ES2351349T3 - Liberación de péptidos trébol. - Google Patents

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ES2351349T3 ES06021747T ES06021747T ES2351349T3 ES 2351349 T3 ES2351349 T3 ES 2351349T3 ES 06021747 T ES06021747 T ES 06021747T ES 06021747 T ES06021747 T ES 06021747T ES 2351349 T3 ES2351349 T3 ES 2351349T3
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Wolfgang Christian Hans
Lothar Steidler
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Abstract

Uso de una bacteria recombinante no patógena y no invasiva transformada con ADN que codifica un péptido trébol y que es capaz de liberar un péptido trébol en el tracto gastrointestinal de un ser humano o un animal para la preparación de un medicamento para tratar lesiones o para inhibir la formación de lesiones en el canal alimentario producidas por terapia con radiaciones o quimioterapia para el tratamiento del cáncer, un fármaco que lesiona el canal alimentario incluyendo alcohol, la exposición accidental a la radiación o a una sustancia caústica, infección, trastorno digestivo, incluyendo pero sin limitarse a dispepsia no ulcerosas, gastritis, úlcera péptica o duodenal, cáncer gástrico, linfoma MALT, síndrome de Menetier o enfermedad por reflujo gastroesofágico.

Description

LIBERACIÓN DE PÉPTIDOS TRÉBOL
La presente memoria descriptiva se refiere al campo de sistemas de liberación de proteínas in vivo. Más particularmente, la presente memoria descriptiva se refiere a la secreción in vivo de péptidos trébol por parte de microorganismos, preferiblemente cepas bacterianas, preferiblemente cepas no patógenas, preferiblemente cepas no invasivas, preferiblemente cepas de calidad alimentaria, a procedimientos para la liberación de péptidos trébol usando dichos sistemas y al uso de dichos sistemas de expresión de péptidos trébol para el tratamiento de trastornos inflamatorios del tracto gastrointestinal.
Lactococcus lactis es una bacteria del ácido láctico Gram positiva no patógena que puede sobrevivir en el intestino (Klijn y col., 1995). No se sabe con certeza si
L. lactis puede estar también metabólicamente activa en todos estos entornos.
La expresión del fragmento C de la toxina tetánica por parte de Lactococcus lactis con vistas a la vacunación fue descrita por Wells y col. (1993b) y Robinson y col. (1997). Además se demostró que cuando se administraban por vía intranasal a ratones preparaciones bacterianas de L. lactis modificadas para expresar interleucina-2 o interleucina-6 junto con el fragmento C de la toxina tetánica (TTFC), se producía más de 10 veces más anticuerpos dirigidos contra TTFC que tras la administración similar de cepas que expresaban TTFC únicamente (solicitud de patente internacional publicada en el documento WO 97/14806). Estos resultados prueban el uso de un vector de vacuna bacteriano experimental que secreta citocinas no invasivo para potenciar las respuestas inmunes a un antígeno conjuntamente expresado. También se ha descrito un enfoque para adjuntar fragmentos proteicos heterólogos en la pared celular y de esta forma mostrarlos en la superficie de L. lactis, conduciendo posiblemente a propiedades de vacunación más potenciadas (documento WO 9709437 Steidler,
Remaut, Wells).
Los péptidos trébol son secretados por las células epiteliales mucosas y son estables en un entorno ácido. Estos péptidos contribuyen a la protección de la mucosa (formación de un gel sobre el epitelio) y están implicados probablemente en la reparación de la mucosa dañada mediante la estimulación de la migración epitelial (Playford y col., 1996). La producción de péptidos trébol aumenta localmente en aquellas regiones en las que se ha producido un daño tales como úlceras gástricas y colitis (Wright y col., 1990). Babyatsky y col (1996) han demostrado que la administración de péptidos trébol recombinantes reduce el daño en esos lugares. Al contrario que la mayoría de las demás proteínas que son importantes para la protección de la mucosa (tales como el factor de crecimiento epidérmico), la mayoría de los estudios han demostrado que los péptidos trébol provocan poca o ninguna proliferación (Playford y col., 1996). Se han identificado en humanos tres miembros de esta familia de péptidos trébol y se designaron originalmente: pS2 (gen inducible por estrógenos de cáncer de mama, O. Lefebvre, 1993), SP (péptido espasmolítico) e ITF (factor trébol intestinal). En la nomenclatura actual, se ha renombrado pS2 como TFF1, SP como TFF2 e ITF como TFF3 (véase por ejemplo Wong y col., 1999). Esta nueva nomenclatura se usará a lo largo de la presente divulgación.
En seres humanos, ratones y ratas, TFF1 y TFF2 se encuentran predominantemente en el estómago, mientras que TFF3 se encuentra predominantemente en el duodeno y el colon. Wong y col. (1999) dan una visión general reciente de péptidos trébol.
Se piensa que TFF1 actúa por medio de un receptor de la superficie celular (Tan y col., 1997).
El uso de péptidos o proteínas trébol para el tratamiento de trastornos y daños del tracto digestivo, incluyendo la boca, el esófago, el estómago y los intestinos grueso y delgado, así como para la protección y el tratamiento de tejidos que se encuentran fuera del tracto digestivo se describe en los documentos WO 97/38712 y WO 92/14837. Estas proteínas se pueden usar o bien para tratar lesiones en estas áreas o bien para inhibir la formación de lesiones. Estas lesiones pueden ser provocadas por: radioterapia o quimioterapia para el tratamiento del cáncer, cualquier otro fármaco incluyendo alcohol que dañe el tracto digestivo, exposición accidental a radiación o a una sustancia cáustica, infección, un trastorno digestivo incluyendo, pero sin limitación dispepsia no ulcerosa, gastritis, úlcera péptica o duodenal, cáncer gástrico, linfoma MALT, síndrome de Menetier, enfermedad de reflujo gastroesofágico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y colitis aguda de origen químico, bacteriano o desconocido.
Los péptidos trébol son particularmente útiles para el tratamiento de la colitis aguda.
También se ha usado el ITF en combinación con EGF (factor de crecimiento epidérmico) para tratar úlceras del tracto gastrointestinal. Experimentos in vitro e in vivo han demostrado que las actividades de curación de heridas del EGF se incrementan notablemente por el tratamiento de EGF en combinación con ITF, sin incrementar la acción proliferativa del EGF (Chinery y Playford, 1995).
La enfermedad inflamatoria intestinal es el nombre conjunto de una serie de inflamaciones gastrointestinales. A este grupo pertenecen la enteritis, la colitis, inflamaciones de la mucosa del duodeno o del colon respectivamente. La enfermedad de Crohn (enteritis regionalis) y la colitis ulcerosa (colitis ulcerosa) son enfermedades del tracto gastrointestinal íntimamente relacionadas espontáneamente recurrentes. Estas enfermedades están mediadas inmunológicamente y tienen causas ambientales y genéticas. Sartor (1995) describe los diferentes aspectos de la enfermedad inflamatoria intestinal. La enfermedad de Crohn ha sido particularmente estudiada por ejemplo por Herfath y Sartor, (1994), Cominelli y col., (1994) y MacDermott (1989).
La presente invención proporciona materia según se reivindica en uno cualquiera y en todos los apartados (i) a
(viii) siguientes:
(i)
Uso de una bacteria recombinante no patógena y no invasiva transformada con un ADN que codifica un péptido trébol y que es capaz de liberar un péptido trébol en el canal alimentario de un ser humano o animal para la preparación de un medicamento para tratar lesiones o para inhibir la formación de lesiones en el canal alimentario producidas por terapia con radiaciones o quimioterapia para el tratamiento del cáncer, un fármaco que lesiona el canal alimentario incluyendo alcohol, la exposición accidental a la radiación o a una sustancia caústica, infección, trastorno digestivo, incluyendo pero sin limitarse a dispepsia no ulcerosas, gastritis, úlcera péptica o duodenal, cáncer, gástrico, linfoma MALT, síndrome de Menetier o enfermedad por reflujo gastroesofágico.
(ii)
Uso como se ha definido en (i) anterior en donde las lesiones en el canal alimentario están originadas terapia con radiaciones o quimioterapia para el tratamiento del cáncer.
(iii) Uso como se ha definido en uno cualquiera de (i) o
(ii)
anterior en donde el canal alimentario incluye la boca, esófago, estómago, intestino grueso y delgado.
(iv)
Uso como se ha definido en uno cualquiera de (i) a
(iii) en donde las lesiones se encuentran en las superficies mucosas.
(v)
Uso como se ha definido en uno cualquiera de (i) a (iv) anterior en donde dicha bacteria no patógena y no invasiva es una cepa bacteriana de calidad alimentaria, preferiblemente una cepa bacteriana Gram positiva.
(vi)
Uso como se ha definido en (v) anterior en donde dicha cepa bacteriana es una especie de Lactococcus o Lactobacillus.
(vii) Uso como se ha definido en (vi) anterior en donde dicha cepa bacteriana es Lactococcus lactis.
(viii) Uso como se ha definido en uno cualquiera de (i) a
(vii) en donde dicho péptido trébol es TFF1.
La materia proporcionada por la presente invención pertenece así específicamente a la divulgación y descripción de la presente memoria descriptiva.
La presente divulgación da a conocer un procedimiento para la liberación de péptidos trébol para el tratamiento de trastornos gastrointestinales y una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos gastrointestinales.
La presente invención da a conocer más particularmente un microorganismo que libera un péptido trébol in vivo. Preferiblemente, Dicho microorganismo es una cepa bacteriana, preferiblemente una cepa no patógena, preferiblemente una cepa no invasiva, preferiblemente una cepa de calidad alimentaria, más preferiblemente una cepa bacteriana Gram positiva, de la forma más preferida una cepa bacteriana fermentadora de ácido láctico, preferiblemente una especie de Lactococcus o de Lactobacillus que expresa un péptido trébol in vivo. La presente invención se puede aplicar por lo tanto a cualquiera de las especies de Lactococcus o de Lactobacillus seleccionadas de la lista que comprende Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subespecie cremoris, Lactococcus lactis subespecie hordniae, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subespecie Lactis, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis, Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus aviarius, Lactobacillus aviarius subespecie araffinosus, Lactobacillus aviarius subespecie aviarius, Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchnneri, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus carnis, Lactobacillus casei, Lactobacillus casei subespecie alactosus, Lactobacillus casei subespecie casei, Lactobacillus casei subespecie pseudoplantarum, Lactobacillus casei subespecie rhamnosus, Lactobacillus casei subespecie tolerans, Lactobacillus catenaformis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus confusus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis, Lactobacillus coryniformis subespecie torquens, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus curvatus subespecie curvatus , Lactobacillus curvatus subespecie melibiosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subespecie delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subespecie lactis, Lactobacillus divergens, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus fructosus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus graminis, Lactobacillus halotolerans, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus heterohiochii, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus iners, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kandleri, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefirgranum,
Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus minor, Lactobacillus minutus, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus oris, Lactobacillus panis, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paracasei subespecie paracasei, Lactobacillus paracasei subespecie tolerans, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus piscicola, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rimae, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus sakei, Lactobacillus sakei subespecie camosus, Lactobacillus sakei subespecie sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus salivarius subespecie salicinius, Lactobacillus salivarius subespecie salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus trichodes,
Lactobacillus
uli, Lactobacillus vaccinostercus,
Lactobacillus
vaginalis, Lactobacillus viridescens,
Lactobacillus
vitulinus, Lactobacillus xylosus,
Lactobacillus yamanashiensis, Lactobacillus yamanashiensis subespecie mali, Lactobacillus yamanashiensis subespecie Yamanashiensis y Lactobacillus zeae.
No resultaba obvio a partir de la capacidad de Lactococcus lactis de liberar un antígeno heterólogo o de su capacidad para producir moléculas tales como IL-2 e IL-6 in vivo e in vitro que las bacterias fuesen un vehículo apropiado para la liberación de otros tipos de péptidos o polipéptidos in vivo. Además no se sabe si dichos péptidos trébol expresados por dichas cepas bacterianas proporcionarían un efecto beneficioso en enfermedades inflamatorias de tracto gastrointestinal, tales como enfermedad inflamatoria intestinal o colitis aguda.
Resulta por lo tanto sorprendente que se pudiera demostrar en la presente sección de ejemplos que cepas bacterianas son capaces de expresar péptidos trébol in vivo cuando están presentes en el tracto gastrointestinal y ejercen un efecto curativo en situaciones de colitis aguda. A modo de ejemplo, se clonaron fragmentos de PCR que contenían las regiones codificantes del TFF1 de ratón. Se construyeron vectores recombinantes que comprendían estos clones de PCR bajo el control de un promotor y la secuencia de la señal de secreción de Lactococcus lactis usp45. Se construyeron cepas de Lactococcus lactis transformadas que expresaban péptidos trébol TFF1 de ratón. Se demostró adicionalmente en un sistema modelo de ratón in vivo que el mTFF1 recombinante producido por estas bacterias puede ejercer sorprendentemente efectos curativos sobre la parte distal del colon inflamado.
La presente memoria descriptiva se refiere particularmente a una cepa bacteriana que libera un péptido trébol in vivo.
La presente memoria descriptiva se refiere adicionalmente a una bacteria que libera TFF1 in vivo.
La presente memoria descriptiva se refiere también partes o variantes de cualquier péptido trébol. Tales partes se refieren a partes bioilógicamente activas que se pueden generar mediante procedimientos bien conocidos por aquellos expertos en la materia. Estas partes contendrán generalmente al menos 10 aminoácidos contiguos, típicamente al menos 20 aminoácidos contiguos, más típicamente al menos 30 aminoácidos contiguos, normalmente al menos 40 aminoácidos contiguos y preferiblemente al menos 50 aminoácidos contiguos. Dichas variantes se refieren a variantes que tienen la misma actividad biológica que los péptidos trébol anteriormente mencionados.
Las cepas bacterianas según se divulgan en el presente documento también pueden expresar proteínas recombinantes adicionales que sean beneficiosas para el tratamiento de cualquier trastorno previsto.
La presente memoria descriptiva se refiere adicionalmente a una composición farmacéutica que comprende un microorganismo que expresa un péptido trébol como se ha definido anteriormente.
De forma ventajosa, la composición farmacéutica según se divulga en el presente documento es preferiblemente adecuada para su aplicación sobre superficies de mucosas.
Las composiciones farmacéuticas según se divulgan en el presente documento y para su uso según el presente documento pueden comprender, además del microorganismo, un excipiente, vehículo, tampón, estabilizante farmacéuticamente aceptable u otros materiales bien conocidos para aquellos expertos en la materia. Tales materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza concreta del vehículo u otros materiales puede depender de la vía de administración. Aquellos con relevante experiencia en la materia son perfectamente capaces de preparar soluciones adecuadas.
La presente memoria descriptiva se refiere adicionalmente a un procedimiento para la liberación de un péptido trébol al tracto gastrointestinal que comprende la administración de un microorganismo como se ha definido anteriormente.
La presente memoria descriptiva se refiere adicionalmente también al uso de un microorganismo como se ha definido anteriormente para la fabricación de un agente
para
la liberación de un péptido trébol al tracto
gastroint
estinal.
La
presente memoria descriptiva se refiere
adicionalmente a un procedimiento de tratamiento de enfermedades y/o trastornos gástricos y/o intestinales que comprende la administración de un microorganismo como se ha definido anteriormente.
La presente memoria descriptiva se refiere adicionalmente también a un procedimiento de tratamiento de enfermedades y/o trastornos gástricos y/o intestinales que comprende la administración de un microorganismo que libera un péptido trébol TFF1 in vivo.
Las proteínas trébol que expresan las cepas bacterianas según se divulgan en el presente documento pueden usarse o bien para tratar lesiones en estas áreas o bien para inhibir la formación de lesiones provocadas por enfermedades y trastornos gastrointestinales.
La expresión “enfermedades y/o trastornos gástricos y/o intestinales” se refiere a todos los tipos de enfermedades y/o trastornos gástricos, intestinales y gastrointestinales. En formas de realización preferidas de la invención, esta expresión se refiere a enfermedades y trastornos gastrointestinales agudos. Estas enfermedades son preferiblemente enfermedades gastrointestinales agudas de origen químico, bacteriano o desconocido. A este grupo pertenecen la enteritis, la colitis, incluyendo pero sin limitación reagudizaciones de la enfermedad de Crohn e inflamaciones de colitis ulcerosa de la mucosa del duodeno
o del colon, respectivamente. También se incluye aquí la diarrea del viajero. En otras formas de realización preferidas de la invención, la expresión “enfermedades y/o trastornos gástricos y/o intestinales” se refiere a enfermedades crónicas y espontáneamente recurrentes del tracto gastrointestinal tales como la enfermedad de Crohn (enteritis regionales) y la colitis ulcerosa (colitis ulcerosa).
La expresión “enfermedades y/o trastornos gástricos y/o intestinales” se refiere particularmente a enfermedades en las que están implicadas lesiones en superficies de mucosas. Como tales, los estados de enfermedad que se van a tratar mediante los procedimientos y composiciones farmacéuticas de la invención también pueden incluir trastornos y daño del tracto digestivo, incluyendo la boca, el esófago, el estómago y los intestinos grueso y delgado, así como para la protección y el tratamiento de tejidos que se encuentran fuera del tracto digestivo. Estas lesiones pueden estar provocadas por: radioterapia o quimioterapia para el tratamiento del cáncer, cualquier otro fármaco incluyendo alcohol que dañe el tracto digestivo, exposición accidental a radiación o a una sustancia cáustica, infección, un trastorno digestivo incluyendo, pero sin limitación dispepsia no ulcerosa, gastritis, úlcera péptica
o duodenal, cáncer gástrico, linfoma MALT, síndrome de Menetier, enfermedad de reflujo gastroesofágico y enfermedad de Crohn.
La presente invención se refiere por lo tanto al uso de un microorganismo como se ha descrito anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades y/o trastornos gástricos y/o intestinales.
La presente invención se refiere por lo tanto al uso de un microorganismo como se ha descrito anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias gastrointestinales agudas, colitis aguda, reagudizaciones de la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, y para el tratamiento de enfermedades crónicas y espontáneamente recurrentes del tracto gastrointestinal que comprenden enfermedad de Crohn (enteritis regionales) y colitis ulcerosa (colitis ulcerosa).
La memoria descriptiva también se refiere al uso de un microorganismo como se ha descrito anteriormente para la preparación de un medicamento para inhibir la formación de lesiones provocadas por enfermedades y trastornos gástricos y/o intestinales.
La administración del microorganismo puede ser por vía oral o por medio de cualquier otro procedimiento conocido en la materia que permita que el microorganismo entre en los lugares que se desean tratar, tales como por ejemplo por vía anal, vaginal. El microorganismo puede aplicarse en un medio nutritivo, es decir, en un medio que contiene una sustancia o sustancias que mantienen (al menos in vitro) la actividad metabólica del microorganismo. Tales sustancias pueden mantener la viabilidad si no el crecimiento del microorganismo. Tales sustancias pueden incluir una fuente de energía tal como glucosa, aminoácidos y así sucesivamente.
El individuo al que se le administra el microorganismo puede ser un ser humano o un animal.
En un contexto terapéutico, es decir, cuando el efecto biológico de la liberación del polipéptido a un individuo es beneficioso para ese individuo, la administración es preferiblemente en una cantidad “terapéuticamente eficaz”, siendo esta suficiente para mostrar un beneficio al paciente. Tal beneficio puede ser al menos la mejora de un síntoma. La cantidad real administrada y la tasa y desarrollo temporal de la administración dependerán de la intención de la administración, por ejemplo, del efecto biológico buscado en vistas de la naturaleza y de la gravedad del problema y está sujeta a una optimización de rutina. Las prescripciones de tratamiento, por ejemplo, decisiones de dosificación, etc., son responsabilidad de facultativos generales y otros médicos.
Se puede administrar una composición que comprende microorganismos según divulga la presente memoria descriptiva sola o combinada con otros tratamientos, bien de forma simultánea o secuencial.
La presente memoria descriptiva se refiere adicionalmente a un procedimiento para la producción de un microorganismo que libera un péptido trébol in vivo como se ha definido anteriormente que comprende transformar un microorganismo con un vector recombinante que lleva una secuencia codificante de un péptido trébol bajo el control de un promotor adecuado y una secuencia señal de secreción bacteriana.
Tal secuencia señal de secreción bacteriana puede ser cualquier secuencia que se conozca en la técnica que realice dicha función. Preferiblemente, para L. lactis, dicha secuencia señal de secreción es la secuencia señal de secreción usp45 de L. lactis. Tal secuencia promotora puede ser cualquier promotor que permita la expresión de dicha secuencia codificante en dicho microorganismo. Los ejemplos que se dan en la sección de ejemplos incluyen el promotor conocido T7 inducible por fago de E. coli y el promotor constitutivo conocido P1 de L. lactis.
La presente memoria descriptiva también se refiere a un vector recombinante que comprende al menos una parte de una secuencia codificante de un péptido trébol bajo el control de un promotor adecuado y una secuencia señal de secreción adecuada. Dicho vector recombinante puede usarse para liberar in vivo al menos una parte de una secuencia de péptido trébol que puede ejercer un efecto curativo sobre áreas dañadas de las superficies de las mucosas.
La presente memoria descriptiva se refiere
adicionalmente a un vector recombinante como se ha definido
anteriormente que tiene una secuencia de nucleótidos como
se representa por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2 ó 4. Los siguientes ejemplos sirven únicamente para
ilustrar la presente invención, y no se deben considerar
como limitantes de la invención en ningún sentido.
LEYENDAS DE LAS FIGURAS
Figura 1: Vista general de los plásmidos usados
Figura 1a: mapas esquemáticos de los plásmidos pL2mTFF1 v1 y pT1mTFF1. T7 es el principal promotor tardío del colifago T7 (Studier y Moffatt, 1986). P1 es el promotor de lactococos como en Waterfield y col., (1995), usp45S es un fragmento de ADN que codifica el péptido señal de secreción de la proteína de lactococos Usp45 (van Asseldonck y col., 1990), mtff1 es un fragmento de ADN que codifica la parte madura del TFF1 murino, mtffv1 es un fragmento de ADN que codifica un TFF1 murino maduro truncado (sin dos restos aminoácido aminoterminales), Cm es el marcador de selección de cloranfenicol, Em es el marcador de selección de eritromicina. Para pPICmTFF1: PPMF es el factor de acoplamiento α prepro de Saccharomyces cerevisiae; AOX1 es el promotor de la alcohol oxidasa, AOX1 term es el terminador de la alcohol oxidasa, HIS4 es el gen de la histidol deshidrogenada, Ori es un origen de replicación de Escherichia coli, AOXfr es un fragmento 3’ del gen de la alcohol oxidasa, AmpR es el gen de la resistencia a la ampicilina. Todos los componentes son del plásmido pPIC9 (Invitrogen).
Figura 1b: secuencia de ADN del plásmido pL2mTFF1v1 (SEQ ID NO 1)
Figura 1c: secuencia de ADN del plásmido pT1mTFF1 (SEQ ID NO 2)
Figura 1d: secuencia de ADN del plásmido pPICmTFF1 (SEQ ID NO 3) Figura 2: SDS PAGE. Las diferentes fracciones de proteínas se derivan del medio de células de L. lactis MG1820 [pILPOL] control), MG1820 [pILPOL; pL2mTFF1v1], MG1363 [pTREX1] o MG1363 [pT1mTFF1]. Los dos carriles izquierdos contienen proteínas marcadoras en las que el peso molecular se da en kDa. Las proteínas se visualizaron usando tinción con azul de Coomasie.
Figura 3: Representación de los valores histológicos de la parte distal del colon. Gráfico superior izquierdo: daño en el epitelio (parte distal del colon). Gráfico superior derecho: infiltración inflamatoria (parte distal del colon). Gráfico inferior: suma de los valores de los gráficos superiores (parte distal del colon).
Figura 4: Representación de los valores histológicos de la parte distal del colon de ratones sanos (control) o ratones con colitis DSS aguda sin tratamiento (DSS) o después del tratamiento con células MG1363, MG1363 [pTREX1] o MG1363 [pT1mTFF1].
Figura 5: Valoraciones de citocina proinflamatoria en tejido de colon con inflamación aguda. Interlecucina-1β en el colon distal (izquierda) e interferón-γ en el colon medio y distal (derecha) de ratones sanos (control) o ratones con colitis DSS aguda sin tratamiento (DSS), o después del tratamiento con células MG1363, MG1363 [pTREX1] o MG1363 [pT1mTFF1].
Figura 6: SDS PAGE de fracciones proteicas del medio de Pichia pastoris seleccionada (GST115::pPICmTFF1) y control negativo. El clon productor de mTFF1 que se usó adicionalmente para la producción de mTFF1 se indica con una punta de flecha. Las proteínas se visualizaron usando tinción con azul de Coomasie.
Figura 7: A: patrón de filtración en gel de mTFF1 purificada (Superdex 75; Pharmacia). La proteína mTFF1 eluyó en dos picos, estando presente la mayoría en las fracciones 14, 15, 16 (dímero) y 20 (monómero). Se demostró que la identidad de la proteína en estas fracciones era mTFF1 por SDS-PAGE (inserto). Las proteínas se visualizaron usando tinción con azul de Coomasie. B: SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras de mTFF1 purificada. Los carriles de la izquierda son marcadores de tamaño de tamaños indicados, tinción con azul brillante de Coomasie.
Figura 8: Representación de los valores histológicos de la parte distal del colon de ratones tratados por inoculación por inyección intraperitoneal (i.p.), oral (oral) y rectal (rectal), antes (pre), durante (du) o después (po) de la instalación de colitis aguda inducida por DSS. DSSdu representa los valores de ratones tratados con PBS a los que se les indujo colitis DSS aguda.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Clonación y expresión de TTF1 de ratón (mTTF1).
Medios de cultivo
GM17 es M17 (Difco, Detroit) suplementado con un 0,5% p/v de glucosa. El medio M9 contiene por litro: 6g de Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 1 g de NH4Cl, 0,5 g of NaCl, 2 mmol de MgSO4, 0,1 mmol de CaCl2 y 5 g de Casitone (Difco). M9B es M9 suplementado con 2,1 g de NaHCO3 y 2,65 g de Na2CO3 por litro. GM9B es M9B suplementado con glucosa al 0,5% p/v. LM9B es M9B suplementado con lactosa al 0,5% p/v.
Cuando resultaba apropiado, se añadieron los antibióticos eritromicina (Er) o cloranfenicol (Cm) a los medios respectivos a concentraciones finales de 5 μg/ml cada uno. La designación usada par indicar la presencia del anticuerpo es, por ejemplo GM17Er, LM9BC y así sucesivamente. Los medios sólidos contenían agar al 1,2%.Técnicas de ADN recombinante
Se usaron enzimas modificadoras del ADN y endonucleasas de restricción en condiciones normales y en los tampones recomendados por los fabricantes. Las técnicas moleculares generales de clonación y las electroforesis de ADN y proteínas se llevaron a cabo según procedimientos convencionales. L. lactis se transformó por electroporación de células cultivadas en presencia de glicina (Wells y col., 1993a). El ADN plasmídico se purificó de forma rutinaria usando el kit Plasmad de Quiagen.Amplificación por PCR de mTFF1
Se llevó a cabo la reacción de la PCR sobre un plásmido que contenía ADNc de mTFF1 (Lefebvre, 1993), usando los cebadores oligonucleotídicos mTFF1S y mTFF1A. El cebador mTFF1S corresponde a los primeros 18 nucleótidos de la hebra sentido de mTFF1 desde el primer nucleótido después de la secuencia señal. El cebador mTFF1A es complementario a los últimos 26 nucleótidos de la hebra sentido del mTFF1 incluyendo el codón de terminación, e introduce un sitio de restricción Spel adicional.
mTFF1S: 5’-CAGGCCCAGCCCAGGCC -3’ (SEQ ID NO 4)
mTFF1A: 5’-GCACTAGTTAGAAGGGACATTCTTCTTCTTG AG-3’ (SEQ ID NO 5) en el que ACTAGT en mTFF1A representa un sitio Spel.
Se llevó a cabo la amplificación por PCR usando la ADN polimerasa VentTM (New England Biolabs, Beverly, EE.UU.), que da un producto de PCR que lleva extremos romos. La mezcla de PCR consistía en 2 unidades de ADN polimerasa Vent, 10 μl de de tampón Vent (thermopol), 4 μl de dXTP (0,5 mM máximo), 4 μl (0.5μM) d cada cebador, 1μl (50 ng) de ADN molde y 74μl de H2O. Se dispusieron seis reacciones, que diferían en su concentración final de MgSO4, ajustadas a 0, 1, 2, 3, 4 y 5 mM respectivamente. Los ciclos de amplificación de PCR fueron: T0 durante 300" a 94°C, T1 durante 45" a 94°C, T2 durante 30" a 60°C, T3 durante 20" a 72°C, T4 durante 10" a 20°C. Estos ciclos T1 hasta T3 se llevaron a cabo 30 veces.
La amplificación por PCR con estos cebadores dio los genes para mTFF1 maduro sin la secuencia señal e incluyendo un sitio de restricción Spel adicional. Después de comprobar por electroforesis en gel, el fragmento amplificado aparecía como una banda en el intervalo de longitud esperado. El extremo 5’ de la secuencia de mTFF1 contiene dos secuencias diana posibles complementarias al cebador anterior. Como una consecuencia de dos fragmentos de 202 pares de bases y 208 pares de bases respectivamente, se puede amplificar a partir del ADNc de mTFF1 usando los cebadores mencionados. No se espera resolver estos fragmentos por electroforesis en gel de agarosa.Construcción de plásmidos
Se usaron dos tipos de vectores diferentes como aceptores para el fragmento de PCR que codifica el péptido trébol mTFF1. La estructura primaria de los dos vectores originales pT1NX, derivado de pTREX1 (Wells y Schofield, 1996), y pLET2NX, derivado de pLET2N (Steidler y col., 1995) – contienen los siguientes elementos comunes: un promotor (T7 o P1), la secuencia señal de secreción de L. lactis usp45 (van Asseldonk y col., 1990 y la solicitud de patente europea publicada con el Nº 0 455 280), modificados para contener un sitio de restricción Nael solapándose con la secuencia que codifica el último resto aa (Steidler y col., 1995), y un sitio de restricción Spel en dirección 3’. Los plásmidos derivados de pT1NX especifican resistencia a la eritromicina, los plásmidos derivados de pLET2NX especifican resistencia al cloranfenicol. Los fragmentos de PCR se trataron durante 1 hora a 37 ºC usando 50 μl de solución de ADN, 10 μl de tampón Spel, 50 unidades de Spel, 10 unidades de polinucleótido cinasa T4 (Gibco BRL, Bethesda, EE.UU.), ATP 0,5 mM ajustado a pH 7,5 y 36 μl de H2O. El vector pT1NX se digirió durante 1 hora a 37 ºC usando 10 ADN purificado a 20 μl, 10 μl de tampón Nael, 10 unidades de Nael, 50 unidades de Spel, 1 unidad de fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim, Alemania) y 73 a 63 μl de H2O. Después de 30 minutos de incubación, se añadieron de nuevo a la mezcla 50 unidades de Spel y 10 unidades de Nael. Las enzimas de restricción se inactivaron y se extrajeron de la mezcla mediante extracción con fenol/cloroformo. Después de la digestión de restricción, la banda derivada de mTFF1 (que comprendía un fragmento de 195 pb y uno de 201 pb como se ha descrito anteriormente bajo “amplificación por PCR de TFF1 de ratón (mTFF1)” y las partes de vector fueron escindidas del gel de agarosa. Después del ligamiento de los respectivos fragmentos de PCR y del vector durante 45 minutos a 16 ºC usando una ligasa de ADN “lista para usar” (Pharmacia Biotech, R.U.), se obtuvieron plásmidos recombinantes que contenían el cistrón mTFF1 como una fusión en marco a la secuencia señal de secreción usp45 bajo el control del promotor.
El plásmido pT1 mTFF1 (Figura 1a), que contiene el promotor constitutivo de L. lactis P1 surgió como resultado del ligamiento de la parte del vector purificado Nael -Spel de pT1NX y el fragmento de PCR cortado y fosforilado en 5’ de Spel.
El plásmido pL2mTFF1v1 (Figura 1a), que contiene el promotor de E. coli inducible por fago T7 surgió como resultado del ligamiento de la parte del vector purificado
Nael - Spel de pLET2N y el fragmento de PCR cortado y fosforilado en 5’ de Spel. El promotor T7 sólo puede ser activado por la ARN polimerasa análoga de T7 codificada por ejemplo por el plásmido pILPOL. Este plásmido está presente en la cepa de L. lactis MG1820 [pILPOL] (Wells y col.,
1993c).
Para el análisis estructural, el plásmido pT1mTFF1 se transformó en la cepa de L. lactis MG1363. Las células se cultivaron en placas GM17Er. Las colonias se cultivaron en 2,5 ml de GM17Er y se aisló el plásmido. Por medio de una digestión analítica, se compararon el patrón de restricción del vector pT1NX (2μl de ADN (pT1NX), 20 unidades de EcoRI, 50 unidades de Spel, 2μl de tampón Spel y 15μl de H2O) y el plásmido recombinante aislado (5μl de ADN, 20 unidades de EcoRI, 50 unidades de Spel, 2μl de tampón Spel, 0,25 μl de una solución madre de 10 μg/ml de ARNasa A, 12μl de H2O). Los plásmidos se cortaron con EcoRI y Spel durante 1 hora a 37° C. En los plásmidos de referencia, se prevén dos fragmentos lineales de 907pb y 4999 pb. En pT1mTFF1, se prevén dos bandas de 499 pb y 4999 pb. Los tamaños de los fragmentos obtenidos experimentalmente, como se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio resultaron coherentes con las longitudes previstas. A partir de cada plásmido recombinante se extendió un cultivo en placas de GM17Er para obtener colonias aisladas. Una colonia se inoculó a continuación en 100 ml de medio MM17Er y se dejó crecer hasta la saturación. Se recogieron las células y se purificaron los plásmidos. Su estructura física se verificó mediante análisis con enzimas de restricción y electroforesis en gel de agarosa. Además, los análisis de las secuencias revelaron que el cistrón mTFF1 se había ligado perfectamente en marco con la secuencia líder de secreción usp45. El pT1mTFF1 contiene un inserto de 208 pb que representa la secuencia codificante completa del mTFF1 maduro (como se ha descrito anteriormente bajo “amplificación por PCR del TFF1 de ratón (mTFF1)”).
Para el análisis estructural, el plásmido pL2mTFF1v1 se transformó en la cepa MG1820[pILPOL]. Las células se cultivaron en placas GM17Cm. Las colonias se cultivaron en 2,5 ml de GM17Cm y se aislaron los plásmidos. Por medio de una digestión analítica, se compararon el patrón de restricción del vector pLET2NX (2μl de ADN (pLET2NX), 20 unidades de EcoRI, 50 unidades de Spel, 2μl de tampón Spel y 15μl de H2O) y el plásmido recombinante aislado (5μl de ADN, 20 unidades de EcoRI, 50 unidades de Spel, 2μl de tampón Spel, 0,25 μl de una solución madre de 10 μg/ml de ARNasa A, 12μl de H2O). El plásmido recombinante se cortó con EcoRI y Spel durante 1 hora a 37° C. En los plásmidos de referencia, se prevén dos fragmentos lineales de 907pb y 4650 pb. En pL2mTFF1, se prevén dos bandas de 499 pb y 4650 pb. Los tamaños de los fragmentos obtenidos experimentalmente, como se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio resultaron coherentes con las longitudes previstas. A partir de cada plásmido recombinante se extendió un cultivo en placas de GM17Cm para obtener colonias aisladas. Una colonia se inoculó a continuación en 100 ml de medio GM17Cm y se dejó crecer hasta la saturación. Se recogieron las células y se purificaron los plásmidos. Su estructura física se verificó mediante análisis con enzimas de restricción y electroforesis en gel de agarosa. Además, los análisis de las secuencias revelaron que el cistrón mTFF1 se había ligado perfectamente en marco con la secuencia líder de secreción usp45. El pL2mTFF1v1 contiene un inserto de 202 pb (que carece coherentemente de los dos primeros restos aa aminoterminales del mTFF1 maduro, como se ha descrito anteriormente bajo “amplificación por PCR del TFF1 de ratón (mTFF1)”). Estas secuencias de los plásmidos recombinantes se dan en las figuras 1b y 1c. Sus secuencias completas se recopilaron a partir de las secuencias publicadas de las partes constitutivas. Además, las secciones relevantes de las secuencias, tales como los fragmentos de PCR y los puntos de unión de ligamiento se verificaron experimentalmente.
Expresión de proteínas en L. lactis transformados
Se transformaron cepas de L. lactis con los plásmidos construidos anteriormente. Para la transformación del plásmido pT1mTFF1, se usó la cepa de L. lactis MG 1363 (Gasson, 1983). Para la transformación del plásmido pL2mTFF1v1, se usó la cepa de L. lactis MG 1820 (pILPOL) (Meda y Gasson, 1986).
La expresión de las proteínas por parte de estas cepas de L. lactis transformadas se detectó mediante SDS-PAGE.
Para preparar las fracciones del sobrenadante del cultivo, las células se cultivaron durante 20 horas a 28 ºC en cinco ml de medio GM17Er para el plásmido pT1mTFF1 o medio GM17Cm para el plásmido pL2mTFF1v1. Los cultivos se diluyeron en cinco ml de medio GM17Er o GM17Cm y se cultivaron durante 3 horas a 28 ºC. Las células se recogieron por centrifugación a 2800 rpm durante 20 minutos y se resuspendieron en 5 ml del medio apropiado, es decir, GM9Er para células MG1363 o LM9BCm para células MG 1820 [pILPOL]. Después de cinco horas adicionales de cultivo, las células se aglomeraron. Las proteínas presentes en las fracciones de medio se recuperaron mediante extracción con fenol y precipitación con etanol.
Las proteínas expresadas en la fracción sobrenadante del cultivo de una cepa MG 1820 de L. lactis de control comparadas con las cepas MG 1820 de L. lactis transformadas con [pILPOL; pL2mTFF1v1] y la cepa MG 1363 transformada con [pTREX1; pT1mTFF1] se muestran en la figura 2. Esta figura muestra una banda de proteína adicional del tamaño apropiado (indicada por la cabeza de flecha) en MG 1820 [pL2mTFF1v1] y MG 1363 [pT1mTFF1] cuando se compara con los controles. Como se puede observar a partir de esta figura, la expresión del gen recombinante es bastante baja. Esto hace que el resultado observado in vivo sea sorprendente ya que otros usan péptidos trébol purificados en terapias para la reparación de lesiones gástricas e intestinales a niveles enormemente más elevados, por ejemplo Tran y col (1999) usaban una aplicación intrarrectal diaria de TFF2 recombinante humano a niveles de 2,5 mg/kg de peso corporal durante cinco días para obtener una reducción en el índice de inflamación de colitis instalada de forma experimental en ratas (administración intracolónica de ácido dinitrobencenosulfónico en alcohol).
Ejemplo 2: Comprobación in vivo de MG1363 [pT1mTFF1]
Preparación de células para la administración intragástrica
Se extendieron sobre placas GM17Er transformantes de las cepas de L. lactis MG1363 [pTREX1], MG1363 [pT1mTFF1] y se cultivaron durante toda la noche a 28 ºC. En cada caso se cultivó a continuación una única colonia a 28 ºC durante toda la noche en 15 ml de medio GM17Er. A este cultivo se le añadieron 15 ml de glicerol al 100% para conservar dichas células a -20 ºC. Cada día se pudo inocular la cantidad necesaria de células para el trata miento de los ratones. Para ello, el cultivo se diluía a 1/200 en 10 ml de medio GM17Er. Después de cómo mínimo 20 horas de crecimiento a 30 ºC, las células se recogieron mediante centrifugación durante 15 minutos a 2800 rpm. Las células se resuspendieron entonces en 1 ml de M9B sin antibiótico. Pruebas in vivo en ratones con colitis aguda
Se probó el efecto de los péptidos trébol expresados por estas bacterias L. lactis en ratones que sufrían colitis aguda. Veintiún ratones Balb/c hembra recibieron DSS (sulfato sódico de dextrano) al 5% disuelto en su agua de bebida durante 7 días. De esta forma se indujo la colitis aguda (Kojouharoff y col., 1997). Para los propósitos terapéuticos, a estos ratones se les inoculó diariamente por vía oral por medio de un catéter gástrico usando una 100 μl de suspensión bacteriana (mínimo 1.108 células) desde el día 1 hasta el día 7 del tratamiento con DSS. Como se ha indicado, a seis ratones se les inocularon células MG1363 [pTRX1], a seis ratones se les inocularon células MG1363 [pT1mTFF1] y a tres ratones no se les inoculó nada (control DSS). El día 8 después de la inducción de la colitis, los ratones fueron sacrificados y examinados inmunológica e histológicamente.
Las pruebas inmunológicas de los sueros mostraron que los ratones tratados no mostraban respuesta inmune frente a las proteínas expresadas. Se tomó suero de los ratones a los que se extrajo sangre en día 8. Este suero se analizó por medio de inmunotransferencia para comprobar si contenía anticuerpos frente a las proteínas presentes en las fracciones del medio de las células de L. lactis. Las fracciones del medio usadas se derivaron de las cepas de L. lactis MG1363 [pTREX1] y MG1363 [pT1mTFF1]. Se analizó el equivalente a 1 ml de fracciones del medio concentradas (extracción con fenol y precipitación con etanol) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS al 20%. Después de pasarlas a filtros de nitrocelulosa, los filtros se incubaron durante 1 hora con las soluciones de suero de los 4 grupos de ratones. El suero se diluyó 500 veces en 20 ml de tampón de bloqueo de nitrocelulosa (Blotto: 100 ml 10xPBS, 150 m de NaCl 1 M, 2 ml de Triton X-100, 25 g de leche en polvo desnatada, agua hasta un volumen total de 1 litro). Como anticuerpo secundario, se usó IgG de oveja dirigida contra ratón acoplada a peroxidasa de rábano (HRP). Usando el suero diluido 500 veces no se detectó señal.
Se realizaron análisis histológicos a los colones de los ratones tratados. Los colones se cortaron en dirección longitudinal y se dividieron en tres porciones iguales: las partes distal (la más cercana al ano), media y proximal. Estas partes del colon se analizaron histológicamente después de una fijación durante toda la noche en formaldehído al 3,7% (en PBS), seguida de inclusión en parafina, asegurando la posición vertical de las muestras de tejido en los bloques de parafina. De cada muestra de tejido se hicieron secciones longitudinales de 3 μm de grosor espaciadas uniformemente a lo largo de la muestra. Estas secciones transversales se tiñeron con hematoxilina/eosina. Se realzó el análisis histológico de forma enmascarada, lo que significa que las marcas de las preparaciones fueron cubiertas antes de valorar los cortes. Las preparaciones que llevaban secciones obtenidas de los varios grupos de ratones se aleatorizaron antes del examen microscópico. Entonces se asignó un valor histológico a cada preparación (oscilando de 0 a 5) según la descripción
sintomática definida en la tabla 1.
Para cada ratón y para cada parte del colon se calculó el valor medio de las tres secciones. En las partes distales y medias del colon, la inflamación que consistía en daño epitelial e infiltración era la más pronunciada. En la parte proximal, no se pudo observar apenas inflamación. Se calculó el valor histológico medio tanto para la parte distal como para la parte media del colon por grupo de animales. La suma final de los valores histológicos es la suma de los dos valores separados (valor suma= valor de daño epitelial + valor de infiltración) y es la medida del grado de la inflamación. La suma de los valores histológicos de la parte distal del colon para cada uno de los grupos de ratones se muestra en la figura 3.
A partir de los valores histológicos para la parte distal del colon como se expone en la figura 3 se podría concluir que existe una clara disminución de la inflamación tras la inoculación de células de L. lactis que producen péptidos trébol en ratones. Los ratones que recibieron células de L. lactis transformadas con [pT1mTFF1] muestran una reducción significativa de la inflamación de más del 65%.
Como se puede ver en la figura 3, la infiltración inflamatoria u el daño epitelial en la parte distal del colon han disminuido significativamente después de la inoculación con cepas recombinantes de L. lactis que segregan polipéptidos TFF1.
Estos resultados fueron confirmados en un experimento independiente que se llevó a cabo de la misma forma, incluyendo grupos mayores (tamaño del grupo= 10) y más grupos control. La figura 4 muestra los valores histológicos (obtenidos como se ha descrito anteriormente) de ratones sanos de control (control) y de ratones que habían recibido DSS como se ha descrito, bien sin tratar (DSS), o tratados (como se ha descrito anteriormente) con MG1363, MG1363 [pT1TREX1] o MG1363 [pT1mTFF1] como se ha indicado. El experimento muestra una clara y significativa disminución de la inflamación intestinal en el grupo de los ratones tratados con MG1363 [pT1mTFF1].
El último experimento también se evaluó determinando los niveles de interleucina-1β (IL-1β) e interferón-γ (IFNγ), ambos citocinas proinflamatorias bien conocidas para los expertos. A los ratones (n=10) se les inocularon las cepas indicadas como se ha descrito. Control= ratones sanos, DSS= ratones que recibieron DSS al 5% en el agua de bebida sin tratamiento alguno. El colon se extrajo y se preparó y se aislaron áreas de la misma superficie por medio de un troquel (Ø= 4mm). Las muestras de tejido de cada grupo se recubrieron con 500 μl de RPMI + suero fetal bovino al 10% y se incubaron durante toda la noche a 37 ºC. Se recogió el sobrenadante y se valoró el contenido en citocina mediante ELISA. La cantidad de IL-1β e IFN-γ en los respectivos tejidos se muestra en la figura 5. Los resultados muestran una clara reducción en estas citocinas proinflamatorias en los grupos de ratones tratados con MG1363 [pT1mTFF1].Ejemplo 3: Comparación del tratamiento con MG1363 [pT1mTFF1]y TFF1 purificado Construcción de plásmidos
Para la expresión de mTFF1 a partir de Pichia pastoris se construyó el plásmido pPICmTFF1, el gen del mTFF1 se amplificó mediante PCR como se ha descrito (amplificación por PCR del TFF1 de ratón). Este fragmento se ligó en el sitio de restricción abierto Nael de un derivado de pPIC9 (Invitrogen). La mezcla de ligamiento se transforma a MC1061 de E. coli y los clones correctamente ensamblados se identificaron mediante análisis de restricción y secuenciación del ADN (secuencia como en la figura 1d). En el plásmido resultante pPICmTFF1, la secuencia de mTFF1 se fusiona en fase con la secuencia de secreción prepro del factor de acoplamiento α de Saccharomyces cerevisiae. Expresión y purificación de mTFF1
El plásmido pPICmTFF1 se transfirió a Pichia pastoris GST115 por un procedimiento como se describe en Logghe (1995) y se seleccionaron los clones positivos que tenían la unidad mTTF1 integrada en el locus his4 mediante identificación por PCR. Estos clones positivos se indujeron con metanol y se detectó selectivamente la expresión mediante análisis de proteínas del sobrenadante de cultivo y un clon que mostraba, en comparación con el control negativo (negativo) una expresión particularmente alta de una banda adicional a los 6,5 kDa (GST115::pPICmtFF1) se retuvo para trabajos posteriores (figura 6, indicado por la punta de la flecha). La banda de proteína adicional se identificó como mTFF1 mediante secuenciación de proteínas. Este procedimiento de expresión se optimizó a gran escala y se optimizó hasta un cultivo de 16 l y se purificó mTFF1 a partir del sobrenadante del cultivo.
Para ello, se concentró GST115::pPICmTFF1 de sobrenadantes inducidos por metanol mediante filtración tangencial (Millipore proflux M12, punto de corte 3000 Da) y se dializó a pH 7,4 en un tampón fosfato 0,02 M. Se purificó mTFF1 a partir de este concentrado en una columna de intercambio iónico (Q-column de Biorad). Las proteínas fueron eluidas de la columna por un gradiente salino isocrático. El mTFF1 resultante era puro en más del 99% y se concentró de forma adicional. La preparación final contiene menos de 160 ng/l de LPS/ml. Esta cantidad de LPS está dentro de los límites aceptables y la proteína pS2 puede usarse en experimentos futuros.
Tras el análisis en una columna de exclusión por tamaño de mTFF1 purificado (Superdex 75, Pharmacia) se concluyó que el 7,5% del mTFF1 está en forma monomérica, y el 92,5% está en forma dimérica (figura 7A). Esto se conformó mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras frente a no reductoras del mTFF1 purificado (figura 7B). Evaluación de la actividad biológica del mTFF1 purificado
Una característica bien conocida de la proteína mTFF1 es que después de la administración de la proteína a monocapas de células Caco-2 disminuye de forma significativa la expresión superficial de cadherina E (Liu y col., 1997). Se mostró una disminución del 10% de la expresión superficial de cadherina E después de administrar el mTFF1 preparado como se ha descrito anteriormente a monocapas de Caco-2.
Tratamiento de la colitis murina aguda con mTFF1 purificado:
Para la inducción de la colitis aguda, los ratones recibieron sulfato sódico de dextrano al 6% (DSS, PM 40000) disuelto en el agua de bebida durante 7 días (Kojouharoff y col., 1997). Los ratones que se usaron para los experimentos tenían la misma edad y habían recibido el tratamiento con DSS de forma simultánea. Para propósitos terapéuticos, los ratones fueron tratados diariamente con 50 μl de mTFF1 en 200 μl de PBS antes de la administración de DSS desde el día -7 al día 0 (grupos de tratamiento previo), durante la administración de DSS desde el día 0 al día 7 (grupos durante el tratamiento) y después de la administración de DSS desde el día 7 al 14 (grupos de tratamiento posterior). Para estudiar las diferentes vías para liberar mTFF1, se trataron los ratones mediante inyección intraperitoneal (i.p.), inoculación intragástrica y administración rectal en cada caso. Los ratones se sacrificaron el día 8 después de recibir agua de bebida sin DSS durante un día (los grupos de tratamiento previo y durante el tratamiento) y el día 14 después de recibir agua de bebida sin DSS durante siete días (los grupos de tratamiento posterior). Los grupos control no tratados con DSS en el agua de bebida se sacrificaron el día 8 y 14. Todos los grupos estaban constituidos por 9 ratones. Los resultados se representan en la figura 8 y muestran claramente que en el régimen sin tratamiento no se puede observar ninguna mejora estadísticamente significativa. Esto hace que la invención descrita sea sorprendente ya que se observa una clara mejora (figuras 3 y 4). Esto significa que la liberación de TFF1 a través de L. lactis supone una contribución esencial al efecto terapéutico observado.
Tabla 1. Descripción sintomática de los valores histológicos
Valor
Daño epitelial Infiltración inflamatoria*
0
Morfología normal No hay infiltración
1
Pérdida de algunas células caliciformes Infiltración alrededor de las bases de las criptas
2
Pérdida generalizada de células caliciformes Infiltración que alcanza la mucosa de la lámina muscular
3
Pérdida de las criptas Infiltración extensiva que alcanza la mucosa de la lámina muscular y engrosamiento de la mucosa con edema prominente
4
Pérdida generalizada de las criptas Infiltración que alcanza la lámina submucosa
*La infiltración inflamatoria incluye la infiltración de los granulocitos, macrófagos y linfocitos
REFERENCIAS
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LISTA DE SECUENCIAS
<110> vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw
<120> Liberación de péptidos trébol
<130> VIB-013-EP-DIV
<140>
<141>
<150> 99870143.7
<151> 05-07-1999
<160> 5
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 5142
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: construcción sintética : plásmido
<400> 1
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<210> 2
<211> 5505
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: construcción sintética: plásmido
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<210> 3
<211> 8241
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: construcción sintética: plásmido
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<210> 4
<211> 17
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: construcción sintética: cebador
<400> 4 10 caggcccagc ccaggcc 17
<210> 5
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 15 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: construcción sintética: cebador
<400> 5
gcactagtta gaagggacat tcttcttctt g 31 20
REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN
Esta lista de referencias citadas por el solicitante no tiene otro propósito que servir de ayuda al lector y no forma parte del documento de Patente Europea. A pesar de la gran atención dedicada a su confección, no puede descartarse la presencia de errores u omisiones, en cuyo caso la OEP declina toda responsabilidad.
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J. Pathol., 1990, vol. 162, 279-284 [0075]

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Uso de una bacteria recombinante no patógena y no invasiva transformada con ADN que codifica un péptido trébol y que es capaz de liberar un péptido trébol en el tracto gastrointestinal de un ser humano o un animal para la preparación de un medicamento para tratar lesiones o para inhibir la formación de lesiones en el canal alimentario producidas por terapia con radiaciones o quimioterapia para el tratamiento del cáncer, un fármaco que lesiona el canal alimentario incluyendo alcohol, la exposición accidental a la radiación o a una sustancia caústica, infección, trastorno digestivo, incluyendo pero sin limitarse a dispepsia no ulcerosas, gastritis, úlcera péptica o duodenal, cáncer gástrico, linfoma MALT, síndrome de Menetier o enfermedad por reflujo gastroesofágico.
  2. 2.
    Uso según la reivindicación 1 en donde las lesiones en el canal alimentario están originadas por terapia con radiaciones o quimioterapia para el tratamiento del cáncer.
  3. 3.
    Uso según en una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en donde el canal alimentario incluye la boca, esófago, estómago, intestino grueso y delgado.
  4. 4.
    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde las lesiones se encuentran en las superficies mucosas.
  5. 5.
    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde dicha bacteria no patógena y no invasiva es una cepa bacteriana de calidad alimentaria, preferiblemente una cepa bacteriana Gram positiva.
  6. 6.
    Uso según la reivindicación 5, en la que dicha cepa bacteriana es una especie de Lactococcus o de Lactobacillus.
  7. 7.
    Uso según la reivindicación 6, en la que dicha cepa bacteriana es Lactococcus lactis.
  8. 8.
    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde dicho péptido trébol es TFF1.
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