CN102762589A - 带有氯化氨基酸的胰岛素类似物 - Google Patents
带有氯化氨基酸的胰岛素类似物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102762589A CN102762589A CN2010800636163A CN201080063616A CN102762589A CN 102762589 A CN102762589 A CN 102762589A CN 2010800636163 A CN2010800636163 A CN 2010800636163A CN 201080063616 A CN201080063616 A CN 201080063616A CN 102762589 A CN102762589 A CN 102762589A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- insulin
- phe
- phenylalanine
- analog
- analogs
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 420
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 title claims description 27
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 133
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 133
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims abstract description 48
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 35
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 35
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N chlorobenzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1 MVPPADPHJFYWMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 7
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 claims 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 1
- YAJCHEVQCOHZDC-QMMNLEPNSA-N actrapid Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3N=CNC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@H](C)CC)[C@H](C)CC)[C@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C(N)=O)C1=CNC=N1 YAJCHEVQCOHZDC-QMMNLEPNSA-N 0.000 claims 1
- 229950004152 insulin human Drugs 0.000 claims 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 abstract description 213
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract description 72
- NIGWMJHCCYYCSF-QMMMGPOBSA-N 4-chloro-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(Cl)C=C1 NIGWMJHCCYYCSF-QMMMGPOBSA-N 0.000 abstract description 64
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 abstract description 39
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 abstract description 33
- 206010061592 cardiac fibrillation Diseases 0.000 abstract description 27
- 230000002600 fibrillogenic effect Effects 0.000 abstract description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 20
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 15
- 150000002993 phenylalanine derivatives Chemical class 0.000 abstract description 9
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 abstract description 8
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 abstract description 8
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 abstract description 8
- HSPPJXGQIRTEQQ-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoyl chloride Chemical compound ClC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HSPPJXGQIRTEQQ-QMMMGPOBSA-N 0.000 abstract description 7
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 abstract 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 abstract 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 27
- WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N humalog Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N 0.000 description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 23
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 20
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 19
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 18
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 18
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 18
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 229960002068 insulin lispro Drugs 0.000 description 14
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 13
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 13
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 13
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 12
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 12
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 12
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 10
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 10
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 9
- 229940038661 humalog Drugs 0.000 description 9
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 9
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 7
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 7
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 7
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 6
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 6
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 6
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 5
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 4
- 108700021255 DKP-insulin Proteins 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 4
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101500025354 Homo sapiens Insulin B chain Proteins 0.000 description 3
- 108010073961 Insulin Aspart Proteins 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 3
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 3
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229960004717 insulin aspart Drugs 0.000 description 3
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N novorapid Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 VOMXSOIBEJBQNF-UTTRGDHVSA-N 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 3
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 3
- JADVWWSKYZXRGX-UHFFFAOYSA-M thioflavine T Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=[N+](C)C2=CC=C(C)C=C2S1 JADVWWSKYZXRGX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FCSKFTKZLAGOGY-BYSRGVEESA-N 81541-05-1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 FCSKFTKZLAGOGY-BYSRGVEESA-N 0.000 description 2
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 2
- 101500027330 Homo sapiens Kaliuretic peptide Proteins 0.000 description 2
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229940123452 Rapid-acting insulin Drugs 0.000 description 2
- 108010026951 Short-Acting Insulin Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N butane-1,4-diol Chemical compound OCCCCO WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- LEMUFSYUPGXXCM-JNEQYSBXSA-N caninsulin Chemical compound [Zn].C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC3N=CN=C3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1C=NC=N1 LEMUFSYUPGXXCM-JNEQYSBXSA-N 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 108010092446 cecropin A (1-33) Proteins 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 2
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 2
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229940112879 novolog Drugs 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- -1 zinc insulin analogue Chemical class 0.000 description 2
- YYTDJPUFAVPHQA-VKHMYHEASA-N (2s)-2-amino-3-(2,3,4,5,6-pentafluorophenyl)propanoic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1F YYTDJPUFAVPHQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-aminopropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical group C[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O RVLOMLVNNBWRSR-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N (4r,7s,10s,13r,16s,19r)-10-(4-aminobutyl)-19-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-16-benzyl-n-[(2r,3r)-1,3-dihydroxybutan-2-yl]-7-[(1r)-1-hydroxyethyl]-13-(1h-indol-3-ylmethyl)-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17-pentazacycloicosane-4-carboxa Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC1=O)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- CVZZNRXMDCOHBG-QMMMGPOBSA-N 2-Chloro-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1Cl CVZZNRXMDCOHBG-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJDJLFDGCUYZMN-QMMMGPOBSA-N 3-chloro-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC(Cl)=C1 JJDJLFDGCUYZMN-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- 102000052866 Amino Acyl-tRNA Synthetases Human genes 0.000 description 1
- 108700028939 Amino Acyl-tRNA Synthetases Proteins 0.000 description 1
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N Atorvastatin Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N 0.000 description 1
- XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N Atorvastatin Natural products C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000020401 Depressive disease Diseases 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101500025353 Homo sapiens Insulin A chain Proteins 0.000 description 1
- 108010090613 Human Regular Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000013266 Human Regular Insulin Human genes 0.000 description 1
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 1
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000010625 Insulin Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 102100039688 Insulin-like growth factor 1 receptor Human genes 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005237 Isophane Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081368 Isophane Insulin Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical class NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000019022 Mood disease Diseases 0.000 description 1
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GIYXAJPCNFJEHY-UHFFFAOYSA-N N-methyl-3-phenyl-3-[4-(trifluoromethyl)phenoxy]-1-propanamine hydrochloride (1:1) Chemical compound Cl.C=1C=CC=CC=1C(CCNC)OC1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 GIYXAJPCNFJEHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091060545 Nonsense suppressor Proteins 0.000 description 1
- 108010016076 Octreotide Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003942 amyloidogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000031016 anaphase Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000007080 aromatic substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005370 atorvastatin Drugs 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical group 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004700 cobalt complex Chemical class 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012866 crystallographic experiment Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N cystine group Chemical group C([C@@H](C(=O)O)N)SSC[C@@H](C(=O)O)N LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 108700028250 desoctapeptide- insulin Proteins 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003503 early effect Effects 0.000 description 1
- 238000005421 electrostatic potential Methods 0.000 description 1
- 230000003241 endoproteolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229960000389 fluoxetine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000001995 gravitational field-flow fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940103471 humulin Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000003199 leukotriene receptor blocking agent Substances 0.000 description 1
- 238000004102 ligand field theory Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical class [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 108010013359 miniproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001951 montelukast sodium Drugs 0.000 description 1
- LBFBRXGCXUHRJY-HKHDRNBDSA-M montelukast sodium Chemical compound [Na+].CC(C)(O)C1=CC=CC=C1CC[C@H](C=1C=C(\C=C\C=2N=C3C=C(Cl)C=CC3=CC=2)C=CC=1)SCC1(CC([O-])=O)CC1 LBFBRXGCXUHRJY-HKHDRNBDSA-M 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229960001494 octreotide acetate Drugs 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002571 pancreatic alpha cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 210000005152 placental membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003935 rough endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940052907 telazol Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
一种胰岛素类似物包含掺入了氯化苯丙氨酸的B链多肽。氯化苯丙氨酸可位于B24位。氯化苯丙氨酸可为对单氯苯丙氨酸。该类似物可属于哺乳动物胰岛素，例如人胰岛素。一种核酸编码所述胰岛素类似物。氯化胰岛素类似物保留重要的活性。一种治疗患者的方法，包括将生理学上有效量的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐给予患者。基于氯取代的胰岛素稳定可降低原纤化，因而增强在缺乏冷藏的发展中世界的地区中对糖尿病的治疗。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年12月11日提交的待审美国临时申请号61/285,955的权益。
关于联邦政府资助研究或开发的声明
本发明在由国立卫生研究院授予的合作协议下由政府支持完成，补助号为DK40949和DK074176。美国政府可享有本发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及抵抗热降解的多肽。更具体地，本发明涉及热稳定的胰岛素类似物。甚至更具体地，本发明涉及通过在其氨基酸中掺入氯元素而化学和热稳定的胰岛素类似物。氯被分类为卤素，因其原子半径、电负性、局部电荷的立体电子分布和对分子中邻近原子的立体电子特性的传送效应而区别于蛋白质中的一般组成。
发明背景
超稳定蛋白质(包括治疗剂和疫苗)工程在无法连续获得电和冷藏的发展中世界的地区可能具有广泛的社会效益。胰岛素提供了易于热降解的治疗性蛋白质的实例。非洲和亚洲糖尿病的即将来临的流行加深了因胰岛素的化学和物理降解而致的挑战。因为胰岛素类似物的化学降解速率与其相对稳定性反相关，所以超稳定制剂的设计可提高所述挑战区域内胰岛素代替疗法的安全性和功效。
小有机分子中一些卤素取代的效用在药物化学中已知。氟化官能团对治疗中广泛采用的小分子的功效至关重要，所述小分子为例如胆固醇生物合成抑制剂阿托伐他汀(Liptor™)以及用于治疗抑郁和其它情感障碍的选择性血清素再吸收抑制剂盐酸氟西汀(Prozac™)。虽然氟原子半径与氢原子半径相似，但其巨大的诱导效应改变了这些药物的立体电子特性，进而增强药物的生物学活性。物理有机化学的类似考虑涉及更大的卤素原子例如氯的掺入。小分子孟鲁司特钠(montelukast
sodium) (Singulair™)是白细胞三烯抑制剂，通过共价掺入氯原子来增强其药学特性。另外，2009年7月31日提交的国际专利申请号PCT/US2009/52477提供了胰岛素类似物中氟取代氨基酸的用途。
与掺入氟原子的上述效应相比，在科学文献中较少良好表征通过位点特异性掺入氯原子到修饰的氨基酸中来调整蛋白质的化学、物理和生物特性。
芳族侧链可参与许多种弱极性相互作用，其不但涉及邻近芳环，而且还涉及正或负静电势的其它来源。实例包括肽键中的主链羰基和酰胺基。
胰岛素给药早已建立为糖尿病的治疗。胰岛素是小的球状蛋白质，在脊椎动物的新陈代谢中起着重要作用。胰岛素含有两条链，其中A链含有21个残基，B链含有30个残基。该激素以Zn2+稳定的六聚体储存于胰β-细胞中，但在血流中以无Zn2+的单体发挥作用。胰岛素是单链前体胰岛素原的产物，在胰岛素原中连接区(35个残基)将B链的C-末端残基(残基B30)连接到A链的N-末端残基上(图1A)。虽然尚未测定胰岛素原的结构，但许多证据表明其由胰岛素样的核心和无序的连接肽组成(图1B)。认为在糙面内质网(ER)中三个特异性二硫键(A6-A11、A7-B7和A20-B19，图1A和1B)的形成与胰岛素原的氧化折叠偶联。从ER中输出到高尔基体后，胰岛素原即刻装配形成Zn2+配位的可溶性六聚体。内切蛋白酶解消化及转化为胰岛素发生在未成熟的分泌颗粒中，接着发生形态学凝聚。已通过电镜学(EM)观察到成熟贮藏粒中锌胰岛素六聚体的晶体阵列。
已对Zn2+配位的胰岛素六聚体，即生理学上的储存形式，进行了大量X-射线晶体学研究。在体外已阐述了多种晶形，定义了三个结构家族，命名为T6、T3Rf 3和R6。在这些六聚体中，认为两个Zn离子位于沿六聚体中心轴的位置，每一个Zn离子被三个组氨酸(HisB10)配位；在一些晶形中观察到另外的低亲和力的Zn结合位点。T态原体类似于溶液中胰岛素单体的结构。R态原体在B链的二级结构上表现出变化：中央α-螺旋延伸至B1 (R态)或至B3 (扰乱的Rf态)。
胰岛素在血流中以单体发挥作用，但认为正是单体对原纤化和化学降解的大部分形式最为敏感。通过NMR在溶液中表征的胰岛素单体的结构见图1D。A链由N-末端α-螺旋(残基A1-A8)、不规则转角(A9-A12)、第二个α-螺旋(A12-A18)和C-末端延伸(A19-A21)组成。B链含有N-末端臂(B1-B6)、β-转角(B7-B10)、中间α-螺旋(B9-B19)、β-转角(B20-B23)、β-链(B24-B28)和柔性C-末端残基B29-B30。两条链包装形成通过三个二硫键(胱氨酸A6-A11、A7-B7和A20-B19)来稳定的致密球状结构域。
普通胰岛素的吸收受限于Zn-胰岛素六聚体的动力学寿命，为使胰岛素能通过毛细血管内皮层运输，需要六聚体分解为更小的二聚体和单体。隐含在Humalog®和Novolog®设计下的基本想法是加速分解。这通过使典型的二聚体形成表面(C-末端反向平行β-折叠)失稳来完成。Humalog®含有ProB28→Lys和LysB29→Pro取代，即模拟IGF-I序列的倒位。Novolog®含有ProB28→Asp取代。虽然取代削弱二聚化作用，但类似物有能力组装苯酚或间甲酚稳定的锌六聚体。这种组装保护类似物在小瓶中不会原纤化，但在皮下注射之后，六聚体随苯酚(或间甲酚)和锌离子扩散开而迅速离解。这些类似物的不稳定性是由患者或医疗保健提供者稀释后其储存期限缩短的原因。对于胰岛素类似物而言，在保留Humalog®的变体二聚体相关的β-折叠的同时，增加胰岛素单体的内在稳定性将会有益。
已知在储存期间锌胰岛素六聚体的用途，其代表着延缓小瓶或泵贮器中制剂的物理降解和化学降解的经典策略。因为锌胰岛素六聚体太大以致不能立刻进入毛细血管，所以皮下注射后胰岛素的吸收速率受限于六聚体离解为更小的二聚体和单体单元所需的时间。因此，以下胰岛素类似物是有利的，其既(a)能允许六聚体在高蛋白质浓度下(如在小瓶或泵中)组装，但又(b)在二聚体界面下充分地去稳定以表现出加速分解，由此预测从皮下储库中超速吸收。这些结构目标是在稳定性(储存中)和不稳定性(注射后)之间找到平衡。
已研究了胰岛素中的氨基酸取代对热力学稳定性和生物学活性的影响。没有观察到稳定性和活性之间有一致的关联。尽管一些增强热力学稳定性的取代也增强与胰岛素受体的结合，但是其它增强稳定性的取代却阻碍所述结合。在野生型人胰岛素中已研究了用数个其它氨基酸取代ThrA8的影响，报道了B链中含有三个不相关取代(HisB10→Asp、ProB28→Lys和LysB29→Pro)的工程改造的胰岛素单体。加速或延缓吸收时程的取代实例亦为本领域所知。所述取代(例如Novalog®中的AspB28和Humalog®中的[LysB28,
ProB29])可与并通常与更迅速的原纤化和更差的物理稳定性相关。实际上，在一项研究中，测试了一系列十种人胰岛素类似物对原纤化的敏感性，包括AspB28-胰岛素和AspB10-胰岛素。发现十种全部在pH
7.4和37℃下都比人胰岛素对原纤化更敏感。十种取代位于胰岛素分子中的不同部位，很可能与典型热力学稳定性的多种变化有关。虽然已观察到一系列效应，但活性和热力学稳定性之间不存在相关性。
胰岛素是小的球状蛋白质，非常容易化学合成和半合成，这有利于掺入非标准侧链。胰岛素含有三个苯丙氨酸残基(B1、B24和B25位)和在B26位的结构相似的酪氨酸。在脊椎动物胰岛素和胰岛素样生长因子中保守的PheB24芳环紧靠着疏水核组装(但并不在核内)以稳定B链的超二级结构。PheB24位于典型的受体结合表面，已提出将其针对受体结合指导在构象方面的改变。PheB25凸出于胰岛素单体表面，而TyrB26在核的一个边缘邻近脂族侧链(IleA2、ValA3和ValB12)组装。提出B24相关构象改变能够使PheB25和TyrB26接触胰岛素受体的不同结构域。
蛋白质原纤化的现有理论假定，原纤化的机理经由局部折叠的中间状态进行，该中间状态进而聚集形成促淀粉状变(amyloidogenic)核。在该理论中，有可能的是，稳定天然状态的氨基酸取代可以或不可以稳定局部折叠的中间状态，并可以或不可以增加(或减少)天然状态和中间状态之间的自由能屏障。因此，当前的理论表明，胰岛素分子中给定的氨基酸取代增加或减少原纤化风险的趋势是高度不可预知的。
在用于糖尿病治疗的胰岛素和胰岛素类似物的生产、储存和使用中严重担心的原纤化，随着较高的温度、较低的pH、搅拌或存在尿素、胍、乙醇共溶剂或疏水表面而增加。当前的美国药物法规要求，若原纤化的发生水平为1%或更多，应丢弃该胰岛素。因为在较高的温度下增加原纤化，所以在使用前，糖尿病个体最好必须让胰岛素保持冷藏。对于利用外部胰岛素泵(其中定期向患者体内注入小量胰岛素或胰岛素类似物)的糖尿病患者，胰岛素或胰岛素类似物的原纤化可为特别关注的。在所述用法中，泵装置中的胰岛素或胰岛素类似物未保持冷藏，胰岛素的原纤化可导致用于向体内注入胰岛素或胰岛素类似物的导管的堵塞，从而可能导致不可预知的血糖水平波动或甚至危险的高血糖症。最近至少有一例报道表明赖脯胰岛素(lispro
insulin)(其中相对于它们在野生型人胰岛素中的位置，B28和B29残基互换的类似物；商品名Humalog®)可能对原纤化尤为敏感，导致胰岛素泵导管的堵塞。
在可植入的胰岛素泵中，胰岛素原纤化甚至更令人关注，在所述泵中在高浓度和生理温度(即37℃)而非像外部泵的环境条件下，胰岛素在植入物中包含1-3个月。另外，正常运动引起的搅动也可易于加速胰岛素原纤化。尽管可能增加胰岛素原纤化，但由于这类系统的潜在优势，可植入的胰岛素泵仍是研究工作的主题。这些优势包括腹膜内递送胰岛素至门静脉循环系统，其比皮下注射更接近地模拟了胰岛素的正常生理递送，皮下注射通过体循环系统向患者提供胰岛素。与皮下注射比较，腹膜内递送提供更迅速和一致的胰岛素吸收，皮下注射可提供从一个注射部位到另一注射部位的可变的吸收和降解。经由可植入泵来给予胰岛素亦可能提供增加的患者便利。虽然防止原纤化所作的努力(例如通过向贮器中加入表面活性剂)提供了一些改善，但迄今为止认为这些改善不足以让植入的胰岛素泵在严格监测临床试验之外的糖尿病患者中可靠地使用。
如上所述，发展中世界面对关于药品和疫苗的安全储存、运输和使用的挑战。这种挑战使在缺乏持续获得电和冷藏的非洲和亚洲地区中温度敏感的胰岛素制剂的使用更糟糕，而该挑战很可能被发展中世界中糖尿病的即将来临的流行加深。在25℃以上，温度每增加10℃，胰岛素的降解速率显示10倍或更多的增加，指导方针要求在< 30℃温度下储存，优选冷藏储存。在较高温度下，胰岛素遭受化学降解(共价结构的变化，例如异天冬氨酸的形成、二硫键的重排和共价聚合物的形成)和物理降解(非天然聚集和原纤化)二者。
业已阐述了胰岛素中的这样的氨基酸取代，其稳定该蛋白质，但以以下方式增进其与胰岛素受体(IR)的结合及其与胰岛素样生长因子(IGFR)的同源受体的交叉结合，所述方式使得赋予致癌作用的风险。用天冬氨酸取代HisB10提供了本领域已知的实例。虽然AspB10-胰岛素在稳定性和药代动力学上表现出良好的药学特性，但其增加的受体结合特性与Sprague-Dawley大鼠中的肿瘤发生有关。虽然在A链和B链中有很多潜在的可引入到AspB10胰岛素或相关类似物中以降低其与IR和IGFR的结合水平至类似于人胰岛素的结合水平的取代，但所述取代通常损害胰岛素(或胰岛素类似物)的稳定性，并增加其对化学和物理降解的敏感性。期望发现修饰胰岛素和胰岛素类似物的方法，其能够使受体结合亲和力“协调”并同时增加稳定性和对原纤化的抗性。所述应用要求一套这样的稳定修饰，其降低与IR和IGFR的结合至不同程度，使得消除在其受体结合特性方面活性超常的类似物的潜在致癌性。
因此，需要备选胰岛素类似物，包括储存过程中稳定但同时又快速起效的胰岛素类似物。
发明概述
因此，本发明一方面提供胰岛素类似物，所述类似物通过在氨基酸中的氯取代来提供改变的特性，例如改进的稳定性，其中所述类似物亦保留相应的非氯化胰岛素或胰岛素类似物的至少一部分生物学活性。
另外或作为备选，本发明一方面提供胰岛素类似物，所述类似物为速效胰岛素，但亦具有相对于之前的速效胰岛素类似物改进的稳定性。
总的来说，本发明提供包含掺入氯化氨基酸的B链多肽的胰岛素类似物。在一个实施方案中，氯化氨基酸为B24位的苯丙氨酸。在一特定实施方案中，氯化苯丙氨酸为对单氯苯丙氨酸。另外或作为备选，胰岛素类似物可为哺乳动物胰岛素类似物，例如人胰岛素类似物。在一个特定组的实施方案中，B链多肽包含选自SEQ. ID. NO. 4-8和其具有三个或更少的另外氨基酸取代的多肽的氨基酸序列。
亦提供编码包含B链多肽的胰岛素类似物的核酸，所述B链多肽在B24位掺入氯化苯丙氨酸例如对单氯苯丙氨酸。在一个实例中，氯化苯丙氨酸由终止密码子例如核酸序列TAG编码。表达载体可包含所述核酸，宿主细胞可含有所述表达载体。
本发明亦提供治疗患者的方法。所述方法包括将生理学有效量的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐给予患者，其中所述胰岛素类似物或其生理学可接受的盐含有氯化氨基酸。在一个实施方案中，胰岛素B链在B24位掺入氯化苯丙氨酸。在一特定实施方案中，氯化苯丙氨酸为对单氯苯丙氨酸。另外或作为备选，胰岛素类似物可为哺乳动物胰岛素类似物，例如人胰岛素类似物。此外，B链多肽可包含选自SEQ. ID. NO. 4-8和其具有三个或更少的另外氨基酸取代的多肽的氨基酸序列。
附图简述
图1A是包括A链和B链及连接区的人胰岛素原的序列示意图，其中显示了侧翼的二碱基切割位点(实心圆)和C-肽(空心圆)。
图1B是胰岛素原的结构模型，其由胰岛素样部分和无序的连接肽(虚线)组成。
图1C是人胰岛素的序列示意图，其标明B链中残基B24的位置。
图1D是胰岛素单体的带状模型，其显示相对于三个二硫键的芳族残基PheB24。显示了LeuB15(黑色)和PheB24(灰色)的相邻侧链。显示了A链和B链，二硫键显示为球和棒。
图1E是胰岛素的空间结构模型，其显示疏水核边缘口袋中的PheB24侧链。
图2A是邻单氯化苯丙氨酸(2Cl-Phe)的示意图。
图2B是间单氯化苯丙氨酸(3Cl-Phe)的示意图。
图2C是对单氯化苯丙氨酸(4Cl-Phe)的示意图。
图3A是显示使用分离的胰岛素受体(B同工型)的体外受体结合测定结果的曲线图：人胰岛素(三角形)、KP-胰岛素(方形)和4Cl-PheB24-KP-胰岛素(倒三角形)。
图3B是显示采用IGF-1R的体外受体结合测定结果的曲线图：人胰岛素(三角形)、KP-胰岛素(方形)、4Cl-PheB24-KP-胰岛素(倒三角形)和天然IGF-I (圆形)。
图3C是比较使用分离的胰岛素受体(B同工型)的体外受体结合测定结果的曲线图：人胰岛素(实线)、KP-胰岛素(虚线)、4Cl-PheB24-KP-胰岛素(三角形)、4F-PheB24-KP-胰岛素(方形)。
图3D是比较使用分离的胰岛素受体(B同工型)的体外受体结合测定结果的曲线图：人胰岛素(实线)、KP-胰岛素(虚线)、4Cl-PheB26-KP-胰岛素(三角形)、4F-PheB26-KP-胰岛素(方形)。
图4是显示相对于仅稀释剂(圆形)、人胰岛素(十字形)和KP-胰岛素(方形)，随时间推移在STZ诱导的糖尿病Lewis大鼠中皮下注射4Cl-PheB24-KP-胰岛素(倒三角形)的降血糖作用的曲线图。
图5A-C是显示胰岛素钴溶液的平均迹线的曲线图，所述平均迹线显示加入2 mM
EDTA之前和之后的400-750 nm特征光谱曲线。将样品溶于50 mM
Tris (pH 7.4)、50 mM苯酚和0.2
mM CoCl2。然后加入NaSCN至终浓度为1 mM。实线表示EDTA提取前的数据。虚线表示EDTA提取后的数据。图A：野生型胰岛素；图B：KP-胰岛素；图C：4Cl-PheB24-KP-胰岛素。
图5D是显示加入2 mM EDTA后在574 nm (25℃和pH
7.4)下监测的六聚体离解动力学的曲线。将每一样品的数据标准化至零时刻：野生型(实线)、KP-胰岛素(虚线)和4ClPheB24-KP-胰岛素(点线)。
图6是显示以剂量为每千克体重0.2单位对KP-胰岛素(赖脯胰岛素)和4Cl-PheB24-KP-胰岛素(4-Cl-赖脯胰岛素)进行胰岛素给药后，平均滤过的葡萄糖输注速率相对于时间的曲线图。
图7是概述猪中20个药效学研究的柱状图，其表明在五种不同给药水平下，4Cl-PheB24-KP-胰岛素相对于KP-胰岛素在1/2
T-max后期方面有显著改善。
图8是概述猪中14个药效学研究的柱状图，其表明在三种不同给药水平下，4Cl-PheB24-KP-胰岛素相对于KP-胰岛素在1/2
T-max早期方面有改善。
图9是十个匹配的药效学研究的概述，所述研究比较4Cl-PheB24-KP-胰岛素和KP胰岛素的相对功效，所述功效如通过曲线下面积(AUC)所测量，其中发现4-Cl-KP的平均功效稍微降低，但在统计学上不显著(p=0.22)。
实施方案阐述
本发明涉及通过在氨基酸中的氯取代而提供更大稳定性的胰岛素类似物，其中该类似物另外保留相应的非氯化胰岛素或胰岛素类似物的至少部分生物学活性。具体来说，本发明提供通过在氨基酸中的氯取代而提供更大稳定性的胰岛素类似物，其中该类似物另外保留相应的非氯化胰岛素或胰岛素类似物的至少部分生物学活性。在一特定实施方案中，本发明提供含有对单氯苯丙氨酸(4ClPheB24)残基作为B24位野生型苯丙氨酸的取代的胰岛素类似物。
然而，本发明不限于人胰岛素及其类似物。亦设想这些取代也可在动物胰岛素中进行，所述动物胰岛素的非限制性实例为例如猪的、牛的、马的和犬的胰岛素。
此外，考虑到人和动物胰岛素之间的相似性及动物胰岛素过去在人糖尿病患者中的使用，亦设想可在胰岛素序列中引入其它较小修饰，尤其是被认为“保守的”那些取代。例如，可在具有相似侧链的氨基酸群内进行氨基酸的另外取代，而不偏离本发明。这些包括中性疏水氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)和甲硫氨酸(Met或M)。类似地，中性极性氨基酸可在其群内相互取代，该群氨基酸有：甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Glu或Q)和天冬酰胺(Asn或N)。认为碱性氨基酸包括：赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和组氨酸(His或H)。酸性氨基酸为天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)。除非另外指出或根据上下文显而易见时，否则应认为本文所指的氨基酸是L-氨基酸。在一个实例中，本发明的胰岛素类似物除含有本发明的4Cl-PheB24取代之外还含有三个或更少的保守取代。在另一实例中，本发明的胰岛素类似物除含有本发明的4Cl-PheB24取代之外还含有一个或更少的保守取代。
如本说明书和权利要求中所用，胰岛素或胰岛素类似物中的不同氨基酸可用所述氨基酸残基接着氨基酸的位置(任选用上标)表示。所述氨基酸的位置包括取代位于其中的胰岛素的A链或B链。因此，PheB24表示胰岛素B链在第24位氨基酸处的苯丙氨酸，而PheB25表示胰岛素B链在第25位氨基酸处的苯丙氨酸。氯化氨基酸可用前缀“Cl-”标明。因此，氯化苯丙氨酸可缩写为“Cl-Phe”。在苯丙氨酸情况下，氯取代基或苯基侧链上的取代基的位置可进一步由氯所连接的碳的编号标明。因此，邻单氯苯丙氨酸(图2B中所示)缩写为“2Cl-Phe”，间单氯苯丙氨酸(图2C中所示)缩写为“3Cl-Phe”，对单氯苯丙氨酸(图2D中所示)缩写为4Cl-Phe。
B24位的苯丙氨酸是功能性胰岛素中的不变氨基酸，含有芳族侧链。导致人糖尿病的临床突变(SerB24)表明胰岛素中PheB24的生物学重要性。如图1D和1E所阐明，尽管不希望受理论所束缚，但认为PheB24装配在典型受体结合表面的疏水核边缘。该模型基于晶体学原体(2-Zn分子1；蛋白质数据库标识符4INS)。位于B链C-末端β链(残基B24-B28)之中的PheB24毗邻中央α-螺旋(残基B9-B19)。芳环的一面和一边位于由LeuB15和CysB19界定的浅口袋中；另一面和另一边暴露在溶剂中(图lE)。主链羰基和酰胺基部分地包围这一口袋，并因此产生复杂的不对称静电环境。
设想可在很多现存胰岛素类似物的任意一种中进行本发明取代。例如，本文所提供的氯化PheB24取代除了在人胰岛素中进行外，还可在胰岛素类似物例如赖脯(KP)胰岛素、门冬胰岛素(insulin
Aspart)、其它修饰的胰岛素或胰岛素类似物中进行；或在各种药物制剂中进行，所述药物制剂为例如普通胰岛素、NPH胰岛素、慢胰岛素或超慢胰岛素。门冬胰岛素含有AspB28取代，以Novalog®出售；而赖脯胰岛素含有LysB28和ProB29取代，以名称Humalog®闻名和出售。美国专利号5,149,777和5,474,978阐述了这些类似物。这两类类似物都称为速效胰岛素。
尽管不希望受理论所束缚，但认为在芳环对位处的氯取代(4ClPheB24)埋于二聚体的界面之中，亦认为其通过形成不利的氯-芳族静电偶极矩排列来加速六聚体的分解，所述偶极矩在六聚体中的每一个二聚体界面处成对并置。这被认为允许在Zn2+离子存在的情况下配制胰岛素类似物，并仍保留速效(进餐时间)胰岛素类似物的能力。
亦可将包括在B24的取代在内的氯化-Phe取代引入到人胰岛素类似物中，这种类似物尽管以前在临床上没有使用，但在实验上仍是有用的，例如在下面更全面阐述的DKP胰岛素，或在胰岛素的A链和B链部分之间含有二肽(Ala-Lys)接头的胰岛素原类似物小胰岛素原(miniproinsulin)，所述二肽接头取代了B链C-末端残基和A链N-末端残基之间的正常35氨基酸连接区(见图1B)。在DKP-胰岛素(或其它含有AspB10或表现出比人胰岛素更高的受体结合亲和力的胰岛素类似物)中的B24位掺入氯化-Phe，可降低其受体结合亲和力至类似于或低于人胰岛素的受体结合亲和力，所以潜在能够使其在临床上使用。以这种方式亦可减少胰岛素类似物与促有丝分裂的IGFR的交叉结合。
为比较目的提供了人胰岛素原的氨基酸序列，其为SEQ. ID. NO. 1
SEQ. ID. NO. 1 (胰岛素原)
提供了人胰岛素A链的氨基酸序列，其为SEQ. ID. NO. 2
SEQ. ID. NO. 2 (A链)
提供了人胰岛素B链的氨基酸序列，其为SEQ. ID. NO. 3
SEQ. ID. NO. 3 (B链)
其它取代的更多组合亦在本发明的范围之内。亦设想本发明的取代也可与先前已知胰岛素类似物的取代组合。例如，提供了其中也可引入氯化Phe取代的含有赖脯胰岛素(Humalog®)的LysB28
ProB29取代的人胰岛素B链类似物的氨基酸序列，其为SEQ. ID. NO. 4。类似地，提供了其中亦可引入氯化-PheB24取代的含有门冬胰岛素的AspB28取代的人胰岛素B链的类似物的氨基酸序列，其为SEQ. ID. NO. 5
SEQ. ID. NO. 4
SEQ. ID. NO. 5
氯化-PheB24取代亦可与其它胰岛素类似物取代联合引入，所述其它胰岛素类似物取代为例如含有残基A4、A8和/或B1的His取代的人胰岛素类似物，该类似物的更全面的阐述见共同待审国际申请号PCT/US07/00320和美国申请序号12/160,187，这两个申请的公开内容通过引用并入本文。例如，4Cl-PheB24取代可与具有由SEQ. ID. NO.6表示的氨基酸序列的胰岛素类似物或胰岛素原类似物的[HisA4、HisA8]和/或HisB1取代一起存在。
SEQ.
ID. NO. 6
其中R1为His或Phe；其中R2为Tyr或Phe，R3为Pro、Lys或Asp；其中R4为Lys或Pro；其中R5为His或Glu；其中R6为His或Thr；和其中Xaa0-35为0-35个任意氨基酸或氨基酸链中的断裂；
进一步其中存在至少一个选自以下氨基酸取代的取代：
R1为His；和
R6为His；和
R5和R6都为His。
亦可将4Cl-PheB24取代引入到单链胰岛素类似物中，如共同待审美国专利申请号12/419,169所公开，其公开内容通过引用并入本文。
亦设想可将氯化-PheB24取代引入到在胰岛素A链中含有取代的胰岛素类似物中。例如，胰岛素类似物可另外含有如SEQ. ID. NO. 7所示在A8位的赖氨酸、组氨酸或精氨酸取代，其取代了野生型A8位的苏氨酸(见SEQ. ID. NO. 2)
SEQ. ID. NO. 7
如上所述，可将4Cl-PheB24取代引入到高活性的工程改造的胰岛素单体中，该单体命名为DKP-胰岛素，含有AspB10(D)、LysB28(K)和ProB29(P)取代。认为B链表面的这三个取代阻碍二聚体和六聚体的形成。工程改造的单体的使用避开了自组装对稳定性测定的混淆效应。DKP-胰岛素的结构极像晶体学原体。提供了DKP胰岛素B链多肽的序列，其为SEQ. ID. NO. 8
SEQ. ID. NO. 8 (DKP B链序列)
KP-胰岛素类似物可通过胰蛋白酶催化的半合成来制备并通过高效液相色谱法纯化(Mirmira, R.G.和Tager, H.S., 1989. J. Bioi. Chem. 264: 6349-6354)。该方案采用：(i)表示残基(N)-GF*FYTKPT的合成八肽(包括修饰后的残基(F*)和“KP”取代(下划线)；SEQ. ID. NO. 9)；和(ii)截短类似物去八肽[B23-B30]-胰岛素(DOI；SEQ. ID. NO. 15)。因为八肽通过互换ProB28和LysB29
(斜体)而不同于野生型B23-B30序列(GFFYTPKT；SEQ.
ID. NO. 10)，所以在胰蛋白酶处理期间不需要保护赖氨酸的ε-氨基。简言之，在该方案中，将去八肽胰岛素(150 mg)和八肽(150
mg)溶于含有10 mM乙酸钙和1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)的二甲基乙酰胺/1,4-丁二醇/0.2 M Tris乙酸盐(pH
8)混合物(35:35:30，v/v，4 mL)中。相对于DOI的5倍摩尔过量的八肽，确保通过底物饱和来防止胰蛋白酶的逆反应(蛋白水解方向)。用0.1 mL N-甲基吗啉调节最终pH至7.0。将溶液冷却至12℃，加入1.5 mg胰蛋白酶并于12℃下孵育2天。24小时后再加入1.5 mg胰蛋白酶。用0.1%三氟乙酸酸化反应物，将其通过制备型反向HPLC
(C4)纯化。然后可通过使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF；Applied
Biosystems，Foster City，CA)来确证产物。固相合成的一般方案如Merrifield等(1982. Biochemistry 21: 5020-5031)所述。9-芴-9-基-甲氧基-羰基(F-moc)保护的苯丙氨酸类似物可自Chem-Impex
International (Wood Dale，IL)市购。
可用Aviv分光偏振计在4℃和25℃获得圆二色性(CD)谱(Weiss等, Biochemistry
39: 15429-15440)。样品可在50 mM磷酸钾(pH 7.4)中含有大约25 μM KP-胰岛素或类似物；将样品于25℃稀释至5 μM用于胍诱导的变性研究。为了求出解折叠的自由能，通过非线性最小二乘将变性转换拟合至二态模型，参见Sosnick等，Methods Enzymol. 317: 393-409。简而言之，按照以下方程式，通过非线性最小二乘程序将CD数据θ(x)
(其中x表示变性剂的浓度)拟合：
其中x为胍的浓度，其中θ A 和θ B 为天然和解折叠状态的基线值。通过转换前和转换后曲线求出基线近似值
将相对活性定义为置换50%特异性结合的125I-人胰岛素所需要的类似物与野生型人胰岛素的比率。如本领域已知的，使用含有胰岛素受体(IR)的人胎盘膜制备物。在选定浓度的未标记类似物存在下，将膜碎片(0.025 mg蛋白质/管)与125I标记的胰岛素(约30,000 cpm)在最终体积为0.25
ml的0.05 M Tris-HCl和0.25% (重量/体积)牛血清白蛋白(pH 8)中于4℃温育18小时。温育后，将混合物用1 ml冰冷的缓冲液稀释，于4℃离心(10,000g) 5分钟。然后通过吸出除去上清液，统计膜沉淀的放射性。针对非特异性结合(在1 μM人胰岛素存在下相关的放射性残余膜的量)校正数据。在所有测定中，在缺乏竞争性配体时结合的示踪剂的百分比小于15%以避免配体消耗假象。可使用本领域已知的微量滴定板抗体俘获，进行另外的胰岛素受体结合测定以监测胰岛素类似物于37℃温育期间活性的改变。将微量滴定条板(Microtiter strip plates) (Nunc
Maxisorb)于4℃与AU5 IgG
(100 µl/孔，40 µg/ml，于磷酸缓冲盐溶液中)一起温育过夜。可通过二部位序贯模型(two-site sequential model)对结合数据进行分析。可采用使用IGF I型受体的相应微量测定板抗体测定法评价与该同源受体的交叉结合。
在KP-胰岛素的情况下引入修饰的残基。所显示的活性值基于激素-受体解离常数与人胰岛素的比率；因此按定义人胰岛素的活性为1.0。活性值的标准误差一般低于25%。于25℃解折叠的自由能(∆Gu)根据推算至零变性剂浓度的二态模型估算。滞后时间表示在无锌磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4)中于37℃轻轻摇动时开始蛋白质原纤化所需要的时间(天)。
可在胰岛素类似物例如赖脯胰岛素(即是说，亦含有取代LysB28、ProB29的胰岛素类似物(以名称Humalog®出售))中进行本文提供的氯化-PheB24取代。所述胰岛素类似物命名为氯化-PheB24-KP-胰岛素。为比较目的，亦引入了氟取代，其基本上如上所述，但是在赖脯胰岛素的B24和B26位引入对氟化苯丙氨酸。在B24位含有对氟化苯丙氨酸取代的类似物命名为4F-PheB24-KP-胰岛素。在B26位含有对氟化苯丙氨酸取代(取代酪氨酸)的类似物命名为4F-PheB26-KP-胰岛素。为简洁起见，KP-胰岛素和DKP-胰岛素的各个类似物的名称在表和图中可缩写为省略“胰岛素”的KP和DKP。
对于B24处的氯化苯丙氨酸取代，使用了表示残基(N)-GF*FYTKPT的合成八肽(氯化苯丙氨酸残基表示为“F*”和“KP”取代(下划线)；SEQ. ID. NO. 9)和截短类似物去八肽[B23-B30]-胰岛素(B10位为野生型，SEQ. ID. NO. 15)。对于B26处的氟化苯丙氨酸取代，使用了表示残基(N)-GFFF*TKPT的合成八肽(氟化苯丙氨酸残基再次表示为“F*”和“KP”取代(下划线)；SEQ. ID. NO. 16)和截短类似物去八肽[B23-B30]-胰岛素(SEQ.
ID. NO. 15)。
得到的在赖脯胰岛素类似物背景中的B24或B26位的卤化苯丙氨酸取代的数据见下表1
表
1
赖脯胰岛素的卤化Phe类似物的稳定性和活性
原纤化测定。在玻璃小瓶中于温和搅动、pH 7.4和37℃下在无锌的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中孵育期间，一式三份评估了4Cl-PheB24-KP-胰岛素的物理稳定性。针对肉眼可见混浊在60 μM的蛋白质浓度下观察样品12天，每天两次取出等分样用于分析硫磺素-T
(ThT)荧光。因为ThT荧光在不存在淀粉样蛋白时是可忽略的，但在原纤化发生时则显著增强，所以本测定探测的是滞后时间。人胰岛素、KP-胰岛素和4Cl-PheB24-KP-胰岛素各自的滞后时间为5 ± 1天、3 ± 1天和多于12天。因此，在这些条件下，4Cl-PheB24-KP-胰岛素对原纤化的抗性为KP-胰岛素的至少4倍，为人胰岛素的至少2倍。尽管在理论上不希望限制专利性，设想4Cl-PheB24胰岛素类似物的原纤化抗性增加允许将其调配于无锌制剂中，以增强胰岛素类似物的速效特性而不显著缩短类似物样品的储存时间，而不论是在个体样品开始使用之前还是之后。
热力学稳定性。我们测量了pH 7.4和25℃时在无锌缓冲液(10 mM的磷酸钾和50 mM KCl)中4Cl-PheB24-KP-胰岛素相对于KP-胰岛素和LysA8-KP-胰岛素的解折叠自由能。该测定利用在螺旋敏感波长222 nm下所探测的胍诱导的变性的CD检测。通过基于二态模型的解折叠自由能来将ΔGu值推算至零变性剂浓度以获得估计值。尽管ThrA8→Lys取代增加热力学稳定性达0.6 ± 0.2千卡/摩尔，但4Cl-PheB24修饰降低稳定性达0.4 ± 0.2千卡/摩尔。
4Cl-PheB24-KP-胰岛素-A8T与去垢剂增溶的和凝集素纯化的胰岛素受体(B同工型)的亲和力类似于人胰岛素。用125I-标记的人胰岛素作为示踪剂的竞争性置换测定示于使用分离的胰岛素受体(B同工型)的图3A：人胰岛素(三角形)、KP胰岛素(方形)、4Cl-PheB24-KP-胰岛素(倒三角形)。所有三条曲线紧密排列，表明相似的受体结合亲和力。4Cl-PheB24-KP胰岛素对胰岛素受体的亲和力与KP-人胰岛素无差别，每一种情况皆稍低于野生型胰岛素的亲和力。
图3B显示采用胰岛素样生长因子I受体(IGF-1R)的相应测定的结果，该测定通过使用125I-标记的IGF-I作为示踪剂的竞争性置换来进行探测。符号相同并外加天然IGF-I
(圆形)。4Cl-PheB24-KP-胰岛素曲线的右移表明与IGF-1R的交叉结合降低。4Cl-PheB24-KP-胰岛素与IGF-1R的交叉结合降低至KP-胰岛素或野生型胰岛素的约1/3。
用分离的胰岛素受体(B同工型)在人胰岛素(实黑线)、KP-胰岛素(虚线)、4Cl-PheB24-KP-胰岛素(三角形)、4F-PheB24-KP-胰岛素(方形)之间进行的相似比较见图3C。4FPheB24-KP-胰岛素曲线相对于4Cl-PheB24-KP-胰岛素、野生型人胰岛素和赖脯胰岛素的右移显示，与B24位苯丙氨酸的对氯取代相比，在苯丙氨酸环上同一位置使用不同卤素降低了受体结合亲和力。相反，4Cl-PheB24-KP-胰岛素的胰岛素受体结合亲和力类似于野生型人胰岛素和赖脯(KP)胰岛素的亲和力。
用分离的胰岛素受体(B同工型)在人胰岛素(实线)、KP-胰岛素(虚线)、4Cl-PheB26-KP-胰岛素(三角形)、4F-PheB26-KP-胰岛素(方形)之间进行的更多比较见图3D。与野生型和赖脯胰岛素相比，4Cl-PheB26-KP-胰岛素和4FPheB26-KP-胰岛素二者都表现出降低的胰岛素受体结合亲和力。如上所述，4Cl-PheB24-KP-胰岛素并不显示类似的受体结合亲和力降低。
在糖尿病大鼠中，4Cl-PheB24-KP-胰岛素的体内功效类似于KP-胰岛素。为了能够表征生物学活性，用链脲佐菌素使雄性Lewis大鼠(约300 g体重)患糖尿病。通过HPLC纯化人胰岛素、KP-胰岛素和4Cl-PheB24-KP-胰岛素，干燥成粉末，并溶解于胰岛素稀释剂(Eli
Lilly Corp)中。在时间= 0时给大鼠皮下注射含20 μg或6.7 μg的KP-胰岛素或4Cl-PheB24-KP-胰岛素的100 μl稀释剂；较高剂量处于野生型胰岛素剂量反应曲线的坪值，而较低剂量对应于葡萄糖处理的最大初始速率的50-70%。进行仅稀释剂的注射作为阴性对照。每组研究了8只大鼠。在0时和以连续间隔直至120分钟从剪断的尾巴尖端获得血液。用Hypoguard
Advance Micro-Draw测量仪来测量血糖。如图4所示，观察到血糖浓度降低。对4Cl-PheB24-KP-胰岛素(-225 ± 29 mg/dl/h)、KP-胰岛素(-256 ± 35 mg/dl/h)和人胰岛素(-255
± 35 mg/dl/h)进行比较时，注射后的最初24分钟期间血糖浓度降低的初始速率类似。初始速率的任何差异在统计学上都不显著。然而，在接下来的60分钟内，与人胰岛素或KP-胰岛素的持续时间相比，4Cl-PheB24-KP-胰岛素作用的持续时间似乎更短。
考虑到4Cl-PheB24-KP-胰岛素的天然的受体结合亲和力，其功效低于人胰岛素是不同寻常的。实际上，相对于野生型具有在30-100%范围内的相对亲和力的胰岛素类似物通常在体内表现出天然功效。然而，4Cl-PheB24-KP-胰岛素的生物学功效稍微低于(基于摩尔)人胰岛素或KP-胰岛素的功效在形式上是可能的。如果这样的话，我们注意到任何这类降低都在临床上使用的现行胰岛素产品的摩尔活性的三倍范围之内(按照惯例将各自的国际单位(IU)重新定义以反映葡萄糖降低的程度，这导致各产品之间在毫克/单位或纳摩尔/单位的数量上的差异)。应该注意，无蛋白的稀释剂对照注射时的血糖浓度的缓慢降低(图4中的棕色虚线)反映的是接受注射后的动物白天的禁食。
胰岛素六聚体分解的药代动力学(命名为EDTA螯合测定)的替代标志物采用钴离子(Co2+)而非锌离子(Zn2+)，以介导六聚物装配。虽然Co2+和Zn2+六聚体在结构上类似，但钴离子因其未填充的d-电子层而提供便利的分光镜探针。
测定原理如下。R6苯酚稳定的Co2+胰岛素六聚体溶液因四面体Co2+配位而为蓝色；分解时蛋白质溶液为无色，因为八面体Co2+与水或EDTA (乙二胺四乙酸，一种金属离子的强螯合剂)的配位在可见波长下由于配位场理论而无光学跃迁。EDTA螯合测定利用如下光谱特征。在t = 0时，将摩尔过量的EDTA加入到R6胰岛素六聚体或胰岛素类似物六聚体溶液中。虽然EDTA本身并不攻击六聚体来剥夺六聚体的金属离子，但瞬时六聚体分解过程中所释放的任何Co2+离子被该螯合剂捕获，并因此不可用于重新装配。因此，蓝色(R-特异性的胰岛素结合的Co2+在574 nm下的四面体d-d光学跃迁)的消失率提供六聚体分解动力学的光学信号特征。
在加入2 mM EDTA之前和之后，测定了显示400-750 nm特征光谱曲线的胰岛素钴溶液的平均迹线(图5A-C)。将样品溶解于50 mM Tris (pH 7.4)、50 mM苯酚和0.2 mM CoCl2中。然后加入NaSCN至终浓度为1 mM。亦显示了如在574 nm (25℃和pH 7.4)下所监测的加入2 mM EDTA后的六聚体离解动力学。在EDTA提取前类似物的光谱以实线显示。EDTA提取后的光谱以虚线显示。图A显示野生型，图B显示KP-胰岛素，图C显示4Cl-PheB24-KP-胰岛素。每一样品的数据标准化至零时。
在一方面，六聚化的钴络合物在t = 0时的基线光吸收谱在野生型胰岛素六聚体、KP胰岛素六聚体和4Cl-PheB24-KP-胰岛素六聚体之间类似(见图5A-5C)。这些各自的d-d电子跃迁的相似形状和大小，意味着在野生型和变体六聚体中的金属离子处于相似的R6特异性四面体配位位点。因为这意味着4Cl-PheB24-KP-胰岛素保留了金属离子介导的装配并因此基于锌的制剂的能力，所以该结果意义重大。
加入2 mM EDTA后在574 nm (25℃和pH 7.4)下监测的六聚体离解动力学显示，野生型和变体六聚体在EDTA介导的Co2+螯合率上表现出显著的不同。正如所期望的那样，野生型六聚体表现出最大的动力学稳定性(图5D中的实线)，接着是KP-胰岛素(图5D中的虚点线)和4-Cl-PheB24-KP-胰岛素(图5D中的点线)。各自的半衰期为481秒(野生型)、363秒(KP胰岛素)和66秒(4Cl-PheB24-KP-胰岛素)。因此，对-氯-芳族取代诱导的加速程度比与赖脯胰岛素(Humalog™) “KP转换”相关的加速程度更深远。因为锌离子从皮下注射位点的扩散类似于EDTA螯合测定中钴离子的体外螯合，所以这些发现预测出4Cl-PheB24-KP-胰岛素将表现出吸收的显著加速。
在未成年Yorkshire家养猪(重25-45 kg)中，相对于野生型胰岛素(Humulin™；Eli Lilly and Co.)和KP-胰岛素(Humalog™)研究了4-Cl-PheB24-KP-胰岛素的药代动力学(PK)和药效学(PD)特性和功效。使用由销售商(Eli Lilly and
Co.)以U-100强度提供的野生型胰岛素和KP-胰岛素。在Lilly稀释剂中配制4-Cl-PheB24-KP-胰岛素，其中蛋白质与锌离子的比值类似于野生型和KP-胰岛素产品中的比值，4-Cl-PheB24-KP-胰岛素的强度为U-87。在研究的当天，用Telazol对每只动物进行麻醉诱导，然后用异氟烷进行全身麻醉。对每一动物进行气管插管，连续监测氧饱和和呼气末呼出的CO2。在开始钳夹试验之前约30分钟和其后的每两个小时，给猪皮下注射醋酸奥曲肽(44 μg/kg)，以阻止内源的胰腺α和β细胞分泌。在放置IV导管并用10%葡萄糖输注建立基线血糖正常后，经由导管给予胰岛素的IV注入。为了定量测量外周胰岛素介导的葡萄糖摄取，给予可变的葡萄糖输注速率，以维持血糖浓度为大约85 mg/dl。所述葡萄糖输注通常需要5-8小时，直到葡萄糖输注速率回到胰岛素前基线。每隔10分钟用Hemocue 201手提式葡萄糖分析仪来测量葡萄糖浓度(仪器误差率：1.9%)。葡萄糖钳夹的计算机化方案如Matthews等所述。亦根据下述时间表来获得用于胰岛素测定的2-ml血液样品：胰岛素递送后的0-40分钟：5-分钟间隔；50-140分钟：10-分钟间隔；160分钟至GIR回到基线的时刻：20-分钟间隔。为分析PK/PD，应用了20-分钟移动平均曲线拟合和过滤。按照至早期半数最大效应的时间(½ Tmax早期)、至后期半数最大效应的时间(½ Tmax后期)、至最大效应的时间和相对于基线的曲线下面积(AUC)测量PD。对于每一个这些分析，使用拟合曲线，而非原始数据。对3只猪中的每一只进行三项研究。图6-9提供了这些研究的结果。
发现4-Cl-PheB24-KP-胰岛素(图6中缩写为4-Cl-赖脯胰岛素)显示比KP-胰岛素或野生型胰岛素显著较不延长的后期“尾部”。对胰岛素作用改进的关闭表明关于后期餐后低血糖潜在的临床益处。
图7概述在猪中的20个药效学研究，其证明在五种不同给药水平0.05 U/kg、0.1
U/kg、0.2 U/kg、0.5
U/kg和1 U/kg下，4Cl-PheB24-KP-胰岛素相对于KP-胰岛素在½ T-max后期方面的显著改善。
图8概述在猪中的14个药效学研究，其证明在三种不同给药水平0.05 U/kg、0.1
U/kg和0.2 U/kg下，4Cl-PheB24-KP-胰岛素相对于KP-胰岛素在½ T-max早期方面的改善。
图9概述十个匹配的药效学研究，其比较了通过曲线下面积(AUC)测量的4Cl-PheB24-KP-胰岛素和KP胰岛素的相对功效，其中发现4-Cl-KP的平均功效稍微降低，但在统计学上不显著(p=0.22)。在相似的制剂条件(通过苯酚和间甲酚稳定的锌胰岛素六聚体或锌胰岛素类似物六聚体)下，4-Cl-PheB24-KP-胰岛素相对于野生型胰岛素和KP-胰岛素(赖脯胰岛素)的药代动力学(PK)和药效学(PD)特性显示，通过曲线下面积(AUC)方法测得的4Cl-PheB24-KP-胰岛素的功效与野生型胰岛素和KP-胰岛素的相似。
用于治疗患者的方法包括将氯化-PheB24取代的胰岛素类似物给予患者。在一个实例中，胰岛素类似物为4ClPheB24-KP胰岛素。该胰岛素类似物可任选在A8位含有组氨酸、赖氨酸或精氨酸取代。在另一个实例中，氯取代的胰岛素类似物可在设计以改变机体中类似物作用速率的胰岛素分子的另外位置另外含有一个或多个取代。在再一实例中，通过外部或可植入的胰岛素泵给予胰岛素类似物。本发明的胰岛素类似物亦可含有其它修饰，例如在B链的C-末端和A链的N末端之间的连接物，如共同待审美国专利申请号12/419169中所更全面阐述的。
药物组合物可包含所述胰岛素类似物，可任选包含锌。锌离子可以每胰岛素类似物六聚体2.2-3.0的摩尔比值的水平包含在所述组合物中。在这类制剂中，胰岛素类似物的浓度通常为约0.1-约3 mM，高达3 mM的浓度可用于胰岛素泵贮器中。进餐时间胰岛素类似物的修饰可如所述调配用于：(a) Humulin®
(Eli Lilly and Co.)、Humalog®
(Eli Lilly and Co.)、Novalin®
(Novo-Nordisk)和Novalog® (Novo-Nordisk)的“普通”制剂和目前批准用于人用的其它速效胰岛素制剂；(b)上述和其它胰岛素类似物的“NPH”制剂；和(c)这类制剂的混合物。如上所述，认为对原纤化的抗性增加可允许含有4Cl-PheB24的胰岛素类似物在不存在锌时调配，以使类似物的速效特性最大化，然而，亦认为即使在锌存在时，含有4Cl-PheB24的胰岛素类似物足够快地自六聚体离解为二聚体和单体，以至于亦认为其是速效胰岛素类似物制剂。
赋形剂可包括甘油、甘氨酸、其它缓冲剂和盐以及抗微生物防腐剂，例如苯酚和间甲酚；已知后一防腐剂提高胰岛素六聚体的稳定性。可通过将生理学上有效量的组合物给予患者，而将这类药物组合物用于治疗患有糖尿病或其它医学病况的患者。
还设想包含编码多肽的序列的核酸，其编码胰岛素类似物，并含有编码至少一个胰岛素B链的序列，所述B链在B24位上具有氯化苯丙氨酸。如前所述(Furter, 1998, Protein Sci. 7:419-426; Xie等, 2005, Methods. 36: 227-238)，这可通过在B24位引入终止密码子(例如琥珀密码子，TAG)结合阻抑型tRNA (使用琥珀密码子时的一种琥珀抑制子)和相应的tRNA合成酶来实现，其在响应终止密码子时将非标准氨基酸掺入多肽。具体序列可取决于核酸序列将引入其中的物种的优选密码子使用。所述核酸还可编码野生型胰岛素的其它修饰。所述核酸序列可编码在所述多肽或者修饰的胰岛素原类似物的其它位置含有无关取代或延伸的修饰A链或B链序列。核酸还可以是表达载体的一部分，且可将该载体插入宿主细胞，例如原核宿主细胞(像大肠杆菌(E. coli)细胞系)或真核细胞系例如酿酒酵母(S. cereviciae)或巴斯德毕赤酵母(Pischia
pastoris)菌株或细胞系。
例如，设想可合成合成基因以指导B链多肽在巴斯德毕赤酵母和其它微生物中表达。在B24位利用终止密码子以便在该位置掺入氯化苯丙氨酸的B链多肽的核苷酸序列可以是下列序列或其变体之一：
(a)具有人密码子偏好：
(b)具有毕赤酵母(Pichia)密码子偏好：
相似地，具有人密码子偏好并在B24位利用终止密码子以在该位置掺入氯化苯丙氨酸的全长胰岛素原cDNA，可具有SEQ. ID NO. 13的序列
同样地，在B24位利用终止密码子以在该位置掺入氯化苯丙氨酸并具有巴斯德毕赤酵母偏好的密码子的全长人胰岛素原cDNA，可具有SEQ. ID NO. 14的序列
基于前述公开内容，氯取代的胰岛素类似物将实现上文所述的目标现在应该是显而易见的。也就是说，这些胰岛素类似物具有提高的热力学稳定性、对原纤化的抗性和降低血糖水平的功效。含有氯取代的苯丙氨酸的胰岛素类似物还降低了与胰岛素样生长因子(IGFR)的交叉反应性。因此，要理解的是，任何变化明显都落入要求保护的发明的范围内，因此，可以确定具体组成要素的选择而又不偏离本文公开和描述的本发明的精神。
引用下列文献以表明本文所述测试和测定方法应为本领域普通技术人员所了解。
Furter,
R., 1998. Expansion of the genetic code: Site-directed p-fluoro-phenylalanine
incorporation in Escherichia coli (遗传密码的扩展：在大肠杆菌中的位点定向对氟苯丙氨酸掺入).
Protein Sci. 7:419-426.
Matthews D.R., Hosker J.P. 1989. Unbiased and flexible iterative computer
program to achieve glucose clamping (获得葡萄糖钳夹的无偏倚的灵活迭代的计算机程序). Diabetes
Care. 12: 156-9.
Merrifield, R.B., Vizioli, L.D.和Boman,
H.G. 1982. Synthesis of the antibacterial peptide cecropin A (1-33) (抗菌肽杀菌肽A (1-33)的合成). Biochemistry
21: 5020-5031.
Mirmira, R.G.和Tager, H.S.
1989. Role of the phenylalanine B24 side chain in directing insulin interaction
with its receptor: Importance of main chain conformation (苯丙氨酸B24侧链在指导胰岛素与其受体相互作用中的作用：主链构象的重要性). J.
Bioi. Chem. 264: 6349-6354.
Sosnick, T.R., Fang, X.和Shelton, V.M.
2000. Application of circular dichroism to study RNA folding transitions (研究RNA折叠转换的圆二色性的应用). Methods
Enzymol. 317: 393-409.
Wang, Z.X. 1995. An exact mathematical expression for describing
competitive biding of two different ligands to a protein molecule (用于描述两种不同配体与蛋白质分子竞争结合的准确数学表达式). FEES Lett. 360:
111-114.
Weiss, M.A., Hua, Q.X., Jia, W., Chu, Y.C., Wang, R.Y.和Katsoyannis, P.G. 2000. Hierarchiacal protein
"un-design": insulin's intrachain disulfide bridge tethers a
recognition α-helix (等级蛋白质“设计解析”：胰岛素链内二硫键系链识别α-螺旋). Biochemistry 39: 15429-15440.
Whittaker, J.和Whittaker, L.
2005. Characterization of the functional insulin binding epitopes of the full
length insulin receptor (全长胰岛素受体的功能性胰岛素结合表位的表征). J.
Bioi. Chem. 280: 20932-20936.
Xie, J.和Schultz, P.G. 2005. An expanding genetic
code (扩展的遗传密码). Methods. 36: 227-238。
Claims (15)
1. 一种包含掺入了氯化苯丙氨酸的B链多肽的胰岛素类似物。
2. 权利要求1的胰岛素类似物，其中所述氯化苯丙氨酸位于B24位。
3. 权利要求2的胰岛素类似物，其中所述氯化苯丙氨酸为对单氯苯丙氨酸。
4. 权利要求1-3中任一项的胰岛素类似物，其中所述类似物为哺乳动物胰岛素的类似物。
5. 权利要求4的胰岛素类似物，其中所述类似物为人胰岛素的类似物。
6. 权利要求4的胰岛素类似物，其中所述B链多肽包含选自SEQ. ID. NO. 4-8和其具有三个或更少的另外氨基酸取代的多肽的氨基酸序列。
7. 一种编码权利要求4的胰岛素类似物的核酸。
8. 权利要求6的核酸，其中所述氯化苯丙氨酸由终止密码子编码。
9. 权利要求7的核酸，其中所述终止密码子是核酸序列TAG。
10. 一种包含权利要求7、8或9的核酸序列的表达载体。
11. 一种用权利要求10的表达载体转化的宿主细胞。
12. 一种治疗患者的方法，所述方法包括将生理学上有效量的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐给予所述患者，其中所述胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐含有掺入了氯化苯丙氨酸的B链多肽。
13. 权利要求12的方法，其中所述氯化苯丙氨酸位于B24位。
14. 权利要求13的方法，其中所述氯化苯丙氨酸为对单氯苯丙氨酸。
15. 权利要求14的方法，其中所述B链多肽包含选自SEQ. ID. NO. 4-8和其具有三个或更少的另外氨基酸取代的多肽的氨基酸序列。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28595509P | 2009-12-11 | 2009-12-11 | |
| US61/285,955 | 2009-12-11 | ||
| PCT/US2010/060085 WO2011072288A2 (en) | 2009-12-11 | 2010-12-13 | Insulin analogues with chlorinated amino acids |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102762589A true CN102762589A (zh) | 2012-10-31 |
Family
ID=44146220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010800636163A Pending CN102762589A (zh) | 2009-12-11 | 2010-12-13 | 带有氯化氨基酸的胰岛素类似物 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9079975B2 (zh) |
| EP (1) | EP2509995A4 (zh) |
| JP (1) | JP5866120B2 (zh) |
| CN (1) | CN102762589A (zh) |
| AU (1) | AU2010327949A1 (zh) |
| BR (1) | BR112012014025A2 (zh) |
| CA (1) | CA2783763A1 (zh) |
| EA (1) | EA201200717A1 (zh) |
| IL (1) | IL220284A0 (zh) |
| MX (1) | MX2012006568A (zh) |
| MY (1) | MY189079A (zh) |
| NZ (1) | NZ600477A (zh) |
| RU (1) | RU2012123642A (zh) |
| SG (1) | SG181527A1 (zh) |
| WO (1) | WO2011072288A2 (zh) |
| ZA (1) | ZA201204308B (zh) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8343914B2 (en) | 2006-01-06 | 2013-01-01 | Case Western Reserve University | Fibrillation resistant proteins |
| WO2008043033A2 (en) | 2006-10-04 | 2008-04-10 | Case Western Reserve University | Fibrillation-resistant insulin and insulin analogues |
| US8993516B2 (en) | 2008-04-14 | 2015-03-31 | Case Western Reserve University | Meal-time insulin analogues of enhanced stability |
| KR20120129875A (ko) | 2008-07-31 | 2012-11-28 | 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티 | 염소화 아미노산을 갖는 인슐린 유사체 |
| WO2011072288A2 (en) | 2009-12-11 | 2011-06-16 | Case Western Reserve University | Insulin analogues with chlorinated amino acids |
| US9200053B2 (en) | 2008-07-31 | 2015-12-01 | Case Western Reserve University | Insulin analogues containing penta-fluoro-Phenylalanine at position B24 |
| US8399407B2 (en) | 2009-09-17 | 2013-03-19 | Case Western Reserve University | Non-standard insulin analogues |
| WO2013010048A2 (en) | 2011-07-13 | 2013-01-17 | Case Western Reserve University | Non-standard insulin analogues |
| US10405961B2 (en) | 2013-03-14 | 2019-09-10 | Cell and Molecular Tissue Engineering, LLC | Coated surgical mesh, and corresponding systems and methods |
| US10130288B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-11-20 | Cell and Molecular Tissue Engineering, LLC | Coated sensors, and corresponding systems and methods |
| BR112016016290A2 (pt) | 2014-01-13 | 2017-10-03 | Thermalin Diabetes Llc | Composições farmacêuticas de insulina de ação rápida, conjunto de infusão, sistema de conjunto de infusão e usos de análogos monoméricos ou diméricos de insulina |
| JP6745468B2 (ja) * | 2014-02-28 | 2020-08-26 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 改変タンパク質及びその製造方法 |
| AU2015328222B9 (en) | 2014-10-06 | 2020-12-24 | Case Western Reserve University | Biphasic single-chain insulin analogues |
| US20240190937A1 (en) * | 2021-04-22 | 2024-06-13 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Human insulin c-alpha-peptides and methods of use |
| WO2023041758A1 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-23 | Kyon Biotech Ag | Arginase-insulin fusion protein |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5422339A (en) * | 1991-03-19 | 1995-06-06 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Peptides having insulin autoantibody but not insulin receptor binding capacity |
| WO2003053339A2 (en) * | 2001-12-20 | 2003-07-03 | Eli Lilly And Company | Insulin molecule having protracted time action |
| WO2010014946A2 (en) * | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Case Western Reserve University | Halogen-stabilized insulin |
Family Cites Families (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PH25772A (en) | 1985-08-30 | 1991-10-18 | Novo Industri As | Insulin analogues, process for their preparation |
| EP0425482B1 (en) | 1988-07-20 | 1993-08-18 | Novo Nordisk A/S | Human insulin analogs and preparations containing them |
| US5716927A (en) | 1988-12-23 | 1998-02-10 | Novo Nordisk A/S | Insulin analogs having a modified B-chain |
| DE3844211A1 (de) | 1988-12-29 | 1990-07-05 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| US5514646A (en) | 1989-02-09 | 1996-05-07 | Chance; Ronald E. | Insulin analogs modified at position 29 of the B chain |
| DE3936876A1 (de) | 1989-11-06 | 1991-05-23 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| CZ342492A3 (en) | 1991-11-26 | 1993-06-16 | Lilly Co Eli | Derivatives of tri-arginine insulin, process of their preparation and a pharmaceutical composition in which said derivatives are comprised |
| DE9115660U1 (de) | 1991-12-18 | 1992-07-30 | Aventis Research & Technologies GmbH & Co KG, 65929 Frankfurt | L-Phenylalanyl-tRNA-Synthetase mit erweiterter Substratselektivität aus Mikroorganismen |
| US6011007A (en) * | 1993-09-17 | 2000-01-04 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin |
| US5547929A (en) | 1994-09-12 | 1996-08-20 | Eli Lilly And Company | Insulin analog formulations |
| US20030104981A1 (en) | 1995-11-03 | 2003-06-05 | Jelena Mandic | Human insulin analogues |
| DE19652713C2 (de) | 1996-12-18 | 2001-11-22 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch Chromatographie an stark saurem Kationenaustauscher |
| DE19726167B4 (de) | 1997-06-20 | 2008-01-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung |
| CO4970769A1 (es) | 1997-10-24 | 2000-11-07 | Lilly Co Eli | Composiciones insolubles de insulina do de insulina para el control de la glucosa en la sangre y el proceso para la preparacion de las composiciones |
| US6531448B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-03-11 | Eli Lilly And Company | Insoluble compositions for controlling blood glucose |
| US6537806B1 (en) * | 1998-06-02 | 2003-03-25 | University Of Washington | Compositions and methods for treating diabetes |
| US7449443B2 (en) | 2000-03-23 | 2008-11-11 | California Institute Of Technology | Method for stabilization of proteins using non-natural amino acids |
| US7316999B2 (en) * | 2000-06-02 | 2008-01-08 | Novo Nordisk A/S | Glucose dependent release of insulin from glucose sensing insulin derivatives |
| KR100449454B1 (ko) | 2000-10-02 | 2004-09-21 | 이현철 | 단일사슬 인슐린 유도체의 유전자를 포함하는 당뇨병치료용 벡터 |
| US20070293426A1 (en) * | 2001-04-02 | 2007-12-20 | Hans-Ulrich Demuth | Methods for improving islet signaling in diabetes mellitus and for its prevention |
| AU2002346491A1 (en) | 2001-12-19 | 2003-07-09 | Eli Lilly And Company | Crystalline compositions for controlling blood glucose |
| AU2003226619A1 (en) | 2002-03-26 | 2003-10-08 | Council Of Scientific And Industrial Research | An adipocyte insulin and a method of treating diabetes |
| WO2003093299A2 (en) | 2002-05-06 | 2003-11-13 | Thomas Jefferson University | Insulin-associated peptides with effects on cerebral health |
| EP1620465A2 (en) | 2003-04-29 | 2006-02-01 | Eli Lilly And Company | Insulin analogs having protracted time action |
| PL1633876T3 (pl) | 2003-06-17 | 2009-01-30 | Sembiosys Genetics Inc | Sposoby wytwarzania insuliny w roślinach |
| WO2005039624A1 (en) * | 2003-10-24 | 2005-05-06 | Theratechnologies Inc. | Use of ghrelin and unacylated ghrelin compostions in insulin-related disease conditions |
| JP5697831B2 (ja) | 2003-12-03 | 2015-04-08 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 単鎖インシュリン |
| US8343914B2 (en) | 2006-01-06 | 2013-01-01 | Case Western Reserve University | Fibrillation resistant proteins |
| WO2007096332A1 (en) | 2006-02-21 | 2007-08-30 | Novo Nordisk A/S | Single-chain insulin analogues and pharmaceutical formulations thereof |
| ES2504521T3 (es) * | 2006-03-03 | 2014-10-08 | California Institute Of Technology | Incorporación específica del sitio de aminoácidos en moléculas |
| WO2008043033A2 (en) | 2006-10-04 | 2008-04-10 | Case Western Reserve University | Fibrillation-resistant insulin and insulin analogues |
| US8673852B2 (en) * | 2006-11-10 | 2014-03-18 | Genervon Biopharmaceuticals, LLC | Methods of treating neuronal disorders using MNTF peptides and analogs thereof |
| US7790677B2 (en) | 2006-12-13 | 2010-09-07 | Elona Biotechnologies | Insulin production methods and pro-insulin constructs |
| AU2009203809B2 (en) | 2008-01-09 | 2013-07-25 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Novel insulin derivatives having an extremely delayed time-action profile |
| US8993516B2 (en) | 2008-04-14 | 2015-03-31 | Case Western Reserve University | Meal-time insulin analogues of enhanced stability |
| MX2010011329A (es) | 2008-04-22 | 2011-03-15 | Univ Case Western Reserve | Analogos de insulina especificos de isoforma. |
| WO2011072288A2 (en) | 2009-12-11 | 2011-06-16 | Case Western Reserve University | Insulin analogues with chlorinated amino acids |
| KR20120129875A (ko) | 2008-07-31 | 2012-11-28 | 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티 | 염소화 아미노산을 갖는 인슐린 유사체 |
| RU2011125366A (ru) * | 2008-12-05 | 2013-01-10 | Ангиочем Инк. | Конъюгаты терапевтических пептидов и их применение |
| US20120184488A1 (en) | 2009-09-01 | 2012-07-19 | Case Western Reserve University | Insulin analogues of enhanced receptor-binding specificity |
| US8399407B2 (en) | 2009-09-17 | 2013-03-19 | Case Western Reserve University | Non-standard insulin analogues |
| WO2011103575A1 (en) | 2010-02-22 | 2011-08-25 | Case Western Reserve University | Long-acting insulin analogue preparations in soluble and crystalline forms |
-
2010
- 2010-12-13 WO PCT/US2010/060085 patent/WO2011072288A2/en active Application Filing
- 2010-12-13 JP JP2012543329A patent/JP5866120B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-12-13 EA EA201200717A patent/EA201200717A1/ru unknown
- 2010-12-13 MX MX2012006568A patent/MX2012006568A/es active IP Right Grant
- 2010-12-13 AU AU2010327949A patent/AU2010327949A1/en not_active Abandoned
- 2010-12-13 BR BR112012014025A patent/BR112012014025A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-12-13 MY MYPI2012700335A patent/MY189079A/en unknown
- 2010-12-13 US US13/515,192 patent/US9079975B2/en active Active
- 2010-12-13 CA CA2783763A patent/CA2783763A1/en not_active Abandoned
- 2010-12-13 NZ NZ600477A patent/NZ600477A/en not_active IP Right Cessation
- 2010-12-13 RU RU2012123642/10A patent/RU2012123642A/ru not_active Application Discontinuation
- 2010-12-13 CN CN2010800636163A patent/CN102762589A/zh active Pending
- 2010-12-13 EP EP10836802.8A patent/EP2509995A4/en not_active Withdrawn
- 2010-12-13 SG SG2012041398A patent/SG181527A1/en unknown
-
2012
- 2012-06-10 IL IL220284A patent/IL220284A0/en unknown
- 2012-06-12 ZA ZA2012/04308A patent/ZA201204308B/en unknown
-
2015
- 2015-06-22 US US14/745,859 patent/US9758563B2/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5422339A (en) * | 1991-03-19 | 1995-06-06 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Peptides having insulin autoantibody but not insulin receptor binding capacity |
| WO2003053339A2 (en) * | 2001-12-20 | 2003-07-03 | Eli Lilly And Company | Insulin molecule having protracted time action |
| WO2010014946A2 (en) * | 2008-07-31 | 2010-02-04 | Case Western Reserve University | Halogen-stabilized insulin |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BINGHAM EMMA M ET AL: "The role of insulin in human brain glucose metabolism an 18fluoro-deoxyglucose positron emission tomography study", 《DIABETES》, vol. 51, 31 December 2002 (2002-12-31), pages 3384 - 3390 * |
| LIU HONG-MEI ET AL: "Utilization of combined chemical modification to enhance the blood-brain barrier permeability and pharmacological activity of endomorphin-1", 《THE JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS》, vol. 319, no. 1, 31 December 2006 (2006-12-31), pages 308 - 316 * |
| QUAN BEILI ET AL: "Site specific introduction of unnatural amino acids at sites critical to insulin receptor recognition and biological activity", 《UNDERSTANDING BIOLOGY USING PEPTIDES》, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 311 - 312 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2013513391A (ja) | 2013-04-22 |
| US9079975B2 (en) | 2015-07-14 |
| BR112012014025A2 (pt) | 2017-01-31 |
| US20120277148A1 (en) | 2012-11-01 |
| EA201200717A1 (ru) | 2013-03-29 |
| AU2010327949A1 (en) | 2012-06-28 |
| CA2783763A1 (en) | 2011-06-16 |
| MX2012006568A (es) | 2012-12-17 |
| NZ600477A (en) | 2014-07-25 |
| RU2012123642A (ru) | 2014-01-20 |
| WO2011072288A2 (en) | 2011-06-16 |
| MY189079A (en) | 2022-01-25 |
| IL220284A0 (en) | 2012-07-31 |
| JP5866120B2 (ja) | 2016-02-17 |
| EP2509995A4 (en) | 2013-08-21 |
| WO2011072288A3 (en) | 2011-11-10 |
| ZA201204308B (en) | 2013-08-28 |
| US20150361153A1 (en) | 2015-12-17 |
| EP2509995A2 (en) | 2012-10-17 |
| US9758563B2 (en) | 2017-09-12 |
| SG181527A1 (en) | 2012-07-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9758563B2 (en) | Insulin analogues with chlorinated amino acids and nucleic acids encoding the same | |
| EP2318432B1 (en) | Halogen-stabilized insulin | |
| US9388228B2 (en) | Halogen-stabilized insulin | |
| US8343914B2 (en) | Fibrillation resistant proteins | |
| US8399407B2 (en) | Non-standard insulin analogues | |
| US10745458B2 (en) | Non-standard insulin analogues | |
| CN104010652A (zh) | 超浓缩的速效胰岛素类似物制剂 | |
| US9200053B2 (en) | Insulin analogues containing penta-fluoro-Phenylalanine at position B24 | |
| CN105142660A (zh) | N末端截短的胰岛素类似物 | |
| US10995129B2 (en) | Non-standard insulin analogues | |
| AU2013237740B2 (en) | Insulin analogues containing penta-fluora-phenyalanine at position B24 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1177746 Country of ref document: HK |
|
| AD01 | Patent right deemed abandoned |
Effective date of abandoning: 20170329 |
|
| AD01 | Patent right deemed abandoned |