KR20070087256A - Ｉｌ-18 저해물질의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 관절염, 특히 류머티스 관절염의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다. 이에 더하여, 본 발명은 염증성 장 질환, 특히 크론병과 궤양성 대장염의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.

IL-18 저해물질

Description

ＩＬ-18 저해물질의 용도{USE OF IL-18 INHIBITORS}

본 발명은 몇몇 병리 질환에서 IL-18 저해물질의 치료요법적 용도에 관한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 관절염, 간 질환, 염증성 장 질환(IBD)의 치료 및/또는 예방에 관한다.

1989년에, 생쥐의 비장세포로부터 수득된 인터루킨-γ(IFN-γ)을 유도하는 엔도톡신-유도된 혈청 활성이 보고되었다(Micallef et al., 1996). 이와 같은 혈청 활성은 IFN-γ의 직접적인 유도인자일 뿐만 아니라, IL-2 또는 미토겐과 함께 보조-자극인자로 작용한다. 엔도톡신-이후 생쥐 혈청으로부터 활성을 정제하려는 시도에서 상동한 50-55 kDa 단백질이 발견되었다. 다른 사이토킨이 IFN-γ 생산에 대한 보조-자극물질로 작용할 수 있기 때문에, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 또는 TNF에 대한 중화 항체가 혈청 활성을 중화시키지 못한다는 것은 이것이 별개의 인자라는 것을 의미한다. 1995년 이들 연자들은 여드름균(P. acnes)으로 전처리된 생쥐의 간 추출물에 IFN-γ 생산을 위한 엔도톡신-유도된 보조-자극물질이 존재함을 입증하였다(Novick et al., 1992). 상기 모형에서 간 대식세포 집단(Kupffer cell)은 증폭되는데, 전처리안된 생쥐에게는 치명적이지 않은 적은 약량의 세균성 리포폴리사카 라이드(LPS)가 이들 생쥐에게는 치명적이다. 초기에 IFN-γ-유도 인자(IGIF)라고 불렸고 이후 인터루킨-18(IL-18)로 명명된 이 인자는 1,200g 여드름균(P. acnes)-처리된 생쥐간으로부터 균질하게 정제되었다. 정제된 IL-18의 아미노산 서열에서 유도된 축중 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 뮤린 IL-18 cDNA을 클론하였다(Novick et al., 1992). IL-18은 157개 아미노산으로 구성된 18-19kDa 단백질로, 데이터베이스 상에서 임의 펩티드와 명백한 유사성을 보이지 않는다. IL-18 및 인터루킨-12(IL-12)에 대한 메신저 RNA는 Kupffer 세포 및 활성화된 대식세포에서 쉽게 검출된다. 재조합 IL-18은 독립된 과정을 통하여, IL-12보다 더 강하게 IFN-감마를 유도한다(Novick et al., 1992). 엔도톡신-유도된 혈청 활성과 유사하게, IL-18은 스스로 IFN-γ를 유도하지는 못하고 미토겐 또는 IL-2와 함께 보조-자극물질로 주로 작용한다. IL-18은 IL-2-의존성 과정을 통하여 T 세포 증식을 강화시키고, Th1 사이토킨 in vitro 생산을 강화시키고, 강화된 IFN-γ 생산측면에서 IL-12와 병용하면 시너지 효과를 나타낸다(Maliszewski et al, 1990).

생쥐 IL-18에 대한 중화 항체는 여드름균(P. acnes) 선-처리된 생쥐에서 저용량 LPS의 살상력을 예방하는 것으로 나타났다. 선-처리된 생쥐에서 LPS 치사의 매개물질로서 IFN-γ의 중요성이 보고되었다. 가령, 항-IFN-γ 중화 항체는 Shwartzman-형 쇼크로부터 생쥐를 보호하였고(Fantuzzi et al., 1998), IFN-γ수용체가 결핍된 갈락토사민-처리된 생쥐는 LPS-유도된 사멸에 저항하였다(Bym, 1990)). 따라서, 뮤린 IL-18에 대한 중화 항체는 치사성 LPS로부터 여드름균(P. acnes) 선-처리된 생쥐를 보호할 것으로 기대되었다(Novick et al., 1992). 또한, 항-뮤린 IL-18 처리는 중증 간 세포독성으로부터 생쥐를 보호한다.

뮤린 형태가 클론된 이후, IL-18에 대한 사람 cDNA 서열이 1996년에 보고되었다(Okamura et al., 1995). 재조합 사람 IL-18은 중성 IL-18 활성을 나타낸다(Okamura et al., 1995). 사람 재조합 IL-18은 사람 T-세포에 대한 직접적인 IFN-γ 유도 활성은 없지만, IFN-γ 및 다른 T-헬퍼 세포-1(Th1)을 생산하기 위한 보조-자극물질로 작용한다(Okamura et al., 1995). 현재 IL-18은 주로 Th1 사이토킨(IFN-γ, IL-2, 과립세포-대식세포 콜로니 자극 인자) 생산에 대한 보조-자극물질(Izaki, 1978) 및 뮤린 중성 킬러 세포 클론의 FAS 리간드-매개된 세포독성에 대한 보조-자극물질로 생각된다(Novick et al., 1989).

병든 조직으로부터 IL-18을 클로닝하고 IL-18 유전자 발현을 조사하여, 이런 사이토킨과 자가면역 질환의 밀접한 연관성을 발견하였다. 비-비만 당뇨병 생쥐(NOD)는 자가면역 인슐린증과 당뇨병이 자발적으로 발병하는데, 이는 사이클로포스파미드를 1회 주사하여 가속화 및 동조시킬 수 있다. IL-18 mRNA는 인슐린증의 초기 단계동안 NOD 생쥐 췌장에서 역전사효소 PCR로 입증한다. 사이클로포스파미드 처리후 IL-18 mRNA 수준은 급격하게 증가되고, 이후 IFN-γ mRNA 상승 및 당뇨로 진행된다. 흥미롭게도, 이들 역학은 IL-12-p40 mRNA의 역학을 모방하고, 따라서 개별적인 mRNA 수준간의 밀접한 상관관계를 유발한다. 췌장 RNA에서 IL-18 cDNA의 클로닝 및 후속적인 서열화에서, Kupffer 세포와 in vivo 선-활성화된 대식세포로부터 클론된 IL-18 서열의 동일성이 밝혀졌다. NOD 생쥐 대식세포 역시 사이클로포스파미드에 대하여 IL-18 유전자 발현으로 대응하지만, 동일하게 처리된 Balb/c 생쥐 의 대식세포는 이런 반응을 보이지 않는다. 따라서, 자가면역 NOD 생쥐에서 IL-18 발현은 비정상적으로 조절되고 당뇨병 발생과 밀접하게 관계한다는 결론이 도출되었다(Novick et al., 1992).

IL-18은 Th1 세포에서 Fas 리간드의 기능 활성을 증폭하여, 면역조절 또는 염증에 중요한 역할을 수행한다(Conti et al., 1997). IL-18은 부신피질에서도 발현되고, 따라서 신경-면역조절물질로 분비되어 스트레스를 받은 면역계를 조정하는데 중요한 역할을 한다(Chater, 1986).

in vivo에서, IL-18은 프로-IL-18 절단으로 형성되고, 이의 내생적 활성은 여드름균(P. acnes)과 LPS-매개된 치사에서 IFN-γ 생산을 설명하는 것으로 보인다. 성숙 IL-18은 IL-1β전환효소(IL-1베타-전환효소, ICE, 카스파제-1)에 의해 전구물질로부터 만들어진다.

IL-18 수용체는 리간드 결합에서 동시-작동하는 적어도 2개의 요소로 구성된다. 뮤린 IL-12 촉진된 T 세포에서 IL-18에 대한 고-친화성 결합 부위와 저-친화성 결합 부위가 발견되었는데(Yoshimoto et al., 1998), 이는 다중적인 체인 수용체 복합체를 암시한다. 지금까지 2개의 수용체 아단위이 확인되었는데, 이들 둘 모두 IL-1 수용체 집합에 속한다(Parnet et al., 1996). IL-18의 신호 전달에는 NF-κB의 활성화가 관여한다(DoDonato et al., 1997).

몇몇 공지된 사이토킨 결합단백질은 가용성 사이토킨 수용체로서, 각각의 세포 표면 사이토킨 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인에 상응한다. 이들은 세포 표면 수용체에 공통된 전구-mRNA의 대체 접합 또는 세포 표면 수용체의 단백분해 절단으로 제거된다. 이런 가용성 수용체는 IL-6과 IFN-γ(Nakamura et al., 1989), TNF(Dao et al., 1996; Engelmann et al., 1989), IL-1과 IL-4(John, 1986), IFN-α/β(Mizushima and Nagata, 1990) 등을 비롯하여 이미 공지되어 있다. 오스테오프로테게린(osteoprotegerin)(OPG, 골파괴세포 저해 인자-OCIF)이라고 하는 사이토킨-결합 단백질은 TNFR/Fas 집합의 일원으로서, 분비 단백질로만 존재하는 가용성 수용체의 첫 번째 실례로 생각된다(Anderson, 1997; Bollon, 1980).

최근에, IL-18에 대하여 고친화성을 보이는 가용성 단백질이 사람 소변으로부터 분리되었고, 사람과 생쥐 cDNA가 보고되었다(Novick et al., 1999; WO 99/09063). 상기 단백질은 IL-18 결합단백질(IL-18BP)로 명명되었다.

IL-18BP는 공지된 IL-18 수용체중 한가지의 세포외 도메인이 아닌 분비된 천연 순환 단백질이다. 이는 신규한 분비단백질 군에 속한다. 상기 군에는 IL-18BP에 높은 상동성을 보이는 몇몇 폭스바이러스-인코드된 단백질이 포함된다(Novick et al., 1999). IL-18BP는 비장에서 구조적으로 발현되고 면역글로불린 대과에 속하며 IL-1 II형 수용체에 제한적인 상동성을 갖는다. 이의 유전자는 사람 크로모좀 11q13에 위치하고, 막통 도메인을 코딩하는 비-엑손은 8.3kb 게놈 서열에서 발견되었다(Novick et al., 1999).

mRNA 접합으로 만들어지고 다양한 cDNA 라이브러리에서 발견되는 IL-18BP의 4가지 사람 동소체와 2가지 생쥐 동소체는 발현시키고 정제하고 결합 및 IL-18 생리활성의 중화를 평가하였다(Kim et al., 2000). 사람 IL-18BP 동소체 a(IL-18BPa)는 빠른 온-레이트, 느린 오프-레이트, 399pM의 분리 계수(K(d))로 IL-18에 대하여 가장 높은 친화성을 보였다. IL-18BPc는 29 C-말단 아미노산을 제외한 IL-18BPa의 Ig 도메인을 공유한다; IL-18BPc의 K(d)는 10배나 낮다(2.94nM). 그럼에도 불구하고, IL-18BPa와 IL-18BPc는 과몰량에서 IL-18을 >95% 중화시킨다. IL-18BPb와 IL-18BPd 동소체는 완전한 Ig 도메인이 결핍되고, IL-18과 결합하거나 이를 중화시키는 능력이 부족하다. 동일한 Ig 도메인을 보유하는 뮤린 IL-18BPc와 IL-18BPd 동소체 역시 과몰량에서 뮤린 IL-18을 >95% 중화시킨다. 하지만, 사람 IL-18BPa와 공통된 C-말단 모티프를 공유하는 뮤린 IL-18BPd 역시 사람 IL-18을 중화시킨다. 분자 모형링을 통하여, IL-18BP의 Ig 도메인에서 정전성과 소수성이 혼합된 상당히 큰 결합 위치가 확인되었는데, 이런 결합 위치는 리간드에 대한 이의 높은 친화성 결합을 설명할 수 있다(Kim et al., 2000).

최근에, 인터루킨 IL-18은 엔도톡신 쇼크, 간염, 자가면역-당뇨병을 비롯한 만성 염증성 질환에서 병리발생의 진행에 관여하는 것으로 알려졌다(Kahiwamura and Okamura, 1998). 간 손상의 발생에서 IL-18의 가능 역할은 Tsuij et al.의 공개 실험으로 뒷받침되었는데(Tsuij et al., 1999), 상기 실험동안 생쥐 모형의 리포폴리사카라이드-유도된 급성 간 손상에서 IL-18의 수준 상승이 관찰되었다. 하지만, 간 손상의 발생에서 다중-기능성 인자 IL-18의 기전은 아직까지 명확하게 밝혀지지 않고 있다.

간 손상은 다양한 원인에 의해 야기될 수 있다. 이는 예로써 바이러스 혹은 박테리아 감염, 알코올 중독, 면역 질환 또는 암에 기인할 수 있다.

가령, B형과 C형 간염 바이러스에 기인한 바이러스성 간염은 전세계적으로 만연한 난치성 질환이다. 공지된 간염 바이러스의 개체수는 지속적으로 증가하고 있다. B형과 C형 간염 바이러스와는 별개로, 바이러스-관련된 간염을 유발하는 적어도 4가지의 다른 바이러스(즉, A형, D형, E형, G-바이러스 간염)가 발견되었다.

알코올성 간 질환은 알코올의 만성적인 소비와 관련된 질환이다. 면역성 간염은 치료하기 힘든 희귀한 자가면역 질환이다. 간 손상에는 담관의 손상이 포함된다. 원발성 담즙성 경화증(PBC)은 간내 담관의 파괴로 특징지어지는 자가면역성 간 질환이다.

*몇몇 연구에서, 알코올성 간염, 간경화증, 바이러스성 간염, 원발성 담즙성 경화증과 같은 질환에서 간에 대한 손상이 T-보조세포-1(Th1) 반응과 연관하는 것으로 확인되었다. 한 연구에서, 간으로 난알부민-함유 리포좀의 표적화 및 이후 난알부민-특이적 Th1 세포의 수용성 전달로 신규한 간 손상 모형을 확립하였다. 생쥐를 난알부민-함유 리포좀과 Th1 세포 전달로 복합 치료하면, 혈청 IFN-γ 수준의 상승과 함께 혈청 트랜스아미나제 활성이 증가하였다. 대조적으로, 난알부민-특이적 Th2 세포 전달은 혈청 IL-4 수준을 증가시키긴 하지만 간 손상을 유도하지는 않는다. 간 손상은 안티-IFN-γ 항체 및 안티-종양괴사인자(TNF)-α항체에 의해 차단된다. 이런 연구결과는 Th1 세포가 급성 간 손상에서 중요한 주효체 세포라는 것을 시사한다(Nishimura and Oata, 1999). 다른 일단의 연구에서, IFN-γ를 과다-발현하는 생쥐는 임의의 병원균 또는 임의의 다른 자극물질없이 자발적인 간염을 보이는 것으로 밝혀졌다(Okamoto et al., 1998).

다른 연구는 원발성 담즙성 경화증(PBC)에서 Th1 반응의 연관성을 보고하였다. PBC는 간내 담관의 파괴로 특징지어지는 자가면역성 간 질환이다. 일반적으로, T 세포가 참여하는 세포 면역 기전이 이런 담관 손상을 초래하는 것으로 생각된다. 최근에, Th1과 Th2 반응의 상대적 강도는 다양한 자가면역 질환의 병리생리학적 성상에서 중요 인자로 제시되었다. 상기 연구에서, 2가지 T-세포 아집합에 특이적인 사이토킨, 즉 Th1 세포에 대한 IFN-γ 및 Th2 세포에 대한 IL-4의 검출로 PBC에서 아집합 균형을 측정하였다. IFN-γ과 IL-4 메신저 RNA(mRNA) 파지티브 세포는 비동위원소 in situ 혼성화와 면역조직화합법을 이용하여, 18명의 PBC 환자 및 만성 C형 간염 환자, 간외 담도 폐색 환자, 정상 간 환자를 비롯한 35명의 질환 대조군으로부터 얻은 간 조직에서 카운트한다. IFN-γ와 IL-4 mRNA를 발현하는 단핵구 세포는 PBC 간의 염증 간문맥에서 증폭되지만, 간외 담도 폐색, 알코올성 간 섬유증 또는 정상 간 조직에서는 거의 존재하지 않는다. PBC 간에서 IFN-γ과 IL-4 mRNA 파지티브 세포는 대조군 간에서보다 훨씬 많이 검출되었다(P<0.01). 이에 더하여, PBC 간에서 IFN-γ mRNA 발현은 IL-4 발현보다 더욱 빈번하게 검출되고, IFN-γ mRNA 발현 수준은 간문맥 염증 활성의 정도와 현저하게 연관하였다. IFN-γ mRNA-파지티브 세포는 림프성 응집체로 둘러싸인 손상된 담관 주변에서 주로 검출되었다(Harada et al., 1997).

바이러스 항원 인식에서, 사이토킨 패턴 역시 바이러스 감염과 바이러스 제거의 결정에 현저한 영향을 미치는 것으로 생각된다. 한 연구에서, Th2형 반응 편향의 사이토킨 불균형이 만성 B형 간염에 일정한 역할을 하는 지를 조사하였다. 만 성 B형 간염과 연관된 말초혈 단핵구 세포의 사이토킨 프로파일은 RT-PCR로 분석하였다. B형 간염 표면 항원(HbsAg) 자극 직후에, IFN-γ, IL-12, IL-4, IL-10의 발현은 각각, 41%, 8%, 41%, 50%의 환자에서 검출되었다. 이들 사이토킨에서, Th1 사이토킨 IFN-γ의 발현은 높은 수준의 혈청 AST/ALT(아스파테이트 아미노트랜스퍼라제/알라닌 아미노트랜스퍼라제)와 연관하고, 간 손상의 전형적인 기준이 된다. Th2형 사이토킨은 간세포에 대한 보호 효과를 발휘하지 못하는 것으로 밝혀졌다. 결론적으로, HBsAg-반응성 세포에 의한 Th1 사이토킨인 IFN-γ의 생산은 만성 B형 간염에서 간세포 손상과 연관한다(Lee et al., 1999). 높은 수준의 FAS 리간드와 이의 수용체(CD95)는 B형 간염 환자의 간에서 보고되었다(Luo et al., 1997). Fas 리간드는 간세포 아폽토시스를 초래하는 주요 세포독성 인자중 하나로 인식되고 있다.

다른 연구에서, C형 간염 바이러스/RNA(HCV/RNA)-파지티브 처리된 30명의 만성 간염 환자에서 간 손상의 진행과 관련된 인자가 확인되었다. 염증괴사성 손상 및 구조적 손상은 Ishak 스코어를 이용하여 평가한다. 활성화된 간 성상 세포(HSC)는 α-평활근 액틴(αSMA)에 대한 면역조직화학법으로 가시화시키고 형태 계측 검사로 정량한다. 혈장 HCV/RNA는 경합 RT-PCR 방법으로 평가한다. 간 손상의 진행에 관여하는 면역 반응의 유형을 조사하기 위하여, IFN-γ-파지티브 세포(Th1-유사 반응의 발현)는 면역조직화학법으로 평가하고 형태 계측 검사로 정량한다. HSC는 소엽성 염증괴사 부위 또는 내층 섬유화 격막에 인접하여 검출되었다. αSMA-와 Sirius Red-파지티브 실질(parenchyma)은 염증괴사 및 구조적 스코어와 밀접한 상관관계를 갖는다. IFNγ-파지티브 세포는 염증성 침윤 병소와 연관된 문맥 주위부 에서 발견되고, 구조적 손상과 현저한 상관관계를 갖는다. 따라서, HSC 활성화 및 간 손상의 진행은 Th1형 반응과 연관한다는 결론이 도출되었다(Baroni et al, 1999). B형 간염의 경우와 유사하게, FAS 리간드와 이의 수용체는 C형 간염 환자의 간과 혈청에서 발견되었다(Hiramatsu et al, 1994; Okazaki et al, 1996; Lio et al, 1999).

Th1 사이토킨 및 다른 Th1 마커는 알코올성 간염 및 간경화증과 연관하는 것으로 밝혀졌다. 염증성 자극 및 지질과산화는 핵인자 κB(NF-κB)를 활성화시키고 친염증성 사이토킨과 케모킨을 상향 조절한다. 한 연구에서, 병리학적 간 손상, 내독소 혈증, 지질 과산화, NF-κB 활성간의 상관관계 및 친-염증성 사이토킨과 항-염증성 사이토킨간의 불균형을 평가하였다. 위내 주입으로 에탄올 및 포화된 지방, 팜기름, 옥수수기름 또는 어유를 함유하는 사료를 쥐(군당 5마리)에게 공급한다. 대조군 쥐에서 에탄올은 등열량의 덱스트로스로 대체한다. 병리학적 분석을 실시하고, 엔도톡신; 지질 과산화; NF-κB; 친염증성 사이토킨(TNFα, IL-1베타, IFN-γ, IL-12), C-C 케모킨(활성화직후에 조절됨, 발현 및 분비된 정상 T 세포[RANTES], 단핵세포 화학주성 단백질[MCP]-1, 대식세포 염증 단백질[MIP]-1-α), C-X-C 케모킨(사이토킨 유도된 호중구 화학주성인자[CINC], MIP-2, IP-19, 상피 호중구 활성 단백질[ENA]-78), 항-염증성 사이토킨(IL-10, IL-4, IL-13)의 메신저 RNA(mRNA) 수준을 측정한다. NF-κB의 활성화 및 친염증성 사이토킨 C-C와 C-X-C의 발현 증가는 염증괴사적 손상(어류-에탄올과 옥수수기름-에탄올)을 보이는 생쥐에서 관찰된다. 이들 군은 최대 수준의 엔도톡신과 지질 과산화를 보였다. IL-10과 IL-4 mRNA의 수 준은 염증성 간 손상을 보이는 군에서 더욱 낮게 나타난다. 따라서, NF-κB의 활성화는 염증성 자극의 존재하에 발생하고, Th1 친염증성 사이토킨과 케모킨의 발현 증가를 초래한다(Naji et al., 1999). Fas 리간드와 이의 수용체 역시 알코올성 간질환에서 상승하는데, 이는 Th1 사이토킨이 알코올성 간염에서 유도된 자가면역 과정에 관여한다는 것을 추가로 뒷받침한다.

TNF-α또한, 알코올-관련된 간 괴사-염증의 발병에서 공통된 경로로서 부상하고 있다. 간과 혈청 TNF의 증가는 알코올성 간질환과 사람 알코올성 간질환의 동물 모형에서 확인되었다. 이런 무절제된 TNF 기전은 알코올성 간질환의 다수 대사 합병증과 간 손상의 주요 원인이 된다(Grove et al., 1997; McClain and Cohen, 1989). 가령, 한 연구에서 알코올성 간염 환자는 정상 개체(6.4ng/ℓ; Cl, 5.4 내지 7.4)보다 높은 TNF-α 수준(평균, 26.3ng/ℓ; 95% Cl, 21.7 내지 30.9)을 보였다. 이로 인해 사망한 환자는 생존자(16.6ng/ℓ; Cl, 14.0 내지 19.2)보다 높은 TNF-α 수준(34.7ng/ℓ; Cl, 27.8 내지 41.6)을 보였다. 특히 알코올성 간염에서 TNF-α수준은 혈청 빌리루빈(r=0.74; P=0.0009) 및 혈청 크레아티닌(r=0.81; P=0.0003)과 파지티브한 상관관계를 보였다. 알코올성 간염 환자는 불활성 알코올성 간경화증 환자(11.1ng/ℓ; Cl, 8.9 내지 13.3) 및 간질환이 없는 중증 알코올 환자(6.4ng/ℓ; Cl, 5.0 내지 7.8)보다 높은 TNF-α수준을 보였다. 신장 부전 환자는 알코올성 간염 환자보다 낮은 TNF-α수준(14.1ng/ℓ; Cl, 5.4 내지 22.8)을 보였다. 따라서, 중증 알코올성 간염에서 TNF-α의 상승이 가장 현저하게 나타나는데, 이는 TNF-α가 발병에 원인이라는 것을 시사한다(Bird et al., 1990).

TNF는 엔도톡신의 다수 생리작용을 매개한다. 최근 연구에서, TNF 투여가 간 손상을 초래하고 TNF가 간세포독소 갈락토사민의 치사율을 조절할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 알코올성 간 질환 환자에게 내독소혈증이 자주 발생하고 알코올성 간 질환의 많은 임상적 징후가 TNF의 공지된 생리 작용이기 때문에, 알코올 간염 환자에서 이의 활성을 평가하였다. TNF 생산의 주요 근원인 말초혈 단핵세포로부터 기저 TNF 방출 및 리포폴리사카라이드-자극된 TNF 방출은 16명의 알코올 간염 환자와 16명의 건강한 지원자에서 측정한다. 16명의 알코올 환자 전체와 16명중 2명의 건강한 지원자에서 자발적인 TNF 활성이 검출되었다(p<0.05). 리포폴리사카라이드 자극이후, 알코올성 간염 환자로부터 평균 단핵구 TNF 방출은 건강한 대조군에서보다 2배이상 현저하게 증가하였다(25.3 +/- 3.7 vs. 10.9 +/- 2.4 유닛/ ㎖, p<0.005). 따라서, 알코올성 간염 환자의 단핵세포가 건강한 지원자의 단핵세포에 비하여 현저하게 증가된 리포폴리사카라이드-자극된 TNF 방출을 자발적으로 유인한다는 결론이 도출되었다(McClain and Cohen, 1989).

리포폴리사카라이드(LPS)-결합단백질(LBP)과 CD14는 엔도톡신에 의한 세포의 활성화에서 핵심적인 중간자 역할을 수행한다. 장-유래된 LPS는 알코올성 간 질환에서 병리학적 간 손상을 촉진하는데 참여한다. 4주동안 유중 에탄올을 위내 공급받은 쥐는 각각 쿠퍼 세포와 간세포에서 상승된 수준의 CD14와 LBP를 보유하는 것으로 확인되었다. CD14 mRNA의 발현은 비골수 세포에서도 상승하였다. 강화된 LBP와 CD14 발현은 다양한 친-염증성 사이토킨의 LPS-유도된 발현을 급속하게 증가시키고, 알코올성 간 손상에서 병리학적 간 손상의 존재와 연관한다(Su et al., 1998; Lukkari et al., 1999).

관절염은 관절 염증이 유발되는 질환이다. 관절은 팽화, 경직, 무름, 발적 또는 체온 상승을 보인다. 이런 증상은 체중 감소, 열 또는 허약함을 동반할 수 있다. 이들 증상이 2주이상 지속되는 경우에, 염증성 관절염, 예를 들면 류머티스 관절염이 원인일 수 있다. 관절 염증은 또한, 감염에 의해서 야기되는데, 이는 감염성 관절염을 초래할 수 있다. 관절염의 가장 흔한 유형은 퇴행성 관절 질환(골관절염)이다.

관절염 및 이와 관련된 질환에 주로 처방되는 약제는 비-스테로이드성 항-염증성 약제(NSAID)이다. NSAID에는 아스피린과 아스피린-유사 약제가 포함된다. 이들은 관절의 통증, 경직, 팽화의 원인인 염증을 감소시킨다. 하지만, NSAID는 장출혈을 비롯한 다수의 부작용을 보이는 비특이적 약제이다(www.orthop.washington.edu). NSAID 이외에, 사이클로옥시게나제(COX-2) 저해물질인 Celebrex^TM가 성인에서 골관절염과 류머티스 관절염의 징후와 증상을 완화시키는데 사용되고 있다. 이는 가족성 선종성 용종증 환자의 치료에도 처방되고 있다.

WO 01/00229는 염증 치료를 위한 종양 괴사 인자(TNF) 길항물질과 COX-2 저해물질의 화합물을 개시한다.

TNF 길항물질은 관절염의 치료에도 사용된다. TNF 길항물질은 예로써 WO 91/03553에서 제시한다.

최근의 연구는 인터루킨-18(IL-18)이 관절 대사에서 친염증성 역할을 수행한 다는 것을 시사한다. Olee et al.(1999)은 IL-18이 관절 연골세포에 의해 생산되고, 친염증성 반응 및 이화 반응을 유도한다는 것을 입증하였다. 연골세포는 IL-18 전구물질을 생산하고, IL-1 자극에 반응하여 성숙한 형태의 IL-18을 분비한다. 연골세포에 대한 IL-18 효과와 관련된 연구들은 이것이 TGF-β-유도된 증식을 저해하고 산화질소 생산을 강화시킨다는 것을 추가로 입증하였다. IL-18은 산화질소 합성효소, 유도성 사이클로옥시게나제, IL-6, 스트로멜리신을 비롯하여, 정상적인 사람 관절 연골세포에서 몇몇 유전자의 발현을 촉진한다. 유전자 발현은 상응하는 단백질의 합성과 연관한다. 정상적인 사람 관절 연골을 IL-18로 처리하면, 글리코사미노글리칸의 방출이 증가한다. 이런 연구결과는 IL-18이 연골세포 반응을 조절하고 연골 퇴행의 원인이 되는 사이토킨임을 입증한다.

사람 골관절염 조직에서 인터루킨-1β-전환효소(ICE)/카스파제-1의 국소화 및 인터루킨-1베타와 인터루킨-18의 성숙에서 이의 역할은 Saha et al.(1990)에 의해 확인되었다. Saha et al.은 연골세포의 아폽토시스뿐만 아니라, 사람의 정상적인 연골과 활액 및 골관절염(OA) 연골과 활액에서 카스파제-1의 발현과 생산을 조사하고 OA 연골세포에서 ICE의 수준을 정량하고 ICE, 인터루킨-1β(IL-1β), IL-18의 국소위적 분포간 관계를 검사하였다. 상기 연구동안 실시된 실험에서 ICE는 사람 활액막과 연골 모두에서 발현되고 합성되는 것으로 밝혀졌는데, OA 조직에서 정상조직보다 현저하게 많은 수의 세포가 파지티브 염색되었다. ICE 생산은 가급적, 관절 연골의 표면과 상부 중간층에서 발견된다. OA 연골 외식편과 연골세포에서 성숙 IL-1베타의 생산은 IL-18-파지티브 세포의 수를 현저하게 감소시키는 특이적인 저해물질로 처리하면, 완전히 차단된다. 활성 IL-1베타와 ICE간의 관계는 ICE가 친염증성 사이토킨을 활성화시켜 OA 진행을 촉진하고 IL-18이 연골 병리의 원인이 된다는 것을 시사한다.

Gracie et al.(1999)은 류머티스 관절염에서 IL-18의 친염증성 역할을 시사하였다. Gracie et al.은 류머티스 관절염 활액 조직에서 골관절염 대조군에서보다 현저하게 높은 수준의 IL-18 mRNA와 단백질을 검출하였다. 또한, IL-12 혹은 IL-15와 IL-18의 화합물이 시험관내에서 활액 조직에 의한 IFN-γ 생산을 유도한다는 것을 밝혔다. 이에 더하여, 콜라겐/불완전 프레운드 어쥬번트-면역된 생쥐에 IL-18을 투여하면 퇴행성 염증성 관절염의 발생이 용이해지는데, 이는 IL-18이 생체내에서 친염증성임을 암시한다.

하지만, 화학적 화합물을 제외하고 가용성 수용체 또는 단클론 항체를 사용한 TNFα와 IL-1β의 차단만이 뮤린 콜라겐-유도된 관절염(CIA, 이는 류머티스 관절염에 대한 생쥐 모형)을 감소시키는 것으로 밝혀졌고, 따라서 류머티스 관절염에 대한 치료방법으로 제시되었다.

“만성 또는 특발성 염증성 장 질환”에는 적어도 2가지 질환이 포함된다: 크론병과 궤양성 대장염. 이들 질환은 위장관 질환이고, 크론병은 특히 소장에 많은 피해를 입힌다. 여기에 결장이 포함되는 경우, 궤양성 대장염과 구별하여 진단하는 것이 어려울 수 있다.

크론병에서 만성 염증과 궤양형성은 일반적으로, 급성 충수염과 유사한 소장 폐색증 또는 복통으로 시작된다; 다른 증상은 이의 합병증과 관련될 수 있다. 질환 과정이 만성으로, 치료에도 불구하고 악화 및 재발될 수 있다. 발병은 일반적으로 초기 성인 단계에서 일어나는데, 모든 사례의 절반 정도가 대략 20대 내지 30대에서, 90%가 10대 내지 40대에서 발생한다. 여성보다 남성에서 조금 더 많이 발병한다.

현미경 검사는 전체적인 상황을 반영한다. 염증 병발은 불연속적이다: 이는 한 곳에 집중되거나 또는 일정하지 않게 분포한다. 림프구와 혈장 세포의 집적은 점막과 점막하에서 주로 발견되지만, 모든 층에 영향을 준다(경벽성 염증). 크론병의 고전적인 현미경적 특징은 림프구로 둘러싸인 과립 세포의 존재다. 특발성 염증성 장질환의 빈도는 상당한 지리적 편차를 보인다. 이들 질환은 남유럽, 아프리카, 남아메리카, 아시아의 국가에서보다 북유럽과 미국에서 훨씬 빈번하게 발병하고, 도시화가 확산되고 있는 남유럽 일부와 일본에서도 발병율이 증가할 것으로 예상된다(General and Systematic Pathology, Churchill Livingstone, 3rd edition 2000, JCE Underwood, Ed.).

크론병에서 임상적으로 2부류의 군이 존재하는데, 제 1 군은 발병으로부터 3년이내에 질환이 완화되는 환자로 구성되고, 제 2 군은 3년이상 질환이 지속되는 환자로 구성된다.

병인에 상관없이, 친염증성 사이토킨, 특히 인터루킨(IL) 1,2,6,8, 인터페론(IFN)-γ, 종양 괴사 인자(TNF)α의 생산 증가로 크론병에서 부적절한 T-세포와 대식세포 활성화가 일관되게 나타난다. 크론병은 섬유증이 동반되는 지속성(만성) 염증으로 특징지어진다. 섬유아세포 증식과 콜라겐 침전의 과정은 특정 항-염증 활 동, 즉 섬유아세포 유입, 매트릭스 합성, 염증 세포의 하향 조절을 수행하는 전환 성장인자β에 의해 매개되지만, 다수의 다른 매개물질이 관여할 가능성도 있다.

궤양성 대장염은 대장의 비-특이적 염증성 질환으로서, 일반적으로 직장에서 시작하여 다양한 수준으로 인근 부위로 확대된다. 크론병과 달리, 궤양성 대장염은 대장에 국한된다.

궤양성 대장염이 변형된 자가면역 활성의 결과라는 증거가 늘어나고 있지만, 점막 손상은 대식세포와 호중구로부터 유래된 사이토킨, 프로테아제, 반응성 산소 대사물질에 의해 초래된 부적절한 T-세포 활성화 및 간접적인 손상에 기인할 수도 있다. 결장 상피세포에 대한 이런 후자 손상 기전은 “순수성 방관자“ 손상이라 한다. 자가면역을 뒷받침하는 증거는 만성 상피 세포와 내피세포에 반하는 자가-반응성 T-림프구와 자기항체 및 항-호중구 세포질 자기항체(ANCA)의 존재다. 하지만, 궤양성 대장염은 자가면역 질환으로 간주하지 않는데, 그 이유는 점막 손상이 자기항원에 대한 면역반응의 직접적인 결과이기 때문이다(General and Systematic Pathology, supra).

크론병의 치료와 관련하여, 대부분의 사람들은 염증 조절을 조력하는 물질인 메살라민을 함유하는 약제로 치료받게 된다. 이로부터 효과가 없는 또는 이를 견뎌낼 수 없는 환자는 5-ASA 약품으로 알려진 다른 메살라민-함유 약제를 복용할 수 있다. 메살라민의 가능 부작용에는 메스꺼움, 구토, 속쓰림, 설사, 두통이 포함된다.

일부 환자는 염증을 조절하기 위하여 코르티코스테로이드를 복용한다. 이들 약제는 활성 크론병에 매우 효과적이긴 하지만, 감염 위험성 증가를 비롯한 심각한 부작용을 초래할 수 있다.

면역계를 억제하는 약제 역시 크론병을 치료하는데 사용되고 있다. 6-멀캡토푸린 및 이와 관련된 약제인 아자티오프린이 가장 일반적으로 처방된다. 면역억제제는 염증의 원인이 되는 면역 반응을 차단하는 작용을 한다. 이들 약제는 메스꺼움, 구토, 설사와 같은 부작용을 초래하고 감염에 대한 환자의 저항성을 약화시킬 수 있다. 환자를 코르티코스테로이드와 면역억제제의 화합물로 치료하는 경우, 코르티코스테로이드의 복용량을 낮출 수 있다. 일부 연구는 면역억제제가 코르티코스테로이드의 유효성을 강화시킬 수 있음을 시사한다.

미국 식품의약국은 표준 요법(메살라민 물질, 코르티코스테로이드, 면역억제제)에 반응하지 않는 중등도 내지 중증도의 크론병 및 열린 배수 누관의 치료에 인플릭시맵을 승인하였다. 크론병에 대하여 한정적으로 승인된 첫 번째 치료약제인 인플릭시맵은 항-종양 괴사 인자(TNF) 단클론 항체다. 항-TNF는 TNF가 장에 도달하기 전에 혈류로부터 이를 제거하여, 염증을 예방한다.

항생제는 협착, 누관 또는 이전의 수술에 의해 초래된 소장에서 박테리아의 과성장을 치료하는데 사용된다. 이런 경우에, 의사는 다음의 항생제중 적어도 한가지를 처방할 수 있다: 앰피실린, 설폰아미드, 세팔로스포린, 테트라사이클린, 메트로니다졸.

설사와 경련성 복통은 염증이 가라앉으면 완화되는 경우가 많지만, 추가적인 약제가 필요할 수도 있다. 몇몇 항-설사제, 예를 들면 디페녹실레이트, 로페라미 드, 코데인을 사용할 수 있다. 설사로 인해 탈수증상을 보이는 환자는 일반적으로, 수액과 전해질로 치료한다.

부작용이 줄어들거나 또는 이상적으로는 부작용이 전혀 없으면서, 염증성 장 질환, 특히 크론병과 궤양성 대장염의 치료 및/또는 예방에 효과적인 치료법이 여전히 필요하다.

조직학적ㆍ면역학적 관찰은 세포-매개된 면역과 T 세포 활성화가 CD의 핵심적인 특성임을 시사한다. 사람과 실험 모형에서 연구결과는 국소적 면역반응이 주로 Th1형이고, 국소적으로 방출된 사이토킨, 예를 들면 IFN-γ, IL-1β, TNF-α가 염증 반응을 촉진하고 확대하는 한 원인이 된다는 것을 시사한다(Reimund et al. 1996).

사이토킨 IL-18은 사이토킨 IL-12와 협력하여 IFN-γ 분비를 촉진하고 고유 킬러 세포의 세포독성을 강화시키고 TH1 세포 분화를 촉진함으로써, Th1 매개된 면역 반응에서 중요한 역할을 수행한다(Uschito et al., 1996).

IL-18은 IL-12, IL-2, 항원, 미토겐, 다른 추가적인 인자와 함께 IFN-γ의 생산을 유도하는 역할을 한다. IL-18은 또한, GM-CSF와 IL-2의 생산을 강화시키고 항-CD3 유도된 T 세포 증식을 가능하게 하며 고유 킬러 세포의 Fas-매개된 사멸을 증가시킨다. 성숙 IL-18은 IL-1β전환효소(ICE, 카스파제-1)에 의해 전구물질로부터 만들어진다. IL-18 수용체는 리간드 결합에서 동시-작용하는 적어도 2가지의 성분으로 구성된다. IL-18에 대한 고-친화성 결합 부위와 저-친화성 결합부위가 뮤린 IL-12 자극된 T 세포에서 발견되었다(Okamoto et al., 1999). IL-18의 신호 전달에 는 NF-κB의 활성화가 관여한다(Matsumoto et al., 1997).

최근에, IL-18은 염증성 장 질환에 얼마간 관여하는 것으로 제시되었다(Pizarro, et al. 1999; Monteleone, et al. 1999).

Pizarro et al.(1999)은 크론병 환자로부터 유래된 결장 표본과 분리된 점막 세포 개체군에서 IL-18의 발현 및 국소화를 특성화하였다. 반정량적 RT-PCR 프로토콜을 활용하여, IL-18 mRNA 전사체가 궤양성 대장염과 비염증성 대조군 환자에 비하여 CD로부터 새로 분리된 장 상피세포와 점막고유층 단핵세포에서 증가한다는 것을 밝혔다. IL-18 mRNA 전사체는 점막고유층 단핵세포에 비하여 장내 상피세포에 더욱 풍부하게 존재한다. 외과적으로 절개된 결장 조직의 면역조직화학적 분석에서, IL-18은 점막고유층 단핵세포(특히, 대식세포와 수상돌기세포) 및 장내 상피세포 모두에서 확인되었다. 웨스턴 블랏 분석에서, 재조합 사람 IL-18 단백질 및 성숙 사람 IL-18 단백질과 일치하는 18.3-kDa 밴드는 주로 CD와 UC 장내 점막 생검에서 관찰되었다; 불활성 IL-18 전구물질과 일치하는 24kDa의 두 번째 밴드는 CD와 UC 생검의 비염증성 부위에서 검출되었고 비염증성 대조군에서 단독 형태로 관찰되었다.

Monteleone et al.(1999)은 이런 연구결과를 입증하였다. 12명의 크론병 환자와 9명의 궤양성 대장염 환자 및 15명의 비-염증성 장 질환 대조군의 전체 점막 장 조직과 점막고유층 단핵세포는 반정량적 RT-PCT과 웨스턴 블랏 분석으로 IL-18에 대하여 검사하였다. IL-18에 대한 전사체는 모든 검사 샘플에서 관찰되었다. 하지만, 증가된 IL-18 mRNA 축적은 궤양성 대장염과 대조군에 비하여 크론병의 점막 단핵세포와 점막고유층 단핵세포에서 검출되었다. 크론병에서, IL-18에 대한 전사체는 관련 부위에서 취한 점막 샘플에서 더욱 풍부하게 존재한다. 성숙 IL-18과 일치하는 18-kDa 밴드는 크론병 점막 샘플에서 주로 관찰된다. 비-IBD 대조군의 점막 샘플에서, IL-18은 24-kDa 폴리펩티드로 존재한다. 앞서 밝힌 바와 같이, 활성 IL-1베타-전환효소(ICE) 아단위(p20)은 CD 또는 UC의 샘플에서 발현되는 반면, 비-IBD 대조군의 결장 샘플에서 ICE는 전구물질(p45)로만 합성된다.

Dayer(1999)는 IL-18의 상이하고 부분적으로 상충되는 기능을 개관하였다. 요약하면, IL-18은 염증 강화와 약화 기능을 동시에 갖는 다향성 인터루킨이다. 한편, 이는 TNFα와 같은 친염증성 사이토킨의 생산을 증가시켜 염증을 촉진한다. 다른 한편, 이는 카스파제-1의 저해물질인 NO의 생산을 유도하여 IL-1β와 IL-18의 성숙을 차단하고 염증을 약화시킨다. IL-18의 이런 다의적인 역할은 염증성 질환에서 IL-18 저해물질의 효능에 심각한 의문을 제기한다. 이에 더하여, 염증의 조절에서 매우 다양한 별개의 사이토킨과 케모킨의 상호작용으로 인해, 염증 질환의 치료 또는 예방에서 주효체중 한가지만을 차단함으로써 얻을 수 있는 유익한 효과는 예단하기 어렵다.

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본 발명은 IL-18 저해물질이 상이한 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방에 효과적이라는 연구결과에 기초한다.

본 발명의 첫 번째 목적은 간 손상을 치료 및/또는 예방하는 신규한 수단을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 급성 또는 만성 간 손상의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 알코올성 간염, 바이러스성 간염, 면역성 간염, 전격성 간염, 간경화증, 원발성 담즙성 경화증의 치료 및/또는 예방에 관한다.

본 발명의 두 번째 목적은 관절염을 예방 및/또는 치료하는 신규한 수단을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 관절염의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다. IL-18 저해물질의 유익한 효과에는 관절염의 확대를 예방할 뿐만 아니라 이의 중증도를 감소시키는 것이 포함된다. 이런 연구결과는 관절염에 관여하는 특정 한 인자, 즉 인터루킨 IL-18의 차단이 관절염의 완화 또는 병든 관절의 치료를 결과한다는 결론을 도출할 수 없었던 선행 기술 과 현저하게 격별하다.

또한, IL-18의 투여는 관절염 뮤린 모형에서 연골 침식을 현저하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 연골 파괴의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.

본 발명의 세 번째 목적은 염증성 장 질환(IBD), 특히 크론병과 궤양성 대장염을 치료 및/또는 예방하는 신규한 수단을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 IBD의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다. 본 발명에 따라 IL-18BP mRNA와 단백질의 농도는 크론병 환자에서 유래된 생검의 염증성 점막 부위에서 증가하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 2가지 상이한 IL-18 저해물질이 염증성 장 질환의 뮤린 모형에서 질환으로부터 이를 보호하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명에서 IL-18 저해물질 및/또는 인터페론 및/또는 TNF 길항물질 및/또는 COX-2 저해물질의 병용을 창안한다. 병든 조직 또는 세포에 IL-18 저해물질을 전달하는데 있어 유전자 치료법을 적용하기 위한 본 발명의 다른 측면은 질환의 치료 및/또는 예방에서 IL-18 저해물질의 코딩 서열로 구성되는 발현 벡터의 용도에 관한다. 본 발명은 또한, 간 손상, 관절염, IBD의 예방 및/또는 치료에서 IL-18 저해물질의 내인성 유전자 활성화의 활용 및 IL-18 저해물질을 발현하도록 유전자 조작된 세포의 용도에 관한다.

본 발명은 상이한 질환과 장애에서 IL-18 저해물질의 유익한 효과의 발견에 기초한다.

본원에서 “IL-18 저해물질”은 IL-18 생산 및/또는 작용을 약화, 감소 또는 부분적으로, 실질적으로 혹은 완전히 예방하거나 차단하는 방식으로 IL-18 생산 및/또는 작용을 조정하는 임의의 분자를 의미한다. “Il-18 저해물질”에는 IL-18 작용의 저해물질뿐만 아니라 IL-18 생산의 저해물질이 포함된다.

생산의 저해물질은 IL-18의 합성, 가공 또는 성숙에 부정적인 영향을 주는 임의의 분자일 수 있다. 가령, 본 발명에 따른 저해물질은 인터루킨 IL-18의 유전자 발현의 저해물질, IL-18 mRNA의 전사를 감소 혹은 예방하거나 또는 mRNA의 분해를 초래하는 안티센스 mRNA, 정확한 접힘을 손상시키거나 또는 IL-18의 분비를 부분적으로 혹은 완전하게 예방하는 단백질, 일단 합성된 IL-18을 분해시키는 프로테아제, 성숙 IL-18을 만들기 위하여 전구-IL-18을 절단하는 프로테아제의 저해물질(예, 카스파제-1의 저해물질) 등일 수 있다.

IL-18 작용의 저해물질은 예로써 IL-18 길항물질일 수 있다. 길항물질은 IL-18, 또는 리간드(예, 수용체)에 대한 IL-18 결합을 담당하는 IL-18 결합위치를 부분적으로 혹은 실질적으로 중화시키는 친화성과 특이성으로 IL-18 분자 자체와 결합하거나 이를 격리시킬 수 있다. 길항물질은 IL-18 신호 경로를 저해할 수도 있는데, 이런 경로는 IL-18/수용체 결합직후에 세포에서 활성화된다.

IL-18 작용의 저해물질은 가용성 IL-18 수용체 혹은 이런 수용체를 모방하는 분자, IL-18 수용체를 차단하는 약제, IL-18 항체(예, 다클론과 단클론 항체), 또는 IL-18과 이의 표적의 결합을 예방하여 IL-18에 의해 매개되는 세포내외 반응의 유인을 감소 혹은 예방하는 임의의 다른 약제 또는 분자일 수도 있다.

본 발명의 제 1 측면에서, IL-18 저해물질은 간 손상의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용된다. 바람직하게는, 본 발명은 급성과 만성 간 질환, 더욱 바람직하게는 알코올성 간염, 바이러스성 간염, 면역성 간염, 전격성 간염, 간경화증, 원발성 담즙성 경화증의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.

간 손상 또는 간 질환에는 다양한 병리학적 이상이 포함된다. 본 발명에서 목적으로 하는 여러 질환은 상기 “본 발명의 배경 기술”에서 구체적으로 설명하였다. 본 발명에 따라 치료 및/또는 예방할 수 있는 추가적인 간 질환에는 예로써 화농성 간농양이 포함된다. 이는 세균 간이라고도 하며, 간에 화농성 구멍이 생긴다. 간농양의 원인은 다중적이다. 이는 복부 간염, 예를 들면 충수염, 게실염, 천공된 장; 혈액 감염; 담즙(간 분비)관 감염; 또는 상처입은 간이 감염될 때의 외상으로부터 발생할 수 있다. 간농양을 초래하는 가장 일반적인 미생물은 대장균(E. coli), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 엔테로박터 에로제니스(Enterobacter aerogenes)이다. 발병율은 1만명당 1명이다.

알코올성 간 질환은 본 발명에 따른 IL-18 저해물질로 치료 및/또는 예방할 수 있다. 여기에는 알코올 중독으로 인한 간의 급성 또는 만성 염증이 포함된다. 알코올성 간염은 수년간의 과도한 음주에 의해 발생한다. 음주 기간이 길고 주량이 많을수록, 간 질환이 발병할 가능성이 높다. 알코올의 엠프티칼로리(empty calorie), 식욕 감소, 흡수장애(장관으로부터 영양분의 부적절한 흡수)의 결과로 영양불량이 발생한다. 영양불량은 간 손상의 한 원인이다. 간에 대한 에탄올의 독성, 알코올-유도된 간 질환에 대한 개인적 취약성, 유전 인자 역시 알코올성 간 질환 발병의 원인이 된다.

본 발명에 따라, 간경화증은 IL-18 저해물질로 치료 및/또는 예방할 수 있다. 경화증은 간 조직에 대한 손상, 간의 반흔(섬유증; 결절성 재생), 간 기능의 점진적인 저하, 복부에 과도한 체액(복수증), 출혈성 질환(응고장애), 혈압에서 압력증가(문맥압 항진증), 뇌 기능 장애(간성 뇌증)를 초래하는 만성 간 질환이다. 손상되고 반흔형성된 간은 혈액으로부터 노폐물을 효과적으로 제거하지 못하고, 반흔 조직의 형성은 장과 비장 및 간사이의 정맥에 압력을 증가시킨다(문맥압 항진증). 과도한 음주는 경화증의 주원인이 된다. 다른 원인에는 감염(예, 간염), 담즙 배출 체계의 결함(예, 담관 협착이나 폐색), 낭포성 섬유증, 철과 구리의 흡수 증가가 포함된다.

경화증의 유형은 병의 원인에 따라 달라진다. 경화증의 합병증은 심할 수 있다. 경화증은 9번째 주요 사망 원인이다. 신경학적 문제(예, 간성 뇌증)가 발생할 수도 있다. 복강에서 체액 증가(복수증)는 체단백질 감소, 나트륨 증가, 간의 혈관에서 압력 증가(문맥압 항진증)에 의해 야기된다. 문맥압 항진증은 혈관의 압력, 크기, 포만의 증가를 초래할 수 있다(식도 정맥류). 출혈과 응혈에 문제가 발생할 수 있다. 혈관에서 압력이 증가하고 응혈에 문제가 발생하면, 생명을 위협하는 심각한 출혈이 발생할 수 있다.

본 발명에 따른 “간 손상”에 포함되는 추가적인 질환은 자가면역성 간염이 다. 이는 면역계와의 상호작용으로 야기되는 간의 염증이다. 자가면역성 간염은 일종의 만성 활성 간염이다. 세포성 면역반응이 만성 활성 간염의 원인일 수 있다. 다양한 순환 자기항체가 만성 활성 간염 환자의 혈액에서 발견된다. 다른 자가면역성 질환은 만성 활성 간염과 연관하거나, 또는 만성 활성 간염 환자의 친척에서 발생할 수 있다. 이들 질환은 갑상선염, 당뇨병, 궤양성 대장염, 쿠움즈-파지티브 용혈성 빈혈, 증식성 사구체신염, 쇼그렌 증후군이다. 위험 인자에는 이들 질환 또는 만성 활성 간염과 관련된 위험 인자가 포함된다. 발병률은 1만명당 4명이다.

담관 폐쇄는 “간 손상”에 포함되는 추가적인 질환이다. 이는 일반적으로 출생이전에 발생하는(자궁에서) 담관의 부전으로 발생하는 폐쇄다. 담관 폐쇄는 간내외에서 담관의 비정상적이고 부적절한 발달에 의해 야기된다. 담관계의 목적은 간으로부터 노폐물을 제거하고, 지방 분해에 필요한 담즙산 염을 소장에 전달하는 것이다. 상기 질환에서, 간에서 방광으로의 담즙 흐름이 차단된다. 이는 간 손상 및 간경화증를 초래하는데, 이들 질환은 치료하지 않는 경우 치명적이다.

본 발명에 따라, IL-18 저해물질은 만성 활성 간염(또는 만성 공격성 간염)의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에도 사용된다. 만성 활성 간염의 원인에는 바이러스 감염, 약제 반응/섭취, 대사장애 또는 자가면역 질환이 포함된다. 또한, 명확한 원인이 없을 수도 있다. 상기 질환은 간부전, 경화증, 사망을 초래할 수 있는 간세포의 괴사나 죽음, 활성 염증, 섬유증으로 특징지어진다. 발병률은 1만명당 1명이다. 위험 인자는 자가면역 질환, C형 간염의 이전 감염, 또는 6개월이상의 양성 A형이나 B형 간염 항원이다.

만성 지속성 간염은 경등도의 비진행성 간 염증으로, 본 발명에 따른 “간 손상”에 포함된다.

*본 발명에 따라, IL-18 저해물질은 원발성 담즙성 경화증(PBC)의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에도 사용된다. PBC는 간에서 담즙 흐름의 폐쇄에 기인하는 염증성 질환이다. 간에서 담관은 미지의 원인에 의해 과도한 자극을 받게 된다. 상기 질환은 주로 중년의 여성에게 피해를 준다. 증상의 징후는 점진적인데, 첫 번째 증상으로 피부가 가렵다. 간내에서 담관에 염증이 발생한다. 최종적으로 간경화증이 발병한다. 상기 질환은 자가면역 질환과 관련될 수 있다. 발병률은 10만명당 8명이다. 본 발명에 따른 IL-18은 예로써 과량의 파라세타몰에 의해 야기되는 급성 간 중독의 치료에도 사용할 수 있다. 이런 급성 간 중독은 파라세타몰의 과량 복용에 기인할 수도 있다.

하기 실시예에 보인 바와 같이, IL-18 저해물질은 전격성 간염(급성 간염)의 예방과 치료에 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 바람직하게는 전격성 간염의 예방 및/또는 치료에 관한다.

본 발명의 두 번째 측면에 따라, IL-18 저해물질은 관절염의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용된다.

본원에서 “관절염”에는 Department of Orthopaedics of the University of Washington on Arthritis의 홈페이지(www.orthop.washington.edu)에 정의되어 있는 모든 상이한 유형의 급성과 만성 관절염 및 관절 이상이 포함된다. 관절 이상의 예 는 강직성 척추염, 요통, 수근 침착 증후군, Ehlers-Danlos 증후군, 통풍, 연소자성 관절염, 홍반성 루프스, 근염, 골형성 부전증, 골다공증, 다발성 관절염, 다발성 근염, 건선성 관절염, 라이터 증후군, 경피증, 장 질환과 관련된 관절염, 베체트병, 소아 관절염, 퇴행성관절염, 섬유근통, 감염성 관절염, 라임병, 마로판 증후군, 골관절염, 골괴사, 파제트병, 류머티스성 다발성관염, 가성통풍, 반사성 교감신경성 이영양증, 류머티스 관절염, 류머티즘, 쇼그렌 증후군, 가족성 선종성 용종증 등이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 IL-18 저해물질은 염증성 관절염의 치료 및/또는 예방을 위하여 제공한다. 염증성 관절염은 지속적인, 연속적인 또는 재발성 과정에 따른 만성적인 관절염으로 특징지어진다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 염증성 관절염은 류머티스 관절염(RA)이다. RA는 관절의 내막(관절의 활막, 단일세포층 내피) 및 내부 기관에 염증을 초래한다. 상기 질환은 수년동안 지속되고, 전신의 다수 관절에 영향을 주며, 궁극적으로 연골, 뼈, 건, 인대에 손상을 초래할 수 있다. RA의 영향을 받는 관절은 목, 어깨, 팔꿈치, 엉덩이, 손목, 손, 무릎, 발목, 발가락에 위치하는 관절이다. 많은 경우에, RA상태의 관절은 대칭적으로 염증이 발생한다.

RA는 전체 인구의 1%에서 발병하고, 모든 인종과 연령에서 폭넓게 분포한다. 이는 전세계적으로 발병하고, 여성 환자가 남성 환자보다 3배 더 많다.

하기 실시예에 보인 바와 같이, IL-18 저해물질은 연골 침식증에 매우 유익한 효과를 보이는 것으로 입증되었다. 따라서, 본 발명은 연골 파괴의 예방 및/또 는 치료를 위한 약제의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도, 다시 말하면 연골보호성 약제로서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다. IL-18 저해물질은 연골 파괴 또는 침식이 발생하는 임의의 이상에도 사용할 수 있다. 연골 파괴는 관절 연골의 구조적 일체성의 점진적인 감소다. 이는 류머티스 관절염, 연소자성 류머티스 관절염 또는 골관절염과 같은 관절 연골에 피해를 입히는 질환 및 전염성 활막염에서 발생한다.

본 발명의 세 번째 측면은 염증성 장 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다. 이는 IL-18의 저해물질이 CD 환자의 염증 점막에서 상향 조절된다는 발견에 기초한다. 이는 상이한 IL-18 저해물질의 투여가 대장염의 뮤린 모형에서 보호 효과를 갖는다는 발견에 추가적으로 기초한다.

CD 환자의 염증 점막에서 IL-18의 상향 조절은 당분야에 공지된 것이다(Monteleone, et al. 1999; Pizarro, et al. 1999).

본 발명에서 장내 점막의 염증 부위에서 높은 함량의 IL-18BP 존재가 입증된 이후, 동물 모형에서 대장염의 발생 및 증상에 대한 전신 투여된 IL-18BP의 현저하고 유익한 효과가 밝혀졌다. 비록 IL-18BP가 하기 실시예에 보인 바와 같이 CD 환자의 장에서 내생적으로 상향 조절되지만, 신체가 생산할 수 있는 IL-18BP의 함량은 대장염을 극복하는데 충분하지 않은 것으로 보인다.

바람직하게는, 본 발명에서 염증성 장 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 카스파제-1(ICE) 저해물 질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 임의 하나에 대한 항체, IL-18 신호 경로의 저해물질, IL-18과 경합하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질 및 IL-18 결합단백질, 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성단편 또는 동일 활성을 보유하는 이들의 순환 치환된 유도체에서 선택된다.

“IL-18 결합단백질”은 본원에서 IL-18BP와 동의어로 사용된다. 이는 WO 99/09063 또는 Novick et al., 1999에 정의된 IL-18 결합단백질 및 Kim et al., 2000에 정의된 IL-18 결합단백질의 접합변이체 또는 동소체로 구성된다. 특히, 본 발명에서 IL-18BP의 사람 동소체 a와 c가 유용하다. 본 발명에 효과적인 단백질은 당화되거나 또는 당화되지 않을 수 있고, 천연 공급원(예, 소변)으로부터 유래되거나 또는 재조합 방식으로 만들 수 있다. 재조합 발현은 원핵 발현계(예, 대장균(E. coli)) 또는 진핵, 특히 포유동물 발현계에서 실시할 수 있다.

본원에서 “뮤테인”은 IL-18BP의 유사체 혹은 바이러스성 IL-18BP의 유사체를 말하는데, 여기서 고유 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 아미노산 잔기중 적어도 하나는 상이한 아미노산 잔기로 치환되거나, 결실되거나 또는 1개 이상의 아미노산 잔기가 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 고유 서열에 부가되는데, 이때 야생형 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP과 비교하였을 때 생성된 산물의 능력에 큰 변화가 없다. 이와 같은 뮤테인은 공지된 합성 방법 및/또는 특정부위-돌연변이유발 기술, 또는 임의의 다른 공지된 적절한 기술을 이용하여 만들 수 있다.

임의의 이런 뮤테인은 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 가지기 때문에, IL-18BP와 실제 유사한 활성을 가진다. IL- 18BP의 한 가지 활성은 IL-18에 결합하는 능력이다. 뮤테인이 IL-18에 대하여 실제적인 결합 활성을 가지는 경우에, 이는 친화성 크로마토그래피와 같은 수단으로 IL-18의 정제에 사용할 수 있고, 이로써 IL-18BP와 실제 동일한 활성을 가지는 것으로 간주할 수 있다. 따라서, 통상적인 실험방법으로 임의의 뮤테인이 IL-18BP와 실질적으로 동일한 활성을 가지는 지를 결정할 수 있는데, 상기 실험방법은 적절히 라벨된 IL-18과 뮤테인이 결합하는 지를 측정하는 간단한 샌드위치 경합 분석 단계, 예를 들면 방사능면역검사 또는 ELISA 분석에 이런 뮤테인을 적용하는 단계로 구성된다.

본 발명에 따라 사용할 수 있는 IL-18BP 폴리펩티드 혹은 바이러스성 IL-18BP의 뮤테인 또는 이를 인코드하는 핵산에는 본원에 제시된 지시에 따라 과도한 실험없이 당업자가 용이하게 수득할 수 있는 치환된 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 일단의 실질적으로 상응하는 서열이 포함된다.

본 발명에 따른 뮤테인에 대한 적절한 변화는 “보존성” 치환이다. IL-18BP 폴리펩티드 혹은 단백질 또는 바이러스성 IL-18BP의 보존성 아미노산 치환에는 분자의 생물학적 기능을 보존하면서 유사한 물리화학적 성질을 가지는 일군의 동질성 아미노산이 포함된다(Grantham, 1974). 기능의 변화없이 아미노산의 부가 또는 결실이 상기 정의된 서열에서 이루어질 수 있는데, 특히 30개 이하, 적절하게는 10개 이하의 아미노산이 부가 또는 결실되고 기능적 구조에 중요한 아미노산(시스테인 잔기)은 결실 또는 치환되지 않는 경우에, 기능의 변화없이 아미노산의 부가 또는 결실이 가능하다. 이런 결실/부가에 의해 만들어지는 단백질 및 뮤테인은 본 발명 의 목적에 포함된다.

바람직한 동질성 아미노산 군은 표 1에 제시한다. 더욱 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 2에 제시한다; 가장 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 3에 제시한다.

본 발명에 사용할 수 있는 IL-18BP 폴리펩티드이나 단백질의 뮤테인 또는 바이러스성 IL-18BP의 뮤테인을 수득하는데 사용할 수 있는 단백질에서 아미노산의 치환체를 만드는 방법의 예는 임의 공지된 방법이 포함되는데, 이들 방법은 가령 미국 특허 RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al.,) 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,); 리신이 치환된 경우는 미국 특허 4,904,584(Shaw et al.,)에서 제시한다.

“융합단백질”은 체액에서 체류 시간이 연장된 다른 단백질과 융합되는 IL-18BP, 바이러스성 IL-18BP 또는 이들의 뮤테인으로 구성되는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, IL-18BP 또는 바이러스성 IL-18BP는 다른 단백질, 폴리펩티드 등, 예를 들면, 면역글로불린 또는 이의 단편과 융합될 수 있다.

본원에서 “기능성 유도체”에는 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 유도체, 이들의 뮤테인, 융합된 단백질이 포함되고, 이들은 당분야에 공지된 수단으로 잔기 또는 N- 혹은 C-말단기에서 측쇄로 생성되는 작용기로부터 만들 수 있는데, 이들이 제약학적으로 수용가능하면, 다시 말하면 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 활성과 실제 유사한 단백질의 활성을 파괴하지 않고 이를 함유하는 조성물에 독성 성질을 부여하지 않는다면 본 발명에 포함된다.

가령, 이들 유도체는 폴리에틸렌 글리콜 측쇄를 포함하는데, 이는 항원성 부위를 차단하고 체액에서 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 잔류를 연장시킬 수 있다. 다른 유도체에는 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 일ㆍ이차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아미드, 아실 성분(가령, 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일 작용기)으로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 N-아실 유도체, 아실 성분으로 형성된 유리 하이드록실기(가령, 세릴 또는 테레오닐 잔기)의 O-아실 유도체 등이 포함된다.

본 발명에서 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 “활성 분획물”, 뮤테인, 융합단백질에는 단독으로, 또는 관련된 분자나 이와 결합된 잔기(예, 당이나 인산염 잔기) 혹은 단백질 분자나 당 잔기의 자체적인 응집체와 조합된 단백질 분자의 폴리펩티드 사슬의 임의 단편이나 전구물질이 포함되는데, 단 이런 분획물은 IL-18BP와 실질적으로 유사한 활성을 보유해야 한다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 IL-18 항체다. 항-IL-18 항체는 다클론이나 단클론, 키메라, 인화 또는 인간 항체다. 재조합 항체와 이의 단편은 생체내에서 IL-18에 대한 높은 친화성 결합 및 저독성으로 특징지어진다. 본 발명에 사용할 수 있는 항체는 병리 이상 또는 이와 관련된 여러 증상 및 저독성을 효과적으로 저하 또는 완화시킬 만큼 충분한 기간 동안 환자를 치료할 수 있는 능력으로 특징지어진다.

중화 항체는 IL-18 면역주사로 토끼, 염소 또는 생쥐와 같은 동물에서 생성시킨다. 면역화된 생쥐는 하이브리도마 제조를 위한 B 세포의 공급원을 제공하는데 특히 유용한데, 상기 하이브리도마는 배양하여 다량의 항-IL-18 단클론항체를 생산한다.

키메라 항체는 상이한 동물 종으로부터 유래된 2개 이상의 분절 또는 일부분으로 특징지어지는 면역글로불린 분자다. 일반적으로, 키메라 항체의 가변 영역은 비-사람 포유동물 항체, 예를 들면 뮤린 단클론항체로부터 유래되고, 면역글로불린 불변 영역은 사람 면역글로불린 분자로부터 유래된다. 가급적, 양 영역 및 이들의 조합은 일반적으로 낮은 면역원성을 갖는다(Elliote et al., 1994). 인간화 항체는 유전공학 기술로 만들어진 면역글로불린 항체로, 여기서 뮤린 불변 영역은 사람 불변 영역으로 대체되고 뮤린 항원 결합 영역은 계속 잔존한다. 생성된 생쥐-사람 키메라 항체는 사람에서 낮은 면역원성 및 향상된 약동학을 보유한다(Knight et al., 1993).

따라서, 다른 바람직한 구체예에서 IL-18 항체는 IL-18 인간화 항체다. 바람직한 항-IL-18 인간화 항체의 예는 유럽 특허 출원 EP 0 974 600에서 기술한다.

다른 바람직한 구체예에서, IL-18 항체는 완전한 인간 항체다. 인간 항체를 생산하는 기술은 WO 00.76310, WO 99/53049, US 6,162,963 또는 AU5336100에서 자세히 기술한다. 바람직한 완전 인간 항체는 기능성 사람 Ig 좌위의 전체 또는 일부분을 포함하는 외래유전자도입 동물, 예를 들면 외래유전자도입 생쥐에서 만들어진 재조합 항체다.

본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 IL-18BP, 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 이들의 순환 치환된 유도체이다. 이들 동소체, 뮤테인, 융합단백질 또는 기능성 유도체는 IL-18BP의 생물학적 활성, 특히, IL-18에 대한 결합능력을 유지하고, IL-18BP와 적어도 유사한 활성을 보유한다. 이상적으로는, 이런 단백질은 변형되지 않은 IL-18BP와 비교하여 증가된 생물학적 활성을 갖는다. 적절한 활성 분획물은 IL-18BP의 활성보다 더욱 높은 활성, 바람직하게는 더욱 높은 안정성 또는 더욱 낮은 독성이나 면역원성을 보유하거나, 대량으로 더욱 용이하게 생산 또는 정제된다.

IL-18BP의 서열 및 이의 접합변이체/동소체는 Kim et al., 2000 뿐만 아니라, WO 99/09063 또는 Novick et al., 1999에서 구할 수 있다.

IL-18BP의 기능성 유도체는 중합체에 공액시켜 단백질의 특성, 예를 들면 안정성, 반감기, 생체이용효율, 사람 신체에 의한 내약성 또는 면역원성을 향상시킬 수 있다. 이를 달성하기 위하여, IL-18BP는 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 결합시킬 수 있다. 페길화(PEGlaytion)는 WO 92/13095에서 밝힌 방법으로 실시할 수 있다.

따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서 IL-18BP는 페길화된다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 IL-18 결합단백질의 전체 또는 일부분으로 구성되는 융합단백질로, 이는 면역글로불린의 전체 또는 일부분과 융합된다. 생성된 융합단백질은 IL-18BP의 생물학적 활성, 특히 IL-18에 대한 결합능력을 계속 유지한다. 융합은 직접적으로, 또는 짧게는 1 내지 3개 아미노산 잔기 혹은 이보다 긴, 예를 들면 13개 아미노산 잔기의 링커 펩티드를 통하여 달성할 수 있다. 상기 링커는 삼중항 IL-18BP 서열과 면역글로불린 서열간에 도입된 펩티드 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met) 또는 13개 아미노산 링커 서열 Glu-Phe- Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met이다. 생성된 융합단백질은 체액에서 연장된 잔류 시간(반감기), 증가된 특이적 활성, 증가된 발현 수준 또는 용이해진 융합단백질의 정제와 같은 향상된 특성을 보유한다.

바람직한 구체예에서, IL-18BP는 Ig 분자의 불변 영역에 융합된다. 바람직하게는, 이는 예로써 사람 IgG1의 CH2와 CH3 도메인과 같은 중쇄 영역에 융합된다. IL-18BP 및 면역글로불린의 일부분으로 구성되는 특이적 융합단백질의 생산은 WP 99/09063(실시예 11)에서 기술한다. Ig 분자의 다른 동소체는 본 발명에 따른 융합단백질, 예를 들면 동소체 IgG₂ 혹은 IgG₄, 또는 다른 Ig(IgM, IgA)의 생산에도 적합하다. 융합 단백질은 단량체 또는 다량체(헤테로- 혹은 동종)일 수 있다.

인터페론은 바이러스 복제와 세포 증식에 대한 저해 효과로 알려져 있다. 가령, 인터페론-γ는 면역과 염증 반응을 촉진하는데 중요한 역할을 한다. 인터페론β(IFN-β, I형 인터페론)는 항-염증 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. TRiantaphyllopoulos et al(1999)의 연구는 IFN-β가 콜라겐-유도된 관절염(CIA) 모형인 류머티스 관절염 생쥐 모형에서 류머티스 관절염 치료에 유익한 효과를 갖는다고 암시하였다. IFN-β의 이런 유익한 효과는 하기 실시예에서 입증된다.

또한, 본 발명은 관절염, 특히 류머티스 관절염의 치료를 위한 약제의 제조에서 IL-18 저해물질과 인터페론의 병용에 관한다.

인터페론은 중합체에 공액시켜 단백질의 안정성을 향상시킬 수 있다. 인터페론β와 폴리올 폴리에틸렌글리콜(PEG)간의 공액체는 WO 99/55377에서 기술한다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 인터페론은 인터페론-β, 더욱 바람직하게는 IFN-β1a이다.

IL-18 생산 및/또는 작용의 저해물질은 가급적 인터페론과 동시에, 순차적으로 또는 별도로 사용한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, IL-18 저해물질은 TNF 길항물질과 병용한다. TNF 길항물질은 여러 방식으로 활성을 나타낸다. 먼저, 길항물질은 TNF 수용체 결합을 담당하는 TNF 에피토프를 부분적으로 또는 실질적으로 중화시키는데 충분한 친화성과 특이성으로 TNF 분자 자체와 결합하거나 또는 이를 격리시킬 수 있다(이후, “격리 길항물질”). 격리 길항물질은 예로써 TNF에 대한 항체일 수 있다.

대안으로, TNF 길항물질은 TNF 결합이후에 세포표면 수용체에 의해 활성화되는 TNF 신호 경로를 저해할 수 있다(이후, “신호 길항물질”). 이들 길항물질은 관절염, 특히 류머티스 관절염의 치료에서 단독으로 사용하거나 또는 IL-18 저해물질과 병용한다.

TNF 길항물질은 시험관내에서 영향을 쉽게 받는 세포주, 예를 들면 TNF가 증식과 면역글로불린 분비를 유발하는 사람 B 세포에서 고유 TNF의 활성에 대한 효과를 일반적인 후보 스크리닝으로 확인하고 평가한다. 상기 분석에는 다양하게 희석된, 예를 들면 분석에 사용된 TNF의 0.1 내지 100배 몰농도의 후보 길항물질의 TNF 제형 및 TNF가 없거나 길항물질만 있는 대조군이 포함된다(Tucci et al., 1992).

격리 길항물질은 본 발명에 사용하는데 적합한 TNF 길항물질이다. 격리 길항물질중에서, 높은 친화성으로 TNF와 결합하고 낮은 면역원성을 보유하는 폴리펩티드가 바람직하다. 가용성 TNF 수용체 분자 및 TNF에 대한 중화 항체가 특히 바람직하다. 가령, 가용성 TNF-RI과 TNF-RII는 본 발명에 유용하다. 수용체의 세포외 도메인 또는 이들의 기능성 일부분을 포함하는 이들 수용체의 절두형은 본 발명에 특히 바람직한 길항물질이다. 절두된 가용성 TNF I형 수용체와 II형 수용체는 EP914431에서 기술한다.

TNF 수용체의 절두형은 가용성이고 소변과 혈청에서 30kDa와 40kDa TNF 저해 결합단백질로 검출되는데, 이들은 각각 TBPI과 TBPII라고 한다(Engelmann et al., 1990). 본 발명에서 TNF 길항물질 및/또는 인터페론과 IL-18 저해물질의 동시, 순차 또는 개별 사용이 바람직하다.

본 발명에서, TBPI과 TBPII는 IL-18 저해물질과 병용하는데 적합한 TNF 길항물질이다. 수용체 분자의 유도체, 단편, 일부분, 생물학적 활성 단편은 본 발명에 사용할 수 있는 수용체 분자와 기능적으로 유사하다. 수용체 분자의 이런 생물학적 활성 등가물 또는 유도체는 폴리펩티드의 일부분 또는 수용체 분자를 인코드하는 서열의 일부분을 의미하는데, 이는 막-결합된 TNF 수용체를 저해 또는 차단할 정도의 친화력으로 TNF와 결합할 수 있다.

다른 바람직한 구체예에서, 사람 가용성 TNF-RI(TBPI)는 본 발명에 따라 사용되는 TNF 길항물질이다. 고유와 재조합 가용성 TNF 수용체 분자 및 이들의 생산 방법은 유럽 특허 EP308 378; EP 398 327; EP 433 900에서 기술한다.

IL-18 저해물질은 TNF 저해물질과 동시에, 순차적으로 또는 독립적으로 사용할 수 있다. 가급적, TNF 저해활성을 보유하는 IL-18 항체 또는 항혈청과 가용성 TNF 수용체의 화합물을 사용한다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 약제는 COX-저해물질, 바람직하게는 COX-2 저해물질을 추가로 함유한다. COX 저해물질은 당분야에 공지되어 있다. 특이적인 COX-2 저해물질은 WO 01/00229에서 개시한다.

또한, 본 발명은 IL-18 저해물질 및/또는 인터페론 및/또는 TNF 길항물질 및/또는 COX-2 저해물질의 화합물의 용도에 관한다. 상기 화합물은 관절염(특히, 류머티스 관절염), 간 손상, 염증성 장 질환(특히, 크론병과 궤양성 대장염)의 치료 및/또는 예방에 적합하다. 활성 성분은 동시에, 순차적으로 또는 독립적으로 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 체중 ㎏당 대략 0.0001 내지 10 ㎎, 바람직하게는, 체중 ㎏당 대략 0.01 내지 5 ㎎, 더욱 바람직하게는, 체중 ㎏당 대략 0.1 내지 3 ㎎, 가장 바람직하게는, 체중 ㎏당 대략 1 내지 2 ㎎의 양으로 사용된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 체중 ㎏당 대략 0.1 내지 1000 ㎍, 바람직하게는, 체중 ㎏당 대략 1 내지 100 ㎍, 더욱 바람직하게는, 체중 ㎏당 대략 10 내지 50 ㎍의 양으로 사용된다.

또한, 본 발명은 관절 이상 혹은 관절염(특히, 류머티스 관절염), 간 손상, 염증성 장 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 IL-18 저해물질의 코딩 서열로 구성되는 발현 벡터의 용도에 관한다. 따라서, 상기 질환을 치료 및/또는 예방하는데 유전자 치료법을 활용한다. 가급적, IL-18 저해물질은 in situ 발현시켜, 상기 질환의 영향을 받는 조직 또는 세포에서 IL-18을 효율적으로 직접 차단한다.

관절염을 치료 및/또는 예방하기 위하여, IL-18 생산 또는 작용의 저해물질 서열로 구성되는 유전자 치료 벡터는 질환 관절에 직접 주사하고, 따라서 유전자 치료 벡터의 전신 투여와 관련된 문제점, 예를 들면 벡터의 희석, 표적 세포 혹은 조직의 접근과 표적화, 부작용을 회피할 수 있다.

정상 상태에서는 IL-18 저해물질의 발현이 중단되는 또는 충분한 함량의 저해물질을 발현하지 못하는 세포에서 IL-18 저해물질의 내생적 생산을 유도 및/또는 강화하기 위한 벡터의 용도 역시 본 발명에 포함된다. 상기 벡터는 IL-18 저해물질을 발현하도록 소요의 세포에서 작동하는 조절 서열을 포함한다. 이런 조절 서열은 프로모터 또는 인헨서일 수 있다. 이후, 조절 서열은 동종 재조합으로 게놈의 정확한 좌위에 도입할 수 있는데, 여기서 조절 서열은 발현을 유도 혹은 강화시켜야 하는 유전자에 동작가능하도록 연결된다. 이런 기술은 “내생적 유전자 활성화(EGA)“라 한다(WO 91/09955).

당업자가 인지하는 바와 같이 동일 기술을 활용하여, 다시 말하면 네거티브 조절 요소(예, 억제 인자)를 Il-18의 유전자 좌위에 도입하여 IL-18 발현을 차단하고, 따라서 IL-18 발현을 하향-조절 또는 예방하는 것이 가능하다. 당업자가 인지하는 바와 같이 IL-18 발현의 이런 하향-조절 또는 억제는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 IL-18 저해물질의 이용과 동일한 효과를 갖는다.

또한, 본 발명은 간 손상, 관절염 또는 염증성 장 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 IL-18의 저해물질을 생산하도록 유전자 조작된 세포의 용도에 관한다.

또한, 본 발명은 염증성 관절염, 간 손상 또는 염증성 장 질환의 예방 및/또는 치료에 특히 유용한 제약학적 조성물에 관하는데, 이는 치료요법적 효과량의 IL-18 저해물질 및 치료요법적 효과량의 인터페론으로 구성된다. IL-18의 저해물질로서, 상기 조성물은 카스파제-1 저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 임의 하나에 대한 항체, IL-18 신호 경로의 저해물질, IL-18과 경합하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18 길항물질 및 IL-18 결합단백질, 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 동일 활성을 보유하는 순환 치환된 이들의 유도체를 함유할 수도 있다.

전술한 IL-18BP, 이의 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 순환 치환된 유도체는 제약학적 조성물에 적합한 활성 성분이다.

제약학적 조성물에 포함되는 인터페론은 IFN-β이다.

다른 바람직한 구체예에서, 제약학적 조성물은 치료요법적 효과량의 IL-18 저해물질, 선택적으로 인터페론, TNF 길항물질로 구성된다. TNF 길항물질은 TNF 활성을 중화시키는 항체 또는 절두된 가용성 TNF 수용체 단편(즉, TBPI과 TPBII)일 수 있다. 본 발명에 따른 제약학적 조성물은 하나 또는 복수의 COX 저해물질, 바람직하게는 COX-2 저해물질을 추가로 함유할 수 있다.

“제약학적으로 수용가능한”은 활성 성분의 생물학적 효능을 방해하지 않고 투여된 숙주에 독성을 보이지 않는 임의의 담체를 의미한다. 가령, 비경구 투여에서 활성 단백질은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 운반체에 녹인 주사용 단위 약형으로 만들 수 있다.

본 발명에 따른 제약학적 조성물의 활성 성분은 다양한 방법으로 개체에 투여할 수 있다. 투여 경로에는 피내, 경피(예, 서방 제형), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구, 경막외, 표면, 비강내 경로가 포함된다. 치료요법적으로 유효한 임의의 투여 경로, 예를 들면 상피나 내피 조직을 통한 흡수, 또는 활성 성분을 인코드하는 DNA 분자를 환자에 투여하고(예, 벡터를 통하여) 상기 DNA 분자가 생체내에서 활성 성분을 발현 및 분비하는 유전자 요법을 활용할 수 있다. 이에 더하여, 본 발명에 따른 단백질은 제약학적으로 수용가능한 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제, 운반체와 같은 다른 생물학적 활성 성분과 함께 투여할 수 있다.

비경구(예, 정맥내, 피하, 근육내) 투여에서, 활성 단백질은 제약학적으로 수용가능한 비경구 운반체(예, 물, 식염수, 덱스트로스 용액) 및 등장성(예, 만니톨) 또는 화학적 안정성(예, 방부제와 완충제)을 유지시키는 첨가제와 혼합된 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말 형태로 만들 수 있다. 상기 제형은 통상의 기술로 멸균한다.

본 발명에 따른 활성 단백질의 생체이용효율은 사람 체내에서 분자의 반감기를 증가시키는 공액 과정으로, 예를 들면 상기 분자에 폴리에틸렌글리콜을 부착시켜 개선할 수 있다(PCT 특허 출원 WO 92/13095).

치료요법적 효과량의 활성 단백질은 길항물질의 유형, IL-18에 대한 길항물질의 친화성, 길항물질에 의한 임의 잔기의 세포독성, 투여 경로, 환자의 임상적 상태(내생적 IL-18 활성의 비-독성 수준 유지 필요성 포함)를 비롯한 다양한 변수의 함수다.

*“치료요법적 효과량”은 IL-18의 생물학적 활성을 저해하는 IL-18 저해물질 복용량이다. 개체에 투여된 단일 또는 다중 복용량은 IL-18 저해물질 약동학, 투여 경로, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 병행 치료법, 치료 빈도, 소요 효과를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라진다. 개체에서 IL-18의 저해를 측정하는 시험관내와 생체내 방법을 비롯하여, 기존 용량 범위의 조정은 당업자에게 공지된 것이다.

본 발명에 따라, IL-18 저해물질은 체중 ㎏당 대략 0.0001 내지 10 ㎎, 바람직하게는, 체중 ㎏당 대략 0.01 내지 5 ㎎, 더욱 바람직하게는, 체중 ㎏당 대략 0.1 내지 3 ㎎, 가장 바람직하게는, 체중 ㎏당 대략 1 내지 2 ㎎의 양으로 사용된다. 더욱 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 체중 ㎏당 대략 0.1 내지 1000 ㎍, 바람직하게는, 체중 ㎏당 대략 1 내지 100 ㎍, 더욱 바람직하게는, 체중 ㎏당 대략 10 내지 50 ㎍의 양으로 사용된다.

본 발명에서 바람직한 투여 경로는 피하 경로를 통한 투여다. 본 발명에서 더욱 바람직한 투여 경로는 근육내 투여다.

다른 바람직한 구체예에서, IL-18의 저해물질은 매일 또는 격일로 투여한다.

일일 복용량은 분할 분량으로 또는 소요 결과를 달성하는데 효과적인 지속 방출 형태로 제공한다. 2차 또는 후속 투여는 개체에 투여된 초기량 또는 이전 분량과 동일한, 이보다 적은 또는 이보다 많은 복용량으로 실시할 수 있다.

본 발명에 따라, IL-18 저해물질은 예방이나 치료 목적으로 치료요법적 효과량의 다른 섭생이나 약제(예, 다중 약제 요법), 특히 인터페론 및/또는 TNF 길항물질 및/또는 COX 저해물질에 앞서, 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다.

다른 치료요법적 약제와 동시에 투여할 수 있는 활성 약제는 동일한 또는 상이한 조성물로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 제약학적 조성물을 제조하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 IL-18 저해물질 및/또는 인터페론 및/또는 TNF 길항물질 및/또는 COX 저해물질의 된효과량 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 혼합하는 단계로 구성된다.

결과

생쥐 실험 모형, CIA(콜라겐 유도된 관절염)는 관절염 치료를 위한 약제로서 IL-18BP의 효능을 평가하는데 이용하였다. DBA/1 생쥐에 콜라겐과 불완전 프레운드 어쥬번트의 투여는 침식성 염증성 관절염의 발병을 유도하고, IL-18BP의 치료요법적 잠재력을 탐구하는 이상적인 기회를 제공한다. 이를 위해, 내생적 IL-18은 IL-18BP로 중화시키고, 다양한 병리학적 파라미터에 대한 효과를 평가한다.

용량-관련된 연구를 실시한다. 콜라겐-유도된 관절염 DBA/1 생쥐의 3개 군은 5가지 용량의 IL-18BP로 복강내(i.p.) 투여한다. 10, 3, 1, 0.5 또는 0.25 ㎎/㎏ 농도의 IL-18BP는 질환의 첫 번째 임상적 징후 시점에 투여한다. 생리식염수(염화나트륨, NaCl) 주사는 대조군으로 한다. 이에 더하여, 10,000 IU의 인터페론β(IFN-β)를 i.p. 투여하여, 관절염의 실험 모형에서 IFN의 효과를 평가한다. 질환 중증도에 대한 효과는 전술한 바와 같이 개별 발의 일일 시각적 채점으로 모니터한다. 생쥐는 발병후 8일째에 죽인다.

다음과 같은 수치를 측정한다:

ㆍ시각적 임상 스코어(각각의 발에 대하여 0-3.5)(도 7A와 B)

ㆍ뒷발중에서 첫 번째 병든 발의 관절 팽화/부종(mm, 칼리퍼로 측정)

ㆍ병든 발의 개수(도 9)

ㆍ첫 번째 병든 발의 침식 스코어(0-4 연골 파괴, 도 10)

ㆍ관절염이 처음 발생한 발의 조직병리학적 분석

ㆍ항-콜라겐 II형 항체의 수준(도 12)

ㆍIL-6의 수준(도 13)

질환의 임상적 중증도

도 7A와 B에 도시한 바와 같이, 질환의 임상적 중증도는 1 ㎎/㎏(p<0.01)과 0.5 ㎎/㎏(0.01<p<0.05) rhIL-18BP로 처리한 군에서 현저하게 감소하였다. 저용량(0.25 ㎎/㎏) 또는 고용량(10 ㎎/㎏)의 rhIL-18BP를 섭취한 생쥐는 위약과 유사한 임상적 스코어를 보였다. 1 ㎎/㎏ 용량의 IL-18BP는 인터페론 β(도 7A에서 IFNb) 만큼 효과적이었다.

관절 염증과 발 팽화(부종)

현미경적 염증(팽화)은 발병후 1일부터 8일까지의 발 부종 측정으로 조사하였다. 결과는 도 8A와 B에 도시한다. IL-18BP의 효과량은 1, 3, 10 ㎎/㎏이다. 이보다 적은 용량의 투여는 발의 팽화에 유익한 영향을 주지 못했다. 도 8A와 B에 도시한 바와 같이, 10,000 IU 농도의 인터페론은 발 팽화에 유익한 효과를 보였다.

*현미경적 활막염은 조직병리학적 절편에서 실험 종결시점에 검사하고 스코어(“활막염 스코어”)로 표시한다. 염증(팽화)과 활막염의 결과는 표1에 요약한다. 1과 3 ㎎/㎏ rhIL-18BP 처리는 팽화의 감소 추세를 결과하지만, 임의 용량의 IL-18BP 처리는 염증성 활막염에 단지 제한적인 영향만을 보였다(표 4).

관절 염증에 대한 IL -18 BP 처리의 효과
처리		팽화(AUC, 평균 ±SEM)	활막염 스코어(평균 ±SEM)
RhIL-18BP-6His	3㎎/㎏	1.55 ±0.64	2.17 ±0.5
	1㎎/㎏	1.53 ±0.60	1.98 ±0.4
	0.5㎎/㎏	3.38 ±0.70	1.92 ±0.5
	0.25㎎/㎏	3.06 ±0.90	2.08 ±0.5
위약		3.11 ±0.77	2.23 ±0.3

도 9는 병든 발의 개수가 IL-18BP 투여이후에 줄어든다는 것을 보여준다. 특히, 1과 0.5 ㎎/㎏ IL-18BP의 치료요법적 주사는 병든 발의 개수를 감소시키는데, 이는 생체내에서 IL-18의 차단이 관절염의 다른 관절로의 확대를 중단시킨다는 것을 입증한다. 이에 더하여, 1과 0.5 ㎎/㎏ IL-18BP 처리는 일부 관절염 관절을 정상 상태로 회복시킬 수 있는 것으로 보인다.

관절 파괴로부터 보호

rhIL-18BP 처리는 관절 파괴로부터 생쥐를 보호한다(도 10). 반-정량적 기록 시스템은 골침식이 10과 3 ㎎/㎏(p<0.05, 도10)에서 현저한 용량-관련된 보호 효과를 보인다는 것을 입증한다. 1 ㎎/㎏ rhIL-18BP를 섭취한 생쥐는 운반체 단독을 섭취한 생쥐보다 적은 침식을 보였다. 0.5와 0.25 ㎎/㎏ 복용량에서는 보호가 관찰되지 않았다. 흥미롭게도, 3과 10 ㎎/㎏ IL-18BP의 관절 보호에 대한 효과는 10,000 IU 인터페론 β(IFN-β)의 효과와 비슷하거나 또는 이보다 더 현저하였다.

도 11은 IL-18BP로 처리된 동물로부터 유래된 관절과 비교하여 건강한 관절(A)과 병든 관절(B)의 조직학적 성상을 보여준다. 절편은 실험 종결시점에서 관절염이 처음 발생한 발로부터 취한다.

관절염 생쥐의 관절은 연골 고갈과 침식 및 염증 활막에 다수의 침윤 세포가 나타나는 중증의 파괴성 관절염을 보였다. rhIL-18BP 처리된 생쥐의 관절에서 연골은 활액 공간에서 염증성 세포의 존재에도 불구하고, 거의 정상으로 나타났다. 훨씬 많은 함량의 연골이 존재했을 뿐만 아니라, 이들 연골은 더욱 매끄러운 외형을 보였다.

항-IL-18 처리는 항-콜라겐 II형 항체의 수준을 조절한다

CIA 생쥐는 상승된 수준의 IgG1과 IgG2a 항-콜라겐 II형 순환 항체를 보유한다. 이소타입 IgG1의 항체는 TH2 매개된 질환과 연관하는 반면, 이소타입 IgG2a와 IgG2b의 항체는 TH1 매개된 질환과 연관한다. 관절염은 일반적으로, TH1 매개된 질환으로 분류된다.

항-콜라겐 II형(CII) IgG1과 IgG2a 항체 이소타입은 IL-18BP로 처리된 동물의 혈청에서 측정한다(도 12). IgG 이소타입 IgG1과 IgG2a의 항-CII 수준은 임상적 질환의 4일과 8일(D4, D8)에서, IL-18BP 처리에 의해 별로 변하지 않는다. 하지만, 각각 1과 3 ㎎/㎏ rhIL-18BP 처리로부터 8일이후 콜라겐-특이적 IgG1/IgG2a 비율에서 2.6과 3.4배 감소가 관찰되었다. 도 12는 3 ㎎/㎏을 사용한 실험을 도시한다. 1 ㎎/㎏ IL-18BP에서 동일한 결과가 얻어졌다. 항-CII 항체의 감소된 IgG1/IgG2a 비율은 이소타입 IgG2a의 항-콜라겐 II형 항체의 농도 감소 및 이소타입 IgG1의 항-콜라겐 II형 항체의 농도 증가를 시사하는데, 이는 이런 관절염 모형에서 TH2-매개된 질환으로의 전환이 있음을 암시한다.

IL-18 중화이후 IL-6 수준의 감소

IL-18 차단의 효과를 살펴보기 위하여, IL-6은 IL-18BP 처리된 동물의 혈청에서 측정한다. 도 13은 생활성 IL-6의 수준이 측정된 모든 용량, 즉 1, 3, 10 ㎎/㎏의 IL-18BP 및 인터페론-β(IFNb)를 섭취한 동물에서 현저하게 감소한다는 것을 보여준다. 3 ㎎/㎏ rhIL-18BP로 처리된 동물의 혈청에서 측정된 IL-6의 면역활성 수준은 식염수-처리된 동물과 비하여 현저하게 감소되었다(P<0.0023). 1, 3, 10 ㎎/㎏의 IL-18BP 또는 10,000 IU의 인터페론-β(IFNb)로 처리된 병든 동물의 IL-6 혈청 수준은 건강한 동물, 다시 말하면 염증성 질환이 없는 동물로부터 유래된 정상 생쥐 혈청(MNS)과 유사하였다.

이들 검사결과는 상기 질환의 발병동안 IL-18이 IL-6을 억제한다는 것을 입증한다. IL-6이 염증의 마커라는 점에서, 이들 검사결과는 IL-18BP로 병든 생쥐를 치료하면 염증이 감소된다는 것을 암시한다.

전술한 실험으로부터, 다음의 결론을 도출할 수 있다:

ㆍIL-18BP의 투여는 관절염의 임상적 중증도를 감소시킨다

ㆍIL-18BP는 상기 질환의 추가적인 진행 또는 확산을 저해한다

ㆍIL-18BP의 투여는 부종을 감소시킨다

ㆍIL-18BP의 투여는 연골 파괴를 감소시킨다

ㆍIL-18BP 치료이후, 혈청 IL-6 수준은 감소하고 IgG1/IgG2a 항-CII 비율은 낮아진다.

전술한 데이터는 발병이후 IL-18 생활성의 중화가 질환-변환 항-류머티스 치료법이 됨을 시사한다. 이런 결과는 IL-18 차단이 관절염의 임상적 진행을 감소시키고, 더욱 중요하게는 연골의 진행과 골파괴를 저지한다는 것을 분명하게 보여준다. 따라서, IL-18BP, 항-IL-18 항체 또는 임의의 다른 IL-18 차단물질에 의한 IL-18 차단은 신규한 질환-변화 항-류머티스 치료법이다.

결과

IL-18BP는 체중 감소로부터 뮤린 대장염 모형을 보호한다.

실험적 대장균에서 IL-18의 역할, 특히 IL-18 결합단백질(IL-18BP)의 보호 효과를 조사하기 위하여, BALB/c 생쥐에서 TNBS 대장염을 유도한다. 이런 모형은 40% 에탄올에 녹인 트리-니트로벤젠 설폰산(TNBS)에 대한 국소적 노출로 만들어진다. 이는 합텐(트리니트로페닐) 변형된 자가 항원에 대한 지연형 과민반응을 유인하는데, 상기 반응은 친-염증성 사이토킨 생산이 증가되는 Th-1형 반응이다.

*생쥐는 사람 IL-18BP 또는 대조군을 복강내 매일 투여한다.

12.5㎍ 내지 50㎍ 범위로 매일 복강내 투여되는 hIL-18BP는 질환 중증도에 영향을 주지 않는다. 하지만, 200㎍으로 매일 복강내 투여되는 hIL-18BP는 질환의 유도와 연관된 체중 감소를 줄이는데 효과적이다.

예상한 바와 같이, TNBS의 직장내 주입은 설사와 소모를 초래한다. 도 16에 도시한 바와 같이, 양 치료군의 동물은 3일째 기저 체중의 15%를 잃는다. 하지만, 대조군 생쥐와는 대조적으로, TNBS 주입후 4일째부터 hIL-18BP-처리된 동물은 초기 체중 손실을 빠르게 회복하기 시작하여 8일째 기저 체중으로 복귀한다. 대조군 생쥐에서 8일째 TNBS의 2차 투여는 현저한 체중 손실을 한번 더 야기하는데, 이는 hIL-18BP 투여에 의해 본질적으로 예방된다. 식염수-처리된 생쥐에 hIL-18BP 투여는 어떤 효과도 미치지 못한다. 따라서, hIL-18BP 투여는 TNBS-유도된 대장염과 관련된 체중 감소를 현저하게 완화시킨다(p<0.05).

염증 파라미터에 대한 효과

10일째 생쥐는 죽이고, 6㎝ 결장의 중량을 측정한다(도 17A). TNBS 대장염에서 결장 중량은 식염수 처리된 생쥐에 비하여 증가한다. 이런 중량 증가는 hIL-18BP-처리된 생쥐에서 현저하게 적다(식염수 처리된 생쥐에서 268 ㎎ ±27.3에 비하여 181.6 ㎎ ±11.4)(p<0.05). TNBS 대장염은 꼬리모양 림프절로의 증가된 세포 이동과 연관하는 것으로 이미 보고되었다(Camoglio et al., 2000). IL-18BP 처리는 식염수로 처리된 TNBS 생쥐에서 꼬리모양 림프절에 침윤하는 세포수에 비하여, 꼬리모양 림프절에 침윤하는 세포수를 감소시킨다(도 17B).

T 림프구 활성화 마커인 CD69 발현의 변화는 Facscan 분석으로 측정한다(도 17C). CD69를 발현하는 CD4⁺ 비장 세포의 비율은 TNBS-처리된 생쥐에서 11.4%인 반면, hIL-18BP 처리된 TNBS 생쥐에서 CD4⁺/CD69⁺ 비율은 7.3%이다(p<0.05).

비장, 꼬리모양 림프절 세포, 결장 균질체의 사이토킨 생산

T-세포 수용체의 활성화이후 친-염증성 사이토킨 합성을 유발하는 T-림프구의 능력에 대한 hIL-18BP의 효과를 조사하기 위하여, 세포는 꼬리모양 림프절과 비장으로부터 분리하고 48시간동안 항 CD3/CD28 항체로 자극한다. 상층액에서 IFNγ과 TNFα생산을 측정한다(도 18). hIL-18BP 생쥐와 대조군 처리된 생쥐의 사이토킨 생산간에 현저한 차이는 관찰되지 않았다. 따라서, hIL-18BP에 의한 IL-18의 중화는 T-세포 수용체 활성화에 반응하는 T-림프구 활성화의 전반적인 감소를 초래하지 않는다.

결장 균질체에서 사이토킨 수준을 분석하고, 따라서 사이토킨의 국소적 생산을 측정한다(도 19). TNBS 생쥐 및 hIL-18BP 처리된 TNBS 생쥐의 결장 균질체에서 IFNγ 수준의 차이는 검출되지 않는다(각각, 134pg/㎖ ±7.8과 139pg/㎖ ±23). 하지만, TNFα수준은 hIL-18BP로 처리된 생쥐의 결장 균질체에서 현저하게 감소하였다(TNBS 생쥐에서 110pg/㎖ ±3에서 hIL-18BP 처리된 TNBS 생쥐에서 59pg/㎖ ±2.7).

조직학적 검사결과

hIL-18BP-매개된 염증성 파라미터의 감소가 조직학적 스코어에 영향을 주는 지를 조사하기 위하여, 파리핀-절편에서 조직병리학적 검사를 실시한다. 조직학적 검사에서 전체 염증 스코어는 점막을 침윤하는 백혈구수의 감소로 인해, 대조군 처리된 생쥐에 비하여 hIL-18BP 처리된 생쥐에서 현저하게 감소하였다(처리되지 않은 생쥐에서 15.9 ±1.1에서 hIL-18BP 처리된 생쥐에서 9.8 ±1.3)(p<0.05). 놀랍게도, IL-18BP-처리된 생쥐에서는 점막 궤양형성이 전혀 없었다(p<0.05). 이런 검사결과는 하기 표 5에 요약 제시한다. IL-18BP 처리된 생쥐에서 궤양형성의 완전한 예방은 특히 놀랍다.

식염수 또는 rhIL-18BPa 처리된 TNBS 생쥐의 대장염 스코어의 개별 항목
	대조군 처리된 TNBS 생쥐	hIL-18BP 처리된 TNBS 생쥐
관련 부위 %	3.4 ±0.4	3.2 ±0.5
소낭 응집체	2.0 ±0.4	1.5 ±0.4
부종	2.1 ±0.3	1.3 ±0.3
섬유증	0.85 ±0.26	0.50 ±0.2
궤양형성	2.0 ±0.3	0.0 ±0.0*
음와 손실	1.7 ±0.3	1.0 ±0.3
다핵구 세포	2.6 ±0.2	1.3 ±0.2*
단핵구 세포	1.1 ±0.1	0.33 ±0.21*

데이터는 0-4의 스케일로 평균 ±SEM으로 표시하고, *은 현저한 차이를 나타낸다.

항- mIL -18 다클론항체는 덱스트란 설페이트 소디움 -유도된 대장염의 생쥐 모형에서 질환으로부터 보호한다

상기 모형에서, 덱스트란 설페이트 소디움(DSS)은 동물을 죽일 때까지 0일째부터 음료와 섞어 준다. 항-IL-18BP 다클론항체는 0일, 4일, 8일째에 i.p. 투여한다. 복용량은 200과 400㎕의 토끼 혈청이다. 최대량(400㎕)은 체중 감소, 임상적 스코어, 직장 출혈, 결장 단축을 현저하게 감소시킨다. 토끼 항-mIL-18 처리는 질환의 발병을 지연시키고 진행을 억제한다.

요약

상기 실시예 12는 hIL-18BP 또는 IL-18에 대한 다클론항체의 투여가 생쥐에서 실험적으로 유도된 대장염의 중증도를 효과적으로 감소시킨다는 것을 입증한다.

hIL-18BP를 복강내 매일 투여한 생쥐는 대조군 처리된 생쥐에 비하여 일차적인 체중 감소로부터 빠르게 회복하였다. 결장 중량 및 꼬리모양 림프절에 세포의 침윤으로 측정한 결장 염증의 다른 파라미터는 hIL-18BP 처리된 생쥐에서 감소하였다. 처리된 생쥐의 조직병리학적 성상은 조직 파괴(궤양형성)의 중증도 감소 및 침윤 세포 양의 현저한 감소로 특징지어진다. 또한, hIL-18BP의 효과는 비장 세포에 의한 CD69의 발현 감소에서 입증된 바와 같이 전신적으로 나타난다.

결장 균질체에서 측정된 TNFα의 국소적 생산은 hIL-18BP로 처리된 TNBS 생쥐에서 현저하게 감소한다. 이는 TNFα가 질환 진행에서 중요한 역할을 수행한다는 것을 시사한다. IFNγ 수준은 TNBS 생쥐와 hIL-18BP로 처리된 TNBS 생쥐간에 비슷한데, 이는 IFNγ-유도성 자극의 과잉으로 설명할 수 있다.

결론적으로, 전술한 데이터는 염증성 장 질환의 치료에서 IL-18 저해물질의 유익한 효과를 입증한다.

PART 1: 간 손상에서 IL-18 저해물질의 활용과 관련된 실시예 1 내지 8

실시예 1: IL-18BP-His tag의 생산

his-tag를 보유하는 정제된 재조합 사람 IL18BP(r-hIL-18BP-His tag)는 CHO 세포에서 만들었다. 진핵 세포에서 재조합 단백질의 생산은 당업자에게 공지된 것이다. IL-18BP를 코드하는 DNA를 보유하고 재조합 IL-18BP를 생산하기 위한 진핵 세포의 트랜스펙션에 적합한 벡터를 작제하는 방법 역시 공지되어 있다. 세포에서 발현을 위하여, IL-18BP를 코딩하는 DNA(e.g. Novick et al., 1999)는 잘라내고 세포의 트랜스펙션에 적합한 발현 벡터에 삽입한다. 대안으로, 이런 DNA는 적절한 센스와 안티센스 프라이머를 이용한 PCR로 만들 수 있다. 이후, 이렇게 생성된 cDNA 구조체는 당분야에 공지된 기술로, 적절히 작제된 진핵 발현 벡터에 삽입한다(Maniatis, 1982). 재조합 단백질은 95%이상 순도로 정제하는데, 시험관내와 생체내에서 리간드에 대하여 높은 친화성을 보였다.

실시예 2: 뮤린 모형에서 엔도톡신 -유도된 죽음에 대한 IL-18BP의 보호 효과

IL-18의 저해물질인 IL-18BP가 고용량의 리포폴리사카라이드(LPS)로부터 생쥐를 보호하는 지를 테스트하기 위하여 뮤린 모형을 이용하였다. LPS는 급성 간 손상 및 이후 생쥐의 급사를 초래한다.

his-tag(단백질의 재조합 생산에 기인)를 보유하는 4 ㎎/㎏ 재조합 사람 IL-18BP(rhIL18BPhis)는 C57BL/6 생쥐에 복강내(i.p.) 주사한다. 1시간후, 60 ㎎/㎏(치사량) LPS를 주사한다. 생쥐의 생존율은 LPS 단독(IL18BP 없음)을 투여한 동물 군과 비교한다.

rhIL-18BP-his를 주사한 7마리의 생쥐중 5마리가 LPS 주사를 이겨낸 반면, 대조군 생쥐는 3일이내에 모두 사망하였다.

혈액 샘플은 상이한 용량의 rhIL-18BP-his 존부하에 LPS 주사 5시간후에 취하고 ELISA로 순환 IFN-γ(도 1)을 분석한다. 0.4와 4㎎/㎏ rhIL-18BP는 혈청 IFN-γ의 2배 감소를 유도하였다. 이런 저해는 낮은 용량(0.004와 0.04 ㎎/㎏)의 rhIL- 18BP에서는 나타나지 않았다.

실시예 3: IL-18BP는 뮤린 질환 모형에서 간 손상에 대한 보호 효과를 보인다

IL-18BP의 효과를 테스트하기 위하여 전격성 간염의 생쥐 모형을 이용하였다. 생쥐는 여드름균(Propionibacterium acnes)과 리포폴리사카라이드(LPS)의 순차적인 투여이후, 급성 간 손상이 발생하였다.

C57BL/6 여드름균(P. acnes) 감작화된 생쥐는 LPS를 주사한 후 다양한 시점(1시간, 20분, 동시)에서 상이한 용량(4; 0.4; 0.04; 0 ㎎/㎏)의 rhIL-18BP-his를 주사한다. LPS와 동시에 rhIL-18BP-his를 복강내 주사하는 경우, 생쥐는 전부 사망하였고, 순환 IFN-γ와 TNF-α수준은 전혀 영향을 받지 않았다. 놀랍게도, rhIL-18BP(4와 0.4 ㎎/㎏)는 도 2에 도시한 바와 같이, 순환 알라닌 아미노트랜스퍼라제(간 손상의 마커)의 70% 감소를 유도하였다.

이에 더하여, 생쥐의 생존율을 모니터한다(도 3): LPS 20분전에 rhIL-18BP를 복강내 주사하는 경우, 가장 높은 2가지 용량의 IL-18BP(4와 0.4 ㎎/㎏)는 IL-18BP 대신 NaCl을 투여한 대조군 생쥐와 비교하여 10시간정도 생쥐의 죽음을 지연시켰다.

혈청 IFN-γ 수준의 측정 결과는 도 4에 도시한다. rhIL-18BP(4 ㎎/㎏)는 순환 IFN-γ 수준의 90% 및 순환 알라닌 아미노트랜스퍼라제의 80%를 저해하였다.

LPS 1시간전에 rhIL-18BP-his를 주사한 경우의 생존 곡선 및 순환 IFN-γ 수준은 LPS 20분전에 rhIL-18BP-his를 주사한 경우에 관찰되는 것과 유사하지만, 순 환 알라닌 아미노트랜스퍼라제의 수준은 영향을 받지 않았다.

이에 더하여, 뮤린 간 조직은 헤마톡실린-에오신 염색 및 터널 현미경검사로 분석한다. 이전에 중증 간염이 유도된 생쥐의 간은 정상 간 조직에 비하여 심각한 괴사를 보였다. 이와는 대조적으로, IL-18BP로 처리된 생쥐의 간 조직은 처리되지 않은 생쥐보다 현저하게 적은 괴사성 병변을 보였다.

실시예 4: 항-IL-18 항체는 치사성 내독혈증에 길항한다

IL-18 항체를 이용한 IL-18 차단이 박테리아 리포폴리사카라이드의 치사량으로부터 생쥐를 보호하는 지를 평가하기 위하여, C58BL/6J 생쥐는 중화 토끼 항-생쥐 IL-18 항체(다클론) 또는 정상 토끼 혈청(NDS)(대조군)을 먼저 주사하였다. 항체 처리 30분후, 대장균(E. coli)(도 5A) 또는 쥐티푸스균(S. thyphimurium)(도 5B)으로부터 유래된 치사량의 LPS를 주사하였다. 실험은 군당 10-12마리 생쥐에서, 2가지 각 경우에 2번 실시한다.

도 5A에 도시한 바와 같이, 항-IL-18 항혈청의 생쥐 처리는 40 ㎎/㎏대장균(E. coli) LPS에 의해 유도되는 치사 효과를 예방한다. 항-IL-18 처리한 생쥐에서는 100%가 생존한 반면, 정상 토끼 혈청으로 처리한 생쥐에서는 10%만 생존하였다(p<0.005).

도 5B는 항체 처리된 생쥐가 쥐티푸스균(S. thyphimurium) 치사에 대해서도 보호 효과를 보인다는 것을 도시한다.

실시예 5: IL-18과 TNF -α의 차단은 ConA -와 PEA-유도된 간독성으로부터 생쥐를 보호한다

간 손상에서 IL-18과 TNF-α의 역할을 평가하기 위하여, 2가지 간독성 실험 모형을 이용하였다. 콘카나발린(Con A)과 슈도모나스 애루지아노(Pseudomonas aeruginosa)(PEA)의 생쥐 주사는 둘 모두 간 손상을 유도하는데, 이들은 T 세포 매개된 간염의 모형이 된다.

C57BL/6J 생쥐는 항-IL-18 항혈청 또는 가용성 TNF-α수용체(TNFsRp55)로 전-처리하였다. 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)는 간 손상의 지표로 측정한다(도 6).

도 6A에 도시한 바와 같이, IL-18 항혈청과 가용성 TNF-수용체 둘 모두 운반체 단독(발열인자가 없는 식염수)의 대조군 주사와 비교하여 ConA-유도된 혈청 ALT 수준을 현저하게 감소시켰다. 가용성 TNF 수용체와 IL-18 항혈청의 동시-투여는 ConA-유도된 간 손상의 완전한 저해를 결과하였다.

도 6B에 도시한 바와 같이, PEA-주사된 생쥐에서 TNF-α저해물질 또는 항-IL-18 항체의 중화는 각각, 혈청 ALT 수준의 93%와 83% 저해를 결과하였다. 이들 둘의 완전한 차단은 99% 보호를 결과하였다.

실시예 6: IL-18- 결합단백질의 혈장 수준은 만성 간 질환 환자에서 상승한다

IL-18BP 혈장수준은 다양한 병인의 만성 간 질환 환자 133명과 건강한 대조군 31명에서, 18BP 단클론 항체를 이용한 특이적인 ELISA로 측정한다.

IL-18BP의 혈장 수준은 건강한 개체(4.96 ±0.43 ng/㎖, p<0.001)보다 CLD 환자(12.91 ±0.89 ng/㎖; 평균 ±SEM)에서 현저하게 높았다. 경화증 환자는 비-경화증 CLD 환자보다 현저하게 높은 수준을 보였다(19.23 ±1.28 ng/㎖, n=67, vs. 6.49 ±0.51 ng/㎖, n=66, p<0.001). Child-Pugh 분류의 B 등급 환자는 A 등급 환자보다 높은 수준의 IL-18BP를 보였다(22.48 ±2.44 ng/㎖ vs. 9.57 ±1.25 ng/㎖, p<0.001). 하지만, Child B 등급과 C 등급간에는 유의성 차이가 없었다(22.48 ±2.44 ng/㎖ vs. 20.62 ±4.75 ng/㎖, p=0.7). IL-18BP의 혈장 수준은 GOT, 빌리루빈, 적혈구 침강 속도와 파지티브 상관관계를 보였다. 네거티브 상관관계는 프로트롬빈 타임에서 나타났다.

결론적으로, 상기 결과는 IL-18BP 혈장 수준이 CLD에서 상승하고 질환의 병인과 무관하며 질환의 중증도와 상관관계를 갖는다는 것을 보여준다. 친염증성 IL-18의 내생적 길항물질이 IL-18BP의 수준을 증가시키긴 하지만, 이는 CLD에서 압도적 우세의 친염증성 매개물질을 상쇄시키기에는 충분치 않아 보인다.

실시예 7: IL-18BP에 의한 알코올성 간염의 저해

4주동안 에탄올 및 옥수수기름을 함유한 사료를 4개의 쥐 군(군당 5마리)에 위내 주입으로 공급한다. 에탄올은 대조군 쥐에서 덱스트로스로 대체된다. 생쥐 IL-18BP(1 ㎎/㎏) 또는 식염수를 쥐에 매일 주사한다. 병리학적 분석은 간 절편에서 실시하고, 혈청상의 간 효소, TNF-α, Fas 리간드, IFN-γ를 측정한다. 염증괴사성 손상 및 간 효소, TNF-α, Fas 리간드, IFN-γ의 발현은 식염수를 주사한 에탄올-공급 쥐에서 나타났다.

생쥐 IL-18BP를 주사한 쥐는 염증괴사성 손상으로부터 보호되고 간 효소, TNF-α, Fas 리간드, IFN-γ의 수준은 현저하게 감소하였다(>90%).

실시예 8: IL-18BP에 의한 콘카나발린 A-유도된 간염의 저해

Balb/c 생쥐는 Con A 투여 2시간전에, 뮤린 IL-18BP(1 ㎎/㎏)의 주사와 함께 또는 이런 주사없이 12 ㎎/㎏ 콘카나발린 A(Con A)를 주사한다. 간 손상은 간 효소, TNF-α, Fas 리간드, IFN-γ의 혈청 수준을 측정하여 평가한다. 간 조직병리는 콘카나발린 단독으로 처리된 생쥐와 비교한다.

IL-18BP 처리는 간 효소와 TNF-α의 혈청 수준을 현저하게 감소시키는데, 조직병리학적 검사에서 Con A로 처리된 대조군 생쥐와 비교하여 염증의 흔적이 없었다.

PART II: 관절염에서 IL-18 저해물질의 활용과 관련된 실시예 9와 10

실시예 9: IL-18BP-His tag의 생산

하기 실시예 10에서 상세하게 밝힌 실험에서, 6개 잔기의 his-tag를 보유하는 재조합 사람 IL-18BP(r-hIL-18BP-His tag)는 CHO 세포에서 만들고 Kime et al., 2000에 따라 정제한다. 재조합 단백질은 95%이상 순도로 정제하는데, 시험관내와 생체내에서 리간드에 대하여 높은 친화성을 보였다.

재조합 단백질의 정제를 용이하게 하는 tag를 보유하는 또는 이를 보유하지 않는 다른 진핵 세포에서 재조합 단백질의 생산은 당업자에게 공지된 것이다. IL-18BP를 코드하는 DNA를 보유하고 재조합 IL-18BP를 생산하기 위한 진핵 세포의 트랜스펙션에 적합한 벡터를 작제하는 방법 역시 공지되어 있다. 세포에서 발현을 위하여, IL-18BP를 코딩하는 DNA(e.g. Novick et al., 1999)는 잘라내고 세포의 트랜스펙션에 적합한 발현 벡터에 삽입한다. 대안으로, 이런 DNA는 적절한 센스와 안티센스 프라이머를 이용한 PCR로 만들 수 있다. 이후, 이렇게 생성된 cDNA 구조체는 당분야에 공지된 기술로, 적절히 작제된 진핵 발현 벡터에 삽입한다(Maniatis, 1982).

실시예 10: 뮤린 관절염 모형에서 내재성 IL-18의 차단

방법

콜라겐-유도된 관절염(CIA)의 유도

CIA는 기존의 고유 II형 소 콜라겐(Plater-Zyberk et al., 1995)으로 면역하여 수컷 DBA/1 생쥐(8-12주)에서 유도한다. CII 면역후 25일부터, 생쥐는 발병을 매일 검사한다.

rhIL -18BP-6his 처리

CII-면역된 DBA/1 생쥐의 치료는 질환의 임상적 증상의 첫 출현 시점에서 시작한다. 6개 히스티딘 tag를 보유하는 재조합 사람 IL-18BP(rh-IL-18BPa 6his)는 콜라겐 처리된 생쥐에서 내생적 IL-18을 중화시키는데 사용하였다. rh-IL-18BPa 6his는 5가지 상이한 농도(10, 3, 1, 0.5, 0.25 ㎎/㎏)로 7일동안 매일 복강내(i.p.) 주사한다. 위약 대조군 생쥐는 운반체 단독(0.9% NaCl)을 섭취한다.

질환 발생의 평가

세포 평가(임상적 스코어)

임상적 증상의 첫 출현 시점부터, 생쥐는 치료에 대하여 전혀 모르는 연자로 매일 검사한다. 각 사지에서 질환 중증도의 등급을 매긴다(스코어 0-3.5, 최대 스코어 = 14/생쥐). 부종(염증)의 진행은 정밀 캘리퍼(Proctest 2T, Kroeplin Langenmesstechnik)를 이용하여, 질환 증상을 보인 첫 번째 발에서 측정한다.

질환 진행은 발병후 8일동안 매일 평가하는데, 발병 시점에서 모든 생쥐는 죽이고 발은 조직병리학적 검사를 위하여 수집한다.

연골 침식과 현미경적 염증의 조직학적 평가

실험의 종결시점, 즉 발병후 8일째, 생쥐는 죽이고 질환 증상을 보인 첫 번째 발을 잘라낸다. 관절은 고정시키고 석회질을 제거하며 파라핀에 포매(embedding)시킨다. 관절의 표준 절편(5 내지 7㎛)을 만들고 헤마톡실린/에오신/사프라닌으로 염색한다. 각 관절은 치료 프로토콜을 전혀 모르는 연자로 등급을 매긴다(연골이나 뼈의 파괴없음 = 0; 국소적인 연골 침식 = 1-2; 더욱 확대된 침식 = 3; 전반적인 연골 파괴와 뼈 침식의 존재 = 4). 각 생쥐의 최종 스코어는 채점된 모든 관절에서 결과의 평균이다. 현미경적 염증 또는 활막염은 다음과 같이 0 내지 4의 등급을 매긴다: 염증없음 = 0; 내막층의 약간 굵어짐 및/또는 내막하층에 일부 세포 침윤 = 1-2; 내막층의 굵어짐 및/또는 내막하층에 세포의 깊은 침윤 = 3; 염증성 세포가 다수 침윤한 활액 공간과 활막에서 세포의 존재 = 4.

항-콜라겐 항체의 측정

II형 소 콜라겐에 대한 항체는 효소-결합된 면역흡착법(ELISA)으로 검사한다. IgG1과 IgG2의 역가를 측정한다. 간단히 말하면, 평판은 10㎍ 소 콜라겐으로 피복하고, 비-특이적 결합 부위는 0.1M 에탄올아민(Sigma)으로 차단한다. 연속 1:2 희석된 혈청을 첨가하고, 이후 이소타입 특이적 염소 항-생쥐 과산화효소(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA) 및 기질(5-아미노살리실산, Sigma)과 함께 배양한다. 평판은 492nm에서 읽는다. 역가는 평균 ±SD 희석으로 표 시하는데, 이는 반-진폭값을 제공한다.

IL-6 분석

IL-6의 수준은 상업적 ELISA(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)로 측정한다. IL-6 생활성은 B9 세포를 이용한 증식성 분석으로 측정한다. 간단히 말하면, 웰당 200㎕ 5% FCS-RPMI 1640 배지에서 5x10³ B9-세포는 원형-바닥 마이크로역가 평판에 도말하고, 사람 재조합 IL-6(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)을 기준으로 하여 3일동안 배양한다. 배양 종결시점에서, 웰당 0.5μCi ³[H]티미딘(NEN-Dupont, Boston, MA, USA)을 첨가한다. 3시간후, 세포는 수거하고 티미딘 통합을 측정한다. IL-6 생물학적 정량에 대한 검출 한계는 1 pg/㎖이다.

통계 분석

유의성 차이는 SigmaStat 통계분석 프로그램 및 GraphPad Prism 프로그램을 이용한 Mann Whitney 검정으로 평가한다.

PART III: 염증성 장 질환과 관련된 실시예 11과 12

실시예 11: 활성 크론병동안 내피세포와 대식세포에 의한 IL-18BP 발현

시료의 수집

장 점막 생검은 CD 또는 UC 환자의 수술 절제 시료로부터 분리한다. 37.8세(20-78세) 평균 연령 및 8.3년의 질환 지속기간을 갖는 14명의 CD 환자(3명의 남성과 11명의 여성)가 참여하였다. 8명의 환자에서 질환은 회장에서 발견되고, 6명 의 환자에서는 결장에서 발견되었다. 12명의 환자는 면역억제제를 복용하였다. 활성 CD의 진단은 다음과 같은 기준: 궤양의 존재, 염증성 세포의 수적 증가, 경벽성 염증에 기초하여 조직-병리학적 검사로 실시한다. 7명의 활성 CD 환자와 7명의 비-활성 질환 환자가 확인되었다. 활성 CD 환자와 비-활성 CD 환자간에 연령, 질환 위치, 성별, 약제 치료, 질환 지속기간의 유의성 차이는 발견되지 않았다. 5명의 UC 환자(3명의 남성과 2명의 여성)의 평균 연령은 37.6세(30-44세)이었다. 이들 환자에서, 질환은 결장에서 발견되었고 면역억제제 치료를 받았다. 평균 질환 지속기간은 4년(1-8년)이었다. 대조군 시료는 비-IBD 관련된 질환으로 절제술을 받은 5명의 환자(3명의 남성과 2명의 여성)로부터 수득하였다. 이들의 평균 연령은 55.2세(24-76세)이었다. 이들 환자에서, 질환은 결장에서 발견되었다.

사람 IL-18과 IL-18BP에 대한 정량적 RT- PCR

전체 RNA는 CD 환자, UC 환자 또는 대조군 환자의 동결된 장 생검으로부터 추출한다. RNA 추출은 제조업자의 지시에 따라 Trizol(Gibco)를 이용하여 실시한다. 수득된 샘플은 1% 아가로즈 겔에서 전기영동으로 평가한다. cDNA는 제조업자의 지시에 따라 Promega 역전사 시스템을 이용하여 1㎍ 전체 RNA로부터 합성한다. PCR 반응은 1U AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer, Roche, U.S.A), 2.5 mM dNTP(Amersham, U.S.A), 50 pmole 선행과 역행 PCR 프라이머의 존재하에 50㎕ 전체 부피로 실시한다. 반응물은 다음의 조건하에 PTC-200 Peltier Effect Thermal Cycler(MJ Research, U.S.A)에 배양한다: 94℃에서 1분동안 변성, 55℃에서 1분동안 어닐링, 72℃에서 1분동안 신장. 밴드의 포화에 앞서 IL-18BP, IL-18, β-액틴 에 대한 최적 사이클은 각각 31, 28, 25회다. PCR 프라이머는 다음과 같은 공개된 서열(AF110799, D49950, X00351)에 기초하여 디자인하였다: IL-18, 역행 5‘-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3'; 선행 5’-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3'; IL-18BP, 선행 5’-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3'; 역행 5‘-GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3'; β-액틴, 역행 5’-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3'; 선행 5'-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3'. 샘플을 함유하는 게놈 DNA의 증폭을 배제하기 위하여, PCR 반응은 cDNA 주형의 부재하에 실시한다. PCR 산물(10㎕)은 1x TAE 완충액에서 전기영동된 1% 아가로즈 겔에서 분석한다. PCR 산물의 크기는 겔 염색이후 1Kb 라더(Gibco)로 비교하여 확인한다. 에티듐-브로마이드 염색된 밴드의 상대적 정량은 Kodak Digital Sciences 분석 소프트웨어를 이용하여 UV광하에서 실시하고 하이스키핑 유전자(hβ-액틴)에 대한 표적 유전자(hIL-18BP, hIL-18)의 비율로 표시한다.

hIL -18BP에 대한 단클론항체의 생성

BALB/c 생쥐는 0일, 7일, 28일에 어쥬번트(MPL+TDM Emulsion, RIBI Immunochem Research, Inc.)와 함께, PBS 용매의 50㎍ 동소체 rhIL-18BP-6his(중국 햄스터 난세포로부터 정제됨, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel)를 항부내 및 사지에 피하 주사한다. 3번째 면역후 4일째, 림프절은 수득하고 2.4 ㎎/㎖ 콜라게나제(콜라게나제 IV, Worthington Biochemical Corp.)와 0.1% Dnase(Sigma)로 절단한다. 이후, 분리된 세포는 PEG 1000(FLUKA)을 이용하여 Sp2/0 골수종 세포와 융합시킨다. 세포는 HAT(히폭산틴, 아미노프테린, 티미딘)의 존재하에 DMEM- F12, 10% FCS(Gibco)에 재부유시키고 5x10^{- 4}세포/㎖ 농도로 96웰 평판에 도말한다. 하이브리도마 배양 상층액 샘플은 직접 스크리닝 분석으로, 반응 항체의 존재를 스크린한다. 이를 위해, ELISA 평판은 염소 항-생쥐 F(ab‘)₂ 항체(Jackson Immuno Research, Milan analytica, Swizerland)로 피복하고, 하이브리도마 배양 상층액을 첨가하고, 이후 rhIL-18(재조합 대장균(E. coli)으로부터 정제됨, Serono Pharmaceutical Research institute, Geneva)과 함께 또는 단독으로, 전술한 바와 같이 중국 햄스터 난세포로부터 정제된 비오틴화된 rhIL-18BP-6his(Novick, et al. 1999)를 첨가하고, 최종적으로 페닐렌디아민(OPD)(Sigma)을 이용하여 만들어진 스트렙타비딘-양고추냉이 과산화효소(HRP)(Jackson Immuno Research, Milan analytica, Switzerland)를 첨가한다. 비-중화 항체는 선별하고 서브클론한다. 본 연구 95-H20에서, 생쥐 IgG1 단클론 항체를 사용한다.

IL-18BP- 파지티브 세포의 국소화에 대한 면역조직화학적 연구

조직 시료는 -80℃에서 짧게 동결하고 저장한다. 일련의 동결절편(10㎛)이 수득되는데, 이는 폴리-L-리신-피복된 Superfrost/Plus 유리 슬라이드(Polylabo, Plan-les-Ouates, Switzerland)에 올려놓고 얼음-냉각 아세톤에 고정시킨다. 사람 IL-18BP 단백질의 국소화는 Mab 95-H20을 이용한 면역조직화합법으로 분석한다. PBS에서 짧게 재수화(Rehydration)시킨 이후, 절편은 2% 우태아혈청(FCS)(Cansera, Ontario, Canada), 1% 사람 혈청(AB⁺ 혈청, Transfusion Center, Annemasse, France), 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)(Sigma, St. Louis, MO, U.S.A)으로 보충된 PBS 에서 30분동안 선-배양한다. 내생적 과산화효소 활성은 슬라이드를 PBS, 2% FCS, 1% 사람 혈청, 0.5% BSA, 1% 과산화수소(H₂O₂)의 용액(Fluka, Switzerland)에 1시간동안 위치시켜 차단한다. PBS에서 세척한 이후, 절편은 Mab 95-H20의 비-희석된 배양 상층액과 함께 하룻밤동안 배양한다. PBS에서 추가로 세척한 이후, 절편은 0.5% BSA를 함유하는 PBS 용매의 비오틴화된 염소 항-생쥐 항체(Jackson Immuno Research, Milan analytica, Switzerland)(5㎎/㎖)와 함께 1시간동안 배양한다. 염색의 감도는 아비딘DH/비오틴화된 HRP 복합체(Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories, CA, U.S.A)를 30분동안 함께 배양함으로써 증가시킨다. 이후, 슬라이드는 PBS로 세척하고, 아세테이트 완충액에 녹인 30% H₂O₂, 3,3-아미노-9-에틸 카르바졸(AEC)(Sigma), N,N-디메틸포름아미드(Merck)의 용액(pH 5)을 이용하여 현상시킨다. 헤마톡실린(Sigma)으로 대조-염색한 이후, 절편은 글리세롤로 피복하고 커브 슬립을 덮는다. 생쥐 IgG1 항체(R and D system)는 이소타입 대조군으로 사용한다.

사람 IL-18BP의 세포 국소화를 확인하기 위하여, 점막 장 절편에서 2색 면역조직화학법을 실시한다. PBS에서 10분간 재수화시킨 이후, 절편은 2% FCS, 1% 사람 혈청, 0.5% BSA로 보충한 PBS에서 30분동안 선-배양한다. 내피세포와의 상호국한(colocalization)을 위하여 절편은 PBS/0.5%BSA에서 FITC-공액된 생쥐 항-사람 CD31(1:50)(Pharmingen, CA, U.S.A)과 혼합된 비오틴화된 Mab 95-H20과 함께 하룻밤동안 배양한다. 대식세포의 상호국한을 위하여 FITC-공액된 생쥐 항-사람 CD68(1:25)(Dako, Denmark)과 혼합된 비오틴화된 Mab 95-H20(20㎍/㎖)과 함께 하룻밤동안 배양한다. 슬라이드는 한번 더 세척하고, 절편은 모비올로 피복하고 커브 슬립을 덮는다. 비오틴화된 생쥐 IgG1 항체(Pharmingen) 및 후속 스트렙타비딘(Texas-Red)은 이소타입 대조군으로 사용한다.

세포 배양

사람 탯줄정맥 내피세포(HUVEC)(Clonetics Corp., San Diego, CA)는 제조업자의 지시에 따라 사람 재조합 상피 성장 인자(hEGF)(10 ng/㎖), 하이드로코르티손(1ng/㎖), 젠타아미신과 앰포테리신 B(50ng/㎖), 쇠 뇌 추출물(BBE)(3㎎/㎖), 2% 우태아혈청(FBS)(Clonetics Corp., San Diego, CA)으로 보충한 내피세포 성장배지(EGM)를 이용하여 배양하였다. 조직 배양 접시는 사람 피브로넥틴(10 ng/㎠)(Boehringer, Mannheim)으로 선-피복한다. 세포는 가습된 5% CO₂ 배양기에서 배양하고, 실험은 3번 계대배양된 HUVEC를 이용하여 실시한다. HUVEC는 사람 IL-1β(10 ng/㎖), TNFα(10 ng/㎖), IFNγ(20 ng/㎖)(R and D system, Germany)로 24시간동안 처리한다. 배양의 종결시점에서 세포는 수거하고 RNA 분리하고 IL-18BP와 IL-18 mRNA 분석을 위한 RT-PCR을 실시한다. 상층액은 수거하고 ELISA로 IL-18BP와 IL-18 mRNA 단백질 발현을 분석한다.

사람 단핵구세포주 THP-1은 10% 열-불활화된 FCS, L-글루타민(2 mM), 페니실린-스트렙토마이신(10 U/㎖)(Gibco BRL, Life Technologies), β-멀캡토에탄올(50 mM)(Fluka)로 보충한 RPMI 배지의 현탁 배양액에 부유시킨다. 이들은 가습된 5% CO₂ 배양기에서 배양하고 매 5일마다 1:10으로 계대배양한다. 실험 3일전, 사람 단핵구세포는 비타민 D3(80 nM)(Biomol Research Laboratories, USA)으로 0.4x10⁶ 세포/㎖ 밀도로 분화시키고 그 상태를 유지시킨다. 분화된 세포 배양액에 LPS(100 ng/㎖)(Calbiochem), 사람 IL-1β(10 ng/㎖), TNFα(10 ng/㎖), IFNγ(20 ng/㎖)를 첨가한다. 48시간후에, 상층액은 수거하고 ELISA로 IL-18BP와 IL-18 단백질 발현을 분석한다.

사람 IL-18BP와 IL-18 생산의 측정

IL-18BP의 존재는 48시간동안 사이토킨 칵테일(LPS, IL-1β, TNFα, IFNγ)로 자극한 또는 자극하지 않은 THP-1 세포주 및 사이토킨 칵테일 (IL-1β, TNFα, IFNγ)로 자극한 또는 자극하지 않은 HUVEC의 무세포 상층액에서 ELISA로 평가한다. 이를 위해, 평판은 rhIL-18BP(동소체 a)에 반하는 캡처 Mab(0.5 ㎍/㎖/well의 클론 657.27, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel)로 하룻밤동안 피복한다. 이후, 가용성 rhIL-18BP는 rhIL-18BP-6his(중국 햄스터 난소 세포로부터 정제됨, Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel)에 반하는 토끼 다클론 항체(1/10,000으로 희석됨)를 이용하여 검출하고, 이후 과산화효소 공액된 친화성 정제된 염소 항-토끼 IgG(1/20,000으로 희석됨)(Jackson Immuno Research, Milan analytica, Switzerland)와 함께 배양한다. 캡처 Mab와 토끼 다클론 항체는 웨스턴 블랏으로 검사하여, IL-18BP 특이성을 확인한다. 동시에, 사람 IL-18 ELISA 키트(MBL, Immunotech)를 이용하여 IL-18 수준을 정량한다. ELISA의 감도는 12.5 pg/ ㎖이다.

CHO 세포에서 hIL -18 BPa - His6 의 발현

재조합 사람 IL-18BP(hIL-18BPa-His6-tag)는 중국 햄스터 난소 세포(Interpharm Laboratories, Nes Ziona, Israel)로부터 정제한다.

결과

장 생검에서 IL-18BP mRNA 전사체의 발현

IL-18BP mRNA 발현에 대한 분석은 활성 CD 환자, 비-활성 CD 환자 또는 UC 환자의 결장수술 시료의 조직 균질체 및 비-염증 장 조직의 조직 균질체에서 RT-PCR로 실시한다(도 14). IL-18BP와 액틴 전사체는 검사된 모든 장 균질체에서 검출되었다. 유사하게, IL-18에 대한 전사체는 CD, UC 또는 비-IBD 대조군의 모든 조직 균질체에서 발견되었다(도 14A). 대조군 mRNA 수준에 대한 IL-18BP 또는 IL-18의 비율은 비-활성 CD 환자, UC 환자 또는 비-IBD 대조군 환자의 생검과 비교하여, 활성 CD 환자에서 수득된 생검에서 IL-18BP와 IL-18에 대한 전사체의 함량에서 통계학적으로 유의한 증가가 나타났다(도 14B와 c). 이들 데이터는 IL-18BP가 활성 CD동안 점막 조직에서 상향 조절되고, IL-18BP 발현 수준이 활성 CD와 비-활성 CD, UC, 비-IBD 대조군에서 명확하게 차별화된다는 일차적인 증거를 제공한다.

장 생검에서 IL-18BP mRNA 전사체의 발현에 대한 통계학적 분석

변이 분석은 모든 가용한 데이터를 수집하여 실시한다. 결과는 활성 CD 군의 환자중 한 명의 결과에서 통계학적 극단치(IL 18에 대하여 매우 높은 OD 비율, 즉 16252 및 IL 18에 대하여 매우 낮은 OD 비율, 즉 1058)를 분명하게 나타난다. 이런 극히 불규칙적인 한 쌍의 측정값으로 인해 ANOVA 모형의 인증이 불가능하였다(나머지 측정값의 정규성에 대한 Shapiro-Wilks 검증의 p-값 < 0.0001). 따라서, 통계학적 분석에서 이들 한 쌍의 측정값은 무시한다.

사용된 ANOVA 모형은 인자 군(대조군, 활성 CD, 불활성 CD, UC), 단백질(IL-18 또는 IL-18BP), 환자수(23명)를 고려한다. 군간에는 유의성 차이가 존재한다(p-값 < 0.0001). 흥미롭게도, IL-18과 IL-18BP간의 CD 비율 차이는 현저하지 않았다. 이에 더하여, IL-18과 IL-18BP간의 상관관계분석을 실시한다. IL-18과 IL-18BP간의 상관관계 계수는 0.67인데, 이는 IL-18과 IL-18BP에 대하여 측정된 OD비율간의 강한 관련성을 암시한다. Group 효과와 관련된 결과를 추적하는 Scheffe 방법을 이용하여 개별 군을 비교한다. IL-18BP와 IL-18 발현에 대한 활성 CD의 OD 비율은 대조군(+3280), UC(+2590), 특히 불활성 CD(+4580)의 OD 비율보다 현저하게 높다는 결론을 도출할 수 있다.

장 조직에서 IL-18BP의 면역조직화학적 국소화

IL-18BP의 세포 발현을 in situ 평가하기 위하여, 활성 CD 환자와 비-IBD 대조군 환자로부터 얻은 장 조직에서 준비한 동결절편에서 항-hIL-18BP 단클론항체를 이용한 면역조직화학법을 실시한다. IL-18BP 파지티브 세포는 점막고유층, 점막하층, 근육층 내에서 검출된다. 점막고유층과 점막하층에 존재하는 파지티브 염색된 단핵구 세포는 풍부한 세포질, 소포성 망상 핵을 보유하고 조직 대식세포와 형태적으로 일치한다. 근육층에서 파지티브 염색된 세포는 세포질을 풍부하게 보유하고 미세혈관의 파지티브 염색을 시사하는 개방된 내강이 중간부에 가끔 존재하며 내피 세포와 형태적으로 일치한다. 비-IBD 대조군 환자로부터 얻은 시료와 비교하여, 활성 CD 환자로부터 얻은 시료에서 관찰되는 파지티브 염색된 세포의 유의성 증가는 RT-PCR 분석동안 관찰되는 IL-18BP 발현의 증가와 상관한다.

점막 생검에 존재하는 IL-18BP 생산 세포의 확인

염증 장 조직에 존재하는 IL-18BP 파지티브 세포는 대식세포(항-CD68)와 내피세포(항-CD31)의 특정 마커를 이용하여 확인한다. CD68 파지티브 세포(녹색)와 IL-18BP 파지티브 세포(적색)는 활성 CD 환자로부터 얻은 장 조직의 점막고유층과 점막하층에서 검출된다. CD31 파지티브 세포(녹색)와 IL-18BP 파지티브 세포(적색)는 점막하층에서 검출된다. 대식세포와 내피세포가 IL-18BP에 대하여 모두 파지티브인 지를 확인하기 위하여 항-CD68이나 항-CD31의 녹색과 항-IL-18BP의 적색을 분석하는데, 이는 항-IL-18BP 항체에 결합하는 세포가 CD68 파지티브 또는 CD31 파지티브(오렌지-황 색)임을 입증한다. 이런 이중 면역표지는 대식세포와 내피세포가 CD 환자에서 유래된 염증 조직에서 IL-18BP 염색의 근원이라는 것을 입증한다.

내피세포에 의한 IL-18BP mRNA 와 단백질의 발현

IL-18BP를 생산하는 사람 내피세포의 능력을 조사하고 전체 생검에서 면역염색 및 RT-PCR에 의해 밝혀진 결과를 확인하기 위하여, 사람 탯줄정맥 내피세포(HUVEC)에서 추가적인 RT-PCR 실험을 실시한다(도 15A). 내피세포는 사이토킨 칵테일(hIL-1β, hTNFα, hIFNγ)로 처리하고 RNA 추출과 PCR 분석을 위하여 24시간후에 수거한다. 24시간후 대조군 액틴 mRNA 수준에 대한 IL-18BP의 비율은 자극하지 않은 세포와 비교하여 자극받은 세포에서 IL-18BP 전사체 양의 증가를 입증한 다. 게다가, IL-18 mRNA는 내피세포에서 구조적으로 발현되는 것으로 나타났다. 또한, IL-18 mRNA 수준을 분석하는데, 이는 처리된 세포에서 약간의 증가를 나타낸다. 하지만, IL-18 mRNA는 자극하지 않은 내피세포에서 발현되지 않았다.

자극하지 않은 세포(매질) 및 24시간동안 자극받은 HUVEC의 배양 상층액의 ELISA에서 IL-18BP 단백질이 매질 및 자극받은 세포 모두에 존재한다는 것을 알 수 있는데, 24시간 자극이후에 30x 증가한다(도 15B).

단핵구 세포주( THP -1)에 의한 IL-18BP 단백질의 발현

IL-18과 IL-18BP의 발현은 자극하지 않은, 자극받은, 분화된 THP-1의 배양 상층액에서 ELISA로 분석한다(도 15). 이 실험에서, 48시간의 LPS, hIL-1β, hTNFα, hIFNγ 자극이후 IL-18BP 발현이 증가한다는 것을 알 수 있다. 자극이후 IL-18 분비 역시 증가한다.

요약

본 연구에서 크론병과 궤양성 대장염 환자에서 유래된 점막 조직에서 IL-18BP의 발현 및 국소화를 특성화하였다. 반정량적 RT-PCR 프로토콜을 이용하여, 궤양성 대장염 환자 및 비염증성 대조군 환자와 비교하여 활성 크론병 환자의 점막 생검에서 IL-18BP mRNA 전사체가 증가한다는 것을 발견하였다. 점막 생검의 면역조직학적 분석으로, 크론병동안 점막에 침윤한 내피세포와 대식세포에서 IL-18BP 단백질을 확인하였다. 내피세포와 활성화된 대식세포에 의한 IL-18BP 발현은 시험관내에서 자극받은 일차 사람 탯줄정맥 내피세포(HUVEC)와 THP1 단핵구 세포주에서 확인되었다. 자극이후, 이들 세포는 생활성 IL-18BP를 분비하였다.

실시예 12: IL-18 저해물질 치료는 실험적 대장염을 완화시킨다

재료와 방법

생쥐와 대장염의 유도

네덜란드 암스테르담 대학의 동물 연구 윤리 위원회는 모든 실험을 승인하였다. BALB/c 생쥐는 Harlan Spargue Dawley Inc(Horst, The Netherlands)에서 구하였다. 생쥐는 표준 조건하에 사육하고 음료와 사료(AM-ll 10mm, Hope Farms, Woerden, The Netherlands)를 제공하였다.

실험은 8 내지 10주된 암컷 BALB/c 생쥐에서 실시하였다. 대장염은 항문으로부터 3㎝ 지점에 위치시킨 비닐 카테터로 40% 에탄올(Merck, Darmstadt, Germany)에 녹인 2㎎ 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산(TNBS)(Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA)의 2회 복용량을 직장 주입하여 유도하였다(군당 10마리의 생쥐). 생쥐는 주입동안 이소플루란(1-클로로-2,2,2-트리플루오르에틸-이소플루란-디플루오르메틸-에테르, Abbot Laboratories Ltd., Queenborough, Kent, UK)으로 마취시키고, 주입이후 60초동안 직각으로 유지시켰다. 대조군 생쥐에 동일한 과정을 실시하지만, 생리식염수를 주입한 점은 예외로 한다. 모든 생쥐는 1차 TNBS 주사후 9일(즉, 2차 TNBS 주사후 48시간)째에 죽인다.

생쥐는 500㎕ 0.9% 식염수에 녹인 사람 IL-18BP를 복강내 투여한다.

hIL-18BP는 CHO 발현 시스템에서 만들어진 6개 히스티딘 꼬리의 사람 재조합 단백질이다. hIL-18BP는 KG-1 세포주에서 IFNγ 생산을 저해하고 생쥐 비장 세포에 의한 IFNγ 생산을 감소시키는 생활성을 보였다.

염증의 평가

체중은 매일 기록한다. 비장, 꼬리모양 림프절, 결장은 죽임직후에 수거한다. 결장은 중간선 절개를 통하여 떼어내고 세로로 개복한다. 찌꺼기를 제거한 이후, 6㎝ 결장을 칭량하고, 이는 질환-연관된 장벽 비후(intestinal wall thickening)의 지수로 활용한다. 이후, 결장은 세로로 양분하고, 이중 하나를 조직학적 평가에 사용한다.

조직학적 분석

세로로 양분된 결장은 일반 조직검사를 위하여 둥글게 말고 4% 포르말린에 고정시키고 파라핀에 포매한다. 생쥐의 치료 프로토콜을 알지 못하는 2명의 연자가 다음의 파라미터를 기록한다: 1) 관련 부위의 비율, 2) 소낭 응집체의 과형성, 3) 부종, 4) 침식/궤양형성, 5) 음와 손실, 6) 단핵구와 다핵구 세포. 관련 부위의 비율 및 음와 상실은 다음과 같이 0 내지 4의 스코어로 기록한다: 0, 정상; 1, 10%이하; 2, 10%; 3, 10 내지 50%; 4, 50%이상. 침식은 다음과 같이 정의한다: 0, 내피에 손상없음; 1, 점막고유층의 침윤; 2, 점막하층의 궤양형성; 3, 경벽성 궤양형성. 다른 파라미터의 중증도는 다음과 같이 0 내지 3의 스코어로 기록한다: 0, 없음; 1, 경미; 2, 중간; 3, 심각. 이런 스코어 범위는 0에서 최대 26 포인트다.

결장 균질체

결장은 수거하고, 9 체적의 Greenburger 용해 완충액(300 mM NaCl, 15 mM Tris, 2 mM MgCl, 2 mM Triton(X-100), 펩스타틴 A, 레우펩틴, 아프로티닌(모두 20 ng/㎖), pH 7.4)에서 조직 분쇄기로 균질체를 만든다. 조직은 얼음에서 30분동안 용해시키고, 이후 2회 원심분리(10분, 14,000g)한다. 균질체는 사용할 때까지 -20℃로 저장한다.

세포 배양과 사이토킨에 대한 ELISA

비장과 꼬리모양 림프절의 세포 현탁액을 만들기 위하여, 필터 세포 여과기(Becton/Dickinson Labware, New Jersey, USA)를 사용한다. 세포는 10% FCS와 시프록신(10 ㎍/㎖)(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 함유하는 RPMI 1640 배지(BioWhittaker-Boehringer, Verviers, Belgium)에 부유시킨다. 비장 세포는 멸균 Ficoll(Pharmacia, Uppsala, Sweden)로 원심분리하고, 단핵구 세포는 RPMI로 옮기고, 세포 현탁액은 카운트한다. 생쥐당 총 1x10⁵ 세포는 삼중웰에서 항생제와 10% 우태아혈청을 함유하는 200 ㎕ RPMI(BioWhittaker-Boehringer, Verviers, Belgium)에 부유시킨다. 세포는 항-CD3 항체(1:30 농도; 145.2C11 클론)와 가용성 항-CD28 항체(1:1000 농도; Pharmingen)로 선-피복하여 자극한다. 상층액은 48시간후 제거하고, IFN-γ(Pharmingen)과 TNF-α(R&D systems, Abington, Inited Kingdom) 농도는 ELISA 분석으로 측정한다.

유세포분석

분리된 비장 세포는 Facs 완충액(PBS)(0.5% BSA, 0.3mmol/ℓ EDTA, 0.01% 아지드화 나트륨 함유)으로 세척하고 나머지 과정동안 얼음에 유지시킨다. 웰당 2x10⁵ 세포(96웰 V-형 마이크로평판, Greiner B.V. labor techni다, Alphen aan de Rijin, The Netherlands)는 다음의 항체(mAb): Cy-크롬-공액된 쥐 항-생쥐 CD4(클 론 RM4-5), Fitc-공액된 쥐 항-생쥐 CD69, Fitc-공액된 쥐 항-생쥐 CD25(Pharmingen, san Diego, CA)와 함께 배양한다. 림프구는 Facscan 소프트웨어(Becton Dickinson, Mountain View, USA)와 함께, FACScan 유세포분석기를 이용한 전방 산란과 측방 산란으로 측정하고, 5000 세포는 카운트한다. 결과는 사용된 mAb에 대한 파지티브 세포의 비율로 표시한다.

통계 분석

수치는 처리군당 평균과 SEM으로 제시한다. 군간의 차이는 비모수 Mann-Withney U 검정으로 분석한다. 시간에 따른 체중 변화는 일방 분산분석으로 분석한다. p<0.05는 유의한 것으로 간주한다. SPSS 통계 소프트웨어(SPSS Inc., Chicago, USA)는 모든 분석에 활용한다.

도 1은 LPS 주사 1시간전에 다양한 함량(0; 0.04; 0.4; 4 ㎎/㎏)의 재조합 IL-18BP를 생쥐에 주사한 이후, IFN-γ(pg/㎖)의 혈청 수준을 도시한다. 혈액 샘플은 LPS 주사 5시간후에 취하고 ELISA로 순환 IFN-γ을 분석한다.

도 2는 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)의 혈청 수준을 도시한다. 여드름 균(P. acnes) 감작화된 생쥐에 LPS를 주사하기에 앞서, 다양한 함량(0; 0.04; 0.4; 4 ㎎/㎏)의 재조합 사람 IL-18BP를 생쥐에 주사한다. 혈액 샘플은 LPS 주사 5시간후에 취하고 ALT의 혈청 수준을 측정한다. SF = Sigma-Frankel: 1 SF 유닛의 AST/ALT는 25℃, 7.5 pH에서 4.82x10^-4 μmol 글루타메이트/min을 생성한다.

도 3은 LPS 주사후 생쥐의 생존 기간을 도시한다. 여드름 균(P. acnes) 감작화된 생쥐에 LPS를 주사하기 20분전에, 다양한 함량(0; 0.04; 0.4; 4 ㎎/㎏)의 재조합 사람 IL-18BP를 생쥐에 주사한다. 삼각형: 4 ㎎/㎏; 작은 다이아몬드: 0.4; 큰 다이아몬드: 0.04; 원: IL-18BP 없음(LPS 단독).

도 4는 여드름 균(P. acnes) 감작화된 생쥐에 LPS를 주사하기 20분전에 투여된 다양한 함량(0; 0.4; 4 ㎎/㎏)의 IL-18BP 주사 5시간후에 측정된 IFN-γ의 혈청 수준을 도시한다.

도 5는 대장균(E. coli)(도 5A) 또는 쥐티푸스균(S. thyphimurium)(도 5B)으로부터 유래된 40 ㎎/㎖(치사량) LPS 주사 30분전에 다클론 IL-18 항혈청 또는 정상 토끼 혈청(NDS = 대조군)을 주사한 생쥐의 생존을 도시한다. 삼각형: IL-18 항 혈청을 주사한 생쥐; 원: NDS를 주사한 생쥐. x-축은 LPS 공격접종이후의 일수를 나타낸다. ^*p<0.05.

도 6은 다음의 방식으로 처리된 군당 5마리 생쥐의 평균± SEM을 도시한다. 생쥐는 항-IL-18 항혈청, 가용성 TNF-α수용체(TNFsRp55) 또는 운반체(식염수)를 복강내 주사하고, 직후에 콘카나발린 A(Con A; 도 6A) 또는 PEA(녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 도 6B)를 정맥내 투여한다. ^**p<0.01; ^***p<0.001 vs Con A 또는 PEA 단독; #p<0.01 vs TNFsRp55 또는 항-IL-18 인자 ANOVA.

도 7은 뮤린 관절염 모형에서 임상적 스코어에 대한 IL-18BP의 효과를 도시한다. 도 7A는 상이한 함량의 IL-18BP, IFN-β또는 운반체(NaCl)를 생쥐의 i.p.(복강내)에 매일 투여한 이후 측정된 임상적 스코어를 도시한다. 기호: 채워진 삼각형: 10,000 IU IFN-β; 열린 삼각형: 3 ㎎/㎏ IL-18BP; 다이아몬드: 1 ㎎/㎏ IL-18BP; 원: 0.5 ㎎/㎏ IL-18BP; 열린 사각형: 0.25 ㎎/㎏ IL-18BP; 채워진 사각형: NaCl. 치료 일수는 X-축에 표시하고, 임상적 스코어는 Y축에 표시한다. 통계수치는 Mann Whitney 검증으로 계산한다. 도 7B는 도 7A의 그래프로부터 유도된 AUC(곡선 아래 면적)을 도시한다. n = 동물의 개체수.

도 8은 발 부종에 대한 IL-18BP의 효과를 도시한다. 도 8A는 상이한 함량의 IL-18BP로 처리된 개별 동물의 병든 뒷발의 부종 두께(팽화)를 측정하여 수득된 결과를 도시한다. Y축은 치료 시작부터 ㎜ 단위로 부종 두께의 변화를 도시한다. 기호는 도 7에서와 동일하다. 도 8B는 도 8A로부터 유도된 AUC를 도시한다. n = 동물 의 개체수.

도 9는 급성 관절염 시점, 다시 말하면 관절염이 다른 관절로 확산되는 시점에서 병든 뒷발의 수치 분석 결과를 도시한다. 기호: 채워진 사각형: NaCl(대조군); 삼각형: 10 ㎎/㎏ IL-18BP; 역삼각형: 3 ㎎/㎏ IL-18BP; 다이아몬드: 1 ㎎/㎏ IL-18BP; 원: 0.5 ㎎/㎏ IL-18BP; 열린 사각형: 0.25 ㎎/㎏ IL-18BP.

도 10은 병든 관절의 연골 침식 스코어를 도시한다.

도 11은 생쥐 관절의 조직생리를 도시한다. 실험의 종결시점에서, 관절염이 첫 번째로 발병한 발은 절개하고 고정하고 하기 실시예 10에서 밝힌 바와 같이 처리한다. 도 11A: 정상 생쥐 관절; 도 11B: 관절염 생쥐의 관절; 도 11C: rhIL-18BP로 처리된 생쥐의 관절.

도 12는 각각 3 ㎎/㎏ IL-18BP 또는 식염수(운반체)로 처리한 생쥐의 이소타입 IgG1(열린 칼럼) 또는 IgG2a(교차된 평행선 무늬의 칼럼)의 항-콜라겐 II형 항체의 수준을 도시한다. 측정은 4일(D4)과 8일(D8)에 실시한다.

도 13은 1,3 혹은 10 ㎎/㎏ IL-18BP, 10,000 IU의 인터페론 β(IFN-b), 정상 생쥐 혈청(NMS) 또는 식염수(NaCl)로 처리된 동물의 IL-6 수준(pg/㎖)을 도시한다.

도 14는 활성 크론병 환자, 궤양성 대장염 환자 또는 건강한 정상 개체의 장 생검에서 hIL-18BP와 IL-18 mRNA의 발현을 도시한다. IL-18BP, IL-18, 하우스키핑 유전자(β-액틴)에 대한 대표적인 RT-PCR 산물을 도시한다(도 14A). 에티디움브로마이드-염색된 밴드의 정량은 Kodak Digital Imaging 소프트웨어로 실시하고, β-액틴에 대한 표적 유전자의 비율로 표시한다. 표적 유전자는 도 14B에서는 IL-18이 고, 도 14C에서는 IL-18BP이다.

도 15는 HUVEC에 의한 hIL-18BP mRNA 전사체와 단백질의 발현 및 THP1(사람 단핵구성 세포주)에 의한 단백질의 발현을 도시한다. RNA는 처리되지 않은 내피세포(매질) 및 IL-1β, TNFα, IFNγ로 자극된 내피세포로부터 분리한다. 파지티브 대조군: 크론병 환자의 결장. 네거티브 대조군: cDNA 없음. IL-18BP와 IL-18 발현은 반정량적 RT-PCR로 분석한다(도 15A). 처리되지 않은(매질) 및 HUVEC(도 15 B) 또는 THP1(도 15C) 세포의 IL-1β, TNFα, IFNγ로 24시간 활성화된 세포의 세포 상층액은 ELISA로 IL-18BP와 IL-18에 대하여 분석한다.

도 16은 식염수(NaCl) 또는 IL-18BP(8 ㎎/㎏)를 복강내(IP) 투여한 이후 IBD의 생쥐 모형에서 1일부터 10일까지의 체중 변화를 도시한다. 체중 변화는 1일을 기준으로 하여 체중 변화 퍼센트로 표시한다. 두 군(각각 8마리 생쥐)의 평균값과 SEM을 도시한다.

도 17은 IL-BP 처리된 생쥐 vs 처리되지 않은 IBD 생쥐로부터 유래된 결장, 꼬리모양 림프절, 비장의 분석 결과를 도시한다. 도 17A는 마지막 6㎝ 결장의 중량(㎎)을 나타낸다. 도 17B는 꼬리모양 림프절에 존재하는 전체 세포수를 도시한다. 도 17C는 비장에서 CD4⁺/CD69⁺에 대하여 파지티브 염색된 세포의 퍼센트를 나타낸다. 데이터는 평균값과 SEM으로 표시한다. ^*는 유의성 차이를 표시한다.

도 18은 상층액에 존재하는 CD3/CD28로 자극한 이후 꼬리모양 림프절 세포(도 18A와 C)와 비장 세포(도 18B와 D)에 의해 48시간이후 생성된 IFNγ(도 18A와 B)와 TNFα(도 18C와 D)의 함량을 도시한다. 평균값과 SEM으로 표시한다.

도 19는 결장 균질체에서 TNFα(도 19 A)와 IFNγ(도 19 B)를 도시한다. 데이터는 결장 중량에 대하여 보정한다. 평균값과 SEM으로 표시한다. ^*는 유의성 차이를 표시한다.

Claims (30)

1. 염증성 장 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 이용되고, IL-18 저해물질을 활성 성분으로 함유하는 제약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 염증성 장 질환은 크론병인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 염증성 장 질환은 궤양성 대장염인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
4. 제 1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 카스파제-1(ICE) 저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위 중에서 하나에 대한 항체, IL-18 신호 경로의 저해물질, IL-18과 경합하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질 및 IL-18 결합단백질, 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 IL-18 결합단백질과 동일 활성을 보유하는 이들의 순환 치환된 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
5. 제 4항에 있어서, IL-18 저해물질은 IL-18 항체인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
6. 제 5항에 있어서, IL-18 항체는 IL-18 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
7. 제 5항에 있어서, IL-18 항체는 IL-18 인간 항체인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
8. 제 7항에 있어서, IL-18 저해물질은 IL-18 결합단백질, 또는 이의 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 순환 치환된 유도체인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
9. 제 8항에 있어서, IL-18 결합단백질은 PEG화되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
10. 제 8항에 있어서, IL-18 저해물질은 면역글로불린의 전체 또는 일부에 융합된 IL-18 결합단백질의 전체 또는 일부로 구성되는 융합단백질이고, 상기 융합단백질은 IL-18에 결합하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 융합단백질은 면역글로불린 불변영역의 전체 또는 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
12. 제 11항에 있어서, 면역글로불린은 IgG1 또는 IgG2 이소타입인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
13. 전술한 어느 한 항에 있어서, 약제는 인터페론을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
14. 제 13항에 있어서, 인터페론은 인터페론-β인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
15. 제 13항 또는 제14항에 있어서, IL-18 저해물질은 인터페론과 동시에, 순차적으로 또는 독립적으로 사용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
16. 전술한 어느 한 항에 있어서, 약제는 종양괴사인자(TNF) 길항물질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
17. 제 16항에 있어서, TNF 길항물질은 TBPI 또는 TBPII인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
18. 제 16항 또는 제17항에 있어서, IL-18 저해물질 또는 인터페론은 TNF 길항물 질과 동시에, 순차적으로 또는 독립적으로 사용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
19. 전술한 어느 한 항에 있어서, 약제는 COX-저해물질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
20. 제 19항에 있어서, COX-저해물질은 COX-2 저해물질인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
21. 전술한 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 체중 ㎏당 0.0001 내지 10 ㎎의 양 또는 체중 ㎏당 0.01 내지 5 ㎎의 양 또는 체중 ㎏당 0.1 내지 3 ㎎의 양 또는 체중 ㎏당 1 내지 2 ㎎의 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
22. 전술한 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 체중 ㎏당 0.1 내지 1000㎍의 양 또는 체중 ㎏당 1 내지 100㎍ 또는 체중 ㎏당 10 내지 50㎍의 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
23. 전술한 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 피하 투여되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
24. 전술한 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 근육내 투여되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
25. 전술한 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 매일 투여되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
26. 전술한 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 격일로 투여되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
27. 염증성 장 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 이용되고, IL-18 저해물질의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 활성 성분으로 함유하는 제약학적 조성물.
28. 제 27항에 있어서, 유전자 치료에 이용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
29. 염증성 장 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 이용되고, 세포에서 IL-18 저해물질의 내인성 생산을 유도하거나 강화하는 벡터를 활성 성분으로 함유하는 제약학적 조성물.
30. 염증성 장 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 이용되고, IL-18 저해물질을 생산하도록 유전자 조작된 세포를 활성 성분으로 함유하는 제약학적 조성물.

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