DD268976A5 - Verfahren zur Herstellung von Humaninsulinanaloga - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Humaninsulinanaloga Download PDFInfo
- Publication number
- DD268976A5 DD268976A5 DD29398186A DD29398186A DD268976A5 DD 268976 A5 DD268976 A5 DD 268976A5 DD 29398186 A DD29398186 A DD 29398186A DD 29398186 A DD29398186 A DD 29398186A DD 268976 A5 DD268976 A5 DD 268976A5
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- amino acid
- insulin
- human insulin
- asp
- chain
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
Die Erfindung betrifft neuartige schnellwirkende Humaninsulinanaloga mit geringerer Tendenz zur Selbstassoziation zu Dimeren, Tetrameren, Hexameren oder Polymeren werden zur Verfuegung gestellt. Die neuartigen Humaninsulinanaloga werden durch Substituieren eines oder mehrerer Aminosaeurereste von Humaninsulin mit natuerlich vorkommenden Aminosaeureresten gebildet. Die Aminosaeurerestsubstitutionen sind vorzugsweise hydrophiler als der natuerliche Aminosaeurerest in der entsprechenden Stellung im Molekuel. Ausserdem haben die Insulinanaloga die gleiche Ladung oder eine groessere negative Ladung bei neutralem p H als Humaninsulin. Bevorzugte Aminosaeuresubstituionen sind Asp, Glu, Ser, Thr, His und Ile, und am meisten bevorzugt werden Asp und Glu. Die erfindungsgemaessen Humaninsulinanaloga haben die Formel I. Sie koennen fuer die Herstellung schnellwirkender Insulinloesungen verwendet werden. Formel I
Description
Hierzu 5 Seiten Zeichnungen
Die Erfindung betrifft neuartige Humaninsulinanaloga, die durch schnellen Wirkungsbeginn bei subkutaner Injektion gekennzeichnet sind, und injizierbare Insulinlösungen, die solche Ins. ilinanaloga enthalten, sowie Verfahren zur Herstellung der neuartigen Insulinanaloga.
während chirurgischer Eingriffe, in der Schwangerschaft und bei schweren Infektionen. Außerdem können mehrfache, tägliche
insulin als schwierig erwiesen hat.
von den ß-Zellen des gesunden Organismus ähnlich ist, d. h. Zufuhr von Insulin mit den Mahlzeiten und Aufrechterhaltunp, eines
beobachtet (Binder, Diabetes Care, 7, Nr. 2 [1984], 188-189). Eine zu einem langsameren Einsetzen der Wirkung führende
schnellwirkenden Insulinlösungen mit längerwirkenden Insulinpräparaten kann außerdem zu verringerter
die kontinuierliche Insulinzufuhr verwendeten Insulinlösungen abzusetzen, wodurch mechanische Teile und Zuführkatheter verstopft werden.
normalem Insulin resistent sind.
[1979], 1619-1632) beschrieben die Synthese von Humaninsulinanaloga, die sich vom Humaninsulin im Austausch einer einzigen Aminosäure in den Stellungen 2,5,6,7,8 und 11 der Α-Kette und 5,7,13 und 16 der B-Kette entsprechend neuen
die Rezeptorbindungswirksamkeit zu erforschen. Die bekannten Humaninsulinanaloga werden jedoch nicht die von ihren
verminderte Insulinwirksamkeit, die etwa 20% der Wirksamkeit von natürlichem Insulin beträgt. Ein weiterer Nachteil von sulfatierten Insulinen im Vergleich mit natürlichem Insulin besteht darin, daß sie unnötigerweise Aminosäurereste enthalten, die chemisch modifiziert sind, d. h. Aminosäuren, die nicht natürlich vorkommen.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung neuartiger schnellwirkender Insulinlösungen mit einer oder mehreren der folgenden verbesserten Eigenschaften.
1. schnelleres Einsetzen der Wirkung bei subkutaner Injektion oder anderen Arten der Verabreichung
2. verbesserte Mischbarkeit mit protrahierten Insulinpräparaten
3. verminderte Fibrillationstendenz beim Einsatz in implantierbaren Zufuhrsystemen und
4. Verwendbarkeit für die Behandlung resistenter Patienten (geringe Affinität für bereits vorhandene Antikörper)
zu ihrer Herstellung aufzufinden.
biologische Wirksamkeit aufweisen als sulfatierte Insuline und außerdem vorzugsweise nur natürlich vorkommende
einschließlich der Disulfidbrücken zwischen A(7)Cys und B(7)Cys und zwischen A(20)Cys und B(19)Cys und einer internen
gestellt, die durch Substitution eines oder mehrerer der Aminosäurereste von Humaninsulin mit natürlich vorkommenden
und bei neutralem pH die gleiche Ladung oder eine größere negative Ladung als Humaninsulin aufweisen.
bestimmte Humaninsulinreste vorzugsweise mit anderen Aminosäureresten substituiert, die hydrophiler sind als der natürliche
Α-Kette
to ιι ia υ η is ι» u te 1930
9 10 11 U IJ 14 1» 18
B-Kette, I
worin die X die Aminosäurereste von Humaninsulin oder die gleichen oder unterschiedliche Aminosäurerestsubstitutionen sind, deren reine Funktion darin besteht, dem Molekül bei neutralem pH die gleiche Ladung oder eine größere negative Ladung als die von Humaninsulin zu verleihen, unter der Voraussetzung, daß sich mindestens ein X von den Aminosäureresten von
in Stellung A(21) Asp ist, X in Stellung B (5) AIa ist, X in Stellung B(9) Leu ist, X in Stellung B (10) Asn oder Leu ist, X in Stellung
mehrere Aminosäurerest(e) von den N- und/oder C-terminalen Enden der A- und/oder B-Kette entfernt worden sein können.
entsprechenden Stelle im Humaninsulinmolekül, und noch besser ist es, wenn alle Aminosäurerestsubstitutionen hydrophiler sind als die entsprechenden Humaninsulin-Aminosäurereste.
in der entsprechenden Stellung im Humaninsulinmolekül. Stärker bevorzugt sind 2 bis 4 Substitutionen.
ausgewählt und sind noch besser negativ geladene Aminosäurereste, d.h. Asp und/oder GIu.
oder mehrerer der Aminosäurereste von Humaninsulin mit einer aliphatischen und/oder aromatischen Seitenkette enthalten.
werden, und in den Stellungen B 20, B 27 und B28 sind die Aminosäurerestsubstitutionen vorzugsweise Asp oder GIu.
mit den obengenannten Positionen) erforderlich, um die verbesserten Eigenschaften zu erzielen. In diesen Stellungen können
A 21 Asp, GIu
Weitere bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind Insulinanaloga mit Substitutionen an den folgenden Stellen: B27,B12,B9,(B27 + B9), (B27 + A21),B27 + B12),(B12 + A21),{B27 + B17), (B27 + A13),(B 27 + B16),(B27 + A10), (B27 + B28),(B27 + B26),(B27 + B10UB27 + B1),(B27 + B2),(B27 + B5),(B27 + B14),(B27 + B18),(B27 + B20), (Β12 + Β17),(Β12 + Α10),(Β12 + Α13),(Β12 + Β16),(Β12 + Β1),(Β12 + Β2),(Β12Η·Β5),(Β12 + Β10),(Β12 + Β26), (B12 + B28), (B9 + B17), (B9 + A13),(B9 + B16), (B9 + A8), (B9 + A9), (B9 + A10), (B9 + B1), (B9 + B2),(B9 + B5), (B9 + B10), (B9 + B12), (B9 + B14), (B9 + B28), (B9 + B18), (B9 + B20), (B9 + B26), (B27 + B9 + A21), (B9 + B27 + A8), (B27 +'B12 + A21), (B27 + BYi + B9),(B9 + B12 + B27 + B17),(B9 + B12 + B27 + A13),(B9 + B12 + B27 + B16)und (B12 + B16 + B17 + B27 + A10 + A13). Bevorzugte Ausführungsformen der oben angeführten Formel I sind folgende: A-Kette
1 2 3 4 β «7 β β 10 11 12 13 14 16 18 17 10 19 201
B Kette A-Kette
3 4 6 β 7 β 9 10 11 12 13 14 16 10 17 10 19 20 21 22 23 24 26 20 2/ 28 29
1 2 3 4 6 β Τ| · 9 10 11 12 13 14 16 10 17 10 19 20|
3 4 6 0 7 8 9 10 11 12 13 14 16 10 17 10 19 20 21 22 23 24 25 20 27 20 29
B-Kette A-Kette
-COOH
1 2 3 4 (87
β 9 10 11 12 13 14 16 10 17 18 19 2o|
1 2 3 4 6 β 7 β 9 10 11 12 13 14 16 10 17 10 19 20 21 22 23 24 26 20 27 20 28
B-Kette
worin die X der obigen Definition entsprechen. Unter Bezugnahme auf Formel I sind andere bevorzugte erfindungsgemäße Insulinanaloga diejenigen, bei denen X in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung B12 He oder Tyr ist, X in Stellung A21 Asp und in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung B9 Asp ist X in Stellung A21 und in Stellung B9 Asp ist und in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung A8 His ist, in Stellung B9 Asp ist und in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung B10 Asp ist, X in Stellung B28 Asp ist, oder X in Stellung B9 Asp und in Stellung B27 GIu ist. Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung werden injizierbare Lösungen mit Insulinwirksamkeit zur Verfügung gestellt. Die injizierbaren Insulinlösungen der Erfindung enthalten die oben beschriebenen Humaninsulinanaloga oder ein pharmazeutisch
annehmbares Salz davon in wäßriger Lösung, vorzugsweise bei neutralem pH. Das wäßrige Medium kann durch den Zusatz von beispielsweise Natriumchlorid und Glycerol isotonisch gemacht werden. Auch Puffer wie ein Acetat oder Citrat und
können ferner Zinkionen enthalten.
wurden die Möglichkeiten für die Proteintechnik enorm. Durch das sogenannte stellenspezifische
eines oder mehrerer Codons im natürlichen Gen mit Codcn(s) für andere natürlich vorkommende Aminosäure(n) zu verändern.
hergestellt werden. Der Zweck einer solchen Manipulation eines Gens für ein natürliches Protein besteht normalerweise darin, die Eigenschaften des natürlichen Proteins in der einen oder anderen gezielton Richtung zu verändern.
entsprechenden Stelle im natürlichen Humanproinsulingen durch den (die) gewünschten Aminosäurerestsubstitute codierende
wird. Das neue modifizierte oder synthetische, das gewünschte Insulinanalogon codierende Gen wird dann in einen geeigneten
das gewünschte Produkt erzeugt. Das verwirklichte Produkt wird dann von den Zellen oder der Kulturlösung isoliert, je nachdem, ob das verwirklichte Produkt von den Zellen abgesondert wird oder nicht.
al. (Hoppa-Seyler's Z. Physiol. Chem., 360 [1979], 1619-1632) beschriebenen Verfahren analog sind. Sie können auch aus separat in vitro hergestellten A- und B-Ketten, die die entsprechenden Aminosäurerestsubstitutionen enthalten, gebildet werden, wonach die modifizierten A- und B-Ketten durch Herstellen von Disulfidbrücken nach bekannten Methoden (z. B. Chance et al., in:
miteinander verknüpft werden.
Formel II:
A-Kette
IO 11 11 13 M 19 16 17 16 19 JO
β 10 11 12 13 M '.δ It IT 16 19 10 11 21 13 14 16 26 27 28 2»
B-Kette, "·
worin Qn eine Peptidkette mit η natürlich vorkommenden Aminosäureresten ist, R Lys oder Arg ist, η eine ganze Zahl von 0 bis 33 ist, m 0 oder 1 ist, und die X der obigen Definition entsprechen, unter der Voraussetzung, daß die Peptidkette -Qn-R- nicht zwei benachbarte basische Aminosäurereste enthält, mit eir.em L-Threoninester in Anwesenheit von Trypsin oder einem Trypsinderivat umgesetzt wird, woran sich die Umwandlung des gewonnenen Threoninesters des Humaninsulinanalogons in das Humaninsulinanalogon nach bekannten Methoden anschließt. Diese sogenannte „Transpeptisierungs"-Reaktion wird in US-PS Nr.4,343,898 beschrieben (auf deren Offenbarungen hierin Bezug genommen wird).
Durch die Transpeptisierungsreaklion wird die Brückenbildung -(Qn-R)n,- zwischen Aminosäure 29 in der B-Kette und Aminosäure 1 in der Α-Kette abgebrochen und eine Threoninestergruppe an das C-terminnle Ende von B29 Lys gekoppelt. Die Vorläufer der vorstehenden Formel Il können nach dem in EP PA Nr. 0163529 A beschriebenen Verfahren hergestellt werden, auf dessen Offenbarungen hierin Bezug genommen wird. Nach diesem Verfahren wird eins den betreffenden Vorläufer codierende DNS-Sequenz in einen geeigneten Expressionsträger eingefügt, der nach Übertragung auf Hefe in der Lage ist, die gewünschte Verbindung mit genau positionierten Disulfidbrücken zu verwirklichen und abzugeben. Das verwirklichte Produkt wird dann von der Kulturlösung isoliert.
Die Insulinanaloga können auch hergestellt werden, indem ein biosynthetischer Vorläufer der allgemeinen Formel I A-Kette
* ICiI I K I QIuI AielQly I I1IuI I1InI I
» IAmIGInI » IliuICMlGlrl »IX Illui X JQIuI » IHuI X
B-Kette,
worin V und T jeweils Lys oder Arg sind und die X der obigen Definition entsprechen, in wäßriger Lösung mit Trypsin und Carboxypeptidase B umgesetzt und das Humaninsulinanalogon aus der Reaktionslösung rückgewonnen wird. Die Vorläufer der obengenannten Formel III können nach einem Verfahren hergestellt werden, welches dem in EP PA Nr. 86302133.3 beschriebenen Verfahren analog ist und auf Hassen Offenbarungen hier Bezug genommen wird. Nach diesem \ erfahren wird eine den Vorläufer codierende DNS-Sequenz in einen geeigneten Hefeexpressionsträger eingefügt, der nach Übertragung auf Hefe zur Expression und Sekretio ί des verwirklichten Produktes mit genau positionierten Disulfidbrücken im Kulturmedium in der Lage ist.
Nach einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung der neuartigen Insulinanaloga zur Verfügung gestellt, bei dem ein Hefestamm mit einem replizierbaren Expressionsträger, der eine einen Vorläufer q«.s Insulinanalogons codierende DNS-Sequenz enthält, in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet wird, und bei dem der Vorläufe.' aus dom Kulturmedium rückgewonnen und durch enzymatische und chemische i-vitro-Umwandlung in das neuartige Insulinanalogon umgewandelt wird.
Die Erfindung betrifft auch neuartige Vorläufer der neuartigen Insulinanaloga, solche neuartigen Vorläufer codierende DNS-Sequenzen, Expressionsträger, die solche DNS-Sequenzen enthalten, und mit solchen Expressionst -ftgern transformierte Hefestämme.
Die Erfindung betrifft auch bestimmte Ableitungen oder weitere Substitutionen der Insjilinanaloga, vorausgesetzt, daß solche Ableitungen oder weiteren Substitutionen keinen wesentlichen Einfluß auf das oben beschriebene ZgI der Erfindung haben. Es ist demzufolge möglich, einen oder mehrere der funktioneilen Gruppen In den Aminosäuraresten abzuleiten. Beispiele für eine solche Ableitung sind die an sich bekannte Umwandlung von Säuregruppen im Insulinmolekül in Ester- oder Amidgruppen, die Umwandlung von Alkoholgruppen in Alkoxygruppen oder umgekehrt, und selektive Desamidierung. Beispielsweise kann A21 Asn durch Hydrolyse im sauren Medium zu A21 Asp desamidiert werden, oder B3 Asri kann im neutralen Medium zu B3Asp desamidiert werden.
Es ist ferner möglich, die Insulinanaloga entweder durch Zusetzen oder Entfernen von Aminosäuraresten an den N- oder C-terminalen Enden zu modifizieren. Den erfindungsgemäßen Insulinanaloga können bis zu vier Aninocäurorcsto am N-terminalen Ende άει S-Keite und bis zu fünf Aminosäurereste am C-terminalen Ende der B-Kette fehlen, ohne daß sich ein bedeutender Einfluß auf die Gesamteigenschaften des Insulinanalogons ergibt. Beispiele für solche modifizierten Insulinanaloga sind diejenigen, denen der B1 Phe- oder der B30Thr-Aminosäurerest '3hlt. Es können auch an einem otter mehreren Enden der Polypeptidketten natürlich vorkommende Aminosäurereste hinzugefügt werden, vorausgesetzt, daß d.is keinen bedeutenden Ein'L'ß auf das obengenannte Ziel der Erfindung hat.
Solche Deletionen oder Additionen an den Enden der Polypeptidkette der Insulinanaloga können an den Insulinanaloga mit Aminosäuresubstitutionen entsprechend der Erfindung In vitro vorgenommen werden. Wahlweise kann das Gen für die neuartigen erfindungsgemäßen Insulinanaloga entweder durch Zusatz oder Entfernung von Codons entsprechend der zusätzlichen bzw. fehlenden Aminosäurereste an den Polypeptidkettenenden modifiziert werden.
Die für die Aminosäuren verwendeten Abkürzungen sind die in J. Biol. Chem. 243 (1963), 3558, festgelegten. Die Aminosäuren sind in der L-Konfiguration angegeben.
Gemäß Verwendung im folgenden Text bedeutet 8(1-29) eine verkürzte B-Kette von Humaninsulin aus B1 Phe bis B23Lys, und A(1-21) bedeutet die Α-Kette von Humaninsulin.
Die entsprechend der erfindungsgemäßen Praxis durchgeführte(n) Substitutionen) im Humaninsulinmolekül ist (sind) mit einem auf Humaninseln bezogenen Präfix angegeben.
Beispielsweise bedeutet B27Glu-Humaninsulin ein Humaninsulinanalogon, in dem GIu in Stellung 27 in der B-Kette fürThr eingesetzt ist. B25Glu, B9Asp-Humaninsulin bedeutet ein Humaninsulinanalogon, in dem GIu fürThr in Stellung 27 in der B-Kette eingesetzt ist und Asp für Ger in Stellung 9 in der B-Kette eingesetzt ist. B27GIu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin bedeutet einen Vorläufer für das Insulinanalogon (siehe Formel II), worin GIu in Stellung 27 in der verkürzten B-Kette (siehe oben) für Thr eingesetzt worden ist und worir die B (1-29)-Kette und die Α-Kette (A [1-21 J) durch die Peptidsequenz Ala-Ala-Lys verbunden sind. Sofern nichts anderes angegeben ist, versteht es sich, daß die B(1-19)-Kette und die A(1-21)-Kerfe durch Disulfidbrückon zwischen A(7)Cys und B (7) Cys bzw. zwischen A(20)Cys und B(19) Cys wie im Humaninsulin verbunden sind und daß die Α-Kette die interne Disulfidbrücke zwischen A(6)Cys und A (11)Cys enthält.
Wie bereits festgestellt wurde, besieht das Ziel der Erfindung darin, schnellwirkende injizierbare Insulinlösungen zur Verfugung zu stellen. Um dieses Ziel zu erreichen, gingen die Erfinder zu allererst davon aus, daß beträchtliche Unterschiede zwischen Depot- oder Bolusinsulin und Insulin im Kreislauf einschließlich selbstverständlich eines vollkommen unvermeidlichen Unterschieds in der Insulinkonzentration bestehen. Insulin liegt im Blutstrom in hochverdünmer Form, nämlich 10"" bis 1O-8M, und in Monomerform vor, wobei etwas Insulin evtl. in Dimerform vorliegt. Das viel stärker konzentrierte Insulin, welches im B-Zellenkörnchen des Pankreas gespeichert ist und in der üblichen verabreichungsfähigen Lösung vorkommt, liegt größtenteils, wenn nicht grundsätzlich, in der inaktiven Heximerform, zum Beispiel, als das bekannte 2-Zinkhexamer vor. Humaninsulin in Lösung liegt bekanntlich in vielen molekularen Formen vor, nämlich als Monomer, Dimer, Tetramer und Hexamer (Blundell et al. in: Advances in Protein Chemistry [Fortschritte in der Proteinchemie], Academic Press, New York und London, Bd.26, S. 279-330,1972), wobei die Oligorr.erformen bei hohen Insulinkonzentrationen bevorzugt werden und de Monomerform die wirksame Insulinform ist. Tetramer und Hexamer sind keine Wirkformen, und selbst das Dimer kann inaktiv sein. Die der Erfindung zugrunde liegende Konzeption ist die Meinung des Erfinders, daß die im Fachgebiet erkannten Erscheinungen einer verzögerten Absorption (Binder, Diabetes Care [Diabetesbehandlung) 7, Nr. 2 [1984), 188-199) zum großen Teil der Zeit zuzuschreiben sind, die das Insulin benötigt, um vom Hoxamer, Tetramer und Dimer zur (aktiven) Monomerform zu dissoziieren.
Die erfindungsgemäßen Humaninsulinanaloga erreichen ihre schnelle Wirkung durch eine Molekülstruktur, die Dimer-, Tetramer-, Hexamer- oder Polymerbildung nicht leicht zuläßt, d. h. eine verminderte Tendenz zur Selbstassoziation zu Dimeren, Tetrameren, Hexameren oder Polymeren mit oder ohne Anwesenheit von Zinkionen aufweist.
Aus den erheblichen, im Insulin existierenden Unterschieden in der Aminosäuresequenz von Art zu Art wurde schon lange erkannt, daß nicht alle im Molekül vorhandenen Aminosäurereste für die Insulinwirksamkeit entscheidend sind, und daß einige der für die Insulinwirksamkeit nicht wesentlichen Aminosäuren für die physikalischen Eigenschaften des Insulinmoleküls wichtig sind. Von Meerschweincheninsulin ist bekannt, daß es sich nicht dimerisieren läßt. So können viele der Aminosäurereste im Humaninsulinmolekül ohne wesentliche Verringerung der Insulinwirksamkeit verändert werden. Die hier ins Auge gefaßten Amino&äurßsubstitutionen im Humaninsulinmolekül sind auf die Verhinderung der Bildung von Dimeren, Tetrameren, Hexameren oder Polymeren ohne Zerstörung der Insulinwirksamkeit gerichtet.
Die Aminosäurereste in den Stellungen in der Α-Kette und der B-Kette von Formel I, wo Substitutionen erfolgen können, sind für die Insulinwirksamkeit nicht entscheidend, aber sie sind wichtig für die Fähigkeit von Humaninsuün, Dimere, Tetramere, Hexamere oder Polymere zu bilden, oder für die Löslichkeit des Humaninsulins. Die Aminosäurerestsubstitutionen stören die Atom/Atom-Kontakte zwischen benachbarten Insulinmolekülen, die die Aggregierung zu Dimeren, Tetrameren, Hexameren odor Polymeren erleichtern.
Wie für Substitutionszwecke zu erwarten, sind Veränderungen in bestimmten Stellungen im Humaninsulinmoleb'/i wirksamer als andere. Im großen und ganzen kann eine in der B-Kette vorgenommene Einzelsubstitution ausreichend sein, um die Selbstassoziationstendenz zu verringern, während mindestens zwei Veränderungen anderer Reste erforderlich sein können. Die Substitutionen in der Α-Kette dienen vorwiegend der Verbesserung der Löslichkeit des dissoziierten Moleküls. Bevorzugte Stellungen für die Durchführung von Aminosäurerestsubstitutionen sind B9, B12, B10, B26, B27 und B28 allein oder in Kombination miteinander oder zusammen mit Substitutionen an anderer Stelle im Insulinmolekül, als in Formel I angegeben. Die Substitution eines oder mehrerer negativ geladener Aminosäurereste für einen ungeladenen oder positiv geladenen Aminosäurerest erfolgt eindeutig mit der Absicht, die Ladung des Humaninsulinanalogons bei neutralem pH negativer zu machen und den isoelektrischen Punkt gegenüber Humaninsulin zu senken. Bezeichnenderweise haben die erfindungsgemäßen Humaninsulinanaloga die gleiche oder eine negativere Ladung (bei neutralem pH) und einen niedrigeren isoeiektrischen Punkt als Humaninsulin.
Im großen und ganzen erzielen 1 bis 3 Substitutionen die unmittelbaren Ziele der Erfindung, nämlich, ein schneller wirkendes Insulin zur Verfügung zu stellen, und bilden daher bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Durch Anwendung von 2 bis 3 Substitutionen kann eine verbesserte Mischbarkeit mit geschützten Insulinpräparaten erzielt werden. Es wird jedoch als vorteilhaft angesehen, daß die unmittelbaren Ziele der Erfindung auch durch eine größere Anzahl von Substitutionen als drei erreicht werden können, weil dadurch wünschenswerte Nobenziele erreicht werden können.
Insbesondere kann ein zusätzlicher Substitutionsgrad, etwa die Anwesenheit von 4 oder 5 substituierten Aminosäureresten, ein Humaninsulinanalogon ergeben, das auch weniger anfällig für Fibrillierung oder Grenzflächenpolymerisierung ist, eine Eigenschaft, die insbesondere dann wünschenswert ist, wenn die Insulinlösung für die kontinuierliche Infusion vorgesehen ist. Im großen und ganzen werden nicht mehr als 7 Substitutionen im Insulinmolekül für das erfindungsgemäße Insulinanalogon in Betracht gezogen. Bevorzugt werden 2 bis 4 Substitutionen.
Die Vorläufer der Insulinanaloga codierende Gene können durch Modifikation von die obengenannten Insulinvorläufer codierenden Genen mit Formel (II) (oder III), worin alle X die Aminosäurereste von Humaninsulin sind, durch stellenspezifische Mutationsausiösung zum Einfügen von oder Substituieren mit Codons, die die gewünschte Mutation codieren, hergestellt werden. Eine den Vorläufer des Insulinanalogons codierende DNS-Sequenz kann auch durch enzymatisch^ Synthese aus Oligonuclootiden hergestellt werden, die ganz oder teilweise dem Vorläufergen des Insulinanalogons entsprechen. DNS-Ssquenzen, die ein Gen mit dor gewünschten Mutation des Insulingens enthalten, werden dann mit Fragmenten zusammengenommen, die für den TPI-Promoter (TPIP) (T. Alber und G. Kawasaki. Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cereviae (Nucleotidsequenz des Triose-phosphatisomerasegens von Saccharomyces cerevisiae). J. MoI. Applied Genet. 1 (1982] 419-434), die MFa 1 -Führersequenz (J. Kurjan und I. Herskowitz, Structure of a Yeast Pheromone Gene [MFa 1 ]: A Putative α-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Mature α-Factor [Aufbau eines Hefepheromongens [MFa »]: Ein mutmaßlicher α-Faktor-Vorläufer enthält vier Tandemkopien von reifem α-Faktor], Cell 30 [ 1982] 933-943) und die Transkriptions-Terminations-Sequenz von TPI von S. corevlslae (TPIT) codieren. Diese Fragmente stellen Sequenzen zur Gewährleistung einer hohen Transkriptionsrate für Vorläufer codierendes Gen und auch eine Präsequenz zur Verfugung, die die Vorläuferlokalisierung in der sekretorischen Leitungsbahn und ihre eventuelle Exkretion μ das Nährmedium bewirken kann. Die Expressionseinheiten werden ferner mit dem Hefe-2p-Replikatiensursprung und einem selektierbaren Marker, LEU 2, zur Verfügung gestellt.
Während der in-vivo-Reifung von α-Faktor in Hefe werden die letzten (C-terminalen) sechs Aminosäuren des MFaI-Führerpeptius iLys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala) durch die sequentielle Wirkung einer Endopeptidase, die die Lys-Arg-Sequenz erkennt,
und einer Aminodipeptidase, die die Glu-Ab-Reste entfernt, beseitigt (Julius, D. et al. Cell 32 [1983] 839-852). Zur Überwindung des Bedarfs an Hefe-Aminodipeptidase wu/de die für C-terminales GIu-AIa-GIu-AIa des MFa 1-Führers codierende Sequenz durch in-vitro-Mutationsauslösung von der MFa 1-Führersequenz entfernt, im folgenden Text bedeutet „MFa1-Führer" die ganze Führersequenz, während MFa 1-Führer (minus GIu-AIa-GIu-AIa) eine Führersequenz bedeutet, in der die C-terminale Glu-Ala-Glu-Ala-Sequenz entfernt worden hit.
1859-18G9) synthetisiert.
35-mer II: AACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAACGAA
36-mer IH: TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCt
43-mer IV: GTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCAAACCAAGTACAAAGCTTC
42-mer V: TCTACACTCCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGTC
32-mer Vl: ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTACCAGT
34-mer VII: GAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTC JTTGTACCAAT
37-mer VIII: TTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGC
37-mer IX: TGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCT
36-mer X: CTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAG
33-mer
Aus den oben angeführten 10 Oligonucleotiden wurden, wie in Fig. 1 angegeben, 5 Duplexe A-E gebildet. 20 pMol jedes der Duplexe A-E wurden durch öminütiges Halten bei einer Temperatur von 9O0C und anschließendes Abkühlen auf Raumtemperatur über einen Zeitraum von 75 Minuten aus den entsprechenden Paaren von 5'-phosphorylierten Oligonucleotiden I-X gebildet. Das 33-mer (X) in Duplex E wurde nicht 5'-phosphoryliert, um während der Ligation Dimerisierung um die selbstkomplementären-Xbal-einsträngigen Enden zu vermeiden. Die fünf Duplexe wurden gemischt und mit T4-Ligase behandelt. Das synthetische Gen wurde nach Elektrophorese des Ligationsgemisches auf einem 2%igen Agarosegel als 182/ 183bp Bande isoliert.
Das synthetische Gen wurde an ein 4kb Kpn 1-EcoR 1 -Fragment und ein 8kb Xba 1-Kpn 1-Fragment von pMT644 und ein 0,3kb EcoR 1-Hga1-Fragment von pKFN9 ligiert, um die folgende Struktur, TPIp-MFaI Führer-B (1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-TPIT, zu erhalten.
Plasmid pMT644 enthält die DNS-Sequenz TPI„-MFa 1 Führer-B(1-29)-A(1-21 )-TPIT, und die Konstruktion wird in der DK-PS Nr. 1 293/85 beschrieben. Die Konstruktion von Plasmid pKFN9 wird nachstehend beschrieben. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation eines geeigneten E.coli-Stammes (r~, m+) (MT 172) verwendet. 30 umpicillinresistente Kolonien wurden auf Platten übertragen, die minimale Mengen Medium M 9 enthielten (T. Maniatio et al., Molecular Cloning [Molekulares Cloning], Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, S. 68), und es entstanden 8 Leu* Kolonien. Maxam-Gilbert-Sequenzierung eines 32p-Xba 1-EcoR 1 -Fragments zeigte, daß drei Plasmide ein Gen mit der gewünschten Sequenz enthielten. Ein Plasmid pKFN 27 wurde zur weiteren Verwendung ausgewählt. Die Konstruktion von pKFN 27 wird in Fig. 2 gezeigt. Konstruktion von Plasmid pKFN9 Das Ziel der Konstruktion von Plasmid pKFN 9 bestand darin, ein Plasmid mit einer Hga1-Stelle unmittelbar nach der MFa 1-Führersequenz zu gewinnen. Plasmid pMT544 (dessen Konstruktion in der Dänischen PS Nr. 278/85 beschrieben ist) wurde mit Xba 1 unterbrochen, und etwa 250 Basen wurden von den 3'-Enden durch ExolliNuclease-Behandlung entfernt. Ein synthetischer 32-mer-lnsertionsprimer GGATAAAAGAGAGGCGCGTCTGAAGCTCACTC mit einer Hga 1-Sequenz wurde zu einer teilweise einsträngigen DNS „annealed". Einedoppelsträngigezirkulare DNS wurdedurch Füllen mit Klenow-Polymerase und Ligation mit T4-Ligase hergestellt. Nach Transformation von E. coil (r~, m+) (MT 172) wurden Kolonien mit Gehalt an mutiertem Plasmid durch Koloniehybridisierung mit 5'-32p-markiertem 32-mer Insertionsprimer nachgewiesen. Das Auftreten einer neuen Hga 1 -Stolle wurde mit Restriktions-Enzymunterbrcchung (EcoR 1 + Hga 1, Hind 3 + Hga 1) bestätigt. Nach Retransformation wurde ein .reiner" Mutant pKFN 9 zur weiteren Verwendung selektiert. Die Konstruktion von pKFN 9 wird in Fig. 3 veranschaulicht.
und Acidolyse des gewonnenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure gewonnen. Die Herstellung bestand aus folgenden Schritten:
Piasm'id pKFN 27 wurde in der einzigen Xba 1 -Stelle unmittelbar nach dem synthetischen Insulin-Vorläufergnn linearisiert. Um die Xba 1-Stelle durch den nachstehend beschriebenen Füllschritt nicht zu zerstören, wurde ein 19-mer Hind3-Xba 1 doppelsträngiger Linker
Xba1 Hind3
an jedes Ende des linearisierten Plasmids ligiert. Der Linker wurde am Xba 1 einsträngigen Ende 5'-phosphoryliert, aber am
der DNS, siehe Fig.4, vermieden wurde.
5'-Mononucleotide wurden von den 3'-Enden der gewonnenen linearen doppelsträngigen DNS mittels Exolll-
250 Nucleotide von den 3'-Enden der DNS entfernt wurden (L. Guo und R. Wu (1983], Methods in Enzymology [Methoden in der
„ annealed". Nach Füllen mit Klenow-Polymerase in Anwesenheit von T4-Ligase wurde die doppelsträngige DNS mit Xba 1 digeriert. Dann wurde Heteroduplex-Zirkular-DNS mit der Mutation in einem Strang mit T4-Ligase gebildet.
pKFN37 aus einer der entstehenden Kolonien die gewünschte Mutation aufwies (A.Maxam und W.Gilbert [1980] Methods in
S.cerevislae-Stamm MT663 (E2-7 B X E11-3C a/a, Atpi/Atpi, pep 4-3/pep 4-3) wurde auf YPGaL (1 % Bacto-Hef9extrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Galactose, 1 % Lactat) auf einen OD60ORm von 0,6 gezüchtet.
100ml der Kultur wurden durch Zentrifugieren geerntet, mit 10ml Wasser gewaschen, rezentrifugiert und in 10ml 1,2 M Sorbitol, 25mM Na2EDTApH = - 8,0,6,7mg/ml Dithictreitol resuspendiert. Die Suspension wurde 15 Minuten bei 30°C inkubiert, zentrifugiert, und die Zellen wurden in 10ml 1,2M Sorbitol, 1OmM Na2EDTA, 0,1 M Natriumeitrat pH = 5,8,2mgNovozyme234 resuspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 30°C inkubiert, die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt, in 10ml 1,2M Sorbitol und in 10ml CAS (1.2M Sorbitol, 1OmM CaCI2,1OmM Tris [Tris = Tiis(hydroxymethyl)aminometan) pH = 7,5) gewaschen und in 2 ml CAS resuspendiert. Für die Transformation wurden 0,1 ml CAS-resuspendierte Zellen mit etwa 1 \ig Plasmid pKFN37 gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. 1 ml 20%iges Polyethylenglyr.ol 4000,1OmM CaCI2,10mM Tris pH = 7,5 wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Gemisch wurde zentrifugiert, und das Pellet wurde in 0,1 ml SOS (1,2M Sorbitol, 33% [Vol./Vol.] YPGaL, 6,7mM CaCI2, 14 pg/ml Leucin) resuspendisrt und 2 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Die Suspension wurde dann zentrifugiert, und das Pellet wurde in 0,5 ml 1,2 M Sorbitol resuspendiert. 6ml oberes Agar (SC-Medium von Sherman et al., [Methods in Yeast Ganerics, Cold Spring Karbor Laboratory, 1981 ], wobei Leucin ausgelassen wurde und ein Gehalt von 1,2 M Sorbitol plus 2,5% Agar vorhanden war! wurden bei 520C zugesetzt, und die Suspension wurde oben auf Platten gegossen, die das gleiche agar-verfestigte, sorbitolhaltige Medium enthielten. Nach 3 Tagen bei 3O0C wurden Transformantkolonien ausgewählt, reisoliert und verwendet, um flüssige Kulturen anzusetzen. Ein solcher TransformantKFN40(- MT663/pKFN37) wurde für die weitere Charakterisierung gewählt.
gezüchtet. Eine 10-ml-Kultur des Stamms wurde bei 3O0C bis zu einem ODeoo von 26 geschüttelt. Nach Zentrifugieren wurde die überstehende Flüssigkeit durch Umkehrphasen-HPLC analysiert, und es wurden 13,5mg/l Vorläufer gefunden.
sich Desorption mit einer geeigneten Pufferlösung anschloß. Die Kristallisation wurde mit einem alkoholischen Citratpuffer vorgenommen.
0,2 Mol (41,1 g) Thr-OBu', HOAC wurden in DMF gelöst, um 100 ml Lösung zu erhalten, 50ml 76,5%iges (Vol./Vol.) DMF in Wasser wurden zugesetzt, und 10g rohes B27Glu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin wurden in dem Gemisch gelöst, das bei 120C temperiert war. Dann wurde 1 g Trypsin in 25ml 0,0öM Calciumacetat zugesetzt, und nach 24 Stunden bei 120C wurde das Gemisch in 21 Aceton gegeben, und die ausgefällten Peptide wurden durch Zentrifugieren isoliert und im Vakuum getrocknet. Das B27 GIu, B30Thr-O8u'-Humaninsulin wurde auf einer präparativen HPLC-Säula mit Silica-C18 als Säulenmaterial gereinigt.
Das B27GIU, BSOThr-OBu'-Humaninsulin wurde in 100ml Trifluoressigsäure gelöst. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Lösung lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wurde in 400ml 47,4mM Natriumeitrat bei pH 7 gelöst. Die Peptide wurden bei pH 5,5 nach Zusatz von 2,4 ml 1M ZnCI2 ausgefällt, durch Zentrifugieren isoliert und im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde durch Anionenaustauschchromatografie gereinigt und durch Gelfiltration entsalzt. Ausbeute: 1,7g B27GIu-Humaninsulin.
Dieses Gen wurde auf die gleiche Weise konstruiert, wie es für das B27Glu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin codierende Gen beschrieben wurde, und zwar durch stellenspezifische Mutationsauslösung von pKFN27, gelenkt durch einen 23-mer Mutationsauslösungsprimer d(CTTGTGCGGTGACCACTTGGTTG). Plasmid pKFN38 enthielt nachweislich die gewünschte Mutation.
Plasmid pKFN38 wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 2, II, in S. cerevislae-Stamm MT663 transformiert, und ein Transformant KFN41 wurde isoliert.
Hefestamm KFN41 «vurde, wie in Beispiel 2, III beschrieben, auf YPD-Medium gezüchtet. 2,5mg/l Insulinanalogonvorläufer wurden in der überstehenden Flüssigkeit gefunden.
7,4g rohes B9Asp, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin wurden, wie in Beispiel 2, IV beschrieben, transpeptisiert, um B9Asp, B30Thr-OBu'-Humaninsulin zu gewinnen.
Das B9Asp, B30Thr-OBu'-Humaninsulin wurde, wie in Beispiel 2, V beschrieben, in B9Asp-Humaninsulin umgewandelt. Ausbeute: 0,83g B9Asp-Humaninsulin.
mit Thr-OBu1 und Acidolyse des gewonnenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure hergestellt.
i. Konstruktion eines B9Asp, B27Glu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin codierenden Gens
(1982), Gene 19,259-268) für pUC8 und p'JC 9 beschrieben, konstruiert.
einem Plasmid, das die richtigen Restriktionsenzymmuster zeigte, wurde an ein 7,8kb Xba 1 -Kpn 1 -Fragment und ein 4,3 kb
das Gen für den gewünschten Insulinderivatvorläufer, wie es anhand von DNS-Sequenzierung eines 0,5kb Xba 1-EcoR 1-
Plasmid pKFN38 wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 2, II, in S. cerevislae-Stamm MT663 transformiert, und ein Transformant KFN44 wurde isoliert.
Hefestamm KFN44 wurde, wie in Beispiel 2, III beschrieben, auf YPD-Medium gezüchtet. 7,3mg/l Insulinanalogonvorläufer wurden in der überstehenden Flüssigkeit gefunden.
12,7g rohes BOAsp, 327GIu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin wurden, wie in Beispiel 2, IV beschrieben, transpeptisiert, um B9Asp, B27GIu, B30Thr-OBu'-Humaninsulin zu gewinnen.
Das B9Asp, B 27GIu, B30Thr-OBu'-Humaninsulin wurde in B9Asp, B27Glu, B30Thr-Humaninsulin umgewandelt und, wie in Beispiel 2, V beschrieben, gereinigt. Ausbeute: 1,0gB9Asp, B27Glu-Humaninsulin.
21 )-Humaninsulin mit Thr-OBu1 und Acidolyse des gewonnenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt.
und den B 9Asp, B27 Glu-Humaninsulinvorläufer (Fig. 5) codierende pUC 13-abgeleitete Plasmid wurde mit Hpa I und Xba I unterbrochen. Das große Fragment wurde mit dem mit Ndel linearisierten Plasmid gemischt. Nich Wärme-Denaturierung und
entsprechenden Region. Der 37-mer mutagene Fehlanpassungs-Primer (mismatch primer) dlGAACAATGCTGTCACTCCATCTGCTCCTTGTACCAAi) wurde zu dem Spalt-Duplex hybridisiert, woran sich Füllen mit Klenow-
(MT172) verwendet. Mutanten wurden durch Koloniehybridisierung mit einer 18-mer 5'-wp-markierten Sonde d(AATGCTGTCACTCCATCT) nachgewiesen. Nach Retransformation wurde anhand von DNS-Sequenzierung eines 0,5kb
verwendet.
II. Transformation
Plasmid pKFN 102 wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 2, Il in S. cerevisiae Stamm MT633 transformiert, und ein Transformant KFN109 wurde isoliert.
III. Expression von A 8 His, B 9 Asp, B 27 GIu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)Humanlnsulln
Hefestamm KFN109 wurde auf YPD-Medium, wie in Beispiel 2, III beschrieben, gezüchtet. 21,5mg/l Insulinanalogon-Vorläufer wurden in der überstehenden Flüssigkeit gefunden.
IV.-V. Transpeptislerung und Umwandlung
22,0g rohes A8His, B 9Asp, B27 GIu, B{1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21 )-Humaninsulin wurden transpeptisiort, umgewandelt und, wie in Beispiel 2, IV-V beschrieben, gereinigt. Ausbeute: 4,0g A8HisB9AspB27Glu-Humaninsulin.
Herstellung von S12llo-Mumanlnsulln
B^lle-HumaninsulinwurdedurchTranspeptisierungvon B12lle-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-HumaninsulinmitThr-OBu'und Acidolyse des gewonnenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt.
I. Konstruktion einos B12 Me, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin codierenden Gens Ein 0,5kb EcoR 1-Xba 1-Fragment von pMT598(die Konstruktion von Plasmid pMT598 wird in EP PA Nr. 0163529 A beschrieben), das MFa1-Führer (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) codiert, wurde in mitXbai-EcoRI unterbrochene M13 mp 10 RF-Phage eingesetzt, und die entsprechende einsträngige DNS wurde von der M13 mp 10 Rekombinantphage gereinigt.
Die einsträngige Template-DNS wurde zu einem mutagenen 27-mer Primer NOR-92 d(GTAGAGAGCTTCGATCAGGTGTGAGCC) und einem M13 Universal-Sequenzierungs-Primer d(TCCCAGTCACGACGT) hybridisiert. Die Primer wurden durch dNTPs und Klenow-Polymerase erweitert und durch T4 DNS-Ligase ligiert. Der mutagene Primer KFN92 wurde so gewählt, daß eine BstN 1-Stelle (die einzige im Xba 1-EcoR 1-Fragment) zerstört wurde. Daher wurde das Gemisch zur Selektion in bezug auf nichtmutiertesEcoRI-Xbai-FragmentmitBstNI und anschließend mit EcoR 1 und Xba 1 unterbrochen und an mit EcoR 1 und Xba 1 unterbrochenen pUC 13-Vector ligiert. Aus einem der gewonnenen Transformanten wurde ein Plasmid, pMT760, dem die BstN 1 -Stelle in der Insulincodierungssequenz fehlt, ausgewählt. Die gewünschte mutierte Sequenz wurde mit Hilfe der Maxam-Gilbert-DNS-Sequenzierung nachgewiesen. Plasmid pMT760 enthält eine 0,5kb EcoR 1-Xba 1-Sequenz, die dem gleichen Fragment von pMT598 (siehe oben) entspricht, abgesehen von einer Mutation bei B12 (VaI-IIe). Diese mutierte Sequenz wurde dann auf ein Hefeexpressionsplasmid gebracht, und zwar durch Ligation des 0,5 kb EcoR 1 -Xba 1 -Fragments von pMT760 an ein 7,8kb Xba 1 -Kpn 1 - und ein 4,3kb Kpn 1 -EcoR 1 -Fragment von pMT644, um pMTA zu gewinnen.
Herstellung von B12Tyr-Humanlnsul!n
B12Tyr-Humaninsulin kann durch Transpeptisierung von B12Tyr, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21 )-Humaninsulin mit Thr-OBu1 und Acidolyse des gewonnenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt werden.
I. Konstruktion eines B12Tyr, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humanlnsulin codierenden Gens Das Gen wurde nach einem Verfahren konstruiert, welches dem Verfahren für die Herstellung des B 121Ie, (B1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin codierenden Gens analog ist, mit der einzigen Ausnahme, daß Primer KFN93 d(GTAGAGAGCT l CCTACAGGTGTGAGCC) anstelle von KFN 92 verwendet wurde.
II.—IV. Transformation, Expression, Transpeptisierung, Umwandlung
Die Schritte Il und III wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt. In der überstehenden Flüssigkeit wurden 1,7 mg/l des Insulinanalogen-Vorläufers gefunden. Der rohe Analogonvorläufer kann transpeptisiert, umgewandelt und, wie in Beispiel 2, Vl-V beschrieben, gereinigt werden, um B 12Tyr-Humaninsulin zu gewinnen.
Herstellung von BIOAsp-Humaninsulin
B 10Asp-Humaninsulin wurde durch Transpeptisierung von B 10Asp, B(1-29)-A!a-Ala-Lys-A(1-21 )-Humaninsulin mit Thr OBu* und Acidolyse des gewonnenen Threoninesters mit Trifluoressigsäure, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt.
I. Konstruktion eines B10Asp, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humar.nsulln codierenden Gens Das Gen wurde nach einem Verfahren konstruiert, welches dem Verfahren für die Herstellung des 812He, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin codierenden Gens analog ist, mit dem einzigen Unterschied, daß Primer KFN94 d(AGCTTCCACCAGATCTGAGCCGCACAG) anstelle von KFN 92 verwendet wurde.
IL-V. Transformation, Expression, Transpeptisierung, Umwandlung
Die Schritte Il und III wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt. In der überstehenden Flüssigkeit wurden 36 mg/l Insulinanalogon-Vorläufer gefunden. Der rohe Analogonvorläufer wurde transpeptisiert, umgewandelt und, wie in Beispiel 2, IV-Vbeschrieben,gereinigt. Ausbeute: 7,6g BIOAsp-Humaninsulin.
Herstellung von B28Asp-Humanlnsulin
B 28Asp-Humaninsulin wurde durch Transpeptisierung von B 28Asp, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humaninsulin mit Thr-OMe und Hydrolyse des gewonnenen Threoninesters bei einem pH-Wert von etwa 8 bis 12 hergestellt.
I. Konstruktion eines B 28Asp, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Humanlnsulin codierenden Gens Ein 0,5kb EcoR 1 -Xba 1 -Fi agment von pMT462 (die Konstruktion von Plasmid pMT462 wird in der Dänischen PA Nr. 1257/86 beschrieben), das den MFo.1-Führer (minus GIu-AIa-GIu-AIa)-B-C-A, d.h. das Humanproinsulingen, das dem modifizierten MFo.1 -Führer vorangeht, codiert, wurde in mit Xba 1-EcoR 1 unterbrochene M13 mp 10 RF-Phage eingesetzt, und die einsträngige DNS wurde von der M13 mp 10 Rekombinantphage gereinigt. Die einsträngige Template-DNS wurde zu einem mutagenen 41-mer Primer NOR 205 d(TCCACMTGCCCTTAGCGGCCTTGTCTGTGTAüAAGAAGC) und einem M13 Universal-Sequenzierungs-Primer d(TCCCAGTCACGACGT) hybridisiert. Die Primer wurden durch dNTPs und Klenow-Polymerase erweitert und durch T4-DNS-Ligase ligiert.
Nach Phenol-Extraktion, Ethanolpräzipitation und Resuspension wurde die DNS mit Restriktionsenzymen Apa 1, Xba 1 und EcoR 1 unterbrochen. Nach einer weiteren Phenolextraktion, Ethanolpräzipitation und Rosuspension wurde die DNS an mit EcoR 1-Xba 1 unterbrochene pUC 13 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coil (r~ m+)-Stamm transformiert, und aus einer Anzahl Transformanten wurden Plasmide hergestellt. Die Plasmidpräparate wurden mit EcoR 1 und Xba 1 unterbrochen, und jene Präparate mit Banden bei 0,5 und 0,6kb wurden in E. coil retransformiert. Von der Retransformation wurde ein Transformant, der nur pU 13 mit einem 0,5 Insert beherbergt, selektiert.
Von einem der gewonnenen Transformanten wurde ein Plasmid pMT881 mit der gewünschten Mutation bei B 28 (Pro -» Asp) gewählt. Die mutierte Sequenz wurde durch Maxam-Gilbert-DNS-Sequenzierung nachgewiesen. Die mutierte Sequenz wurde dann durch Ligation eines 0,5kb EcoR 1-Xba 1-Fragments von pMT881 an ein 7,8kb Xba 1-Kpn 1 Fragment und ein 4,3kb Kpn 1-EcoR 1 -Fragment von pMT644 auf ein Hefeexpressionsplasmid pebracht, um pMTA 1 zu erhalten.
Plasmid pMTA 1 wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 2, Ii in S. cerevisiae-Stamm MT663 transformiert, und ein Transformant MTA1 wurde isoliert.
Hefestamm MTA1 wurde, wie in Beispiel 2, III beschrieben, auf YPD-Medium gezüchtet. 7,2mg/l Insulinanalogon-Vorläufer wurden in der überstehenden Flüssigkeit gefunden.
Das rohe B28Asp, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) wurde, wie in Beispiel 2, IV beschrieben, durch Substituieren von Thr-OBu' mit Thre-OMe transpeptisiert, um B28Asp, B30Thr-OMe-Humaninsulin zu gewinnen.
Das B 28 Asp, B30Thr-OMe-Humaninsulin wurde in Wasser auf 1 % (Masse/Vol.) dispergiort und durch Zusatz von 1 η Nat:iumhydroxid gelöst, so daß sich ein pH-Wert von 10,0 ergab. Der pH-Wert wurde 24 Stunden bei 25°C konstant bei 10,0 gehalten. Das gebildete B28Asp-Humaninsulin wurde durch Zusatz von Natriumchlorid bis etwa 8% (Masse/Vol.), Natriumacetattrihydrat bis etwa 1,4% (Masse/Vol.) und Zinkacetatdihydrat bis etwa 0,01 % (Masse/Vol.) und anschließenden Zusatz von 1 η Salzsäure bis pH 5,5 ausgefällt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren isoliert und durch Anionenaustauschchromatografie gereinigt und durch Gelfiltration entsalzt. Ausbeute: 0,2g B28Asp-Humaninsulin.
Typ: 1,00
Typ:R52
Temperatur: 210C Resultate: Alle Insulinarten wurden mit einer Konzentration von 4 mg/ml gemessen.
kDalton
Aus der vorstehenden Tabelle 1 geht hervor, daß die Humaninsulinanaloga im Vergleich zu Humaninsulin sin merklich reduziertes Molekulargewicht aufweisen, was bedeutet, daß die Selbstassoziation zu Dimeren, Tetremeren und Hexameren weniger ausgeprägt ist und in einigen Fällen sogar fehlt.
Humaninsulinanalogon | T,/2 | Biologische Wirksamkeit |
(% Humaninsulin! | % Humaninsulin | |
95% Übertragungsinter | ||
* | (conf. interval) | |
B27Glu-Humaninsulin | 78 | 101(83-123) |
B9Asp,B27Glu-Humaninsuiin | 54 | 110(90-139) |
B12lle-Humaninsulin | 78 | 91(80-103) |
B27Glu,A21Asp-Humaninsulin | 56 | 64(58-71) |
BSAsp-Humaninsuiin | 52 | 80(72-90) |
A21A.$p,B9Asp,B27Glu-Humaninsulin | 56 | 75(66-85) |
A8His, B9Asp, B27Glu-Humaninsulin | 68 | 116(101-135) |
B 10Asp-Humaninsulin | 64 | 104(92-118) |
B 28 Asp-Humaninsulin | 104(95-114) |
' Zeit biv zum 50%igen Verscnwinden von der Injektionsstelle (subkutan) bei Schweinen. Methode nach Binder
1969 (Acta Pharmacol. Toxicol [Anlage 2) 27:1-87) ** Mäusebi'utglucosebestimrnung nach der Europäischen Pharmakopöe.
Aus Tabelle 2 geht hervor, daß die Zeit bis zum 50%igen Verschwinden der Insulinanaloga von der Injektionsstelle im Vergleich mit Humaninsulin erheblich reduziert ist.
Die biologische Wirksamkeit der Insulinanaloga ist mit der von Humaninsulin vergleichbar oder nur geringfügig verringert.
Claims (10)
- Patentansprüche:B-Kette Iworin die X die Aminosäurereste von Humaninsulin oder die gleichen oder unterschiedliche Aminosäurerestsubstitutionen sind, deren reine Funktion darin besteht, dem Molekül bei neutralem pH die gleiche Ladung oder eine größere negative Ladung als Humaninsulin zu verleihen, unter der Voraussetzung, daß sich mindestens ein X von den Aminosäureresten von Humaninsulin in der betreffenden Stellung im Insulinmolekül unterscheidet und daß, wenn X in Stellung A(S) His oder Phe ist, X in Stellung A(21) Asp ist, X in Stellung B (5) AIa ist, X in Stellung B (9) Leu ist, X in Stellung B (10) Asn oder Leu ist, X in Stellung B (12) Asn ist oder X in Stellung B (26) AIa ist, sich dann mindestens eines der verbleibenden X von den Aminosäureresten von Humaninsulin in der betreffenden Stellung im Insulinmolekül unterscheidet, und unter der weiteren Voraussetzung, daß ein oder mehrere Aminosäurerest(e) von den N- und/oder C-terminalen Enden der A- und/oder B-Kette entfernt worden sein können, dadurch gekennzeichnet, daßa) ein Hefestamm mit einem replizierbaren Expressionsträger, der eine einen Vorläufer des Insulinanalogens codierende DNS-Sequenz umfaßt, in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet wird, und der Vorläufer aus dem Kulturmedium gewonnen und durch enzymatische und chemische in-vitro-Umwandlung in das neuartige Insulinanalogen umgewandelt wird, oderb) ein biosynthetischer Vorläufer der allgemeinen Formel II,
A-Kette1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 I1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617 18 19B-Kette20 21 22 23 24 25 26 27 28 29worin Qn eine Pepticlkette mit η natürlich vorkommenden Aminosäureresten ist, R Lys oder Arg ist,η eine ganze Zahl von 0 bis 33 ist, m 0 oder 1 ist, und die X der obigen Definition entsprechen, unterder Voraussetzung, daß die Peptidkette-Qn-R-nicht zwei benachbarte basische Aminosäurereste enthält, mit einem L-Threoninester in Anwesenheit von Trypsin oder eines Trypsinderivatesumgesetzt wird, woran sich die Umwandlung des gewonnenen Threoninesters desHumaninsulinanalogons in das Humaninsulinanalogon nach bekannten Verfahren anschließt,oderc) ein biosynthetischer Vorläufer der allgemeinen Formel IIIA-Kette12 3 4 5 6J 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2(8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19B-KetteIII20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30worin V und T jeweils Lys oder Arg sind und die X der obigen Definition entsprechen, mit Trypsin und Carboxypeptidase B in wäßriger Lösung umgesetzt wird und das Humaninsulinanalogon aus dem Reaktionsgemisch gewonnen wird, oderd) die Insulinanaloga, die die entsprechenden Aminosäuresubstitutionen enthalten, chemisch nach bekannten Verfahren synthetisiert werden, oder die A- und B-Ketten, die die entsprechende Aminosäuresubstitution enthalten, chemisch nach bekannten Verfahren synthetisiert werden, und die modifizierten A- und B-Ketten durch Herstellen von Disulfidbrücken zwischen A(7)Cys und B(7)Cys und zwischen A(20)Cys und B(19)Cys und der internen A-Ketten-Brücke zwischen A(6)Cys und A(11)Cys verknüpft werder - 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäurerestsubstitutionen hydrophiler sind als der Aminosäurerest von Humaninsulin in der betreffenden Stellung im Insulinmolekül.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich nicht mehr als etwa 7 der X von dem Aminosäurerest in der entsprechenden Stellung im Humaninsulin unterscheiden.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresubstitutionen aus der aus Asp, GIu, Ser, Thr, His und He bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäurerestsubstitutionen Asp und/oder GIu sind.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich mindestens ein X in Stellung B (9), B(10), B(12), B (26) oder B(27) oder B(28) von dem Aminosäurerest an der entsprechenden Stelle im Hurnaninsulinmolekül unterscheidet.
- 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich mindestens ein X in Stellung B (9), B (12) oder B (27) oder B (28) von dem Aminosäurerest an der entsprechenden Stelle im Hurnaninsulinmolekül unterscheidet.
- 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung B \2 Ne oder Tyr ist, X in Stellung A21 Asp ist und in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung B9 Asp ist, X in Stellung A21 und in Stellung B9 Asp ist und in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung A8 His ist, in Stellung B9 Asp ist und in Stellung B27 GIu ist, X in Stellung B10 Asp ist, oderX in Stellung B9 Asp ist und in Stellung B27 GIu ist oder X in Stellung B28 Asp ist.
- 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ihnen bis zu vier Aminosäurereste am N-terminalen Ende der B-Kette und/oder bis zu fünf Aminosäurereste am C-terminalen Ende der B-Kette fehlen.
- 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß ihnen der B (D-Aminosäurerest und/ oder der B (30)-Aminosäurerest fehlt.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK395685A DK395685D0 (da) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | Peptider |
DK467785A DK467785D0 (da) | 1985-10-14 | 1985-10-14 | Peptider |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DD268976A5 true DD268976A5 (de) | 1989-06-14 |
Family
ID=26067291
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DD29398186A DD268976A5 (de) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | Verfahren zur Herstellung von Humaninsulinanaloga |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5618913A (de) |
EP (1) | EP0214826B1 (de) |
JP (1) | JP2662390B2 (de) |
KR (1) | KR940000756B1 (de) |
CN (1) | CN1029977C (de) |
AR (1) | AR241801A1 (de) |
AT (1) | ATE113061T1 (de) |
AU (1) | AU593274B2 (de) |
CA (1) | CA1306212C (de) |
CS (1) | CS275613B6 (de) |
DD (1) | DD268976A5 (de) |
DE (2) | DE3650101T2 (de) |
ES (1) | ES2001624A6 (de) |
FI (1) | FI102182B (de) |
GR (1) | GR862233B (de) |
HU (1) | HU206518B (de) |
IE (1) | IE66138B1 (de) |
IL (1) | IL79887A (de) |
LU (1) | LU90484I2 (de) |
NL (1) | NL990042I2 (de) |
NO (2) | NO177009C (de) |
NZ (1) | NZ217406A (de) |
PH (1) | PH25772A (de) |
PT (1) | PT83278B (de) |
YU (2) | YU46023B (de) |
Families Citing this family (219)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK437786D0 (da) * | 1986-09-12 | 1986-09-12 | Nordisk Gentofte | Insulinprecursorer |
IE62879B1 (en) * | 1987-02-25 | 1995-03-08 | Novo Nordisk As | Novel insulin derivatives |
US4992418A (en) * | 1987-07-17 | 1991-02-12 | Mount Sinai School Of Medicine | Superactive human insulin analogue-[10-Aspartic Acid-B]Human Insulin |
US4992417A (en) * | 1987-07-17 | 1991-02-12 | Mount Sinai School Of Medicine | Superactive human insulin analogues |
CA1340772C (en) * | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
EP0425482B1 (de) * | 1988-07-20 | 1993-08-18 | Novo Nordisk A/S | Menschliche insulinanalage und zubereitungen daraus |
DE3837825A1 (de) * | 1988-11-08 | 1990-05-10 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
KR910700262A (ko) * | 1988-12-23 | 1991-03-14 | 안네 제케르 | 사람 인슐린 유사체 |
US5716927A (en) * | 1988-12-23 | 1998-02-10 | Novo Nordisk A/S | Insulin analogs having a modified B-chain |
US5514646A (en) * | 1989-02-09 | 1996-05-07 | Chance; Ronald E. | Insulin analogs modified at position 29 of the B chain |
JPH04504858A (ja) * | 1989-04-20 | 1992-08-27 | マウント シナイ スクール オブ メディスン オブ ザ シティー ユニバーシティー オブ ニューヨーク | 肝臓特異性インシュリン類似体 |
US5208217A (en) * | 1989-04-20 | 1993-05-04 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Hepatospecific insulin analogues |
DK155690D0 (da) * | 1990-06-28 | 1990-06-28 | Novo Nordisk As | Nye peptider |
DK158390D0 (da) * | 1990-07-02 | 1990-07-02 | Novo Nordisk As | Nye peptider |
DK10191D0 (da) * | 1991-01-22 | 1991-01-22 | Novo Nordisk As | Hidtil ukendte peptider |
DK33591D0 (de) * | 1991-02-27 | 1991-02-27 | Novo Nordisk As | |
CA2071382A1 (en) * | 1991-06-21 | 1992-12-22 | David N. Brems | Insulin analogs |
AU680462B2 (en) * | 1992-12-18 | 1997-07-31 | Eli Lilly And Company | Insulin analogs |
DK72793D0 (da) * | 1993-06-21 | 1993-06-21 | Novo Nordisk As | Nyt produkt |
WO1995000550A1 (en) * | 1993-06-21 | 1995-01-05 | Novo Nordisk A/S | Aspb28 insulin crystals |
US5461031A (en) * | 1994-06-16 | 1995-10-24 | Eli Lilly And Company | Monomeric insulin analog formulations |
US5504188A (en) * | 1994-06-16 | 1996-04-02 | Eli Lilly And Company | Preparation of stable zinc insulin analog crystals |
US5474978A (en) * | 1994-06-16 | 1995-12-12 | Eli Lilly And Company | Insulin analog formulations |
US5547929A (en) | 1994-09-12 | 1996-08-20 | Eli Lilly And Company | Insulin analog formulations |
WO1996010417A1 (en) * | 1994-10-04 | 1996-04-11 | Novo Nordisk A/S | PREPARATIONS CONTAINING AspB28 HUMAN INSULIN AND NICOTINAMIDE |
US5597893A (en) * | 1994-10-31 | 1997-01-28 | Eli Lilly And Company | Preparation of stable insulin analog crystals |
US5693609A (en) * | 1994-11-17 | 1997-12-02 | Eli Lilly And Company | Acylated insulin analogs |
US5646242A (en) * | 1994-11-17 | 1997-07-08 | Eli Lilly And Company | Selective acylation of epsilon-amino groups |
YU18596A (sh) * | 1995-03-31 | 1998-07-10 | Eli Lilly And Company | Analogne formulacije monomernog insulina |
US5631347A (en) * | 1995-06-07 | 1997-05-20 | Eli Lilly And Company | Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein |
US5700904A (en) * | 1995-06-07 | 1997-12-23 | Eli Lilly And Company | Preparation of an acylated protein powder |
ATE208208T1 (de) * | 1996-06-20 | 2001-11-15 | Novo Nordisk As | Halogenid-enthaltende insulinzubereitungen |
CO4750643A1 (es) | 1997-06-13 | 1999-03-31 | Lilly Co Eli | Formulacion estable de la insulina que contiene l-arginina y protamina |
DE19726167B4 (de) * | 1997-06-20 | 2008-01-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung |
KR20010024556A (ko) | 1997-10-24 | 2001-03-26 | 피터 지. 스트링거 | 불용성 인슐린 조성물 |
CO4970787A1 (es) * | 1997-12-23 | 2000-11-07 | Lilly Co Eli | Composiciones insolubles de insulina y derivados de insulina que controlan la glucosa sanguinea |
IL137904A0 (en) * | 1998-02-23 | 2001-10-31 | Neurocrine Biosciences Inc | Peptide analogues of insulin and pharmaceutical compositions containing the same |
DE19825447A1 (de) * | 1998-06-06 | 1999-12-09 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung |
US6933272B1 (en) | 1998-09-22 | 2005-08-23 | Erik Helmerhorst | Use of non-peptidyl compounds for the treatment of insulin related ailments |
AUPP609198A0 (en) * | 1998-09-22 | 1998-10-15 | Curtin University Of Technology | Use of non-peptidyl compounds for the treatment of insulin related ailments |
AU762047B2 (en) | 1999-01-06 | 2003-06-19 | Genentech Inc. | Insulin-like growth factor (IGF) I mutant variants |
IL143866A0 (en) | 1999-01-06 | 2002-04-21 | Genentech Inc | Insulin-like growth factor (igf) i mutant variants |
US6746853B1 (en) * | 1999-05-19 | 2004-06-08 | Xencor, Inc. | Proteins with insulin-like activity useful in the treatment of diabetes |
CN1125081C (zh) * | 1999-09-08 | 2003-10-22 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 重组天然和新型人胰岛素及其制备方法 |
US7022674B2 (en) * | 1999-12-16 | 2006-04-04 | Eli Lilly And Company | Polypeptide compositions with improved stability |
ATE328605T1 (de) | 2000-03-24 | 2006-06-15 | Genentech Inc | Verwendung von insulin zur behandlung von knorpelkrankheiten |
AU2001254621A1 (en) * | 2000-05-05 | 2001-11-20 | K.U. Leuven R And D | Critical illness neuropathy |
DK1282437T3 (da) | 2000-05-16 | 2008-06-30 | Genentech Inc | Behandling af brusklidelser |
AR025646A1 (es) * | 2000-09-13 | 2002-12-04 | Beta Lab Sa | Cepa de levaduras metilotroficas recombinantes productoras de un precursor de insulina, construcciones de adn y metodo para obtener la cepa. |
US7202059B2 (en) | 2001-02-20 | 2007-04-10 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium |
US7638618B2 (en) | 2001-02-20 | 2009-12-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest |
DE10114178A1 (de) | 2001-03-23 | 2002-10-10 | Aventis Pharma Gmbh | Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
JP4563675B2 (ja) | 2001-10-12 | 2010-10-13 | ハイ・ポイント・ファーマスーティカルズ、エルエルシー | 置換ピペリジン類、およびヒスタミンh3受容体関連疾患の治療のためのその使用 |
WO2003044210A2 (en) | 2001-11-19 | 2003-05-30 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing insulin compounds |
GB0206792D0 (en) | 2002-03-22 | 2002-05-01 | Leuven K U Res & Dev | Normoglycemia |
DE10227232A1 (de) | 2002-06-18 | 2004-01-15 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität |
US7193035B2 (en) | 2002-10-29 | 2007-03-20 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Crystals of insulin analogs and processes for their preparation |
US7871607B2 (en) * | 2003-03-05 | 2011-01-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases |
ATE482747T1 (de) | 2003-04-11 | 2010-10-15 | High Point Pharmaceuticals Llc | Neue amide derivate und deren pharmazeutische verwendungen |
DE602004032237D1 (de) | 2003-06-27 | 2011-05-26 | Novo Nordisk As | Behälter für medizinische flüssigkeiten mit hoher wasserdampfsperre |
US20060183667A1 (en) * | 2003-07-11 | 2006-08-17 | Novo Nordisk A/S | Stabilised insulin compositions |
EP1644411A2 (de) * | 2003-07-11 | 2006-04-12 | Novo Nordisk A/S | Stabilisierte insulinzusammensetzungen |
WO2005012346A1 (en) * | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Conjuchem, Inc. | Long lasting insulin derivatives and methods thereof |
PL2275439T3 (pl) | 2003-08-05 | 2014-09-30 | Novo Nordisk As | Nowe pochodne insuliny |
EP2107069B1 (de) | 2003-08-05 | 2013-01-16 | Novo Nordisk A/S | Neuartige Insulinderivate |
JP4800959B2 (ja) * | 2003-11-13 | 2011-10-26 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 糖尿病及び過食症を治療するためのglp−1ペプチド及び短時間作用型インスリンペプチドを含む、非経口投与用の可溶性医薬組成物 |
US20060287221A1 (en) * | 2003-11-13 | 2006-12-21 | Novo Nordisk A/S | Soluble pharmaceutical compositions for parenteral administration comprising a GLP-1 peptide and an insulin peptide of short time action for treatment of diabetes and bulimia |
RU2421238C2 (ru) | 2003-11-20 | 2011-06-20 | Ново Нордиск А/С | Пептидная композиция, содержащая пропиленгликоль, являющаяся оптимальной для изготовления и применения в инъекционных устройствах |
EP1692168B1 (de) | 2003-12-03 | 2011-07-20 | Novo Nordisk A/S | Einzelketteninsulin |
JP2007515235A (ja) | 2003-12-22 | 2007-06-14 | ノボ・ノルデイスク・エー/エス | 医薬液を保存するための、透明で、可撓性且つ不浸透性のプラスチック製容器 |
CN1909930B (zh) | 2004-01-21 | 2015-12-16 | 诺和诺德医疗保健公司 | 转谷氨酰胺酶介导的肽的接合 |
US7875700B2 (en) | 2004-07-19 | 2011-01-25 | Biocon Limited | Cation complexes of insulin compound conjugates, formulation and uses thereof |
CN101115900B (zh) | 2004-11-04 | 2012-03-07 | 亨特道格拉斯有限公司 | 用于建筑开口的单轨道层叠板体遮蔽件 |
US7833513B2 (en) | 2004-12-03 | 2010-11-16 | Rhode Island Hospital | Treatment of Alzheimer's Disease |
ES2490243T3 (es) | 2005-02-02 | 2014-09-03 | Novo Nordisk A/S | Derivados de insulina |
EP1846446B1 (de) | 2005-02-02 | 2013-06-26 | Novo Nordisk A/S | Insulinderivate |
EP2233470B1 (de) | 2005-07-04 | 2011-12-07 | High Point Pharmaceuticals, LLC | Histamine H3 Receptor Antagonisten |
EP1910317B1 (de) | 2005-07-20 | 2013-07-03 | Eli Lilly And Company | 1-amino-verbundene verbindungen |
WO2007020256A1 (en) | 2005-08-16 | 2007-02-22 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
BRPI0616054B8 (pt) | 2005-09-14 | 2021-05-25 | Sanofi Aventis Deutschland | processo para a preparação de insulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina, tripsina porcina, método para sua produção, dna e vetor |
WO2007123581A1 (en) | 2005-11-17 | 2007-11-01 | Eli Lilly And Company | Glucagon receptor antagonists, preparation and therapeutic uses |
EP1969004B1 (de) | 2005-12-28 | 2011-08-10 | Novo Nordisk A/S | Ein acyliertes insulin und zink enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur herstellung dieser zusammensetzungen |
US8343914B2 (en) * | 2006-01-06 | 2013-01-01 | Case Western Reserve University | Fibrillation resistant proteins |
WO2007096332A1 (en) * | 2006-02-21 | 2007-08-30 | Novo Nordisk A/S | Single-chain insulin analogues and pharmaceutical formulations thereof |
EP2256129B1 (de) | 2006-02-27 | 2012-05-09 | Novo Nordisk A/S | Insulin Derivate |
EP1996224B1 (de) | 2006-03-15 | 2012-11-07 | Novo Nordisk A/S | Mischungen aus amylin und insulin |
EP1999120B1 (de) | 2006-03-28 | 2012-06-27 | High Point Pharmaceuticals, LLC | Benzothiazole mit wirkung am histamin-h3-rezeptor |
ATE543798T1 (de) | 2006-04-24 | 2012-02-15 | Lilly Co Eli | Cyclohexyl-substituierte pyrrolidinone als hemmer von 11-beta-hydroxysteroiddehydrogenase 1 |
BRPI0712041A2 (pt) | 2006-05-09 | 2011-12-27 | Novo Nordisk As | derivado de insulina |
EP2024390B1 (de) | 2006-05-09 | 2015-08-19 | Novo Nordisk A/S | Insulinderivate |
ES2375872T3 (es) | 2006-05-29 | 2012-03-07 | High Point Pharmaceuticals, Llc | 3-(1,3-benzodioxol-5-il)-6-(4-ciclopropilpiperacin-1-il)-piridacina, sus sales y solvatos, y su uso como antagonista del receptor h3 de la histamina. |
EP2021368A4 (de) * | 2006-06-08 | 2010-01-20 | Diabecore Medical Inc | Derivatisierte insulinoligomere |
DE102006031955A1 (de) * | 2006-07-11 | 2008-01-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Insulinanaloga mit dibasischem B-Kettenende |
DE102006031962A1 (de) | 2006-07-11 | 2008-01-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Amidiertes Insulin Glargin |
JP5550338B2 (ja) | 2006-07-31 | 2014-07-16 | ノボ・ノルデイスク・エー/エス | ペグ化持続型インスリン |
ES2601839T3 (es) | 2006-09-22 | 2017-02-16 | Novo Nordisk A/S | Análogos de insulina resistentes a proteasas |
EP2074140B8 (de) | 2006-10-04 | 2015-10-28 | Case Western Reserve University | Fibrillationsresistentes insulin und insulinanaloga |
WO2008049711A1 (en) * | 2006-10-27 | 2008-05-02 | Novo Nordisk A/S | Peptide extended insulins |
US20120214963A1 (en) * | 2011-02-23 | 2012-08-23 | Elona Biotechnologies | Aspart proinsulin compositions and methods of producing aspart insulin analogs therefrom |
US10100098B2 (en) | 2006-12-13 | 2018-10-16 | Stelis Biopharma Private Limited | Insulin production methods and proinsulin constructs |
ES2563038T3 (es) | 2007-04-30 | 2016-03-10 | Novo Nordisk A/S | Método para secar una composición proteica, una composición proteica seca y una composición farmacéutica que comprende la proteína seca |
WO2008139496A1 (en) * | 2007-05-16 | 2008-11-20 | Bigtec Private Limited | Recombinant human insulin and a method thereof |
EP2514407A1 (de) | 2007-06-01 | 2012-10-24 | Novo Nordisk A/S | Stabile nichtwässrige pharmazeutische Zusammensetzungen |
EP2514406A1 (de) | 2007-06-01 | 2012-10-24 | Novo Nordisk A/S | Spontan dispergierbare Vorkonzentrate mit einem Peptidwirkstoff in einem festen oder halbfesten Träger |
ES2744384T3 (es) | 2007-06-13 | 2020-02-24 | Novo Nordisk As | Formulación farmacéutica que comprende un derivado de insulina |
ES2558930T3 (es) | 2007-08-13 | 2016-02-09 | Novo Nordisk A/S | Análogos de la insulina de acción rápida |
EP2178911A2 (de) * | 2007-08-13 | 2010-04-28 | Novo Nordisk A/S | Schnell wirkende insulin-analoge |
WO2009022013A1 (en) | 2007-08-15 | 2009-02-19 | Novo Nordisk A/S | Insulin analogues with an acyl and aklylene glycol moiety |
WO2009022006A1 (en) | 2007-08-15 | 2009-02-19 | Novo Nordisk A/S | Insulins with an acyl moiety comprising repeating units of alkylene glycol containing amino acids |
DK2217265T3 (en) | 2007-11-20 | 2017-07-03 | Ambrx Inc | Modified insulin polypeptides and their use |
PL2229407T3 (pl) | 2008-01-09 | 2017-06-30 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nowe pochodne insuliny o ekstremalnie spowolnionym profilu czasu działania |
HUE032287T2 (en) | 2008-03-18 | 2017-09-28 | Novo Nordisk As | Protease-stabilized, acylated insulin analogues |
EP2262539B1 (de) | 2008-04-01 | 2015-07-15 | Novo Nordisk A/S | Insulin-albumin-konzentrate |
WO2009129250A2 (en) * | 2008-04-14 | 2009-10-22 | Case Western Reserve University | Meal-time insulin analogues of enhanced stability |
AU2009240636A1 (en) * | 2008-04-22 | 2009-10-29 | Case Western Reserve University | Isoform-specific insulin analogues |
TWI394580B (zh) | 2008-04-28 | 2013-05-01 | Halozyme Inc | 超快起作用胰島素組成物 |
TWI451876B (zh) | 2008-06-13 | 2014-09-11 | Lilly Co Eli | 聚乙二醇化之離脯胰島素化合物 |
US9200053B2 (en) | 2008-07-31 | 2015-12-01 | Case Western Reserve University | Insulin analogues containing penta-fluoro-Phenylalanine at position B24 |
KR20120129875A (ko) | 2008-07-31 | 2012-11-28 | 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티 | 염소화 아미노산을 갖는 인슐린 유사체 |
US9090705B2 (en) | 2008-08-07 | 2015-07-28 | Biocon Limited | Process for preparation of insulin compounds |
DE102009038210A1 (de) | 2009-08-20 | 2011-03-03 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten |
DE102008053048A1 (de) | 2008-10-24 | 2010-04-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten |
PT3228320T (pt) | 2008-10-17 | 2020-03-26 | Sanofi Aventis Deutschland | Combinação de uma insulina e de um agonista do glp-1 |
DE102008051834A1 (de) | 2008-10-17 | 2010-04-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten |
RU2540922C2 (ru) | 2008-10-30 | 2015-02-10 | Ново Нордиск А/С | Лечение сахарного диабета с использованием инъекций инсулина с частотой менее одного раза в день |
JP2012509879A (ja) | 2008-11-21 | 2012-04-26 | ハイ ポイント ファーマシューティカルズ,リミティド ライアビリティ カンパニー | アダマンチルベンズアミド化合物 |
US9018190B2 (en) | 2009-03-27 | 2015-04-28 | Adocia | Functionalized oligosaccharides |
FR2943538B1 (fr) | 2009-03-27 | 2011-05-20 | Adocia | Formulation a action rapide d'insuline recombinante humaine |
JP2012532177A (ja) | 2009-07-06 | 2012-12-13 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 熱及び振動安定性インスリン製剤 |
US20120232002A1 (en) | 2009-07-06 | 2012-09-13 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Slow-acting insulin preparations |
DK2451437T3 (en) | 2009-07-06 | 2017-02-13 | Sanofi Aventis Deutschland | Aqueous INSULIN PREPARATIONS CONTAINING METHIONIN |
UA108475C2 (uk) | 2009-07-31 | 2015-05-12 | Санофі-Авентіс Дойчланд Гмбх | Композиція інсуліну тривалої дії |
MX2012001399A (es) | 2009-07-31 | 2012-03-21 | Sanofi Aventis Deutschland | Profarmacos que comprenden un conjugado de insulina-conector. |
US8399407B2 (en) * | 2009-09-17 | 2013-03-19 | Case Western Reserve University | Non-standard insulin analogues |
JP5973918B2 (ja) | 2009-11-13 | 2016-08-23 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | Glp−1アゴニスト及びメチオニンを含む薬学的組成物 |
TR201809460T4 (tr) | 2009-11-13 | 2018-07-23 | Sanofi Aventis Deutschland | Bir GLP- 1-agonisti, bir insülin ve metiyonin içeren farmasötik bileşim. |
US8637096B2 (en) | 2009-12-04 | 2014-01-28 | Curtis C. Stojan | Compositions and method for enhancing insulin activity |
CN102762589A (zh) | 2009-12-11 | 2012-10-31 | 卡斯西部储备大学 | 带有氯化氨基酸的胰岛素类似物 |
EP2359843A1 (de) | 2010-01-21 | 2011-08-24 | Sanofi | Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines metabolischen Syndroms |
UY33326A (es) | 2010-04-14 | 2011-12-01 | Sanofi Aventis | Conjugados de insulina-sirna |
MX2012012943A (es) * | 2010-05-10 | 2012-11-29 | Novo Nordisk As | Proceso para preparacion de complejos de insulina-cinc. |
US8940860B2 (en) | 2010-06-16 | 2015-01-27 | Indiana University Research And Technology Corporation | Single-chain insulin agonists exhibiting high activity at the insulin receptor |
EP2585485A1 (de) | 2010-06-23 | 2013-05-01 | Novo Nordisk A/S | Insulinderivate, die zusätzliche disulfidbindungen enthalten |
DK2605789T3 (da) | 2010-08-17 | 2019-09-16 | Ambrx Inc | Modificerede relaxinpolypeptider og anvendelser deraf |
JP6199186B2 (ja) | 2010-08-30 | 2017-09-20 | サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 2型糖尿病の治療用の医薬の製造のためのave0010の使用 |
EP2438930A1 (de) | 2010-09-17 | 2012-04-11 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Prodrug mit einem exendinbindenden Konjugat |
SI2632478T1 (sl) | 2010-10-27 | 2019-11-29 | Novo Nordisk As | Zdravljenje sladkorne bolezni z uporabo inzulinskih injekcij, ki se dajejo v različnih injicirnih intervalih |
JP6049625B2 (ja) | 2010-10-27 | 2016-12-21 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 様々な注射間隔を用いて施されるインスリン注射を使用する、真性糖尿病の治療 |
WO2012080320A1 (en) | 2010-12-14 | 2012-06-21 | Novo Nordisk A/S | Fast-acting insulin in combination with long-acting insulin |
MX342922B (es) * | 2011-02-01 | 2016-10-19 | Novo Nordisk As | Purificacion de insulina. |
EP2670368A4 (de) | 2011-02-03 | 2015-04-15 | Pharmedica Ltd | Neue im mund zersetzbare filme zur insulinverabreichung zwecks behandlung von diabetes |
WO2012115637A1 (en) | 2011-02-23 | 2012-08-30 | Elona Biotechnologies | Aspart proinsulin compositions and methods of producing aspart insulin analogs |
WO2012115638A1 (en) | 2011-02-23 | 2012-08-30 | Elona Biotechnologies | Glargine proinsulin compositions and methods of producing glargine insulin analogs therefrom |
JP2014509603A (ja) | 2011-03-15 | 2014-04-21 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | システイン置換を含むヒトインスリン類似体およびヒトインスリン誘導体 |
US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
US9993529B2 (en) | 2011-06-17 | 2018-06-12 | Halozyme, Inc. | Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme |
EP2548570A1 (de) | 2011-07-19 | 2013-01-23 | Sanofi | Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines metabolischen Syndroms |
AR087693A1 (es) | 2011-08-29 | 2014-04-09 | Sanofi Aventis Deutschland | Combinacion farmaceutica para uso en el control glucemico en pacientes con diabetes de tipo 2 |
TWI559929B (en) | 2011-09-01 | 2016-12-01 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease |
US20130231281A1 (en) | 2011-11-02 | 2013-09-05 | Adocia | Rapid acting insulin formulation comprising an oligosaccharide |
IN2014MN00933A (de) * | 2011-12-15 | 2015-05-01 | Shanghai Hengrui Pharm Co Ltd | |
CN104114183A (zh) | 2011-12-20 | 2014-10-22 | 印第安纳大学研究及科技有限公司 | 用于治疗糖尿病的基于ctp的胰岛素类似物 |
CN104364260B (zh) | 2012-04-11 | 2017-02-22 | 诺和诺德股份有限公司 | 胰岛素制剂 |
JP6262206B2 (ja) | 2012-05-01 | 2018-01-17 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 医薬組成物 |
WO2013173923A1 (en) | 2012-05-25 | 2013-11-28 | Diamedica, Inc. | Formulations of human tissue kallikrein-1 for parenteral delivery and related methods |
SI2854841T1 (sl) | 2012-06-04 | 2017-06-30 | Diamedica Inc. | Glikozilacijske izooblike humanega tkivnega kalikreina-1 |
EP3395358B1 (de) | 2012-09-26 | 2019-11-06 | Indiana University Research and Technology Corporation | Insulinanalogdimere |
ES2670969T3 (es) | 2012-11-13 | 2018-06-04 | Adocia | Formulación de acción rápida de insulina que comprende un compuesto aniónico sustituido |
EP2925345B1 (de) | 2012-12-03 | 2018-09-05 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Methode zur herstellung von o-glycosyliertem carboxyterminus-peptid (ctp)-basiertem insulin und insulinanaloga |
WO2014093696A2 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Insulin derivatives for diabetes treatment |
RU2015129087A (ru) | 2012-12-19 | 2017-02-02 | Вокхардт Лимитед | Стабильная водная композиция, содержащая инсулин человека или его аналог или производное |
WO2014102623A1 (en) | 2012-12-26 | 2014-07-03 | Wockhardt Limited | Pharmaceutical composition |
TWI780236B (zh) | 2013-02-04 | 2022-10-11 | 法商賽諾菲公司 | 胰島素類似物及/或胰島素衍生物之穩定化醫藥調配物 |
JP6538645B2 (ja) | 2013-03-14 | 2019-07-03 | インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションIndiana University Research And Technology Corporation | インスリン‐インクレチン複合物 |
EP2991672A1 (de) | 2013-04-30 | 2016-03-09 | Novo Nordisk A/S | Neuartiges verabreichungsschema |
RU2016107610A (ru) | 2013-09-30 | 2017-11-03 | Вокхардт Лимитед | Фармацевтическая композиция |
MX366636B (es) | 2013-10-07 | 2019-07-17 | Novo Nordisk As | Nuevo derivado de un análogo de insulina. |
BR112016015851A2 (pt) | 2014-01-09 | 2017-08-08 | Sanofi Sa | Formulações farmacêuticas estabilizadas de insulina aspart |
MX2016008979A (es) | 2014-01-09 | 2016-10-04 | Sanofi Sa | Formulaciones farmaceuticas estabilizadas de analogos de insulina y/o derivados de insulina. |
CN105899191B (zh) | 2014-01-09 | 2020-06-16 | 赛诺菲 | 胰岛素类似物和/或胰岛素衍生物的稳定化不含甘油的药物制剂 |
FR3020947B1 (fr) | 2014-05-14 | 2018-08-31 | Adocia | Composition aqueuse comprenant au moins une proteine et un agent solubilisant, sa preparation et ses utilisations |
US9795678B2 (en) | 2014-05-14 | 2017-10-24 | Adocia | Fast-acting insulin composition comprising a substituted anionic compound and a polyanionic compound |
US9656017B2 (en) | 2014-06-20 | 2017-05-23 | Howard E. Greene | Infusion delivery devices and methods |
WO2016001862A1 (en) | 2014-07-04 | 2016-01-07 | Wockhardt Limited | Extended release formulations of insulins |
ES2822994T3 (es) | 2014-09-24 | 2021-05-05 | Univ Indiana Res & Tech Corp | Conjugados de incretina-insulina |
CA2961037A1 (en) | 2014-10-06 | 2016-04-14 | Case Western Reserve University | Biphasic single-chain insulin analogues |
SG10201809428UA (en) | 2014-11-21 | 2018-11-29 | Merck Sharp & Dohme | Insulin receptor partial agonists |
CA2970200A1 (en) | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin glargine/lixisenatide fixed ratio formulation |
TW201630622A (zh) | 2014-12-16 | 2016-09-01 | 美國禮來大藥廠 | 速效胰島素組合物 |
CN105884879A (zh) * | 2015-01-26 | 2016-08-24 | 漳州博欣生物技术有限公司 | 一种胰岛素类似物的化学合成方法 |
TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第2型糖尿病病患治療 |
TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第2型糖尿病病患之治療 |
US11352406B2 (en) | 2015-08-25 | 2022-06-07 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives and the medical uses hereof |
JO3749B1 (ar) | 2015-08-27 | 2021-01-31 | Lilly Co Eli | تركيبات إنسولين سريعة المفعول |
FR3043557B1 (fr) | 2015-11-16 | 2019-05-31 | Adocia | Composition a action rapide d'insuline comprenant un citrate substitue |
WO2017180988A2 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Indiana University Research And Technology Corporation | Fgf21 c-terminal peptide optimization |
GB201607918D0 (en) | 2016-05-06 | 2016-06-22 | Arecor Ltd | Novel formulations |
US10953076B2 (en) | 2016-05-24 | 2021-03-23 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Insulin receptor partial agonists and GLP-1 analogues |
EP3463413A4 (de) | 2016-05-25 | 2020-03-04 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Insulinrezeptorteilagonisten |
WO2018024186A1 (zh) * | 2016-08-02 | 2018-02-08 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 一种人胰岛素或其类似物的酰化衍生物 |
ES2954180T3 (es) | 2016-09-29 | 2023-11-20 | Arecor Ltd | Formulación farmacéutica que comprende un compuesto de insulina |
TWI700092B (zh) | 2016-12-16 | 2020-08-01 | 丹麥商諾佛.儂迪克股份有限公司 | 含胰島素醫藥組成物 |
JP2020510023A (ja) | 2017-03-09 | 2020-04-02 | ダイアメディカ, インコーポレイテッド | 組織カリクレイン1の剤形 |
GB201707189D0 (en) | 2017-05-05 | 2017-06-21 | Arecor Ltd | Novel formulations |
GB201707188D0 (en) | 2017-05-05 | 2017-06-21 | Arecor Ltd | Novel formulations |
GB201707187D0 (en) | 2017-05-05 | 2017-06-21 | Arecor Ltd | Novel formulations |
MX2019014195A (es) | 2017-06-01 | 2020-01-27 | Lilly Co Eli | Composiciones de insulina de rapida accion. |
CA3071686A1 (en) | 2017-08-17 | 2019-02-21 | Novo Nordisk A/S | Novel acylated insulin analogues and uses thereof |
US20210038506A1 (en) | 2018-04-04 | 2021-02-11 | Arecor Limited | Medical infusion pump system for the delivery of an insulin compound |
CA3094304A1 (en) | 2018-04-04 | 2019-10-10 | Arecor Limited | Medical infusion pump system for the delivery of an insulin compound |
CA3094308A1 (en) | 2018-04-04 | 2019-10-10 | Arecor Limited | Medical infusion pump system for the delivery of an insulin compound |
US10335464B1 (en) | 2018-06-26 | 2019-07-02 | Novo Nordisk A/S | Device for titrating basal insulin |
US20210332100A1 (en) * | 2018-09-12 | 2021-10-28 | Amphastar Nanjing Pharmaceuticals Inc | Novel pro-insulin aspart structure and method for preparing insulin aspart |
KR20200082618A (ko) | 2018-12-31 | 2020-07-08 | 주식회사 폴루스 | 인슐린 과발현용 램프 태그 및 이를 이용한 인슐린의 제조방법 |
JP6995284B2 (ja) * | 2019-12-11 | 2022-01-14 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 新規インスリン類似体およびそれらの使用 |
JP2023510206A (ja) | 2019-12-30 | 2023-03-13 | 甘李薬業股▲フン▼有限公司 | インスリン誘導体 |
BR112022013042A2 (pt) | 2019-12-30 | 2022-10-18 | Gan & Lee Pharmaceuticals Co Ltd | Composto da fórmula b, formulação farmacêutica, composição farmacêutica, método para tratar ou prevenir hiperglicemia, diabetes e/ou obesidade |
GB202004814D0 (en) | 2020-04-01 | 2020-05-13 | Arecor Ltd | Novel formulations |
WO2023225534A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Protomer Technologies Inc. | Aromatic boron-containing compounds and related insulin analogs |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2252157C3 (de) * | 1972-10-25 | 1976-03-18 | Hoechst Ag | Zwischenprodukte zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten und verfahren zur herstellung von insulin, insulin analogen und derivaten |
US4652525A (en) * | 1978-04-19 | 1987-03-24 | The Regents Of The University Of California | Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes |
US4411994A (en) * | 1978-06-08 | 1983-10-25 | The President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
US4565785A (en) * | 1978-06-08 | 1986-01-21 | The President And Fellows Of Harvard College | Recombinant DNA molecule |
JPS55138391A (en) * | 1979-04-13 | 1980-10-29 | Shionogi & Co Ltd | New synthetic method of peptide derivative |
IE50892B1 (en) * | 1980-02-11 | 1986-08-06 | Novo Industri As | Process for preparing insulin esters |
US4340674A (en) * | 1980-05-05 | 1982-07-20 | The Upjohn Company | Cointegrate plasmids and their construction from plasmids of Escherichia and Streptomyces |
US4351901A (en) * | 1980-03-24 | 1982-09-28 | Cetus Corporation | Method for single nucleotide alteration |
DK319780A (da) * | 1980-07-24 | 1982-01-25 | Forenede Bryggerier As | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner |
ZA824218B (en) * | 1981-06-29 | 1983-04-27 | Cetus Corp | Plasmid for producing human insulin |
DK58285D0 (da) * | 1984-05-30 | 1985-02-08 | Novo Industri As | Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf |
US5008241A (en) * | 1985-03-12 | 1991-04-16 | Novo Nordisk A/S | Novel insulin peptides |
DK129385A (da) * | 1985-03-22 | 1986-09-23 | Novo Industri As | Peptider og fremstilling deraf |
DK134189D0 (da) * | 1989-03-20 | 1989-03-20 | Nordisk Gentofte | Insulinforbindelser |
US5559094A (en) * | 1994-08-02 | 1996-09-24 | Eli Lilly And Company | AspB1 insulin analogs |
-
1986
- 1986-08-22 PH PH34177A patent/PH25772A/en unknown
- 1986-08-26 YU YU148486A patent/YU46023B/sh unknown
- 1986-08-28 CN CN86106574A patent/CN1029977C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 DE DE3650101T patent/DE3650101T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 CA CA000517255A patent/CA1306212C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 FI FI863512A patent/FI102182B/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 KR KR1019860007225A patent/KR940000756B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 IL IL79887A patent/IL79887A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 NO NO863474A patent/NO177009C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 CS CS866310A patent/CS275613B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 AT AT86306721T patent/ATE113061T1/de active
- 1986-08-29 PT PT83278A patent/PT83278B/pt unknown
- 1986-08-29 AR AR86305098A patent/AR241801A1/es active
- 1986-08-29 NZ NZ217406A patent/NZ217406A/xx unknown
- 1986-08-29 IE IE231786A patent/IE66138B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-08-29 EP EP86306721A patent/EP0214826B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 HU HU863754A patent/HU206518B/hu unknown
- 1986-08-29 AU AU62066/86A patent/AU593274B2/en not_active Expired
- 1986-08-29 DE DE2000175008 patent/DE10075008I2/de active Active
- 1986-08-29 ES ES8601507A patent/ES2001624A6/es not_active Expired
- 1986-08-29 GR GR862233A patent/GR862233B/el unknown
- 1986-08-29 JP JP61201906A patent/JP2662390B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 US US06/901,821 patent/US5618913A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-29 DD DD29398186A patent/DD268976A5/de unknown
-
1988
- 1988-01-11 YU YU4188A patent/YU46857B/sh unknown
-
1999
- 1999-12-06 NL NL990042C patent/NL990042I2/nl unknown
- 1999-12-21 LU LU90484C patent/LU90484I2/fr unknown
-
2000
- 2000-07-21 NO NO2000005C patent/NO2000005I1/no unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DD268976A5 (de) | Verfahren zur Herstellung von Humaninsulinanaloga | |
EP2229406B1 (de) | Neue insulinderivate mit extrem verzögertem zeit- / wirkungsprofil | |
AU615760B2 (en) | Insulin analogues | |
DE19726167B4 (de) | Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung | |
EP0368187B1 (de) | Neue Insulinderivate, ihre Verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische Zubereitung | |
DE102008003566A1 (de) | Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil | |
EP1222207B1 (de) | C-peptid zur verbesserten herstellung von insulin und insulinanaloga | |
EP2229407A2 (de) | Neue insulinderivate mit extrem verzögertem zeit- / wirkungsprofil | |
DD298788A5 (de) | Neue insulinverbindungen | |
DD296965A5 (de) | Hefeverarbeitungssystem | |
DD212982A5 (de) | Verfahren zur herstellung von rinder-wachstumshormon-aehnlichen polypeptiden | |
DE69434909T2 (de) | Herstellung von humaninsulin | |
DE19825447A1 (de) | Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung | |
DE102008025008A1 (de) | Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil | |
EP0219781A2 (de) | Biologisch aktive Derivate des Human-gamma-Interferons, ihre Herstellung und Arzneimittel, die solche Derivate enthalten | |
DE69634757T2 (de) | Vektor zur expression von n-terminal verlängerten proteinen in hefezellen | |
RU2104305C1 (ru) | Аналоги инсулина человека, способ их получения, раствор для инъекций | |
DE102008025007A1 (de) | Neue Insulinderivate mit extrem verzögertem Zeit-/ Wirkungsprofil | |
DD290426A5 (de) | Human insulin analoge | |
DK159274B (da) | Hurtigt virkende human insulinanaloger og injicerbare oploesninger med hurtigt indsaettende virkning indeholdende saadanne insulinanaloger |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
IF04 | In force in the year 2004 |
Expiry date: 20060830 |