PT1194554E - Libertação de péptidos trifólios - Google Patents
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Description
1 DESCRIÇÃO "LIBERTAÇÃO DE PÉPTIDOS TRIFÓLIOS" A presente invenção refere-se ao campo de sistemas de libertação de proteína in vivo. Mais em particular, a presente invenção refere-se à secreção in vivo de péptidos trifólios por microorganismos, de um modo preferido estirpes bacterianas, um modo preferido estirpes não patogénicas, um modo preferido estirpes não invasivas, um modo preferido estirpes de grau alimentar, os métodos para a libertação de péptidos trifólios que utilizam os referidos sistemas e a utilização dos referidos sistemas de expressão de péptido trifólio para o tratamento de desordens inflamatórias do tracto gastrintestinal. 0 Lactococcus lactís é uma bactéria de ácido láctico não patogénica gram positiva a qual pode sobreviver no intestino (Klijn et al., 1995) . Não é certo se o L. lactís também pode ser metabolicamente activo em todos estes ambientes. A expressão do fragmento C da toxina do tétano por Lactococcus lactis com vista à vacinação foi descrita por Wells et ai. (1993b) e Robinson et al. (1997). Além disso, foi demonstrado que quando as preparações de bactérias de L. lactis projectadas para expressarem quer a Interleucina-2 ou a Interleuci3-13-® em conjunto com o fragmento C da toxina do tétano (TTFC) foram administradas intranasalmente a murganhos, mais do que ^ vezes maas anti-TTFC foi produzido do que depois da administraÇ^0 semelhante de estirpes que expressam o TTFC sozinho (pedido Patente internacional 2 publicada como WO 97/14806). Estes resultados comprovam a utilização de um vector de vacina bacteriana experimental não invasiva, que segrega citoquina, para aumentar respostas imunes a um antigénio co-expresso. Também foi descrita uma abordagem para ligar fragmentos de proteína heterólogos na parede da célula e por este modo visualisã-los na superfície de L. lactis, possivelmente levando a propriedades de vacinação mais aumentadas (WO 97 09437 Steidler, Remaut, Wells).
Os péptidos trifólios são segregados por células de muco epiteliais e são estáveis em um ambiente ácido. Estes péptidos contribuem para a protecção da mucosa (a formação de um gel por cima do epitélio) e estão provavelmente implicados na reparação da mucosa danificada pela estimulação da migração epitelial (Playford et al., 1996). A produção de péptidos trifólios aumenta localmente em regiões onde o dano ocorre tal como em úlceras gástricas e na colite (Wright et al., 1990). Babyatsky et al. (1996) mostraram que a administração de péptidos trifólios recombinantes reduz o dano a esses Em contradição com a maior parte de outras proteínas que são importantes para a protecção da mucosa (tal como o f actor de crescimento epidérmico), a maior parte dos estudos demonstraram que os péptidos trifólios causam muito pouca ou nenhuma proliferação (Playford et al., 1996). Três membros desta família de péptidos trifólios foram identificados em seres humanos e originalmente designados: pS2 (gene indutor dos estrogénios do cancro da mama, O. Lefebvre, 1993), SP (péptido espasmolitico) e ITF (factor trifólio intestinal) . Na presente nomenclatura o pS2 é renomeado como TFF1, SP como TFF2 e ITF como TFr3 (ver por exemplo Wong et al., 1999). Esta nova nomenclatura será utilizada em todas as partes do presente texto. 3
Em seres humanos, murganhos e ratos o TFF1 e o TFF2 são predominantemente encontrados no estômago enquanto o TPF3 é predominantemente encontrado no duodeno e no cólon. Wong et al. (1999) dão uma visão geral recente de péptidos trifólios.
Pensa-se que o TFF1 actua através de um receptor de superfície de célula (Tan et al., 1997). A utilização de proteínas ou péptidos trifólios par o tratamento de desordens e dano do canal alimentar, incluindo a boca, o esófago, estômago, e o intestino grosso e delgado, bem como para a protecçâo e o tratamento de tecidos que estão fora do canal alimentar é descrita nos documentos WO 97/38712 e WO 92/14837. Estas proteínas podem ser utilizadas quer para tratar lesões nestas áreas ou para inibir a formação de lesões. Estas lesões podem ser causadas por: terapia de radiação ou quimioterapia para o tratamento do cancro, qualquer outro fármaco incluindo o álcool o qual danifica o canal alimentar, exposição acidental à radiação ou a uma substância cáustica, infecção, uma desordem digestiva incluindo mas não limitada à dispepsia não ulcerosa, gastrite, úlcera péptica ou duodenal, cancro gástrico, linfoma de MALT, síndroma de Menetier, doença de refluxo gastro esofagiana, doença de Crohn, colite ulcerativa e colite aguda de origem química, bacteriana ou obscura.
Os péptidos trifólios são especialmente úteis para tratar a colite aguda. O ITF também tem sido utilizado em combinação com o EGF (factor de crescimento epidérmico) para tratar úlceras do tracto gastrintestinal. A experiências in vitro e in vivo mostraram que as actividades que curam a ferida de EGF são marcadamente aumentadas 4 pelo tratamento de EGF em combinação com o ITF, sem aumentar a acção proliferativa de EGF (Chinery e Playford, 1995). A doença inflamatória do intestino é o nome do grupo para uma variedade de inflamações gastrintestinais. Pertencendo a este grupo são a enterite, a colite, as inflamações respectivamente da mucosa do duodeno ou do cólon. A doença de Crohn (enteritís regionalis) e a colite ulcerativa (colitis ulcerosa) estão intimamente relacionadas, as doenças que recorrem crónica e espontaneamente do tracto gastrintestinal. Estas doenças são imunologicamente mediadas e têm causas ambientais e genéticas. Sartor (1995) descreve os aspectos diferentes da doença inflamatória do intestino. A doença de Crohn foi em particular estudada através de por exemplo Herfath e Sartor, (1994), Cominelli et al. (1994), e MacDermott (1989). 0 obj ectivo da presente invenção é o de fornecer um método para libertar péptidos trifólios para tratar desordens gastrintestinais.
Um outro objectivo da presente invenção é o de fornecer uma composição farmacêutica para tratar desordens gastrintestinais. A presente invenção refere-se mais em particular a um microrganismo que liberta um péptido trifólio in vivo. 0 referido microrganismo é uma estirpe bacteriana, não patogénica não invasiva, de um modo preferido uma estirpe de grau alimentar, de um modo mais preferido uma estirpe bacteriana gram positiva, de um modo o mais preferido uma estirpe bacteriana que fermenta o ácido láctico, de um modo preferido uma espécie de Lactococcus ou de Lactobacillus que expressa um péptido trifólio in vivo. A presente invenção é assim aplicável a qualquer uma das espécies de Lactococcus ou de Lactobacillus ou às subespécies seleccionadas a partir da lista que 5 compreende Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. hordniae, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. Lactis, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis, Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus aviarius, Lactobacillus aviaríus subsp. araffinosus, Lactobacillus aviarius subsp. aviarius, Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus blfermentans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus carnis, Lactobacillus casei, Lactobacillus casei subsp. alactosus, Lactobacillus casei subsp. casei, Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, Lactobacillus casei subsp. tolerans, Lactobacillus catenaformis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus confusus, Lactobacillus coryniformís, Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis, Lactobacillus coryniformis subsp. torquens, Lactobacillus críspatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus curvatus subsp. curvatus, Lactobacillus curvatus subsp. melibiosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus divergens, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus f ructivorans, Lactobacillus fructosus, Lactobacillus gallínarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus graminis, Lactobacillus halotolerans, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus heterohiochii,
Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus iners, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus j ensenii, 6
Lactobacillus johnsoníi, Lactobacillus kandleri, Lactobacíllus kefíri, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus lactis, Lactobacíllus leichmannii, Lactobacillus lindnerí, Lactobacillus malefermentaris, Lactobacíllus mali, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus mínor, Lactobacillus mínutus, Lactobacillus mucosae, Lactobacíllus murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus orís, Lactobacíllus panís, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paracaseí subsp. paracasei, Lactobacillus paracaseí subsp. tolerans, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus piscícola, Lactobacillus planta rum, Lactobacillus pontis, Lactobacíllus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rímae, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus rumínis, Lactobacillus sakei, Lactobacíllus sakeí subsp. carnosus, Lactobacíllus sakei subsp. sakei, Lactobacillus salivaríus, Lactobacillus salivarius subsp. saliciníus, Lactobacillus salivarius subsp. salivaríus, Lactobacíllus sanfranciscensis, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus trichodes, Lactobacillus uli, Lactobacillus vaccínostercus, Lactobacillus vagínalis, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus vitulinus, Lactobacillus xylosus, Lactobacillus yamanashiensis, Lactobacillus yamanashiensis subsp. mali, Lactobacillus yamanashiensis subsp. Yamanashiensis e Lactobacillus zeae. Não foi óbvio através da capacidade de Lactococcus lactis para libertar um antigénio heterólogo ou a sua capacidade de produzir moléculas tais como IL-2 e IL-6 in vitro e in vivo que as bactérias seriam um veiculo apropriado para a libertação de outros tipos de 7 péptidos ou polipéptídos in vivo. Além disso é desconhecido se os referidos péptidos trifólios expressos pelas referidas estirpes bacterianas fornecerão um efeito benéfico a doenças inflamatórias do tracto gastrintestinal, tal como a doença inflamatória do intestino ou a colite aguda. É, por isso, surpreendente que possa ser demonstrado na secção dos Exemplos presentes que as estirpes bacterianas são capazes de expressar péptidos trifólios in vivo quando presentes no canal gastrintestinal e exercem um efeito de cura em situações de colite agudas. Por meio do exemplo, os fragmentos de PCR que contêm o TFFl de rato na região de codificação foram clonados. Os vectores recombinantes que compreendem estes clones de PCR sob o controlo de um promotor e da sequência de sinal da secreção de usp45 Lactococcus lactis foram construídos. As estirpes de Lactococcus lactis transformadas foram construídas as quais expressam os péptidos trifólios de TFFl do rato. Foi além disso mostrado num sistema de modelo de ratos in vivo que o recombinante mTFFl produzido por estas bactérias pode exercer surpreendentemente efeitos de cura na parte distai do cólonontos inflamado.
De acordo com uma forma de realização preferida, a presente invenção refere-se em particular a uma estirpe bacteriana que liberta péptido trifólio in vivo.
De acordo com uma outra forma de realização preferida, a presente invenção refere-se a uma bactéria que liberta TFFl in vivo.
Deve ser entendido que a presente invenção também se refere a partes ou variantes de qualquer péptido trifólio. As referidas partes referem-se a partes biologicamente activas as quais podem 8 ser geradas através de métodos dos especialistas na técnica. Estas partes vão geralmente conter pelo menos 10 amino ácidos contíguos, tipicamente pelo menos 20 amino ácidos contíguos, mais tipicamente pelo menos 30 amino ácidos contíguos, normalmente pelo menos 40 amino ácidos contíguos, e de um modo preferido pelo menos 50 amino ácidos contíguos. As referidas variantes referem-se a variantes as quais têm a mesma actividade biológica que os péptidos trífólíos acima mencionados.
Também deve ser claro que as estirpes bacterianas de acordo com a presente invenção como definido em cima, também podem expressar proteínas recombinantes adicionais as quais são benéficas para o tratamento de qualquer desordem enfrentada.
De acordo ainda com outra forma de realização, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um microrganismo que expressa um péptido trifólio como definido em cima.
Vantajosamente, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é de um modo preferido conveniente para a aplicação a superfícies de mucosas.
As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para a utilização de acordo com a presente invenção, podem compreender, além do microrganismo, um excipiente farmaceuticamente aceitável, portador, tampão, estabilizador ou outros materiais bem conhecidos dos especialistas na técnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir na eficácia do ingrediente activo. A natureza exacta do portador ou de outro material pode depender da via da administração. Aqueles com especializações 9 relevantes na técnica são bem capazes de preparar soluções convenientes.
De acordo com uma outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um método para a libertação do péptido trifólio ao tracto gastrintestinal que compreende a administração de um microrganismo como definido em cima.
De acordo com um outro aspecto, a presente invenção também se refere à utilização de um microrganismo como definido em cima para a fabricação de um agente para a libertação do péptido trifólio ao tracto gastrintestinal.
De acordo com uma outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento de doenças gástricas e/ou intestinais e/ou desordens que compreendem a administração de um microrganismo como definido em cima. A presente invenção também se refere a um método para o tratamento de doenças gástricas e/ou intestinais e/ou desordens que compreendera a administração de um microrganismo que liberta um péptido trifólio de TFF1 in vivo.
As proteínas trifólios expressas pelas estirpes bacterianas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas quer para tratar lesões nessas áreas ou para inibir a formação de lesões causadas por doenças e desordens gastrintestinais. A expressão "doenças e/ou desordens gástricas e/ou intestinais" refere-se a todos os tipos de doenças e/ou desordens gástricas, intestinais e gastrintestinais. Em formas de realização preferidas 10 da invenção esta expressão refere-se a doenças e desordens inflamatórias gastrintestinais agudas. Estas doenças são de um modo preferido desordens gastrintestinais agudas de origem química, bacteriana ou obscura. Pertencendo a este grupo são a enterite, a colite, incluindo mas não limitada às crises agudas da doença de Crohn e inflamações de colite ulcerativa, respectivamente, da mucosa do duodeno ou do cólon. Também incluídas aqui está a doença do viajante. Em outras formas de realização preferidas da invenção a expressão "doenças e/ou desordens gástricas e/ou intestinais" refere-se a doenças crónicas e que ocorrem espontaneamente do tracto gastrintestinal tal como a doença de Crohn (enteritis regionalís) e a colite ulcerativa (colitis ulcerosa). A expressão "doenças e/ou desordens gástricas e/ou intestinais" também se refere a doenças que implicam lesões em superfícies de mucosas. Como tal, os estados de doença a serem tratados pelos métodos e pelas composições farmacêuticas da invenção também podem incluir desordens e danos do canal alimentar, incluindo a boca, o esófago, estômago, e o intestino grosso e delgado, bem como para a protecção e o tratamento de tecidos que estão fora do canal alimentar. Estas lesões podem ser causadas por: terapia de radiação ou quimioterapia para o tratamento do cancro, qualquer outro fármaco incluindo o álcool o qual danifica o canal alimentar, exposição acidental à radiação ou a uma substância cáustica, infecção, uma desordem digestiva incluindo mas não limitada a dispepsia não ulcerosa, gastrite, úlcera péptica ou duodenal, cancro gástrico, linfoma de MALT, síndroma de Menetier, doença de refluxo gastro-esofagiana, e doença de Crohn. A presente invenção refere-se assim à utilização de um microrganismo como descrito em cima para a preparação de um 11 medicamento para o tratamento de doenças e/ou desordens gástricas e/ou intestinais. A presente invenção também se refere à utilização de um microrganismo como descrito em cima para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças inflamatórias gastrintestinais agudas, colite aguda, as crises agudas das doenças de Crohn e colite ulcerativa, e para o tratamento de doenças crónicas e que ocorrem espontaneamente do tracto gastrintestinal que compreende a doença de Crohn (enteritis regionalis) e a colite ulcerativa (colitis ulcerosa).
De acordo com uma outra forma de realização, a invenção refere-se à utilização de um microrganismo como descrito em cima para a preparação de um medicamento para inibir a formação de lesões causadas por doenças e desordens gástricas e/ou intestinais. A administração do microrganismo pode ser oralmente ou por meio de qualquer outro método conhecido na técnica que permite que o microrganismo entre nos locais desejados a serem tratados, tal como por exemplo anal, vaginal. O microrganismo pode ser aplicado num meio nutritivo, isto é um meio que contém uma substância ou substâncias que sustentam (pelo menos in vitro) a actividade metabólica do microrganismo. Tais substâncias podem suster a viabilidade se não houver crescimento do microrganismo. Tais substâncias podem incluir uma fonte de energia tal como a glicose, amino ácidos e assim por diante. 0 indivíduo ao qual o microrganismo é administrado pode ser um ser humano ou um animal. 12
Num contexto terapêutico, isto é onde o efeito biológico da libertação do polipéptido a um indivíduo é benéfico àquele indivíduo, a administração é de um modo preferido numa 'quantidade terapeuticamente eficaz' sendo isto suficiente para mostrar o benefício ao paciente. Tal benefício pode ser pelo menos o melhoramento de um sintoma. A quantidade real administrada, e a taxa e o período decorrido de administração, vai depender do objectivo da administração, por exemplo do efeito biológico pensado em vista da natureza e da gravidade do desafio e é o sujeito da optimização de rotina. As prescrições do tratamento, por exemplo decisões na dosagem etc., estão dentro da responsabilidade de médicos de clínica geral e de outros médicos.
Uma composição que compreende microrganismos de acordo com a presente invenção pode ser administrada de acordo com a presente invenção por si só ou em combinação com outros tratamentos, quer simultaneamente ou em sequência.
De acordo com outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um método para produzir um microrganismo que liberta um péptido trifólio in vivo como definido acima que compreende a transformação de um microrganismo com um vector recombinante que transporta uma sequência de codificação de um polipéptido trifólio no controlo de um promotor conveniente e uma sequência de sinal de secreção bacteriana conveniente. A referida sequência de sinal de secreção bacteriana pode ser qualquer sequência conhecida na técnica para executar a referida função. De um modo preferido, para o L. lactís o referido sinal de secreção é a sequência de sinal de secreção usp45 L. lactis. A referida sequência de promotor pode ser qualquer promotor que 13 permite a expressão da referida sequência de codificação no referido microrganismo. Os exemplos dados na secção de exemplos incluem o conhecido promotor T7 do fago de E. coli induzivel e o promotor PI constitutivo conhecido de L. lactis. A presente invenção também se refere a um vector recombinante que compreende pelo menos uma parte de um péptido trifólio que codifica a sequência sob o controlo de um promotor conveniente e de uma sequência de sinal de secreção conveniente. O referido vector recombinante pode ser utilizado para libertar in vivo pelo menos uma parte de uma sequência de péptido trifólio a qual pode exercer um efeito de cura em áreas danificadas das superfícies de mucosas. A presente invenção refere-se além disso a um vector recombinante tão definido em cima, que tem uma sequência de nucleótido como representada por qualquer uma das de SEQ ID NOs 1, 2 ou 4.
Os exemplos seguintes servem simplesmente para ilustrar a presente invenção, e não devem ser interpretados como limitando a invenção de qualquer forma.
Legendas das Figuras
Figura 1: Vista geral dos plasmídeos utilizados.
Figura la: mapas esquemáticos dos plasmídeos pL2mTFFlvl, e pTlmTFFl. 0 T7 é o principal último promotor do colífago T7 (Studier e Moffatt, 1986) . O PI é o promotor lactococcal como em Waterf ield et al., (1995) , o usp45S é um fragmento de ADN que codifica o péptido de sinal de secreção da proteína lactococal Usp45 (van Asseldonck et al., 1990), o mtffl é um fragmento de ADN 14 que codifica a parte madura do TFF1 de murino, o mtfflvl é um fragmento de ADN que codifica um TFF1 de murino maduro truncado (a que falta dois resíduos aa aminoterminais) , o Cm é o marcador de selecção de cloranfenicol, Em é o marcador de selecção de eritromícina. Para o pPICmTFFl: 0 PPMF é o factor de a- emparcereimento de prepro Saccharomyces cerevisiae; o promotor AOX1 é o promotor da oxidase do álcool; o termo A0X1 é o terminador da oxidase do álcool; o HIS4 é o gene da dsidrogenase de Histidol; o Ori é uma origem de Escherichia coli de replicação; o AOXfr é um fragmento de 3' do gene da oxidase do álcool; o AmpR é o gene de resistência à ampicilin., Todos os componentes são do plasmideo pPIC9 (Invitrogen).
Figura lb: sequência de ADN do plasmideo pL2mTFFlvl (SEQ ID NO. 1).
Figura 1c: sequência de ADN do plasmideo pTl mTFFl (SEQ ID NO. 2}.
Figura Id: sequência de ADN do plasmideo pPICmTFFl (SEQ ID NO. 3).
Figura 2: SDS-PAGE. As fracções de proteína diferentes são libertadas a partir do meio de células de L. lactis MG1820 [pILPOL] (controlo), MG1820 [pILPOL; pL2mTFFlvl] , MG1363 [pTREXl] ou MG1363 [pTlmTFFl]. As duas faixas deixadas contêm proteínas marcadoras em que o peso molecular é dado em kDa. As proteínas foram visualizadas utilizando o mancheamento Azul de Coomassie.
Figura 3: Representação das classificações histológicas da parte distai do cólon. Gráfico do lado esquerdo de topo: o dano de epitélio (parte distai do cólon). Gráfico do lado direito do topo: a infiltração inflamatória (parte distai do cólon). Gráfico do fundo: soma das classificações histológicas dos gráficos superiores 15 (parte distai do cólon).
Figura 4: Representação das classificações histológicas da parte distai do cólon de ratos sãos (controlo) ou de ratos com colite DSS aguda sem tratamento (DSS) ou depois de tratamento com células de MG1363, MG1363 [pTREXl] ou MG1363 [pTl mTFFl].
Figura 5: titulações da citoquina pró-inflamatória em tecidos do cólon inflamado agudo. A interleucina-ΐβ no cólon distai (esquerdo) e o interferão-γ no cólon médio e distai (direito) de ratos sãos (controlo) ou ratos com a colite DSS aguda sem tratamento (DSS) ou depois de tratamento com células de MG1363, MG1363 [pTREXl] ou MG1363 [pTlmTFFl].
Figura 6: SDS-PAGE de fracções de proteína a partir do meio de Pi chia pastoris seleccionado (GST115:: pPICmTFFl) e controlo negativo. O clone produtor de mTFFl o qual foi além disso utilizado para a produção de mTFFl é indicado por uma ponta de seta. As proteínas foram visualizadas por se utilizar o mancheamento Azul de Coomassie.
Figura 7: A: modelo de filtração por gel de mTFFl purificado (Superdex 75; Pharmacia). A proteína de mTFFl eluída em dois picos com a maioria a estar presente em fracções 14, 15, 16 (dímero) e 20 (monómero). A identidade da proteína nestas fracções foi mostrada como sendo o mTFFl pela SDS-PAGE (inserção). As proteínas foram visualizadas por se utilizar o mancheamento Azul de Coomassie. B: redução e não redução de SDS-PAGE de mTFFl purificado. As faixas esquerdas são marcadores de tamanho de tamanhos indicados, mancheamento azul brilhante de coomassie. 16
Figura 8: Representação das classificações histológicas da parte distai do cólon de ratos tratados por injecção intraperitonial {i. p. ) , inoculação oral (oral) e rectal (rectal) , antes (pré), durante (du) ou depois (po) a instalação de colite induzida por DSS aguda. 0 DSSdu representa as classificações de ratos tratados com PBS induzidos para a colite por DSS aguda.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Clonagem e expressão do murganho TTF1 (mTTFl)
Meio de cultura O GM17 é M17 (Difco, Detroit) compl de Na2HP04, 3 g de KH2P04, 1 g de NH4CI, 0,5 g de NaCl, 2 mmol de MgS04, 0, 1 mmol de CaCl2 e 5 g de Casitone (Difco) . Ο M9B é M9 complementado com 2,1 g de NaHC03 e 2, 65 g de Na2C03 por litro. O GM9B é M9B complementado com 0,5 % p/v de glicose. O LM9B é M9B complementado com 0,5 % p/v de lactose.
Quando apropriado os antibióticos, eritromicina (Er) ou o cloramfenicol (Cm), foram adicionados aos respectivos meios em concentrações finais de 5 pg/ml cada um. A designação utilizada para indicar a presença de antibiótico é, por exemplo GM17Er, ^M9BCm e assim por diante. Os meios sólidos contiveram 1,2 % de ágar. Técnicas de ADN Recombinante
As enzimas que modificam o ADN e as endonucleases de restrição foram utilizadas em condições padrão e nos tampões recomendados 17 pelos fabricantes. As técnicas be clonagem molecular gerais e a electroforese bo ADN e das proteínas foram executados de acordo com os procedimentos padrão. 0 L. lactis foi transformado por electroporação de células cultivadas na presença de glicina (Wells et al., 1993a). 0 ADN de plasmídeo foi purificado de forma rotineira por se utilizar o Conjunto de Plasmídeo Qiagen.
Amplificação de PCR de mTFFl A reacção de PCR foi executada num plasmídeo que contém o ADNc de mTFFl (Lefebvre, 1993) por se utilizarem iniciadores de oligonucleótido de mTFFlS e mTFFlA. O iniciador mTFFlS corresponde aos 18 primeiros nucleótidos do cordão de sentido de mTFFl desde o primeiro nucleótido atrás da sequência de sinal. 0 iniciador mTFFl é complementar aos últimos 26 nucleótidos do cordão de sentido de mTFFl incluindo o codão de paragem, e introduz um local extra de restrição Spel. mTFFlS: 5'-CAGGCCCAGCCCAGGCC-3' (SEQ ID NO. 4) mTFFlA: 5'-GCACTAGTTAGAAGGGACATTCTTCTTCTTG AG-3' (SEQ ID NO. 5) em que ACTAGT em mTFFlA representa um local Spel. A amplificação de PCR foi executada por se utilizar a polimerase de ADN de Vent® (New England Biolabs (Beverly, EUA) a qual dá um produto de PCR que transporta extremidades planas. A mistura de PCR consistiu de 2 unidades de polimerase de ADN Vent, 10 pL de tampão Vent (termopol) , 4 pL de dXTP1 s 1 (um máximo de 0,5 rnM) , 5 pL (0,5, pM) de cada iniciador, 1 pL (50 ng) de ADN padrão e 74 pL de H20. Seis reacções foram colocadas diferenciando-se na sua concentração final de MgS04, ajustadas a 0, 1, 2, 3, 4 e 5 mM respectivamente.
Os ciclos de amplificação de PCR foram: T0 para 300" a 94 °C, Τχ para 45" a 94 °C, T2 para 30" a 60 °C, T3 para 20" a 72 °C, T4 para 18 10" a 20 °C. Estes ciclos de Τχ a T3 foram executados 30 vezes. A amplificação de PCR com estes iniciadores produziu o gene para o TFF1 maduro ao qual falta a sequência de sinal e que inclui um local de restrição de Spel adicional. Depois de verificação através de electroforese de gel, o fragmento amplificado apareceu como uma banda na variação de comprimento esperada. A extremidade de 5' da sequência de TFF1 contém duas sequências alvo possíveis complementares ao iniciador que se segue. Como uma consequência dois fragmentos de 202 pares de bases e 208 pares de bases respectivamente podem ser amplificados a partir do ADNc de TFFl através da utilização dos iniciadores mencionados. Estes fragmentos não são esperados que sejam separados por electroforese em gel de agarose.
Construção de plasmideos
Dois diferentes tipos de vectores foram utilizados como aceitantes para o péptido trifólio de mTFFl que codifica o fragmento de PCR. A estrutura primária dos dois vectores parentais - pTlNX, derivado de pTREXl (Wells e Schofield, 1996}, e pLET2NX, derivado de pLET2N (Steidler et al., 1995) - contém os seguintes elementos comuns: um promotor (T7 ou Pl), a sequência de sinal de secreção de usp45 de L. Lactis {van Asseldonk et al., 1990 e o pedido de patente europeia publicada com o No. 0 455 280), modificada para conter um local de restrição Nael que se sobrepõe à sequência que codifica o último resíduo aa (Steidler et al., 1995), e um local de restrição de Spel a jusante. Os plasmideos derivados de pTINX especificam resistência à eritromicína; os plasmideos derivados de pLET2NX especificam resistência ao cloranfenícol. Os fragmentos de PCR foram tratados durante 1 hora a 37 °C utilizando 50 pL de solução 19 de ADN, 10 pL de tampão de Spel, 50 unidades de Spel, 10 unidades de quinase de polinucleótido T4 (Gibco BRL, Bethesda, EUA), 0,5 mM de ATP, ajustado a pH 7,5, e 36 pL de H20. O vector pTINX foi digerido durante 1 hora a 37 °C por se utilizar de 10 a 20 pL de ADN, tampão de Nael, 10 unidades de Nael, 50 unidades de Spel, 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitelo (Boehringer, Mannheim, Alemanha) e de 73 a 63 pL de Η20. Depois de 30 minutos de incubação, 50 unidades de Spel e 10 unidades de Nael foram adicionadas mais uma vez à mistura. As enzimas de restrição foram inactivadas e extraídas a partir da mistura através de extracção com fenol/clorofórmio. Depois da digestão da restrição, a banda derivada de mTFFl (que compreende um fragmento de 195 bp e de 201 bp como descrito antes em "Amplificação de PCR de murganho TFF1 (mTFFl)", e as partes do vector foram excisados a partir de gel de agarose. A seguir à ligação dos respectivos fragmentos de PCR e do vector durante 45 minutos a 16 °C por se utilizar ligase de ADN T4 "Pronta a Usar" (Pharmacia Biotech., Reino Unido) os plasmídeos recombinantes foram obtidos que contêm o cistron de mTFFl como uma fusão em rede para a sequência de sinal de secreção de usp45 sob o controlo do promotor. 0 plasmídeo pTl mTFFl (Figura la), o qual contém o promotor PI de L. lactis constitutivo, resultou da ligação da parte do vector de Nael - Spel purificada de pTINX e do corte de Spel e do fragmento de PCR de 5' fosforilado. 0 plasmídeo pL2mTFFlv1 (Figura la), o qual contém o promotor T7 do fago de E. coli induzível, resultou da ligação da parte do vector Nael - Spel purificada de pLET2N e corte de Spel e do fragmento de PCR de 5' fosforilado. O promotor T7 só pode ser activado através da polimerase de ARN de T7 da mesma orxgem codificado por exemplo 20 através do plasmídeo pILPOL. Este plasmídeo está presente na estirpe de L. lactis MG1820 [pILPOL] (Wells et al., 1993c).
Para a análise estrutural o plasmídeo pTlmTFFl foi transformado na estirpe de L. lactis MG1363. As células foram cultivadas em placas de GMl7Er. As colónias foram cultivadas em 2,5 mL de GM17Er e o plasmídeo foi isolado. Por meio de um sumário analítico, o modelo de restrição do vector pTlNX (2 pL de ADN (pTl NX), 20 unidades de EcoRl, 50 unidades de Spel, 2 pL de tampão de Spel e 15 pL de H20) e o plasmídeo recombinante isolados (5 pL de ADN, 20 unidades de
EcoRl, 50 unidades de Spel, 2 pL de tampão de Spel, 0,25 pL de uma solução normal de lOpg/mL de Rnase A, 12 pL de Η20) foram comparados. Os plasmídeos foram cortados com EcoRl e Spel durante 1 h a 37 °C. Nos plasmídeos de referência, dois fragmentos lineares de 907 bp e 4999 bp são previstos. Em pTlmTFFl, duas bandas de 499 bp e 4999 bp são previstas. Os tamanhos dos fragmentos experimentalmente obtidos, como visualizado através de electroforese de gel de agarose e de mancheamento de EtBr, foram compatíveis com os comprimentos previstos. De cada plasmídeo recombinante, uma cultura positiva foi marcada nas placas de GM17Er para se obterem colónias isoladas. Uma colónia foi pósteriormente inoculada em 100 mL de meio de GM17Er e cultivada até à saturação. As células foram reunidas e os plasmídeos foram purificados. A sua estrutura física foi verificada através da análise da enzima de restrição e da electroforese de gel de agarose. Além do mais, a análise da sequência revelou que o cistron de mTFFl tinha sido ligado perfeitamente na rede com a sequência líder de secreção de usp45. O pTlmTFFl contém uma inserção de 208 bp a qual representa a sequência de codificação completa do mTFFl maduro (como descrito, antes em "A amplificação de PCR do rato TFF1 (mTFFl)”). 21
Para a análise estrutural os plasmídeos pL2mTFFl vl foram transformados na estirpe de MG1820 [pILPOL]. As células foram cultivadas em placas de GMl7Cm. As colónias foram cultivadas em 2,5 mL de GM17Cm e os plasmídeos foram isolados. Por meio de um sumário analítico, o modelo de restrição do vector pLET2NX (2 pL de ADN (pLET2NX), 20 unidades de EcoRI, 50 unidades de Spel, 2 pL de tampão de Spel e 15, pL de H20) e o plasmídeo recombinante isolado (5 pL de ADN, 20 unidades de EcoRI, 50 unidades de Spel, 2 pL de tampão de Spel, 0,25 pL de uma solução normal de lOpg/mL de Rnase A, 12 pL de H20) foram comparados. O plasmídeo recombinante foi cortado com EcoRI e Spel durante 1 hora a 37 °C. Nos plasmídeos de referência, dois fragmentos lineares de 907 bp e 4650 bp são previstos. No pL2mTFFl, duas bandas de 499 bp e 4650 bp são previstas. Os tamanhos dos fragmentos experimentalmente obtidos, como visualizado através de electroforese de gel de agarose e mancheamento de EtBr, foram compatíveis com os comprimentos previstos. A partir do plasmídeo recombinante, uma cultura positiva foi marcada em placas de GM17Cm para se obterem colónias isoladas. Uma colónia foi posteriormente inoculada em 100 mL de meio de GM17Cm e cultivada até à saturação. As células foram reunidas e o plasmídeo foi purificado. A sua estrutura física foi verificada através da análise da enzima de restrição e de electroforese de gel de agarose. Além do mais, a análise da sequência revelou que o cistron rnXFFl tinha sido ligado na rede com a sequência líder de secreção de usp45. A análise além disso mostrou que o pL2mTFFlvl contém uma inserção de 202 bp (consequentemente a que faltam os dois primeiros resíduos aa aminoterminais de mTFFl maduro; como descrito antes em "A amplificação de PCR de rato TFF1 (mTFFl)"). As sequências dos plasmídeos recombinantes são dadas nas figuras lb e lc. As suas sequências completas foram compiladas a partir das sequências publicadas das partes constitutivas. Além do mais, as 22 secções relevantes das sequências tais como os fragmentos de PCR e os pontos de junção da ligação foram experímentalmente verificados.
Expressão da proteína em L. Lactis transformado
As estirpes de L. lactis foram transformadas com os plasmídeos como construído em cima. Para a transformação do plasmídeo de pTlmTFFl, a estirpe de L. lactis MG 1363 (Gasson, 1983) foi utilizada. Para a transformação do plasmídeo de pL2mTFFlvl, a estirpe de L. lactis MG1820 (plLPOL) (Maeda e Gasson, 1986) foi utilizada. A expressão das proteínas através destas estirpes transformadas de L. lactis foi detectada por SDS-PAGE.
Para se prepararem as fracções de sobrenadante de cultura, as células foram cultivadas durante 20 horas a 28 °C em cinco mL de meio de GM17Er para o plasmídeo de pTlmTFFl ou meio de GM17Cin para o plasmídeo de pL2mTFFlvl. As culturas foram diluídas 1/100 em cinco mL de meio quer de GM17Er ou de GM17Cm e cultivadas durante 3 horas a 28 °C. As células foram reunidas através de centrifugação a 2800 rpm durante 20 minutos e ressuspensas em cinco mL do meio apropriado, isto é, GM9BEr para as células MG1363 ou LM9BCm para as células MG1820 [plLPOL]. Depois de mais cinco horas de cultivação as células foram revestidas. As proteínas presentes nas fracções do meio foi recuperadas através da extracção de fenol e da precipitação de etanol.
As proteínas expressas na cultura fracção do sobrenadante de cultura de uma estirpe de controlo de L. lactis MG1820 em comparação com as estirpes de L. lactis de MG1820 transformadas com [plLPOL; pL2mTFFlvl] e de L. lactis de MG1363 transformada com 23 tpTREXl; pTlmTFFl] são mostradas na Figura 2. Esta figura mostra uma banda de proteína extra de tamanho apropriado (indicado pela ponta da seta) em MG1820 [pL2mTFFlvl] e em MG1363 [pTlmTFFl] quando comparada com os controlos. Como pode ser observado a partir desta figura, a expressão do gene recombinante é bastante baixa. Isto produz o resultado in vivo observado que surpreende uma vez que outros utilizam os péptidos trifólios purificados em terapias para a reparação do dano gástrico e intestinal a níveis dramaticamente ma is altos; por exemplo Tran et al. (1999) utilizaram a aplicação intrarectal diariamente do recombinante humano de TTF2 a níveis de 2,5 mg/kg de peso de corpo durante cinco dias para se obter uma redução no índice inflamatório da colite experimentalmente instalada em ratos (administração intra cólon de ácido dinitrobenzeno sulfónico em álcool).
Exemplo 2: Teste in vivo de MG1363 [pTl mTFFl]
Preparação de células para administração intragástrica
Os transformantes de estirpes de L. lactis, MG1363 [pTREXl], MG1363 [pTlmTFFl] foram marcados em placas de GM17Er e cultivados durante a noite a 28 °C. Em cada caso uma única colónia foi posteriormente cultivada durante a noite a 28 °C em 15 mL de meio de GM17Er. A esta cultura, 15 mL de 100 % de glicerol foi adicionado para conservar as referidas células a - 20 °C. Cada dia, a quantidade necessária de células pode ser inoculada para o tratamento de ratos. Neste final a cultura foi diluída 1/200 em 10 mL de meio de GMl7Er. Depois de um mínimo de 20 horas de crescimento a 30 °C, as células foram reunidas através de centrifugação durante 15 minutos a 2800 rpm. As células foram depois ressuspensas em 1 mL de M9B sem antibiótico. 24
Testes in vivo em ratos com colite aguda 0 efeito dos péptidos trifólios expressos a partir desta bactéria de L. lactis foi testado em ratos que sofrem de colite aguda. Vinte e um ratos fêmeas Balb/c receberam 5 % de DSS (sulfato de sódio de dextrano) dissolvido na sua água potável durante 7 dias. Desta maneira, a colite aguda foi induzida (Kojouharoff et ai., 1997). Para objectivos terapêuticos estes ratos foram inoculados oralmente diariamente por meio de um cateter gástrico que utiliza 100 pL de suspensão bacteriana (um mínimo de 1.108 células) desde o dia 1 até ao dia 7 do tratamento com DSS. Como indicado seis ratos foram inoculados com células de MG1363 [pTREXl], seis ratos foram inoculados com células de MG1363 [pTlmTFFl] e três ratos não foram inoculados (controlo de DSS). No dia 8 depois da indução da colite, os ratos foram sacrificados e examinados imunologicamente e histologicamente. 0 teste imunológico dos soros mostrou que os ratos tratados não mostraram uma resposta imune em direcção às proteínas expressas. O soro foi tomado a partir dos ratos que foram sangrados no dia 8. Este soro foi analisado através de mancheamento de Western para verificar se continha anticorpos contra as proteínas presentes nas fracções do meio das células de L. lactis. As fracções do meio utilizadas foram derivadas das estirpes de L. lactis MG1363 [pTREXl] e MG1363 [pTlmTFFl]. Um equivalente de 1 mL das fracções de meio concentrado (extracção de fenol e precipitação de etanol) as foram analisadas através de electroforese em gel de poliacrilamida de SDS (20 %). Depois do mancheamentos filtros de nitrocelulose, os filtros foram incubados durante 1 hora com as soluções de soro dos 4 grupos de ratos. O soro foi diluído 500 vezes em 20 mL de tampão de bloqueio de nitrocelulose (Blotto: 100 25 mL de 10 x PBS, 150 mL de 1M de NaCl, 2 mL de Tritão X-100, 25 g de leite em pó sem gordura, água até um volume total de 1 litro). Como um anticorpo secundário, IgG anti rato de ovelha ligado à peroxidase de armorácia (HRP) foi utilizado. A utilização de 500 vezes de soro diluído, não detectou nenhum sinal. A análise histológica foi executada em cólons dos ratos tratados. Os cólons foram cortados na direcção do comprimento e divididos em três porções iguais: as partes distai (mais perto ao ânus), média e próxima. Estas partes de cólon foram analisadas histologicamente depois de uma fixação durante a noite em 3,7 % de formaldeído (em PBS) , seguido pelo embebimento em parafina, assegurando o posicionamento direito das amostras de tecido nos blocos de parafina. De cada amostra de tecido, três secções longitudinais espessas paralelas de 3 pm, exactamente espaçadas por cima da amostra, foram feitas. Estas ligações transversais foram coloridas com hematoxilina/eosina. A análise histológica foi executada de uma forma cega, significando que os marcadores nas lâminas foram cobertos antes da marcação das secções. As lâminas que transportam as secções obtidas a partir de vários grupos de ratos foram aleatórias antes do exame ao microscópio. Cada lâmina foi depois destinada a uma contagem histológica (variando de 0 a 5) de acordo com a descrição sintomática como definido na Tabela 1.
Para cada rato e para cada parte de cólon, a contagem média das três secções foi calculada. Nas partes distai e média do cólon, a inflamação que consiste de dano epitelial e infiltração foi a mais pronunciada. Na parte próxima, quase nenhuma inflamação pode ser observada. A média da contagem histológica foi calculada para ambas as partes distai e média do cólon por grupo de animais. A soma da contagem histológica final é a soma das duas grande contagens 26 separadas (contagem da soma = contagem do dano epitelíal + contagem da infiltração) e é uma medida para o grau da inflamação. A contagem da soma histológica da parte do cólon distai para cada um dos grupos de ratos é mostrada na Figura 3. A partir das contagens histológicas para a parte distai do cólon como estabelecido na Figura 3, pode ser concluído que há uma redução clara da inflamação depois da inoculação dos ratos com as células de L. lactis que produzem péptidos trifólios. Os ratos que receberam as células de L. lactis de [pTlmTFFl] transformado mostram uma redução significativa da inflamação de mais de 65 %.
Como pode ser visto a partir da Figura 3, a infiltração inflamatória e o dano epitelíal na parte distai do cólon são significativamente reduzidos depois da inoculação com as estirpes de L. lactis recombinante as quais segregam o polipéptido de mTFFl.
Estes resultados foram confirmados numa experiência separada a qual foi conduzida igualmente, incluindo grupos maiores (tamanho de grupo = 10) e mais grupos de controlo. A figura 4 mostra as contagens histológicas (obtidas como descrito em cima) de ratos de controlo sãos (controlo) e de ratos os quais receberam DSS como descrito, quer deixados não tratados (DSS) ou tratados (como descrito em cima) com MG1363, MG1363 [pTITREXI] ou MG1363 [pTlmTFFl] como indicado. A experiência mostra uma redução clara e significativa na inflamação intestinal no grupo de ratos tratados com MG1363 [pTl mTFFl]. A última experiência também foi avaliada por se determinarem os níveis de interleucina-ΐβ (IL-Ιβ) e interferão-γ (IFN-γ), ambas citoquinas pró-inflamatórios bem conhecidas do especialista. Os 27 ratos (η = 0) foram inoculados com as estirpes indicadas como descrito. Controlo = ratos sãos, DSS = ratos que recebem 5 % de DSS na água potável sem qualquer tratamento. O cólon foi preparado e as áreas com a superfície igual foram isoladas por meio de perfurador (0 = 4 mm) . As amostras de tecido de cada grupo foram revestidas outra vez com 500 pL de RPMI + 10 % de soro de bezerro fetal e incubadas durante a noite a 37 °C. 0 sobrenadante foi reunido e titulado para o conteúdo de citoquina através de ELISA. A quantidade de IL-Ιβ e IFN-γ nos respectivos tecidos é mostrada na Figura 5. Os resultados mostram uma redução clara nestas citoquinas pró-inflamatórios em grupos de ratos tratados com MG1363 [pTl mTFFl]
Exemplo 3: Comparação de tratamento com MG1363 [pTITFFl] e TFF1 purificado
Construção de plasmídeos
Para a expressão da forma de mTFFl de Pichia pastoris construímos o plasmídeo pPICmTFFl. Para isto, o gene de mTFFl foi amplificado por PCR como descrito (a amplificação de PCR do TFF1 de rato) . Este fragmento foi ligado no local de restrição de Nael aberto de um derivado de pPIC9 (Invítrogen). A mistura de ligação é transformada para MCI061 de E. coli e correctamente os clones reunidos foram identificados através de análise de restrição e de sequenciação de ADN (sequência como na Figura Id) . No plasmídeo resultante de pPICmTFFl, a sequência de mTFFl é fundida em rede com o sinal de secreção prepro do factor de α-acoplamento de Sacharomuces cerevisiae.
Expressão e Purificação de mTFFl 28 0 plasmídeo de pPICmFFl foi transferido para o GST115 de Pichía pastoris através de um método como descrito em Logghe (1995) e os clones positivos, os quais tinham a unidade integrada de mTFFl no local de his4, foram seleccionados através de identificação de PCR. Estes clones positivos foram induzidos com o metanol e examinados para a expressão pela análise de proteína da cultura do sobrenadante e um clone o qual mostrou, quando em comparação com o controlo negativo (negativo), uma expressão especialmente elevada de uma banda extra a 6,5 kDa (GST115:: pPICmTFFl) foi conservado para um trabalho adicional (Figura 6, indicada pela ponta da seta) . A banda de proteína extra foi identificada como mTFFl pela sequenciação da proteína. O procedimento da expressão foi optimizado aumentado e optimizado para uma cultura de L e o mTFFl foi purificado a partir do sobrenadante de cultura.
Para isto, o metanol que induziu os sobrenadantes de GST115:: pPICmTFFl foi concentrado através de filtração tangencial (profluxo M12 de Millipore, cortado em 3000 Da) e foi díalisado a pH 7,4 a 0, 02 M de um tampão de fosfato. O mTFFl foi purificado a partir deste concentrado numa coluna de troca de iões (coluna Q de Biorad). As proteínas foram eluídas a partir da coluna através de um gradiente de sal isocracional. O mTFFl resultante foi raais de 99 % puro e foi além disso concentrado. A preparação final contém menos do que 160 ng de LPS/mL. Esta quantidade de LPS está dentro dos limites aceitáveis e a proteína de pS2 pode ser utilizada em futuras experiências.
Seguindo a análise numa coluna de exclusão de tamanho de mTFFl purificado (Superdex 75; Pharmacia) concluímos que 7,5 % do mTFFl está na forma monomérica, e 92,5 % está na forma dimérica (Figura 7A). Isto foi confirmado através da redução versus não redução de 29 SDS-PAGE do mTFFl purificado (Figura 7B).
Avaliação da actividade biológica do TFF1 purificado
Uma caracteristica bem conhecida da proteína de TFF1 é que depois da administração da proteína a monocamadas de célula de Caco-2 abaixa significativamente a expressão da superfície de E-cadherine (Liu et al., 1997). Mostramos um abaixamento de 10 % da expressão de superfície de E-cadherine depois da preparação acima descrita de mTFFl ter sido administrada a monocamadas de Caco-2.
Tratamento da colite aguda em murinos com o mTFFl purificado:
Para a indução da colite aguda os ratos receberam 6 % de sulfato de sódio de dextrano (DSS, MW 40 000) dissolvido na água potável durante 7 dias (Kojouharoff et al., 1997). Os ratos utilizados para as experiências foram combinados por idade e receberam o tratamento de DSS simultaneamente. Para objectivos terapêuticos, os ratos foram tratados diariamente com 50 pg de mTFFl em 200 pL de PBS antes da administração de DSS desde o dia 7 a 0 (grupos de pré-tratamento) , durante a administração de DSS desde o dia 0 a 7 (grupos durante o tratamento) e depois da administração de DSS desde o dia 7 a 14 (grupos de pós-tratamento) . Para estudar vias diferentes para libertar o mTFFl, os ratos foram tratados através de administração intraperitoneal (i. p.) injecção, inoculação intragástrica e rectal em cada organização. Os ratos foram mortos no dia 8 depois de receberem água potável sem DSS durante um dia (grupos de pré-tratamento e durante o tratamento) e no dia 14 depois de receberem água potável sem DSS durante sete dias (grupos de pós-tratamento) . Os grupos de controlo não tratados com DSS na água potável foram mortos no dia 8 e no dia 14. Todos os grupos 30 consistiram de 9 ratos. Os resultados são representados na Figura 8 e mostram claramente que em nenhum regime de tratamento qualquer melhoramento por meio de estatística significativo pode ser observado. Isto torna a invenção descrita surpreendente uma vez que um melhoramento claro foi observado (Figura 3 e 4) . Isto significa que a libertação de TFF1 através de L. lactis faz uma contribuição essencial para o efeito terapêutico observado.
Tabela 1. Descrição sintomática de contagens histológicas
Contagem Dano no epitélio Infiltração inflamatória* 0 Morfologia normal Nenhuma infiltração 1 Perda de algumas células de cálice Infiltração à volta da base das criptas 2 Perda comum de células de cálice Infiltração a qual alcança as mucosas musculares da Lamina 3 Perda das criptas Infiltração extensiva a qual alcança as mucosas musculares da Lamina e o espessamento da mucosa com edema proeminente 4 Perda comum das criptas Infiltração a qual alcança a Lamina submucosa * A infiltração inflamatória inclui a infiltração dos granulócitos, macrófagos e linfócitos
REFERÊNCIAS
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Lisboa, 18 de Dezembro de 2006
Claims (14)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Bactéria não invasiva e não patogénica recombinante transformada com ADN que codifica um péptido trifólio capaz de libertar um péptido trifólio no tracto gastrointestinal de um ser humano ou animal.
2. Bactéria não invasiva e não patogénica recombinante de acordo com a reivindicação 1, em que a referida bactéria é uma estirpe bacteriana de grau alimentar, de um modo preferido uma estirpe bacteriana grarn positiva.
3. Bactéria não invasiva e não patogénica recombinante de acordo com a reivindicação 2, em que a referida estirpe bacteriana é uma espécie de Lactococcus ou de Lactobacillus.
4. Bactéria não invasiva e não patogénica recombinante de acordo com a reivindicação 3, em que a referida estirpe bacteriana é Lactococcus lactis.
5. Bactéria não invasiva e não patogénica recombinante de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido péptido trifólio é o TFF1.
6. Composição farmacêutica que compreende uma bactéria não invasiva e não patogénica recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
7. Método para a libertação de péptido trifólio para o tracto gastrointestinal que compreende a administração de uma 2 bactéria não invasiva e não patogénica recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
8. Utilização de uma bactéria não invasiva e não patogénica recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para a fabricação de um agente para a libertação de um péptido trifólio para o tracto gastrointestinal.
9. Utilização de uma bactéria não invasiva e não patogénica recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para a preparação de um medicamento para o tratamento de lesões causadas por doenças e/ou desordens gástricas e/ou intestinais.
10. Utilização de uma bactéria não invasiva e não patogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças e/ou desordens gástricas e/ou intestinais.
11. Utilização de uma bactéria não invasiva e não patogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças inflamatórias gastrointestinais agudas que compreende a colite aguda, as crises agudas da doença de Crohn e a colite ulcerativa.
12. Utilização de uma bactéria não invasiva e não patogénica de acordo coro qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para a preparação de um medicamento para o tratamento de doenças crónicas e que ocorrem espontaneamente do tracto gastrointestinal que compreende a doença de Crohn (enteritis 3 13. regionalis) e a colite ulcerativa (colitís ulcerosa).
14. Utilização de uma bactéria não invasiva e não patogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para a preparação de um medicamento para a inibição da formação de lesões causadas por doenças e/ou desordens gástricas e/ou intestinais.
15. Método para a produção de uma bactéria não invasiva e não patogénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 que compreende a transformação de uma bactéria não invasiva e não patogénica com um vector recombinante que transporta uma sequência de codificação de péptido trifólio sob o controlo de um promotor adequado e de uma sequência de sinal de secreção adequada. Lisboa, 18 de Dezembro de 2006
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