JP4744763B2 - Ｉｌ−１８阻害剤の用途 - Google Patents

Description

【０００１】
［技術分野］
本発明は、さまざまな病的な状況におけるＩＬ−１８阻害剤の治療適用に関する。さらに詳しくは、本発明は関節炎の治療および／または予防、肝疾患の治療および／または予防、ならびに炎症性の腸疾患（ＩＢＤ）の治療および／または予防に関する。
【０００２】
［発明の背景］
１９８９年に、マウスの脾臓細胞から得られるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を誘導する、エンドトキシン誘導血清の活性が記載された（Micallef et al., 1996）。この血清の活性はＩＦＮ−γの直接的な誘導物質として作用するのではなく、むしろＩＬ−２またはマイトジェンといっしょに共刺激剤として作用する。ポスト−エンドトキシンマウス血清から活性を精製しようと試みたところ、おそらく均質の５０〜５５ｋＤａのタンパク質であることが示された。ほかのサイトカインがＩＦＮ−γ産生に対して共刺激剤として働くことができるため、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６またはＴＮＦに対する中和抗体で血清活性の中和を試みたが失敗に終わったことで、該タンパク質は異なる因子であると示唆された。１９９５年に同科学者らによって、ＩＦＮ−γ産生に対するエンドトキシンによって誘導される共刺激剤は、Ｐ．アクネス（P. acnes）によってあらかじめ調整されたマウス由来の肝臓の抽出物内に存在することが証明された（Novick et al., 1992）。このモデルにおいて肝臓のマクロファージ数（クッパー細胞）は増加し、バクテリアのリポ多糖（ＬＰＳ）の低い投与量（あらかじめ調整されていないマウスでは致死ではない）が、これらマウスにおいては致死量であった。ＩＦＮ−γ誘導因子（ＩＧＩＦ）と名づけられ最近インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）と呼ばれるその因子が、Ｐ．アクネス処理されたマウスの肝臓１２００グラムから均質物に精製された。精製されたＩＬ−１８のアミノ酸配列に基づき得られた変性オリゴヌクレオチドは、マウスＩＬ−１８ｃＤＮＡをクローン化するのために使用された（Novick et al., 1992）。ＩＬ−１８は１８〜１９ｋＤａの１５７アミノ酸からなるタンパク質で、データベースに掲載されるどのペプチドとも明らかに類似性がなかった。ＩＬ−１８およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）のメッセンジャーＲＮＡは、クッパー細胞および活性化マクロファージにおいて容易に検出された。組換えＩＬ−１８は、おそらく別の経路を介し、ＩＬ−１２よりもより強力にＩＦＮ−γを誘導するようである（Novick et al., 1992）。エンドトキシンによって誘導される血清活性と同様に、ＩＬ−１８は単独ではＩＦＮ−γを誘導しないが、主にマイトジェンまたはＩＬ−２との共刺激剤として機能する。ＩＬ−１８は、おそらくＩＬ−２に依存した経路を介してＴ細胞の増殖を促進し、インビトロにおいてＴｈ１サイトカイン産生を促進し、そして増強されたＩＦＮ−γ産生に関してはＩＬ−１２を組み合わせた場合に相乗作用を示す（Maliszewski et al., 1990）。
【０００３】
マウスＩＬ−１８の中和抗体は、あらかじめＰ．アクネスで調整されたマウスの低い投与量のＬＰＳによる致死を予防することが示された。このほかにも、あらかじめ調整されたマウスにおけるＬＰＳ致死性のメディエーターとしてのＩＦＮ−γの重要性について報告された。たとえば、抗ＩＦＮ−γ中和抗体は、シュワルツマン様ショック（Shwartzman-like shock）からマウスを保護する（Fantuzzi et al., 1998）、そしてガラクトサミン処理されたＩＦＮ−γ受容体欠損マウスは、ＬＰＳによって誘導される死に対して耐性である（Byrn, 1990）。したがって、マウスＩＬ−１８の中和抗体が、Ｐ．アクネスであらかじめ調整されたマウスを致死のＬＰＳから保護することは予想されていなかった（Novick et al., 1992）。抗マウスＩＬ−１８処理もまた、深刻な肝臓細胞毒性から生存マウスを保護する。
【０００４】
マウスのフォームがクローニングされた後、ＩＬ−１８に対するヒトｃＤＮＡ配列が１９９６年に報告された（Okamura et al., 1995）。組換えヒトＩＬ−１８は天然のＩＬ−１８活性を示す（Okamura et al., 1995）。ヒト組換えＩＬ−１８は、ヒトＴ細胞における直接的なＩＦＮ−γ誘導活性はないが、ＩＦＮ−γおよびほかのＴ−ヘルパー細胞１（Ｔｈ１）サイトカイン産生のための共刺激剤として作用する（Okamura et al., 1995）。今まで、ＩＬ−１８は、主にＴｈ１サイトカイン産生のための共刺激剤として（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２および顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子）（Izaki, 1978）、およびマウスナチュラルキラー細胞クローンのＦＡＳリガンドに仲介される細胞毒性のための共刺激剤として（Novick et al., 1992）考えられている。
【０００５】
影響を受けた組織からＩＬ−１８をクローニングし、ＩＬ−１８遺伝子発現を研究することによって、自己免疫疾患とこのサイトカインとの詳細な関連性が見出された。肥満でない糖尿病（non-obese diabetic）（ＮＯＤ）のマウスは、シクロホフスァミドの単独注射によって促進および同時進行され得る、自己免疫インスリン炎および糖尿病に自然に進行する。ＩＬ−１８ｍＲＮＡは、初期段階のインスリン炎のＮＯＤマウスのすい臓における逆転写ＰＣＲによって明らかにされた。ＩＬ−１８のｍＲＮＡのレベルは、シクロホフスァミドの処理後、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡの増加に先だって急激に増加し、糖尿病を発症した。興味深いことに、それらの動力学はＩＬ−１２−ｐ４０のｍＲＮＡの動力学と似ており、個々のｍＲＮＡレベルは密接に相関する。すい臓ＲＮＡ由来のＩＬ−１８ｃＤＮＡのクローニングついで配列決定により、クッパー細胞およびインビボにおける活性化前のマクロファージからクローニングされたＩＬ−１８配列との同一性が明らかになった。また、ＮＯＤマウスのマクロファージは、シクロホフスァミドに応答してＩＬ−１８遺伝子を発現したが、並行して処理されたＢａｌｂ／ｃマウス由来のマクロファージでは応答しなかった。したがって、ＩＬ−１８発現は、自己免疫ＮＯＤマウスにおいて異常に調節され、糖尿病発症に密接に関連している（Novick et al., 1992）。
【０００６】
ＩＬ−１８は、Ｔｈ１細胞におけるＦａｓリガンドの機能的活性を増大させることによる免疫調節または炎症性において潜在的な役割を担っている（Conti et al., 1997）。ＩＬ−１８はまた、副腎皮質において発現され、したがって、ストレスのある経験につづく免疫系を調節する際に重要役割を担う分泌型の神経−免疫調節剤であり得る（Chater, 1986）。
【０００７】
インビボにおいて、ＩＬ−１８は、ＩＬ−１８前駆体の切断によって形成され、その内因性の活性はＰ．アクネスおよびＬＰＳに仲介される致死性におけるＩＦＮ−γ産生を説明するように思われる。成熟ＩＬ−１８は、ＩＬ−１β変換酵素（１Ｌ−１ベータ−変換酵素、ＩＣＥ、カスパーゼ−１）によって、その前駆体から産生される。
【０００８】
ＩＬ−１８受容体は、リガンドの結合において共作用する、少なくとも２つの成分からなる。ＩＬ−１８に対する高親和性および低親和性の結合部位がマウスＩＬ−１２に刺激されるＴ細胞において見出され（Yoshimoto et al., 1998）、多鎖受容体複合体（multiple chain receptor complex）であることが示唆される。２つの受容体サブユニットはこれまでに同定され、どちらもＩＬ−１受容体ファミリーに属している（Parnet et al., 1996）。ＩＬ−１８のシグナルトランスダクションはＮＦ−κＢの活性化を含む（DiDonato et al., 1997）。
【０００９】
いくつかの既知のサイトカイン結合タンパク質は、可溶性のサイトカイン受容体であり、それらのそれぞれの細胞表面サイトカイン受容体の細胞外リガンド結合ドメインに相当する。それらは、細胞表面受容体に共通したｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシング、または細胞表面受容体のタンパク質分解性切断のどちらかによって得られる。今までに、このような可溶性受容体は記載されており、とくに、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γの可溶性受容体（Nakamura et al., 1989）、ＴＮＦの可溶性受容体（Dao et al., 1996; Engelmann et al., 1989）、ＩＬ−１およびＩＬ−４の可溶性受容体（John, 1986）、ＩＦＮ−α／βの可溶性受容体（Mizushima and Nagata, 1990）などを含む。オステオプロテグリン（Osteoprotegrin）（ＯＰＧ、破骨細胞阻害因子−ＯＣＩＦとしても知られる）と呼ばれＴＮＦＲ／Ｆａｓファミリーのメンバーである１つのサイトカイン結合タンパク質は、分泌タンパク質としてのみ存在する可溶性受容体の最初の例であると思われる（Anderson, 1997; Bollon, 1980）。
【００１０】
最近、ＩＬ−１８に高い親和性を有する可溶性タンパク質がヒトの尿から単離され、ヒトおよびマウスのｃＤＮＡが記載された（Novick et al., 1999; 国際公開第９９／０９０６３号パンフレット）。そのタンパク質はＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）と呼ばれている。
【００１１】
ＩＬ−１８ＢＰは、既知のＩＬ−１８受容体の１つの細胞外ドメインではないが、分泌され、通常循環しているタンパク質である。ＩＬ−１８ＢＰは、分泌タンパク質の新しいファミリーに属する。さらに、そのファミリーは、ＩＬ−１８ＢＰに高い相同性を有し、ポックスウイルスにコードされるいくつかのタンパク質を含む（Novick et al., 1999）。ＩＬ−１８ＢＰは脾臓において構成的に発現され、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、ＩＬ−１の２型受容体にわずかな相同性を有する。ＩＬ−１８ＢＰの遺伝子はヒト染色体の１１ｑ１３に位置し、８．３ｋｂのゲノム配列中において膜貫通ドメインをコードするエクソンは見つかっていない（Novick et al., 1999）。
【００１２】
ヒトにおいて４つ、マウスにおいて２つのＩＬ−１８ＢＰのアイソフォームは、ｍＲＮＡスプライシングによって得られ、さまざまなｃＤＮＡライブラリーにおいて見出されており、そして発現され、精製され、ついて結合およびＩＬ−１８の生物学的活性の中和に対して評価されてきた（Kim et al., 2000）。ヒトＩＬ−１８ＢＰのアイソフォームａ（ＩＬ−１８ＢＰａ）は、急速な吸着速度、遅い離脱速度、および３９９ｐＭの解離定数（Ｋ（ｄ））を有し、最も高いＩＬ−１８への親和性を示した。ＩＬ−１８ＢＰｃは、２９のＣ末端アミノ酸を除くＩＬ−１８ＢＰａのＩｇドメインを有し；ＩＬ−１８ＢＰｃのＫ（ｄ）は、１０倍低い（２．９４ｎＭ）。それにもかかわらず、ＩＬ−１８ＢＰａおよびＩＬ−１８ＢＰｃは、２つのモル過剰により、９５％を超えるＩＬ−１８を中和する。ＩＬ−１８ＢＰｂおよびＩＬ−１８ＢＰｄアイソフォームは、完全なＩｇドメインを欠き、ＩＬ−１８に対する結合能力または中和能力を欠く。マウスのＩＬ−１８ＢＰｃおよびＩＬ−１８ＢＰｄのアイソフォームは同一のＩｇドメインを有し、また、２つのモル過剰により、９５％を超えるマウスＩＬ−１８を中和する。しかしながら、ヒトＩＬ−１８ＢＰａとの共通したＣ末端モチーフを有するマウスＩＬ−１８ＢＰｄはまた、ヒトＩＬ−１８を中和する。分子モデルは、ＩＬ−１８ＢＰのＩｇドメインにおいて、多数の混合された静電気性および疎水性の結合部位を同定し、そのリガンドとの結合に対する高い親和性を説明した（Kim et al., 2000）。
【００１３】
最近、インターロイキン１８は、エンドトキシンショック、肝炎および自己免疫糖尿病を含む慢性炎症疾患における発病の進行に関連することが示唆された（Kahiwamura and Okamura, 1998）。実験から得られた、肝傷害の発症においてＩＬ−１８が役を果たす可能性の指摘は、ツジらによって公開され（Tsuji et al., 1999）、マウスモデルのリポ多糖で誘導される急性肝傷害においてＩＬ−１８レベルが上昇することが示された。しかしながら、肝傷害の発症において、多機能な因子であるＩＬ−１８のメカニズムは、今までに明らかにされていない。
【００１４】
肝臓の損傷または傷害は、さまざまな原因を有する。それは、たとえばウイルスまたは細菌の感染、アルコール乱用、免疫疾患あるいはガンが原因となり得る。
【００１５】
たとえばＢ型肝炎ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルスによるウイルス性肝炎は、世界中の多くの人々をさいなます、対処が不充分な疾患である。既知の肝炎ウイルスの数は絶えず増加している。Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルスのほかに、ウイルスが関連する肝炎を引き起こす少なくとも４つのほかのウイルスが今までに発見されており、それらはＡ型、Ｄ型、Ｅ型およびＧ型肝炎ウイルスと呼ばれている。
【００１６】
アルコール性肝疾患は、慢性のアルコール消費に関連したもう１つの広範に存在する疾患である。免疫肝炎は充分に対処されていない稀な自己免疫疾患である。肝傷害にはまた、胆管の損傷も含まれる。原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）は、肝臓内の胆管の破壊によって特徴付けられる自己免疫性肝疾患である。
【００１７】
アルコール性肝炎、肝硬変、ウイルス性肝炎および原発性胆汁性肝硬変などの、疾患による肝臓の損傷がＴヘルパー細胞１（Ｔｈ１）応答に関連することを、いくつかの研究が証明した。１つの研究において、新しい肝傷害モデルは、オボアルブミン含有リポソームの標的を肝臓にすることにより、続くオボアルブミン特異的Ｔｈ１細胞の選択的な移動によって、マウスで確立されたオボアルブミン含有リポソームとＴｈ１細胞の移動との組み合わせによるマウスの処理によって、血清ＩＦＮ−γレベルの上昇と並行して血清トランスアミナーゼ活性の増加が引き起こされる。きわめて対照的に、オボアルブミン特異的Ｔｈ２細胞の移動によって血清ＩＬ−４レベルの上昇が起こるが、肝傷害は誘導されない。肝傷害は、抗ＩＦＮ−γ抗体および抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α抗体によって妨害された。これらの調査結果は、Ｔｈ１細胞が急性肝傷害における主要なエフェクター細胞であることを示す（Nishimura and Ohta, 1999）。ほかの一連の研究において、ＩＦＮ−γを過剰に発現するマウスは、何の病原体またはほかの刺激もなしに、自然に肝炎を示すことが明らかになった（Okamoto et al., 1998）。
【００１８】
ほかの研究は、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）におけるＴｈ１応答の関わりを示した。ＰＢＣは肝臓内胆管の破壊によって特徴づけられる自己免疫性肝疾患である。一般に、とくにＴ細胞を含む細胞の免疫メカニズムによって、この胆管の損傷が引き起こされると思われている。Ｔｈ１応答およびＴｈ２応答の相関強度は、さまざまな自己免疫疾患の疾病生理学（pathophysiology）において重要な因子であることが最近提唱されている。本研究では、２つのＴ細胞のサブセットに特異的なサイトカインの検出、すなわちＴｈ１細胞に対するＩＮＦ−γおよびＴｈ２細胞に対するＩＬ−４の検出によって、ＰＢＣにおけるサブセットのバランスを評価した。ＰＢＣ患者１８人および慢性活動性Ｃ型肝炎、肝臓外胆汁閉塞を含むコントロール疾患患者３５人ならびに正常な肝臓から得られた肝臓切片において、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）陽性細胞が、非放射性インサイチュハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学を用いて数えられた。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のｍＲＮＡを発現する単核細胞は、ＰＢＣの肝臓における炎症性の門脈管に密集したが、肝臓外胆汁閉塞、アルコール性線維症（alcoholic fibrosis）または正常の肝臓切片では稀にしか存在しなかった。コントロールの肝臓と比較して、ＰＢＣの肝臓におけるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のｍＲＮＡ陽性細胞が顕著に多数検出された（Ｐ＜０．０１）。さらに、ＰＢＣの肝臓において、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現はＩＬ−４発現と比較してより共通して検出され、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現レベルは、門脈の炎症活性の程度とより密接に相関した。ＩＦＮ−γのｍＲＮＡ陽性細胞は、リンパの密集によって覆われた損傷のある胆管のいたるところで主に検出された。そのデータは、Ｔｈ１細胞がＰＢＣのリンパの浸潤において、より重要なＴ細胞サブセットであることを示す（Harada et al., 1997）。
【００１９】
ウイルス性抗原認識におけるサイトカインのパターンはまた、ウイルス感染の解消およびウイルス排除において大きな影響を及ぼすものと思われる。ある研究において、Ｔｈ２型応答に対するサイトカインの不均衡性は慢性Ｂ型肝炎における役割を担うのかどうかが調べられた。慢性Ｂ型肝炎に関連する抹消血単核細胞のサイトカインの特徴は、ＲＴ−ＰＣＲによって解析された。Ｂ型肝炎表面抗原（ＨｂｓＡｇ）刺激を受けて、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の発現は、それぞれ４１％、８％、４１％および５０％の患者において検出された。それらのサイトカインの中でも、Ｔｈ１のサイトカインＩＦＮ−γの発現は、肝傷害の典型的なマーカーに相当する高レベルの血清ＡＳＴ／ＡＬＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ／アラニンアミノトランスフェラーゼ）に関連していた。Ｔｈ２型サイトカインは、肝細胞に対して保護効果を発揮することは示されていない。つまり、ＨＢｓＡｇ反応細胞によるＴｈ１サイトカイン、ＩＦＮ−γの産生は、慢性Ｂ型肝炎における肝細胞損傷に関連していた（Lee et al., 1999）。高レベルのＦＡＳリガンドおよびその受容体（ＣＤ９５）は、Ｂ型肝炎の患者の肝臓において報告されている（Luo et al., 1997）。ＦＡＳリガンドは、肝細胞アポトーシスを導く主な細胞毒性薬剤の１つであると考えられる。
【００２０】
ほかの研究により、Ｃ型肝炎ウイルス／ＲＮＡ（ＨＣＶ／ＲＮＡ）陽性の何の処置も受けていない３０人の慢性肝炎患者において、肝傷害の増加に関連する因子が同定された。壊死炎症性および構造上の損傷は、イスハック採点（Ishak's score）を用いて評価された。活性化肝星状細胞（ＨＳＣ）は、α−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）に対する免疫組織化学により視覚化され、モルフォメトリー（morphometry）により定量化された。血漿ＨＣＶ／ＲＮＡは競合的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて評価された。肝傷害の進行に関する免疫応答のタイプを研究するために、ＩＦＮ−γ陽性細胞（Ｔｈ１様応答の発現など）は、免疫組織化学的に評価され、モルフォメトリーにより定量化された。ＨＳＣは主に小葉の壊死炎症の領域近くまたは線維症の中隔の内壁に近い部分で検出されることが明らかになった。αＳＭＡ陽性およびシリウスレッド陽性実質（Sirius Red-positive parenchyma）は、壊死炎症性および構造上の採点に顕著な相関関係があった。ＩＦＮ−γ陽性細胞は炎症性浸潤に関連する門脈周囲の部分で検出され、構造上の損傷に顕著に相関関係があった。したがって、ＨＳＣ活性化および肝傷害の進行は、Ｔｈ１様応答に関連していることが考えられた（Baroni et al., 1999）。Ｂ型肝炎の場合と同様に、ＦＡＳリガンドおよびその受容体は、Ｃ型肝炎の患者の肝臓および血清において見出された（Hiramatsu et al., 1994; Okazaki et al., 1996; Lio et al., 1998）。
【００２１】
Ｔｈ１サイトカインおよびほかのＴｈ１標識は、アルコール性肝炎および肝硬変に関連していることが明らかにされた。炎症性刺激および脂質の酸化（lipid peroxidation）は、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）を活性化させ、前炎症性の（proinflammatory）サイトカインおよびケモカインをアップレギュレーションさせる。ある研究において、病的な肝傷害、内毒血症、脂質の酸化およびＮＦ−κＢ活性化ならびに前炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインとの不均衡性のあいだの関係について評価された。ラット（各群５匹）は、エタノールと、ヤシ油、トウモロコシ油または魚油といった飽和脂肪を含有する制限食を胃内注入によって与えられた。コントロールラットにおいては、エタノールの代わりに等カロリーのデキストロースとした。脂質の酸化、ＮＦ−κＢならびに前炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１ベータ、ＩＮＦ−γおよびＩＬ−１２）、Ｃ−Ｃケモカイン（活性を調節され、正常Ｔ細胞で発現および分泌される［ＲＡＮＴＥＳ］、単球走化性タンパク質［ＭＣＰ］−１、マクロファージ炎症性タンパク質［ＭＩＰ］−１−α）、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（サイトカインによって誘導される好中球化学性誘引物質［ＣＩＮＣ］、ＭＩＰ−２、ＩＰ−１０および上皮好中球活性化タンパク質［ＥＮＡ］−７８）、および抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−４およびＩＬ−１３）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルについて、病的解析が行なわれ、エンドトキシンの測定が行なわれた。ＮＦ−κＢの活性化ならびに前炎症性サイトカインＣ−ＣおよびＣ−Ｘ−Ｃケモカインの上昇した発現は、壊死炎症性の傷害を示すラットにおいて見られた（魚油−エタノールおよびトウモロコシ油−エタノール）。それらの群はまた、エンドトキシンおよび脂質の酸化において最も高いレベルを有した。ＩＬ−１０およびＩＬ−４のｍＲＮＡのレベルは炎症性肝傷害を示す群においてより低かった。したがって、ＮＦ−κＢの活性化は前炎症誘発刺激が存在すると起こり、Ｔｈ１前炎症性サイトカインおよびケモカインの発現増加を生じる（Naji et al., 1999）。ＦＡＳリガンドおよびその受容体はまた、アルコール性肝傷害において増加したため、Ｔｈ１サイトカインがアルコール性肝炎において誘導される自己免疫作用に関連することが再び示唆された（Galle et al., 1995; Taieb et al., 1998; Fiore et al., 1999）。
【００２２】
ＴＮＦ−αはまた、アルコールが関連した肝臓の壊死炎症の発病における通常の経路として明らかにされた。肝臓および血清のＴＮＦの上昇したレベルは、アルコール性肝疾患の動物モデルおよびヒトアルコール性肝疾患において証拠が提供された。この異常調節されたＴＮＦ代謝は、多くの代謝の合併症およびアルコール性肝疾患からなる肝傷害で役割を担うことが仮定される（Grove et al., 1997; McClain and Cohen, 1989）。たとえば、ある研究において、アルコール性肝炎の患者が（平均、２６．３ｎｇ／Ｌ；９５％Ｃｌ、２１．７から３０．９）、正常な被験者（６．４ｎｇ／Ｌ；Ｃｌ，５．４から７．４）よりも高いＴＮＦ−αレベルを有することが明らかにされた。後に死亡した患者（３４．７ｎｇ／Ｌ；Ｃｌ、２７．８から４１．６）は、生存者（１６．６ｎｇ／Ｌ；Ｃｌ、１４．０から１９．２）よりも高いＴＮＦ−αレベルを有していた。アルコール性肝炎の患者において、ＴＮＦ−αレベルは血清ビリルビン（ｒ＝０．７４、Ｐ＝０．０００９）および血清クレアチニン（ｒ＝０．８１；Ｐ＝０．０００３）に正の相関関係を有していた。アルコール性肝炎の患者は、非活動性アルコール性肝硬変の患者（１１．１ｎｇ／Ｌ；Ｃｌ，８．９から１３．３）、および肝疾患ではない重症アルコール中毒患者（６．４ｎｇ／Ｌ；Ｃｌ，５．０から７．８）よりも、高いＴＮＦ−αレベルを有していた。腎臓機能が異常な患者は、アルコール性肝炎の患者よりも低いＴＮＦ−αレベルを有していた（１４．１ｎｇ／Ｌ；Ｃｌ，５．４から２２．８）。したがって、アルコール性肝炎におけるＴＮＦ−αの上昇は、深刻な状態において最も顕著であると考えられ、ＴＮＦ−αは病原体として作用することが示唆された（Bird et al., 1990）。
【００２３】
ＴＮＦはエンドトキシンの多くの生物学的な作用を仲介する。最近の研究により、ＴＮＦ投与により肝傷害が引きおこされること、および、ＴＮＦが肝臓毒素ガラクトサミンの致死性を仲介することが明らかにされた。最も有力なＴＮＦ誘導物質は、エンドトキシンである。アルコール性肝疾患の患者はしばしば内毒血症を有しており、また多くのアルコール性肝炎の臨床的な徴候はＴＮＦの生物学的な作用であることが知られているため、ＴＮＦの活性がアルコール性肝炎の患者において評価された。主なＴＮＦ産生源である抹消血単球からの基礎的およびリポ多糖により刺激されるＴＮＦ放出は、アルコール性肝炎の１６人の患者および健康な１６人のボランティアにおいて測定された。アルコール性肝炎の患者１６人のうち８人、および健康なボランティア１６人のうち２人が、検出可能な自然発生的なＴＮＦ活性を有した（ｐは０．０５以下）。リポ多糖での刺激後、アルコール性肝炎の患者由来の平均的な単球ＴＮＦ放出は、健康なコントロールの単球ＴＮＦ放出に比べて２倍以上顕著に増加した（１ｍｌ当たり２５．３＋／−３．７対１０．９＋／−２．４ユニット、ｐは０．００５以下）。したがって、アルコール性肝炎の患者由来の単球は、健康なボランティア由来の単球と比較して、自然発生的にもリポ多糖刺激によってもＴＮＦ放出を顕著に上昇させることが考察された（McClain and Cohen, 1989）。
【００２４】
リポ多糖（ＬＰＳ）結合タンパク質（ＬＢＰ）およびＣＤ１４は、エンドトキシンによる細胞の活性化において鍵となる仲介の役割を担う。消化管由来のＬＰＳは、アルコール性肝疾患において病的な肝傷害を促進させる働きがあると仮定されている。エタノールを含有する油を４週間胃内に与えられたラットにおいて、そのマウスのクッパー細胞および肝細胞それぞれでのＣＤ１４およびＬＢＰのレベルが上昇したことが証明された。また、ＣＤ１４のｍＲＮＡの発現についても、無髄の細胞において上昇した。促進されたＬＢＰおよびＣＤ１４の発現は、ＬＰＳに誘導されるさまざまな前炎症性サイトカインの発現を急激に上昇させ、アルコール性肝傷害における病的な肝傷害の存在と相関関係を有する（Su et al., 1998; Lukkari et al., 1999）。
【００２５】
関節炎は、関節の炎症からなる疾患である。その関節は、腫脹、コリ、圧通、赤みまたは熱っぽさ（warmth）を示す。その前兆は、体重減少、発熱または虚弱によって表れる。それらの徴候が２週間以上続くとき、炎症性関節炎たとえば慢性関節リウマチがその原因であり得る。関節の炎症はまた、感染によっても引き起こされ、それは敗血性関節炎（septic arthritis）を誘発する。関節炎の最も一般的なタイプは、進行性の関節疾患（骨関節炎）である。
【００２６】
関節炎および関連する病気に対して一般的に処方される医薬は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）である。ＮＳＡＩＤｓはアスピリンおよびアスピリン様薬剤を含む。それらは、関節通、関節のコリおよび腫脹を引き起こす炎症を押さえる。しかしながら、ＮＳＡＩＤｓは、胃の出血を含む多くの副作用を有する非特異的な薬剤である（フレデリック マトソン（Frederick Matsen）（会長）、関節炎に関するワシントン大学の整形外科学科のホームページ、www.orthop.washington.edu）。ＮＳＡＩＤｓに加えて、Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標）、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）阻害剤は、成人の骨関節炎および慢性関節リウマチの徴候および前兆を緩和させるために使用される。それは家族性腺腫様ポリポーシスの患者の治療用にも指示されている。
【００２７】
国際公開第０１／００２２９号パンフレットには、炎症の治療のための腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニストとＣＯＸ−２阻害剤との組み合わせが記載されている。
【００２８】
ＴＮＦアンタゴニストはまた、関節炎の治療のためにも使用される。ＴＮＦアンタゴニストは、たとえば国際公開第９１０３５５３号パンフレットに記載されている。
【００２９】
最近の研究は、インターロイキンＩＬ−１８が関節の代謝において前炎症性の役割を果たすことを示す。オリーら（Olee et al）（1999）は、ＩＬ−１８が関節の軟骨細胞によって産生され、炎症前応答および分解代謝の応答を誘導することを示した。ＩＬ−１８のｍＲＮＡは、軟骨細胞のＩＬ−１βによって誘導される。軟骨細胞は、ＩＬ−１８前駆体を産生し、ＩＬ−１刺激に応答して成熟した形のＩＬ−１８を分泌した。軟骨細胞におけるＩＬ−１８の効果についての研究によって、さらに、ＩＬ−１８がＴＮＦ−βによって誘導された増殖を阻害し、酸化窒素産生を促進させることが示された。ＩＬ−１８は、正常なヒトにおける関節の軟骨細胞において、誘導性の酸化窒素合成、誘導性のシクロオキシゲナーゼ、ＩＬ−６およびストロメライシンを含むいくつかの遺伝子の発現を刺激した。遺伝子発現は、対応するタンパク質の合成に関連していた。ＩＬ−１８による正常なヒトの関節軟骨の処理は、グリコサミノグリカンの放出を上昇させた。これらの調査結果は、軟骨細胞応答を調節し、かつ軟骨の分解に関与するサイトカインとしてＩＬ−１８を認定した。
【００３０】
ヒトの骨関節炎組織におけるインターロイキン−１β−変換酵素（ＩＣＥ）／カスパーゼ−１の局在ならびにインターロイキン−１ベータおよびインターロイキン−１８の成熟におけるその役割は、サハら（Saha et al）によって明らかにされた（1999）。サハらは、正常および骨関節炎（ＯＡ）のヒト軟骨および滑膜におけるカスパーゼ−１の発現および産生について研究し、軟骨細胞のアポトーシスだけでなく、ＩＣＥ、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）およびＩＬ−１８の局所解剖的な分布との関係について調べた。この研究において行なわれた実験によって、ＩＣＥはヒトの滑膜および軟骨のどちらでも発現され合成されることが、正常組織よりもＯＡ組織において研著に多類の染色陽性細胞により明らかにされた。ＩＣＥ産生は優先的に関節の軟骨の表面および中間より上部の層に位置していた。ＯＡの軟骨移植片および軟骨細胞における成熟ＩＬ−１ベータの産生は、ＩＬ−１８陽性細胞の数をも著しく減少させる、特異的なＩＣＥ阻害剤による処理によって完全に妨害される。活性ＩＬ−１ベータとＩＣＥとの関係は、ＩＣＥが前炎症性サイトカインを活性化することによってＯＡの進行を促進させること、およびＩＬ−１８が軟骨の病状に役割を担うことが示唆される。
【００３１】
グラシーら（Gracie et al）（１９９９）は、慢性関節リウマチにおけるＩＬ−１８の前炎症性作用を示唆した。グラシーらは、骨関節炎コントロールに比べて顕著に高いレベルで、慢性関節リウマチの滑膜組織内においてＩＬ−１８のｍＲＮＡおよびタンパク質を検出した。また、インビトロにおいて、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５と、ＩＬ−１８との組み合わせによって、滑膜組織によるＩＦＮ−γ産生が誘導されることが明らかにされた。さらに、コラーゲン／不完全フロイントアジュバントで免疫されたマウスにＩＬ−１８を投与することによって、侵食性の進行、炎症性関節炎が促進されたことから、ＩＬ−１８はインビボにおいて前炎症性であることが示唆される。
【００３２】
しかしながら、今まで、化学化合物のほかに、可溶性受容体またはモノクローナル抗体を用いたＴＮＦαおよびＩＬ−１βの妨害のみが、マウスのコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ、慢性関節リウマチのためのマウスモデル）を押さえることを明らかにされていたため（Williams et al., 1994）、慢性関節リウマチに対する治療として考えられていた。
【００３３】
「慢性または特発性の炎症性腸疾患」という用語は、少なくとも２つの症状、クローン病および潰瘍性結腸炎を含む。どちらも胃腸の管の疾患であり、クローン病は最も一般的には小腸を冒す。また、結腸をも含む場合、潰瘍性結腸炎からの鑑別診断（以下参照）は、問題となり得る。
【００３４】
クローン病における慢性的な炎症および潰瘍化は、急性虫垂炎によく似た小腸閉塞または腹痛のどちらかでたいてい始まり、そのほかの呈示はその合併症に関連している可能性がある。その疾患の進行は慢性的であり、治療しているにもかかわらず、悪化と軽減があり得る。始まりはたいてい成人期初期であり、全体の約半分の場合が年齢２０から３０歳のあいだに始まり、９０％が１０から４０歳のあいだである。
【００３５】
顕微鏡検査によって、総体的な徴候が示される。炎症の関与は断続的であって、集中的または斑点状である。リンパ球および血漿細胞の堆積は、おもに粘膜および粘膜下層で見られるが、たいてい全ての層に影響する（経壁の炎症）。クローン病の典型的な顕微鏡検査による特徴は、カフのリンパ球によって囲まれた顆粒細胞の存在である。特発性の炎症性腸疾患の出現頻度は、かなり地理的に多様性が見られる。それらの疾患は、北ヨーロッパおよび米国の方が、南ヨーロッパ、アフリカ、南アメリカおよびアジアよりも出現率がより高いが、進行する都市化および繁栄は南ヨーロッパおよび日本の一部で高い出現率を導いている（一般的および系統的な病理学、チャーチル リビングストン（Churchill Livingstone）、第３版、2000年、JCE Underwood、Ed）。
【００３６】
クローン病において、まず、発症から３年のあいだに疾患が継続的な緩解となる患者、２つめに３年以上疾患が持続する患者からなる、臨床的に主に２つの群がある。
【００３７】
因果関係が何であっても、炎症性サイトカイン、とくにインターロイキン（ＩＬ）１、２、６および８、インターフェロン（ＩＦＮ）−γならびに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αの産生が上昇したクローン病において、持続性ならびに不適当なＴ細胞およびマクロファージの活性化の証拠がある。クローン病は、腺維症に伴って持続的な（慢性の）炎症によって特徴付けられている。繊維芽細胞の増殖およびコラーゲンの堆積の進行は、抗炎症作用、すなわち繊維芽細胞の供給、マトリックスの合成および炎症細胞のダウンレギュレーションを有するトランスフォーミング増殖因子βによって仲介されるが、多くのほかのメディエーターが関与しているようである。
【００３８】
潰瘍性結腸炎は、大腸に特有でない炎症性の疾患で、たいてい直腸で始まって、さまざまな程度で近辺に広がる。クローン病とは異なり、潰瘍性結腸炎は大腸に限られる。
【００３９】
潰瘍性結腸炎は変化した自己免疫反応の結果であるが、粘膜傷害もまた不適当なＴ細胞の活性化ならびにマクロファージおよび好中球由来のサイトカイン、プロテアーゼおよび反応性酸素代謝物によって受けた間接的な損傷により生じることを示す増大する証拠がある。結腸上皮に対する後者の損傷のメカニズムは、「ただの通りすがりの（innocent bystander）」損傷と呼ばれる。自己免疫に対する証拠は、結腸上皮細胞および内皮細胞に対して向けられた自己反応性のＴリンパ球および自己抗体ならびに抗好中球細胞質自己抗体（ＡＮＣＡ）の存在である。しかしながら、潰瘍性結腸炎は、粘膜傷害が自己抗原に対する免疫的学反応の直接的な結果である自己免疫疾患として考えるべきではない（前述の一般的および系統的な病理学）。
【００４０】
クローン病の治療に関して、ほとんどの人々はまず、炎症の制御を助ける物質メラサミンを含有する薬剤で治療される。その効果が得られない人またはそれに対して耐性のない人は、一般的に５−ＡＳＡ剤として知られるほかのメサラミン含有薬剤を与えられる。メサラミン調合剤の可能性のある副作用は、吐き気、嘔吐、胸やけ、下痢および頭痛を含む。
【００４１】
なかには、炎症を制御するためにコルチコステロイド類が処方される患者がいる。それらの薬剤は、活動性クローン病に対して最も効果があるが、感染に対するより強い感受性を含む深刻な副作用を引き起こし得る。
【００４２】
免疫系を抑制する薬剤はまた、クローン病を治療するために使用される。６−メルカプトプリンおよび関連する薬剤アザチオプリンが、最も一般的に処方される。免疫抑制剤は炎症に貢献する免疫反応を妨害することによって働く。これらの薬剤は、吐き気、嘔吐および下痢のような副作用を引き起こし、感染に対するヒトの抵抗力を低下させ得る。患者がコルチコステロイド類および免疫抑制剤の組み合わせで治療される場合、コルチコステロイド類の投与量は、結局は低下され得る。いくつかの研究において、免疫抑制剤がコルチコステロイド類の有効性を増強させることが示唆されている。
【００４３】
米国食品医薬品局（The U.S. Food and Drug Administration）は、標準的な治療（メサラミン物質、コルチコステロイド類、免疫抑制剤）が効かない中程度から重度までのクローン病の治療のため、および切開、排出フィステルからなる治療のために、インフリキシマブ（infliximab）という薬剤を是認している。クローン病において特別に初期治療として認められているインフリキシマブは、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）モノクローナル抗体である。抗ＴＮＦは、ＴＮＦが腸に到達する前に血流からＴＮＦを除去することによって、炎症を予防する。
【００４４】
抗生物質は、狭窄病、フィステルまたは以前の手術によって引き起こされた、小腸における細菌の過剰増殖の治療に使用される。この一般的な問題は、医師が以下の抗生物質、アンピシリン、スルホンアミド、セファロスポリン、テトラサイクリンまたはメトロニダゾルの１つ以上処方することである。
【００４５】
炎症が静まると、下痢および急激な腹痛はしばしば和らぐが、付加的な薬物治療もまた必要であり得る。ジフェノキシラート、ロペラミドおよびコデインを含む抗下痢剤のいくつかが使用され得る。下痢のために脱水状態の患者は、通常、流体および電解質で治療される。
【００４６】
副作用が減少した、または理想的には副作用がほとんどない、炎症性腸疾患、とくにクローン病および潰瘍性結腸炎の治療ならびに／または予防に効果的な治療が依然として必要とされている。
【００４７】
組織学的および免疫学的観察のどちらも、細胞が仲介した免疫性およびＴ細胞の活性化がＣＤの鍵となる特徴であることを示す。ヒトおよび実験モデルによる研究から、ＣＤにおいて局所的な免疫応答は主にタイプはＴｈ１である傾向にあること（Desreumaux et al., 1997）、およびＩＦＮ−γ、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αなどの局所的に放出されるサイトカインが炎症応答を促進し広げることに寄与すること（Reimund et al., 1996）が示唆される。
【００４８】
サイトカインＩＬ−１８はサイトカインＩＬ−１２と共同して、ＩＦＮ−γの分泌を刺激し、ナチュラルキラー細胞の細胞毒性を促進し、ＴＨ１細胞の分化を刺激することによって、Ｔｈ１が仲介する免疫応答において重要な役割を担う（Uschito et al., 1996）。
【００４９】
ＩＬ−１８はＩＬ−１２、ＩＬ−１２、抗原、マイトジェンおよびほかに可能性のある因子と共に働き、ＩＦＮ−γの産生を誘導する。ＩＬ−１８はまた、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−２の産生を増強し、抗ＣＤ３に誘導されるＴ細胞の増殖を強化し、そしてＦａｓが仲介するナチュラルキラー細胞の殺傷性を上昇させる。成熟ＩＬ−１８は、その前駆体からＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ、カスパーゼ１）によって産生される。ＩＬ−１８受容体は、リガンドの結合に共に働く、少なくとも２つの成分からなる。ＩＬ−１８における高親和性および低親和性の結合部位が、マウスＩＬ−１２で刺激されたＴ細胞において見出され（Okamoto et al., 1998）、多鎖受容体複合体であることが示唆された。２つの受容体サブユニットは、これまで同定されておらず、どちらもＩＬ−１受容体ファミリーに属する（Okamoto et al., 1999）。ＩＬ−１８のシグナルトランスダクションは、ＮＦ−κＢの活性化に関わる（Matsumoto et al., 1997）。
【００５０】
最近、ＩＬ−１８は炎症性腸疾患において何らかの影響を及ぼすことが示唆されている（Pizarro et al., 1999; Monteleone et al., 1999）。
【００５１】
ピザローら（Pizarro et al）（１９９９年）は、結腸の標本においてＩＬ−１８の発現および局在を特徴づけ、クローン病の患者から粘膜細胞の群を単離した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲプロトコルを使用することにより、潰瘍性結腸炎および炎症を起こしていないコントロールの患者に比べて、ＣＤから新たに単離された腸の上皮細胞および粘膜固有層の単核細胞においてＩＬ−１８のｍＲＮＡ転写産物が増加していることが明らかになった。ＩＬ−１８のｍＲＮＡ転写産物は、粘膜固有層の単核細胞よりも腸の上皮細胞においてより豊富であった。外科的に切除された結腸組織の免疫組織化学的解析は、腸の上皮細胞と同様、粘膜固有層の単核細胞（とくに、マクロファージおよび樹状細胞）のどちらともにＩＬ−１８を局在化した。ウエスタンブロット解析によって、組換えおよび成熟ヒトＩＬ−１８タンパク質と一致する１８．３ｋＤａのバンドがＣＤおよびＵＣの腸粘膜バイオプシーにおいて主に見られ、不活性なＩＬ−１８前駆体と一致する２４ｋＤａの第二のバンドが、ＣＤおよびＵＣのバイオプシーから非炎症領域において検出され、非炎症コントロールにおいては単一の形が見られることが明らかになった。
【００５２】
モンテレオンら（Monteleone et al）（１９９９）は、それらの調査結果を確証した。１２人のクローン病患者および９人の潰瘍性結腸炎患者、ならびに炎症性腸疾患でないコントロール由来の、全粘膜腸組織および粘膜固有層の単核細胞について、半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロット解析によってＩＬ−１８に関するテストを行なった。ＩＬ−１８の転写産物は、テストされた全ての試料で見られた。しかしながら、潰瘍性結腸炎およびコントロールに比べて、クローン病の粘膜および粘膜固有層の単核細胞のどちらの試料においても、増加したＩＬ−１８のｍＲＮＡの蓄積が検出された。クローン病において、ＩＬ−１８の転写産物は、関連している部分から採取された粘膜試料においてより豊富であった。成熟ＩＬ−１８と一致する１８ｋＤａのバンドは主にクローン病の粘膜試料において見られた。ＩＢＤでないコントロール由来の粘膜試料において、ＩＬ−１８は２４ｋＤａのポリペプチドとして存在していた。一貫して、活性ＩＬ−１ベータ変換酵素（ＩＣＥ）サブユニット（ｐ２０）は、ＣＤかＵＣ由来の試料のどちらかで発現しているが、ＩＢＤでないコントロール由来の結腸の粘膜において、ＩＣＥは前駆体（ｐ４５）としてのみ合成されていた。
【００５３】
デイヤー（Dayer）（１９９９）は、ＩＬ−１８のさまざまで部分的に矛盾している機能について再検討を行なった。要約すると、ＩＬ−１８は炎症性を増強および低減させるどちらの機能も有する多面作用のインターロイキンである。一方では、ＩＬ−１８はＴＮＦαのように前炎症性サイトカインの産生を増強することによって、炎症を促進する。逆に、ＩＬ−１８はカスパーゼ−１の阻害剤であるＮＯの産生を誘導することで、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の成熟化を妨害し、炎症性を減じさせているのかもしれない。このＩＬ−１８の不明瞭な役割は、炎症性疾患におけるＩＬ−１８阻害剤の有効性を深刻に問うものである。さらに、炎症の調節における無限に多様なさまざまなサイトカインおよびケモカインとの相互作用のため、たった１つの役者だけを妨害することによる炎症性疾患の治療および予防における有効な効果は予想できない。
【００５４】
［発明の要約］
本発明は、ＩＬ−１８の阻害剤がさまざまな疾患および障害の治療および／または予防に効果的であるという調査結果に基づく。
【００５５】
本発明の第一の目的は、肝傷害の治療および／または予防における新しい方法を提供することである。したがって、本発明は急性または慢性の肝傷害の治療および／または予防用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の用途に関する。さらに詳細には、本発明はアルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、免疫性肝炎（immune hepatitis）、劇症肝炎、肝硬変および原発性胆汁性肝硬変の治療および／または予防に関する。
【００５６】
本発明の第二の目的は、関節炎の治療および／または予防における新しい方法を提供することである。したがって、本発明は関節炎の治療および／または予防用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の用途に関する。ＩＬ−１８阻害剤の有効な効果は、疾患の進行の予防だけでなく、疾患の重症度を減じさせることを含む。この調査結果は、前記要約した技術内容からは予想できず、関節炎に関係する１つの特異的な因子、すなわちインターロイキンＩＬ−１８の妨害が、関節炎の緩和または病気にかかった関節炎の関節の治癒までも導くことは結論付けられていなかった。
【００５７】
関節炎のマウスモデルにおいて、ＩＬ−１８阻害剤の投与は顕著に軟骨の侵食を減じることも明らかになっている。このように、本発明はさらに、軟骨破壊の治療および／または予防用医薬の製造においてＩＬ−１８阻害剤の用途に関する。
【００５８】
本発明の第三の目的は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、とくにクローン病および潰瘍性結腸炎の治療および／または予防における新しい方法を提供することである。したがって本発明はまた、ＩＢＤの治療および／または予防用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の用途にも関する。本発明により今では、クローン病患者由来のバイオプシーの粘膜の炎症領域において、ＩＬ−１８のｍＲＮＡおよびタンパク質の濃度が上昇することが明らかにされた。さらに、炎症性腸疾患のマウスモデルにおいて、２つの異なるＩＬ−１８阻害剤が動物を疾患から保護することが明らかにされた。
【００５９】
また、ＩＬ−１８阻害剤および／またはインターフェロンおよび／またはＴＮＦアンタゴニストおよび／またはＣＯＸ−２阻害剤の組み合わせの用途も、本発明によって考えられる。病気にかかった組織または細胞にＩＬ−１８阻害剤を送達するための遺伝子治療的なアプローチを適用するために、本発明のさらなる局面は、その病気にかかった状態の治療および／または予防用の、ＩＬ−１８阻害剤をコードする配列を含む発現ベクターの用途に関する。本発明はさらに、ＩＬ−１８阻害剤の内因性遺伝子の活性化の用途、ならびに肝傷害、関節炎およびＩＢＤの予防および／または治療用のＩＬ−１８阻害剤を発現する遺伝的に作製された細胞の用途に関する。
【００６０】
［発明の詳細な説明］
本発明は、さまざまな疾患および異常におけるＩＬ−１８の阻害剤の有効な効果の調査結果に基づく。
【００６１】
本発明において用語「ＩＬ−１８の阻害剤」は、ＩＬ−１８の産生および／または作用を減じさせ、縮小させ、または部分的、実質的もしくは完全に予防または妨害するというような方法で、ＩＬ−１８産生および／または作用を調節するあらゆる分子を意味する。用語「ＩＬ−１８阻害剤」は、ＩＬ−１８作用の阻害剤だけでなくＩＬ−１８産生の阻害剤をも含むことを意味する。
【００６２】
産生の阻害剤は、ＩＬ−１８の合成、プロセシングまたは成熟化に負の影響を及ぼすあらゆる分子であり得る。本発明によると、阻害剤は、たとえばインターロイキンＩＬ−１８の遺伝子発現のサプレッサー、ＩＬ−１８ｍＲＮＡの転写を減少させるもしくは妨げるまたはｍＲＮＡの分解を導くアンチセンスｍＲＮＡ、正しい折りたたみを損なわせる、または部分的もしく実質的にＩＬ−１８の分泌を妨げるタンパク質、ＩＬ−１８が合成された場合にＩＬ−１８を分解するプロテアーゼ、カスパーゼ１の阻害剤などの、成熟ＩＬ−１８を産生するためにＩＬ−１８前駆体を切断するプロテアーゼの阻害剤であり得る。
【００６３】
ＩＬ−１８の作用の阻害剤は、たとえばＩＬ−１８アンタゴニストであり得る。アンタゴニストは、ＩＬ−１８のリガンド（たとえばＩＬ−１８の受容体など）にＩＬ−１８が結合するための能力を有するＩＬ−１８またはＩＬ−１８結合部位を部分的または実質的に中和するのに充分な親和性および特異性により、ＩＬ−１８分子そのものと結合またはＩＬ−１８分子そのものを隔離することができる。アンタゴニストは、また、ＩＬ−１８／受容体の結合した細胞内で活性化されるＩＬ−１８シグナル伝達経路をも阻害し得る。
【００６４】
ＩＬ−１８作用の阻害剤は、また、可溶性ＩＬ−１８受容体またはその受容体に似た分子、またはＩＬ−１８受容体を妨害する薬剤、またはポリクローナルもしくはモノクローナル抗体などのＩＬ−１８抗体、またはＩＬ−１８とその標的との結合を妨げる分子であってもよく、このようにＩＬ−１８によって仲介される細胞内または細胞外の反応の誘発を減じさせるかまたは妨げる。
【００６５】
本発明の第一の局面によると、ＩＬ−１８の阻害剤は、肝傷害の治療および／または予防用医薬の製造において使用される。好ましくは、本発明は、急性および慢性の肝傷害、よりとくにアルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、免疫性肝炎、劇症肝炎、肝硬変および原発性胆汁性肝硬変の治療および／または予防用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の用途に関する。
【００６６】
本明細書中で使用される肝傷害または肝疾患という用語は、さまざまな病的症状を含む。本発明において観察されたいくつかの症状は、前記「本発明の技術分野」において詳細に述べている。さらに、本発明によって治療および／または予防され得る肝疾患は、たとえば発熱性の肝膿瘍（pyrogenic liver absess）を含む。それはまた最近性肝臓とも呼ばれ、それは肝臓内の膿を産生する場である。肝膿瘍の原因は多様である。肝膿瘍は、盲腸炎、憩室炎または手術された腸などの腹部における感染；血液における感染；胆汁の（肝臓が分泌する）管からの感染；または傷ついた肝臓が感染したときのトラウマから、進行し得る。肝膿瘍を引き起こす最も一般的な生物は、大腸菌、プロテウス バルガリス（Proteus vulgaris）およびエンテロバクター アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）である。出願頻度は、１００００人に１人である。
【００６７】
アルコール性肝疾患は、本発明したがいＩＬ−１８阻害剤を用いて治療および／または予防され得る。アルコール性肝疾患はアルコールの乱用によって引き起こされる急性および慢性の肝臓の炎症を含む。アルコール性肝炎は、通常、何年もの過度の飲酒の後起こる。アルコールの飲用期間が長ければ長いほど、また、アルコールの消費が多くなるほど、肝疾患が発症する確率は高くなる。栄養失調は、アルコール、食欲減退および吸取不良（腸管からの栄養物の不充分な吸収）に由来するカロリーを欠いた結果として発症する。栄養失調は肝臓疾患に関与する。エタノールの肝臓に対する毒性、アルコールによって誘導される肝臓疾患に対する個人的な感受性および遺伝的な因子もまた、アルコール性肝疾患の発症に関与する。
【００６８】
本発明によると、肝硬変はＩＬ−１８阻害剤を用いて治療および／または予防され得る。硬変は、肝臓組織への損傷、肝臓の傷（腺維症；小結節の再生）、肝機能の進行性の減退、腹腔内の過剰の体液（腹水症）、出血異常（凝固障害）、血管内の増圧（門脈圧亢進症）および脳機能異常（肝性脳症）を引き起こす慢性の肝疾患である。損傷し傷ついた肝臓は、血液から老廃物（毒素）を充分に取り除くことができず、傷ついた組織の形成は、肝臓へ向かう腸と脾臓とのあいだの血管内の増圧（門脈圧亢進症）を導く。アルコールの飲みすぎは、硬変を導く原因である。ほかの原因は、感染（肝炎など）、胆汁排水系の疾患および欠陥（胆汁の狭窄または閉塞など）、嚢胞性腺維症ならびに増加した鉄および銅の吸収をふくむ。
【００６９】
硬変のタイプは、疾患の原因に依存している。硬変の合併症は深刻であり得る。米国では、硬変は９番目の主要な死亡原因である。神経学的問題（肝性脳症など）が発症しうる。腹腔における増大した体液の貯蔵（腹水症）は、体のタンパク質の減少、ナトリウムの増加、および肝臓の血管内の増圧（門脈圧亢進症）によって引き起こされる。門脈圧亢進症は、食道（食道静脈瘤）の血管の血圧、サイズおよび充満さの増大を引き起こす。出血および凝固を伴う問題が起こり得る。その血管内の増圧およびその血液凝固を伴う問題は、深刻で生命を脅かす出血の可能性を増大させ得る。
【００７０】
さらに、本発明における「肝傷害」という用語に含まれることを意図される異常は、自己免疫性肝炎である。自己免疫肝炎は免疫系との相互関係により生じる肝臓の炎症である。自己免疫性肝炎は、慢性活動性肝炎のタイプである。細胞の免疫応答は、慢性活動性肝炎の原因になり得る。さまざまな循環自己抗体は、慢性活動性肝炎の患者の血液から見出された。ほかの自己免疫疾患は、慢性活動性肝炎に関連し得るし、または慢性活動性肝炎患者の親族に起こり得る。これらの疾患は、甲状腺炎、真性糖尿病、潰瘍性結腸炎、クーンズ陽性溶血性貧血（Coombs-positive hemolytic anemia）、増殖性糸球体腎炎およびシェーグレン症候群である。危険因子は、それらの疾患を含み得るし、または危険因子は慢性活動性肝炎に関連し得る。出現頻度は１００００人に４人である。
【００７１】
さらに、胆道閉鎖は「肝傷害」という用語の範囲内の疾患である。胆道閉鎖は、通常、産まれる前に（子宮内で）胆道が発達しないことによって引き起こされる胆管の閉塞である。胆道閉鎖は、肝内または肝外の胆管の異常および不充分な発達によって引き起こされる。胆菅系の目的は、肝臓からの老廃物の除去、および脂肪消化に必要な胆汁酸塩の小腸への運搬である。この病気において、肝臓から胆嚢へ流れる胆汁は遮断される。これは、治療しなければ最終的に死に至る、肝臓への損傷および肝硬変を誘導する。
【００７２】
本発明によると、ＩＬ−１８阻害剤は、慢性悪性肝炎（chronic aggressive hepatitice）とも呼ばれる慢性活動性肝炎の治療および／または予防用医薬の製造においても使用され得る。慢性活動性肝炎は肝臓細胞に損傷を与える継続的な肝臓の炎症である。慢性活動性肝炎の原因は、ウイルスの感染、薬物反応／摂取、代謝異常または自己免疫疾患を含む。明らかな原因はないかもしれない。この疾患は、肝傷害、硬変および死を導き得る肝臓細胞の壊死または死滅、活動性の炎症および腺維症によって特徴付けられる。出現頻度は１００００人に１人である。危険因子は、自己免疫疾患、以前に感染したＣ型肝炎、あるいは６ヵ月以上のＡ型肝炎またはＢ型肝炎の抗原陽性である。
【００７３】
慢性持続性肝炎（chronic persistent hepatitis）は軽く、肝臓の炎症に進行しない状態であり、これもまた本発明によると「肝傷害」という用語に含まれる疾患である。
【００７４】
本発明によると、ＩＬ−１８阻害剤は、また原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）の治療および／または予防用医薬の製造においても使用される。ＰＢＣは、肝細胞を損傷させる肝臓内の胆汁の流出の遮断によって起こる炎症症状である。肝臓内の胆管は、未知の原因により炎症を起こす。その疾患は、最も頻繁に中年女性に影響を及ぼす。前兆の始まりはなだらかであり、最初の前兆としては皮膚のかゆみである。肝臓内の胆管の炎症は起こる。そのうち、肝硬変に進行する。その疾患は、自己免疫疾患に関係し得る。出現頻度は１０００００人に８人である。本明細書中で考えられるＩＬ−１８阻害剤は、また、たとえば大量のパラセタモールによって引き起こされる急性肝臓中毒症の治療にも使用され得る。このような急性肝臓中毒症は、偶発的または故意のパラセタモールの過剰な服用量によるものであり得る。
【００７５】
以下の実施例に示されるように、本発明の発明者らは驚くべきことに、ＩＬ−１８阻害剤が劇症肝炎（急性肝炎）の予防および治療においてとくに有効であることを見出した。したがって、本発明は、好ましくは劇症肝炎の予防および／または治療に関する。
【００７６】
本発明の第二の局面によると、ＩＬ−１８阻害剤は、関節炎の治療および／または予防用医薬の製造において使用される。
【００７７】
本明細書中で使用される「関節炎」という用語は、たとえば、関節炎に関するワシントン大学の整形外科学科のホームページ（www.orthop.washington.edu）に定義されているように、全てのさまざまなタイプの関節炎ならびに関節炎の症状、急性および慢性関節炎を含む。関節炎の症状の例としては、強直性脊椎炎、腰痛（back pain）、手根堆積症候群（carpal deposition syndrome）、エーレルス−ダンロー症候群、痛風、若年性関節炎、紅斑性狼瘡、筋炎、骨形成不全、骨粗しょう症、多発関節炎、多発筋炎、乾癬性関節炎、ライター症候群、強皮症、腸疾患を伴う関節炎、ベーチェット病、小児関節炎（children's arthritis）、変形性関節症、腺維筋痛症（fibromyalgia）、感染性関節炎（infectious arthritis）、ライム病、マルファン症候群、変形性関節症、骨壊死、パジェット病、リウマチ性多発筋痛症（Polymyalgia rheumatica）、偽痛風、反射性交感神経性ジストロフィー、慢性関節リウマチ、リウマチ、シェーグレン症候群、家族性腺腫性ポリポーシス（familial adenomatous polyposis）などがある。
【００７８】
好ましくは、本発明によると、ＩＬ−１８阻害剤は、炎症性関節炎の治療および／または予防に対して提供される。炎症性関節炎は、その疾患の持続性、継続性または再発性の推移に基づいて慢性関節炎として分類される。
【００７９】
本発明の好ましい実施態様における炎症性関節炎は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）である。ＲＡは関節のライニング（lining）（滑膜、１つの上皮の細胞層）および／または内臓において炎症を引き起こす。この疾患は、何年も持続する傾向にあり、通常、体全体の多くのさまざまな関節に影響を及ぼし、ついには軟骨、骨、腱および靭帯に損傷を与え得る。ＲＡによって影響され得る関節は、たとえば首、肩、ひじ、臀部、手首、手、膝、くるぶしおよび足の関節である。多くの場合、ＲＡによって対称的な形式で炎症がおこる。
【００８０】
ＲＡは、米国では人口の約１％で広く行き渡っており、全ての民族および年齢の間で分布している。それは、全世界で起こっており、ＲＡを有する患者において、女性は３対１で男性より数が勝っている。
【００８１】
以下の実施例に示されるように、ＩＬ−１８阻害剤は、軟骨侵食において非常に有効で有益な効果を示すことが証明された。したがって、本発明はさらに、軟骨破壊の治療および／または予防用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の用途、すなわち軟骨保護剤としてのＩＬ−１８の用途に関する。ＩＬ−１８阻害剤は、軟骨の破壊または侵食が起こっているあらゆる症状において使用され得る。軟骨破壊は、関節軟骨の構造的に無傷の状態における進行性の減退である。それは、たとえば慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチまたは骨壊死などの関節軟骨に影響を及ぼす症状において起こるが、たとえば感染性滑膜炎（infectious synovitis）においても起こる。
【００８２】
本発明の第３の局面は、炎症性腸疾患の治療および／または予防用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤の用途に関する。それは、ＩＬ−１８阻害剤がＣＤ患者の炎症粘膜においてアップレギュレーションされたという調査結果に基づく。さらにそれは、さまざまなＩＬ−１８阻害剤の投与は結腸炎のマウスモデルにおいて保護効果を有するという調査結果に基づく。
【００８３】
ＣＤ患者に由来の疾患粘膜におけるＩＬ−１８のアップレギュレーションは、技術分野において既に開示されている（Monteleone, et al. 1999; Pizarro, et al. 1999）。
【００８４】
本発明によって腸粘膜の炎症領域において大量のＩＬ−１８ＢＰの存在が証明されたのち、さらに驚くべきことに、ＩＬ−１８ＢＰを全身に投与したところ、動物モデルにおける結腸炎の発症および症状に対して有効な効果を示すことが見出された。ＩＬ−１８ＢＰは既にＣＤ患者の腸において内因的にアップレギュレーションされているが、以下の実施例において説明されるように、体内で産生することができるＩＬ−１８ＢＰの量は疾患と戦えるほど充分であるとは思えない。
【００８５】
本発明において炎症性腸疾患とは、好ましくは、クローン病または潰瘍性結腸炎である。
【００８６】
本発明の好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、カスパーゼ−１（ＩＣＥ）、ＩＬ−１８に対する抗体、いずれかのＩＬ−１８受容体サブユニットに対する抗体、ＩＬ−１８シグナル伝達経路の阻害剤、ＩＬ−１８と拮抗およびＩＬ−１８受容体を妨害するＩＬ−１８のアンタゴニスト、ならびにＩＬ−１８結合タンパク質、アイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的な誘導体、活性断片または同じ活性を有する循環的に改変されたその誘導体から選択される。
【００８７】
「ＩＬ−１８結合タンパク質」という用語は、本明細書中では「ＩＬ１８ＢＰ」と同義で使用される。それは国際公開第９９／０９０６３号パンフレットまたは１９９９年にノービック（Novick）らによって定義されたＩＬ−１８結合タンパク質からなり、２０００年にキム（Kim）らによって定義されたＩＬ−１８結合タンパク質のスプライシング変性体および／またはアイソフォームを含む。とくに、ＩＬ−１８ＢＰのヒトアイソフォームａおよびｃは、本発明によると有効である。本発明においての有効なタンパク質は、グリコシル化または非グリコシル化のものであってよく、尿などの天然源由来のものであってよく、または好ましくは組換え的に産生されてよい。組換え体の発現は、大腸菌のような原核生物の発現系、または真核生物および好ましくは哺乳動物の発現系において行なわれ得る。
【００８８】
本明細書中で使用されるように、「ムテイン」という用語は、天然のＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの１つまたはそれ以上のアミノ残基が異なるアミノ残基に置換または欠失され、または、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの天然の配列に１つまたはそれ以上のアミノ残基が付加され、野生型のＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性のＩＬ−１８ＢＰと比較して、得られた産物の活性があまり変化していない、ＩＬ−１８ＢＰのアナログまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰのアナログを示す。それらムテインは、既知の合成および／または位置指定突然変異誘発技術、またはこの場合に適した他の既知の技術によって製造される。
【００８９】
そのようなムテインは、好ましくは、ＩＬ−１８ＢＰと実質的に類似する活性を有するほど、ＩＬ−１８ＢＰの配列に充分似た、またはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰに充分似たアミノ酸配列を有する。ＩＬ−１８ＢＰのある活性は、ＩＬ−１８に結合する能力である。ムテインがＩＬ−１８との充分な結合能力を有するかぎり、アフィニティークロマトグラフィーの方法などによって、ＩＬ−１８の精製において使用されることができ、ＩＬ−１８ＢＰと実質的に類似した活性を有すると考えることができる。したがって、得られたムテインが、ＩＬ−１８ＢＰと実質的に同じ活性を有するかどうかは、たとえば、放射線免疫検定法またはＥＬＩＳＡ法などラベルされたＩＬ−１８に適当にムテインが結合するかどうか決定するための単純なサンドウィッチ競合アッセイにそのムテインを供することからなるルーチンの実験方法によって、決定されることができる。
【００９０】
本発明において使用されることができる、ＩＬ−１８ＢＰポリペプチドのムテインまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰのムテイン、もしくはそれをコードする核酸は、本明細書中に表現された教授および指導に基づいて、過度の実験をすることなく、当業者によって決まりきった手順で得られる置換ペプチドまたはポリペプチドと実質的に一致する配列の有限の一群を含む。
【００９１】
本発明におけるムテインの好ましい変更は、「保存的な」置換として知られるものである。ＩＬ−１８ＢＰポリペプチドまたはタンパク質またはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰｓの保存的なアミノ酸置換は、メンバー間における置換は分子の生物学的機能を保存しているという、実質的に類似した物理化学的な特性を有する群における同義アミノ酸を含み得る（Grantham, 1974）。とくに挿入または欠失が、たとえば３０以下、好ましくは１０以下のわずかなアミノ酸に関するのみであり、たとえばシステイン残基など機能的構造に重要なアミノ酸の除去または入れ替えをしない場合、アミノ酸の挿入および欠失もまた、その機能を変化させることなく前記配列においてなされることは明らかである。このような欠失および／または挿入によって産生されるタンパク質およびムテインは、本発明の範囲内である。
【００９２】
好ましくは、同義アミノ酸群は表Ｉに表示されているものである。より好ましくは、同義アミノ酸群は表ＩＩに表示されているものであり；最も好ましくは、同義アミノ酸群は表ＩＩＩに表示されているものである。
【００９３】
【表１】

【００９４】
【表２】

【００９５】
【表３】

【００９６】
本発明において使用されるための、ＩＬ−１８ＢＰのポリペプチドもしくはタンパク質のムテイン、またはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰｓのムテインを得るために用いられ得る、タンパク質のアミノ酸置換の産生の例は、マーク（Mark）らによる米国特許第ＲＥ３３，６５３号明細書、米国特許第４，９５９，３１４号明細書、同第４，５８８，５８５号明細書および同第４，７３７，４６２号明細書；コース（Koths）らによる同第５，１１６，９４３号明細書、ナーメン（Namen）らによる同第４，９６５，１９５号明細書、コング（Chong）らによる同第４，８７９，１１１号明細書、リー（Lee）らによる同第５，０１７，６９１号明細書などの周知の方法手順；および米国特許第４，９０４，５８４号明細書に示されたリジンを置換されたタンパク質（Shaw et al）を含む。
【００９７】
「融合タンパク質」という用語は、たとえば体液内において長時間に延びた滞在時間を有する他のタンパク質と融合された、ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰまたはそのムテインもしくは断片からなるポリペプチドのことを指す。ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰは、このようにたとえば免疫グロブリンまたはその断片といった他のタンパク質、ポリペプチドなどと融合され得る。
【００９８】
本明細書中で用いられる「機能的誘導体」は、本技術分野において周知の方法で、残基もしくはＮ末またはＣ末基の側鎖として生じる官能基から調整され得るＩＬ−１８ＢＰｓまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの誘導体、ならびに、そのムテインおよび融合タンパク質を含み、薬学的に許容し得るかぎり、すなわちＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰｓの活性と実質的に類似しているタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物において毒性を与えないかぎり、本発明に含まれる。
【００９９】
それらの誘導体は、たとえば、抗原部位を覆い、体液内でＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰの滞在を延ばし得るポリエチレングリコール側鎖を含み得る。他の誘導体は、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第一もしくは第二アミンを用いた反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（たとえばアルカノイル基または炭素環式アロイル基）で形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、アシル部分で形成される遊離水酸基（たとえばセリルまたはトレオニル残基）のＯ−アシル誘導体を含む。
【０１００】
ＩＬ−１８ＢＰまたはウイルス性ＩＬ−１８ＢＰ、ムテインおよび融合タンパク質の「活性断片」がＩＬ−１８ＢＰと実質的に類似した活性を有する場合、本発明では、該断片として、タンパク質分子のみまたは関連分子もしくはそれと結合する残基（たとえば糖もしくはリン酸塩残基、またはタンパク質分子の集合体または糖残基）を伴うタンパク質分子のポリペプチド鎖の断片または前駆体を含む。
【０１０１】
本発明のさらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤はＩＬ−１８抗体である。抗ＩＬ−１８抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、キメラ、ヒトに適応させた、または完全にヒトのものであり得る。組換え抗体およびその断片は、インビボにおいてＩＬ−１８と結合する高い親和性および低毒性によって特徴付けられる。本発明において用いられる抗体は、病的な症状またはあらゆる徴候または病的な症状に関連する徴候群を極めて軽減または緩和するために充分な期間、患者を治療することができる能力、および低毒性によって特徴付けられる。
【０１０２】
中和抗体は、ＩＬ−１８で免疫されたウサギ、ヤギまたはマウスなどの動物によって容易に作製することができる。免疫されたマウスはとくに、ハイブリドーマの製造するためのＢ細胞の供給源を提供するのに有効であり、その結果、ハイブリドーマは大量の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体を産生するために培養される。
【０１０３】
キメラ抗体は、さまざまな動物種由来の２つまたはそれ以上の切片または一部によって特徴づけられた免疫グロブリン分子である。一般的に、キメラ抗体の可変領域は、マウスモノクローナル抗体のようなヒトではない哺乳動物の抗体由来であり、免疫グロブリンの定常領域はヒトの免疫グロブリン分子由来である。好ましくは、両方の領域およびその組み合わせは、決まりきった手順によって決定されたように低い免疫原性を有する（Elliott et al., 1994）。ヒトに適応させた抗体は、マウスの定常領域をマウスの抗原結合領域は残したままヒトの対応物で置き換えるという、遺伝子工学技術によって創出された免疫グロブリン分子である。得られるマウス−ヒトキメラ抗体は、ヒトにおいて、好ましくは免疫原性が減少し、薬物動態が改善される（Knight et al., 1993）。
【０１０４】
したがって、さらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８抗体はヒトに適応させたＩＬ−１８抗体である。ヒトに適応させた抗ＩＬ−１８抗体の好ましい例は、たとえば欧州特許出願第０９７４６００号明細書に記載されている。
【０１０５】
さらになお好ましい実施態様において、ＩＬ−１８抗体は、完全にヒト由来のものである。ヒトの抗体を産生する技術は、たとえば国際公開第００／７６３１０号パンフレット、国際公開第９９／５３０４９号パンフレット、米国特許第６，１６２，９６３号明細書またはオーストラリア特許第５３３６１００号明細書に詳細に記載されている。完全なヒトの抗体は、好ましくは、全てまたは一部の機能的なヒトのＩｇ座を含み、たとえば異種マウスといったトランスジェニック動物によって産生される組換え抗体である。
【０１０６】
本発明の非常に好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、ＩＬ−１８ＢＰまたはアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的な誘導体、その活性断片または循環的に改変された誘導体である。それらアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質または機能的な誘導体は、とくにＩＬ−１８との結合するというＩＬ−１８ＢＰの生物学的活性を残し、好ましくは、本質的には少なくともＩＬ−１８ＢＰと類似した活性を有する。理想的には、そのようなタンパク質は、非修飾のＩＬ−１８ＢＰと比較して非常に増大した生物学的活性を有する。好ましい活性断片は、ＩＬ−１８ＢＰの活性よりも優れた活性を有するか、もしくはより優れた安定性またはより低い毒性もしくは免疫原性などのさらなる利点を有し、または大量に産生することがより容易であるか、もしくは精製がより容易である。
【０１０７】
ＩＬ−１８ＢＰおよびそのスプライシング変異体／アイソフォームの配列は、２０００年のキムらによるものだけでなく、国際公開第９９／０９０６３号パンフレットまたは１９９９年のノービックらによって提供される。
【０１０８】
ＩＬ−１８ＢＰの機能的誘導体は、安定性、半減期、生物学的利用能、人体による寛容または免疫原性などのタンパク質の性質を改善するために、ポリマーと結合されてもよい。これらの目標を達成するために、ＩＬ−１８ＢＰはたとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合されてもよい。ペギレーション（PEGylation）は、たとえば国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載されている周知の方法によって行なわれる。
【０１０９】
したがって、本発明の好ましい実施態様において、ＩＬ−１８ＢＰはペギレーションされる。
【０１１０】
本発明のさらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、免疫グロブリンの全てまたは一部に融合したＩＬ−１８結合タンパク質の全てまたは一部からなる融合タンパク質である。得られる融合タンパク質が、とくにＩＬ−１８への結合といったＩＬ−１８ＢＰの生物学的活性を保持することは、当業者には理解されるだろう。融合は、直接または、１から３アミノ酸残基の長さ、またはより長いたとえば１３アミノ酸残基の長さの短いリンカーペプチドを介しなるものであってよい。該リンカーは、たとえば配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチド、またはＩＬ−１８ＢＰ配列と免疫グロブリン配列との間に導入されるＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔからなる１３アミノ酸リンカー配列であり得る。得られる融合タンパク質は、体液内での延びた滞在時間（半減期）、増大した特異的な活性、上昇した発現レベルまたは融合タンパク質の精製が容易になるなどの改善された性質を有する。
【０１１１】
好ましい実施態様において、ＩＬ−１８ＢＰはＩｇ分子の定常領域に融合される。好ましくは、それは、たとえばヒトのＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインのような重鎖領域に融合される。ＩＬ−１８ＢＰおよび免疫グロブリンの部分からなる特異的な融合タンパク質の産生は、たとえば国際公開第９９／０９０６３号パンフレットの実施例１１に記載されている。ＩｇＧ₂もしくはＩｇＧ₄、またはたとえばＩｇＭもしくはＩｇＡのような他のＩｇクラスのアイソフォームなど、Ｉｇ分子の他のアイソフォームもまた、本発明における融合タンパク質の産生に適する。融合タンパク質はまた、モノマーまたはマルチマー、ヘテロもしくはホモのマルチマーであり得る。
【０１１２】
インターフェロンは、主に、ウイルス複製および細胞増殖に対する阻害効果のために知られている。たとえば、インターフェロン−γは、免疫および炎症反応を促進するのに重要な役割を果たす。インターフェロンβ（ＩＦＮ−β、Ｉ型インターフェロン）は、抗炎症的な役割を果たすと言われている。トリアンタフィロポーロら（Triantaphyllopoulos et al）（１９９９）によって公開された研究は、疾患のマウスモデル、すなわちコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて明らかにされたように、ＩＦＮ−βが慢性関節リウマチの治療において有効な効果を有することを示した。このＩＦＮ−βの有効な効果は、以下の実施例において確証された。
【０１１３】
本発明は、また、関節炎、とくに慢性関節リウマチの治療用医薬の製造におけるＩＬ−１８阻害剤とインターフェロンとの組み合わせの用途に関する。
【０１１４】
インターフェロンは、また、タンパク質の安定性を改善するためにポリマーと結合され得る。インターフェロンβとポリオールのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との結合は、たとえば国際公開第９９／５５３７７号パンフレットに記載されている。
【０１１５】
本発明の他の好ましい実施態様において、インターフェロンはインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）であり、より好ましくはＩＦＮ−β１ａである。
【０１１６】
ＩＬ−１８産生および／または作用の阻害剤は、好ましくはインターフェロンと同時に、連続してまたは別々に用いられる。
【０１１７】
なおさらなる本発明の実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤はＴＮＦアンタゴニストと組み合わせて用いられる。ＴＮＦアンタゴニストは、いくつかの方法でその活性を発揮する。まず、アンタゴニストは、ＴＮＦエピトープまたはＴＮＦ受容体結合能力を有するエピトープを部分的または実質的に中和するために充分な親和性および特異性により、ＴＮＦ分子そのものに結合またはＴＮＦ分子そのものを隔離することができる（以下「隔離アンタゴニスト」と呼ぶ）。隔離アンタゴニストは、たとえば、ＴＮＦに対して誘導される抗体である。
【０１１８】
さらに、ＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ結合後、細胞表面の受容体によって活性化されるＴＮＦシグナル伝達経路を阻害することができる（以下「シグナリングアンタゴニスト」と呼ぶ）。アンタゴニストの両群は、関節炎とくに慢性関節リウマチの治療に対して、ＩＬ−１８阻害剤と組み合わせて、単独または併用のどちらでも有益である。
【０１１９】
ＴＮＦアンタゴニストは、また、たとえばＴＮＦによって増殖および免疫グロブリン分泌を引き起こすヒトＢ細胞といった、インビトロでの感受性細胞株における本来のＴＮＦ活性に関する効果に対して、決まりきった手順で候補をスクリーニングすることによって容易に同定、評価される。そのアッセイは、アッセイで用いられるＴＮＦのモル量をたとえば０．１から１００倍にした候補アンタゴニストの希釈によるＴＮＦ処方およびＴＮＦなしまたはアンタゴニストのみのコントロールを含む（Tucci et al., 1992）。
【０１２０】
隔離アンタゴニストは、本発明によって用いられる好ましいＴＮＦアンタゴニストである。隔離アンタゴニストの間でも、高い親和性でＴＮＦに結合し、および低い免疫原性を有するポリペプチドが好ましい。可溶性のＴＮＦ受容体分子およびＴＮＦに対する中和抗体は、とくに好ましい。たとえば、可溶性のＴＮＦ−ＲＩおよびＴＮＦ−ＲＩＩは、本発明において有効である。その受容体の細胞外ドメインまたは機能的な部分からなる切断型のそれらの受容体は、本発明によると、よりとくに好ましいアンタゴニストである。切断型の可溶性のＩ型ＴＮＦ受容体およびＩＩ型ＴＮＦ受容体は、たとえば欧州特許第９１４４３１号明細書に記載されている。
【０１２１】
切断型のＴＮＦ受容体は、可溶性であり、尿および血清において３０ｋＤａおよび４０ｋＤａのＴＮＦ阻害結合タンパク質として検出され、それぞれＴＢＰＩおよびＴＢＰＩＩと呼ばれている（Engelmann et al., 1990）。同時的、連続的または別々の、ＴＮＦアンタゴニストおよび／またはインターフェロンを伴うＩＬ−１８阻害剤の用途は、本発明によると好ましい。
【０１２２】
本発明によると、ＴＢＰＩおよびＴＢＰＩＩはＩＬ−１８阻害剤と組み合わせて使用されるための好ましいＴＮＦアンタゴニストである。受容体分子の誘導体、断片、領域および生物学的活性部位は、本発明においても使用することができる受容体分子に機能的に似ている。受容体分子の生物学的に活性な相当物または誘導体は、充分な大きさであって、かつ膜貫通ＴＮＦ受容体との相互作用が阻害または妨害されるような親和性によりＴＮＦと結合できる、ポリペプチドまたは受容体分子をコードする配列の一部をいう。
【０１２３】
さらに好ましい実施態様において、ヒトの可溶性ＴＮＦ−ＲＩ（ＴＢＰＩ）は、本発明によって使用されるＴＮＦアンタゴニストである。天然および組換えの可溶性ＴＮＦ受容体分子ならびにその産生の方法は、欧州特許第３０８３７８号明細書、同第３９８３２７号明細書および同第４３３９００号明細書において記載されている。
【０１２４】
ＩＬ−１８阻害剤は、ＴＮＦ阻害剤と共に、同時的、連続的または別々に使用され得る。有効的には、ＩＬ−１８抗体または抗血清と、ＴＮＦ阻害活性を有するＴＮＦの可溶性受容体との組み合わせが用いられる。
【０１２５】
本発明のさらに好ましい実施態様において、医薬はさらにＣＯＸ阻害剤、好ましくはＣＯＸ−２阻害剤を含有する。ＣＯＸ阻害剤は、本技術分野において周知である。特異的なＣＯＸ−２阻害剤は、国際公開第０１／００２２９号パンフレットにおいて記載されている。
【０１２６】
本発明は、ＩＬ−１８阻害剤および／またはインターフェロンおよび／またはＴＮＦアンタゴニストおよび／またはＣＯＸ−２阻害剤の組み合わせの用途に関する。その組み合わせは、関節炎とくに慢性関節リウマチの治療および／または予防、肝傷害の治療および／または予防、ならびに炎症性腸疾患とくにクローン病および潰瘍性結腸炎の治療および／または予防に適している。その活性成分は、同時的、連続的または別々に使用され得る。
【０１２７】
本発明の好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、約０．０００１から１０ｍｇ／体重ｋｇ、もたは約０．０１から５ｍｇ／体重ｋｇまたは約１から２ｍｇ／体重ｋｇの量で使用される。さらになお好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、約０．１から１０００μｇ／体重ｋｇ、または約１から１００μｇ／体重ｋｇまたは約１０から５０μｇ／体重ｋｇの量で使用される。
【０１２８】
本発明は、さらに、関節炎の症状または関節炎、とくに慢性関節リウマチの予防および／または治療用、肝傷害の治療用、および炎症性結腸炎の治療用の医薬の製造における、ＩＬ−１８阻害剤をコードする配列からなる発現ベクターの用途に関する。したがって、遺伝子治療的アプローチは、その疾患を治療および／または予防に対して用いられる。有効的には、ＩＬ−１８阻害剤はその後インサイチュで発現され、その疾患によって冒された組織または細胞内で直接効率的にＩＬ−１８を妨害するであろう。
【０１２９】
関節炎を治療および／または予防するために、ＩＬ−１８産生および／または作用の阻害剤の配列からなる遺伝子治療ベクターは、たとえば、遺伝子治療ベクターの全身投与に関する、ベクターの希釈、標的細胞または組織への到達および標的化、および副作用などの問題を避けるために、病的な関節へ直接注入され得る。
【０１３０】
通常はＩＬ−１８阻害剤が発現されていない細胞、または充分量ではない阻害剤を発現している細胞において、ＩＬ−１８阻害剤の内因的な産生を誘導および／または促進させるベクターの用途は、本発明においても観察された。そのベクターは、阻害剤またはＩＬ−１８を発現することが所望される細胞において機能的な調節配列からなる。そのような調節配列は、たとえばプロモーターまたはエンハンサーであり得る。その調節配列は、そののち相同組換えによってゲノムの適当な座に導入されてもよく、調節配列と遺伝子とを結合させることにより遺伝子発現が誘導または促進される。その技術は、通常「内性遺伝子活性化」（ＥＧＡ）と呼ばれ、たとえば国際公開第９１／０９９５５号パンフレットに記載されている。
【０１３１】
同じ技術、すなわち、たとえばサイレンシング因子のような負の調節因子をＩＬ−１８の遺伝子座に導入することによって、ＩＬ−１８発現を停止させることができ、したがって、ＩＬ−１８発現のダウンレギュレーションまたは妨害を導くことは、当業者によって理解されるだろう。そのようなＩＬ−１８発現のダウンレギュレーションまたはサイレンシングが、疾患を予防および／または治療するためのＩＬ−１８阻害剤の用途として同じ効果を有することは、当業者に理解されるだろう。
【０１３２】
本発明はさらに、肝傷害、関節炎または炎症性腸疾患の治療および／または予防用医薬の製造における、ＩＬ−１８阻害剤を産生するための遺伝子的に改変された細胞の用途に関する。
【０１３３】
本発明はさらに、治療に有効量のＩＬ−１８阻害剤および治療に有効量のインターフェロンからなる、炎症性関節炎、肝傷害または炎症性腸疾患の予防および／または治療にとくに有効な、医薬組成物に関する。ＩＬ−１８阻害剤として、その組成物はカスパーゼ−１阻害剤、ＩＬ−１８に対する抗体、あらゆるＩＬ−１８受容体サブユニットに対する抗体、ＩＬ−１８シグナル伝達経路の阻害剤、ＩＬ−１８と競合しＩＬ−１８受容体を妨害するＩＬ−１８のアンタゴニスト、ならびにＩＬ−１８結合タンパク質、アイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的な誘導体、同じ活性を有するその活性断片または循環的に改変された誘導体からなり得る。
【０１３４】
前記ＩＬ−１８ＢＰおよびそのアイソフォーム、ムテイン、融合タンパク質、機能的な誘導体、活性断片または循環的に改変された誘導体は、医薬組成物の好ましい活性成分である。
【０１３５】
医薬組成物に含まれるインターフェロンは、好ましくはＩＦＮ−βである。
【０１３６】
なお他の好ましい実施態様において、医薬組成物は、治療に有効量のＩＬ−１８阻害剤、任意にはインターフェロンおよびＴＮＦアンタゴニストを含有する。ＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦ活性を中和する抗体、または可溶性の切断型ＴＮＦ受容体の断片であり得、ＴＢＰＩおよびＴＰＢＩＩとも呼ばれる。本発明の医薬組成物は、さらに１つまたはそれ以上のＣＯＸ阻害剤、好ましくはＣＯＸ−２阻害剤を含有する。
【０１３７】
「薬学的に許容し得る」という定義は、活性成分の生物学的活性の効果を妨げず、投与される宿主に対する毒性がないあらゆる担体を含むことを意味する。たとえば、非経口投与において、活性タンパク質は、食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー溶液などのビヒクルで注射用の単位投与量に処方されてもよい。
【０１３８】
本発明の医薬組成物の活性成分は、さまざまな方法で個体に投与されることができる。投与経路は、皮内、経皮的（たとえば、徐放性の処方で）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外麻酔、局部および鼻腔内の経路を含む。その他に、たとえば上皮または内皮組織を介した吸収作用、または活性剤をコードするＤＮＡ分子を（ベクターを介して）患者へ投与し、インビボでその活性剤を発現および分泌させる遺伝子治療を、治療に有効な投与経路として用いることができる。さらに、本発明におけるタンパク質は、薬学的に許容し得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤、ビヒクルなどの他の生物学的活性剤の構成要素と共に投与することができる。
【０１３９】
非経口（たとえば、静脈内、皮下、筋肉内）投与において、薬学的に許容し得る非経口ビヒクル（たとえば、水、食塩水、デキストロース溶液）および等脹を維持する添加物（たとえばマンニトール）または化学的安定性を維持する添加物（たとえば防腐剤および緩衝液）に関連して、活性タンパク質は、溶液、懸濁液、乳液または親水性の粉末として処方されることができる。その処方は、よく用いられる技術によって滅菌される。
【０１４０】
本発明において活性タンパク質の生物学的利用能もまた、たとえばＰＣＴ特許出願の国際公開第９２／１３０９５号パンフレットに記載されているように、分子をポリエチレングリコールに結合するなど、ヒトの体内で分子の半減期を延ばす接合方法を用いることによって改良されることができる。
【０１４１】
活性タンパク質の治療に有効な量は、アンタゴニストのタイプ、ＩＬ−１８に対するアンタゴニストの親和性、アンタゴニストによって示された未解決の細胞毒性の活性、投与経路、患者の臨床状態（内因性のＩＬ−１８活性を毒性がないレベルに維持することの望ましさを含む）を含む、要素の相互関係であるだろう。
【０１４２】
「治療に有効な量」とは、投与されると、ＩＬ−１８阻害剤が、ＩＬ−１８の生物学的な活性を阻害する結果となるような量である。単回投与または複数回投与として固体に投与される用量は、ＩＬ−１８阻害剤の薬学動態的性質、投与経路、患者の症状および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、大きさ）、徴候の程度、同時進行中の治療、治療頻度および望ましい効果を含むさまざまな因子に依存して変化するだろう。確立された投与量の範囲の調節および取扱いは、個体においてＩＬ−１８の阻害を測定するインビトロおよびインビボでの方法と同様、当業者の能力の範囲内で充分である。
【０１４３】
本発明において、ＩＬ−１８阻害剤は、約０．０００１から１０ｍｇ／体重ｋｇまたは約０．０１から５ｍｇ／体重ｋｇ、もたは約０．０１から５ｍｇ／体重ｋｇまたは約０．１から３ｍｇ／体重ｋｇまたは約１から２ｍｇ／体重ｋｇの量で使用される。さらに好ましいＩＬ−１８阻害剤の量は、約０．１から１０００μｇ／体重ｋｇまたは約１から１００μｇ／体重ｋｇまたは約１０から５０μｇ／体重ｋｇの量である。
【０１４４】
本発明において好ましい投与経路は、皮下経路による投与である。筋肉内投与は、本発明においてさらに好ましい。
【０１４５】
さらに好ましい実施態様において、ＩＬ−１８阻害剤は、毎日または１日おきに投与される。
【０１４６】
毎日の投与は、望ましい結果を得るために有効な、間隔をあけた投与または持続的な放出処方で通常与えられる。２回目または継続的な投与は、個体に最初またはあらかじめ投与された用量と同じ、それ以下またはそれ以上の用量で行なわうことができる。２回目または継続的な投与は、病気の襲来中またはそれ以前に投与されることができる。
【０１４７】
本発明において、ＩＬ−１８阻害剤は、治療に有効な量で、ほかの治療養生法または薬剤（たとえば多様な薬剤養生法）とともに、とくにインターフェロンおよび／またはＴＮＦアンタゴニストおよび／またはＣＯＸ阻害剤とともに、あらかじめ、同時または連続的に、個体に予防的または治療的に投与されることができる。他の治療薬と同時に投与される活性剤は、同じまたは異なる組成物において投与されることができる。
【０１４８】
本発明はさらに、薬学的に許容し得る担体と共に、有効量のＩＬ−１８阻害剤および／またはインターフェロンおよび／またはＴＮＦアンタゴニストおよび／またはＣＯＸ阻害剤を混合することからなる医薬組成物の製造方法に関する。
【０１４９】
今や本発明を説明したが、実例として提供され本発明を制限しようとすることを意図されていない以下の実施例を参考にすることによって、容易に理解されるだろう。
【０１５０】
［実施例］
第一部：肝傷害におけるＩＬ−１８インヒビターの用途に関する実施例１から８実施例１：ＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓタグ（His tag）の産生
Ｈｉｓタグを含有する、精製された組換えヒトＩＬ１８ＢＰ（r-hIL-18BP-His タグ）は、ＣＨＯ細胞で産生された。真核細胞での組換えタンパク質の産生は、当業者にとって周知である。ＩＬ−１８ＢＰをコードするＤＮＡを運び、かつ組換えＩＬ−１８ＢＰを産生するための真核細胞へのトランスフェクションに適する適当なベクターを構築するために、周知の方法を利用することができる。細胞における発現においては、ＩＬ−１８ＢＰをコードするＤＮＡ（たとえば（Novick et al., 1999）参照）は切り出され、細胞へのトランスフェクションに適する発現ベクターに挿入される。あるいはまた、そのようなＤＮＡは適当なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲによって調製することができる。得られたｃＤＮＡ構築物はついで、本分野における周知の技術により、適当に構築された真核細胞の発現ベクターに挿入される（Manaitis, 1982）。その組換えタンパク質は９５％以上の精度で精製され、そのリガンドに対する高い親和性を有しインビトロおよびインビボにおいて生物学的に活性であることが明らかにされた。
【０１５１】
実施例２：マウスモデルにおける、内毒素誘導死に対するＩＬ１８ＢＰの保護効果
マウスモデルは、リポ多糖（ＬＰＳ）の高い投与量に対して、ＩＬ−１８の阻害剤であるＩＬ１８ＢＰがマウスを保護するかどうかをテストするために使用した。ＬＰＳは急性の肝傷害を誘導し、つづいてマウスは急死する。
【０１５２】
４ｍｇ／ｋｇの組換え体である、Ｈｉｓタグを含むヒトＩＬ−１８ＢＰ（ｒｈＩＬ１８ＢＰｈｉｓ）（そのタンパク質の組換え産物から得られた）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへ腹腔内（ｉ．ｐ．）注射された。１時間後、６０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳが、注射された（致死量）。マウスの生存は、ＬＰＳのみ（ＩＬ１８ＢＰなし）を投与された動物群と比較された。
【０１５３】
３日間で全ての動物が死んだコントロールマウスとは対照に、ｒｈＩＬ−１８ＢＰ−ｈｉｓを注射されたマウス７匹中５匹が、ＬＰＳ注射から生き残った。
【０１５４】
血液試料は、ｒｈＩＬ−１８ＢＰ−ｈｉｓの量を増加せずに、または増加してＬＰＳ注入から５時間後に採取され、循環するＩＦＮ−γに対するＥＬＩＳＡによって解析された（図１）。０．４および４ｍｇ／ｋｇのｒｈＩＬ−１８ＢＰは、血清ＩＦＮ−γを２分の１にした。低い投与量のｒｈＩＬ−１８ＢＰ（０．００４および０．４ｍｇ／ｋｇ）では、この阻害は失われた。
【０１５５】
実施例３：ＩＬ１８ＢＰは疾患のマウスモデルにおける肝傷害に対して保護効果を有する
劇症肝炎のマウスモデルは、ＩＬ１８ＢＰの効果をテストするために使用した。プロピオニバクテリウム アクネス（Propionibacterium acnes）（Ｐ．ａｃｎｅｓ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）を続けて投与されると、マウスは急性肝傷害を発症する。
【０１５６】
Ｃ５７ＢＬ／６ Ｐ. ａｃｎｅｓ感受性マウスにＬＰＳを注射する前に、さまざまな時間（１時間、２０分、同時に）でｒｈＩＬ−１８ＢＰ−ｈｉｓ（４；０．４；０．０４；０ｍｇ／ｋｇ）の増加させた投与量を用い、マウスに注射した。ｒｈＩＬ−１８ＢＰ−ｈｉｓがＬＰＳと同じ時間にｉ．ｐ．投与されたとき、生き残るマウスはなく、循環ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのレベルは影響されない。驚くべきことに、ｒｈＩＬ−１８ＢＰ（４および０．４ｍｇ／ｋｇ）は
、図２に示したように、循環アラニンアミノトランスフェラーゼ（肝傷害のマーカー）の７０％の減少を誘導した。
【０１５７】
これに加えて、マウスの生存について調べた（図３）：ｒｈＩＬ−１８ＢＰがＬＰＳの２０分前にｉ．ｐ．で与えられたとき、ＩＬ−１８ＢＰの最も高い２つの投与量（４および０．４ｍｇ／ｋｇ）は、ＩＬ−１８ＢＰの代わりにＮａＣｌを与えられたコントロールマウスと比較して１０時間まで死を遅らせた。
【０１５８】
血清ＩＦＮ−γレベルの測定の結果は、図４に示す。ｒｈＩＬ−１８ＢＰ（４ｍｇ／ｋｇ）は、循環ＩＦＮ−γレベルの９０％および循環アラニンアミノトランスフェラーゼの８０％を阻害した（示すものはなし（not shown））。
【０１５９】
ｒｈＩＬ−１８ＢＰ−ｈｉｓがＬＰＳの１時間前に与えられたとき、生存曲線および循環ＩＦＮ−γレベルは、ｒｈＩＬ−１８ＢＰ−ｈｉｓをＬＰＳの２０分前に与えたときに観察されたものと類似しているが、循環アラニンアミノトランスフェラーゼのレベルは影響されなかった（示すものはなし）。
【０１６０】
これに加えて、マウスの肝組織は、トンネル顕微鏡検査によってだけでなく、ヘマトキシリン−エオシン染色によって解析された。以前に深刻な肝炎を誘導されたマウスの肝臓は、正常な肝組織と比較して深刻な壊死を示した。これとは対照に、ＩＬ−１８ＢＰで処置されたマウスの肝組織は、未処置のマウスより壊死の患部が顕著に少ないことを示した。
【０１６１】
実施例４：抗ＩＬ−１８抗体は致死的内毒血症から保護する
ＩＬ−１８抗体によるＩＬ−１８の妨害が、致死量のバクテリアリポ多糖からマウスを保護するかどうかを評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスはまず、中和ウサギ抗マウスＩＬ−１８抗体（ポリクローナル）、またはコントロールとして正常ウサギ血清（ＮＤＳ）を注射された。抗体処置から３０分後、大腸菌（図５Ａ）またはＳ．チフィムリウム（S. thyphimurium）（図５Ｂ）のどちらか由来のＬＰＳの致死量を注射した。実験は１０〜１２匹マウス／群を含み、２つの異なる場合において２回行なった。
【０１６２】
図５Ａに示されたように、抗−ＩＬ−１８抗血清でのマウスの処置は、４０ｍｇ／ｋｇの大腸菌ＬＰＳによって誘導される死を予防した。正常ウサギ血清で処置されたマウスの１０％の生存に対して、抗−ＩＬ−１８処置後１００％のマウスが生き残った（ｐ＜０．００５）。
【０１６３】
図５Ｂは、抗体で処置されたマウスは、Ｓ．チフィムリウムの致死効果から保護されたことを示す（５０％対０％生存；ｐ＜０．０５）。
【０１６４】
実施例５：ＩＬ−１８およびＴＮＦ−αの妨害は、ＣｏｎＡ−およびＰＥＡ−誘導肝毒性からマウスを保護する
肝毒性の２つの実験モデルは、肝傷害におけるＩＬ−１８およびＴＮＦ−αの役割を評価するために使用した。コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）および緑膿菌（ＰＥＡ）のマウスへの注射は、どちらも肝傷害を誘導し、Ｔ細胞媒介性肝炎のモデルである。
【０１６５】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは抗−ＩＬ−１８抗血清または可溶性ＴＮＦ−α受容体すなわちＴＮＦｓＲｐ５５で前処理された。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルは、肝傷害の指標として測定された（図６）。
【０１６６】
図６に示されたように、ＩＬ−１８抗血清および可溶性ＴＮＦ受容体はどちらも、賦形剤のみのコントロールの注射（ピロゲンなしの食塩水）と比較して、ＣｏｎＡが誘導する血清ＡＬＴレベルを顕著に減少させた。可溶性ＴＮＦ受容体およびＩＬ−１８抗血清の共投与は、Ｃｏｎ−Ａ誘導肝傷害の完全な阻害を導いた。
【０１６７】
図６Ｂに示されたように、ＰＥＡを注射したマウスにおいて、ＴＮＦ−α阻害剤または抗−ＩＬ−１８抗体のどちらかの中和は、それぞれ血清ＡＬＴレベルを９３％および８３％阻害するという結果になった。両方を組み合わせた妨害により、９９％の保護となった。
【０１６８】
実施例６：ＩＬ−１８結合タンパク質の血漿レベルは、慢性肝疾患の患者で上昇する
ＩＬ−１８ＢＰ血漿レベルは、さまざまな病因の慢性肝疾患（ＣＬＤ）患者１３３人、および健康なコントロール３１人において、ＩＬ−１８ＢＰモノクローナル抗体を用いた特異的なＥＬＩＳＡによって測定された。
【０１６９】
ＩＬ−１８ＢＰの血漿レベルは、健康な被験者（４．９６±０．４３ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００１）よりもＣＬＤ患者（１２．９１±０．８９ｎｇ／ｍｌ；平均±ＳＥＭ）において顕著に高かった。肝硬変の患者は肝硬変でないＣＬＤの患者よりも顕著に高いレベルを有した（１９．２３±１．２８ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝６７、対６．４９±０．５１ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝６６、ｐ＜０．００１）。チャイルド−ピュー（Child-Pugh）分類が段階Ｂの患者は、段階Ａの患者よりもＩＬ−１８ＢＰの高いレベルを有した（２２．４８±２．４４ｎｇ／ｍｌ対９．５７±１．２５ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００１）。しかしながら、チャイルドＢおよびＣのあいだでは、顕著な違いはなかった（２２．４８±２．４４ｎｇ／ｍｌ対２０．６２±４．７５ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．７）。ＩＬ−１８ＢＰの血漿レベルは、ＧＯＴ、ビリルビンおよび赤血球沈降速度とは正の相互関係がある。プロトロンビン期間（prothrombin time）は負の相互関係が見られた。
【０１７０】
要するに、その結果は、ＩＬ−１８ＢＰ血漿レベルはＣＬＤにおいて上昇し、かつ疾患の病因とは無関係な疾患の厳しさと相互関係があることを示す。炎症性（proinflammatory）ＩＬ−１８の内因性アンタゴニストであるにもかかわらわず、ＩＬ−１８ＢＰの増加したレベルは、ＣＬＤにおける圧倒的な炎症性メディエーターに対抗するのに充分でないと思われる。
【０１７１】
実施例７：ＩＬ−１８ＢＰによるアルコール性肝炎の阻害
ラットの４群（５匹／群）は、４週間、胃内注入によってエタノールとトウモロコシ油を含む制限食とを与えた。コントロールラットにおいては、エタノールを同量のカロリーのデキストロースに置き換えた。そのラットは、毎日マウスＩＬ−１８ＢＰ（１ｍｇ／ｋｇ）、または食塩水を注射された。病理解析が肝臓切片に関して実施され、血清中の肝臓酵素、ＴＮＦ−α、ＦＡＳリガンド、およびＩＮＦ−γの測定が行なわれた。炎症壊死性（necroinflammatory injury）傷害ならびに肝臓の酵素、ＴＮＦ−α、ＦＡＳリガンドおよびＩＮＦ−γの発現は、食塩水を注射されエタノールを与えられたラットで見られた。
【０１７２】
ＩＬ−１８ＢＰを注射されたラットは、炎症壊死性傷害から保護され、肝臓の酵素、ＴＮＦ−α、ＦＡＳリガンドおよびＩＮＦ−γのレベルが顕著に減少した（＞９０％）。
【０１７３】
実施例８：コンカナバリンＡ誘導肝炎のＩＬ−１８ＢＰによる阻害
Ｂａｌｂ／ｃマウスに毎日、Ｃｏｎ Ａ投与の２時間前に、マウスＩＬ−１８ＢＰ（１ｍｇ／ｋｇ）を注射してまたは注射せずに、１２ｍｇ／ｋｇのコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）を注射した。肝臓の損傷は、肝臓の酵素、ＴＮＦ−α、ＦＡＳリガンドおよびＩＮＦ−γの血清レベルを決定することで評価した。肝炎の組織病理学はコンカナバリンＡのみで処置したマウスと比較した。
【０１７４】
Ｃｏｎ Ａで処置されたコントロールマウスと比較すると、ＩＬ−１８ＢＰでの前処理により、組織病理学的検査において炎症の兆候がないとともに肝臓の酵素および、ＴＮＦ−αの血清レベルを顕著に減少させた。
【０１７５】
第二部：関節炎におけるＩＬ−１８阻害剤の用途に関する、実施例９および１０実施例９：ＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓタグの産生
以下の実施例１０において詳細に記載される実験のために、６残基のＨｉｓタグを含む組換えＩＬ−１８ＢＰ（ｒ−ｈＩＬ−１８ＢＰ−Ｈｉｓタグ）が、ＣＨＯ細胞で産生され、キム（kim）ら、２０００年に記載されたように精製された。その組換えタンパク質は、９５％以上の精度で精製され、そのリガンドに対して親和性を有しインビトロおよびインビボにおいて生物学的に活性であることを明らかにした。
【０１７６】
組換えタンパク質の精製を用意にするタグを用いる、または用いないほかの真核生物の系におけるその組換えタンパク質の産生は、当業者に周知である。ＩＬ−１８ＢＰをコードするＤＮＡを運び、かつ組換えＩＬ−１８ＢＰを産生するための真核細胞のトランスフェクションに適する適当なベクターを構築するために、周知の方法を利用することができる。細胞における発現においては、ＩＬ−１８ＢＰをコードするＤＮＡ（たとえばNovick et al., 1999参照）はクローニングベクターから切り出され、細胞のトランスフェクションに適する発現ベクターに挿入される。あるいはまた、そのようなＤＮＡは適当なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲによって調製できる。得られたｃＤＮＡ構築物はついで、適当に構築された真核細胞の発現ベクターへ、本分野において既知の技術により挿入される（Maniatis et al., 1982）。
【０１７７】
実施例１０：関節炎のマウスモデルにおける内因性ＩＬ−１８の妨害
方法
コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の誘導
先に記載されているように（Plater-Zyberk et al., 1995）、ＣＩＡは、天然の２型ウシコラーゲン（ＣＩＩ）で免疫することによってオスのＤＢＡ／１マウス（８〜１２週齢）において誘導された。ＣＩＩ免疫後２５日から、マウスは疾患の発症について毎日検査された。
【０１７８】
ｒｈＩＬ−１８ＢＰ−６ｈｉｓでの処置
ＣＩＩで免疫されたＤＢＡ／１マウスの処置は、疾患の臨床的な兆候が初めて現れたときに始めた。６ヒスチジンのタグを含む組換え体、ヒトＩＬ−１８ＢＰ（ｒｈ−ＩＬ−１８ＢＰ ６ｈｉｓ）は、コラーゲン処理されたマウスにおいて内因性ＩＬ１８を中和するために使用した。ｒｈ−ＩＬ−１８ＢＰａ ６ｈｉｓは、７日間毎日、５つの異なる濃度１０、３、１、０．５、０．２５ｍｇ／ｋｇ／注射で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射された。その偽薬コントロールマウスには、賦形剤のみ（０．９％ＮａＣｌ）を与えた。
【０１７９】
疾患の進行評価
臨床評価（臨床スコア）
初めて臨床兆候が現れてから、マウスは毎日、その処理が何か知らされていない調査員によって検査された。各肢は疾患の重傷度について採点された（スコア０〜３．５、最大スコア＝１４／マウス）。浮腫（炎症）の進行は、最初に疾患の兆候を示した肢において精密ノギス（プロクテスト（Proctest） ２Ｔ、クロエプリン ランゲンメステクニック社（Kroeplin Langenmesstechnik）製）を用いて測定された。
【０１８０】
疾患の進行は、開始後８日間毎日評価され、その後全てのマウスは犠牲にされ、肢が組織病理学的検査のために集められた。
【０１８１】
軟骨侵食および微視的な炎症の組織病理学的検査
その実験の終了時、すなわち開始から８日後、マウスは殺されて、始めに疾患の兆候が進行した肢は切り離された。関節は固定され、石灰質を除去され、パラフィンに埋め込まれた。その関節の標準切片（５から７μｍ）が作製され、ヘマトキシリン／エオシン／サフラニン Ｏで染色された。各関節は、処置プロトコルを知らない２人の調査員によって採点された（破壊されていない軟骨または骨＝０；局部の軟骨侵食＝１〜２；より広範囲の侵食＝３；全体的な軟骨破壊および骨侵食の存在＝４）。各マウスの最終的なスコアは、採点された関節全ての結果の平均である。微視的な炎症または滑膜炎は、以下のように０から４で採点された：炎症なし＝０；少し厚くなったライニング層（lining layer）および／またはやや下のライニング層（sublining layer）内における細胞の浸潤＝１〜２：厚いライニング層および／やや下のライニング層内のより著しい細胞の浸潤＝３；滑膜炎部分内の細胞の存在、および多くの炎症性の細胞で高度に浸潤された滑膜＝４。
【０１８２】
抗コラーゲン抗体の測定
ウシ２型コラーゲンに対する抗体は、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて調べられた。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの力価が測定された。つまり、プレートは１０μｇのウシコラーゲンで覆われ、その後非特異的結合部位は、０．１Ｍのエタノラミン（シグマ社（Sigma）製）で遮断される。血清を順に１：２希釈したものを添加し、アイソタイプの特異的ヤギ抗マウスペルオキシダーゼ（サザン バイオテクノロジー アソシエイト社（Southern Biotechnology Associates）製、バーミンガム、アラバマ州、アメリカ合衆国）および基質（５−アミノサリシル酸、シグマ社（Sigma）製）を用いてインキュベーションした。プレートは４９２ｎｍで読み込まれた。力価は最大値の半分を与える平均±ＳＤ希釈として表された。
【０１８３】
ＩＬ−６検定
ＩＬ−６のレベルは、市販用のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）製、ミネアポリス、ミネソタ州、アメリカ合衆国）によって測定した。ＩＬ−６の生物活性は、Ｂ９細胞を用いた増殖検定（proliferative assay）によって検出された。つまり、ウェルあたり２００μｌの５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地内の５×１０³のＢ９細胞は、丸底のマイクロタイタープレートに置かれ、基準としてヒト組換えＩＬ−６（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州、アメリカ合衆国）を用いて３日間インキュベーションした。インキュベーションの最後に、０．５μＣｉの³［Ｈ］チミジン（ネン−ドュポン社（NEN-Dupont）製、ボストン、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国（ＵＳＡ））が、各ウェルに加えられた。３時間後、細胞は採取され、チミジンの取り込みが測定された。ＩＬ−６生物活性の検出限界は、１ｐｇ／ｍｌであった。
【０１８４】
統計解析
顕著な違いは、シグマスタッド統計解析プログラム（SigmaStat statistical analysis program）およびグラフパッド プリズム プログラム（GraphPad Prism program）を用いるマン ウイットニー テスト（Mann Whitney test）によって判断された。
【０１８５】
結果
実験モデルマウスＣＩＡ（コラーゲン誘導関節炎）は、関節炎治療剤としてのＩＬ−１８ＢＰの効能を判断するために使用された。ＤＢＡ／１マウスへのコラーゲンおよびフロイント不完全アジュバントの投与は、侵食による炎症性の関節炎の進行を誘導し、ＩＬ−１８ＢＰの治療能力を探るための理想的な機会となる。この目的のために、内因性ＩＬ−１８は、ＩＬ−１８ＢＰを用いて中和され、さまざまな病原性パラメーターにおける効果が評価された。
【０１８６】
投与に関する研究を行なった。コラーゲン誘導関節炎ＤＢＡ／１マウスの３群は、ｉ．ｐ．（腹腔内）に５投与量のＩＬ−１８ＢＰにより治療された（すなわち疾患の発症後）。１０、３、１、０．５または０．２５ｍｇ／ｋｇの濃度のＩＬ−１８ＢＰは、初めて疾患の臨床的兆候が現れた時、投与された。生理食塩水（塩化ナトリウム、ＮａＣｌ）の注入は、コントロールとして使用した。これに加えて、１００００ＩＵのインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）は、この関節炎の実験モデルにおいてＩＦＮの影響を評価するためにｉ．ｐ．で投与された。疾患の重傷度における効果は、先に述べたように、個々の肢を視覚的に採点することによって毎日調べられた。マウスは開始から８日後に犠牲にされた。
【０１８７】
以下の値を計測した。
・視覚的な臨床的スコア（０〜３．５／肢）（図７ＡおよびＢ）
・後肢の場合、最初に疾患を現した肢の関節の膨張／浮腫（ｍｍで、ノギスで計測された）（図８）
・疾患になった肢の数（図９）
・最初に疾患となった肢の侵食スコア（０〜４軟骨破壊、図１０）
・最初に関節炎を発症した肢の組織病理学的検査（図１１）
・抗２型コラーゲン抗体のレベル（図１２）
・ＩＬ−６のレベル（図１３）
【０１８８】
疾患の臨床的な重傷度
図７ＡおよびＢに示したように、その疾患の臨床的な深刻さは、ｒｈＩＬ−１８ＢＰを１ｍｇ／ｍｌ（Ｐ＜０．０１）および０．５ｍｇ／ｍｌ（０．０１＜Ｐ＜０．０５）で処置された群において顕著に減少した。少量のｒｈＩＬ−１８ＢＰ（０．２５ｍｇ／ｋｇ）または大量の１０ｍｇ／ｋｇを与えられたマウスは、偽薬群と類似した臨床的スコアを有した。その投与量が１ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１８ＢＰは、インターフェロンβ（図７Ａ中にＩＦＮｂと記載）とおよそ同じ効果である。
【０１８９】
関節の炎症および肢の膨張（浮腫）
微視的炎症（膨張）は、疾患の発症後１日目から実験の最終日の８日目まで、肢の浮腫を計測することによって研究された。その結果は、図８ＡおよびＢに示す。ＩＬ−１８ＢＰの有効量は、１、３および１０ｍｇ／ｋｇである。少量の投与では肢の膨張に有効な効果は得られなかった。図８Ａおよび８Ｂに示したように、１００００ＩＵの濃度のインターフェロン−β（ＩＦＮｂ）は肢の膨張に有効な効果を示した。
【０１９０】
微視的な滑膜炎は、組織病理学的切片における実験の最後に検出され、スコア（「滑膜炎スコア」）として表された。炎症（膨張）および滑膜炎スコアの結果は、表１に要約している。１および３ｍｇ／ｋｇの投与量のｒｈＩＬ−１８ＢＰを用いた処置では、膨張が減少する傾向にあったが、少量のＩＬ−１８ＢＰを投与する処置は、炎症性の滑膜炎において限られた効果しかない（表１）。
【０１９１】
【表４】

【０１９２】
図９は、疾患によって冒された肢の数がＩＬ−１８ＢＰの投与後減少したことを示す。とくに、１および０．５ｍｇ／ｋｇの投与量でのＩＬ−１８ＢＰの治療的注入は、疾患になる肢の数を減少させ、インビボでのＩＬ−１８の妨害によってほかの肢への関節炎の広がりを停止させることを証明している。１および０．５ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１８ＢＰでの処置は、いくつかの関節炎の関節を正常に回復することをさらに示す。
【０１９３】
関節の破壊からの保護
ｒｈＩＬ−１８ＢＰでのマウスの処置は、関節を破壊から保護する（図１０）。半定量的採点システムは、１０および３ｍｇ／ｋｇで顕著である投与量に関する保護効果を骨の侵食が示すことを証明した（Ｐ＜０．０５、図１０）。１ｍｇ／ｋｇのｒｈＩＬ−１８ＢＰを与えられたマウスは、ビヒクルのみを与えられたマウスよりも少ない侵食を示した。０．５ｍｇ／ｋｇおよび０．２５ｍｇ／ｋｇの投与量では、保護は観察されなかった。興味深いことに、ＩＬ−１８ＢＰが３および１０ｍｇ／ｋｇの投与量での関節保護における効果は、１００００ＩＵのインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）の有効な効果と同等またはさらにより顕著であった。
【０１９４】
図１１は、ＩＬ−１８ＢＰで処置された動物（Ｃ）由来の関節を比較した健康な関節（Ａ）および疾患（Ｂ）の関節の微細構造を示す。実験の最後に、最初に関節炎を発症した肢から切断をとった。
【０１９５】
関節炎のマウスからの関節は、炎症した滑膜において軟骨の減少および侵食ならびに大量の炎症性細胞を伴う、深刻な破壊的な関節炎を示した。ｒｈＩＬ−１８ＢＰで処置されたマウスからの関節では、滑膜部分に炎症性の細胞が存在しているのにもかかわらず、軟骨はほとんど正常であった。大量に軟骨が存在しているだけでなく、その軟骨はより滑らかな状態であった。
抗ＩＬ−１８処置は、抗２型コラーゲン抗体のレベルを調節する。
【０１９６】
ＣＩＡマウスは、血液循環においてＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗２型コラーゲン抗体のレベルが上昇している。アイソタイプＩｇＧ１の抗体は、ＴＨ２が仲介する疾患に関連し、一方、アイソタイプＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの抗体はＴＨ１を仲介する疾患に関連する。関節炎は通常、ＴＨ１が仲介した疾患と分類される。
【０１９７】
抗２型コラーゲン（ＣＩＩ）ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体アイソタイプは、ＩＬ−１８ＢＰで処置された動物の血清中で測定された（図１２）。ＩｇＧアイソタイプであるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの抗ＣＩＩのレベルは、臨床疾患の４日後または８日後（Ｄ４、Ｄ８）でのＩＬ−１８ＢＰ処置によっては顕著には調節されなかった。しかしながら、コラーゲン特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比において、ｒｈＩＬ−１８ＢＰ処置の８日後に、１および３ｍｇ／ｋｇでそれぞれ、２．６および３．４倍の減少が観察された。図１２は３ｍｇ／ｋｇでの実験が用いられたことを示す。本質的に、１ｍｇ／ｋｇの量のＩＬ−１８ＢＰを用いることにより、同じ結果が得られた。抗ＣＩＩ抗体の減少したＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比は、アイソタイプＩｇＧ２ａの抗２型コラーゲン抗体の減少した濃度、およびアイソタイプＩｇＧ１の抗２型コラーゲン抗体の上昇した濃度を示し、このモデルの関節炎では、ＴＨ２に仲介された疾患への変化が示唆された。
【０１９８】
ＩＬ−１８中和後のＩＬ−６レベルの減少
ＩＬ−１８封鎖の効果を洞察するために、ＩＬ−１８ＢＰ処理された動物の血清中でＩＬ−６が計測された。図１３は、生物学的に活性なＩＬ−６レベルが、計測された全ての投与量、すなわちインターフェロン−β（ＩＦＮｂ）とともに１、３および１０ｍｇ／ｋｇでＩＬ−１８ＢＰ処置を受けた動物において、顕著に減少していることを示す。３ｍｇ／ｋｇのｒｈＩＬ−１８ＢＰで処置された動物の血清中で計測されたＩＬ−６の免疫活性レベルは、食塩水で処置された動物と比較して顕著に減少した（Ｐ＜０．００２３）。１、３または１０ｍｇのＩＬ−１８ＢＰまたは１００００ＩＵのＩＮＦ−βで処置された疾患動物のＩＬ−６血清レベルは、健康な動物すなわち炎症性の疾患を有していない動物由来の正常マウス血清（ＮＭＳ）と類似していた。
【０１９９】
これらの調査結果は、疾患の発症中ＩＬ−１８がＩＬ−６レベルを制御していることを証明する。ＩＬ−６は炎症のマーカーであるため、これらの調査結果はＩＬ−１８ＢＰでの疾患マウスの処置がその動物内の炎症を減少させることを示す。
【０２００】
前記略述した実験から、以下の推論が導かれる。
・ＩＬ−１８ＢＰの投与は関節炎の臨床的重傷度を減少させる
・ＩＬ−１８ＢＰはその疾患のさらなる進行または広がりを阻害する
・ＩＬ−１８ＢＰの投与は、浮腫を減少させる
・ＩＬ−１８ＢＰの投与は、軟骨の破壊を減少させる
・ＩＬ−１８ＢＰ治療後、血清ＩＬ−６レベルは減少し、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２
ａ抗ＣＩＩ比は減少する。
【０２０１】
前記データは、疾患発症後のＩＬ−１８生物活性の中和が疾患を調節する抗リューマチ治療に相当することを示す。その結果は明らかに、ＩＬ１８封鎖が関節炎の臨床的進行を減らし、より重要なことには、軟骨および骨の破壊の進行を停止させることを証明している。したがって、ＩＬ−１８ＢＰ、抗ＩＬ−１８抗体による、またはＩＬ−１８を妨害するほかの薬剤によるＩＬ１８の封鎖は、新規な疾患を調節する抗リューマチ治療に相当する。
【０２０２】
前述の記載の特異的な実施態様は、最新の知識、容易な修正を適用することにより、および／またはさまざまな適用に対して適応させることによって、一般的な概念から逸脱することなしにそのような特異的な実施態様を他者が行うことができるように本発明の全体的な特徴を示すものであって、したがって、そのような適応および修正は、開示された実施態様に相当する意味および範囲内に含まれることを意図する。ここに使用されている表現または専門用語は記載のためであって、制限するものではないことは理解されるだろう。
【０２０３】
第三部：炎症性の腸疾患に関する実施例１１および１２
実施例１１：活動性クローン病における内皮細胞およびマクロファージによるＩＬ−１８ＢＰ発現
試料の収集
腸粘膜バイオプシーは、ＣＤまたはＵＣの患者から外科的切除により単離された。平均年齢が３７．８歳（２０〜７８歳の範囲）であり、疾患の継続年数が８．３年（１〜２１年の範囲）の１４人のＣＤ患者（３人の男性および１１人の女性）が含まれる。８人の患者は回腸に疾患があり、６人は結腸に疾患がある。１２人の患者は、免疫抑制剤を処方されている。活動性ＣＤの診断は、組織病理学的検査によって以下の基準、潰瘍の存在、炎症性細胞の増加数および経壁の炎症に基づいて行なわれた。活動性ＣＤの７人の患者および非活動性疾患の７人の患者が同定された。活動性および非活動性のＣＤ患者間で、年齢、疾患、部位、性別、薬剤および疾患継続年数に顕著な違いは見られなかった。５人のＵＣ患者（３人の男性および２人の女性）の平均年齢は、３７．６歳（３０〜４４歳の範囲）であった。全ての患者において、疾患は結腸に位置し、全員が免疫抑制治療を受けていた。平均疾患継続年数は４年（１〜９年の範囲）であった。コントロール試料は、ＩＢＤに関しない疾患において切除を受けた５人の患者からえた（３人の男性および２人の女性）。この群の平均年齢は５５．２歳（２４〜７６歳の範囲）であった。全ての患者において、疾患は結腸に位置している。
【０２０４】
ヒトＩＬ−１８およびＩＬ−１８ｂｐにおける半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡは、ＣＤ、ＵＣまたはコントロールの患者の凍結された腸粘膜から抽出された。ＲＮＡ抽出は、トライゾル（ギブコ社（Gibco）製）を用いて、製品の取扱い説明書にしたがって行なった。得られた試料は、吸光度２６０ｎｍで測定することによって定量化した。もとのＲＮＡは１％のアガロースゲル電気泳動法によって評価された。ｃＤＮＡは、プロメガ逆転写システムを用いて、製品の取扱い説明書にしたがって、１μｇの全ＲＮＡから合成された。ＰＣＲ反応は、１Ｕのアンプリタック（AmpliTaq）ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー社（Perkin Elmer）、ロシュ社（Roche）、アメリカ合衆国）、２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ（アマシャム社（Amersham）製、アメリカ合衆国）、および５０ｐｍｏｌのフォワードおよびリバースＰＣＲプライマーが存在する、全量５０μｌで行なった。反応では、ＰＴＣ−２００ ペルタイターエフェクトサーマルサイクラー（PTC-200 Peltier Effect Thermal Cycler）（エムジェーリサ−チ社（MJ Reaseach）製、アメリカ合衆国）を用いて以下の条件、変性１分間９４℃、アニーリング１分間５５℃および伸長１分間７２℃でインキュベートした。バンドが飽和する前のＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ−１８およびβ−アクチンの最適なサイクル数が決定された（それぞれ３１、２８および２５回）。ＰＣＲプライマーは、公表された配列（ＡＦ１１０７９９、Ｄ４９９５０、Ｘ００３５１）をもとに、以下のようにデザインされた：ＩＬ−１８、リバース ５′−ＧＣＧＴＣＡＣＴＡＣＡＣＴＣＡＧＣＴＡＡ−３′；フォワード ５′−ＧＣＣＴＡＧＡＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＡＡ−３′；ＩＬ−１８ＢＰ、フォワード ５′−ＡＣＣＴＧＴＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＴＧＡＡ−３′；リバース ５′−ＧＣＡＣＧＡＡＧＡＴＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧ−３′；β−アクチン、リバース ５′−ＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＣＴＴＧＡＴＣＴＴＣ−３′；フォワード ５′−ＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣ−３′。試料に混在しているゲノムＤＮＡの増幅を除外するために、ＰＣＲ反応はｃＤＮＡ鋳型の不在下で行なった。ＰＣＲ産物（１０μｌ）は、１×ＴＡＥ緩衝液における１％のアガロースゲル電気泳動法によって解析された。ＰＣＲ産物のサイズは、ゲルの染色後１Ｋｂラダー（ギブコ社製）との比較によって確認された。エチジウム−ブロマイドによって染色されたバンドの相対的な定量は、コダック デジタル サイエンス解析ソフトウェア（Kodak Digital Sciences analytical software）を用いてＵＶ照射下で行ない、標的遺伝子（ｈＩＬ−１８ＢＰ、ｈＩＬ−１８）とハウスキーピング遺伝子（ｈβ−アクチン）との比率として報告された。
【０２０５】
ｈＩＬ−１８ＢＰに対して誘導されるモノクローナル抗体の産生
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、アジュバント（MPL+TDM エマルジョン、ＲＩＢＩイムノケム リサーチ社（RIBI Immunochem Research, Inc.）製）とともにＰＢＳにおけるｒｈＩＬ−１８ＢＰ−６ｈｉｓ（チャイニーズハムスター卵巣細胞から精製されたもの、インターファーム ラボラトリー社、ネセ ジオナ、イスラエル）の５０μｇのアイソフォームを、０日、７日後および２８日後に、内項部（intranuckally）だけでなく四肢の皮下に注入された。３回目の免疫から４日後、リンパ節を得、２．４？ｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（コラゲナーゼＩＶ、ワシントン バイオケミカル社（Worthington Biochemical）製）および０．１％デオキシリボヌクレアーゼ（シグマ社製）によって消化した。単離された細胞は、ついで、ＰＥＧ１０００（フルカ社（FLUKA）製）を用いてＳｐ２／０ミエローマ細胞と融合した。その細胞は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノペクチン、チミジン）の存在下でＤＭＥＭ−Ｆ１２、１０％ＦＣＳ（ギブコ社製）で再び懸濁され、９６穴プレートに５×１０^-4細胞／ｍｌの濃度で配分された。ハイブリドーマ培養上清試料は、直接的なスクリーニング解析で、反応する抗体の存在に対してスクリーニングした。この際、ＥＬＩＳＡプレートはヤギ抗マウスＦ（ａｂ′）₂抗体（ジャクソン イムノ リサーチ社（Jackson Immuno Research）、ミラン アナライティカ（Milan analytica）、スイス）でコートされ、ハイブリドーマ培養上清を添加し、ｒｈＩＬ−１８（組換え大腸菌から精製されたもの、セロノ ファーマシューティカル リサーチ インスティチュート社（Serono Pharmaceutical Research Institute）、ジェネバ（Geneva））を含むまたは含まない、ビオチン標識されたｒｈＩＬ−１８ＢＰ−６ｈｉｓ（記載されているようにＣＯＳ細胞から精製されたもの（Novick et al. 1999））、および最後にＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（シグマ社製）を用いて開発されたストレプトアビジン−ホースラデッシュ ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ジャクソン イムノ リサーチ社、ミラン アナライティカ、スイス）を加えた。中和されない抗体が選択され、サブクローニングされた。本研究において、９５−Ｈ２０すなわちマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体が使用された。
【０２０６】
ＩＬ−１８ｂｐ陽性細胞の位置における免疫組織化学的研究
組織試料は、−８０℃ですばやく凍結保存された。一連の凍結切片（１０μｌ）が得られ、ポリ−L−リジンでコートされたスーパーフロスト／プラス（Superfrost／Plus）ガラススライド（ポリラボ社（Polylabo）製、プラン−レス−オーテス（Plan-les-Ouates）、スイス）に乗せ、氷冷したアセトンで固定した。ヒトＩＬ−１８ＢＰタンパク質の位置は、Ｍａｂ ９５−Ｈ２０を用いて免疫組織化学によって解析された。ＰＢＳによる単時間での水分補給後、２％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（カンセラ社（cansera）製、オンタリオ、カナダ）、１％のヒト血清（ＡＢ⁺血清、トランスフュージョン センター社（Transfusion Center）製、アンネマッセ（Annemasse）、フランス）および０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ社製、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国）で補充されたＰＢＳで３０分間プレインキュベーションされた。内因性ペルオキシダーゼ活性は、ＰＢＳ、２％ＦＣＳ、１％ヒト血清、０．５％ＢＳＡおよび１％過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）（フルカ社製、スイス）溶液に１時間そのスライドを置くことによってブロッキングされた。ＰＢＳですすいだのち、切片をＭａｂ９５−Ｈ２０の希釈されない培養上清で一晩インキュベーションした。ＰＢＳによりさらに洗ったのち、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳにおいてビオチン標識されたヤギ抗マウス抗体（ジャクソン イムノ リサーチ社、ミラン アナライティカ、スイス）（５？ｇ／ｍｌ）とともに、切片を１時間インキュベーションした。染色の感度は、アビジンＤＨ／ビオチン標識されたＨＲＰ複合体（ベクタステイン エライト ＡＢＣキット（Vectastain Elite ABC kit）、ベクターラボラタリー社（Vector laboratories）製、カルフォルニア州、アメリカ合衆国）で３０分インキュベーションすることによって増大された。スライドはそれからＰＢＳで洗われ、ｐＨ５のアセトン緩衝液における３０％のＨ₂Ｏ₂、３,３−アミノ−９−エチル カルバゾール（ＡＥＣ）（シグマ社製）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（メルク社（Merck）製）の溶液を用いて進めた。ヘマトキシン（シグマ社製）を用いた対比染色したのち、切片をグリセロールでカバーし、そしてカバースリップを適用した。マウスＩｇＧ１抗体（ＲアンドＤシステム社（R and D system）製）が、アイソタイプのコントロールとして用いられた。
【０２０７】
ヒトＩＬ−１８ＢＰの細胞内位置を同定するために、二色免疫組織化学的研究が腸粘膜の切片上で行なわれた。ＰＢＳで水分補給されてから１０分後、切片は２％ＦＣＳ、１％ヒト血清および０．５％のＢＳＡで補充されたＰＢＳで３０分間プレインキュベーションされた。内皮細胞との共局在性（colocalization）に対しては、切片は、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡにおいてＦＩＴＣ−複合マウス抗ヒトＣＤ３１（１：５０）（ファーミンゲン社（Pharmingen）製、カルフォルニア州、アメリカ合衆国）を混合したビオチン標識されたＭａｂ ９５−Ｈ２０（２０μｇ／ｍｌ）で一晩インキュベーションされた。マクロファージとの共局在性に対しては、切片は、ＦＩＴＣ−複合抗ヒトＣＤ６８（１：２５）（ダコ社（Dako）製、デンマーク（Denmark））を混合したビオチン標識されたＭａｂ ９５−Ｈ２０（２０μｇ／ｍｌ）で一晩インキュベーションされた。ＰＢＳでの洗いののち、ストレプトアビジン テキサス−レッド（サザン バイオテクノロジー アソシエイト社（Southern Biotechnology Associates）製、アラバマ州、アメリカ合衆国）が添加して１時間おいた。スライドは再びムビオール（moviol）で洗われ、切片をムビオールでコートし、カバースリップを適用した。ストレプトアビジン テキサス−レッドにおいて、ビオチン標識されたマウスＩｇＧ１抗体（ファーミンゲン社製）は、アイソタイプのコントロールとして使用された。
【０２０８】
細胞培養
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）（クロネチクス社（Clonetics）製、サンディエゴ、カルフォルニア州）は、ヒト組換え上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）（１０ｎｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（１？ｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシンおよびアンフォテリシンＢ（５０？？ｇ／ｍｌ）、ウシ脳抽出物（ＢＢＥ）（３ｍｇ／ｍｌ）および２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（クロネチクス社製、サンディエゴ、カルフォルニア州）で補充された内皮細胞増殖培地（ＥＧＭ）を用いて、その製品の取扱い説明書にしたがって培養された。組織培養皿はヒトフィブロネクチン（１０？ｇ／ｃｍ²）（ベーリンガー社（Boehringer）製、マンハイム）でプレコートされた。細胞は加湿した５％ＣＯ₂インキュベーターでインキュベーションされ、実験は継代培養３のＨＵＶＥＣｓを用いて行なわれた。ＨＵＶＥＣｓは、ヒトＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）（ＲアンドＤシステム社製、ドイツ）で２４時間処理された。培養期間の最後に、細胞は収集されてＲＮＡが単離され、ＩＬ−１８ＢＰおよびＩＬ−１８ｍＲＮＡ転写解析のためにＲＴ−ＰＣＲに供された。上清は収集され、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１８ＢＰおよびＩＬ−１８タンパク質発現について解析された。
【０２０９】
ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１は、１０％の熱不活化ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１０Ｕ／ｍｌ）（ギブコＢＲＬ社（Gibco BRL）、ライフテクノロジーズ（Life Technologies））およびβ−メルカプトエタノール（５０？Ｍ）（フルカ社製）で補充されたＲＰＭＩ培地による懸濁培養で維持された。それらを加湿した５％ＣＯ₂インキュベーターでインキュベーションし、１：１０で５日毎に継代培養した。実験から３日前に、ヒト単球細胞は、ビタミンＤ３（８０ｎＭ）（バイオモル リサーチ ラボラトリーズ社（Biomol Research Laboratories）製、アメリカ合衆国）を用いて、０．４×１０⁶細胞個／ｍｌの濃度で分化させ、付着させたままにした。分化してから、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）（カルバイオケム社（Calbiochem）製）、ヒトＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＮＦγ（２０ｎｇ／ｍｌ）が細胞培養物に添加された。４８時間で、上清は収集されＥＬＩＳＡによってＩＬ−１８ＢＰおよびＩＬ−１８タンパク質発現について解析された。
【０２１０】
ヒトＩＬ−１８ｂｐおよびＩＬ−１８産生の測定
サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）の混合物で２４時間刺激を与えなかったＨＵＶＥＣｓおよび与えたＨＵＶＥＣｓから得られた細胞を含まない上清において、ならびに（ＬＰＳ、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）の混合物で４８時間刺激を与えなかったＴＨＰ−１および与えたＴＨＰ−１細胞株から得られた細胞を含まない上清において、ＩＬ−１８ＢＰの存在がＥＬＩＳＡによって評価された。この際、プレートはｒｈＩＬ−１８ＢＰ（アイソフォーム ａ）に対して誘導される捕捉Ｍａｂ（クローン６５７．２７が０．５μｇ／１００？ｌ／穴、インターファーム ラボラトリーズ社製、ネス ジオナ、イスラエル））で一晩コートした。可溶性ｈＩＬ−１８ＢＰは、ついでｒｈＩＬ−１８ＢＰ−６ｈｉｓ（チャイニーズハムスター卵巣細胞から精製されたもの、インターファーム ラボラトリーズ社製、ネス ジオナ、イスラエル）に対して誘導されるウサギポリクローナル抗体（１／１００００希釈）を用いて検出され、次に、アフィニティー精製されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／２００００希釈）（ジャクソン イムノ リサーチ社、ミラン アナライティカ、スイス）とペルオキシダーゼを用いてインキュベーションすることによって検出された。捕捉Ｍａｂ同様ウサギポリクローナル抗体は、ＩＬ−１８ＢＰ特異性を確認するためにウエスタンブロットによって検査された。組換えｈＩＬ−１８ＢＰ−６ｈｉｓは、基準として使用された。ＥＬＩＳＡの感度は１００ｐｇ／ｍｌであった。並行して、ＩＬ−１８のレベルはヒトＩＬ−１８ＥＬＩＳＡキット（ＭＢＬ、イムノテク社（Immunotech）製）を用いて定量化した。ＥＬＩＳＡの感度は１２．５ｐｇ／ｍｌであった。
【０２１１】
ＣＨＯ細胞におけるｈＩＬ−１８ＢＰａ−Ｈｉｓ６の発現
組換えヒトＩＬ−１８ＢＰ（ｈＩＬ−１８ＢＰａ Ｈｉｓ６−ｔａｇ）は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（インターファーム ラボラトリーズ社、ネス ジオナ、イスラエル）から精製された。
【０２１２】
結果
腸バイオプシーにおけるＩＬ−１８ＢＰ ｍＲＮＡ転写産物の発現
ＩＬ−１８ＢＰ ｍＲＮＡ発現に対する解析は、活動性ＣＤ、非活動性ＣＤ、またはＵＣのいずれかの患者から得た結腸外科用試料からの組織ホモジネート、および非炎症腸組織からの組織ホモジネートのＲＴ−ＰＣＲによって行われた（図１４）。ＩＬ−１８ＢＰおよびアクチンの転写産物は、テストされた全ての腸のホモジネートについて検出された。同様に、ＩＬ−１８の転写産物は、ＣＤ、ＵＣまたはＩＢＤでないコントロールのいずれかから得られた全ての組織ホモジネートで見られた（図１４Ａ）。コントロールのアクチンに対するＩＬ−１８ＢＰまたはＩＬ−１８のｍＲＮＡレベルの比は、非活動性のＣＤ、ＵＣおよびＩＢＤでないコントロールの患者のバイオプシーと比較して、活動性ＣＤの患者から得られたバイオプシーにおけるＩＬ−１８ＢＰおよびＩＬ−１８の双方の転写産物の量において、統計学的に顕著に増加すること（以下に説明する）が証明された（図１４ＢおよびＣ）。それらのデータは、活動性ＣＤの粘膜組織においてＩＬ−１８ＢＰはアップレギュレーションされることを示し、ＩＬ−１８ＢＰの発現レベルは、非活動性ＣＤ、ＵＣおよびＩＢＤでないコントロールと活動性ＣＤとでは明らかに区別されるという最初の証拠を提供する。
【０２１３】
腸のバイオプシーにおけるＩＬ−１８ＢＰのｍＲＮＡ転写産物の発現に対する統計学的解析
分散解析が行なわれ、利用できる全てのデータとともに集められた。出力により、活動性ＣＤ群における１人の患者の結果に関して明らかに統計的部外者であると示された（ＩＬ１８に対する非常に高いＯＤ比、すなわち１６２５２、およびＩＬ１８ＢＰに対して非常に低いＯＤ比、すなわち１０５８）。この単一で非常に変則的な一組の測定は、ＡＮＯＶＡモデルを立証させるものではない（残りの常態に対するシャピロ−ウィルクス（Shapiro−Wilks）のテストのＰ値）。したがって、統計的解析において、この一組の測定は採用しないことに決定した。
【０２１４】
ＡＮＯＶＡモデルは、因子群（コントロール、活動性ＣＤ、非活動性ＣＤおよびＵＣ）、タンパク質（ＩＬ−１８またはＩＬ−１８ＢＰ）、および患者数（２３人）を考慮して使用された。群のあいだで顕著な違いがあった（Ｐ値＜０．０００１）。興味深いことに、ＩＬ−１８とＩＬ−１８ＢＰとの間のＯＤ比の違いが顕著でないことにも気がついた（Ｐ値＝０．３６９）。さらに、ＩＬ−１８発現とＩＬ−１８ＢＰ発現との相互関係についても行なった。ＩＬ−１８とＩＬ−１８ＢＰとのあいだの相互関係の係数は、０．６７に等しく、このことは、ＩＬ−１８およびＩＬ−１８ＢＰにおいて測定されたＯＤ比のあいだの強いつながりを示唆する。その群の影響に関する結果に加え、異なる群を比較するためにシェフェの方法が用いられた。活動性ＣＤに対するＯＤ比は、ＩＬ−１８ＢＰおよびＩＬ−１８の両方の発現に対して、コントロール（＋３２８０）、ＵＣ（＋２５９０）ならびに、とくに非活動性ＣＤ（＋４５８０）に対するＯＤ比よりも顕著に値が大きいということが結論付けられた。
【０２１５】
腸組織におけるＩＬ−１８ＢＰの免疫組織化学的位置
インサイチュでのＩＬ−１８ＢＰの細胞内での発現を評価するために、抗ｈＩＬ−１８ＢＰ特異的モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学を、活動性ＣＤの患者およびＩＢＤでないコントロールから得られた腸組織から調製された凍結切片において行なった。ＩＬ−１８ＢＰ陽性細胞は、粘膜固有層、粘膜下組織および筋層内において検出された（示されていない）。陽性に染色された単核細胞が、豊富な細胞質、小胞の網状の核を有する粘膜固有層および粘膜下組織に存在し、それは構造的に組織マクロファージと一致した。筋層においては、陽性に染色された細胞は豊富な細胞質を有し、しばらく開いた中央の管腔であったため、毛細血管が陽性に染色されたものと示唆され、構造的には内皮細胞と一致した。大きな血管もまた、抗ｈＩＬ−１８ＢＰモノクローナル抗体によって特異的に染色された。ＲＴ−ＰＣＲ解析によって観察されたＩＬ−１８ＢＰの増加した発現と相互関係のあるＩＢＤでないコントロールから得られた試料と比較したとき、陽性に染色された細胞の顕著な増加が、活動性ＣＤの患者から得られた試料において観察された。近接した切片は、対応するマウスのアイソタイプコントロールでインキュベーションした。
【０２１６】
粘膜バイオプシーにおけるｉｌ−１８ｂｐ産生細胞の存在の同定
炎症した腸組織に存在するＩＬ−１８ＢＰ陽性細胞は、マクロファージの特異的なマーカー（抗ＣＤ６８）、および内皮細胞（抗ＣＤ３１）を用いて同定された（示されていない）。ＣＤ６８陽性細胞（緑）およびＩＬ−１８ＢＰ陽性細胞（赤）は、活動性ＣＤからの腸組織の粘膜固有層および粘膜下組織内で検出された（示されていない）。マクロファージおよび内皮細胞もまたＩＬ−１８ＢＰに対して陽性であることを確かめるために、両方の色、抗ＣＤ６８または抗ＣＤ３１からの緑および抗ＩＬ−１８ＢＰからの赤について解析され、それとともに抗ＩＬ−１８ＢＰ抗体と結合する全ての細胞がＣＤ６８陽性またはＣＤ３１陽性のどちらかであることを証明した（橙色〜黄色の色）。その二重免疫染色によって、マクロファージおよび内皮細胞は、ＣＤの患者から得られた炎症組織内で染色されるＩＬ−１８ＢＰの主な産生源であることが証明された。
【０２１７】
内皮細胞によるｉｌ−１８ｂｐのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現
ヒト内皮細胞のＩＬ−１８ＢＰの産生能力を調べることとともに、トータルバイオプシーにおける免疫染色およびＲＴ−ＰＣＲによって明らかにされた結果を確かめるために、さらに、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）においてＲＴ−ＰＣＲを行なった（図１５Ａ）。内皮細胞は、サイトカインの混合物（ｈＩＬ−１β、ｈＴＮＦα、ｈＩＦＮγ）で処理され、２４時間後ＲＮＡ抽出およびＰＣＲ解析のために収集された。コントロールのアクチンのｍＲＮＡレベルに対するＩＬ−１８ＢＰの比により、２４時間後刺激されなかった細胞と比較して、処理された細胞における、ＩＬ−１８ＢＰの転写産物の量が増加していることを証明した。さらに、ＩＬ−１８ＢＰのｍＲＮＡは、内皮細胞において構成的に発現されているように思われる。そのＩＬ−１８ＢＰのｍＲＮＡレベルもまた解析され、処理された細胞においてわずかな増加が証明された。しかしながら、ＩＬ−１８ＢＰのｍＲＮＡは、刺激されていない内皮細胞においては発現されていなかった。
【０２１８】
刺激されていない細胞（培地）および２４時間処理されたＨＵＶＥＣｓの培養上清を用いたＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−１８ＢＰは両培地に存在し、刺激された細胞で２４時間の刺激ののちに３０倍に増加することが示された（図１５Ｂ）。
【０２１９】
単球細胞株（ＴＨＰ−１）によるＩＬ−１８ｂｐタンパク質の発現
ＩＬ−１８およびＩＬ−１８ＢＰの発現は、刺激されていないおよび刺激された分化したＴＨＰ−１細胞の培養上清において、ＥＬＩＳＡによって解析された（図１５Ｃ）。この実験により、ＬＰＳ、ｈＩＬ−１β、ｈＴＮＦα、ｈＩＦＮγでの４８時間の刺激の後、ＩＬ−１８ＢＰ発現の増加が示された。並行して、ＩＬ−１８の分泌は、刺激後増加した（図１５Ｃ）。
【０２２０】
要約
本研究において、ＩＬ−１８ＢＰの発現、ならびにクローン病および潰瘍性結腸炎の患者から得られた粘膜組織内での位置が特徴づけられた。半定量的ＲＴ−ＰＣＲプロトコルの使用により、潰瘍性結腸炎および炎症でないコントロールの患者と比較して、活動性クローン病患者の粘膜バイオプシーにおいて、ＩＬ−１８ＢＰのｍＲＮＡ転写産物が増加していることが明らかになった。粘膜バイオプシーの免疫組織化学的解析により、ＩＬ−１８ＢＰタンパク質は、内皮細胞内およびクローン病の粘膜に浸潤するマクロファージに位置していた。内皮細胞および活性化マクロファージによるＩＬ−１８ＢＰ発現は、まず、インビトロにおいて刺激されたヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）およびＴＨＰ−１単球細胞株で確認された。刺激の後、それらの細胞は生物活性のあるＩＬ−１８ＢＰを分泌した。
【０２２１】
実施例１２：ＩＬ−１８阻害剤での処置は、実験的な結腸炎を改善する
材料と方法
マウスおよび結腸炎の誘導
オランダのアムステルダム大学の動物研究倫理委員会は、全ての実験を承認している。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ハーラン スプラーク ダウリー社（Harlan Sprague Dawley Inc）から得た（ホルスト（Horst）、オランダ）。マウスは標準状態で飼い、飲み水と食べ物を与えた（ＡＭ−ＩＩ、１０ｍｍ、ホープ ファームズ社（Hope Farms）製、ウーエルデン（Woerden）、オランダ）。
【０２２２】
実験は、８および１０週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスで行なった。結腸炎は、４０％エタノール（メルク社、ダームスタッド（Darmstadt）、ドイツ）に溶かした２ｍｇの２，４，６−トリニトロベンゼン硫酸（ＴＮＢＳ）（シグマ ケミカル社（Sigma Chemical Co）、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国）を、肛門から３センチメートルの位置に定められたビニルカテーテルを用いて、２回直腸投与することによって誘導された（１群につきマウス１０匹）。点滴中に、マウスはイソフルラン（１−クロロ−２，２，２−トリフルオロエチルイソフルラン−ジフルオロメチル−エーテル、アボット ラボラトリーズ社（Abbott Laboratories Ltd.）製、クイーンボロウ（Queenborough）、ケント州、ＵＫ）を用いて麻酔され、点滴の後、６０秒間垂直に保たれた。コントロールマウスも、同様の手順を受けたが、生理食塩水が点滴された。全てのマウスが、最初のＴＮＢＳ投与から９日後犠牲された（すなわち２回目のＴＮＢＳの挑戦から４８時間後）。
【０２２３】
マウスは、ヒトＩＬ−１８ＢＰを含有する５００μｌの０．９％の食塩水を腹腔内投与することによりに処置された。
【０２２４】
ＨＩＬ−１８ＢＰは、ＣＨＯ発現系において産生される６つのヒスチジンのタグをつけたヒト組換えタンパク質である。ｈＩＬ−１８ＢＰは、ＫＧ−１細胞株においてＩＦＮγ産生を阻害したり、マウス脾臓細胞によるＩＦＮγ産生を減少させるなど、生物学的に活性である（Kim et al., 2000）。
【０２２５】
炎症の評価
体重は毎日記録された。脾臓、尾のリンパ節および結腸は、犠牲して収集された。結腸は、正中切開により取り出され、縦に開かれた。糞便成分を取り除いた後、抹消の６ｃｍの湿ったままの重量が記録され、疾患に関連した腸壁の厚くなった部分の指標として用いた。次に、結腸を縦に２つに裂き、その一方を組織学的評価のために使用した。
【０２２６】
組織学的評価
縦に裂かれた結腸は巻かれて、４％のホルマリンで固定し、組織学ではルーチンの方法でパラフィンに埋め込まれた。マウスへの処置配分量を知らない２人の調査員によって、以下の特性、１）関連領域の割合、２）小胞の集合体の増殖、３）浮腫、４）浸潤／潰瘍、５）陰窩破壊（crypt loss）および６）単核および多形核細胞の浸潤、について採点された。関連領域の割合および陰窩破壊は、以下の０から４の範囲の段階で採点された。０、通常；１、１０％未満；２、１０％；３、１０から５０％；４、５０％以上。浸潤は、上皮が無傷であるならば０と定義し、１は粘膜固有層の関与、２は粘膜下組織への潰瘍の関与、および３は潰瘍が経壁であるときとした。そのほかの特性の重傷度については、以下の０から３の段階：０、なし；１、わずか；２、中程度；３、重症で採点された。この得点の範囲は０から最大２６ポイントであった。
【０２２７】
結腸ホモジネート
結腸は収集され、ホモジネートは、９容量のグリーンバーガー（Greenburger）溶解緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ、２ｍＭ Ｔｒｉｔｏｎ（Ｘ−１００）、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、アプロチニン（全て２０ｎｇ／ｍｌ）、ｐＨ７．４）において、組織ホノジナイザーを用いて作製された。組織は３０分間氷上で溶かし、次いで２回の遠心分離を行なった（１０分間、１４０００ｇ）。ホモジネートは、使用するまで−２０℃で保存された。
【０２２８】
細胞培養およびサイトカインに対するＥＬＩＳＡ
脾臓および尾のリンパ節細胞の懸濁を調製するために、フィルター セル ストレイナー（filter cell strainers）（ベクトン／ディッキンソン ラブウェア社（Becton/Dickinson labware）製、ニュージャージー州、アメリカ合衆国）が使用された。細胞は１０％ＦＣＳおよびシプロキシン（ciproxin）（１０μｇ／ｍｌ）（シグマ ケミカル社製、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（バイオウィットカー−ベーリンガー社（BioWhittaker-Boehringer）製、ベルバイアーズ（Verviers）、ベルギー）に懸濁された。脾臓細胞は、滅菌フィコール（ファルマシア社製、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン）で遠心分離し、単核細胞はＲＰＭＩへ移され、細胞懸濁液は数えられる。１匹のマウスあたり全部で１×１０⁵細胞個が、抗生物質および１０％のウシ胎仔血清を含有する２００μｌのＲＰＭＩ（バイオウィットカー ヨーロッパ社（BioWhittaker Europe）製、カンブレックス カンパニー（A Cambrex Company）、ベルバイアー（Verviers）、ベルギー）で、３組の穴においてインキュベーションされた。細胞は、抗ＣＤ３抗体（１：３０濃度；１４５．２Ｃ１１クローン）および可溶性の抗ＣＤ２８抗体（１：１０００濃度；ファーミンゲン社製）でプレコートすることによって刺激された。４８時間後上清は取り除かれ、ＩＦＮ−γ（ファーミンゲン社製）およびＴＦＮ−α（Ｒ＆Ｄシステムズ社、アビンドン（Abingdon）、イギリス王国）の濃度はＥＬＩＳＡ分析によって測定された。
【０２２９】
流動細胞計測法
単離された脾臓細胞は、Ｆａｃｓ緩衝液（０．５％のＢＳＡ、０．３ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡおよび０．０１％のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）で洗われ、残りの手順のあいだは、氷上で維持した。各ウェル（９６穴Ｖ形マイクロプレート、グレイナーＢ．Ｖ．、レイバー テクニック社（Greiner B. V. labor techniek）、アルフェン アアン デ リジン（Alphen aan de Rijn）、オランダ）の２×１０⁵細胞は、以下の抗体（ｍＡｂｓ）、Ｃｙクロム複合ラット抗マウスＣＤ４（クローンＲＭ４−５）、Ｆｉｔｃ複合ラット抗マウスＣＤ６９およびＦｉｔｃ複合ラット抗マウスＣＤ２５（ファーミンゲン社製、サンディエゴ、カルフォルニア州）でインキュベートされた。リンパ球は、Ｆａｃｓｃａｎソフトウエアを結合したＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ベクトン ディッキソン社製、マウンテイン ビュー（Mountain View）、アメリカ合衆国）を用いることにより前方および側面散布によりゲートでコントロールされ、５０００細胞が数えられた。結果は、使用されたｍＡｂｓに対して陽性のゲートされた細胞の割合として表された。
【０２３０】
統計的解析
値は処理された各群の平均およびＳＥＭとして与えられた。群間の相違はノンパラメトリック マン−ウィズニーＵ検定（non-parametric Mann-Withney U test）を用いて解析された。順を追った体重の変化は、分散の一方向的解析によって解析された。Ｐ＜０．０５は、顕著であると考えられる。ＳＰＳＳ統計ソフトウエア（ＳＰＳＳ社（SPSS Inc.）、シカゴ、アメリカ合衆国）は、全ての解析において使用された。
【０２３１】
結果
ＩＬ−１８ＢＰは結腸炎のマウスモデルにおける体重の減少に対して保護する。
【０２３２】
実験的な結腸炎におけるＩＬ−１８の役割、およびとくにＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）の保護効果について調べるために、ＴＮＢＳ結腸炎をＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて誘導した。このモデルは、４０％エタノールに含有されるトリニトロベンゼン硫酸（ＴＮＢＳ）の局所的な暴露からなる。ハプテン（トリニトロフェニル）に緩和される自己抗原のために、遅延タイプの過度の過敏症を誘導し、その反応は前炎症性サイトカイン産生を促すＴｈ１型である。
【０２３３】
マウスは、ヒトＩＬ−１８ＢＰまたはコントロールを毎日のペースで腹腔内に処理された。
【０２３４】
ｈＩＬ−１８ＢＰの１２．５μｇから５０μｇの範囲内の毎日の腹腔内投与量は、疾患の深刻さに影響しなかった（示すデータなし）。しかしながら、毎日腹腔内に投与された２００μｇのｈＩＬ−１８ＢＰの投与量は、疾患の誘導に関連して体重の減少を低減ざせるのに有効であった。
【０２３５】
予想通り、ＴＢＳの直腸内点滴は、下痢および体重減少の結果となった。図１６に示したように、処理群のどちらの動物も、３日後に標準体重の１５％を減少した。しかしながら、コントロールマウスとは対照的に、実験開始日から４日後のＴＮＢＳ点滴から、ｈＩＬ−１８ＢＰ処理された動物は急速に最初の体重減少から回復し、８日後には標準体重に戻った。コントロールマウスにおいては、８日後のＴＮＢＳの２回目の投与により再び顕著に体重が減少したことから、ｈＩＬ−１８ＢＰの投与によって体重減少は充分に保護されている。食塩水処理されたマウスにおけるｈＩＬ−１８ＢＰの投与は、何の影響もなかった（示すデータなし）。したがって、ｈＩＬ−１８ＢＰの投与は、ＴＮＢＳにより誘導された結腸炎に関連する体重減少を顕著に減じさせる（Ｐ＜０．０５）。
【０２３６】
炎症性特性の効果
１０日後にマウスは犠牲にされ、結腸の後ろの６センチメートルの重さが決定された（図１７Ａ）。ＴＮＢＳ結腸炎において、結腸の重量は食塩水処理されたマウスと比較して増加した。この重さの増加は、ｈＩＬ−１８ＢＰ処理されたマウスにおいて顕著に減少した（食塩水処理されたマウスにおける２６８ｍｇ±２７．３と比較して、１８１．６ｍｇ±１１．４（Ｐ＜０．０５））。ＴＮＢＳ結腸炎は大量の細胞が尾のリンパ節へ移動することに関連していることが既に報告されている（Camoglio et al, 2000）。食塩水処理されたＴＮＢＳマウスの尾のリンパ節への細胞の数と比較して、ＩＬ−１８ＢＰ処理は尾のリンパ節に侵入する細胞の数を減少させる（図１７Ｂ）。
【０２３７】
早期のＴリンパ球活性化のマーカーであるＣＤ６９発現における変化は、Ｆａｃｓｃａｎ解析によって決定された（図１７Ｃ）。ＣＤ６９を発現するＣＤ４⁺脾臓細胞の割合は、ＴＮＢＳ処理されたマウスにおいて１１．４％であったが、ｈＩＬ−１８ＢＰ処理されたＴＮＢＳマウスのＣＤ４⁺／ＣＤ６９⁺の割合は７．３％であった（Ｐ＜０．０５）。
【０２３８】
脾臓、尾のリンパ節細胞のサイトカイン産生および結腸ホモジネート
Ｔ細胞受容体の活性化に続く生合成である、Ｔリンパ球の炎症性サイトカイン前駆体の産生能力におけるｈＩＬ−１８ＢＰの効果を調べるために、尾のリンパ節および脾臓から細胞を単離し、その細胞を４８時間抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で刺激した。その上清において、ＩＦＮγおよびＴＮＦα産生について測定された（図１８）。ｈＩＬ−１８ＢＰマウスおよびコントロール処理されたマウスのサイトカイン産生のあいだで顕著な違いは見られなかった。したがって、ｈＩＬ−１８ＢＰによるＩＬ−１８の中和は、Ｔ細胞受容体の活性化に反応するＴリンパ球の能力の総合的な減少を引き起こさなかった。
【０２３９】
結腸ホモジネートは、それらのサイトカインレベルに対して解析され、それによって局所的なサイトカインの産生を測定された（図１９）。ＴＮＢＳマウスおよびｈＩＬ−１８ＢＰで処理されたＴＮＢＳマウスの結腸ホモジネートにおいて、ＩＦＮγレベルに違いは検出されなかった（それぞれ１３４ｐｇ／ｍｌ±７．８および１３９ｐｇ／ｍｌ±２３）。しかしながら、結腸ホモジネートにおいて、ＴＮＦαレベルは、ｈＩＬ−１８ＢＰで処理されたＴＮＢＳマウスの１１０ｐｇ／ｍｌ±３から、ＴＮＢＳ処理されたマウスの５９ｐｇ／ｍｌ±２．７まで顕著に減少した。
【０２４０】
組織学的結果
炎症性特性の減少を仲介するｈＩＬ−１８ＢＰが組織学的採点にも影響するのかどうか調べるために、パラフィン切片において組織病理学を行なった。組織学的な炎症性の全採点は、おもに粘膜に浸潤しているリンパ球の数の減少の結果として、コントロール処理されたマウスと比較してｈＩＬ＝１８ＢＰ処理されたマウスにおいて顕著に減少した（ｈＩＬ−１８ＢＰ処理されたマウスにおける９．８±１．３に比較して、処理されていないマウスにおいて１５．９±１．１）。ＩＬ−１８ＢＰ処理されたマウスにおいて粘膜の潰瘍が完全に存在しなかったことが顕著な結果であった（Ｐ＜０．０５）。結果は以下の表２に要約した。ＩＬ−１８ＢＰ処理されたマウスにおける潰瘍の完全な予防が、とくに顕著であった。
【０２４１】
【表５】

【０２４２】
抗ｍＩＬ−１８ポリクローナル抗体は、デキストラン硫酸ナトリウムによって誘導された結腸炎のマウスモデルにおける疾患から保護した。
【０２４３】
このデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）のモデルにおいて、イド（id）は開始日０日からその動物が犠牲にされるまで、飲み水内において与えた。抗ＩＬ−１８ＢＰポリクローナル抗体は、０日、４日および８日にｉ．ｐ．で投与された。その投与量は、ウサギ血清の２００および４００？ｌであった。最も高い投与量（４００μｌ）は、体重の減少、臨床スコア、直腸の出血および結腸の短縮化を顕著に減じさせた（示すものはなし）。ウサギ抗ｍＩＬ−１８処理は疾患の始まりを遅れさせ、進行を予防した（示すものはなし）。
【０２４４】
要約
前記実施例１２は、ｈＩＬ−１８ＢＰまたはＩＬ−１８に対するポリクローナル抗血清の投与によるＩＬ−１８の中和は、マウスにおける実験的に誘導した結腸炎の深刻さを効果的に減じさせる。
【０２４５】
毎日ｈＩＬ−１８ＢＰを腹腔内処置されたマウスは、コントロール処理されたマウスと比較して最初の体重減少から急速に回復した。尾のリンパ節において、結腸重量および細胞の流入によって測定された結腸の炎症のほかの特性は、ｈＩＬ−１８ＢＰ処理されたマウスにおいて減じられた。処理されたマウスの組織病理学は、その組織の破壊（潰瘍）の重傷度の低減、およびかなり減少した浸潤細胞の量によって特徴付けられた。ｈＩＬ−１８ＢＰの効果はまた全身においてであり、脾臓細胞によるＣＤ６９の発現の減少によって証明された。
【０２４６】
結腸ホモジネートにおいて測定されたＴＮＦαの局所的な産生は、ｈＩＬ−１８ＢＰで処理されたＴＮＢＳマウスにおいて顕著に減少した。このことは、ＴＮＦαが疾患の進行において重要な役割を担うことを示す。ＩＦＮγレベルは、ＴＮＢＳマウスとｈＩＬ−１８ＢＰで処理されたＴＮＢＳマウスとは同様であり、これは過剰なＩＦＮγによって誘導される刺激によって説明され得る。
【０２４７】
結論として、前記データから、炎症性腸疾患の処置においてＩＬ−１８の阻害剤としての有効な効果が証明される。
【０２４８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＬＰＳの注射１時間前にマウスにさまざまな量の組換えＩＬ１８ＢＰ（０；０．０４；０．４；４ｍｇ／ｋｇ）をマウスへ注射した後のＩＦＮ−γの血清レベル（ｐｇ／ｍｌ）を表すヒストグラムを示す。血液試料はＬＰＳ注射から５時間後に採取され、循環ＩＦＮ−γに対するＥＬＩＳＡによって解析された。
【図２】 図２は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清レベルを表すヒストグラムを示す。Ｐ．アクネスに感染させたマウスにＬＰＳを注射する前に、組換えヒトＩＬ１８ＢＰの増加する投与量（０；０．０４；０．４；４ｍｇ／ｋｇ）をマウスに注射した。血液試料は、ＬＰＳ注射から５時間後に採取され、ＡＬＴの血清レベルが測定された。ＳＦ＝シグマ−フランケル：ＡＳＴ／ＡＬＴの１ＳＦユニットは、ｐＨ７．５で２５℃のとき、１分間あたり４．８２×１０^-4μｍｏｌグルタミン酸塩を形成する。
【図３】 図３は、ＬＰＳ注射後のマウスの生存時間を示す。Ｐ．アクネスに感染させたマウスにＬＰＳを注射する２０分前に、組換えヒトＩＬ１８ＢＰをさまざまな投与量（０；０．０４；０．００４；４ｍｇ／ｋｇ）で注射した。三角形：４ｍｇ／ｋｇ；小さいひし形：０．４；大きいひし形：０．０４；丸形：ＩＬ１８ＢＰなし（ＬＰＳのみ）。
【図４】 図４は、Ｐ．アクネスに感染させたマウスにＬＰＳを注射する２０分前にさまざまな投与量のＩＬ１８ＢＰ（０；０．４；４ｍｇ／ｋｇ）を投与し、その注射から５時間後に測定されたＩＦＮ−γの血清レベルを表すヒストグラムを示す。
【図５】 図５は、大腸菌（図５Ａ）またはＳ．チフィムリウム（図５Ｂ）由来の４０ｍｇ／ｍｌ（致死投与量）のＬＰＳを注射する３０分前に、ポリクローナルＩＬ−１８抗血清または正常なウサギ血清（ＮＤＳ＝コントロール）のどちらかを注射したマウスの生存を示す。三角形：マウスはＩＬ−１８抗血清を注射された；丸形：マウスはＮＤＳで注射された。ｘ軸において、ＬＰＳテスト後の日数が表される。^★ｐ＜０．０５。
【図６】 図６は、以下の方法で処置された各群５匹のマウスにおける平均＋ＳＥＭを表すヒストグラムを示す。マウスは、抗ＩＬ−１８抗血清、可溶性ＴＮＦ−α受容体（ＴＮＦｓＲｐ５５）または賦形剤（食塩水）のいずれかを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射され、すぐにコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ；図６Ａ）またはＰＥＡ（緑膿菌、図６Ｂ）を静脈内（ｉ．ｖ．）投与された。^★★ｐ＜０．０１；^★★★ｐ＜０．００１およびＣｏｎＡまたはＰＥＡのみ；＃ｐ＜０．０１およびＴＮＦｓＲＰ５５または抗ＩＬ−１８階乗のＡＮＯＶＡのどちらか。
【図７】 図７は、関節炎のマウスモデルの臨床スコアにおけるＩＬ−１８ＢＰの効果を示す。図７Ａは、さまざまな量のＩＬ−１８ＢＰまたはＩＦＮ−βまたは賦形剤（ＮａＣｌ）をマウスに毎日ｉ．ｐ．（腹腔内）投与した後測定された臨床スコアを表すグラフを示す。記号：塗りつぶしの三角形：１００００ＩＵ ＩＦＮ−β；白抜きの三角形：１０ｍｇ／ｋｇ ＩＬ−１８ＢＰ、逆三角形：３ｍｇ／ｋｇ ＩＬ−１８ＢＰ、ひし形：１ｍｇ／ｋｇ ＩＬ−１８ＢＰ；丸形：０．５ｍｇ／ｋｇ ＩＬ−１８ＢＰ；白抜きの四角形：０．２５ｍｇ／ｋｇ ＩＬ−１８ＢＰ、および塗りつぶしの四角形：ＮａＣｌ。ｘ軸において処置日数が表され、ｙ軸において臨床スコア（平均値）が表される。統計はマンウイットニーテストによって計算された。図７Ｂは図７Ａのグラフから推論されるＡＵＣ（曲線下の面積）を表すヒストグラムを示す。ｎ＝動物の数。
【図８】 図８は、肢の膨張におけるＩＬ−１８ＢＰの効果を示す。図８Ａは、さまざまな量のＩＬ−１８ＢＰで処置された個々の動物の病気にかかった後肢の肢の太さ（膨張）を計測することによって得られた結果を表すグラフを示す。ｙ軸は処置の開始からのミリメートルでの肢の太さの変化を示す。記号は図７と同じである。図８Ｂは図８Ａから推論されるＡＵＣを表すヒストグラムを示す。ｎ＝動物の数。
【図９】 図９は、ほかの肢に疾患が広がっていく急性関節炎のときの病気にかかった後肢の数の解析を示す。記号：塗りつぶしの四角形：ＮａＣｌ（コントロール）、三角形：１０ｍｇ／ｋｇ ＩＬ−１８ＢＰ、逆三角形：３ｍｇ／ｋｇ ＩＬ−１８ＢＰ、ひし形：１ｍｇ／ｋｇ ＩＬ−１８ＢＰ；丸形：０．５ｍｇ／ｋｇ ＩＬ−１８ＢＰおよび白抜きの四角形：０．２５ｍｇ／ｋｇ ＩＬ−１８ＢＰ。
【図１０】 図１０は、病気にかかった関節の軟骨の侵食スコアを表すヒストグラムを示す。
【図１１】 図１１は、マウスの関節の組織病理学を示す。実験の最後に、最初に関節炎が発症した肢を切断し、固定し実施例１０に記載したように処理した。図１１Ａ：正常なマウスの関節；図１１Ｂ：関節炎のマウス由来の関節；図１１Ｃ：ｒｈＩＬ−１８ＢＰで処置されたマウス由来の関節。
【図１２】 図１２は、それぞれ３ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１８ＢＰまたは食塩水（賦形剤）で処理されたマウスの、アイソタイプＩｇＧ１（白抜きの支柱）またはＩｇＧ２ａ（線影がついた支柱）の抗２型コラーゲン抗体のレベルを表すヒストグラムを示す。測定は、疾患の４日後（Ｄ４）または８日後（Ｄ８）に行なった。
【図１３】 図１３は、１、３または１０ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１８ＢＰ、１００００ＩＵのインターフェロンβ（ＩＦＮ−ｂ）、正常マウス血清（ＮＭＳ）または食塩水（ＮａＣｌ）でそれぞれ処置された動物のＩＬ−６レベルをｐｇ／ｍｌで表すヒストグラムを示す。
【図１４】 図１４は、活動性クローン病、潰瘍性結腸炎を患った患者または正常で健康な個体由来の腸バイオプシーにおける、ｈＩＬ−１８ＢＰおよびＩＬ−１８のｍＲＮＡ転写産物の発現を示す。ＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ−１８およびハウスキーピング遺伝子（β−アクチン）に対して、対応するＲＴ−ＰＣＲ産物は表される（図１４Ａ）。エチジウムブロマイド染色されたバンドの比較的な定量化は、コダックデジタルイメージングソフトウェアを用いて行なわれ、標的遺伝子とβ−アクチンとの比として報告される。その標的遺伝子は図１４ＢにおいてＩＬ−１８、図１４ＣにおいてＩＬ−１８ＢＰである。
【図１５】 図１５は、ＨＵＶＥＣｓ（ヒト臍帯静脈血管内皮細胞）によるｈＩＬ−１８ＢＰのｍＲＮＡの転写産物およびタンパク質の発現、ならびにＴＨＰ１（ヒト単球細胞株）によるタンパク質の発現を示す。ＲＮＡは処置されていない内皮細胞（培地）および、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＦＮγで刺激された内皮細胞から単離された。陽性コントロール：クローン病の患者からの結腸、陰性コントロール：ｃＤＮＡなし。ＩＬ−１８ＢＰおよびＩＬ−１８の発現は、半定量ＲＴ−ＰＣＲによって解析された（図１５Ａ）。処置されていない（培地）培養上清およびＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＦＮγで２４時間活性化したＨＵＶＥＣｓ（図１５Ｂ）またはＴＨＰ１（図１５Ｃ）細胞の培養上清は、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１８ＢＰおよびＩＬ−１８のタンパク質産生について解析された。
【図１６】 図１６は、食塩水（ＮａＣｌ）またはＩＬ−１８ＢＰ（８ｍｇ／ｋｇ）のどちらかの腹腔内（ｉｐ）投与後、ＩＢＤのマウスモデルにおいて１日から１０日のあいだの体重の発達を示す。重さの変化は、第１日からの体重の変化の割合として表される。２つの群の平均値およびＳＥＭは、各群８匹のマウスで示される。
【図１７】 図１７は、ＩＬ−１８ＢＰ処理されたＩＢＤマウスおよび処理されていないＩＢＤマウス由来の結腸、尾のリンパ節および脾臓の解析の結果を示す。図１７Ａは、結腸の最後６センチメートルの重さをｍｇで表す。図１７Ｂは、尾のリンパ節に存在する細胞全ての数を示す。図１７Ｃは脾臓においてＣＤ４⁺／ＣＤ６９⁺について陽性染色される細胞の割合を表す。データは平均値とＳＥＭを表す。^★は顕著な違いを示す。
【図１８】 図１８は、上清に存在するＣＤ３／ＣＤ２８による刺激後の、尾のリンパ節細胞（図１８５ＡおよびＣ）および脾臓細胞（図１８ＢおよびＤ）によって４８時間後産生されたＩＦＮγ（図１８ＡおよびＢ）およびＴＮＦα（図１８ＣおよびＤ）の量を示す。平均およびＳＥＭが示される。
【図１９】 結腸ホモジネート内のＴＮＦα（図１９Ａ）およびＩＦＮγ（図１９Ｂ）の内容量を示す。データは結腸の重さに対して補正されている。平均値およびＳＥＭを示す。^★は顕著な違いを示す。

Claims (28)

1. 慢性肝傷害の治療および／または予防用医薬の製造における、ＩＬ−１８に対する抗体およびＩＬ−１８結合タンパク質からなる群より選択されるＩＬ−１８阻害剤の使用であって、該慢性肝傷害がアルコール性肝炎である使用。
2. 前記ＩＬ−１８抗体がヒトに適応させたＩＬ−１８抗体である請求項１記載の使用。
3. 前記ＩＬ−１８抗体がヒトＩＬ−１８抗体である請求項１記載の使用。
4. 前記ＩＬ−１８結合タンパク質がペギレーションされている請求項１記載の使用。
5. 前記ＩＬ−１８結合タンパク質が、免疫グロブリンの全てまたは一部と融合されたＩＬ−１８結合タンパク質を含む融合タンパク質であって、ＩＬ−１８と結合する融合タンパク質である、請求項１記載の使用。
6. 前記融合タンパク質が免疫グロブリンの定常領域の全てまたは一部を含む請求項５記載の使用。
7. 前記免疫グロブリンがＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプである請求項６記載の使用。
8. 前記医薬がさらにインターフェロンを含有する請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
9. 前記インターフェロンがインターフェロン−βである請求項８記載の使用。
10. 前記ＩＬ−１８阻害剤がインターフェロンと同時に、連続的にまたは別々に用いられる請求項８または９記載の使用。
11. 前記医薬がさらに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニストを含有する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
12. 前記ＴＮＦアンタゴニストがＴＢＰＩおよび／またはＴＢＰＩＩである請求項１１記載の使用。
13. 前記ＩＬ−１８阻害剤および／または前記インターフェロンが、ＴＮＦアンタゴニストと同時に、連続的にまたは別々に用いられる、請求項１１または１２記載の使用。
14. 前記医薬がさらにＣＯＸ阻害剤を含有する請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
15. 前記ＣＯＸ阻害剤がＣＯＸ−２阻害剤である請求項１４記載の使用。
16. 前記ＩＬ−１８阻害剤が、約０．０００１から１０ｍｇ／体重ｋｇ、または約０．０１から５ｍｇ／体重ｋｇ、または約０．１から３ｍｇ／体重ｋｇ、または約１から２ｍｇ／体重ｋｇの量で使用される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
17. 前記ＩＬ−１８阻害剤が、約０．１から１０００μｇ／体重ｋｇ、または約１から１００μｇ／体重ｋｇ、または約１０から５０μｇ／体重ｋｇの量で使用される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
18. 前記ＩＬ−１８阻害剤が皮下に投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
19. 前記ＩＬ−１８阻害剤が筋肉内に投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
20. 前記ＩＬ−１８阻害剤が毎日投与される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用。
21. 前記ＩＬ−１８阻害剤が１日おきに投与される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の使用。
22. 慢性肝傷害の治療および／または予防用医薬の製造における、ＩＬ−１８結合タンパク質をコードする配列を含む発現ベクターの使用であって、該慢性肝傷害がアルコール性肝炎である使用。
23. 遺伝子治療のための請求項２２記載の使用。
24. 慢性肝傷害の治療および／または予防用医薬の製造における、ＩＬ−１８阻害剤を産生するように遺伝的に改変された細胞の使用であって、該ＩＬ−１８阻害剤がＩＬ−１８に対する抗体およびＩＬ−１８結合タンパク質からなる群より選択され、該慢性肝傷害がアルコール性肝炎である使用。
25. ＩＬ−１８阻害剤を含む慢性肝傷害の治療用医薬組成物であって、該ＩＬ−１８阻害剤がＩＬ−１８に対する抗体およびＩＬ−１８結合タンパク質からなる群より選択され、該慢性肝傷害がアルコール性肝炎である医薬組成物。
26. さらにインターフェロンを含む請求項２５記載の医薬組成物。
27. さらにＴＮＦアンタゴニストを含む請求項２５または２６記載の医薬組成物。
28. さらにＣＯＸ−２阻害剤を含む請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の医薬組成物。

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