HU206518B - Process for producing new insuline analogues and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents

Process for producing new insuline analogues and pharmaceutical compositions containing them Download PDF

Info

Publication number
HU206518B
HU206518B HU863754A HU375486A HU206518B HU 206518 B HU206518 B HU 206518B HU 863754 A HU863754 A HU 863754A HU 375486 A HU375486 A HU 375486A HU 206518 B HU206518 B HU 206518B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
asp
glu
human insulin
thr
insulin
Prior art date
Application number
HU863754A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT42526A (en
Inventor
Jens Jorgen Veilgaard Brange
Mogens Trier Hansen
Kjeld Norris
Original Assignee
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DK395685A external-priority patent/DK395685D0/da
Priority claimed from DK467785A external-priority patent/DK467785D0/da
Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Publication of HUT42526A publication Critical patent/HUT42526A/hu
Publication of HU206518B publication Critical patent/HU206518B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A jelen találmány új humán inzulin-analógokkal foglalkozik, amelyek azzal jellemezhetők, hogy szubkután injekcióként gyorsan hatnak a rohamok ellen, valamint ilyen inzulin-analógokat tartalmazó injektálható oldatokkal, és az új inzulin-analógok előállítási eljárásaival.
A Diabetes mellitus kezelésében a szakterületen eddig számtalan inzulin-készítményt javasoltak. Ezek közül a készítmények közül több gyorsan ható, míg mások többé-kevésbé nyújtott hatásúak,
A gyorsan ható inzulin-készítményeket akut helyzetben lehet alkalmazni, mint pl. hiperglikémiás kómában, sebészeti beavatkozás közben, terhességnél, és súlyos fertőzésekben. Ezenkívül a gyorsan ható inzulin-készítmények napi többszöri injekciója javíthatja az ellenőrzést azokban a cukorbetegekben, akiknél nehéznek bizonyul az ellenőrzés hosszan tartó inzulinnal.
Az elmúlt években növekvő érdeklődés volt egy olyan inzulin kezelés iránt, amely az egészséges organizmus béta-sejtjeiből való inzulin-kiválasztást közelíti, azaz az inzulin szolgáltatását az étkezésekkel kapcsolatban, és az alapvető inzulinszint fenntartását. A klinikai vizsgálatok kimutatták, hogy a cukorbetegek szerezhetnek csaknem normális inzulin és glükóz koncentrációkat napi egy nyújtott hatású inzulin-injekcióval az alapigény fedezésére, és ezt egészítik ki kis mennyiségű gyorsan ható inzulin-injekciók (emlékeztető oltás) a főétkezések előtt.
Gyorsan ható inzulinokat alkalmaznak közepesen és hosszan ható inzulinokkal együtt keverékekben olyan cukorbetegek kezeléséhez, akik erősebb kezdeti hatást is igényelnek a közepesen vagy hosszan ható inzulinok késleltetett hatásán kívül.
Végül a gyorsan ható inzulinokat használják a folyamatos inzulin-szolgáltató rendszerekben.
A gyorsan ható inzulin-oldatok szubkután injekciói révén egy beindulási késleltetést figyeltek meg az abszorpcióban [Binder: Diabetes Care. 7(2), 188— 199(1984)]. Késleltetés az abszorpcióban amely a hatás lassabb előrehaladását eredményezi, azonban nem kívánatos, amikor szoros metabolikus szabályozást célzunk meg. A gyorsan ható inzulin-oldatok összekeverése hosszan ható inzulin-készítményekkel továbbá a gyorsan ható inzulin abszorpciójának csökkentett sebességét eredményezheti.
Következésképpen szükség van gyorsan ható inzulin-oldatokra a hatás gyorsabb előrehaladásával szubkután injekciónál és a nyújtott inzulin készítményekkel való megjavított keverhetőséggel.
Az ismert gyorsan ható inzulin-oldatok további hátránya az inzulinnak az a hajlama, hogy a folyamatos inzulin-szolgáltatáshoz alkalmazott inzulin-oldatokban fibrillálódik és kicsapódik, ezáltal eltömve a mechanikus részeket és a szolgáltató katétereket.
Végül pedig szükség van másféle inzulin-készítményekre olyan betegek kezelésére, akik rezisztensek a normál inzulinra.
A jelen találmány tárgya új, gyorsan ható inzulin-oldatokat szolgáltatni az alábbi megjavult tulajdonságok közül eggyel vagy többel:
1. a hatás gyorsabb előrehaladása szubkután injekcióval vagy a beadás más útjaival;
2. megjavult összekeverhetőség a nyújtott hatású inzulin készítményekkel;
3. csökkent hajlam a fibrillálódásra, amikor beültethető szolgáltató rendszerben alkalmazzuk; és
4. alkalmazhatóság rezisztens betegek kezelésében (kis affinitás az előre létező antitestekhez).
A jelen találmány tárgyait a később leírt új humán inzulin-analógok injektálható vizes oldataival érjük el.
Nagy számú inzulin-analógot írtak le már eddig. Márki és munkatársai leírták olyan humán inzulin-analógok szintézisét [Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem., 360, 1619-1632(1979)], amelyek egyes aminosavak helyettesítésében különböznek a humán inzulintól, mégpedig a 2., 5„ 6., 7., 8., és 11., helyzetekben az A láncban, és az 5., 7., 13., 16., helyzetekben a B láncban, új bepillantást nyújtva az inzulin mesterséges szerkezetaktivitás kapcsolatába. További tanulmányok módosították a fő receptor kötőhelyeket az inzulinban [B(22)~B(26)], hogy megvizsgálják az ilyen változtatások hatását a receptor kötő aktivitásra. Az ismert humán inzulin-analógok azonban nem mutatják a jelen találmány feltalálói által kívánt tulajdonságokat.
Ismeretes, hogy a szulfáttá alakított inzulinnak lényegesen kisebb a hajlama a fibrillálódásra [Albisser és munkatársai: Desired Charasteristics of insulin to be used in infusion pumps (Az infúziós szivattyúzáshoz alkalmazandó inzulin kívánatos jellemzői), az US Pharmacopeial Convention című kiadványban (Rockville, Maryland), 84-95 (Gueriguian, J. L. és munkatársai szerkesztésében)], és kisebb antigén-tulajdonságot mutatnak. A szulfáttá alakított inzulin azonban legalább kilenc különböző inzulin-származék heterogén keveréke, amely molekulánként átlagosan 4,5 szulfátészter csoportot tartalmaz. A szulfáttá alakított inzulin ezenkívül csökkentett inzulinaktivitást mutat, amely a természetes inzulinnak mintegy 20%-a. A szulfáttá alakított inzulinoknak további hátránya a természetes inzulinhoz viszonyítva az, hogy szükségszerűen tartalmaznak olyan aminosav-gyököket, amelyek kémiailag módosítva vannak, azaz olyan aminosavakat, amelyek a természetben nem fordulnak elő.
A találmány tárgya ennek megfelelően eljárás olyan inzulin-analógok előállítására, amelyek homogének, nagyobb biológiai aktivitással rendelkeznek, mint a szulfáttá alakított inzulinok, és amelyek ezenkívül előnyösen csak természetben előforduló aminosavakat tartalmaznak.
Az „inzulin származékok” kifejezés itt olyan vegyületeket jelent, amelyeknek molekulaszerkezete a humán inzulinéhoz hasonló, beleértve a diszulfid-hidakat az A(7)Cys és B(7)Cys, illetve az A(20)Cys és B(19)Cys között, valamint egy belső diszulfid-hidat az A(6)Cys és A(ll)Cys között, és amelyek inzulin-aktivitással bírnak.
A találmány azon a meglepő tényen alapszik, hogy bizonyos inzulin-analógok, amelyekben a humán inzulin aminosavai közül legalább egy természetben előforduló másik aminosav-gyökkel van helyettesítve, a kívánt gyorsan ható aktivitást mutatják.
Szélesebben vizsgálva a jelen találmány új, gyorsan
HU 206518 Β ható inzulin-analógokat szolgáltat, amelyek a humán inzulin aminosav-gyökei közül legalább egynek a helyettesítésével alakulnak ki természetben előforduló más aminosavakkal; ezek kevesebb ön-összekapcsolódást idéznek elő dimerekké, tetramerekké, hexamerekké vagy polimerekké, és azonos töltéssel vagy több negatív töltéssel rendelkeznek semleges pH-η, mint a humán inzulin töltése.
Hogy az ön-összekapcsolódás csökkentett hajlamát idézzük elő dimerekké, tetramerekké, hexamerekké vagy polimerekké, előnyösen a humán inzulin bizonyos gyökeit helyettesítjük más aminosavakkal, amelyek inkább hidrofilek, mint a természetes aminosav-gyökök a molekula megfelelő helyzetében. Ezenkívül az inzulin molekulában bizonyos helyzeteknél a helyettesítés egy terjedelmes aminosav-gyökkel az inzulin molekuláknak szintén csökkentett hajlamát idézi elő arra, hogy dimerekké, tetramerekké, hexamerekké vagy polimerekké egyesüljenek.
Pontosabban meghatározva, a jelen találmány az (I) általános képletű új inzulin-származékokat nyújtja, ahol az (1) általános képletben
X a humán inzulin aminosav szekvenciájának megfelelő aminosav, melyek helyett a molekula alábbi helyzeteiben a következő aminosavak állhatnak:
A8: His, Gly, Gin, Glu, Ser, Asn, Asp vagy Pro,
A9: Gly, Asp, Glu, Thr, His, Gin, Asn, Alá vagy Pro, A10: Ser, Leu, Pro, Val, His, Alá, Glu, Asp, Thr, Gin vagy Asn,
A13:Pro, Ser, Val, Arg, His, Alá, Glu, Asp, Thr, Gly, Gin vagy Asn,
A21: Asp, Glu, Ser, Thr vagy Gly,
Β1: Glu, Asp, Thr, Ser vagy Gly,
B2 Arg, His, Alá, Glu, Asp, Thr, Pro, Gly, Gin, Ser vagy Asn,
B5: Glu, Asp, Thr, Ser, Gin vagy Asn,
B9: Asp, Pro, Glu, Ile, Leu, Val, His, Thr, Gin, Asn, Met, Tyr, Trp, Phe vagy Lys,
B10: Asp, Arg, Glu, Asn, Gin, Thr vagy Ser,
B12: Ile, Tyr, Asp vagy Glu,
B14: Glu, Asp, Asn, Ser, Thr vagy Gly,
B16: Asp, Glu, Gin, Asp, Ser, Thr, His vagy Arg,
B17: Ser, Thr, Asn, Gin, Glu, Asp vagy His,
B18: Ser, Thr, Asn, Glu, Gin, Asp vagy His,
B20: Gin, Ser, Asn, Asp, Glu vagy Arg,
B26, B27 és B28: Asp vagy Glu, azzal a feltétellel, hogy legalább egy X aminosav eltérő a humán inzulin molekula megfelelő helyén előforduló aminosavtól, és ha
X az A8 helyzetben His vagy Phe, vagy X az A21 helyzetben Asp, vagy X a B5 helyzetben Alá, vagy X a B9 helyzetben Leu, vagy X a B10 helyzetben Asn vagy Leu, vagy X a B12 helyzetben Asn, vagy X a B26 helyzetben Alá, akkor a fennmaradó X aminosavak közül legalább egy eltérő a humán inzulin molekula megfelelő helyén előforduló aminosavaktól.
Előnyösen az aminosav-gyök helyettesítéseknek legalább a többsége jobban hidrofil, mint a humán inzulin-molekulában a megfelelő helynél levő aminosav-gyök, és még előnyösebben az összeg aminosav-gyök helyettesítések jobban hidrofilek, mint a megfelelő humán inzulin aminosav-gyökök.
A hidrofil tulajdonságokra vonatkozóan Frömmel C. közleményére hivatkozunk [J. Theor. Bioi., 111, 247260.1. táblázat (1984)].
Az alábbiakban a találmány előnyös kiviteli módjait ismertetjük.
Az aminosav-gyök helyettesítések előnyösen Asp, Glu, Ser, Thr, His és Ile lehetnek, és még előnyösebben a negatív töltésű aminosavak, pl. az Asp és/vagy Glu.
Az új humán inzulin-analógok előnyösen Asp-t és Glu-t tartalmaznak a humán inzulin egy vagy több hidroxi-aminosava helyett, vagy a humán inzulin egy vagy több Gln-je vagy Asn-ja helyett.
Az új humán inzulin-analógok továbbá előnyösen tartalmaznak Ser-t és/vagy Thrt-t, vagy Asp-t és/vagy Glu-t a humán inzulin egy vagy több olyan aminosav-gyöke helyett, amely alifás és/vagy aromás oldallánccal rendelkezik.
Az új humán inzulin-analógok előnyösen His-t is tartalmazhatnak a humán inzulin egy vagy több olyan aminosav-gyöke helyett, amely alifás és/vagy aromás oldallánccal rendelkezik, vagy a humán inzulin egy vagy több hidroxi-aminosava helyett.
A helyettesítések előnyös helyei a B9, BIO, B12, B26, B27 és B28 helyeinél, előnyösebben a B9, B12, B27 és B28 helyeinél vannak, amely helyzetekben egy helyettesítés elegendő lehet, hogy az önegyesülésre csökkentett hajlamot és a beadásra sokkal gyorsabb hatást érjünk el.
A B9 helyzetben az aminosav-gyök helyettesítések előnyösen Asp, Glu, Gin, Asn és His lehetnek.
A B12 helyzetben az aminosav-gyök helyettesítések előnyösen Ile és Tyr lehetnek, míg a BIO helyzetben előnyösen Asp, Arg, Glu, Asn és Gin áll.
A jelen találmány további előnyös vegyületei azok az inzulin-analógok, amelyekben a helyettesítések a következő helyeken vannak: B27, B12, B9, (B27+B9), (B27+A21), (B27+B12), (B12+A21), (B27+B17), (B27+A13), (B27+B16), (B27+A10), (B27+B28), (B27+B26), (B27+B10), (B27+B1), (B27+B2), (B27+B5), (B27+B14) (B27+B18), (B27+B20), (B12+B17), (B12+A10), (B12+A13), (B12+B16), (B12+B1), (B12+B2), (B12+B5), (B12+B10), (B12+B26), (B12+B28), (B9+B17), (B9+A13), (B9+B16), (B9+A8), (B9+A9), (B9+A10), (B9+B1), (B9+B2), (B9+B5), (B9+B10), (B9+B12), (B9+B14), (B9+B28), (B9+B18), (B9+B20), (B9+B26), (B27+B9+A21), (B9+B27+A8), (B27+B12+A21), (B27+B12+B9), (B9+B12+B27+B17), (B9+B12+B27+A13), (B9+B12+B27+B16) és (Β 12+B16+B17+B27+A10+A13).
Az (I) általános képlet előnyös kiviteli formái a (IV), (V) és (VI) általános képletű vegyületek, amelyekben az X-ek jelentése a korábban megadott.
Az (I) általános képletre utalva a jelen találmány szerinti további előnyös inzulin-analógok azok, ame3
HU 206 518 Β lyekben X jelentése a B27 helyzetben Glu, X jelentése a B12 helyzetben He vagy Tyr, X jelentése az A21 helyzetben Asp és B27 helyzetben Glu, X jelentése a B9 helyzetben Asp, X jelentése az A21 helyzetben és a B9 helyzetben Asp és a B27 helyzetben Glu, X jelentése az A8 helyzetben His, a B9 helyzetben Asp és B27 helyzetben Glu, X jelentése a BIO helyzetben Asp, X jelentése a B28 helyzetben Asp, vagy X jelentése a B27 helyzetben Glu.
A jelen találmány tárgya továbbá inzulinaktivitással rendelkező injektálható oldatok előállítása. A jelen találmány szerinti injektálható oldatok a fentebb leírt inzulin-analógokat vagy gyógyászatilag elfogadható sóikat tartalmazzák vizes oldatban, előnyösen semleges pH-η. A vizes oldatot izotóniássá lehet tenni pl. nátrium-klorid és glicerin hozzáadásával. Puffereket, pl. acetát- vagy citrátpuffert és tartósítószereket, pl. m-krezolt, fenolt, vagy 4-hidroxi-benzoátot is lehet hozzáadni. Az inzulin-oldat tartalmazhat továbbá cinkionokat is.
A jelen találmány szerinti humán inzulin-analógok helyettesíthetik a humán vagy sertés inzulint az eddig a szakterületen ismert gyorsan ható oldatokban.
Az inzulin-analógok előállítása
A rekombináns DNS technológia megjelenése óta a fehérjetervezés lehetőségei óriásivá váltak. Az úgynevezett hely-specifikus mutagenezis technika segítségével lehetséges megváltoztatni egy természetben előforduló fehérjét kódoló gént, helyettesítve egy vagy több kodont a natív génben más, természetben előforduló aminosav(ak) kodonja(i)val. Egy más módszer szerint a módosított gént a jól ismert technika segítségével a teljes DNS szekvencia kémiai szintézisével lehet előállítani. A természetes fehérjéhez szolgáló gén ilyen manipulációjának a célja tipikusan az, hogy megváltoztassuk a természetes fehérje tulajdonságait egyik vagy másik célzott irányban.
Az új inzulin-analógokat úgy készíthetjük, hogy megváltoztatjuk a proinzulin gént kodonok helyettesítésével a megfelelő helyen a natív humán proinzulin génben olyan kodonokkal, amelyek a kívánt aminosavgyök helyettesítőket kódolják, vagy úgy, hogy szintetizáljuk a kívánt humán inzulin-analógot kódoló teljes DNS szekvenciát. Az új, módosított vagy szintetizált gént, amely a kívánt inzulin-analógot kódolja, azután megfelelő kifejeződő vektorba iktatjuk, amelyet azután átviszünk egy megfelelő gazdaorganizmusba, pl. E. coli-ba, Bacillusba vagy élesztőbe, ebben azután kialakul a kívánt termék. A kifejezett terméket azután a sejtekből vagy a tenyésztő közegből izoláljuk attól függően, vajon a kifejeződött tennék kiválasztódik-e a sejtekből vagy sem.
Az új inzulin-analógokat elő lehet állítani kémiai szintézissel is olyan módszerek segítségével, amelyek a Márki és munkatársai által leírt eljárással analógok [Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 360, 1619— 1632(1979)]. Ezeket lehet képezni külön-külön in vitro készített A- és B-láncokból, amelyek a megfelelő aminosav-gyök helyettesítéseket tartalmazzák, ezután a módosított A- és B-láncokat kapcsoljuk össze ismert módszerek szerint (pl. Chance és munkatársai: a „Peptides - Synthesis - Structure - Function” (Peptidek: Szintézis - Szerkezet - Működés) című kiadványban (szerkesztők: Rick, Ο. H. és Gross, E.) Proceedings of the Seventh American Peptid Symposium, Illinois, 721-728 oldal].
Az új inzulin-analógokat úgy állítjuk elő, hogy egy (II) általános képletű inzulin-származék prekurzort - ahol
Qn természetes aminosavból álló peptidlánc,
R Lys vagy Arg, n értéke 0-33, m értéke 0 vagy 1 és
X jelentése a fentiekben megadott, kódoló DNS-molekulát és egy hozzá működőképesen illesztett szignálszekvenciát expressziós plazmidba építünk, a plazmiddal élesztőt transzformálunk, majd az élesztőt tenyésztjük 25-37 °C hőmérsékleten, asszimilálható szén- és nitrogénforrást és ásványi sókat tartalmazó tápközegben a prekurzort elválasztjuk a tenyészet felülúszójából, és L-treonin-észterrel vagy sójával reagáltatjuk, tripszin vagy tripszin-származék jelenlétében, szerves oldószerben, majd a keletkezett treoninésztert savas vagy bázikus körülmények között a humán inzulin-származékká hidrolizáljuk.
A fenti „transzpeptidálási” reakciót a 4 343 898 lajstromszámú amerikai szabadalmi leírásban írják le.
A transzpeptidálási reakcióval a B láncban levő 29. aminosav és az A láncban levő 1. aminosav közti -(QnRn,)- hidat kimetsszük és egy treonin-észter csoportot kapcsolunk a B29 Lys C-terminális végéhez.
A fenti (II) általános képletű prekurzorokat például a 0 163 529A bejelentési számú európai nyilvánosságrahozatali iratban leírt módszerrel állíthatjuk elő. Ennek a módszemek a segítségével a szóban forgó prekurzort kódoló DNS szekvenciát iktatjuk be egy megfelelő kifejeződő vektorba, amelyet azután élesztőbe viszünk át, amely képes kifejezni és kiválasztani a kívánt vegyületet korrektül elhelyezett diszulfid-hidakkal. A kifejezett teiméket azután izoláljuk a tenyészközegből.
Az aminosavakhoz alkalmazott rövidítések azok, amelyet a J. Bioi. Chem., 243, 3358(1968) helyen található közleményben megállapítottak. Az aminosavak L-konfigurációjúak.
Amint ezt a későbbi szövegben alkalmazzuk, a B(l29) a humán inzulin egy rövidített B láncát jelenti Bl Phe-től B29 Lys-ig, és az A(l-21) a humán inzulin A láncát jelenti.
A jelen találmány gyakorlata szerint a humán inzulin molekulában végzett helyettesítéseket egy, a humán inzulinra utaló előjellel jelezzük. így pl. B27 Glu humán inzulin olyan humán inzulin-analógot jelent, ahol Glu helyettesíti a Thr-t a B lánc 27. helyzetében. A B27 Glu, B9 Asp humán inzulin olyan humán inzulin-analógot jelent, ahol Glu helyettesíti Thr-t a B lánc 27. helyzetében, és Asp helyettesíti a Sert-t a B lánc 9. helyzetében. A B27 Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l21) humán inzulin olyan inzulin-analóghoz szolgáló prekurzort jelent (lásd II általános képlet), ahol Glu
HU 206518 Β helyettesíti a Thr-t a 27. helyzetben a megrövidített B láncban (lásd fentebb), és amelyben a B(l-29) lánc és az A lánc A-(l-21) Ala-Ala-Lys peptid-szekvenciával van összekapcsolva. Hacsak másképpen nem jelezzük, úgy kell értelmezni, hogy a B(l-29) lánc és az A(l-29) lánc diszulfid-hidakkal van összekötve az A(7) Cys és a B(7) Cys, valamint az A(20) Cys és a B(19) Cys között, akárcsak a humán inzulinban, és hogy az A lánc tartalmazza a belső diszulfid-hidat az A(6) Cys és A(ll) Cys között.
Amint ezt fentebb kihangsúlyoztuk, a jelen találmány tárgya gyorsan ható, injektálható inzulin oldatokat nyújtani. Azokban az erőfeszítéseikben, hogy a találmánynak tárgyát megoldják, a jelen találmány feltalálói először és elsőként felismerték, hogy jelentős különbségek vannak egy raktáron vagy kapszulában levő inzulin és a véráramban levő inzulin között, beleértve nevezetesen egy teljesen elkerülhetetlen különbséget az inzulin-koncentrációban. Pontosabban, az inzulin a véráramban nagyon híg, 10~**—10-8 mól/1 koncentrációban és monomer formában van jelen, esetleg néhány inzulin dimer formában. A legnagyobb inzulin-koncentráció a hasnyálmirigy B-sejt szemcséiben és a szokásos beadható oldatokban nagymértékben, ha nem teljes egészében, a nem-aktív hexamer-formában van, pl. a jól ismert 2-cink hexamer formában.
A humán inzulinról oldatban ismert, hogy több molekuláris formában is létezik, nevezetesen monomer, dimer, tetramer és hexamer formában [Blundell és munkatársai: az Advances in Protein Chemistry (Haladás a fehérje-kémiában) című kiadványban, Academic Press, New-York és London 26, 279-330(1972)]; az oligomer formáknak kedveznek a nagy inzulin-koncentrációk, és a monomer az inzulin aktív formája. A tetramer és a hexamer nem aktív formák, és még a dimer is lehet, hogy nem aktív. A koncepció, amelyen a jelen találmány alapszik, a feltalálóknak az a véleménye, hogy a késleltetett abszorpciónak a szakterületen felismert tünete [Binder: Diabetes Care 7(2), 188— 199(1984)] nagyobb részt annak az időnek tulajdonítható, amely az inzulinnak szükséges, hogy disszociálódjék a hexamer, tetramer és dimer formákból az aktív monomer formává.
A jelen találmány szerinti humán inzulin-analógok egy olyan molekulaszerkezet révén érik el gyors hatásukat, amely nem könnyen hajlamos dimer, tetramer, hexamer vagy polimer képzésére, azaz csökkentett hajlama van ön-egyesülésre dimerekké, tetramerekké, hexamerekké vagy polimerekké cinkionoknak akár jelenlétében, akár távollétében.
Már régóta felismerték az aminosav-szekvenciákban levő jelentős fajták közti különbségekből, amelyek az inzulinnál léteznek, hogy az inzulin-molekulában jelen levő aminosavgyököknek nem mindegyike döntő fontosságú az inzulin-aktivitáshoz, és hogy az inzulin-aktivitáshoz nem lényeges aminosavak közül néhány fontos az inzulin molekula fizikai tulajdonságaihoz. A tengerimalac inzulinról ismeretes, hogy nem képes dimerizálódni. A szulfáttá alakított inzulin és a tetranitrotirozin inzulin nem dimerizálódik. így az aminosav-gyökök közül a humán inzulin molekulában többet is ki lehet cserélni jelentős csökkentés nélkül az inzulin-aktivitásban. Az itt megtervezett humán inzulin molekulában az aminosav-helyettesítések arra irányulnak, hogy megakadályozzák a dimerek, tetramerek, hexamerek vagy polimerek képződését anélkül, hogy az inzulin aktivitás megsemmisülne.
Az aminosav-gyökök az I általános képletű vegyület A láncában és B láncában azoknál a helyzeteknél, ahol a helyettesítéseket végezhetjük, nem döntő fontosságúak az inzulin-aktivitáshoz, de fontosak a humán inzulin olyan képessége szempontjából, hogy dimerekké, tetramerekké, hexamerekké vagy polimerekké aggregálódjék, vagy a humán inzulin oldhatósága szempontjából. A jelen aminosavgyök helyettesítések megakadályozzák a szomszédos inzulin-molekulák közti atomatom kapcsolatokat, amelyek megkönnyítik a dimerekké, tetramerekké, hexamerekké vagy polimerekké való aggregálódást.
Amint ez elvárható lehet a helyettesítések céljaihoz, a változások bizonyos helyzetekben a humán inzulin molekulában hatásosabbak, mint másokban. Mindent összevéve egy egyedi helyettesítés, amelyet a B láncon hajtunk végre, elegendő lehet az ön-egyesítési hajlam csökkentésére, míg más gyököknél legalább két változtatás lehet szükséges. A helyettesítések az A láncban főleg arra szolgálnak, hogy megjavítsák a disszociált molekula oldhatóságát. Az előnyös helyzetek az aminosav helyettesítések elvégzésére a B9, B12, B10, B26, B27 és B28 helyzetek egyedül, egymással kombinálva, vagy az inzulin molekulában másutt levő helyettesítésekkel együtt, amint ezt az (I) általános képletnél jeleztük.
Nyilvánvaló, hogy egy vagy több negatív töltésű aminosavgyök behelyettesítése töltéssel nem rendelkező vagy pozitív töltésű aminosav-gyökök helyére a humán inzulin-analóg töltését semleges pH-nál negatívabbá teszi, és az izoelektromos pontot csökkenti a humán inzulinhoz viszonyítva. Jellegzetesen a jelen találmány szerinti humán inzulin-analógoknak (semleges pH-nál) azonos vagy több negatív töltése és kisebb izoelektromos pontja van, mint a humán inzulinnak.
Mindent összevéve 1-3 helyettesítéssel elérjük a jelen találmány közvetlen tárgyát, nevezetesen gyorsabb hatású inzulint biztosítunk, és így valóban megalkotjuk a találmány előnyös kiviteli módját. 2-3 helyettesítést alkalmazva megjavult elegyíthetőséget érhetünk el védett inzulin készítményekkel. Előnyösnek véljük azonban, ha a jelen találmány közvetlen tárgyait olyan módon tudjuk elérni, hogy háromnál nagyobb számú helyettesítést végzünk, mivel a kívánt másodlagos tárgyakat ezáltal érhetjük el.
Részletesebben, a helyettesítés további szintje, pl. 4 vagy 5 helyettesítő aminosav jelenléte, olyan humán inzulin-analógot eredményezhet, amely kevésbé tárgya a fibrillálódásnak, vagy határfelületi polimerizálódásnak, ezeknek a jellemzőknek a hiánya különösen kívánatos, amikor az inzulin-oldatot folyamatos infúzióhoz szánjuk. Mindent összevéve 7 helyettesítésnél nem többet tervezünk a jelen találmány szerinti humán inzulin-analógokhoz. Az előnyös a 2-4 helyettesítés.
HU 206 518 Β
A jelen inzulin-analógok prekurzorait kódoló géneket a (Π) általános képletű fenti inzulin prekurzorokat amelyekben az összes X a humán inzulin aminosav gyökeinek felei meg - kódoló gének módosításával készíthetjük el helyspecifikus mutagenezissel, hogy olyan kodonokat iktassunk be, vagy olyan kodonokkal helyettesítsünk, amelyek a kívánt mutációt kódolják. Az inzulin-analóg prekurzort kódoló DNS szekvenciát úgy is el lehet készíteni, hogy a teljes inzulin-analóg prekurzor génnek vagy egy részének megfelelő oligonukleotidokból enzimes szintézist végzünk.
Az inzulin gén kívánt mutációjával bíró gént tartalmazó DNS szekvenciákat azután olyan fragmensekkel kombináljuk, amelyek a TPI promotort (TPIp) [Alber, T. és Kawasaki, G.: Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cerevisiae (A Saccharomyces cerevisiae trióz-foszfátizomeráz génjének nukleotid szekvenciája), J, Mól. Applied Génét. 1, 419-434(1982)], az MFal vezető szekvenciát [Kurjan J. és Herskowitz J.: Structure of a Yeast Pheromone Gene (MFal): APutative α-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Natúré a-Factor (Egy élesztő feromon gén (MFal) szerkezete: Egy vélt a-faktor prekurzor az érett α-faktor négy tandem kópiáját tartalmazza), Cell, 30,933-943(1982)], és a S. cerevisiae TPl-jéből származó átírás-befejező szekvenciát (TPIT) kódolják. Ezek a fragmensek olyan szekvenciákat szolgáltatnak, amelyek a prekurzort kódoló gén átírásának nagy sebességét biztosítják, valamint egy olyan elő-szekvenciát is nyújtanak, amely hatással lehet a prekurzor elhelyezkedésére a kiválasztási útban és ennek végleges kiválasztódására a növesztő tápközegbe. A kifejeződési egységek továbbá el vannak látva az élesztő 2 μ-os replikonjának origójával és egy szelektálható markerrel, a LEU2-vel. Az α-faktor in vivő érése során élesztőben az MFal vezető peptid utolsó 6 (C-terminális) aminosavat (Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala) eltávolítjuk az α-faktor prekurzorról a Lys-Arg szekvenciát felismerő valamely endopeptidáz és a Glu-Ala gyököket eltávolító valamely aminodipeptidáz [Julius, D. és munkatársai: Cell, 32, 839-852 (1983)] egymás utáni hasításával. Hogy kiküszöböljük az élesztő aminodipeptidáz szükségességét, az MFal vezető GluAla-GIu-Ala C-terminálisát eltávolítjuk az MFal vezető szekvenciáról in vitro mutagenezissel. A következőkben az „MFal vezető” a teljes vezető szekvenciát jelenti, míg az MFal vezető (mínusz Glu-Ala-GluAla) egy olyan vezető szekvenciát jelent, ahol a C-terminális Glu-Ala-Glu-Ala szekvencia el van távolítva.
Az alábbi példákban alkalmazott T4 ligáz, ExoIII nukleáz, Klenow polimeráz, valamint restrikciós enzimek a New England Biolabs, Beverly MA, USA gyártmányai, és a reakciókat a gyártó által megadott körülmények között végeztük. A NovozymR 234 saját gyártmányunk. Az enzimreakciókat, szelekciós és hibridizálási módszereket Maniatis, T. és munkatársai; Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) 68. oldal szerint végeztük. A példákban felhasznált E. coli MT172 törzs [azonos az MC 1000 törzzsel (Casadaban és Cohen: J. Med. Bioi., 138:179-207, 1980] és a
Saccharomyces cerevisiae MT663 saját törzsgyűjteményünkben hozzáférhető.
I. példa
B(1 -29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) humán inzulint kódoló szintetikus gén megalkotása
Egy élesztő kodonokhoz optimalizált B(l-29)-AlaAla-Lys-A(l-21) humán inzulinhoz szolgáló strukturgént alkotunk meg a következőképpen. Az alábbi 10 oligonukleotidot szintetizáljuk automatizált DNS-szintetizáló berendezésen, foszforamidit-kémiát alkalmazva szabályozott pórusnagyságú üveg hordozón [Beaucage, S. L. és Caruthers, Μ. H.: Tetrahedron Letters, 22,1589-1869 (1981)]:
I: AAAGATTCGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCCAC
35- mer
II: AACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAACGAA
36- mer
III. TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT
43-mer
IV: GTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCAAACCAAGTACAAAGCTTC
42-mer
V: TCTACACTCCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGTC
32- mer
VI: ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTACCAGT
34-mer
VII: GAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT
37- mer
VIII: TTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGC
37-mer
IX: TGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCT mer
X: CTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAG
33- mer
A fenti 10 oligonukleotidból 5 duplexet (A-E) képezünk, amint ezt az 1. ábrában bemutatjuk.
Az A-E duplexek mindegyikéből 20 pikomólt alakítunk ki, az I-X, 5’ foszforilezett oligonukleotidok megfelelő párjaiból olyan módon, hogy 5 percig melegítjük 90 °C hőmérsékleten, majd 75 perc alatt szobahőmérsékletre hűtjük. Az E duplexben a 33-mer (X) nincs foszforilezve abból a célból, hogy elkerüljük a dimerizálódást az önmagával komplementer Xbal egyszálú végek közül a ligálás során. Az öt duplexet összekeverjük és T4 DNS ligázzal kezeljük. A szintetikus gént 182/183 pb-s csíkként izoláljuk a ligálási keverék 2%os agaróz gélen végzett elektroforézise után.
A kapott szintetikus gént az 1. ábrában mutatjuk be.
A szintetikus gént a pMT644-ből (lásd EP-A 195691) származó 4 kb-s KpnI-EcoRI fragmenshez és
HU 206518 Β kb-s Xbal-KpnI fragmenshez, valamint a pKFN9-ből származó 0,3 kb-s EcoRI-Hgal fragmenshez ligáljuk, a TPIp-MFal vezető - B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)TPIT szerkezetet alakítva ki.
A pMT644 plazmid a TPIp-MFctl vezető - B(l— 29)-Α(1-29)-ΤΡΙτ DNS szekvenciát tartalmazza, és a konstrukció a fenti európai szabadalmi leírásban van leírva. A pKFN9 plazmid leírását a következőkben adjuk meg.
A ligáló keveréket alkalmazzuk kompetens E. coli (r, m+) törzs (MT172) transzformálására. 30 ampicillin-rezisztens telepet viszünk át M9 minimál tápközeget [Maniatis, T., és munkatársai: Molecular Cloning (Molekuláris klónozás), Cold Spring Harbor Laboratory (1982) 68. oldal] tartalmazó lemezekre; 8 Leu+ telepet kapunk. A 32P-XbaI-EcoRI fragmens MaxamGilbert féle szekvenciaelemzése kimutatja, hogy három plazmid tartalmazza a kívánt szekvenciával bíró gént. Egy plazmidot, a pKFN27-et választjuk ki további felhasználásra.
a pKFN27 megalkotását a 2. ábrában mutatjuk be.
A pKFN9 plazmid megalkotása
A pKFN9 plazmid megalkotásának az a célja, hogy egy olyan plazmidot nyerjünk, amely egy Hgal helyet tartalmaz közvetlenül az MFal-vezető szekvencia után. pMT544 plazmidot (amelynek megalkotását az EP 189988 számú európai szabadalmi leírás írja le) elhasítunk Xbal-gyel és mintegy 250 bázist távolítunk el a 3’ végről ΕχοΠΙ nukleázos kezeléssel. Egy szintetikus, 32-mer, Hgal szekvenciát tartalmazó, CGATAAAAGAGAGGCGCGTCTGAAGCTCACTC képletű beiktató prímért forrasztunk a részben egyszálú DNShez. Kétszálú, kör alakú DNS-t készítünk, betöltve Klenow polimerázzal és ligáivá T4 ligázzal. E. coliba (r, m+) (MT 172) való transzformálás után a mutált plazmidot tartalmazó telepeket 5’-32P-jelzett 32-mer beiktatási primerrel végzett telephibridizálással azonosítjuk. Az új Hgal hely jelenlétét restrikciós enzimmel végzett hasítással igazoljuk (EcoRI+Hgal, HindHI+HgaI). Visszatranszformálás után a pKFN9 „tiszta” mutánst kiválasztjuk további felhasználásra. A pKFN9 megalkotását a 3. ábrában mutatjuk be.
2. példa
B27 Glu humán inzulin előállítása
B27 Glu humán inzulint állítunk elő olyan módon, hogy B27 Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) humán inzulint transzpeptidálásnak vetjük alá Thr-OBul-val, és a keletkezett treonin-észtert acidolízisnek vetjük alá trifluor-ecetsavval. Az előállítás a következő lépésekből áll:
I. B27 Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) inzulint kódoló gén megalkotása pKFN27 plazmidot linearizálunk az egyedi Xbal helynél éppen lefelé a szintetikus inzulin prekurzor géntől. Abból a célból, hogy ne roncsoljuk el az Xbal helyet az alább leírt lépésben való kitöltésnél, egy 19-mer HindlII-Xbal kettős szálú kapcsolót:
Xbal Hindii!
CTAGAAGAGCCCAAGACTA
TTCTCGGGTTCTGATTCGA ligálunk a linearizált plazmid mindkét végéhez. A kapcsoló 5’ foszforilezve van az Xbal egyedi szál végnél, de nem foszforilezett marad a HindlII végnél, ezáltal elkerüljük a kapcsoló polimerizálódását a ligálási lépés és a DNS kör alakúvá záródása során (lásd 4. ábra).
Az 5’-mononukleotidokat eltávolítjuk a nyert lineáris kettős szálú DNS 3’-végeiről ΕχοΠΙ nukleázos kezelés segítségével. Az ΕχοΙΠ nukleázos kezelést 23 °C hőmérsékleten olyan körülmények között hajtjuk végre, hogy mintegy 250 nukleotíd távolítódik el a DNS mindegyik 3’-végéről [Guo, L. és Wu, R.: Methods in Enzymology 100,60-96(1983)].
5’-foszforilezett 25-mer mutagenezis prímért, dGTTTCTTCTACGAACCTAAGGCTGC-t fomsztunk a mutációs helyre. Klenow-fragmenssel végzett betöltés után T4 ligáz jelenlétében a kettős szálú DNS-t Xbal-gyel emésztjük. Ezután olyan heteroduplex kör alakú DNS-t képezünk T4 ligáz segítségével, amelynek az egyik szálában mutáció van.
A ligációs keveréket E. coli (r, m+) (MT172)-be transzformáljuk, ampicillín rezisztenciára szelektálva.
A mutánsokat 5’-32P-jelzett 25-mer mutagenezis primerrel végzett telephibridizálással azonosítjuk. A visszatranszformálás után a pKFN37 plazmidról létrejött telepek egyikéből kimutatjuk, hogy tartalmazza a kívánt mutációt, a kimutatást egy 0,5 kb-s Xbal-EcoRI fragmens DNS-szekvencia-elemzésével végezve [Maxam, A. és Gilbert, W.: Methods in Enzimology, 65, 499-560(1980)].
II. Transzformálás
Saccharomyces cerevisiae MT663 törzset /E27B/X/E11-3C a/α, Atpi/Atpi, pép 4-3(pep 4-3) növesztünk YPGaL tápközegen (1% Bacto élesztőkivonat, 2% Bacto pepton, 2% galaktóz, 1% laktat) 0,6 OD^#^ értékig.
100 ml tenyészetet nyerünk ki centrifugálással, 10 ml vízzel mossuk, újból centrifugáljuk, és újra szuszpendáljuk 10 ml olyan közegben, amely 1,2 mól/1 szorbitot, 25 mmól/1 Na2EDTA-t (pH-8,0) és 6,7 mg/ml ditiotreitolt tartalmaz. A szuszpenziót 30 °C hőmérsékleten 15 percig inkubáljuk, centrifugáljuk, és a sejteket újra szuszpendáljuk 10 ml olyan közegben, amely 1,2 mól/1 szorbitot, 10 mmól/1 Na2EDTA-t, 0,1 mól/1 nátrium-citrátot (pH-5,8) és 2 mg Novozym® 234-et tartalmaz. A szuszpenziót 30 °C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk, a sejteket centrifugálással összegyűjtjük, 10 ml 1,2 mól/l-es szorbittal és 10 ml CAS-sal mossuk [a CAS összetétele: 1,2 mól/1 szorbit, 10 ml CaCl2,10 mmól/1 trisz [trisz-trisz(hidroxi-metil)-amino-metán] (pH-75)]. és újra szuszpendáljuk 2 ml CAS-ban. A transzformáláshoz 0,1 ml CAS-ban szuszpendált sejtet keverünk mintegy 1 pg pKFN37 plazmiddal, és szobahőmérsékleten hagyjuk 15 percen át. 1 ml olyan oldatot, amely 20%-os polietilénglikol 4000-t, 10 mmól/1 CaCl2-t és 10 mmól/1 triszt
HU 206 518 Β (pH - 7,5) tartalmaz, adunk hozzá és a keveréket további 30 percig hagyjuk szobahőmérsékleten. A keveréket centrifugáljuk és az üledéket újra szuszpendáljuk 0,1 ml SOS-ben [1,2 mól/1 szorbit, 33% (térfogat) YPGaL, 6,7 mmól/1 CaCl2 és 14 pg/ml leucin] és inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten 2 órán át. A szuszpenziót azután centrifugáljuk és az üledéket újra szuszpendáljuk 0,5 ml 1,2 mól/l-es szorbitban. 6 ml fedő-agart {Sherman és munkatársainak SC tápközege [Methods in Yeast Genetics (Módszerek az élesztő-genetikában), Gold Spring Harbor Laboratory (1981)] leucin elhagyásával, amely még 1,2 mól/1 szorbitot és 2,5% agart is tartalmaz} adunk hozzá 52 °C hőmérsékleten, és a szuszpenziót olyan lemezek tetejére öntjük, amely ugyanezt az agarral szilárdított, szorbitot tartalmazó tápközeget tartalmazza. Transzformáns telepeket szúrunk fel 3 napos 30 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után, újra izoláljuk ezeket és ezeket használjuk fel folyékony tenyészetek beindítására. Az egyik ilyen transzformánst, a KFN40-et (- MT663/pKFN37) választjuk ki további jellemzésre.
III. B27 Glu, B( l-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-21) inzulin prekurzor kifejeződése
KFN40 élesztőtörzset növesztünk YPP tápközegben [1% élesztőkivonat, 2% pepton (mindkettő a Difco Laboratories-től), és 2% glükóz], A törzs 10 ml-es tenyészetét 30 °C hőmérsékleten rázatjuk 26 OD^ értékig. Centrifugálás után a felülúszót fordított fázisú HPLC-vel elemezzük, és 13,5 mg/1 prekurzort találunk.
Az analógot a felülúszóban kationcserélő oszlopon koncentráljuk alacsony pH-η, ezt követi a deszorpció megfelelő pufferoldattal. A kristályosítást alkoholos citrát pufferból hajtjuk végre.
IV. Transzpeptidálás
0,2 mól (47,1 g) Thr-OBu'xHOAc-t feloldunk DMF-ben, hogy 100 ml oldatot kapjunk, 50 ml 76,5%os vizes DMF oldatot (térfogat/térfogat) adunk hozzá, és 10 g nyers B27 Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) humán inzulint oldunk fel a keverékben, amelyet 12 °C hőmérsékleten termosztálunk. Ezután 1 g tripszint 25 ml 0,05 mól/l-es kalcium-acetátban adunk hozzá, és 24 órán át 12 °C hőmérsékleten végzett tárolás után a keveréket 2 liter acetonhoz adjuk, és a kicsapódott peptideket centrifugálással izoláljuk, és vákuumban szárítjuk. A B27 Glu, B30 Thr-OBu1 humán inzulint preparatív HPLC oszlopon tisztítjuk, Silica-C18-cal mint oszloptöltő anyaggal. V.
V. Átalakítás B27 humán inzulinná
A B27 Glu, B30 Thr-Obu1 humán inzulint feloldjuk 100 ml trifluor-ecetsavban. 2 órán át szobahőmérsékleten történő állás után az oldatot liofilezzük. A liofilizált port 400 ml 47,5 mmól/l-es nátrium-citrátban oldjuk pH 7-nél. A peptideket pH 5,5-nél kicsapjuk 2,4 ml 1 mól/l-es ZnCl2 hozzáadása után, centrifugálással izoláljuk, és vákuumban szárítjuk. A terméket anioncserélő kromatográfiával tisztítjuk, és gélszűréssel sómentesítjük. Kitermelés: 1,7 g B27 Glu humán inzulin.
3. példa
B9 Asp humán inzulin előállítása
A B9 Asp humán inzulint B9 Asp, B(l-29)-Ala-AlaLys-A(l-21) humán inzulin Thr-OBu-vel végzett transzpeptidálásával, és a nyert treonin-észter trifluorecetsavval végzett acidolízisével állítjuk elő.
I. A B9 Asp, B(I-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-21) humán inzulint kódoló gén megalkotása
Ezt a gént azonos módon alkotjuk meg, mint ahogyan a B27 Glu, B(l-29)-Ala-AIa-Lys-A(l-21) humán inzulint kódoló génnél leírtuk, a pKFN27 irányított helyspecifikus mutagenezisével, egy 23-mer mutagenezis primer, a d(CTTGTGCGGTGACCACTTGGTTG) irányításával. A pKFN38 plazmidról kimutatjuk, hogy tartalmazza a kívánt mutációt.
II. Transzformálás
A pKFN38 plazmidot S. cerevisiae MT663 törzsbe transzformáljuk azonos eljárással, mint a 2. példa Π. részében, és egy KFN41 jelű transzformánst izolálunk.
III. B9 Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-21) humán inzulin kifejeződése
A KFN41 élesztőtörzset YPD tápközegben növesztjük, amint ezt a 2. példa III. részében leírtuk. 2,5 mg/1 inzulin-analóg prekurzort találunk a felülúszóban.
IV. Transzpeptidálás
7,4 g nyers B9 Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) humán inzulint transzpeptidálunk olyan módon, ahogyan ezt a 2. példa IV. részében leírtuk, így kapjuk a B9 Asp, B30 Thr-OBu1 humán inzulint.
V. Átalakítás
A B9 Asp, B30 Thr-OBu' humán inzulint átalakítjuk B9 Asp humán inzulinná, amint ezt a 2. példa V. részében leírtuk. Kitermelés: 0,83 g B9 Asp humán inzulin.
4. példa
B9 Asp, B27 Glu humán inzulin előállítása
A B9 Asp, B27 Glu humán inzulint B9 Asp, B27 Glu B( 1-21 )-Ala-Ala-Lys-A( 1-21) humán inzulin ThrOBu'-vel végzett transzpeptidálásával és a nyert treonin-észter trifluor-ecetsavval végzett acidolízisével állítjuk elő.
I. A B9 Asp, B27 Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l21) humán inzulint kódoló gén megalkotása
A pKFN38-ból (lásd 3. példa) származó 367 bp-s EcoRI-HindlII fragmenst és egy pKFN37-ből (lásd 2. példa) származó HindlII-Xbal fragmenst ligálunk pUC13 plazmid {ezt a plazmidot úgy alkotjuk meg, amint ezt Viera és munkatársai a pUC8-nál és pUC9nél leírták [Gene, 19, 259-268(1982)]} nagy XbalEcoRI fragmenséhez. A ligációs keveréket E. coli (MT172)-be transzformáljuk, ampicillin rezisztenciára szelektálva. Több transzformánsból plazmidokat állítunk elő és elemezzük ezeket Pstl-gyel és HíndlH-mal végzett emésztéssel. Az egyik plazmidból, amely a
HU 206518 Β korrekt restrikciós enzimes mintát mutatja, a 0,5 kb-s Xbal-EcoRI fragmenst ligáljuk egy 7,8 kb-s XbalKpnl fragmenshez, és egy 4,3 kb-s KpnI-EcoRI fragmenshez; a két utóbbi fragmens a pMT644-böl származik. A ligációs keveréket E. coli (MT172)-be transzformáljuk ampicillin rezisztenciára szelektálva. Az így létrejött telepek egyikéből származó pKFN43 plazmidról kimutatjuk, hogy tartalmazza a kívánt inzulin-származék prekurzort, a kimutatást egy 0,5 kb-s Xbal-EcoRI fragmens DNS-szekvencia-elemzésével végezve. A pKFN43 megalkotását az 5. ábrán mutatjuk be.
II. Transzformálás
A pKFN38 plazmidot S. cerevisiae MT663 törzsbe transzformáljuk azonos eljárással, mint ahogyan ezt a
2. példa II. részében leírtuk, és egy KFN44 jelű transzformánst izolálunk.
III. A B9 Asp, B27 Glu, B(I-29)-Ala-Ala-Lys-A(l21) humán Inzulin kifejeződése
A KFN44 élesztőtörzset YPD tápközegen növesztjük, amint ezt a 2. példa Hl. részében leírtuk. 7,3 mg/1 inzulin-analóg prekurzort találunk a felülúszóban.
IV. Transzpeptidálás
12,7 g nyers B9 Asp, B27 Glu, B( 1-29)-Ala-AlaLys-A(l-21) humán inzulint transzpeptidálunk, amint ezt a 2, példa IV. részében leírtuk, B9 Asp, B27 Glu, Thr-OBu1 humán inzulint alakítva ki.
V. Átalakítás
A B9 Asp, B27 Glu, B30 Thr-OBu1 humán inzulint átalakítjuk B9 Asp, B27 Glu, B30 Thr humán inzulinná és tisztítjuk olyan módon eljárva, ahogyan ezt a 2. példa V. részében leírtuk. A kitermelés 1,0 g B9 Asp, B27 Glu humán inzulin.
5. példa
A8 His, B9 Asp, B27 Glu humán inzulin előállítása
Az A8 His, B9 Asp, B27 Glu humán inzulint A8 His, B9 Asp, B27 Glu, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) humán inzulin Thr-OBu'-vel végzett traszpeptidálásával és a nyert treonin-észter trifluor-ecetsavval végzett acidolízisével állítjuk elő, amint ezt a példában leírjuk.
I. Az A8 His, B9 Asp, B27 Glu, B(l-29)-Ala-AlaLys-A( 1-21) humán inzulint kódoló gén megalkotása
Ezt a gént irányított oligonukleotid mutagenezissel alkotjuk meg, „réseit” (gapped) duplex eljárást alkalmazva [Morinaga, Y„ Franceschini, T., Inouye, S. és Inouye, M.: Biotechnology, 2, 636-639(1984)]. Az MFal vezető szekvenciát és a B9 Asp, B27 Glu humán inzulin prekurzort kódoló pUC13-eredetű plazmidot Hpal-gyel és Xbal-gyel hasítjuk. A nagy fragmenst összekeverjük az Ndel-gyel linearizált plazmiddal. Hődenaturálás és hűtés után a keverék „réseit” duplexeket tartalmaz egyszálas „ablakok”-kal abban a területben, amely az inzulin prekurzor gén (Hpal-Xbal)-nek felel meg. A 37-mer mutagén hibás illesztésű prímért, a d(GAACAATGCTGTCACTCCATCTGCTCCTTGT ACCAAT)-t hibridizáljuk a „réseit” duplexhez, ezt követi a kitöltés Klenow polimerázzal, és a ligálás. A keveréket E. coli (MTI 72) transzformálására használjuk, ampicillin rezisztencia alapján szelektálva. Mutánsokat azonosítunk 18-mer 5’-32P-jelzett vizsgáló mintával, d(AATGCTGTCACTCCATCT)-vel, végzett telep-hibridizálással. Visszatranszformálás után az így létrejött telepek egyikéből nyert egyik plazmidról kimutatjuk, hogy tartalmazza a kívánt mutációt, a kimutatást egy 0,5 kb-s Xbal-EcoRI fragmens DNS-szekvencia-elemzésével végezve. Ezt a plazmidot használjuk a pKFN102 élesztő-plazmid megalkotásához, úgy, amint ezt a 4. példában a pKFN43 megalkotásánál leírtuk.
II. Transzformálás
A pKFN102 plazmidot S. cerevisiae MT663 törzsbe transzformáljuk azonos eljárással, amint ezt a 2. példa Π. részében leírtuk és egy KFN109 transzformánst izolálunk.
IH. Az A8 His, B9 Asp, B27 Glu, B(l-29)-Ala-AlaLys-A(l-2l) humán inzulin kifejeződése
KFN109 élesztőtörzset növesztünk YPD tápkőzegen, amint ezt a 2. példa III. részében leírtuk. 21,5 mg/1 inzulin-analóg prekurzort találunk a felülúszóban.
IV - V. Transzpeptidálás és átalakítás
22,0 g nyers A8 His, B9 Asp, B27 Glu, B(l-29)Ala-Ala-Lys-A(l-21) humán inzulint transzpeptidálunk, átalakítunk és tisztítunk, amint ezt a 2. példa IV. és V. részében leírtuk. Kitermelés: 4,0 g A8 His B9 Asp B27 Glu humán inzulin.
6. példa
BJ2 Ile humán inzulin előállítása
A B12 Ile humán inzulint B12 Ile, B( l-29)-Ala-AlaLys-A(l-21) humán inzulin Thr-OBu'-vel végzett transzpeptidálásával, és a nyert treonin észter trifluorecetsavval végzett acidolízisével állítjuk elő, amint ezt a 2. példában leírtuk.
I. A ΒΓ2 Ile, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) humán inzulint kódoló gén megalkotása A pMT598 egy 0,5 kb-s EcoRI-Xbaí fragmensét (a pMT598 plamzid megalkotását a 01635 291 bejelentési számú európai szabadalmi bejelentésben írják le), amely az MFal vezetőt kódolja, beiktatjuk Xbal-gyel és EcoRI-val hasított M13 mplO RF fágba, és a megfelelő egyszálú DNS-t az M13 mplO rekombináns fágból tisztítjuk. Az egyszálú templát DNS-t hibridizáljuk egy mutagén 27-mer NOR-92 primerhez, a d(GTAGAGAGCTTCGATCAGGTGTGAGCC)-hez, és egy M13 univerzális szekvenciáló primerhez, a d(TCCCAGTCACGACGT)-hez. A primereket a dNTP-kel és Klenow polimerázzal kiterjesztjük, és T4 DNS ligázzal ligáljuk. A KFN92 mutagén prímért úgy választjuk ki, hogy egy BstNI hely (egyedi az Xbal-EcoRI fragmensben) elroncsolt legyen. Ezért
HU 206 518 Β hogy a nem mutált EcoRI-Xbal fragmens ellen szelektáljunk, a keveréket BstNl-gyel és ezt követően EcoRl-vel és Xbal-gyel hasítjuk, és EcoRI-vel és Xbalgyel hasított pUC13 vektorhoz ligáljuk. A nyert transzfcrmánsok egyikéből az egyik plazmidot, a pMT760at, amelyben az inzulin-kódoló szekvenciában a BstNl hely hiányzik, kiválasztjuk. A kívánt mutált szekvenciát Maxam-Gilbert féle szekvenciaelemzéssel igazoljuk. A pMT760 plazmid tartalmaz egy 0,5 kb-s Ecorl-Xbal szekvenciát, amely a pMT598-ból (lásd fentebb) származó azonos ffagmensnek felel meg, eltekintve a B12 helynél levő mutációtól (Val-Ile). Ezt a mutált szekvenciát azután egy élesztő eredetű kifejeződő plazmádba visszük át olyan módon, hogy a pMT760 0,5 kb-s Ecorl-Xbal fragmensét a pMT644-ből származó 7,8 kb-s Xbal-KpnI fragmenshez és 4,3 kb-s KpnI-EcoRI fragmenshez ligáljuk, így kapva a pMTA plazmidot.
II - V. Transzformálás; Kifejeződés; Transzpeptidálás; Átalakítás pMTA plazmidot transzformálunk MT663 élesztőtörzsbe, amint ezt a 2. példa II. részében leírtuk, és az MTA transzformáns törzset növesztjük, amint ezt a 2. példa III. részében leírtuk. 10,4 mg/1 inzulin-analóg prekurzort találunk a felülúszóban. 10 g nyers analóg prekurzort transzpeptidálunk, átalakítunk és tisztítunk, amint ezt a 2. példa IV - V. részében leírtuk. Kitermelés: 1,3 g B12 Ile humán inzulin.
7. példa
A B12 Tyr humán inzulin előállítása
A B12 Tyr humán inzulint B12 Tyr, B(l—29)-AlaAla-Lys-A(l-21) humán inzulin Thr-OBu-vel végzett transzpeptidálásával és a nyert treonin-észter trifluorecetsavval végzett acidolízisével állítjuk elő, amint ezt a 2. példában leírtuk.
I. A BI2 Tyr, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) humán inzulint kódoló gén megalkotása
Agént a B12 Ile, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l) humán inzulint kódoló gén előállításához alkalmazott módszerrel analóg módszerrel alkotjuk meg, csupán azzal a különbséggel, hogy a KFN93 prímért, a d(GTAGAGAGCTTCGTACAGGTGTGAGCC)-t alkalmazzuk a KFN92 helyett.
II - IV. Transzformálás; Kifejeződés; Transzpepíidálás; Átalakítás
A Π-ΙΠ. lépéseket úgy hajtjuk végre, ahogyan ezt a
2. példában leírtuk. 1,7 mg/1 inzulin-analóg prekurzort találunk a felülúszóban. A nyers analóg prekurzort úgy transzpeptidálhatjuk, alakíthatjuk át és tisztíthatjuk, amint ezt a 2. példda IV - V. részében leírtuk, így kapunk B12 Tyr humán inzulint.
8. példa
B10 Asp humán inzulin előállítása
A B10 humán inzulint B10 Asp, B(l-29)-Ala-AlaLys-A(l-21) humán inzulin Thr-OBu-vel végzett transzpeptidálásával, és a nyert treonin-észter trifluorecetsavval végzett acidolízisével állítjuk elő, amint ezt a 2. példában leírtuk.
I. A BIO Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2I) humán inzulint kódoló gén megalkotása
Agént a B12 Ile, B( 1-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-21) humán inzulint kódoló gén előállításához alkamazott módszerrel analóg módszerrel alkotjuk meg azzal az egyedi kivétellel, hogy a KFN94 prímért, a d(AGCTTCCACCAGATCTGAGCCGCACAG)-t alkalmazzuk a KFN92 helyett.
II - V. Transzformálás; Kifejeződés; Transzpeptidálás; Átalakítás
A II—III. lépéseket úgy hajtjuk végre, ahogyan ezt a
2. példában leírtuk. 36 mg/1 inzulin-analóg prekurzort találunk a felülúszóban. A nyers analóg prekurzort úgy transzpeptidáljuk, alakítjuk át és tisztítjuk, mint ahogyan ezt a 2. példában leírtuk. Kitermelés: 7,6 g B10 Asp humán inzulin.
9. példa
A B28 Asp humán inzulint B28 Asp, B(l-29)-AlaAla-Lys-A(l-2l) humán inzulin Thr-OME-vel végzett transzpeptidálásával és a nyert treonin-észter pH 8 és 12 közt végzett hidrolízisével állítjuk elő.
I. B28 Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) humán inzulint kódoló gén megalkotása A pMT 462 plazmid (a pMT462 megalkotását az EP
0189998 számú európai szabadalmi leírásban írják le) egy 0,5 kb-s EcoRI-Xbal fragmensét, amely az MFal vezető (mínusz Glu-Ala-Glu-Ala)-B-C-A-t kódolja, vagyis a módosított MFal vezetővel megelőzött humán proinzulin gént, beiktatjuk Xbal-gyel és EcoRIvel hasított M13 mplO RF fágba, és a megfelelő egyszálú DNS-t az M13 mplO rekombináns fágból tisztítjuk. Az egyszálú templát DNS-t egy mutagén 41-mer primerhez (NOR 205), a d(TTCCACAATGCCCTT AGCGGCCTTGTCTGTGTAGAAGAAGC)-hez és egy M13 univerzális szekvencia primerhez, a d(TCCCAGTCACGACGT)-hez hibridizáljuk. A printereket a dNTP-kel és Klenow-polimerázzal kiterjesztjük, és T4 DNS ligázzal ligáljuk.
Fenolos extrahálás, etanolos kicsapás és újra szuszpendálás után a DNS-t Apai, Xbal és EcoRI restrikciós enzimekkel hasítjuk. Egy második fenolos extrahálás, etanolos kicsapás és újra szuszpendálás után a DNS-t EcoRI-vel és Xbal-gyel hasított pUC13-ba ligáljuk. A ligációs keveréket E. coli (Γ, m+) törzsbe transzformáljuk, és egy sor transzformánsból plazmidokat állítunk elő. A plazmid-készítményeket EcoRI-vel és Xbal-gyel hasítjuk, és azokat a készítményeket, amelyek mind 0,5 kb-nél, mind 0,6 kb-nél mutatnak kötéseket, újra transzformáljuk E. coli-ba. Az újra transzformálásból olyan transzformánst szelektálunk, amely csak egy 0,5 kb-s beiktatással rendelkező pUC13-at fogad be.
A nyert transzformánsokból egy pMT881 plazmidot választunk ki, amely a kívánt mutációval rendelkezik a B28-nál (Pro-»Asp). A mutált szekvenciát Maxam10
HU 206 518 Β
Gilbert féle szekvencia-elemzéssel igazoljuk. A mutált szekvenciát ezután egy élesztő-eredetű kifejeződő plazmidba visszük át olyan módon, hogy a pMT881 0,5 kb-s EcoRI-Xbal fragmensét ligáljuk a pMT644ből származó 7,8 kb-s Xbal-KpnI fragmenshez és
4,3 kb-s KpnI-EcoRI fragmenshez, így kapjuk meg a pMTAl-et.
II. Transzformálás
A pMTAl plazmidot S. cerevisiae MT663 törzsbe transzformáljuk azonos módszerrel, mint ahogyan ezt a
2. példa II. részében leírtuk, és egy MTA1 transzformánst izolálunk.
III. Λ B28 Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-21) humán inzulin kifejeződése
Az MTA1 élesztőtörzset növesztjük YPD tápközegben, amint ezt a 2. példa III. részében leírtuk. 7,2 mg/1 inzulin-analóg prekurzort találunk a felülúszóban.
IV. Transzpeptidálás
A nyers B28 Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)-et transzpeptidáljuk olyan módon, ahogyan ezt a 2. példa
IV. részében leírtuk, a Thr-OBu'-t Thr-OMe-vel helyettesítve, így B28 Asp, B30 Thr-OMe humán inzulint kapunk.
V. Átalakítás
A B28 Asp, B30 Thr-OMe humán inzulint 1% (tömeg/térfogat) arányban vízben diszpergáljuk és feloldjuk 1 n nátrium-hidroxi hozzáadásával a pH-t 10,0 értékre beállítva. A pH-értéket állandóan 10,0-n tartjuk 25 °C hőmérsékleten 24 órán át. A képződött B28 Asp humán inzulint kicsapjuk olyan módon, hogy nátriumkloridot adunk hozzá mintegy 8% (tömeg/térfogat) koncentráció eléréséig, nátrium-acetát-trihidrátot mintegy 1,4% (tömeg/térfogat) koncentráció eléréséig, és cink-acetát-dihidrátot mintegy 0,01% (tömeg/térfogat) koncentráció eléréséig, ezután 1 n sósavat adunk hozzá, pH 5,5 értéket állítva be. A csapadékot centrifugálással izoláljuk és anioncserélő kromatográfiával tisztítjuk, és gélszűréssel sómentesítjük. Kitermelés: 0,2 g B28 Asp humán inzulin.
10. példa
A21 Asp, B9 Asp, B27 Glu humán Inzulin előállítása
A21 Asp, B9 Asp, B27 Glu humán inzulint állítunk elő B9 Asp, B27 Glu humán inzulinból szelektív dezaminálással (5%-os oldat hidrolízise 14 napon át 37 °C hőmérsékleten, pH 2,5-nél). A dezaminált terméket anioncseréld kromatográfiával tisztítjuk.
11. példa
B27 Glu, A21 Asp humán inzulin előállítása
A B27 Gin, A21 Asp humán inzulint B27 Glu, A21 Asp, B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) humán inzulin Thr-OBu'-vel végzett transzpeptidálásával, és a nyert treonin-észter trifluor-ecetsavval végzett acidolizisével állítjuk elő, amint ezt a 2. példában leírtuk.
A B27 Glu A21 Asp B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21)et a B27 Glu, B( 1-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-2 l)-ből (lásd
2. példa) állítjuk elő dezaminálással, amint ezt a 10. példában leírtuk.
A jelen találmány szerinti humán inzulin-analógok jellemzése
A molekulatömegek meghatározása [Gutffeund, H. Biochemical Journal 42,544(1948)].
Módszer Knauer Membrán Osmometer
1,00 típus
Membrán: Schleicher és Schüll R 52 típus
Oldószer: 0,05 mól/1 NaCl, pH 74 Hőmérséklet 21 ’C
Eredmények: Az összes inzulin-típust 4 mg/ml koncentrációnál mérjük.
1. táblázat
Az inzulin típusa Molekulatömeg, kilodalton
Humán 2 Zn inzulin 36+2
Humán Zn-mentes inzulin 29 ±1
Zn-mentes B27 Glu humán inzulin 22 ±1
Zn-mentes B12 lle humán inzulin 17 ±1
Zn-mentes B27 Glu, A21 Asp humán inzulin 8±1
Zn-mentes B9 Asp, B27 Glu humán inzulin 6±1
Zn-mentes B9 Asp humán inzulin 6±1
Zn-mentes B9 Asp, B27 Glu, A21 Asp humán inzulin 6±1
Zn-mentes B9 Asp, B27 A8 His humán inzulin 9±3
Zn-mentes B10 Asp humán inzulin 12 ±1
Zn-mentes B28 Asp humán inzulin 9 ±2
A fenti 1. táblázatból úgy tűnik, hogy a humán inzulin-analógoknak jellegzetesen csökkent molekulatömege van a humán inzulinnal összahasonlítva, ami azt jelenti, hogy az ön-összekapcsolódás dimerekké, tetramerekké és hexamerekké kevésbé jellegzetes, vagy számos esetben teljesen hiányzik.
2. táblázat
Fél-élettartam és biológiai potenciál
Humán inzulin-analóg Ti«* (a humán inzulin %-ában) Biológiai potenciál** a humán inzulin%-ában (95% konfidencia intervallum)
B27 Glu humán inzulin 78 101(83-123)
B9 Asp, B27 Glu humán inzulin 54 110(90-139)
B12 lle humán inzulin 78 91(80-103)
B27Glu,A21 Asp humán inzulin 56 64(58-71)
HU 20ό 518 Β
Humán inzulin-analóg V (a humán inzulin %-ában) Biológiai potenciál*’* a humán inzulin%-ában (95% konfidencia intervallum)
B9 Asp humán inzulin 52 80(72-90)
A21 Asp, B9 Asp, B27 Glu humán inzulin 56 75(66-85)
A8 His, B9 Asp, B27 Glu humán inzulin 68 116(101-135)
B10 Asp humán inzulin 64 104(92-118)
B28 Asp humán inzulin 104(95-114)
*Αζ időtartam az 50%-os eltűnésig az injekció helyéről (szubkután) sertésekben, Binder módszere szerint [Acta Pharmacol. Toxicol. 27, 2. kiegészítés, 1-87(1969)] ”*Egér-vér glükóz mérés, az Európai Gyógyszerkönyv (European Pharmacopoeia) szerint
A fenti 2, táblázatból kitűnik, hogy az inzulin-analógok 50%-os eltűnési ideje az injekciós helyről lényegesen csökkent, ha a humán inzulinnal hasonlítjuk össze.
Az inzulin-analógok biológiai potenciálja a humán inzulinnal hasonlítható össze, vagy csak kissé csökkent ahhoz viszonyítva.
12. példa
B26 Glu humán inzulint állítunk elő a B26Glu,B(l29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l) peptid Thr-OMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés 6 mg.
13. példa
B9Asp,B27Arg humán inzulint állítunk elő a B9Asp,B27Arg,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2i) peptid Thr-OMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés 04 g.
14. példa
B16GluJB27Glu humán inzulint állítunk elő a B 16Glu,B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-21) peptid Thr-OMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés 8 g.
15. példa
B20Gln humán inzulint állítunk elő a B20Gln,B(l29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) peptid Thr-OMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés 220 mg.
16. példa
Al3Ser,B27Glu humán inzulint állítunk elő az A13Ser,B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) peptid Thr-OMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés 7,4 g.
17. példa
B10Asp,B28Asp humán inzulint állítunk elő a B 10Asp,B28Asp,B( l-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-21) peptid Thr-OMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés 3 g.
18. példa
B17Gln humán inzulint állítunk elő a B17Gln,B(l29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) peptid Thr-OMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés 4,2 g.
19. példa
BlGlu,B27Glu humán inzulint állítunk elő a BlGlu,B27Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) peptid Thr-OMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés 24,4 g.
20. példa
B2Asp,B5Ser,B27Glu humán inzulint állítunk elő a B2Asp,B5Ser,B27Glu,B(l-29)-Ala-Aia-Lys-A(l-21) peptid Thr-OMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés 4,8 g.
21. példa
BlOThr humán inzulint állítunk elő a B10Thr,B(l29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) peptid Thr-OMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés 6,4 g.
22. példa
A12Glu,B10Glu humán inzulint állítunk elő az A13Glu,B10Glu,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) peptid Thr-OMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés 25,2 g.
23. példa
B2Ser,B lOAsp humán inzulint állítunk elő a B2SerB10Asp,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) peptid ThrOMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés
7,4 g.
24. példa
BlóHis humán inzulin állítunk elő a B16His,B(l29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) peptid Thr-OMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés 0,8 g.
HU 206518 Β
25. példa
A21Gly,B10Asp humán inzulint állítunk elő az A21 Gly,B 10Asp,B( 1-29)-Alá- Ala-Lys-A( 1-21) peptid Thr-OMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés 9,3 g.
26. példa
A21Gly,B28Asp humán inzulint állítunk elő az A21 Gly,B28 Asp,B (1-29)-Alá-Ala-Lys-A( 1-21) peptid Thr-OMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés 3,4 g.
27. példa
A21Gly,B9Asp humán inzulint állítunk elő az A21GlyJB9Asp,B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) peptid Thr-OMe-vel végzett transzpeptidálásával, majd a kapott treonin-észter 8-12 közötti pH-értéken történő hidrolízisével, a 9. példában leírtak szerint. A kitermelés 1,3 g.

Claims (6)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás (I) általános képletű humán inzulin-származékok előállítására, ahol a képletben X a humán inzulin aminosavszekvenciájának megfelelő aminosav, melyek helyett a molekula alábbi helyzeteiben a következő aminosavak állhatnak:
    A8: His, Gly, Gin, Glu, Ser, Asn, Asp vagy Pro,
    A9: Gly, Asp, Glu, Thr, His, Gin, Asn, Alá vagy Pro,
    A10: Ser, Leu, Pro, Val, His, Alá, Glu, Asp, Thr, Gin vagy Asn,
    A13: Pro, Ser, Val, Arg, His, Alá, Glu, Asp, Thr, Gly, Gin vagy Asn,
    A21: Asp, Glu, Ser, Thr vagy Gly,
    Β1: Glu, Asp, Thr, Ser vagy Gly,
    B2: Arg, His, Alá, Glu, Asp, Thr, Pro, Gly, Gin, Ser vagy Asn,
    B5: Glu, Asp, Thr, Ser, Gin vagy Asn,
    B9: Asp, Pro, Glu, Ile, Leu, Val, His, Thr, Gin, Asn, Met, Tyr, Trp, Phe vagy Lys,
    B10: Asp, Arg, Glu, Asn, Gin, Thr vagy Ser,
    B12: Ile, Tyr, Asp vagy Glu,
    B14: Glu, Asp, Asn, Gin, Ser, Thr vagy Gly,
    B16: Asp, Glu, Gin, Asp, Ser, Thr, His vagy Arg,
    B17: Ser, Thr, Asn, Gin, Glu, Asp vagy His,
    B18: Ser, Thr, Asn, Glu, Gin, Asp vagy His,
    B20: Gin, Ser, Asn, Asp, Glu vagy Arg,
    B26, B27 és B28: Asp vagy Glu, azzal a feltétellel, hogy legalább egy X aminosav eltérő a humán inzulin molekula megfelelő helyén előforduló aminosavtól, és ha
    X az A8 helyzetben His vagy Phe, vagy X az A21 helyzetben Asp, vagy X a B5 helyzetben Alá, vagy X a B9 helyzetben Leu, vagy X a B10 helyzetben Asn vagy Leu, vagy
    X a B12 helyzetben Asn, vagy
    X a B26 helyzetben Alá, akkor a fennmaradó X aminosavak közül legalább egy eltérő a humán inzulin molekula megfelelő helyén előforduló aminosavaktól, azzal jellemezve, hogy egy (Π) általános képletű inzulin-származék prekurzort - ahol Qn természetes amonosavból álló peptidlánc,
    R Lys vagy Arg, n értéke (k-33, m értéke 0 vagy 1 és
    X jelentése a fentiekben megadott, kódoló DNS-molekulát és egy hozzá működőképesen illesztett szignálszekvenciát expressziós plazmidba építünk, a plazmiddal élesztőt transzformálunk, majd az élesztőt tenyésztjük, a prekurzort elválasztjuk a tenyészet felülúszójából, és L-treonin-észterrel vagy sójával reagáltatjuk, tripszín vagy tripszin-származék jelenlétében, szerves oldószerben, majd a keletkezett treοηίη-észtert savas vagy bázikus körülmények között a humán inzulin-származékká hidrolizáljuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű humán inzulin-származékok előállítására, ahol legfeljebb 7 X aminosav-gyök különbözik a humán inzulin megfelelő helyeknél levő aminosav-gyökeihez képest, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-t tartalmazó plazmiddal transzformált élesztőt tenyésztjük.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű humán inzulin-származékok előállítására, melyekben legalább egy X aminosav-gyök a B(9), B(10), B( 12), B(26), B(27) vagy B(28) helyzetekben különbözik a humán inzulin-molekulában a megfelelő helyzetnél levő aminosav-gyöktől, azzaljellemezve, hogy a megfelelő DNS-t tartalmazó plazmiddal transzformált élesztőt tenyésztjük.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű humán inzulin-származékok előállítására, melyekben legalább egy X aminosav-gyök a B(9), B(12), B(27) vagy B(28) helyzetekben különbözik a humán inzulin-molekulában a megfelelő helyzetnél levő aminosav-gyöktől, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-t tartalmazó plazmiddal transzformált élesztőt tenyésztjük.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű humán inzulin-származékok előállítására, melyekben X jelentése a B27 helyzetben Glu, X jelentése a B12 helyzetben Ile vagy Tyr, X jelentése az A21 helyzetben Asp és a B27 helyzetben Glu, X jelentése a B9 helyzetben Asp, X jelentése az A21 helyzetben és a B9 helyzetben Asp és a B27 helyzetben Glu, X jelentése az A8 helyzetben His, a B9 helyzetben Asp és a B27 helyzetben Glu, X jelentése a BIO helyzetben Asp, vagy X jelentése a B9 helyzetben Asp és a B27 helyzetben Glu, vagy X jelentése a B28 helyzetben Asp, azzal jellemezve, hogy a megfelelő DNS-t tartalmazó plazmiddal transzformált élesztőt tenyésztjük.
  6. 6. Eljárás inzulin-aktivitással bíró injektálható oldatok előállítására, azzaljellemezve, hogy valamely 1. igénypont szerint előállított humán inzulin-származékot vagy ennek gyógyászatilag elfogadható sóját vizes, előnyösen semleges pH-jú oldattá alakítunk.
HU863754A 1985-08-30 1986-08-29 Process for producing new insuline analogues and pharmaceutical compositions containing them HU206518B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK395685A DK395685D0 (da) 1985-08-30 1985-08-30 Peptider
DK467785A DK467785D0 (da) 1985-10-14 1985-10-14 Peptider

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT42526A HUT42526A (en) 1987-07-28
HU206518B true HU206518B (en) 1992-11-30

Family

ID=26067291

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU863754A HU206518B (en) 1985-08-30 1986-08-29 Process for producing new insuline analogues and pharmaceutical compositions containing them

Country Status (25)

Country Link
US (1) US5618913A (hu)
EP (1) EP0214826B1 (hu)
JP (1) JP2662390B2 (hu)
KR (1) KR940000756B1 (hu)
CN (1) CN1029977C (hu)
AR (1) AR241801A1 (hu)
AT (1) ATE113061T1 (hu)
AU (1) AU593274B2 (hu)
CA (1) CA1306212C (hu)
CS (1) CS275613B6 (hu)
DD (1) DD268976A5 (hu)
DE (2) DE3650101T2 (hu)
ES (1) ES2001624A6 (hu)
FI (1) FI102182B (hu)
GR (1) GR862233B (hu)
HU (1) HU206518B (hu)
IE (1) IE66138B1 (hu)
IL (1) IL79887A (hu)
LU (1) LU90484I2 (hu)
NL (1) NL990042I2 (hu)
NO (2) NO177009C (hu)
NZ (1) NZ217406A (hu)
PH (1) PH25772A (hu)
PT (1) PT83278B (hu)
YU (2) YU46023B (hu)

Families Citing this family (219)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK437786D0 (da) * 1986-09-12 1986-09-12 Nordisk Gentofte Insulinprecursorer
AU612141B2 (en) * 1987-02-25 1991-07-04 Novo Nordisk A/S Novel insulin derivatives
US4992417A (en) * 1987-07-17 1991-02-12 Mount Sinai School Of Medicine Superactive human insulin analogues
US4992418A (en) * 1987-07-17 1991-02-12 Mount Sinai School Of Medicine Superactive human insulin analogue-[10-Aspartic Acid-B]Human Insulin
CA1340772C (en) 1987-12-30 1999-09-28 Patricia Tekamp-Olson Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
WO1990001038A1 (en) * 1988-07-20 1990-02-08 Nordisk Gentofte A/S Human insulin analogs and preparations containing them
DE3837825A1 (de) * 1988-11-08 1990-05-10 Hoechst Ag Neue insulinderivate, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung
AU641631B2 (en) * 1988-12-23 1993-09-30 Novo Nordisk A/S Human insulin analogues
US5716927A (en) * 1988-12-23 1998-02-10 Novo Nordisk A/S Insulin analogs having a modified B-chain
US5514646A (en) * 1989-02-09 1996-05-07 Chance; Ronald E. Insulin analogs modified at position 29 of the B chain
ATE120762T1 (de) * 1989-04-20 1995-04-15 Sinai School Medicine Hepatospezifische insulin-analoga.
US5208217A (en) * 1989-04-20 1993-05-04 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Hepatospecific insulin analogues
DK155690D0 (da) * 1990-06-28 1990-06-28 Novo Nordisk As Nye peptider
DK158390D0 (da) * 1990-07-02 1990-07-02 Novo Nordisk As Nye peptider
DK10191D0 (da) * 1991-01-22 1991-01-22 Novo Nordisk As Hidtil ukendte peptider
DK33591D0 (hu) * 1991-02-27 1991-02-27 Novo Nordisk As
ZA924448B (en) * 1991-06-21 1993-12-17 Lilly Co Eli Insulin Analogs
CZ158895A3 (en) * 1992-12-18 1995-12-13 Lilly Co Eli Insulin analog, process of its preparation and pharmaceutical composition containing thereof
DK72793D0 (da) * 1993-06-21 1993-06-21 Novo Nordisk As Nyt produkt
AU6995794A (en) * 1993-06-21 1995-01-17 Novo Nordisk A/S Aspb28 insulin crystals
US5461031A (en) * 1994-06-16 1995-10-24 Eli Lilly And Company Monomeric insulin analog formulations
US5474978A (en) * 1994-06-16 1995-12-12 Eli Lilly And Company Insulin analog formulations
US5504188A (en) * 1994-06-16 1996-04-02 Eli Lilly And Company Preparation of stable zinc insulin analog crystals
US5547929A (en) 1994-09-12 1996-08-20 Eli Lilly And Company Insulin analog formulations
AU3562195A (en) * 1994-10-04 1996-04-26 Novo Nordisk A/S Preparations containing aspb28 human insulin and nicotinamide
US5597893A (en) * 1994-10-31 1997-01-28 Eli Lilly And Company Preparation of stable insulin analog crystals
US5646242A (en) * 1994-11-17 1997-07-08 Eli Lilly And Company Selective acylation of epsilon-amino groups
US5693609A (en) * 1994-11-17 1997-12-02 Eli Lilly And Company Acylated insulin analogs
YU18596A (sh) * 1995-03-31 1998-07-10 Eli Lilly And Company Analogne formulacije monomernog insulina
US5631347A (en) * 1995-06-07 1997-05-20 Eli Lilly And Company Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein
US5700904A (en) * 1995-06-07 1997-12-23 Eli Lilly And Company Preparation of an acylated protein powder
BR9709845B1 (pt) * 1996-06-20 2008-11-18 preparaÇço aquosa de insulina, formulaÇço farmacÊutica parenteral, e, processso para aumentar a estabilidade quÍmica de uma preparaÇço de insulina.
CO4750643A1 (es) * 1997-06-13 1999-03-31 Lilly Co Eli Formulacion estable de la insulina que contiene l-arginina y protamina
DE19726167B4 (de) 1997-06-20 2008-01-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung
JP2001521004A (ja) 1997-10-24 2001-11-06 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 脂肪酸−アシル化インスリン類似体
US6531448B1 (en) * 1997-12-23 2003-03-11 Eli Lilly And Company Insoluble compositions for controlling blood glucose
AU741037B2 (en) * 1998-02-23 2001-11-22 Neurocrine Biosciences, Inc. Methods for treatment of diabetes using peptide analogues of insulin
DE19825447A1 (de) * 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
AUPP609198A0 (en) * 1998-09-22 1998-10-15 Curtin University Of Technology Use of non-peptidyl compounds for the treatment of insulin related ailments
US6933272B1 (en) 1998-09-22 2005-08-23 Erik Helmerhorst Use of non-peptidyl compounds for the treatment of insulin related ailments
PT1141014E (pt) 1999-01-06 2005-04-29 Genentech Inc Variante mutante do factor de crescimento semelhante a insulina (igf-i)
JP2002535967A (ja) 1999-01-06 2002-10-29 ジェネンテック・インコーポレーテッド インシュリン様成長因子（ｉｇｆ）ｉ変異体
US6746853B1 (en) * 1999-05-19 2004-06-08 Xencor, Inc. Proteins with insulin-like activity useful in the treatment of diabetes
CN1125081C (zh) * 1999-09-08 2003-10-22 中国科学院上海生物化学研究所 重组天然和新型人胰岛素及其制备方法
US7022674B2 (en) * 1999-12-16 2006-04-04 Eli Lilly And Company Polypeptide compositions with improved stability
US6689747B2 (en) 2000-03-24 2004-02-10 Genentech, Inc. Use of insulin for the treatment of cartilagenous disorders
JP2003532691A (ja) * 2000-05-05 2003-11-05 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 重症疾患神経障害
AU2001263215A1 (en) 2000-05-16 2001-11-26 Genentech Inc. Method for treating cartilage disorders
AR025646A1 (es) * 2000-09-13 2002-12-04 Beta Lab Sa Cepa de levaduras metilotroficas recombinantes productoras de un precursor de insulina, construcciones de adn y metodo para obtener la cepa.
US7202059B2 (en) 2001-02-20 2007-04-10 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium
US7638618B2 (en) 2001-02-20 2009-12-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest
DE10114178A1 (de) 2001-03-23 2002-10-10 Aventis Pharma Gmbh Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
WO2003031432A1 (en) 2001-10-12 2003-04-17 Novo Nordisk A/S Substituted piperidines and their use for the treatment of diseases related to the histamine h3 receptor
RU2376379C2 (ru) 2001-11-19 2009-12-20 Ново Нордиск А/С Способ получения инсулиновых соединений
GB0206792D0 (en) 2002-03-22 2002-05-01 Leuven K U Res & Dev Normoglycemia
DE10227232A1 (de) 2002-06-18 2004-01-15 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
US7193035B2 (en) 2002-10-29 2007-03-20 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Crystals of insulin analogs and processes for their preparation
US7871607B2 (en) * 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
WO2004089896A1 (en) 2003-04-11 2004-10-21 Novo Nordisk A/S 11β-HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE TYPE 1 ACTIVE COMPOUNDS
RU2381103C2 (ru) 2003-06-27 2010-02-10 Ново Нордиск А/С Контейнер для жидких фармацевтических композиций с высокими влагозащитными свойствами
US20060183667A1 (en) * 2003-07-11 2006-08-17 Novo Nordisk A/S Stabilised insulin compositions
WO2005005477A2 (en) * 2003-07-11 2005-01-20 Novo Nordisk A/S Stabilised insulin compositions
AU2004261319B2 (en) * 2003-07-25 2010-12-23 Conjuchem Biotechnologies Inc. Long lasting insulin derivatives and methods thereof
DK2107069T3 (da) 2003-08-05 2013-04-15 Novo Nordisk As Nye insulinderivater
EP2264065B1 (en) 2003-08-05 2017-03-08 Novo Nordisk A/S Novel insulin derivatives
US20060287221A1 (en) * 2003-11-13 2006-12-21 Novo Nordisk A/S Soluble pharmaceutical compositions for parenteral administration comprising a GLP-1 peptide and an insulin peptide of short time action for treatment of diabetes and bulimia
JP4800959B2 (ja) * 2003-11-13 2011-10-26 ノヴォ ノルディスク アー／エス 糖尿病及び過食症を治療するためのｇｌｐ−１ペプチド及び短時間作用型インスリンペプチドを含む、非経口投与用の可溶性医薬組成物
PL1687019T3 (pl) 2003-11-20 2018-05-30 Novo Nordisk A/S Formulacje peptydowe zawierające glikol propylenowy, które są optymalne do produkcji i do zastosowania w urządzeniach do wstrzykiwań
CN1902226A (zh) 2003-12-03 2007-01-24 诺和诺德公司 单链胰岛素
CN1898087A (zh) 2003-12-22 2007-01-17 诺沃挪第克公司 用于储存药物液体的透明、柔性、不可渗透的塑料容器
RU2385879C2 (ru) 2004-01-21 2010-04-10 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг Способ конъюгации пептидов, опосредованной трансглутаминазой
RU2393168C2 (ru) 2004-07-19 2010-06-27 Биокон Лимитед Инсулин-олигомерные конъюгаты, их препараты и применения
CN102140875B (zh) 2004-11-04 2014-11-26 亨特道格拉斯有限公司 用于建筑开口的单轨道层叠板体遮蔽件
US7833513B2 (en) 2004-12-03 2010-11-16 Rhode Island Hospital Treatment of Alzheimer's Disease
ES2428510T3 (es) 2005-02-02 2013-11-08 Novo Nordisk A/S Derivados de insulina
ES2435522T3 (es) 2005-02-02 2013-12-20 Novo Nordisk A/S Derivados de insulina
KR101286569B1 (ko) 2005-07-04 2013-07-23 하이 포인트 파마슈티칼스, 엘엘씨 신규 약제
ES2426345T3 (es) 2005-07-20 2013-10-22 Eli Lilly And Company Compuesto unidos en posición 1-amino
CN101243190B (zh) 2005-08-16 2015-05-13 诺沃-诺迪斯克有限公司 制备成熟胰岛素多肽的方法
BRPI0616054B8 (pt) 2005-09-14 2021-05-25 Sanofi Aventis Deutschland processo para a preparação de insulina, um análogo de insulina ou um derivado de insulina, tripsina porcina, método para sua produção, dna e vetor
PT1951658E (pt) 2005-11-17 2012-11-12 Lilly Co Eli Antagonistas do receptor do glucagon, preparação e utilizações terapêuticas
EP2505593A1 (en) 2005-12-28 2012-10-03 Novo Nordisk A/S Compositions comprising an acylated insulin and zinc and method of making the said compositions
US8343914B2 (en) * 2006-01-06 2013-01-01 Case Western Reserve University Fibrillation resistant proteins
WO2007096332A1 (en) * 2006-02-21 2007-08-30 Novo Nordisk A/S Single-chain insulin analogues and pharmaceutical formulations thereof
ES2387955T3 (es) 2006-02-27 2012-10-04 Novo Nordisk A/S Derivados de insulina
ES2397659T3 (es) 2006-03-15 2013-03-08 Novo Nordisk A/S Mezclas de amilina e insulina
AU2007229492B2 (en) 2006-03-28 2011-11-03 High Point Pharmaceuticals, Llc Benzothiazoles having histamine H3 receptor activity
DK2049475T3 (da) 2006-04-24 2012-03-05 Lilly Co Eli Cyclohexyl-substituerede pyrrolidinoner som inhibitorer af 11-beta-hydroxysteroid dehydrogenase1
MX2008014061A (es) 2006-05-09 2008-11-14 Novo Nordisk As Derivado de insulina.
JP5269766B2 (ja) 2006-05-09 2013-08-21 ノボ・ノルデイスク・エー／エス インスリン誘導体
BRPI0711370A2 (pt) 2006-05-29 2011-11-01 High Point Pharmaceuticals Llc 3-(1,3-benzodioxol-5-il)-6-(4-ciclopropilpiperazin-1-il)pi ridazina e seus sais e solvatos e seu uso como antagonista receptor h3 de histamina
WO2007140619A1 (en) * 2006-06-08 2007-12-13 Diabecore Medical Inc. Derivatized insulin oligomers
DE102006031955A1 (de) * 2006-07-11 2008-01-17 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Verfahren zur Herstellung von Insulinanaloga mit dibasischem B-Kettenende
DE102006031962A1 (de) 2006-07-11 2008-01-17 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Amidiertes Insulin Glargin
US20090306337A1 (en) 2006-07-31 2009-12-10 Novo Nordisk A/S Pegylated, Extended Insulins
AU2007298919C1 (en) * 2006-09-22 2014-02-06 Novo Nordisk A/S Protease resistant insulin analogues
ES2554773T3 (es) 2006-10-04 2015-12-23 Case Western Reserve University Insulina y análogos de la insulina resistentes a la fibrilación
WO2008049711A1 (en) * 2006-10-27 2008-05-02 Novo Nordisk A/S Peptide extended insulins
US10100098B2 (en) 2006-12-13 2018-10-16 Stelis Biopharma Private Limited Insulin production methods and proinsulin constructs
US20120214963A1 (en) * 2011-02-23 2012-08-23 Elona Biotechnologies Aspart proinsulin compositions and methods of producing aspart insulin analogs therefrom
WO2008132224A2 (en) 2007-04-30 2008-11-06 Novo Nordisk A/S Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein
WO2008139496A1 (en) * 2007-05-16 2008-11-20 Bigtec Private Limited Recombinant human insulin and a method thereof
EP2164459A1 (en) 2007-06-01 2010-03-24 Novo Nordisk A/S Stable non-aqueous pharmaceutical compositions
EP2514406A1 (en) 2007-06-01 2012-10-24 Novo Nordisk A/S Spontaneously dispersible preconcentrates including a peptide drug in a solid or semisolid carrier
US9034818B2 (en) 2007-06-13 2015-05-19 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical formulations comprising an insulin derivative
JP5710253B2 (ja) 2007-08-13 2015-04-30 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 速効型インスリンアナログ
CN101796071A (zh) * 2007-08-13 2010-08-04 诺沃-诺迪斯克有限公司 快速作用的胰岛素类似物
ES2526924T3 (es) 2007-08-15 2015-01-16 Novo Nordisk A/S Insulinas con una fracción acilo que comprende unidades repetitivas de aminoácidos que contienen alquilenglicol
CN101784562B (zh) 2007-08-15 2016-07-13 诺沃-诺迪斯克有限公司 具有酰基和亚烷基二醇部分的胰岛素类似物
JP5547083B2 (ja) 2007-11-20 2014-07-09 アンブルックス，インコーポレイテッド 修飾されたインスリンポリペプチドおよびそれらの使用
CN102007143B (zh) 2008-01-09 2015-08-26 塞诺菲-安万特德国有限公司 具有超延迟时效特征的新型胰岛素衍生物
PT2254906T (pt) 2008-03-18 2017-01-03 Novo Nordisk As Análogos de insulina acilados, estabilizados contra proteases
ES2563553T3 (es) 2008-04-01 2016-03-15 Novo Nordisk A/S Conjugados de insulina-albúmina
WO2009129250A2 (en) * 2008-04-14 2009-10-22 Case Western Reserve University Meal-time insulin analogues of enhanced stability
JP2011521621A (ja) * 2008-04-22 2011-07-28 ケイス、ウエスタン、リザーブ、ユニバーシティ アイソフォーム特異的インスリン類似体
TWI394580B (zh) 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
TWI451876B (zh) 2008-06-13 2014-09-11 Lilly Co Eli 聚乙二醇化之離脯胰島素化合物
KR20120129875A (ko) 2008-07-31 2012-11-28 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티 염소화 아미노산을 갖는 인슐린 유사체
US9200053B2 (en) 2008-07-31 2015-12-01 Case Western Reserve University Insulin analogues containing penta-fluoro-Phenylalanine at position B24
MX2011001408A (es) 2008-08-07 2011-05-02 Biocon Ltd Proceso para la preparacion de compuestos de insulina.
DE102009038210A1 (de) 2009-08-20 2011-03-03 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten
DE102008053048A1 (de) 2008-10-24 2010-04-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten
DE102008051834A1 (de) 2008-10-17 2010-04-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Kombination von einem Insulin und einem GLP-1-Agonisten
MX344293B (es) * 2008-10-17 2016-12-13 Sanofi Aventis Deutschland Combinacion de una insulina y un agonista de glp-1.
WO2010049488A1 (en) 2008-10-30 2010-05-06 Novo Nordisk A/S Treating diabetes melitus using insulin injections with less than daily injection frequency
KR20110088575A (ko) 2008-11-21 2011-08-03 하이 포인트 파마슈티칼스, 엘엘씨 아다만틸 벤즈아미드 화합물
US9018190B2 (en) 2009-03-27 2015-04-28 Adocia Functionalized oligosaccharides
FR2943538B1 (fr) 2009-03-27 2011-05-20 Adocia Formulation a action rapide d'insuline recombinante humaine
TW201105346A (en) 2009-07-06 2011-02-16 Sanofi Aventis Deutschland Heat-stable and vibration-stable insulin preparations
WO2011003823A1 (de) 2009-07-06 2011-01-13 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Langsamwirkende insulinzubereitungen
PT2451437T (pt) 2009-07-06 2017-01-17 Sanofi Aventis Deutschland Preparações aquosas de insulina contendo metionina
MA33466B1 (fr) 2009-07-31 2012-07-03 Sanofi Aventis Deutschland Composition d'insuline à longue duree d'action
CA2769340C (en) 2009-07-31 2018-09-11 Harald Rau Prodrugs comprising an insulin linker conjugate
US8399407B2 (en) * 2009-09-17 2013-03-19 Case Western Reserve University Non-standard insulin analogues
KR101772372B1 (ko) 2009-11-13 2017-08-29 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하 Ｇｌｐ-1 효능제 및 메티오닌을 포함하는 약제학적 조성물
AU2010317995B2 (en) 2009-11-13 2014-04-17 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical composition comprising a GLP-1 agonist, an insulin, and methionine
US8637096B2 (en) 2009-12-04 2014-01-28 Curtis C. Stojan Compositions and method for enhancing insulin activity
CA2783763A1 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Case Western Reserve University Insulin analogues with chlorinated amino acids
EP2460527A1 (en) 2010-01-21 2012-06-06 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
UY33326A (es) 2010-04-14 2011-12-01 Sanofi Aventis Conjugados de insulina-sirna
EP2569002B1 (en) * 2010-05-10 2016-10-26 Novo Nordisk A/S Process for the preparation of insulin-zinc complexes
WO2011159895A2 (en) 2010-06-16 2011-12-22 Indiana University Research And Technology Corporation Single chain insulin agonists exhibiting high activity at the insulin receptor
RU2598273C2 (ru) * 2010-06-23 2016-09-20 Ново Нордиск А/С Производные инсулина, содержащие дополнительные дисульфидные связи
AU2011291943B2 (en) 2010-08-17 2015-01-22 Ambrx, Inc. Modified relaxin polypeptides and their uses
CN103179978A (zh) 2010-08-30 2013-06-26 赛诺菲-安万特德国有限公司 Ave0010用于制造供治疗2型糖尿病用的药物的用途
EP2438930A1 (en) 2010-09-17 2012-04-11 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Prodrugs comprising an exendin linker conjugate
AU2011322495A1 (en) 2010-10-27 2013-04-11 Novo Nordisk A/S Treating diabetes melitus using insulin injections administered with varying injection intervals
JP6049625B2 (ja) 2010-10-27 2016-12-21 ノヴォ ノルディスク アー／エス 様々な注射間隔を用いて施されるインスリン注射を使用する、真性糖尿病の治療
EP2651432A1 (en) 2010-12-14 2013-10-23 Novo Nordisk A/S Fast-acting insulin in combination with long-acting insulin
US9447163B2 (en) * 2011-02-01 2016-09-20 Novo Nordisk A/S Purification of insulin
EP2670368A4 (en) 2011-02-03 2015-04-15 Pharmedica Ltd NEW ORAL DISSOLUTION FILMS FOR INSULIN DELIVERY FOR THE TREATMENT OF DIABETES
WO2012115638A1 (en) 2011-02-23 2012-08-30 Elona Biotechnologies Glargine proinsulin compositions and methods of producing glargine insulin analogs therefrom
WO2012115637A1 (en) * 2011-02-23 2012-08-30 Elona Biotechnologies Aspart proinsulin compositions and methods of producing aspart insulin analogs
JP2014509603A (ja) 2011-03-15 2014-04-21 ノヴォ ノルディスク アー／エス システイン置換を含むヒトインスリン類似体およびヒトインスリン誘導体
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
US20130011378A1 (en) 2011-06-17 2013-01-10 Tzung-Horng Yang Stable formulations of a hyaluronan-degrading enzyme
EP2548570A1 (en) 2011-07-19 2013-01-23 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
AU2012300978B2 (en) 2011-08-29 2017-04-27 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for use in glycemic control in diabetes type 2 patients
TWI559929B (en) 2011-09-01 2016-12-01 Sanofi Aventis Deutschland Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease
US20130231281A1 (en) 2011-11-02 2013-09-05 Adocia Rapid acting insulin formulation comprising an oligosaccharide
MX2014006698A (es) * 2011-12-15 2014-07-09 Shanghai Hengrui Pharm Co Ltd Analogo de insulina humana y derivado acilado del mismo.
WO2013096386A1 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Indiana University Research And Technology Corporation Ctp-based insulin analogs for treatment of diabetes
KR20150002777A (ko) 2012-04-11 2015-01-07 노보 노르디스크 에이/에스 인슐린 제제
BR112014026442A8 (pt) 2012-05-01 2018-01-16 Novo Nordisk As combinação para alcançar o controle glicêmico, seu uso, e composição farmacêutica.
WO2013173923A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 Diamedica, Inc. Formulations of human tissue kallikrein-1 for parenteral delivery and related methods
HUE032613T2 (hu) 2012-06-04 2017-10-30 Diamedica Therapeutics Inc Humán szöveti kallikrein 1 glikozilezett izoformák
CN104981251B (zh) 2012-09-26 2018-03-20 印第安纳大学研究及科技有限公司 胰岛素类似物二聚体
JP6322642B2 (ja) 2012-11-13 2018-05-09 アドシア 置換されたアニオン性化合物を含有する速効型インスリン製剤
WO2014088836A1 (en) 2012-12-03 2014-06-12 Merck Sharp & Dohme Corp. O-glycosylated carboxy terminal portion (ctp) peptide-based insulin and insulin analogues
WO2014093696A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Massachusetts Institute Of Technology Insulin derivatives for diabetes treatment
NZ707160A (en) 2012-12-19 2016-08-26 Wockhardt Ltd A stable aqueous composition comprising human insulin or an analogue or derivative thereof
CA2889162A1 (en) 2012-12-26 2014-07-03 Wockhardt Limited Pharmaceutical composition
TWI641381B (zh) 2013-02-04 2018-11-21 法商賽諾菲公司 胰島素類似物及／或胰島素衍生物之穩定化醫藥調配物
BR112015023071A2 (pt) 2013-03-14 2017-07-18 Univ Indiana Res & Tech Corp conjugados de insulina-incretina
EP2991672A1 (en) 2013-04-30 2016-03-09 Novo Nordisk A/S Novel administration regime
JP2016531847A (ja) 2013-09-30 2016-10-13 ウォックハート リミテッド 医薬組成物
KR20160065126A (ko) 2013-10-07 2016-06-08 노보 노르디스크 에이/에스 인슐린 유사체의 신규한 유도체
CA2932875A1 (en) 2014-01-09 2015-07-16 Sanofi Stabilized glycerol free pharmaceutical formulations of insulin analogues and/or insulin derivatives
MX2016008977A (es) 2014-01-09 2016-10-04 Sanofi Sa Formulaciones farmaceuticas de insulina aspart estabilizadas.
AU2015205624A1 (en) 2014-01-09 2016-07-14 Sanofi Stabilized pharmaceutical formulations of insulin analogues and/or insulin derivatives
US9795678B2 (en) 2014-05-14 2017-10-24 Adocia Fast-acting insulin composition comprising a substituted anionic compound and a polyanionic compound
FR3020947B1 (fr) 2014-05-14 2018-08-31 Adocia Composition aqueuse comprenant au moins une proteine et un agent solubilisant, sa preparation et ses utilisations
WO2015196174A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Greene Howard E Infusion delivery devices and methods
WO2016001862A1 (en) 2014-07-04 2016-01-07 Wockhardt Limited Extended release formulations of insulins
JP6657230B2 (ja) 2014-09-24 2020-03-04 インディアナ ユニヴァーシティ リサーチ アンド テクノロジー コーポレイション インクレチン−インスリンコンジュゲート
KR102569743B1 (ko) 2014-10-06 2023-08-23 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티 이상 단일 사슬 인슐린 유사체
WO2016081670A2 (en) 2014-11-21 2016-05-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin receptor partial agonists
TN2017000235A1 (en) 2014-12-12 2018-10-19 Sanofi Aventis Deutschland Insulin glargine/lixisenatide fixed ratio formulation
TW201630622A (zh) 2014-12-16 2016-09-01 美國禮來大藥廠 速效胰島素組合物
CN105884879A (zh) * 2015-01-26 2016-08-24 漳州博欣生物技术有限公司 一种胰岛素类似物的化学合成方法
TWI748945B (zh) 2015-03-13 2021-12-11 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患治療
TW201705975A (zh) 2015-03-18 2017-02-16 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患之治療
JP2018531900A (ja) 2015-08-25 2018-11-01 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規インスリン誘導体及びその医学的使用
JO3749B1 (ar) 2015-08-27 2021-01-31 Lilly Co Eli تركيبات إنسولين سريعة المفعول
FR3043557B1 (fr) 2015-11-16 2019-05-31 Adocia Composition a action rapide d'insuline comprenant un citrate substitue
EP3442997A2 (en) 2016-04-15 2019-02-20 Indiana University Research & Technology Corporation Fgf21 c-terminal peptide optimization
GB201607918D0 (en) 2016-05-06 2016-06-22 Arecor Ltd Novel formulations
EP3922260A3 (en) 2016-05-24 2022-06-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin receptor partial agonists and glp-1 analogues
EP3463413A4 (en) 2016-05-25 2020-03-04 Merck Sharp & Dohme Corp. PARTIAL INSULIN RECEPTOR AGONISTS
EP3495384A4 (en) * 2016-08-02 2020-02-26 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. ACYLATED DERIVATIVE OF HUMAN INSULIN OR ANALOGUE OF IT
CA3034971A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Arecor Limited A pharmaceutical insulin formulation
PE20210857A1 (es) 2016-12-16 2021-05-18 Novo Nordisk As Composiciones farmaceuticas que contienen insulina
CA3054962A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Rick PAULS Dosage forms of tissue kallikrein 1
GB201707188D0 (en) 2017-05-05 2017-06-21 Arecor Ltd Novel formulations
GB201707189D0 (en) 2017-05-05 2017-06-21 Arecor Ltd Novel formulations
GB201707187D0 (en) 2017-05-05 2017-06-21 Arecor Ltd Novel formulations
MX2019014195A (es) 2017-06-01 2020-01-27 Lilly Co Eli Composiciones de insulina de rapida accion.
JP2020531451A (ja) 2017-08-17 2020-11-05 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規のアシル化インスリン類似体およびそれらの使用
CN111989088A (zh) 2018-04-04 2020-11-24 艾瑞克有限公司 用于递送胰岛素化合物的医用输注泵系统
WO2019193349A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Arecor Limited Medical infusion pump system for the delivery of an insulin compound
IL277720B2 (en) 2018-04-04 2024-03-01 Arecor Ltd A medical infusion pump system for administration of an insulin compound
US10335464B1 (en) 2018-06-26 2019-07-02 Novo Nordisk A/S Device for titrating basal insulin
CN112584853B (zh) * 2018-09-12 2021-12-10 美药星（南京）制药有限公司 一种新型门冬胰岛素原的结构和制备门冬胰岛素的方法
KR20200082618A (ko) 2018-12-31 2020-07-08 주식회사 폴루스 인슐린 과발현용 램프 태그 및 이를 이용한 인슐린의 제조방법
AR120717A1 (es) * 2019-12-11 2022-03-09 Novo Nordisk As Análogos de insulina y usos de los mismos
BR112022013042A2 (pt) 2019-12-30 2022-10-18 Gan & Lee Pharmaceuticals Co Ltd Composto da fórmula b, formulação farmacêutica, composição farmacêutica, método para tratar ou prevenir hiperglicemia, diabetes e/ou obesidade
JP2023510219A (ja) 2019-12-30 2023-03-13 ガン アンド リー ファーマスゥーティカルズ カンパニー リミテッド インスリン誘導体
GB202004814D0 (en) 2020-04-01 2020-05-13 Arecor Ltd Novel formulations
TW202409070A (zh) 2022-05-18 2024-03-01 美商普羅托莫科技公司 芳族含硼化合物及相關胰島素類似物

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2252157C3 (de) * 1972-10-25 1976-03-18 Hoechst Ag Zwischenprodukte zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten und verfahren zur herstellung von insulin, insulin analogen und derivaten
US4652525A (en) * 1978-04-19 1987-03-24 The Regents Of The University Of California Recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of insulin genes
US4411994A (en) * 1978-06-08 1983-10-25 The President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
US4565785A (en) * 1978-06-08 1986-01-21 The President And Fellows Of Harvard College Recombinant DNA molecule
JPS55138391A (en) * 1979-04-13 1980-10-29 Shionogi & Co Ltd New synthetic method of peptide derivative
IE50892B1 (en) * 1980-02-11 1986-08-06 Novo Industri As Process for preparing insulin esters
US4340674A (en) * 1980-05-05 1982-07-20 The Upjohn Company Cointegrate plasmids and their construction from plasmids of Escherichia and Streptomyces
US4351901A (en) * 1980-03-24 1982-09-28 Cetus Corporation Method for single nucleotide alteration
DK319780A (da) * 1980-07-24 1982-01-25 Forenede Bryggerier As Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyren i insuliner
ZA824218B (en) * 1981-06-29 1983-04-27 Cetus Corp Plasmid for producing human insulin
DK58285D0 (da) * 1984-05-30 1985-02-08 Novo Industri As Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf
US5008241A (en) * 1985-03-12 1991-04-16 Novo Nordisk A/S Novel insulin peptides
DK129385A (da) * 1985-03-22 1986-09-23 Novo Industri As Peptider og fremstilling deraf
DK134189D0 (da) * 1989-03-20 1989-03-20 Nordisk Gentofte Insulinforbindelser
US5559094A (en) * 1994-08-02 1996-09-24 Eli Lilly And Company AspB1 insulin analogs

Also Published As

Publication number Publication date
IE66138B1 (en) 1995-12-13
CS275613B6 (en) 1992-03-18
ATE113061T1 (de) 1994-11-15
PT83278A (en) 1986-09-01
FI863512A0 (fi) 1986-08-29
NZ217406A (en) 1989-05-29
KR870002165A (ko) 1987-03-30
NO177009C (no) 1995-07-05
KR940000756B1 (ko) 1994-01-29
AU6206686A (en) 1987-03-05
EP0214826A3 (en) 1987-06-03
YU46857B (sh) 1994-06-24
DD268976A5 (de) 1989-06-14
PH25772A (en) 1991-10-18
JPS6253999A (ja) 1987-03-09
HUT42526A (en) 1987-07-28
AU593274B2 (en) 1990-02-08
FI863512A (fi) 1987-03-01
PT83278B (pt) 1989-03-30
AR241801A1 (es) 1992-12-30
CS8606310A2 (en) 1990-09-12
CA1306212C (en) 1992-08-11
NO863474D0 (no) 1986-08-29
NL990042I2 (nl) 2000-03-01
EP0214826A2 (en) 1987-03-18
FI102182B1 (fi) 1998-10-30
DE10075008I2 (de) 2004-10-21
YU46023B (sh) 1992-12-21
DE10075008I1 (de) 2000-05-18
LU90484I2 (fr) 2000-02-21
GR862233B (en) 1986-12-31
NL990042I1 (nl) 2000-02-01
DE3650101T2 (de) 1995-02-23
NO177009B (no) 1995-03-27
CN1029977C (zh) 1995-10-11
JP2662390B2 (ja) 1997-10-08
NO2000005I1 (no) 2000-07-21
US5618913A (en) 1997-04-08
FI102182B (fi) 1998-10-30
NO863474L (no) 1987-03-02
YU4188A (en) 1990-06-30
EP0214826B1 (en) 1994-10-19
CN86106574A (zh) 1988-08-03
YU148486A (en) 1991-04-30
DE3650101D1 (de) 1994-11-24
IE862317L (en) 1987-02-28
ES2001624A6 (es) 1988-06-01
IL79887A (en) 1991-11-21
IL79887A0 (en) 1986-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU206518B (en) Process for producing new insuline analogues and pharmaceutical compositions containing them
AU615760B2 (en) Insulin analogues
FI87801C (fi) Foerfarande foer framstaellning av maenniskoinsulinprekursorer samt i foerfarandet anvaenda dna-sekvensen och plasmider
JP2609367B2 (ja) プロセッシング部位に隣接する負に帯電したアミノ酸からなる酵母プロセッシングシステム
FI89183C (fi) Dna-sekvens som kodar foer insulinprekursorer, vektorer innehaollande denna sekvens, insulinprekursorer och foerfarande foer framstaellning av dessa samt foerfarande foer framstaellning av humaninsulin
EP0375437B1 (en) Human insulin analogues
EP0347845B1 (en) Insulin precursors, their preparation, and dna sequences, expression vehicles and primers and a process for producing human insulin and analogues
AU619768B2 (en) Polypeptides
EP0463072B1 (en) Novel insulin compounds
WO1992008736A1 (fr) Mutant d'hirudine, sa production, anticoagulant, vecteur secretoire, microorganisme transforme par ledit vecteur et production d'un produit a partir dudit microorganisme
FI104428B (fi) Menetelmä aprotiniinin ja aprotiniinihomologien tuottamiseksi hiivassa
RU2104305C1 (ru) Аналоги инсулина человека, способ их получения, раствор для инъекций
JPH06306100A (ja) Ｖｉｐアナログ調製用融合蛋白、ｖｉｐアナログの製法並びにそのための遺伝子組換えプラスミド及び形質転換微生物
DK159274B (da) Hurtigt virkende human insulinanaloger og injicerbare oploesninger med hurtigt indsaettende virkning indeholdende saadanne insulinanaloger
HUT72848A (en) Dna sequences encoding novel biosynthetic insulin precursors and process for preparation of insulin