるプロバイオティック組成物、又は本明細書で規定されるスターター培養物と、上記グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌によって発酵させることが可能な基質材料とを混合する工程を含む、方法にも関する。基質材料は通常は炭素源、好ましくは炭水化物又は糖である。グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌によって発酵させることが可能な炭水化物としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース等の単糖類又は二糖類が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、食品を調製する方法は、
ｉ）本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌、食品添加物、プロバイオティック組成物又はスターター培養物を準備する工程と、
ｉｉ）上記グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌によって発酵させることが可能である、基質材料、又は基質材料を含む組成物、好ましくは非毒性若しくは食用の組成物を準備する工程と、
ｉｉｉ）本明細書で規定されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌、本明細書で規定される食品添加物、本明細書で規定されるプロバイオティック組成物又は本明細書で規定されるスターター培養物と、基質材料又は組成物とを混合する工程と、
ｉｖ）任意に上記グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌を増殖させる、及び／又は上記基質材料若しくは組成物を上記グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌によって発酵させる工程と、
を含む。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の方法によって直接的若しくは間接的に得られる又は得ることができる食品にも関する。
先述のように、本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、トレハロースを細胞内に有利に蓄積させる。したがって、一態様では、本発明は、トレハロースが成長培地中に存在するか、又は外部から若しくは外生的に添加されたトレハロースであるようにグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌においてトレハロースを内因的に蓄積させる方法であって、本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を、該グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌によって発酵させることが可能な基質材料を含む培地中で増殖させる工程を含む、方法にも関する。一実施形態では、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌においてトレハロースを内因的に蓄積させる方法は、
ｉ）本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌、又はスターター培養物を準備する工程と、
ｉｉ）上記グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌によって発酵させることが可能である、基質材料、又は基質材料を含む組成物、好ましくは非毒性若しくは食用の組成物を準備する工程と、
ｉｉｉ）本明細書で規定されるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌、又は本明細書で規定されるスターター培養物と、基質材料又は組成物とを混合する工程と、
ｉｖ）任意に上記グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌を増殖させる、及び／又は上記基質材料若しくは組成物を上記グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌によって発酵させる工程と、
を含む。
本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、改善されたストレスに対する抵抗性、並びに改善された製造特性、加工特性及び／又は保存特性を有利に示す。したがって、一態様では、本発明はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌のストレス抵抗性又は製造特性、加工特性及び／又は保存特性を改善する方法であって、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を、ＴｒｅＰＰ活性を欠くように改変することを含む、方法に関する。一実施形態では、内因性ＴｒｅＰＰをコードする遺伝子は、機能的なｔｒｅＰＰ遺伝子産物を産生することが不可能なように部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されている。ストレス抵抗性又は製造特性、加工特性及び／又は保存特性が酸性条件に対する抵抗性、胆汁塩に対する抵抗性、熱に対する抵抗性、塩に対する抵抗性、乾燥、噴霧乾燥、凍結又はフリーズドライに対する抵抗性、及び浸透圧抵抗性を含む群から選択される１つ又は複数のストレス抵抗性又は製造特性、加工特性及び／又は保存特性であるのが好ましい。
一実施形態では、本発明はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌が、本明細書の他の部分に記載されるように、機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼ（例えばｏｔｓＢ）及び／又は機能的な異種トレハロース６−リン酸シンターゼ（例えばｏｔｓＡ）を含有しない、本明細書に記載される方法のいずれかに関する。また更なる実施形態では、本発明はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌が、トレハロース又はトレハロース６−リン酸の代謝（異化又は同化）に関与する機能的な異種遺伝子を含有しない、本明細書に記載される方法のいずれかに関する。かかる遺伝子はトレハラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ及びトレハロース６−リン酸ヒドロラーゼを包含するが、これらに限定されない。
別の実施形態では、本発明はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌が、セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（ｐｔｃＣ）活性を欠いている本明細書に記載される方法のいずれかに関する。好ましい実施形態では、本明細書の他の部分に記載されるように、内因性ｐｔｃＣをコードする遺伝子は、機能的なｐｔｃＣ遺伝子産物を産生することが不可能なように部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されている。
更なる実施形態では、本明細書の他の部分に記載されるように、本発明はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌が、トレハローストランスポーター、好ましくは内因性トレハローストランスポーターをコードする１つ又は複数の遺伝子を過剰発現する、好ましくは構成的に過剰発現する、本明細書に記載される方法のいずれかに関する。
また別の実施形態では、本明細書の他の部分に記載されるように、本発明はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌が、１つ又は複数の異種遺伝子産物、好ましくは１つ又は複数の予防的及び／又は治療的な遺伝子産物を発現する、本明細書に記載される方法のいずれかに関する。
一実施形態では、本発明はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌、薬剤、食品添加物、プロバイオティック組成物又はスターター培養物を乾燥、凍結、噴霧乾燥又はフリーズドライする工程を更に含む、本明細書に記載される方法のいずれかに関する。
本発明者らは驚くべきことに、本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌が、外部から添加されるトレハロースを添加することなくトレハロースを細胞内に蓄積させることが可能であることを見出した。有利には、本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、任意にトレハロースが外部から添加されない培地中であっても増殖させ、トレハロースを内部に蓄積させることができる。したがって、一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を、トレハロースを欠く若しくは実質的に欠く培地、又は外部から若しくは外生的に添加されるトレハロースを欠く若しくは実質的に欠く培地中で維持又は増殖させる工程を含む、本明細書に記載される方法に関する。有利には、かかる培地は、限定されるものではないがマルトース及び／又はグルコース等の別の発酵性炭素源を含み得る。
したがって、一実施形態では、本発明は、本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を、該グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌によって発酵させることが可能な基質材料を含む培地中で維持又は増殖させ、該基質材料がトレハロースをほとんど含まない（例えば準最適量）、含まない又は実質的に含まない、本明細書に記載される方法のいずれかに関する。代替的には、本発明は、本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を、該グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌によって発酵させることが可能な基質材料を含む培地中で維持又は増殖させ、該基質材料がマルトースを含む、本明細書に記載される方法のいずれかに関する。好ましい実施形態では、本発明は、本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を、該グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌によって発酵させることが可能な基質材料を含む培地中で維持又は増殖させ、該基質材料がマルトースを含み、該基質材料がトレハロースをほとんど含まない（例えば準最適量）、含まない又は実質的に含まない、本明細書に記載される方法のいずれかに関する。
本明細書で使用される場合、トレハロースを含まない若しくは実質的に含まない、又は外部から添加された若しくは外因性トレハロースを含まない培地は、トレハロースを含有しないか、又は少量のトレハロースしか含有しない培地を指す。かかる培地中のトレハロースの量又は濃度は、細菌が唯一の炭素源として使用することが可能となる程低いことが好ましい。一実施形態では、培地は１００ｍＭ未満、好ましくは５０ｍＭ未満、より好ましくは２５ｍＭ未満、例えば１５ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、５ｍＭ未満、２ｍＭ未満又は１ｍＭ未満のトレハロースを含有する。更なる実施形態では、培地は２ｗ／ｗ％未満又は２ｖ／ｗ％未満のトレハロース、好ましくは１ｗ／ｗ％未満又は１ｖ／ｗ％未満のトレハロース、より好ましくは０．５ｗ／ｗ％未満又は０．５ｖ／ｗ％未満のトレハロース、例えば０．３ｗ／ｗ％若しくはｖ／ｗ％未満、０．２ｗ／ｗ％若しくはｖ／ｗ％未満、０．１ｗ／ｗ％若しくはｖ／ｗ％未満、０．０５ｗ／ｗ％若しくはｖ／ｗ％未満、又は０．０１ｗ／ｗ％若しくはｖ／ｗ％未満のトレハロースを含有する。別の実施形態では、培地は炭素源又は発酵性炭水化物の総量の２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、例えば３％未満、２％未満又は１％未満のトレハロースを含有する。
更なる態様では、本発明は、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌において細胞内トレハロースを蓄積させる、本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の使用に関する。好ましい実施形態では、本発明は、トレハロースの非存在下又は実質的に非存在下でグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌において細胞内トレハロースを蓄積させる、本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の使用に関する。別の実施形態では、本発明は、好ましくはマルトースを唯一又は実質的に唯一の炭素源として維持又は増殖させた場合にグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌において細胞内トレハロースを蓄積させる、本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の使用に関する。
上記のように、本発明によるグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌は、改善された様々な環境ストレスに対する抵抗性、並びに改善された製造特性、加工特性及び／又は保存特性を示す。したがって、一態様では、本発明はグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌においてストレス抵抗性を改善する、又は製造特性、加工特性及び／又は保存特性を改善する、本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌の使用に関する。更なる態様では、本発明は、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌においてストレス抵抗性を改善する、又は製造特性、加工特性及び／又は保存特性を改善する方法であって、本明細書に記載のグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を生成することを含む、方法に関する。
一実施形態では、ストレス抵抗性は酸性条件に対する抵抗性、胆汁塩に対する抵抗性、熱抵抗性、塩に対する抵抗性、低温抵抗性、浸透圧抵抗性を含む群から選択され、好ましくは酸性条件又は胆汁塩に対する抵抗性、より好ましくは胆汁塩に対する抵抗性から選択される。別の実施形態では、製造特性、加工特性及び／又は保存特性は、培地中での乾燥、凍結、フリーズドライ、噴霧乾燥又は保存、好ましくは凍結又はフリーズドライ、より好ましくはフリーズドライを含む群から選択される。
別の態様では、本発明は、ＴｒｅＰＰ活性を欠き、以下の特性のいずれか一方又は好ましくは両方を更に示すグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌に関する：（ｉ）グラム陽性菌がｐｔｃＣ活性を欠いている；（ｉｉ）グラム陽性菌が１つ又は複数のトレハローストランスポーターを過剰発現、好ましくは構成的に過剰発現する。一実施形態では、本発明は、ＴｒｅＰＰ活性を欠き、ｐｔｃＣ活性を欠くグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌に関する。別の実施形態では、本発明は、ＴｒｅＰＰ活性を欠き、１つ又は複数のトレハローストランスポーターを（構成的に）過剰発現するグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌に関する。また別の実施形態では、本発明は、ＴｒｅＰＰ活性を欠き、ｐｔｃＣ活性を欠き、１つ又は複数のトレハローストランスポーターを（構成的に）過剰発現するグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌に関する。更なる実施形態では、本発明は、機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼ及び／又は機能的な異種トレハロース６−リン酸シンターゼを含有しない、これらのグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌のいずれかに関する。別の実施形態では、本発明は、機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼ及び／又は機能的な異種トレハロース６−リン酸シンターゼを含有する、これらのグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌のいずれかに関する。更なる実施形態では、本発明は、１つ又は複数の異種遺伝子産物、好ましくは予防的及び／又は治療的な遺伝子産物を含有し、好ましくは機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼ及び／又は機能的な異種トレハロース６−シンターゼを含有しない、これらのグラム陽性菌、好ましくは乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌のいずれかに関する。
本発明の態様及び実施形態は以下の非限定的な実施例によって更に支持される。
表１は、表２に与えられる図４で使用される株以外の本明細書に記載の株における遺伝子改変の概要を示す。
Figure 2014526266
本明細書に記載の株における遺伝子改変の概要。ａ）トレハロースオペロンの構造：天然トレハロースオペロンプロモーター（Ｐｔｒｅ）がトレハロースＰＴＳトランスポーターに先行するか否か（Ｐｔｒｅ＞＞ＰＴＳ）及びｔｒｅＰＰが欠失している（ＫＯ）か否か（野生型；ｗｔ）；ｂ）ｐｔｃＣ遺伝子の構造：野生型（ｗｔ）、終止コドンの挿入又は遺伝子欠失による不活性化（ＫＯ）；ｃ）欠如（−）又はｔｈｙＡプロモーターに続くｔｈｙＡ遺伝子座に挿入される（ＰｔｈｙＡ＞＞ｏｔｓＢ）、若しくはｕｓｐ４５遺伝子に続く２番目のシストロンとして挿入される（ｕｓｐ４５＞＞ｏｔｓＢ）、機能的に不活性な（突然変異）ｏｔｓＢ若しくは野生型ｏｔｓＢの存在；ｄ）ｔｈｙＡ遺伝子の構造：野生型（ｗｔ）又は遺伝子欠失若しくはカーゴ遺伝子の挿入（遺伝子置換）による不活性化（ＫＯ）；ｅ）欠如（−）又はｈｌｌＡプロモーターの制御下でｔｈｙＡ遺伝子座に挿入される（ＰｈｌｌＡ＞＞）若しくはｕｓｐ４５遺伝子若しくはｇａｐＢ遺伝子の下流に挿入される（ｕｓｐ４５＞＞；ｇａｐＢ＞＞）、ｕｉｄＡ、ｈＩＬ−１０又は抗ＴＮＦ ＣＤＰ８７０カーゴ遺伝子の性質及び構造。全ての株がラクトコッカス・ラクティスＭＧ１３６３に由来する。
Figure 2014526266
トレハロース出口を同定するために構築した株の概要。ｔｒｅＰＰが欠損し、トレハロース蓄積を可能にする株を構築し、ラクトコッカス・ラクティスＣＯＧ機能別カテゴリー「炭水化物の輸送及び代謝（Carbohydrate transport and metabolism）」（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/cogtik.cgi?gi=20494&cog=G）（それから遺伝子及びタンパク質の命名を採用した）から選択した遺伝子を不活性化する。不活性化遺伝子の遺伝子ＩＤ及び不活性化タンパク質産物を示す。
遺伝子不活性化を、インフレーム終止コドンをそれぞれの標的遺伝子に導入するオリゴヌクレオチド指向組換え（recombineering）によって行った。全ての株がラクトコッカス・ラクティスＭＧ１３６３に由来する。
実施例１：ｔｒｅＰＰ不活性化後の細胞内トレハロース蓄積
実験
株を５０ｍｌのＧＭ１７Ｔ＋５００ｍＭトレハロース中、３０℃で一晩（Ａ）又は２４時間（Ｂ）成長させ、細胞を遠心分離によって採集し、トレハロース含量を決定した。細胞ペレット（湿重量）の重量決定後に、１０ｍｌ相当量の一晩培養物を０．２５Ｍ炭酸緩衝剤で３回洗浄した。細胞を、溶解基質Ｂ及びＭＰ Ｆａｓｐｒｅｐ−２４デバイス（MP Biomedicals）を６ｍ／ｓで４０秒間用いて１ｍｌの０．２５Ｍ炭酸緩衝剤に溶解した。溶解細胞の上清を遠心分離によって分離し、９９℃で３０分間加熱した。細胞残屑を遠心分離によって除去し、トレハロースアッセイキット（Ｋ−ＴＲＥＨ ０１０／１０、Megazyme（Ireland））を用いて上清をトレハロース濃度についてアッセイした。簡潔に述べると、サンプル中のトレハロースをトレハラーゼによってＤ−グルコースへと加水分解し、放出されたＤ−グルコースを、アデノシン−５’二リン酸（ＡＤＰ）の同時形成とともに、酵素ヘキソキナーゼ及びアデノシン−５’三リン酸（ＡＴＰ）によってグルコース−６−リン酸へとリン酸化した。酵素グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの存在下で、グルコース−６−リン酸をニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）によってグルコン酸−６−リン酸へと酸化し、還元型ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を形成した。この反応において形成されたＮＡＤＰＨの量はＤ−グルコースの量、したがってトレハロースの量と化学量論的である。ＮＡＤＰＨは３４０ｎｍでの吸光度の増加によって測定される（トレハロース（trehalose）添加前のＯＤ３４０と比較する）。トレハロース値をトレハロース標準の段階希釈物を用いて算出し、細胞ペレットの湿重量（ｗｗ）１ｇ当たりのｍｇとして表した。
結果
細胞内トレハロース蓄積は、図１に示されるようにｔｒｅＰＰ不活性化後、ｏｔｓＢ発現後又はそれらの組合せで可能である。図１（Ａ）はｔｒｅＰＰ野生型株（ｓＡＧＸ００３７及びｓＡＧＸ０１３７）がトレハロースを蓄積させないことを示す。ｓＡＧＸ０１４７をもたらすｓＡＧＸ０１３７（非機能的な突然変異ｏｔｓＢを含有する）におけるｔｒｅＰＰの不活性化は、トレハロースの蓄積を可能にする。ｓＡＧＸ０１３９をもたらす野生型ｏｔｓＢ ｓＡＧＸ００３７の挿入は、トレハロースの蓄積を可能にする。ｏｔｓＢ及びｔｒｅＰＰ ＫＯの組合せは、トレハロース蓄積の適度な増加をもたらし（ｓＡＧＸ０１４８）、これはラクトコッカス・ラクティスのトレハロースオペロン（ｓＡＧＸ０１６７）の両方のホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）遺伝子の前に強力な構成的ＰｈｌｌＡプロモーター（国際公開第２００８／０８４１１５号に開示される）を挿入することによって大幅に増強される。図１（Ｂ）はｔｒｅＰＰ野生型株ｓＡＧＸ００８５がトレハロースを蓄積させることができないことを示す。ｔｒｅＰＰ ＫＯ（ｓＡＧＸ０１６９）の不活性化のみがトレハロースの蓄積を可能にする。
図１から、ｔｒｅＰＰ野生型株がトレハロースを蓄積させないことが明らかである。ｔｒｅＰＰの遺伝子破壊（遺伝子欠失だけでなく点突然変異も）は、外因性トレハロースの細胞内蓄積を可能にする。ｓＡＧＸ０１４７株では、非機能的なｏｔｓＢ突然変異遺伝子が存在するが、ｓＡＧＸ０１６９株、ｓＡＧＸ０３０９株及びｓＡＧＸ０３１９株はｏｔｓＢ遺伝子を保有（carry）しない。ｓＡＧＸ０１６９株は、ｔｈｙＡ遺伝子座に存在するｈＴＦＦ１カーゴ遺伝子を除いて、ｔｒｅＰＰの破壊以外の他の遺伝子変化を保有しない。ｔｒｅＰＰ ＫＯ株におけるトレハロース蓄積は、従来技術によれば、これがトレハロース−６−リン酸ホスファターゼ（ｏｔｓＢ又は類似物）によって決定的に決まると考えられることから予想外である。かかる機能はラクトコッカス・ラクティスにおいては記載されておらず、トレハロース−６−リン酸を不活性な細胞内トレハロースへと変換することによってラクトコッカス・ラクティスによるトレハロースの代謝に対抗し得ることから、存在が期待されていない。今回、予想外にもこの機能がラクトコッカス・ラクティスにおいて存在することが観察される。ｔｒｅＰＰ ＫＯは、本明細書で行ったように遺伝子欠失によって、又は終止コドン若しくはフレームシフト突然変異若しくはプロモーター突然変異の確立、若しくは自然の非機能的なｔｒｅＰＰ突然変異の同定によって行うことができる。ｏｔｓＢがそれ自体で（ｓＡＧＸ０１３９）、又はｔｒｅＰＰ ＫＯと組み合わせて（ｓＡＧＸ０１４８）、又は更にはラクトコッカス・ラクティスのトレハロースオペロンのホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）遺伝子の両方の前に位置する、強力な構成的プロモーターＰｈｌｌＡの挿入（ＰｈｌｌＡ＞＞ｔｒｅＰＴＣ）と更に組み合わせて（ｓＡＧＸ０１６７）存在する場合にトレハロース蓄積は可能である。本明細書で使用される場合、ｏｔｓＢの好ましい位置は、欧州特許出願公開第１１１６８４９５．７号及び同第１１１７３５８８．２号に記載されるような構成における固有のｕｓｐ４５遺伝子後の２番目のシストロンである（ｕｓｐ４５＞＞ｒｐｍＤ＞＞ｏｔｓＢ、ｒｐｍＤはｒｐｍＤに先行する遺伝子間領域である）。
実施例２：外因性トレハロースの蓄積は胆汁溶解に対する保護をもたらす
実験
株を５０ｍｌのＧＭ１７Ｔ又はＧＭ１７Ｔ＋５００ｍＭトレハロース中、３０℃で一晩成長させ、細胞を遠心分離によって採集し、２５ｍｌの０．９％ ＮａＣｌに再懸濁した。サンプルを採取し、適切な希釈物（初期）をプレーティングすることによってＣＦＵを決定した。Ｔ０で、０．９％ＮａＣｌ中の２５ｍｌの１％ｏｘｇａｌを添加し、細胞懸濁液を３７℃で８時間インキュベートした。サンプルをＴ０、１時間、２時間、４時間、６時間及び８時間で採取した。適切な希釈物をプレーティングすることによってＣＦＵを決定し（図２Ａ）、基本的に実施例１に記載のようにトレハロース含量を決定した（図２Ｂ）。
結果
細胞内トレハロースは胆汁溶解を防ぎ、細胞内トレハロースの喪失は胆汁溶解に対する抵抗性の低下と同時に起こる。したがって、トレハロースの漏出は、胆汁における長期安定性に問題である。
ラクトコッカス・ラクティス細胞における外因性トレハロースの蓄積が胆汁溶解に対する保護をもたらすことを図２に示す。細胞内トレハロースの放出は、トレハロースの経時的な保護効果を制限する。トレハロースを蓄積した、すなわち図２Ｂに記載のように５００ｍＭトレハロース中で成長したラクトコッカス・ラクティス細胞（ｓＡＧＸ０１６７＋トレハロース、ｓＡＧＸ０３０９＋トレハロース及びｓＡＧＸ０３１９＋トレハロース）は、細胞内トレハロースを有しないラクトコッカス・ラクティス細胞（ｓＡＧＸ０１６７、トレハロースなしで前培養した）と比較した場合に、細胞内トレハロース濃度に比例して経時的に胆汁溶解に対する実質的な保護を示す。０．５％ｏｘｇａｌ中での生存の低下（図２Ａ）は、細胞内トレハロースの放出と同時に起こる（図２Ｂ）。
実施例３：外因性トレハロースの蓄積は胆汁溶解に対する保護をもたらす
実験
細胞を遠心分離によって採集し、１×Ｍ９塩溶液に再懸濁した。サンプルを採取し、トレハロース濃度を、基本的に実施例１に記載のようにＴ０、１時間、２時間及び４時間で決定した。データは全てのｐｔｃＣ ｗｔ株について典型的なものである。
結果
蓄積の後、トレハロースはこれまで同定及び予期されていないトレハロース出口を介して細胞から或る程度漏出し、上清中で回収され得る。
図３Ａは、トレハロースがデノボ合成及びその後の成長培地からの取込み（ｓＡＧＸ０１６７を、図１に記載のように５００ｍＭトレハロース中で成長させた）によって細胞内に蓄積し得ることを示す。デノボ合成されたトレハロース及び外生的に蓄積したトレハロースの両方が細胞から放出される。図３Ｂは、細胞内トレハロースの喪失が培養上清中に存在するトレハロースの増加をもたらす（ここでは、細胞内及び細胞外のトレハロース濃度間の比較を可能にする１０ｍｌの培養物当たりのトレハロースのｍｇ量として表す）ことを示す。
実施例４：表２に記載の様々な株におけるトレハロースの蓄積及び放出
実験
表２に記載の株を、１００ｍＭ（図４Ａ）又は５００ｍＭ（図４Ｂ）のトレハロースを添加したＧＭ１７中で成長させた。細胞を採集し、Ｍ９緩衝剤（Difco）に再懸濁した。細胞内トレハロース含量を、基本的に実施例１に記載のようにＴ０、２時間、４時間及び８時間で決定した。ｓＡＧＸ０２４８（ｐｔｃＣ ＫＯ）を除く全ての株が、図３に記載のように類似のトレハロース放出を示す。
結果
２０個のラクトコッカス・ラクティスＭＧ１３６３オリゴ糖（oligosaccharide）トランスポーターを、ＣＯＧデータベース（炭水化物の輸送及び代謝のセクション）から選択し、それらの遺伝子をｔｒｅＰＰ ＫＯバックグラウンドにおけるオリゴヌクレオチド指向組換え（ｓＡＧＸ０２７２；トレハロース蓄積に必要とされる）によって破壊した（表２；図４）。ｐｔｃＣの破壊のみがトレハロースの放出を回避する。
表２に挙げられる遺伝子のいずれがトレハロース放出に関与するかを予測することはできない。トレハロースオペロン内に存在するＰＴＳトランスポーター遺伝子（ｌｌｍｇ＿０４５３；ｌｌｍｇ＿０４５４）のいずれか１つの破壊は、トレハロースの取込み又は放出に対して影響を有しない。ｐｔｃＣ遺伝子（セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネントをコードする）の破壊は、蓄積トレハロースの漏出を解消するため、ＰｔｃＣがトレハロース出口であり、このタンパク質がトレハロースの漏出を引き起こす。ｃｅｌＢ（セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント）の破壊は、トレハロースの取込み又は放出に対して影響を有しない。ｔｒｅＰＰ ＫＯバックグラウンドでのｐｔｃＣの破壊は、トレハロースの全放出を防ぐ。
実施例５：表２に記載の様々な株におけるトレハロースの蓄積及び放出
実験
株をＧＭ１７Ｔ＋５００ｍＭトレハロース中、３０℃で一晩成長させ、細胞を遠心分離によって採集し、等量の１×Ｍ９（図５Ａ）又は０．９％ＮａＣｌ中の０．５％Ｏｘｇａｌ（図５Ｂ）に再懸濁し、３７℃で２４時間インキュベートした。サンプルをＴ０、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間及び２４時間で採取した。細胞内トレハロース含量を実施例１に記載のように決定した。
結果
ｐｔｃＣ ＫＯ（終止コドン挿入及び遺伝子欠失）とＰｈｌｌＡ＞＞ｔｒｅＰＴＣ（トレハローストランスポーターの構成的高発現）との組合せは、高いトレハロース取込み及び完全な細胞内保持を可能にする。
図５は、ｐｔｃＣの不活性化が細胞内トレハロースの放出を防ぐ（Ｍ９塩中、パネルＡ）又は遅らせる（０．５％ｏｘｇａｌ中、パネルＢ）ことを示す。ラクトコッカス・ラクティスのトレハロースオペロンの両方のＰＴＳ遺伝子の前に強力な構成的ＰｈｌｌＡプロモーター（国際公開第２００８／０８４１１５号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示される）が存在することにより、外因性トレハロースを蓄積させる能力が参照株の能力にまで回復する（図４も参照されたい）。
実施例６：外因性トレハロースの蓄積は胆汁溶解に対する保護をもたらす
実験
株をＧＭ１７Ｔ＋５００ｍＭトレハロース中、３０℃で一晩成長させ、細胞を遠心分離によって採集し、半量の０．９％ＮａＣｌに再懸濁した。サンプルを採取し、適切な希釈物（初期）をプレーティングすることによってＣＦＵを決定した。Ｔ０で、０．９％ＮａＣｌ中の半量の１％ｏｘｇａｌを添加し、３７℃で８時間インキュベートした。サンプルをＴ０、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間及び２４時間で採取した。トレハロース含量を決定し（図６Ａ、基本的に実施例１と同様）、適切な希釈物をプレーティングする（０〜８時間のみ）ことによってＣＦＵを決定し、初期Ｔ０値に対する％としてプロットした（図６Ｂ）。
結果
細胞内トレハロースを保持する能力の向上は、胆汁抵抗性の改善をもたらす。
図６は、ラクトコッカス・ラクティス細胞における外因性トレハロースの蓄積が胆汁溶解に対する保護をもたらすことを示す。細胞内トレハロースの放出（Ａ）は、０．５％ｏｘｇａｌにおける生存の低下（Ｂ）と同時に起こる。ｐｔｃＣの不活性化は経時的な細胞内トレハロースの存在を延長し、結果的にｏｘｇａｌに対する経時的な抵抗性も改善する。
実施例７：ｔｒｅＰＰ ＫＯ株はグルコース又はマルトースを細胞内トレハロースへと変換することが可能である。マルトースはｔｒｅＰＰ ＫＯ株におけるトレハロース取込みを刺激する
実験
株を指定の培地で一晩成長させた。トレハロースを基本的に実施例１に記載のように決定した。
結果
ｔｒｅＰＰ ＫＯ株は、トレハロースの蓄積にグルコース又はマルトース等の炭素源を利用する能力を獲得した。トレハロースがＭＭ１７Ｔにおいて、すなわちマルトースを単一の炭素源として細胞内に蓄積することができることから、このことは従来技術には記載されていない。
図７は、ｔｒｅＰＰ ＫＯ株（ｐｔｃＣ ｗｔ及びｐｔｃＣ ＫＯの両方）がグルコース又はマルトースを細胞内トレハロースへと変換することが可能であることを示す（第１欄及び第２欄、第５欄〜第８欄）。マルトースは、ｔｒｅＰＰ ＫＯ株において成長培地からの細胞外トレハロースの取込み及び蓄積を向上させる（第９欄及び第１０欄）。
ｔｒｅＰＰ ＫＯ株は、以下のものを用いて成長させた場合にトレハロースを蓄積させる：
１．炭素源としてのグルコース（ＧＭ１７Ｔ；第１欄及び第２欄）
２．炭素源としてのグルコース及び細胞外トレハロース（ＧＭ１７Ｔ＋５００ｍＭトレハロース；第３欄及び第４欄）
３．炭素源としてのマルトース（ＭＭ１７Ｔ；第５欄及び第６欄）
４．炭素源としてのグルコース及びマルトース（ＧＭ Ｍ１７Ｔ；第７欄及び第８欄）
５．炭素源としてのマルトース及び細胞外トレハロース（ＭＭ１７Ｔ＋５００ｍＭトレハロース；第９欄及び第１０欄）
実施例８：凍結乾燥（lyophilization）後の生存
実験
表３Ａ：成長を最適化した２００Ｌの培養物（動物タンパク質を含まない発酵培地）を、限外濾過及び透析濾過、並びに濃縮抗凍結剤ミックス（国際公開第２０１０／１２４８５５号に記載）への再懸濁によって１０倍濃縮した。１ｍｌ当たりのＣＦＵカウントを細菌懸濁液について決定した。懸濁液を大量に分析トレイに調合し、トレイを秤量し、凍結乾燥した。生存能力の評価については、凍結乾燥した適切な重量分を適量の精製水で再構成し、１ｍｌ当たりのＣＦＵカウントを決定した。生存能力（％）を凍結乾燥前後のＣＦＵの比率から決定した。
表３Ｂ：２０Ｌの一晩培養物（ＧＭ１７Ｔ＋５００ｍＭトレハロース）を、遠心分離及び濃縮抗凍結剤ミックス（国際公開第２０１０／１２４８５５号に記載）への再懸濁によって１００倍濃縮した。１ｍｌ当たりのＣＦＵカウントを細菌懸濁液について決定した。懸濁液を大量にバイアル（２．５ｍｌの充填量）に凍結乾燥した。生存能力の評価については、凍結乾燥した２．５ｍｌ容バイアルを２．５ｍｌの精製水で再構成し、１ｍｌ当たりのＣＦＵカウントを決定した。生存能力（％）を凍結乾燥前後のＣＦＵの比率から決定した。２つの独立した製造バッチ（ｓＡＧＸ０１６７及びｓＡＧＸ０３０９）から、凍結乾燥後に１００％を超える生存が得られる。
（Ａ）及び（Ｂ）の両方の凍結乾燥粉末に好適な賦形剤を更に配合し、ＣＦＵ／ｇを標準化した。ｓＡＧＸ００３７、ｓＡＧＸ０１６７及びｓＡＧＸ０３０９を、最低でも１．２×１０１１ＣＦＵ／カプセルでＨＰＭＣカプセルに充填した。カプセルをセルロース膜でまとめ、小腸及び結腸への標的化送達のために腸溶コーティング膜としてメタクリル酸−アクリル酸エチル共重合体でコーティングした。
トレハロースは基本的に実施例１に記載のように決定した。
結果
表３に示されるように、トレハロースを蓄積させることができる株は、大幅に向上したフリーズドライ中に受ける乾燥ストレスに対する抵抗性を示す。
Figure 2014526266
実施例９：ブタの腸における腸通過時の生存
実験
雌ブタ（１５０ｋｇを超える）の近位十二指腸及び近位結腸にカニューレを外科的に取り付けした。十二指腸カニューレに、カプセル化したフリーズドライｓＡＧＸ００３７及びｓＡＧＸ０１６７を挿入した。投与後０時間、２時間、４時間、６時間、８時間及び１０時間の時点で結腸カニューレから結腸内容物をサンプリングした。サンプル中の生ラクトコッカス・ラクティス（ＣＦＵカウント）と全ラクトコッカス・ラクティス（生及び死；Ｑ−ＰＣＲ分析）との比率から生存能力（％）を決定した。数値は表４に示す。
結果
トレハロースを蓄積させることができる株は、大腸系（ブタ）において飼養状態又は絶食状態とは無関係に大幅に向上した生存を示す。
表４及び図８は、フリーズドライしたカプセル化ｓＡＧＸ００３７（表４Ａ）と比較した場合に、フリーズドライしたカプセル化ｓＡＧＸ０１６７（細胞内トレハロース蓄積のために事前に成長させた；表４Ｂ）が、ブタを２４時間絶食させた場合（図８Ａ）及び不断給餌（図８Ｂ）の両方でブタの腸における腸通過時の生存の向上を示すことを示す。
Figure 2014526266
実施例１０：トレハロースはバイオマス産生後に蓄積することができる
実験
指定の株をＧＭ１７Ｔ中で一晩成長させ（３０℃で１６時間）、遠心分離（４０００ｒｐｍで１５分間）によって採集した。細菌ペレットを新たなＧＭ１７Ｔ＋５００ｍＭトレハロースに再懸濁し、インキュベートした。細胞内トレハロース含量を実施例１に記載のようにＴ＝０時間、１時間、２時間及び４時間で決定した。
結果
図９Ａに示されるように、細菌を経時的にインキュベートした場合に、トレハロースはバイオマス産生後に蓄積することができる。図９Ｂに示されるように、これはｔｒｅＰＰ ＫＯ株においてのみ達成することができ（他に対してｓＡＧＸ００９０）、更なる遺伝子の挿入又は欠失を要求しない（ｓＡＧＸ０１６９）。ｏｔｓＢの付加的な存在（ｓＡＧＸ０１６７、ｓＡＧＸ０３４６、ｓＡＧＸ０３５４、ｓＡＧＸ０３６０）はトレハロース蓄積を刺激する。
実施例１１：マルトースは細胞内トレハロースの蓄積を刺激することができる
実験
指定の株をＧＭ１７Ｔ±５００ｍＭトレハロース、ＧＭ１７Ｔ＋０．５％マルトース（ＧＭＭ１７Ｔ）＋５００ｍＭトレハロース又はＭ１７Ｔ＋０．５％マルトース（ＭＭ１７Ｔ）＋５００ｍＭトレハロース中で一晩成長させ（一晩；３０℃で１６時間）、遠心分離（４０００ｒｐｍで１５分間）によって採集した。細胞内トレハロース含量を実施例１に記載のように決定した。
結果
図１０に示されるように、マルトースは一晩成長させた培養物において細胞内トレハロースの蓄積を刺激する。
実施例１２：マルトースはバイオマス産生中又はバイオマス産生後に細胞内トレハロースへと変換されることができる
実験
指定の株をＧＭ１７Ｔ中で一晩成長させ（一晩、３０℃で１６時間）、細胞を遠心分離（４０００ｒｐｍで１５分間）によって採集し、Ｍ１７Ｔ＋０．５％マルトース（ＭＭ１７Ｔ）に再懸濁し、８時間インキュベートした（８時間超、ＭＭ１７Ｔ）。代替的には、指定の株をＭＭ１７Ｔ中で一晩成長させた。細胞内トレハロース含量を実施例１に記載のように決定した。
結果
図１１に示されるように、マルトースはバイオマス産生中又はバイオマス産生後に細胞内トレハロースへと変換されることができる。
略語
Figure 2014526266

Claims (29)

  1. トレハロース６−リン酸ホスホリラーゼ（ＴｒｅＰＰ）活性を欠き、又は機能的なｔｒｅＰＰ遺伝子産物を産生することが不可能なように内因性ＴｒｅＰＰをコードする遺伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されている、薬剤として使用されるグラム陽性菌、又は乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌。
  2. 機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有しない、請求項１に記載の使用されるグラム陽性菌。
  3. セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（ｐｔｃＣ）活性を欠き、又は機能的なｐｔｃＣ遺伝子産物を産生することが不可能なように内因性ｐｔｃＣをコードする遺伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されている、請求項１又は２に記載の使用されるグラム陽性菌。
  4. トレハローストランスポーター、又は内因性トレハローストランスポーターをコードする１つ又は複数の遺伝子を構成的に過剰発現する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用されるグラム陽性菌。
  5. １つ又は複数の異種遺伝子産物、又は１つ又は複数の予防的及び／又は治療的な遺伝子産物又は抗原を含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用されるグラム陽性菌。
  6. 乾燥、噴霧乾燥、凍結又はフリーズドライされている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用されるグラム陽性菌。
  7. ＴｒｅＰＰ活性を欠き、又は機能的なｔｒｅＰＰ遺伝子産物を産生することが不可能なように内因性ＴｒｅＰＰをコードする遺伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されているグラム陽性菌を含む食品添加物、プロバイオティック組成物又はスターター培養物。
  8. 食品の調製用のスターター培養物である、請求項７に記載のスターター培養物。
  9. 前記グラム陽性菌が機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有しない、請求項７に記載の食品添加物若しくはプロバイオティック組成物又は請求項７若しくは８に記載のスターター培養物。
  10. 前記グラム陽性菌がｐｔｃＣ活性を欠き、又は機能的なｐｔｃＣ遺伝子産物を産生することが不可能なように内因性ｐｔｃＣをコードする遺伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されている、請求項７若しくは９に記載の食品添加物若しくはプロバイオティック組成物又は請求項７〜９のいずれか一項に記載のスターター培養物。
  11. 前記グラム陽性菌がトレハローストランスポーター、又は内因性トレハローストランスポーターをコードする１つ又は複数の遺伝子を構成的に過剰発現する、請求項７、９若しくは１０に記載の食品添加物若しくはプロバイオティック組成物又は請求項７〜１０のいずれか一項に記載のスターター培養物。
  12. 前記グラム陽性菌が１つ又は複数の異種遺伝子産物、又は１つ又は複数の予防的及び／又は治療的な遺伝子産物又は抗原を発現する、請求項７若しくは９〜１１のいずれか一項に記載の食品添加物若しくはプロバイオティック組成物又は請求項７〜１１のいずれか一項に記載のスターター培養物。
  13. 前記食品添加物又はスターター培養物が凍結、乾燥、噴霧乾燥又はフリーズドライされている、請求項７若しくは９〜１２のいずれか一項に記載の食品添加物若しくはプロバイオティック組成物又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載のスターター培養物。
  14. 薬剤を調製する又は食品添加物を調製する又はプロバイオティック組成物を調製する又はスターター培養物を調製する方法であって、
    ｉ）ＴｒｅＰＰ活性を欠き、又は機能的なｔｒｅＰＰ遺伝子産物を産生することが不可能なように内因性ＴｒｅＰＰをコードする遺伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されているグラム陽性菌、又は乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌を、該グラム陽性菌によって発酵させることが可能な基質材料を含む培地中で増殖させる工程と、
    ｉｉ）そのようにして増殖させたグラム陽性菌を、薬剤又は食品添加物又はプロバイオティック組成物又はスターター培養物のそれぞれに配合する工程と、
    を含む、方法。
  15. グラム陽性菌、又は乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌においてトレハロースを内因的に蓄積させる方法であって、ＴｒｅＰＰ活性を欠き、又は機能的なｔｒｅＰＰ遺伝子産物を産生することが不可能なように内因性ＴｒｅＰＰをコードする遺伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されているグラム陽性菌を、該グラム陽性菌によって発酵させることが可能な基質材料を含む培地中で増殖させることを含む、方法。
  16. グラム陽性菌、又は乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌のストレス抵抗性又は製造特性、加工特性及び／又は保存特性、又は酸性条件に対する抵抗性、熱に対する抵抗性、塩に対する抵抗性、胆汁塩に対する抵抗性、乾燥、噴霧乾燥、凍結又はフリーズドライに対する抵抗性、及び浸透圧抵抗性を含む群から選択される１つ又は複数のストレス抵抗性又は製造特性、加工特性及び／又は保存特性を改善する方法であって、前記グラム陽性菌を、ＴｒｅＰＰ活性を欠き、又は機能的なｔｒｅＰＰ遺伝子産物を産生することが不可能なように内因性ＴｒｅＰＰをコードする遺伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されるように改変することを含む、方法。
  17. 前記グラム陽性菌が機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有しない、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記グラム陽性菌がｐｔｃＣ活性を欠き、又は機能的なｐｔｃＣ遺伝子産物を産生することが不可能なように内因性ｐｔｃＣをコードする遺伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されている、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記グラム陽性菌がトレハローストランスポーター、又は内因性トレハローストランスポーターをコードする１つ又は複数の遺伝子を構成的に過剰発現する、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記グラム陽性菌が１つ又は複数の異種遺伝子産物、又は１つ又は複数の予防的及び／又は治療的な遺伝子産物又は抗原を発現する、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記グラム陽性菌、薬剤、食品添加物、プロバイオティック組成物又はスターター培養物を乾燥、凍結、噴霧乾燥又はフリーズドライすることを更に含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 培養培地が炭素源、又は主要な又は唯一の炭素源としてマルトース若しくはグルコース又はマルトース及びグルコースの組合せを含む、請求項１４、１５、１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記培養培地が実質的に外部から添加されたトレハロースを含有しない、請求項１４、１５、１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 請求項７〜１３のいずれか一項に記載の食品添加物、プロバイオティック組成物又はスターター培養物と、グラム陽性菌によって発酵させることが可能な基質材料とを混合することを含み、任意に該基質材料を発酵させる工程を更に含む、食品を調製する方法。
  25. 請求項２４に記載の方法によって得ることができる食品。
  26. ＴｒｅＰＰ活性を欠き、以下の特性のいずれか一方又は両方を更に示す、グラム陽性菌、又は乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌：（ｉ）前記グラム陽性菌がｐｔｃＣ活性を欠く；（ｉｉ）前記グラム陽性菌が、１つ又は複数のトレハローストランスポーターを構成的に過剰発現する。
  27. 機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有しない、請求項２６に記載のグラム陽性菌。
  28. ＴｒｅＰＰ活性を欠き、１つ又は複数の異種遺伝子産物、又は予防的及び／又は治療的な遺伝子産物を含有し、更に以下の特性のいずれか一方又は両方を任意に示す、グラム陽性菌、又は乳酸菌（ＬＡＢ）又はビフィズス菌：（ｉ）前記グラム陽性菌がｐｔｃＣ活性を欠く；（ｉｉ）前記グラム陽性菌が、１つ又は複数のトレハローストランスポーターを構成的に過剰発現する。
  29. 機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有しない、請求項２８に記載のグラム陽性菌。
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