MX2014006698A - Analogo de insulina humana y derivado acilado del mismo. - Google Patents

Analogo de insulina humana y derivado acilado del mismo.

Info

Publication number
MX2014006698A
MX2014006698A MX2014006698A MX2014006698A MX2014006698A MX 2014006698 A MX2014006698 A MX 2014006698A MX 2014006698 A MX2014006698 A MX 2014006698A MX 2014006698 A MX2014006698 A MX 2014006698A MX 2014006698 A MX2014006698 A MX 2014006698A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
chain
human insulin
seq
insulin
group
Prior art date
Application number
MX2014006698A
Other languages
English (en)
Inventor
Piaoyang Sun
Lianshan Zhang
Jiajian Liu
Jijun Yuan
Chunqian Fang
Changan Sun
Hengli Yuan
Yali Wang
Original Assignee
Shanghai Hengrui Pharm Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Hengrui Pharm Co Ltd filed Critical Shanghai Hengrui Pharm Co Ltd
Publication of MX2014006698A publication Critical patent/MX2014006698A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Abstract

La presente invención proporciona un análogo de insulina humana, un derivado acilado del mismo y una sal fisiológicamente tolerable y la presente invención proporciona además un método de preparación para el análogo de insulina y una aplicación del análogo de insulina como un agente terapéutico, y particularmente como un agente terapéutico para diabetes mellitus.

Description

ANÁLOGO DE INSULINA HUMANA Y DERIVADO ACILADO DEL MISMO Campo de la Invención La presente invención se refiere a un nuevo análogo de insulina humana y derivados acilados del mismo, a los métodos de preparación del mismo, a la composición farmacéutica que comprende este análogo y derivados acilados del mismo, y al uso del mismo como un agente terapéutico, especialmente como agente terapéutico para diabetes.
Antecedentes de la Invención La diabetes (Diabetes Mellitus, DM) es una enfermedad endocrina metabólica común. Es un síndrome clínicamente crónico y sistémicamente metabólico, que se caracteriza por hiperglucemia crónica, perturbación del metabolismo de los carbohidratos, grasas y proteínas que resulta de una deficiencia absoluta relativa de insulina, o insensibilidad de los tejidos diana a insulina. Se provoca por la interacción de factores genéticos y ambientales, que comprenden varios sistemas corporales, incluyendo complicaciones cardio-cerebrovasculares, renales, oculares, nerviosas y orgánicas . Es una enfermedad que dura toda la vida, y es un peligro serio a la salud humana.
La diabetes es una enfermedad común que se presenta de forma frecuente, y ha llegado a ser la tercera enfermedad común más grande que amenaza vidas humanas después de cáncer y enfermedades cardiovasculares . Es un reto en el mundo. La DM amenaza la salud de las personas a pesar de la raza y de la nación. De acuerdo a las estadísticas de la International Diabetes Federation (IDF, por sus siglas en inglés) , durante los diez años desde mediados de 1980 a mediados de 1990 el último siglo, el número total de diabéticos incrementó 4 veces, hasta 120 millones. En 2007, el número global de diabéticos era de 246 millones, de los cuales 46% eran de la población de la fuerza laboral de 40-59 años de edad. Se anticipa que en 2025, el número global de diabéticos incrementará a 380 millones, dando cuenta de 7.1% de la población adulta global .
De acuerdo a los datos anunciados por la ADA (American Diabetes Association) en Enero del 2011, había 25.6 millones de diabéticos en los Estados Unidos de América, que dan cuenta de 8.3% de la población de los Estados Unidos de América. Entre el gran costo médico en los Estados Unidos de América, uno de cada 10 dólares se gasta para diabetes. En China, el número de diabéticos incrementó significativamente durante los recientes 20 años. Las investigaciones epidemiológicas revelaron que la prevalencia de diabetes es menos de 4% antes del 2002. Recientemente, una encuesta epidemiológica nacial de diabetes mostró que la prevalencia de diabetes entre adultos chinos (de 20 años de edad o mayores) es más de 10%. La prevalencia total de diabetes fue de 9.7%. Actualmente, hay más de 92 millones de personas que padecen de diabetes, otros 100 millones y 5000 personas llagarán a ser diabéticas. China está llegando a ser un país que tiene el número más grande de pacientes diabéticos, en lugar de la India.
La diabetes se divide principalmente en diabetes mellitus dependiente de insulina (diabetes tipo I) , diabetes mellitus independiente de insulina (diabetes tipo II) , así como otros tipos especiales de diabetes. La diabetes tipo I se presenta principalmente en niños y adolescentes, la edad pico es de 12 años de edad, que da cuenta de menos de 10% de los diabéticos. La diabetes tipo II se presenta principalmente en adultos, que da cuenta de más de 90% de los diabéticos. Los mecanismos patológicos exactos que fundamentan la diabetes aun son desconocidos, no hay cura para la diabetes . Actualmente la terapia para la diabetes se enfoca en el tratamiento y control con fármacos . Para una pequeña porción de pacientes que padecen de diabetes tipo , se puede usar dieta y terapia de ejercicio para controlar la condición, en tanto que para la vasta mayoría de pacientes, es necesaria una terapia con fármacos . La terapia con fármacos incluye medicina china y medicina química. La medicina química es predominante, y se divide en dos categorías: fármacos de proteína y de polipéptidos representados por insulina y análogos de la misma, y fármacos anti-diabéticos de molécula pequeña para administración oral.
Con el incremento dramático en el número de pacientes diabéticos a nivel mundial, también está creciendo rápidamente el mercado global de fármacos para diabetes. De acuerdo a las estadísticas, en 2005 el mercado de fármacos para diabetes alcanzó $18.6 billones de dólares americanos, un incremento de 11.5% en comparación al año previo. En 2006, fue de $21.2 billones dólares americanos, un incremento de 14%. En 2007, fue de $24.1 billones de dólares americanos, un incremento del 13.7%, clasificando quinto en el mercado farmacéutico global . Se predice una velocidad de crecimiento anual de 15 a 20 por ciento. La investigación y los mercados reportan que la insulina y los análogos de las misma dan cuenta de 40.1% del mercado total de fármacos para diabéticos, los fármacos hipoglucémicos orales dan cuenta de 58% y otros fármacos comparten el 1.9% restante.
Una serie de solicitudes de patente ha descrito algunos análogos de la insulina, que comprenden sustituciones de aminoácidos en varios sitios de secuencias naturales de insulina humana. La EP0425482B1 describe un análogo de insulina que tiene sus sustituciones de His y Tyr en la posición B25. La EP0419504B1 describe un análogo de insulina que tiene una sustitución en la posición B3, simultáneamente que tiene la sustitución de Gln en A5 o A15, de manera alternativa, la sustitución de Asn en A21 o A18. La US5008241A describe un análogo de insulina que tiene una sustitució específica de aminoácido en A21, así como una sustitución específica de aminoácido en A4, A17, B13 o B21. La US5164366A describe un análogo de insulina que tiene la supresión de aminoácido en una de las posiciones B24, B25. B26 y B27. La CN1195777C describe un análogo de insulina que tiene sustituciones en las posiciones A8, A9, A10, B30. La US7193035B2 describe un análogo cristalino de insulina que tiene una sustitución en la posición B3 y al menos una sustitución en una de las posiciones B27, B28 y B29. La CN1780854 describe un análogo de insulina de AO (Arg)A21 (Gly)B31 (Arg)B32 (Arg) .
Sin embargo, a fin de lograr un mejor efecto de modificación, para obtener una mejor eficiencia, para disminuir la actividad de unión entre fármacos y el receptor del factor- 1 de crecimiento tipo insulina (IGF-1) , y para proporcionar fármacos más selectivos, aun se requieren análogos más modificados de insulina para el tratamiento de diabetes .
Breve Descripción de la Invención Por consiguiente, la presente invención va a proporcionar nuevos fármacos que tienen excelentes propiedades para tratamiento de diabetes. De manera más específica, la presente invención proporciona nuevos análogos de insulina humana y derivados acilados de los mismos, y métodos de preparación para los análogos y derivados, composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos, y el uso de los derivados de insulina humana para el tratamiento de diabetes .
En un primer respecto, la presente invención se refiere a un análogo de insulina humana y una sal fisiológicamente tolerable del mismo, que tiene la cadena A y la cadena B como sigue cadena A: cadena B: en donde : Ao puede ser R o está ausente; A21 puede ser N o G; B3 puede ser K, D o N; B27 puede ser E, T, D o K; B28 puede ser E, D, P o ; puede ser B30 puede ser K, R, E, T o está ausente; B31 , B32 puede ser R, opcionalmente está ausente o ambos están ausentes; en donde, cuando la Ao está ausente, A21 es N, B3 es N: B31 B32 están ausentes, B27B28B29B30 no son t??t, TKPT o TDKT; o B30 B31 B32 están ausentes, B27B28B29 no es TPK; de manera alternativa, cuando Ao está ausente, A21 es N, B3 es K y B31 B32 están ausentes: B27B28B29B30 no es TEKT; de manera alternativa, cuando Ao está ausente, A21 es G y B3 es N, B27B28B29B30 B31B32 no es TPKTR .
De manera alternativa, solo un residuo de aminoácido en las posiciones B3, B27-B30 es residuo de lisina (K) .
Cuando Ao en la cadena A está ausente, y B3 en la cadena B es N: B28 se selecciona preferentemente de E o D, B29 se selecciona de E, K o P, B30 se seleccionada de R, E o está ausente, y B31, B32 están ausentes; de manera más preferente, cuando B30B31B32 están ausentes, B28B29 es KE.
Cuando B3 en la cadena B es D, B28 y B29 son preferentemente P o K, B30 es T o está ausente, B31 y B32 son R o están ausentes, de manera más preferente B28B29 es PK.
Cuando Ao en la cadena A está ausente y B3 en la cadena B es K: B28 y B29 son preferentemente P o E, B30 es-E o R, B31 es R o está ausente, B32 es está ausente, de manera más preferente, B28B29 es PE.
La presente invención proporciona un análogo de insulina humana o una sal fisiológicamente tolerable del mismo, en donde la cadena A y la cadena B del análogo de insulina humana están conectadas por enlace de disulfuro (A7-B7, A20-B19) , A6 y All en la cadena A están conectados por enlace de disulfuro; las secuencia se seleccionan de, pero no se limitan a las siguientes secuencias: En otro aspecto, la presente invención también proporciona un ejemplo preferible del análogo anterior de insulina humana o una sal fisiológicamente tolerable del mismo, en donde el análogo de insulina humana está PEGilado para obtener una insulina PEGilada de acuerdo a la presente invención. El peso molecular de la molécula de PEG es 5-100 KD, de manera preferente 10-80 KD, de manera más preferente 15-45 kDa, de manera mucho más preferente 20-40KD; la molécula de PEG es un tipo de cadena ramificada o cadena recta.
La presente invención también proporciona un método de preparación para el análogo de insulina humana o sal fisiológicamente tolerable del mismo, que comprende construir un vector de expresión, expresar el vector transformado en las células hospedadoras, aislar y purificar el precursor expresado, liberar el análogo de insulina del precursor expresado mediante métodos químicos y/o enzimáticos ; opcionalmente, el análogo de insulina humana está opcionalmente PEGilado, la PEGilación es preferentemente un método de modificación químicamente acilador, que comprende sintetizar un agente de acilación, acilar el grupo amino localizado en los análogos de insulina humana, y remover el grupo protector del grupo acilado.
En donde el precursor expresado tiene la siguiente fórmula (I) : A-Rl-B (I) en donde: Rl es un fragmento peptídico que tiene de 0 a 5 residuos de aminoácido, el fragmento peptídico que consiste de alanina (A) , lisina (K) y arginina (R) ; A y B corresponden a la cadena A y la cadena B del análogo de insulina humana, respectivamente. de manera preferente, el precursor se selecciona del grupo que consiste de: FVNQHLCGSH LVEALYLVCGERGFFYTDKE RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 19, FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO. 20, FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 21 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE RGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO. 77.
La presente invención también proporciona un ADN que codifica el precursor el expresado.
La presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende el ADN.
La presente invención también proporciona una célula hospedadora transformada con el vector de expresión.
La célula hospedadora es preferentemente una bacteria, de manera más preferente Escherichia. coli.
De manera preferente, la célula hospedadora es levadura, de manera más preferente Pichia pastoris o Saccharomyces cerevisiae .
La presente invención también proporciona un derivado de insulina, en donde la insulina acilada se forma al conectar un grupo acilado al grupo a-amino en la N-terminal de la cadena A y de la cadena B de la insulina, o al grupo e-amino en el residuo de lisina (K) de B3, B27-B30, la insulina acilada tiene la siguiente fórmula: S-W-X-Y-Z en donde S es insulina o análogo de insulina de acuerdo al primer aspecto; -W-X-Y-Z es un grupo acilado de análogo de insulina, en donde, W se selecciona de un grupo que tiene una estructura de dos acilos de -OC (CH2) mCO- , donde m es un número entero entre 2 y 10, se forma un enlace de amida entre uno de los grupos carboxílicos en la estructura y el grupo -amino en el residuo de aminoácido N-terminal de la cadena A o la cadena B de la insulina origen o análogo de la misma o el grupo e- amino en un residuo de Lys que existe en la cadena B; un residuo de a-aminoácido con un grupo carboxilo en la cadena lateral o un péptido que tiene 2 a 4 a-aminoácidos con un grupo carboxilo en la cadena lateral, en donde se forma un enlace amida entre el residuo o el péptido y el grupo a-amino en la N-terminal de la cadena A o la cadena B de la insulina de origen o el análogo de la misma o grupo e-amino en un residuo Lys que existe en la cadena B; X se selecciona de -CO-; un compuesto de diamino que comprende un grupo carboxílico, en donde se forma un enlace de amida entre uno de los grupos a-amino del compuesto de diamino y el grupo carboxílico de ; a) cuando W es un residuo de a-aminoácido o un péptido que tiene de 2 a 4 a-aminoácidos , se forma un enlace amida entre el grupo amino de W y el -CO- de X; b) cuando W es un grupo que tiene una estructura de dos acilos, el grupo X se enlaza a la estructura de dos acilos mediante uno de sus grupos amino; Y se selecciona de -A(CH2)m-, donde m es un número entero entre 6 y 32, y A está ausente o es concadena de hidrocarburo bivalente que comprende un grupo acilo, que contiene 1, 2 o 3 grupos -CH=CH- y varios grupos -CH2- suficientes para obtener de manera total 10-32 átomos de carbono en la cadena; cadena de hidrocarburo bivalente que tiene la fórmula de B- (CH2) vCeH4 (CH2) w- , en donde B está ausente o CO-, v y w son números enteros o uno de ellos es 0, haciendo v y W en el intervalo de 6 a 30; a) cuando X es CO-, A o B está ausente; o b) cuando X es un compuesto de diamino, A o B es CO- ; Z se selecciona del grupo que consiste de -OH, -NH2, -COOH, -SO3H, -PO3H.
De manera preferente, la presente invención proporciona un derivado de insulina, en donde el grupos acilado -W-X-Y-Z está conectado al grupo e-amino en el residuo de lisina ( ) de B3, B27 a B30 de la insulina de origen.
De manera preferente, el derivado de insulina como antes, en donde el grupo acilado -W-X-Y-Z está conectado al grupo a-amino en la N-terminal seleccionada de la cadena A y la- cadena B de insulina.
De manera preferente, la presente invención proporciona un derivado de insulina, en donde S es análogo de insulina humana seleccionada del grupo que consiste de cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO .1 cadena B : FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE SEQ ID NO.10 cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO .1 cadena B : FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.9 cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2 cadena B : FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.16 De manera alternativa, la presente invención proporciona un derivado de insulina, en donde el grupo acilado -W-X-Y-Z se selecciona del grupo que consiste de: Nn- (HOOC(CH2)i4CO) -?-Glu; N°- (HO (CH2) isCO) -?-Glu; N°- (HOOC (CH2) 14.CO) -N°- (ácido 3-acilo*) -Lys, en los cuales * es el punto de conexión para la insulina.
De manera preferente, la presente invención proporciona un derivado de insulina seleccionado del grupo que consiste de: B28D-NBB29- (N"- (HOOC (CH2) 14CO) -?-Glu) -B30E insulina humana; (código: HS061) B28D-NBB29- (N°- (HO (CH2) 15CO) -?-Glu) -B30E insulina humana; (código: HS062) N°- (HOOC(CH2)i4CO) -N°- (OCCH2CH2CO- (B28D-NBB 9-B3 OE insulina humana) ; -Lys-OH; (código: HS067) NBB3- (N°- (HOOC (CH2) 14CO) -?-Glu) -B29E-B30E insulina humana; (código: HS605) NB- (HOOC(CH2) 14CO) -N°- (OCCH2CH2CO- (NnB3-B29E-B30E insulina humana) ) -Lys-OH; (código: HS606) NnB3- (N°- (HOC (CH2) isCO) -?-Glu) -B29E-B30E insulina humana;)) (código: HS607) NDB3- (N°- (HOOC(CH2)i4CO) -?-Glu) -B29E-B30E, A21G insulina humana; (código: HS608) N°- (HOOC(CH2) 14CO) -NB- ( OCCH2CH2CO - (NnB3-B29E-B30E, A21G insulina humana; ) ) -Lys-OH. (código: HS609) NBB3- (N°- ( HOC ( CH2 ) isCO ) -?-Glu) -B29E-B30E, A21G insulina humana; (código: HS610) .
La presente invención también proporciona una formulación farmacéutica que comprende el análogo de insulina y/o sales farmacéuticamente aceptables del mismo de acuerdo a la invención, o derivado de insulina como se describe anteriormente .
De manera preferente, la formulación farmacéutica comprende el análogo de insulina humana o una sal fisiológicamente tolerable del mismo presente en las formas disuelta, amorfa y/o cristalina.
De manera preferente, la formulación farmacéutica comprende el adyuvante a largo plazo, el adyuvante a largo plazo está presente junto con el medicamento de una manera de co-cristalización.
La presente invención también proporciona una solución inyectable que tiene actividad de insulina, en donde la solución comprende la formulación farmacéutica presente en forma disuelta.
La presente invención también proporciona el uso del análogo de insulina humana y/o una sal fisiológicamente tolerable del mismo, o derivado de insulina en la preparación de un medicamento para el tratamiento de diabetes tipo II, hiperglucemia, obesidad o síndrome de resistencia a insulina.
La presente invención también proporciona el uso del análogo de insulina humana y/o una sal fisiológicamente tolerable del mismo, en la preparación de una formulación farmacéutica de acción rápida y/o de acción prolongada que tiene actividad de insulina.
La presente invención proporciona nuevos análogos de insulina humana con buenos efectos de modificación y mejor actividad farmacológica, y proporciona más fármacos para opción clínica para el tratamiento de diabetes.
Términos Como se usa en la presente, el código de una sola letra y el código de tres letras para aminoácidos se describieron en J. Biol . Chem. , 243, the (1968) páginas 3558.
En las secuencias de ADN, A se refiere a adenina, C se refiere a citosina, G se refiere a guanina y T se refiere a timina.
"Análogo de insulina humana" se refiere a insulina humana, en donde se ha suprimido y/o reemplazado uno o más residuos de aminoácido con otros residuos de aminoácido, de manera alternativa, se introducen residuos de aminoácido adicionales, es decir, el número de residuos de aminoácido es más de 51.
"Derivado de insulina" se refiere en la presente a insulina acilada formada al conectar un grupo acilado al grupo a-amino en la N-terminal de la cadena A y la cadena B de insulina, o al grupo e-amino en el residuo de lisina de B3, B27-B30. La insulina acilada tiene la siguiente fórmula: S-W-X-Y-Z; en donde cada código se define en la especificación.
"Insulina PEGilada" se refiere a análogo de insulina humana pegilada; en donde la molécula de PEG tiene un peso molecular de 5-100 KD, de manera preferente 10-80 KD, de manera más preferente 15-45 KD, de manera más preferente 20-40KD; en donde la molécula de PEG es del tipo de cadena ramificada o recta. En la presente invención, la insulina PEGilada (20KD) significa que cada subunidad del análogo de insulina humana se conjuga con una molécula de PEG de 20KD; insulina PEGilada (30 kD) significa que cada subunidad del análogo de insulina humana se conjuga con una molécula de PEG de 30 KD; insulina PEGilada (tipo ramificada 40KD) significa que cada subunidad del análogo de insulina humana se conjuga con una molécula de PEG, ramificada de 40KD.
"Adyuvante de acción prolongada" se refiere a sulfato de protamina.
"Una formulación farmacéutica de acción rápida que tiene actividad de insulina" se refiere a la formulación que comprende el análogo de insulina humana o una sal fisiológicamente tolerable del mismo que tiene actividad de insulina de acción rápida.
"Una formulación farmacéutica de acción prolongada que tiene actividad de insulina" se refiere a la formulación que comprende el análogo de insulina humana o una sal fisiológicamente tolerable del mismo que tiene actividad de insulina de acción prolongada.
Las secuencias en la presente invención se designan en base a las secuencias de aminoácidos de la insulina humana natural. La longitud completa de la insulina humana comprende dos cadenas de A y B. La cadena A y la cadena B se enlazan mediante enlace de disulfuro, y hay otro enlace de disulfuro en la cadena A. La insulina humana tiene tres enlaces de disulfuro, marcados con líneas. Los números de serie de los aminoácidos en cada cadena se indican como las siguientes reglas: por ejemplo, los residuos de aminoácido en las posiciones 1-21 de la cadena A se marcan como Al, A2, A3 ; los residuos de aminoácido en las posiciones 1-30 de la cadena B se marcan como Bl, B2, B3 Además, si los residuos de aminoácido se adicionan a la N- terminal de la cadena A y la cadena B, estos residuos de aminoácido se marcan como AO; A(-l) , A (-2) , y B(0), B(-l), B(-2) , respectivamente. Si se adicionan residuos de aminoácido a la C-terminal de la cadena A y la cadena B, estos residuos de aminoácido se marcan como A22, A23, , y B31, B32 , respectivamente. Para representar una fórmula especifica del análogo de insulina humana, el aminoácido determinado se presenta por el código de aminoácido, en tanto que la sustitución insegura o supresión del aminoácido se presenta por el número de serie de la posición, como se muestra en la fórmula de la presente invención.
En las modalidades de la presente invención, B(l-29) usada en la presente se refiere a la cadena B acortada que consiste de Bl a B29 de insulina humana, B(l-30) se refiere a la cadena B que consiste de Bl a B30 de insulina humana, B (1-31) se refiere a la cadena B que consiste de Bl a B31 de insulina humana, B(l-32) se refiere a la cadena B acortada que consiste de Bl a B32 de insulina humana; A(l-21) se refiere a la cadena A de insulina humana, A(0-21) se refiere a la cadena A de insulina humana que tiene un residuo aminoácido adicional en la posición AO . De acuerdo a una modalidad particular de la presente invención, un residuo sustituido en la insulina humana se representa con el número de serie de insulina humana. Por ejemplo, B(l-2)-D-B-(4-30), A(l-21) insulina humana se refiere a un análogo de insulina humana en donde N se reemplaza con D en la posición 3 de la cadena B. A menos que se indique de otro modo, la abreviación de B(l-30), A(l-2l) se refiere a insulina humana natural; B(l-29), A(l-21) se refiere a insulina humana que tiene la supresión en la posición B30; B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-21) significa que la sustitución K está en la posición B3, y sustitución EE está en la posición B29B30 (ejemplo 6) . Adicionalmente, como en la insulina humana, la cadena B y la cadena A del análogo de insulina humana se conecta mediante enlaces de disulfuro intercadena formados entre A(7)Cys y B(7)Cys, y entre A(20)Cys y B(19)Cys. De manera simultánea, la cadena A contiene un enlace de disulfuro intracadena formado entre A(6)Cys y A(ll)Cys.
De acuerdo a la presente invención, la transformación del ADN recombinante a una célula hospedadora se realiza por técnicas convencionales bien conocidas por la persona experta en la técnica. El transformante obtenido se puede cultivar por un método convencional para expresar el polipéptido codificado por el gen de acuerdo a la presente invención. Dependiendo de la célula hospedadora usada, el medio de cultivo usado se puede seleccionar de varios medios convencionales de cultivo. Las células hospedadoras se cultivaron bajo condiciones adecuadas para crecimiento. Los métodos químicos y/o enzimáticos usados para liberar el análogo de insulina del precursor expresado son técnicas convencionales bien conocidas por la persona experta en la técnica, tal como el uso de tripsina, carboxipeptidasa B, lisina-endopeptidasa C, etcétera.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 representa un diagrama esquemático para la clonación del precursor de insulina humana recombinante B(l-30), A(l-21).
La Figura 2 representa los resultados electroforéticos después de la amplificación de PCR del fragmento del precursor de insulina humana recombinante insertada B(l-30), A(l-21).
La Figura 3 representa los resultados comparativos de ensayo de actividad de larga duración in vivo de HS061 y HS060.
La Figura 4 representa los resultados comparativos del ensayo de actividad de larga duración in vivo de HS062 y HS060.
La Figura 5 representa los resultados comparativos del ensayo de actividad de larga duración in vivo de HS067 y HS060.
La Figura 6 representa el ensayo de actividad de larga duración in vivo de (20kD) B ( 1-27 ) -D-K-E, A(l-21) (PEG (20kD)-156) PEGilada, y (20kD) B ( 1-2 ) -K-B ( 4-28 ) -E-E, A ( 1-21 ) ( PEG (20kD)-107) PEGilada.
La Figura 7 representa el ensayo de actividad de larga duración in vivo de PEG ( 30kD) -107 , PEG (40kD)-107, PEG (30kD)-156, PEG (40kD)-156.
Descripción Detallada de la Invención La presente invención se describe adicionalmente por los siguientes ejemplos que no se propone que limiten el alcance de la invención.
Las formulaciones de reactivos usadas en la presente invención son como siguen: caldo YPD (1L) (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa) : 1. lOg de extracto de levadura, 20g de peptona se disolvieron en 900mL de agua; 2. Someter a autoclave durante 20min; 3. Se adicionaron lOOmL de glucosa estéril al 20%.
Medio básico de glucosa (1L) (1.34% de YNB; 4 ? 10"5% de biotina; 2% de glucosa) : 1. Se sometieron a autoclave 800 mL de agua durante 20min, (a fin de preparar una placa de Agar, se pueden adicionar 15-20g de agar antes de la autoclave) ; 2. Enfriar a 60°C, seguido por la adición de lOOmL de 10x YNB estéril, 2mL de biotina al 0.02% estéril y lOOmL de glucosa estéril al 20%.
Medio liquido BMMY (1L) : 1. 10g de extracto de levadura, 20g de peptona se disolvieron en 700mL de agua; 2. Someter a autoclave durante 20min; 3. Enfriar a temperatura ambiente, seguido por la adición y mezclado de las siguientes sustancias: lOOmL de amortiguador de fosfato de potasio estéril 1M, pH6.0; lOOmL de 10* YNB estéril, 2mL de biotina al 0.02% estéril, lOOmL de metanol al 5% estéril.
Medio para inducir la expresión (1L) (BMGY) : 1. lOg de extracto de levadura, 20g de peptona se disolvieron en 700mL de agua; 2. Someter a autoclave durante 20min; 3. Enfriar a temperatura ambiente, seguido por la adición y mezclado de las siguientes sustancias: lOOmL amortiguador de fosfato de potasio estéril 1M, pH6.0; lOOmL de 10? YNB estéril, 2mL de biotina al 0.02% estéril, lOOmL de glicerol al 10% estéril.
Los ejemplos descritos en la presente se realizan en general de acuerdo con condiciones convencionales, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: cold spring harbor laboratory press, 1989); Pichia yeast Expression Laboratory Manual (versión: 10 de Abril del 2009) , o se realizaron siguiendo la recomendación por el fabricante del producto, si no se indicaron las condiciones especificas. Los reactivos usados en la presente se compraron rutinariamente del fabricante.
La unidad de peso molecular mencionada en los siguientes ejemplos de la presente invención es daltons (Dalton) .
Ejemplos Ejemplo 1. Preparación de insulina humana recombinante B(l-30), A(l-21) y B(l-29), R-A(l-21) Paso 1: Clonación y expresión de precursores de insulina humana recombinante B(l-30), A(l-21) 1. Construcción de vector de expresión que tiene precursores de insulina humana recombinante B(l-30), A(l-21) : Los genes que codifican para los precursores de insulina humana recombinante B(l-30), A(l-21) se sintetizaron al usar tres rondas de reacción en cadena la polimerasa (PCR) . Se sintetizaron cinco fragmentos de ADN de hebra individual por Invitrogen y se usaron como cebadores, las secuencias de las cuales son como sigue: Cebador 1 : 5' GTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCAAGCGTGGCATTG 3' SEQ ID NO. 45 Cebador 2: 5' GTAGAGGGAGCAGATGCTGGTACAGCATTGTTCCACAATGCCACGCTTGG 3' SEQ ID NO. 46 Cebador 3 : 5' TGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGG 3' SEQ ID NO. 47 Cebador 4 : 5' CTGACTGAATTCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTAGAGGGAGCAGAT 3' SEQ ID NO. 48 Cebador 5: 5' ACTTGCTCGAGAAAAGATTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTG 3' SEQ ID NO. 49.
La primera ronda de PCR se realizó al usar el equipo de síntesis KOD (TOYOBO, Cat KOD-201) sistema de 50oL: 5DL de amortiguador 10 x KOD, 2nL de dNTP 2mM, 1.5nL de cebador 1 (??p?) , 1.5DL de cebador 2 (????) , 0.5 nL de KOD plus, 2aL de MgS04 25mM, 38nL de ddlfcO. El programa de amplificación fue 94 °C 2min, 94 °C 30seg, 55 °C 30seg, 68 °C 30seg, por 25 ciclos de amplificación, seguido por incubación a 68 °C durante 2 min. El producto de PCR que tiene 85 nucleótidos se sintetizó, luego se identificó con un gel de agarosa al 1.2% y se recuperó.
La segunda ronda de PCR se realizó en el sistema de PCR de 50nL: 5nL de amortiguador 10 x KOD, 2nL de dNTP 2mM, InL del producto 1, 1.5 nL de cebador 3 (??p?) , 1.5nL de cebador 4 (????) , 0.5oL de KOD plus, 2oL de MgS04 25m , 37nL de ddH20. El programa de amplificación fue 94 °C 2min, 94°C 30seg, 55°C 30seg, 68°C 30seg, para 25 ciclos de amplificación, seguido por incubación a 68°C durante 2 min. El producto 2 de PCR obtenido que tiene 155 nucleótidos se identificó por gel de agarosa al 1.2% y se recuperó.
La tercera ronda de PCR se realizó en el sistema de PCR de 50nL: 5nL de amortiguador 10 x KOD, 2nL de dNTP 2mM, loL del producto 2, 1.5 DL de cebador 4 (??p?) , 1.5nL de cebador 5 (??p?) , 0.5DL de KOD plus, 2nL de MgSCU 25mM, 37nL de ddmo. El programa de la síntesis fue 94 °C 2min, 94 °C 30seg, 55°C 30seg, 68°C 30seg, para 25 ciclos de amplificación, seguido por incubación a 68 °C, durante 2min. El producto 3 se identificó por gel de agarosa al 1.2% y se recuperó.
El producto 3 se ligó en el vector T por el equipo de vector T (Takara, Cat. D103A) , y luego se digirió doblemente por EcoR I/Xho I (New England Biolabs, Cat. R0101S/R0146V) . El fragmento obtenido se recuperó por gel de agarosa al 1.2%, luego se ligó al vector de expresión pPIC9K (Invitrogen, Cat. K1750-01) usando T4 ligasa (New England Biolabs, Cat.M0202S). La estructura se mostró en la Figura 1.
El análisis de secuencia del vector de expresión recombinante resultante se llevó a cabo por Invitrogen. El producto 3 se verificó como un fragmento de DNA que codifica para el precursor de insulina humana B (1-30), A(l-21), la secuencia es como sigue: TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGG GAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACC AGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG SEQ ID NO. 32. 2. Transformación del vector de expresión que comprende el precursor de insulina humana recombinante B (1-30) , A(l-21) : Los vectores de expresión 5-10µ? que comprenden el precursor de insulina humana recombinante obtenido de los pasos anteriores se linealizaron con Salí (Takata, Cat . D1080a) , luego se adicionó 1/10 de volumen de acetato de sodio 3M y 2 volúmenes de etanol anhidro. Después mezclar completamente, la mezcla se colocó a -20°C, durante 2 horas. La mezcla se centrifugó a alta velocidad (13.000 rpm) durante 5 minutos, se removió el sobrenadante, y se lavó el sedimento con etanol al 75% dos veces. El sedimento se secó al revés, y se disolvió con 10pL de ddH20. Se adicionaron 80µL de plásmido linealizado y células competentes (Pichia pastoris GS115. Invitrogen, Cat. K1750-01) en la probeta de electroporación (Bio Rad, Cat. 1652086) en hielo durante 5 min. Los parámetros del electroporador (Bio Rad Micropulser) se ajustaron a 2 kV, 25 O, 200 uF. Se llevó a cabo la electroporación. Luego se adicionó rápidamente 1 mL D-Sorbitol enfriado (Biological Engineering Co . , Ltd.) y se mezcló, se colocaron 100-300 L de la mezcla en una placa de cultivo MD, y se cultivaron a 30°C durante 3 días, hasta que se formaron las colonias. 3. Examen de clones de precursor de insulina humana recombinante al usar G418: Colonias en placas de cultivo MD se eluyeron con 3 mL de caldo YPD, se resuspendieron, y se midió la concentración de las células resuspendidas (1 OD60o = 5 ? 107 células/mL) con un espectrofotómetro (Beckman, DU800) . Se colocaron en placa 1 ? 105 células en la placa de cultivo YPD con varias concentraciones de G418 (GIBCO, Cat . 11811-031) (0.25. 0.5. 1.0, 2.0, 4.0 mg/mL) , se cultivaron a 30°C durante 5 dias, hasta que se formaron las colonias. Se seleccionaron 30 clones individuales de las cinco placas con diferentes concentraciones de G418, y se verificaron por PCR de fragmentos recombinantes (reacción en cadena de la polimerasa) . 4. Identificación de clones con precursor de insulina humana recombinante B(l-30), A(l-21) insertado, mediante PCR: Los fragmentos insertados en colonias resistentes a G418 se verificaron por PCR. Se colocaron 18 \x de caldo en tubos de 1.5 mL y se adicionó 2 µ?? de citasa (5 U/ L) (Sigma, Cat. L2524), se incubó 30°C durante 10 min. La muestra entonces se colocó a -80°C, lOmin para lisis completa. La identificación se realizó al usar el equipo KOD (TOYOBO, Cat. KOD-201) : sistema de PCR de 25 µL: 2.5 \i de amortiguador de reacción 10 x, 1.5 µ? de MgCl2 25 mM, 2.5 L de dNTP 2 mM, 1 pL de cebador 5' AOX1 (10 pmol/µ??) , 1 µ?, de cebador 3' AOX1 (10 pmol/ L) , 0.5 µ L de KOD-polimerasa, 15 µ?_ de ddH20, l L de amortiguador de lisado. La mezcla se colocó en un sistema de instrumento de PCR (Eppendorf, 22.331 tipo), el programa de amplificación fue, 94°C 30 seg, 55°C 30 seg, 68°C 4 min, durante 25 ciclos de amplificación, seguido por incubación a 68 °C durante lOmin. Se identificaron los productos de PCR de 10µL por gel de agarosa al 1.0% (Sigma, A9539) . Los resultados se mostraron en la Figura 2, se observaron obviamente dos distintas bandas amplificadas. La banda más grande de 2.2 Kb corresponde al gen AOX portado por GS115 per se, y la más pequeña de 635 pb corresponde al gen extraño insertado. La senda 6 de la Figura 2 corresponde al clon No. 1001/17. El clon 1001/17 se eligió para uso adicional. 5. Expresión y caracterización del precursor de insulina humana recombinante B(l-30), A (1-21): La colonia individual del clon 1001-1017 se cultivó en 50 mL de medio B GY, a 30°C, 250 rpm, durante la noche. Al siguiente dia, el valor OD600 detectado debe estar entre 2-6. A temperatura ambiente, centrifugado a baja velocidad (Beckman Coulter) (1,500 g) durante 5 min, las células se recolectaron y resuspendieron con el medio BMMY a un OD600 de 1.0. Se adicionó 1/200 de volumen total de metanol al 100% al medio con una concentración final de 0.5%. El medio entonces se cultivó a 28°C, 250 rpm durante 72 h, durante el periodo de cultivo, se adicionaron 1/200 del volumen total de metanol al 100% cada 24 horas. Después de la inducción, el medio se centrifugó con baja velocidad (1500 g) y se recolectó el sobrenadante. La expresión de la proteina precursora del clon 1001-1017 se verificó por SDS-PAGE (Invitrogen, Cat. No. 456-1083). El clon No. 1001-17 se seleccionó para la siguiente fermentación.
Paso 2: Fermentación de precursor de insulina humana recombinante B(l-30), A(l-21) 1. Cepa: cepa de expresión No. 1001-17. 2. Proceso de operación para fermentador de 5L: 2.1 Activación y cultivo de la cepa: lmL de solución concentrada de glicerol de la cepa se inoculó en lOOmL del medio BMGY, a 30°C, 220r/min (rpm) durante 20 horas. 2.2 Inoculación: El tamaño del inoculo fue 5%, y se adicionó solución de PTMl esterilizada al 0.4%. Se inició la fermentación. 2.3 La etapa inicial de fermentación: Después de un periodo de fase adaptativa (10-12h) , la fermentación de la cepa entra en la fase de crecimiento exponencial. Se incrementaron continuamente la aireación y la velocidad de agitación para cumplir el requisito de DO>30% para crecimiento celular. Se incrementó la velocidad de agitación por 50-100rpm cada vez. Se adicionó amoniaco industrial al 25% mediante alimentación automática para fijar el pH al valor de ajuste. 2.4 Fase de crecimiento en alimentación de glicerol : Cuando se consumió el sustrato en medio inicial (18-24 horas), se adicionó glicerol al 50% mediante lote de alimentación, a una velocidad restrictiva. 2.5 Fase de inducción de metanol: Después de 4-6 horas de fase de crecimiento celular transiente de glicerol, se detuvo la alimentación de glicerol. Se mantuvo la inanición durante 30 minutos para consumir completamente el resto del glicerol. Entonces se adicionó metanol para iniciar la inducción. Después de 96 horas, se detuvo la fermentación.
Paso 3: Aislamiento y purificación del producto de fermentación El caldo de fermentación obtenido se ultrafiltró de manera convencional, y purificó por columna de SP Sefarosa FF (GE, Cat .17-0729-10 ) y Q Sefarosa FF (GE, Cat .17-0510-10 ) . El producto purificado se analizó por HPLC (medidor de líquidos Waters e2695-2489, Columna: Phenomenex, Júpiter, C18, 250 x 4.6 mm, 5µ??, 300 Á) , la pureza es mayor de 90% de pureza. La secuencia del precursor de expresión resultante es como sigue: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 22 El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS (MS líquida) es 6074, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6074.
Paso 4: Digestión y purificación de producto de fermentación El producto purificado anterior se ajustó a pH 9.0 con Tris 50 mM, se digirió por tripsina (Sigma, Cat . T1426) y CPB (Sigma, C9584). El proceso de reacción se analizó con HPLC. Después de la digestión completa, el valor de pH se ajustó a 2 con HC1 1M y la reacción se terminó. Se prepararon dos productos de insulina por fase inversa (Júpiter C4, 10 m, 300 Á, 50 ? 250 mm) como sigue: Producto 1: Insulina humana recombinante B(l-30), A(l-21) (referida como hl) : FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT, SEQ ID NO. 5 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1 El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5807, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5807.7.
Producto 2: Insulina humana recombinante B(l-29), R-A(l-21): FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO. 78 RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 4 El peso molecular del producto obtenido detectado por LC- S es 5863, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5862.7.
Paso 5: Análisis de estructura del enlace de disulfuro en los productos escindidos El producto 1 y producto 2 preparados anteriormente, se digirieron con GluC (Sigma, P6181) a 37°C durante 4 horas. Se adicionaron 2 L de HC1 1M para terminar la reacción. El producto se analizó por LC-MS. Los resultados fueron como sigue: Análisis de estructura de enlace de disulfuro en insulina humana B(l-30), A(l-21) Los resultados anteriores confirmaron que en la insulina humana recombinante B(l-30), A(l-21), las configuraciones de los enlaces de disulfuro son como sigue: uno formado entre A20 y B19; los otros dos se forman entre cualquiera de los dos seleccionados de A6 Cys, A7 Cys, All Cys y B7 Cys .
Análisis de estructura de enlace de disulfuro en insulina humana B(l-29), R-A(l-21) Estos resultados confirmaron que las configuraciones de los enlaces de disulfuro en insulina humana recombinante Bl-29), R-A(l-21) son como sigue: uno se formó entre A20 y B19; los otros dos se forman entre cualquiera de los dos seleccionado des A6 Cys, A7 Cys, All Cys y B7 Cys.
Ejemplo 2 Preparación de insulina humana recombinante B(l- 29) , A(l-21) Paso 1: Clonación y expresión de precursor de insulina humana recombinante B(l-29), A (1-21) 1. Construcción de vector de expresión que comprende precursor de insulina humana recombinante B(l-29), A(l-21) : Se obtuvo B(l-29), A(l-21) mediante mutagénesis dirigida al sitio al usar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Se sintetizaron dos fragmentos de ADN de hebra individual por Invitrogen y se usaron como cebadores para mutagénesis dirigida al sitio, las secuencias de los cebadores son como sigue: Cebador 1: 5 ' CTTCTACACACCCAAGCGTGGCATTGTGGAAC 3' SEQ ID NO. 50 Cebador 2: 5' GTTCCACAATGCCACGCTTGGGTGTGTAGAAG 3' SEQ ID NO. 51 El vector recombinante obtenido finalmente del ejemplo 1 se uso como una plantilla en el procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Equipo KOD (TOYOBO, Cat . KOD-201). Se aplicó el sistema de 25pL: 2.5pL de amortiguador 10 x KOD, 2.5µ?? de dNTP 2 mM, 1 µ L de cebador 1 (??µ?), 1 µ L de cebador 2 (10 ¿¿M), 0.5 L de KOD plus, 1 µ. L de MgS04 25 mM, ?ßµ?? de ddH20. El programa de amplificación fue como sigue: 94°C 2 min, 94°C 30 seg, 55°C 30 seg, 68°C llmin, durante 25 ciclos de amplificación, seguido por incubación durante 11 min a 68 °C. El producto de PCR se digirió durante 1 hora al adicionar directamente 1 µ L de Dpnl ( EB, Cat. R0176L) , y se transformó en células competentes TOP10 para obtener un plásmido de interés. El vector de expresión recombinante resultante se distribuyó a Invitrogen para análisis de secuencia . 2. Resultado de análisis de secuencia: El plásmido recombinante enlazado se analizó por Invitrogen. Las secuencias de ADN obtenido que codifican para el precursor de insulina humana B(l-29), A(l-21) fueron como sigue: TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGG GAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATC TGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG SEQ ID NO. 33. 3. Transformación del vector de expresión que comprende el precursor de insulina humana recombinante B(l-29), A(l-21) mediante electroporacion: El vector de expresión que comprende el precursor de insulina humana recombinante se transformó como se describe en el ejemplo 1 4. Examen del clon del precursor de insulina humana recombinante B(l-29), A(l-21) al usar G418: El clon del precursor de insulina humana recombinante se examinó como se describe en el ejemplo 1. 5. Identificación de clones con fragmentos insertados de precursor de insulina humana recombinante al usar PCR: Los fragmentos insertados del precursor de insulina humana recombinante se verificaron como se describe en el ejemplo 1. El clon 006-15 se seleccionó para uso adicional . 6. Expresión y caracterización de precursor de insulina humana recombinante B(l-29), A(l-21): El precursor de insulina humana recombinante se expresó e identificó como se describe en el ejemplo 1. Los resultados mostraron que el clon No. 006-15 expresó la proteina de interés, y se seleccionó para la siguiente fermentación.
Paso 2: Fermentación de precursor de insulina humana recombinante B(l-29), A(l-21) Se seleccionó el clon No. 006-15 para fermentación. El método de fermentación fue el mismo como aquel descrito en el ejemplo 1.
Paso 3: Aislamiento y purificación del producto de fermentación El producto de fermentación se aisló y purificó como se describe en el ejemplo 1. El precursor resultante fue como sigue: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 23.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5844.7, y el peso molecular teóricamente previsto es 5846.2.
Paso 4: Digestión enzimática y purificación del producto de fermentación El método de digestión enzimática y purificación es como se describe en el ejemplo 1. Después de la optimización del sistema de reacción enzimática, los productos enzimáticamente digeridos preparados por fase inversa fueron como sigue: Insulina humana recombinante B(l-29), A(l-21) (referida como Des (B30)-hI): FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK, SEQ ID NO. 78 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5578, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5578.
Paso 5: Análisis de estructura de enlace de disulfuro en los productos escindidos La estructura del enlace de disulfuro en los productos escindidos se analizó como se describe en el ejemplo 1.
Los resultados del análisis de la estructura de enlace de disulfuro en la insulina humana B(l-29), A(l-21) fueron como sigue: Estos resultados confirmaron que las configuraciones de los enlaces de disulfuro en la insulina humana recombinante B(l-29), A (1-21) son como sigue: uno se formó entre A20 y B19; los otros dos se forman entre cualquiera de los dos seleccionados de A6 Cys, A7 Cys, All Cys y B7 Cys.
Ejemplo 3. Preparación de insulina humana recombinante (1-27)-K-E-R, A(l-21) Paso 1: Clonación y expresión de precursor de insulina humana recombinante ( 1-27 ) -K-E-R, A(l-21) 1. Construcción de vector de expresión que comprende precursor de insulina humana recombinante (1-27)-K-E-R, A(l-21) : Se mutó B ( 1-27 ) -K-E-R, A(l-21) al usar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Se sintetizaron dos fragmentos de ADN de hebra individual por Invitrogen y se usaron como cebadores para mutagénesis dirigida al sitio, las secuencias de los cebadores son como sigue: Cebador 1: 5 ' GGTTTCTTTTACACCAAGGAAAGAGCTGCTAAAGGTATCGTTGAGC 3' SEQ ID NO. 52 Cebador 2: 5 ' GCTCAACGATACCTTTAGCAGCTCTTTCCTTGGTGTAAAAGAAACC 3' SEQ ID NO. 53 El vector recombinante finalmente obtenido en el ejemplo 1 se uso como plantilla en el procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Equipo KOD (TOYOBO, Cat . KOD-201). Se aplicó el sistema de 25µ?_: 2.5 µ?? de amortiguador lOx KOD, 2.5/ L dNTPs 2 mM, 1 ¿t L de cebador 1 (IOJUM), 1 µ L de cebador 2 (10/zM), 0.5 u de KOD plus, 1/xL de MgS04 25 mM, 16 de ddH20. El programa de amplificación fue como sigue: 94°C 2 min, 94°C 30 seg, 55°C 30 seg, 68°C llmin, durante 25 ciclos de amplificación, seguido por incubación durante 11 min a 68°C. El producto de PCR se digirió durante 1 hora por adición directamente de 1 µ L de Dpnl ( EB, Cat. R0176L), y luego se transformó en células competentes TOP10 para obtener el plásmido de interés. El vector de expresión recombinante resultante se distribuyó a Invitrogen para análisis de secuencia. 2. Resultado del análisis de secuencia: El plásmido recombinante enlazado se analizó por Invitrogen. La secuencia del fragmento de ADN que codifica para el precursor de insulina humana B ( 1-27 ) -K-E-R, A(l-21) fue como sigue: TTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGA GAAAGAGGTTTCTTTTACACCAAGGAAAGAGCTGCTAAAGGTATCGTTGAGCAATGTTGC ACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA SEQ ID NO. 34. 3. Transformación de vector de expresión que comprende precursor de insulina humana recombinante B(l-27)- K-E-R, ? ( 1-21 ) ~ mediante electroporación: El vector de expresión que comprende precursor de insulina humana recombinante se transformó como se describe en el ejemplo 1. 4. Examen del clon de precursor de insulina humana recombinante B ( 1-27 ) -K-E-R, A(l-21) al usar G418: El clon de precursor de insulina humana recombinante se examinó como se describe en el ejemplo 1. 5. Identificación de clones con fragmentos del precursor de insulina humana recombinante insertados, mediante PCR: Los fragmentos insertados del clon del precursor de insulina humana recombinante se verificaron como se describe en el ejemplo 1. Se seleccionó el clon 064-6 para uso adicional. 6. Expresión y caracterización de precursor de insulina humana recombinante B ( 1-27 ) -K-E-R, A(l-21): El método fue el mismo como aquel descrito en el ejemplo 1. Los resultados mostraron que el clon No. 064-6 expresó la proteina de interés, y se seleccionó para la siguiente fermentación.
Paso 2: Fermentación de precursor de insulina humana recombinante Se seleccionó el clon No. 064-6 para fermentación. El método de fermentación fue como se describe en el ejemplo 1.
Paso 3: Aislamiento y purificación de producto de fermentación El producto de fermentación se aisló y purificó como se describe en el ejemplo 1. El precursor resultante fue como sigue: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKERAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 24.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 6147, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6147.
Paso 4: Digestión enzimática y purificación del producto de fermentación El producto purificado anteriormente se ajustó a pH 9.0 con Tris 50 mM, se digirió por tripsina (Sigma, Cat . T1426) . El proceso de reacción se analizó con HPLC. Después de digestión completa, el valor de pH se ajustó a 2 con HC1 1 M para terminar la reacción. Los productos digeridos preparados por fase inversa (C4 Júpiter, 10 m, 300 Á, 50 * 250 mm) fueron como sigue: Insulina humana B ( 1-27 ) -K-E-R, A(l-21) : FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKER, SEQ ID NO. 6 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5894, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5894.7.
Paso 5: Análisis de estructura de enlaces de disulfuro en productos escindidos La estructura del enlace de disulfuro en los productos escindidos se analizó como se describe en el ejemplo 1.
Los resultados del análisis de la estructura de enlace de disulfuro en insulina humana B ( 1-27 ) -K-E-R, A(l-21) fueron como sigue: Estos resultados confirmaron que las configuraciones de los enlaces de disulfuro en la insulina humana recombinante B ( 1-27 ) -K-E-R, A(l-21) fueron como sigue uno se formó entre A20 y B19; los otros dos están se forman por cualquiera de los otros dos seleccionados de A6 Cys, A7 Cys, All Cys y B7 Cys.
Ejemplo 4. Preparación de insulina humana recombinante B(l- 27)-K-E, A(l-21) Paso 1: Clonación y expresión de precursor de insulina humana recombinante B(l-27)-K-E, A(l-21) 1. Construcción de vector de expresión que comprende precursor de insulina humana recombinante: Se obtuvo B(l-27)-K-E, A(l-21) por mutación dirigida al sitio mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Se sintetizaron dos fragmentos de ADN de hebra individual por Invitrogen y se usaron como cebadores para mutagénesis dirigida al sitio, las secuencias son como sigue : Cebador 1:5' GGTTTCTTTTACACCAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3' SEQ ID NO. 54 Cebador 2:5' CAACGATACCTCTTTTTTCCTTGGTGTAAAAGAAACC 3' SEQ ID NO. 55.
El vector recombinante finalmente obtenido en el Ejemplo 1 se usó como plantilla en el procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Equipo KOD (TOYOBO, Cat KOD-201). Se aplicó el sistema de 25µ?.: 2.5µ?? de amortiguador 10 x KOD, 2.5µ?, de dNTP 2mM, ?µ?, de cebador 1 (??µ?), ?µ?, de cebador 2 (??µ?), 0.5µ?, de KOD plus, ?µ? de MgS04 25mM, 16µ?. de ddH20. El programa de amplificación fue como sigue: 94 °C 2min, 94°C 30seg, 55°C 30seg, 68°C 11 min, durante 25 ciclos de amplificación, seguido por incubación durante 11 min a 68 °C. El producto de PCR se digirió durante 1 hr al adicionar directamente ?µ?? de Dpnl ( EB, Cat. R0176L) , y luego se transformó en células competentes TOP10 para obtener el plásmido de interés. El vector de expresión recombinante resultante se distribuyó a Invitrogen para análisis de secuencia. 2. Resultado de análisis de secuencia: El plásmido recombinante enlazado se analizó por Invitrogen. La secuencia del ADN que codifica para el precursor de insulina humana B(l-27)-K-E, A(l-21) fue como sigue : TTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGA GAAAGAGGTTTCTTTTACACCAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCT ATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA SEQ ID NO.35. 3. Transformación de vector de expresión que comprende el precursor de insulina humana recombinante B(l-27)-K-E, A(l-21) mediante electroporación : El vector de expresión que comprende el precursor de insulina humana recombinante se transformó como en el Ejemplo 1.
. Examen de clones de precursor de insulina humana recombinante B(l-27)-K-E, A(l-21) al usar G418: El clon del precursor de insulina humana recombinante se examinó como en el Ejemplo 1. 5. Identificación de clones con fragmentos insertados del precursor de insulina humana recombinante, mediante PCR: Los fragmentos insertados del precursor de insulina humana recombinante se verificaron como se describe en el Ejemplo 1. Se seleccionó el clon 062-6 para uso adicional . 6. Expresión y caracterización del precursor de insulina humana recombinante B(l-27)-K-E, A(l-21): El precursor de insulina humana recombinante se expresó e identificó como en el Ejemplo 1. Los resultados mostraron que el clon No. 062-6 expresó la proteina de interés y se seleccionó para la siguiente fermentación .
Paso 2: Fermentación de precursor de insulina humana recombinante Se seleccionó el clon No. 062-6 para fermentación. El método de fermentación fue como se describe en el Ejemplo 1.
Paso 3: Aislamiento y purificación de producto de fermentación El producto de fermentación se aisló y purificó como se describe en el Ejemplo 1. El precursor resultante fue como sigue: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 25.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 6004.91, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6006.3.
Paso 4: Digestión enzimática y purificación de producto de fermentación El método de digestión enzimática y purificación es como se describe en el Ejemplo 1. Después de la optimización del sistema de reacción enzimática, los productos digeridos preparados por fase invertida fueron como sigue: Insulina humana B(l-27)-K-E, A(l-21: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKE SEQ ID NO. 7 GIVEQCC SICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5738.54, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5738.8.
Paso 5: Análisis de estructura de enlace y sulfuro en productos escindidos Se analizó la estructura de enlace y sulfuro en los productos escindidos como se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados del análisis de la estructura de enlace a disulfuro de insulina humana B(l-27)-K-E, A(l-21) fueron como sigue: Estos resultados confirmaron que las configuraciones de los enlaces de disulfuro de la insulina humana recombinante B(l-27)-K-E, A(l-21) son como sigue: uno se forma entre A20 y B19; los otros dos se forman por cualquiera de los dos seleccionados de A6 Cys, A7 Cys, All Cys y B7 Cys.
Ejemplo 5. Preparación de insulina humana recombinante B(l-27)-K-P-E, A (1-21) Paso 1: Clonación y expresión de precursor de insulina humana recombinante B ( 1-27 ) -K-P-E, A (1-21) 1. Construcción del vector de expresión que comprende precursor de insulina humana recombinante B(l-27)-K-P-E, A(l-21) : Se mutó B (1-27) -K-P-E, A(l-21) mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se sintetizaron dos fragmentos de ADN de hebra individual por Invitrogen y se usaron como cebadores para la mutagénesis dirigida al sitio, las secuencias de los cebadores son como sigue: Cebador 1:5' GGTTTCTTTTACACCAAGCCTGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3' SEQ ID NO. 56 Cebador 2:5' CAACGATACCTCTTTTTTCAGGCTTGGTGTAAAAGAAACC 3' SEQ ID NO. 57.
El vector recombinante finalmente obtenido en el Ejemplo 1 se usó como plantilla en el procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Equipo KOD (TOYOBO, Cat KOD-201.) se aplicó el sistema de 25µ?.: 2.5\i~L de amortiguador 10 x KOD, 2.5µ?, de dNTP 2m , lpL de cebador 1 (??µ?), ?µ? de cebador 2 (??µ?) , 0.5µ?, de KOD plus, ?µ?, de MgS04 25mM, 16µ?? de ddH20. El programa de amplificación fue como sigue, 94 °C 2min, 94°C 30seg, 55°C 30seg, 68°C llmin, para 25 ciclos de amplificación, seguido por incubación durante 11 min a 68 °C. El producto de PCR se digirió durante 1 hora al adicionar ?µ?? de Dpnl (NEB, Cat. R0176L) directamente, luego se transformó en células competentes TOP10 para obtener el plásmido de interés. El vector de expresión recombinante resultante se distribuyó Invitrogen para análisis de secuencia. 2. Resultado del análisis de secuencia: El plásmido recombinante enlazado se analizó por Invitrogen. La secuencia del ADN obtenido que codifica para el precursor de insulina humana B ( 1-27 ) -K-P-E, A(l-21) fue como sigue: TTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGA GAAAGAGGTTTCTTTTACACCAAGCCTGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACC TCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA SEQ ID NO. 36. 3. Transformación de vectores de expresión que comprende precursor de insulina humana recombinante B(l-27)-K-P-E, A(l-21) mediante electroporación: El vector de expresión que comprende el precursor de insulina humana recombinante se transformó como el Ejemplo 1. 4. Examen de clones del precursor de insulina humana recombinante B ( 1-27 ) -K-P-E, A(l-21) al usar G418: El clon del precursor de insulina humana recombinante se examinó como en el Ejemplo 1. 5. Verificación de fragmentos insertados para el clon del precursor de insulina humana recombinante mediante PCR: Los fragmentos insertados del clon del precursor de insulina humana recombinante se verificaron como en el Ejemplo 1. Se seleccionó el clon 061-5 para uso adicional. 6. Expresión y caracterización de precursor de insulina humana recombinante B ( 1-27 ) -K-P-E, A(l-21): El precursor del precursor de Insulina humana recombinante se expresó e identificó como en el Ejemplo 1. Los resultados mostraron que el clon No. 061-5 expresó la proteina de interés, y se seleccionó para la siguiente fermentación.
Paso 2: Fermentación de precursor de insulina humana recombinante B (1-27 ) -K-P-E, A(l-21) El clon No. 061-5 se seleccionó para fermentación. El método de fermentación fue como se describe en el Ejemplo 1.
Paso 3: Aislamiento y purificación de producto de fermentación El producto de fermentación se aisló y purificó como se describe en el Ejemplo 1. El precursor del producto de expresión resultante fue como sigue: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 26.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 6102, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6102.
Paso 4: Digestión enzimática y purificación de producto de fermentación El método de digestión enzimática y purificación es el mismo como se describe en el Ejemplo 1. Después de la optimización del sistema de reacción enzimática, los productos digeridos preparados por fase inversa fueron como sigue : Insulina humana B ( 1-27 ) -K-P-E, A(l-21): FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPE, SEQ ID NO. 8 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5835, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5835.7.
Paso 5: Análisis de estructura de enlace de disulfuro en productos escindidos La estructura del enlace y disulfuro en los productos escindidos se analizó como se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados obtenidos del análisis de la estructura de enlace de disulfuro en insulina Humana B(l-27)-K-P-E, A(l-21) fueron como sigue: Estos resultados confirmaron que las configuraciones de los enlaces de disulfuro de insulina humana recombinante B ( 1-27 ) -K-P-E, A(l-21) son como sigue: uno se formó entre A20 y B19; los otros dos se forman por cualquiera de los seleccionados de A6 Cys, A7 Cys, All Cys y B7 Cys.
Ejemplo 6. Preparación de insulina humana recombinante B(l-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-21) Paso 1: Clonación y expresión de precursor de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -K-B ( 4-28 ) -E-E, A(l-21) 1. Construcción del vector de expresión que comprende precursor de insulina humana recombinante: Se mutó B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-21) mediante mutagénesis dirigida al sitio por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los fragmentos de ADN de hebra individual se sintetizaron por Invitrogen y se usaron como cebadores para mutagénesis dirigida al sitio, la secuencia de los cebadores son como sigue: Cebador 1: 5' GAGAAAAGATTCGTCAAGCAGCACTTGTGTGG 3' SEQ ID NO. 58 Cebador 2: 5' CCACACAAGTGCTGCTTGACGAATCTTTTCTC 3' SEQ ID NO. 59 Cebador 3:5' GTTTCTTTTACACCCCTGAAGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3' SEQ ID NO. 60 Cebador 4:5' bCAACGATACCTCTTTTTTCTTCAGGGGTGTAAAAGAAAC 3' SEQ ID NO. 61.
El vector recombinante finalmente obtenido en el Ejemplo 1 se usó como plantilla en el procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Equipo KOD (TOYOBO, Cat KOD-201). Se aplicó el sistema 25uL: 2.5\xL de amortiguador 10 x KOD, 2.5yL de dNTP 2mM, ?µ?? de cebador 1 (??µ?), ?µ?, de cebador 2 (??µ?), 0.5µ?, de KOD plus, lyL de MgS04 25mM, 16\i de ddH20. El programa de amplificación fue como sigue: 94 °C 2min, 94°C 30seg, 55°C 30seg, 68°C llmin, para 25 ciclos, seguido por incubación durante 11 min a 68 °C. El producto de PCR se digirió durante 1 hr al adicionar lyL de Dpnl (NEB, Cat. R0176L) directamente, y luego se transformó de células competentes TOP10 para obtener el plásmido de interés. El vector de expresión recombinante resultante se distribuyó Invitrogen para análisis de secuencia. 2. Resultado del análisis de secuencia.
El plásmido recombinante enlazado se analizó por Invitrogen. La secuencia del ADN obtenido que codifica para el precursor de insulina humana B ( 1-2 ) -K-B ( 4-28 ) -E-E, A(l-21) precursor fue como sigue: TTCGTCAAGCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGA GAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTGAAGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACC TCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA SEQ ID NO.37. 3. Transformación para vector de expresión que comprende precursor de insulina humana recombinante B(l-2)- K-B (4-28 ) -E-E, A(l-21) mediante electroporación: El vector de expresión que comprende el vector de insulina humana recombinante se transformó como en el Ejemplo 1. 4. Examen de clones de precursor de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -K-B (4-28 ) -E-E, A(l-21) al usar G418: El clon del precursor de insulina humana recombinante se examinó como en el Ejemplo 1. 5. Identificación de clones con fragmento insertado de precursor de insulina humana recombinante mediante PCR: Los fragmentos insertados del precursor de insulina humana recombinante se verificaron como en el Ejemplo 1. Se seleccionó el clon 070-4 para uso adicional. 6. Expresión y caracterización de precursor de insulina humana recombinante B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-21): El precursor de Insulina humana recombinante se expresó e identificó como en el Ejemplo 1. Los resultados mostraron que el clon No. 070-4 expresó la proteina de interés, y se seleccionó para la siguiente fermentación.
Paso 2 : Fermentación de precursor de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -K-B (4-28) -E-E, A(l-21) Se seleccionó el clon No. 070-4 para fermentación. El método de fermentación fue como se describe en el Ejemplo 1.
Paso 3: Aislamiento y purificación de producto de fermentación El producto de fermentación se aisló y purificó como se describe en el Ejemplo 1. El precursor del producto de expresión resultante fue Como sigue: FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 21.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 6117, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6117.
Paso 4: Digestión enzimática y purificación de producto de fermentación El método de digestión enzimática y purificación fue como se describe en el Ejemplo 1. Después de la optimización del sistema de reacción enzimática, los productos digeridos preparados por fase inversa fueron como sigue : Insulina humana B ( 1-2 ) -K-B (4-28 ) -E-E, A(l-21): FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFY PEE, SEQ ID NO.9 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5850, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5850.7.
Paso 5: Análisis de estructura de enlace de disulfuro en productos escindidos La estructura del enlace de disulfuro en productos escindidos se analizó como se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados obtenidos del análisis de la estructura de enlace a disulfuro en insulina humana B(l-2)- K-B (4-28) -E-E, A(l-21) fueron como sigue Estos resultados confirmaron que las configuraciones de los enlaces de disulfuro de la insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -K-B ( 4-28 ) -E-E, A(l-21) son como sigue: uno se forma entre A20 y B19; los otros dos se forman por cualquiera de los dos seleccionados de A6 Cys, A7 Cys, All Cys y B7 Cys.
Ejemplo 7. Preparación de insulina humana recombinante B(l-27)-D-K-E, A(l-21) y B ( 1-27 ) -D-K-E, A(l-20)-G Parte I: Clonación y expresión de insulina humana recombinante B ( 1-27 ) -D-K-E, A(l-21) Paso 1. Construcción del vector de expresión que comprende precursor de Insulina humana recombinante: Se mutó B (1-27) -D-K-E, A (1-21) mediante mutación dirigida al sitio al usar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los fragmentos de DNA de hebra individual se sintetizaron por Invitrogen y se usaron como cebadores para mutagénesis dirigida al sitio, las secuencias de los cebadores son como sigue: Cebador 1:5' GGTTTCTTTTACACCGATAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3' SEQ ID NO.62 Cebador 2:5' CAACGATACCTCTTTTTTCCTTATCGGTGTAAAAGAAACC 3' SEQ ID NO.63.
El vector recombinante finalmente obtenido en el Ejemplo 1 se usó como plantilla en el procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Equipo KOD (TOYOBO, Cat KOD-201) . Se aplicó el sistema de 25µ?_: 2.5µ?, de amortiguador 10 x KOD, 2.5uL de dNTP 2mM, l\iL de cebador 1 (??µ?), ?µ?, de cebador 2 (??µ?), 0.5\iL de KOD plus, l]i de MgS04 25mM, 16µ? de ddH20. El programa de amplificación fue como sigue: 94 °C 2min, 94°C 30seg, 55°C 30seg, 68°C llmin, durante 25 ciclos de amplificación, seguido por incubación durante 11 min a 68 °C. El producto de PCR se digirió durante lhr al adicionar ?µ?; de Dpnl (NEB, Cat. R0176L) directamente, luego se transformó en células competentes TOP10 para obtener el plásmido de interés. El vector de expresión recombinante resultante se distribuyó a Invitrogen para análisis de secuencia . 2. Resultado del análisis de secuencia.
El plásmido recombinante enlazado se analizó por Invitrogen. La secuencia del ADN obtenido que codifica para el precursor de insulina humana B ( 1-27 ) -D-K-E, A(l-21) fue como sigue: TTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGA GAAAGAGGTTTCTTTTACACCGATAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACC TCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA SEQ ID NO.38. 3. Transformación para vector de expresión que comprende el precursor de insulina humana recombinante B(l-27)-D-K-E, A(l-21) mediante electroporación : El vector de expresión que comprende el precursor de insulina humana recombinante B ( 1-27 ) -D-K-E, A (1-21) se transformó como en el Ejemplo 1. 4. Examen de clones de precursor de insulina humana recombinante B (1-27 ) -D-K-E, A(l-21) al usar G418: El clon del precursor de insulina humana recombinante se examinó como en el Ejemplo 1. 5. Identificación de clones con precursor de insulina humana recombinante insertado mediante PCR: Los fragmentos insertados del clon del precursor de insulina humana recombinante se verificaron como en el Ejemplo 1. Se seleccionó el clon 068-4 para uso adicional. 6. Expresión y caracterización de precursor de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -D-K-E, A(l-21): El precursor de insulina humana recombinante se expresó e identificó como en el Ejemplo 1. Los resultados mostraron que el clon No. 068-4 expresó la proteina de interés, y se seleccionó para la siguiente fermentación.
Paso 2: Fermentación de precursor de insulina humana recombinante B (1-27) -D-K-E, A(l-21) Se seleccionó el clon No. 068-4 para fermentación. El método de fermentación fue como se describe en el Ejemplo 1.
Paso 3: Aislamiento y purificación de producto de fermentación El producto de fermentación se aisló y purificó como se describe en el Ejemplo 1. El precursor del producto de expresión resultante fue como sigue: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.19.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 6119.99, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6119.5.
Paso 4: Digestión enzimática y purificación de producto de fermentación Los métodos de digestión enzimática y purificación son como se describe en el Ejemplo 1. Después de la optimización del sistema de reacción enzimática, los productos digeridos preparados por fase inversa fueron como sigue : Insulina Humana B (1-27) -D-K-E, A(l-21): FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE, SEQ ID NO.10 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l.
El peso molecular de producto obtenido detectado por LC-MS es 5853.6, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5853.
Paso 5: Análisis de estructura de enlace a disulfuro en productos escindidos La estructura del enlace de disulfuro en productos escindidos se analizó como se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados obtenidos del análisis de la estructura de enlace a disulfuro en insulina humana B(l-27)-D-K-E, A(l-21) fueron como sigue: Estos resultados confirmaron configuraciones de los enlaces de disulfuro de insulina humana recombinante B ( 1-27 ) -D-K-E, A(l-21) son como sigue: uno se forma entre A20 y B19; los otros dos se forman por cualquiera de los dos seleccionados de A6 Cys, A7 Cys, All Cys y B7 Cys.
Parte II: Preparación de insulina humana recombinante B (1- 27)-D-K-E, A (1-20) -G Repetir los pasos 1 a 3 de la preparación de insulina humana recombinante B ( 1-27 ) -D-K-E, A (1-21), excepto que el cebador y la plantilla usadas son como sigue: 1. Los cebadores para la mutagénesis dirigida al sitio en el Paso 1 tienen las secuencias como sigue: Cebador 1:5' GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3' SEQ ID NO.66 Cebador 2:5' CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3' SEQ ID NO.67.
El vector recombinante que comprende B(l-27)-D-K-E, A (1-21) (SEQ ID NO.38) fue como la plantilla en el procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. 2. Se seleccionó el clon No.115-1 para fermentación. El método de fermentación fue como se describe en el Ejemplo 1. 3. El producto de fermentación se aisló y purificó como se describe en el Ejemplo 1. El precursor del producto de expresión resultante fue como sigue: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.77. 4. Los métodos de digestión enzimática y purificación son como se describen en el Ejemplo 1. Después de la optimización del sistema de reacción enzimática, los productos digeridos preparados por fase inversa fueron como sigue : Insulina Humana B ( 1-27 ) -D-K-E, A(l-20)-G: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE, SEQ ID NO.10 GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2. 5. La estructura del enlace de disulfuro en los productos escindidos se analizó como se describe en el Ejemplo 1. El resultado confirmó que el producto obtenido en el ejemplo tiene la configuración correcta.
Ejemplo 8. Preparación de insulina humana recombinante B(l- 2) -D-B (4-30) -R-R, A(l-20)-G y B(l-2) -D-B (4-30) -R, R-A(l-20)- G Paso 1: Clonación y expresión de precursores de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -D-B ( -30 )-R-R, A(l-20)-G y B(l- 2)-D-B(4-30)-R, R-A(l-20)-G 1. Construcción del vector de expresión que comprende precursores de insulina humana recombinante: Se mutaron los precursores B ( 1-2 ) -D-B ( 4-30 ) -R-R, A(l-20)-G y B (1-2) -D-B (4-30) -R, R-A(l-20)-G mediante mutagénesis dirigida al sitio al usar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Se sintetizaron cuatro fragmentos de ADN de hebra individual por Invitrogen, y se usaron como cebadores para mutagénesis dirigida al sitio, la secuencia de los cebadores son como sigue: Cebador 1:5' GGTTTCTTTTACACCCCTAAGACTAGAAGAGGTATCGTTGAG 3' SEQ ID NO.64 Cebador 2:5' CTCAACGATACCTCTTCTAGTCTTAGGGGTGTAAAAGAAACC 3' SEQ ID NO.65 Cebador 3:5' GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3' SEQ ID NO.66 Cebador 4:5' CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3' SEQ ID NO.67.
Equipo KOD (TOYOBO, Cat KOD-201). Se aplicó el sistema de 25 L en el procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio: 2.5µ?_ de amortiguador 10 x KOD, 2.5µL de dNTP 2mM, ?µ?? de cebador 1 (??µ?), ?µ?? de cebador 2 (??µ?) , 0.5µ11 de KOD plus, li~L de gS04 25mM, ?ßµ]! de ddH20. El programa de amplificación fue como sigue: 94°C 2min, 94°C 30seg, 55°C 30seg, 68 °C llmin, durante 25 ciclos de amplificación, seguido por incubación durante 11 min a 68°C. El producto de PCR se digirió durante lhr al adicionar ?µ?. de Dpnl ( EB, Cat. R0176L) directamente, luego se transformó en células competentes TOP10 para obtener el plásmido de interés. El vector de expresión recombinante resultante se distribuyó Invitrogen para análisis de secuencia. 2. Resultado del análisis de secuencia.
Los plásmidos recombinantes enlazados se analizaron por Invitrogen. Las secuencias de los fragmentos de ADN obtenidos que codifican para los precursores de insulina humana B ( 1-2 ) -D-B ( 4-30 ) -R-R, A(l-20)-G y B(l-2)-D-B(4-30)-R, R-A(l-20)-G son como sigue: TTCGTCGATCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGA GAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTAAGACTAGAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACC TCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCGGTTAA SEQ ID N0.39. 3. Transformación de vector de expresión que comprende precursores de insulina humana recombinante B(l- 2) -D-B (4-30) -R-R, A(l-20)-G y B ( 1-2 ) -D-B ( 4-30 ) -R, R-A(l-20)-G mediante electroporación: El vector de expresión que comprende el precursor de insulina humana recombinante se transformó como en el Ejemplo 1. 4. Examen de clones de precursores de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -D-B (4-30 ) -R-R, A(l-20)-G y B(l-2) -D-B (4-30) -R, R-A(l-20)-G al usar G418: Los clones de los precursores de insulina humana recombinante se examinaron como en el Ejemplo 1. 5. Identificación de clones con fragmentos insertados del precursor de Insulina humana recombinante mediante PCR: Los fragmentos insertados del precursor de Insulina humana recombinante se verificaron como en el Ejemplo 1. Se seleccionó el clon 073-16 para uso adicional. 6. Expresión y caracterización de precursores de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -D-B ( 4-30 ) -R-R, A(l-20)-G y B (1-2) -D-B(4-30) -R, R-A(l-20)-G: El precursor de insulina humana recombinante se expresó e identificó como en el Ejemplo 1. Los resultados mostraron que el clon No. 073-16 expresó la proteina de interés, y se seleccionó para la siguiente fermentación.
Paso 2: Fermentación del precursor de insulina humana recombinante Se seleccionó el clon No. 073-16 para fermentación. El método de fermentación fue como se describe en el Ejemplo 1.
Paso 3: Aislamiento y purificación de producto de fermentación El producto de fermentación se aisló y purificó como se describe en el Ejemplo 1. El producto resultante fue como sigue: FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.27.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 6046.3, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6045.96.
Paso 4: Digestión enzimática y purificación de producto de fermentación Los métodos de digestión enzimática y purificación son como se describen en el Ejemplo 3. Después de la optimización del sistema de reacción enzimática, los productos digeridos preparados por fase inversa fueron como sigue : Producto 1: insulina humana B ( 1-2 ) -D-B ( 4-30 ) -R-R, A ( 1-20 ) -G: FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR, SEQ ID NO.11 GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC- S es 6064.8, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6063.96.
Producto 2: insulina humana B (1-2) -D-B (4-30) -R, R-A(l-20)-G: FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTR, SEQ ID NO.12 RGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.3.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 6064.8, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6063.96.
Paso 5: Análisis de estructura de enlace a disulfuro en productos escindidos La estructura del enlace de disulfuro en los productos escindidos se analizó como se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados obtenidos del análisis de la estructura de enlace a disulfuro en Insulina humana B(l-2)-D-B(4-30) -R-R, A(l-20)-G: Estos resultados confirmaron que las configuraciones de los enlaces de disulfuro de insulina humana recombinante B (1-2) -D-B (4-30) -R-R, A(l-20)-G son como sigue: uno se forma entre A20 y B19; los otros dos se forman por cualquiera de los dos seleccionados de A6 Cys, A7 Cys, All Cys y B7 Cys.
Resultados del análisis de la estructura de disulfuro de insulina humana B (1-2) -D-B (4-30) -R, R-A (1- Estos resultados confirmaron que las configuraciones de los enlaces de disulfuro en insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -D-B ( -30 ) -R, R-A(l-20)-G son como sigue: uno se forma entre A20 y B19; los otros dos se forman por cualquiera de los dos seleccionados de A6 Cys, A7 Cys, All Cys y B7 Cys.
Ejemplo 9. Preparación de insulina humana recombinante B(l-2) -K-B (4-28) -E-R-R, A(l-21) Paso 1: Clonación y expresión de precursor de insulina humana recombinante B (1-2) -K-B (4-28) -E-R-R, A(l-21) 1. Construcción del vector de expresión que comprende precursor de insulina humana recombinante: Se mutaron B ( 1-2 ) -K-B ( 4-28 ) -E-R-R, A(l-21) mediante mutagénesis dirigida al sitio al usar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Se sintetizaron dos fragmentos de ADN de hebra individual por Invitrogen y se usaron como cebadores para mutagénesis dirigida al sitio, la secuencia de los cebadores son como sigue: Cebador 1:5' CTTTTACACCCCTGAAAGAAGAGGTATCGTTGAG 3' SEQ ID NO.68 Cebador 2:5' CTCAACGATACCTCTTCTTTCAGGGGTGTAAAAG 3' SEQ ID NO.69.
El vector recombinante finalmente obtenido en el Ejemplo 6 se usó como plantilla en el procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Equipo KOD (TOYOBO, Cat KOD- 201) . Se aplicó el sistema de 25µ?_: 2.5µ?? de amortiguador 10 x KOD, 2.5iL de dNTP 2mM, lpL de cebador 1 (??µ?), ?µ?, de cebador 2 (??µ?), 0.5µ?, de KOD plus, ?µ?, de MgS04 25mM, 16µ?. de ddH20. El programa de amplificación fue como sigue: 94 °C 2min, 94°C 30seg, 55°C 30seg, 68°C llmin, durante 25 ciclos de amplificación, seguido por incubación durante 11 min a 68 °C. El producto de PCR se digirió durante lhr al adicionar ?µ?? de Dpnl (NEB, Cat. R0176L) directamente, luego se transformó en células competentes TOP10 para obtener el plásmido de interés. El vector de expresión recombinante resultante se distribuyó a Invitrogen para análisis de secuencia . 2. Resultado del análisis de secuencia.
El plásmido recombinante enlazado se analizó por Invitrogen. La secuencia de ADN que codifica para el precursor de insulina humana B ( 1-2 ) -K-B ( 4-28 ) -E-R-R, (1-21) fue como sigue: TTCGTCAAGCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGA GAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTGAAAGAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCT ATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA SEQ ID NO. 0. 3. Transformación de vector de expresión que comprende precursor de insulina humana recombinante B(l-2)-K-B (4-28) -E-R-R, A(l-21) mediante electroporación : El vector de expresión que comprende el precursor de insulina humana recombinante se transformó como en el Ejemplo 1. 4. Examen de clones de precursor de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -K-B ( 4-28 ) -E-R-R, A(l-21) al usar G418: Los clones del precursor de insulina humana recombinante se examinó como en el Ejemplo 1. 5. Identificación de clones con fragmentos insertados de precursor de insulina humana recombinante mediante PCR: Los clones con fragmentos insertados del precursor de insulina humana recombinante se verificaron como en el Ejemplo 1. El clon 072-16 se seleccionó para uso adicional. 6. Expresión y caracterización de precursor de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -K-B ( -28 ) -E-R-R, A(l-21): El precursor de Insulina humana recombinante se expresó e identificó como en el Ejemplo 1. Los resultados mostraron que el clon No. 072-16 expresó la proteina de interés, y se seleccionó para la siguiente fermentación.
Paso 2: Fermentación de precursor de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -K-B ( 4-28 ) -E-R-R, A (1-21) Se seleccionó el clon No. 072-16 para fermentación. El método de fermentación fue como se describe en el Ejemplo 1.
Paso 3: Aislamiento y purificación de producto de fermentación El producto de fermentación se aisló y purificó como se describe en el Ejemplo 1. El producto de fermentación resultante fue como sigue: FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPERRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.28.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 6015.1, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6015.93.
Paso 4: Digestión enzimática y purificación de producto de fermentación Los métodos de digestión enzimática y purificación son como se describe en el Ejemplo 3. Después de la optimización del sistema de reacción enzimática, los productos digeridos preparados por fase inversa fueron como sigue : Insulina humana B ( 1-2 ) -K-B ( 4-28 ) -E-R-R, A(l-21): FV QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPERR, SEQ ID NO.13 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 6064.8, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6063.96.
Paso 5: Análisis de estructura de enlace a disulfuro en productos escindidos La estructura del enlace de disulfuro en product escindidos se analizó como se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados obtenidos del análisis de la estructura de enlace a disulfuro en insulina humana B(l-2) K-B (4-28) -E-R-R, A(l-21) fueron como sigue: Estos resultados confirmaron que las configuraciones de los enlaces de disulfuro de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -K-B ( 4-28 ) -E-R-R, A(l-21) son como sigue: uno se forma entre A20 y B19; los otros dos se forman por cualquiera de los dos seleccionados de A6 Cys, A7 Cys, All Cys y B7 Cys.
Ejemplo 10. Preparación de insulina humana recombinante B(l-2) -D-B (4-29) , A(l-21) y B ( 1-2 ) -D-B (4-29) , R-A(l-21) Paso 1: Clonación y expresión de precursores de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -D-B (4-29) , A(l-21) y B(l-2)-D- B(4-29), R-A(l-21) 1. Construcción del vector de expresión que comprende precursores de insulina humana recombinante: Se mutaron B (1-2) -D-B (4-29) , A(l-21) y B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-21) mediante mutación dirigida al sitio al usar la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Se sintetizaron dos fragmentos de ADN de hebra individual por Invitrogen y se usaron como cebadores para mutagénesis dirigida al sitio, la secuencia de los cebadores son como sigue : Cebador 1:5' CTTTTACACCCCTAAGAGAGGTATCGTTGAGCAATG 3' SEQ ID NO.70 Cebador 2: 5' CATTGCTCAACGATACCTCTCTTAGGGGTGTAAAAG 3' SEQ ID NO.71.
Equipo KOD (TOYOBO, Cat KOD-201) . Se aplicó el sistema de 25µ? en el procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio: 2.5µ?, de amortiguador 10 x KOD, 2.5µ? de dNTP 2mM, luL de cebador 1 (??µ?), ?µ?, de cebador 2 (??µ ) , 0.5µ] de KOD plus, ?µ?, de MgS04 25mM, 16µ]_, de dd¾0. El programa de amplificación fue como sigue: 94°C 2min, 94°C 30seg, 55°C 30seg, 68 °C llmin, durante 25 ciclos de amplificación, seguido por incubación durante 11 min a 68 °C. El producto de PCR se digirió durante lhr al adicionar l\iL de Dpnl (NEB, Cat. R0176L) directamente, luego se transformó en células competentes TOP10 para obtener el plásmido de interés. El vector de expresión recombinante resultante se distribuyó a Invitrogen para análisis de secuencia. 2. Resultado del análisis de secuencia.
Los plásmidos recombinantes enlazados se analizaron mediante Invitrogen. Las secuencias del ADN obtenido que codifica para los precursores de insulina humana B ( 1-2 ) -D-B ( 4-29) , A(l-21) y B (1-2) -D-B (4-29) , R-A(l-21) fueron como sigue: TTCGTCGATCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGA GAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTAAGAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATT TGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA SEQ ID NO.41. 3. Transformación de vector de expresión que comprende precursor de insulina humana recombinante B(l-2)- D-B(4-29), A(l-21) y B (1-2) -D-B (4-29) , R-A(l-21) mediante electroporación : El vector de expresión que comprende el precursor de insulina humana recombinante se transformó como en el Ejemplo 1. 4. Examen de clones de precursor de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -D-B ( 4-29 ) , A(l-21) y B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-21) al usar G418: El clon del precursor de insulina humana recombinante se examinó como en el Ejemplo 1. 5. Identificación de clones con fragmentos insertados de precursor de insulina humana recombinante mediante PCR: Los fragmentos insertados del clon del precursor de insulina humana recombinante se verificaron como en el Ejemplo 1. Se seleccionó el clon 087-1 para uso adicional. 6. Expresión y caracterización de precursor de insulina humana recombinante B (1-2) -D-B (4-29) , A(l-21) y B(l-2)-D-B(4-29) , R-A(l-21): El precursor de insulina humana recombinante se expresó e identificó como en el Ejemplo 1. Los resultados mostraron que el clon No. 087-1 expresó la proteina de interés, y se seleccionó para la siguiente fermentación.
Paso 2: Fermentación de precursor de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -D-B ( 4-29 ) , A(l-21) y B ( 1-2 ) -D-B ( 4-29 ) , R-A(l-21) Se seleccionó el clon No. 087-1 para fermentación. El método de fermentación fue como se describe en el Ejemplo 1.
Paso 3: Aislamiento y purificación de producto de fermentación El producto de fermentación se aisló y purificó como se describe en el Ejemplo 1. El producto de fermentación resultante fue como sigue: FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.29.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5846.2, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5845.74.
Paso 4: Digestión enzimática y purificación de producto de fermentación Los métodos de digestión enzimática y purificación son como se describe en el Ejemplo 3. Después de la optimización del sistema de reacción enzimática, los productos digeridos preparados por fase inversa fueron como sigue : Insulina humana B (1-2) -D-B (4-29) , AQ-21) : FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK, SEQ ID NO.14 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID N0.1.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5707.53, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5708.
El producto del paso 3 se digirió con Lys-C (Sigma, P3428). El producto digerido 2 obtenido por fase inversa fue como sigue: Insulina humana B (1-2) -D-B (4-29), R-A (1-21): FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK, SEQ ID NO.14 RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO . .
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5864.5, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5863.72.
Paso 5: Análisis de estructura de enlace a disulfuro en productos escindidos La estructura del enlace de disulfuro en productos escindidos se analizó como se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados obtenidos del análisis de ' la estructura de enlace a disulfuro en insulina humana B(l-2)-D-B(4-29), A(l-21) fueron como sigue: Estos resultados confirmaron que las configuraciones de los enlaces de disulfuro de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -D-B ( 4-29 ) , A(l-21) son como sigue: uno se forma entre A20 y B19; los otros dos se forman por cualquiera de los dos seleccionados de A6 Cys, A7 Cys, All Cys y B7 Cys.
Resultados del análisis de la estructura de enlace a disulfuro de insulina humana B (1-2) -D-B (4-29), R-A (1- Estos resultados confirmaron que las configuraciones de los enlaces de disulfuro de insulina humana recombinante B ( 1-2 ) -D-B ( 4-29 ) , R-A(l-21) son como sigue: uno se forma entre A20 y B19; los otros dos se forman por cualquiera de los dos seleccionados de A6 Cys, A7 Cys, All Cys y B7 Cys.
Ejemplo 11. Preparación de insulina humana recombinante B(l-27)-K-E, A(l-20)-G Paso 1: Clonación y expresión del precursor de insulina humana recombinante B(l-27)-K-E, A(l-20)-G 1. Construcción del vector de expresión que comprende precursor de insulina humana recombinante: Se mutó B(l-27)-K-E, A(l-20)-G mediante mutación dirigida al sitio al usar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Se sintetizaron dos fragmentos de ADN de hebra individual por Invitrogen y se usaron como cebadores para mutagénesis dirigida al sitio, la secuencia de los cebadores son como sigue: Cebador 1:5' GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3' SEQ ID NO.72 Cebador 2:5' CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3' SEQ ID NO.73.
El vector recombinante finalmente obtenido en el Ejemplo 4 se usó como plantilla en el procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Equipo KOD (TOYOBO, Cat KOD-201). Se aplicó el sistema de 25\i : 2.5µ?, de amortiguador 10 x KOD, 2.5uL de dNTP 2mM, ?µ?, de cebador 1 (??µ?), ?µ? de cebador 2 (??µ?) , 0.5µ?. de KOD plus, ?µ?, de gS04 25m , 16\iL ddH20. El programa de amplificación fue como sigue: 94 °C 2min, 94°C 30seg, 55°C 30seg, 68°C llmin, durante 25 ciclos de amplificación, seguido por incubación durante 11 min a 68 °C. El producto de PCR se digirió durante lhr al adicionar ?µ?,? de Dpnl ( EB, Cat. R0176L) directamente, luego se transformó en células competentes TOP10 para obtener el plásmido de interés. El vector de expresión recombinante resultante se distribuyó a Invitrogen para análisis de secuencia. 2. Resultado del análisis de secuencia.
El plásmido recombinante enlazado se analizó por Invitrogen. La secuencia del ADN obtenido que codifica para el precursor de insulina humana B(l-27)-K-E, A(l-20)-G fue como sigue: TTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGA GAAAGAGGTTTCTTTTACACCAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCT ATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAG SEQ ID NO.42. 3. Transformación para vector de expresión de precursor de insulina humana recombinante B(l-27)-K-E, A(l-20) -G mediante electroporación : El vector de expresión del precursor de insulina humana recombinante B(l-27)-K-E, A(l-20)-G se transformó como en el Ejemplo 1. 4. Examen de clones de precursor de insulina humana recombinante B(l-27)-K-E, A(l-20)-G al usar G418: El clon del precursor de insulina humana recombinante se examinó como en el Ejemplo 1. 5. Identificación de clones con fragmentos insertados de precursor de insulina humana recombinante B(l-27)-K-E, A(l-20)-G mediante PCR: Los clones insertados con fragmentos del precursor de insulina humana recombinante B(l-27)-K-E, A(l-20)-G se verificaron como en el Ejemplo 1. Se seleccionó el clon 094-4 para uso adicional. 6. Expresión y caracterización de precursor de insulina humana recombinante B(l-27)-K-E, A(l-20)-G: El precursor de insulina humana recombinante se expresó e identificó como en el Ejemplo 1. Los resultados mostraron que el clon No. 094-4 expresó la proteina de interés, y se seleccionó para la siguiente fermentación.
Paso 2: Fermentación del precursor de insulina humana recombinante Se seleccionó el clon No. 094-4 para fermentación.
El método de fermentación fue como se describe en el Ejemplo 1.
Paso 3; Aislamiento y purificación de producto de fermentación El producto de fermentación se aisló y purificó como se describe en el Ejemplo 1. El precursor B(l-27)-K-E, A(l-20)-G resultante fue como sigue: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.30.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC- S es 5948, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5947.85.
Paso 4 : Digestión enzimática y purificación de producto de fermentación Los métodos de digestión enzimática y purificación son como se describen en el ejemplo 1. Después de la optimización del sistema de reacción enzimática, los productos digeridos preparados por fase inversa fueron como sigue : Insulina humana B(l-27) -K-E, A(l-20)-G: FV QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYT E, SEQ ID NO.15 GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO. 2.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5681, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5681.49.
Paso 5: Análisis de estructura de enlaces de disulfuro en productos escindidos La Estructura del enlace de disulfuro en los productos escindidos se analizó como se describe en el ejemplo 1.
Los resultados obtenidos del análisis de la estructura de enlace de disulfuro en insulina humana B(l-27) -K-E, A(l-20)-G fueron como sigue: Estos resultados confirmaron que configuraciones de los enlaces de disulfuro de insulina recombinante humana B(l-27)-K-E, A(l-20)-G son como sigue: uno se forma entre A20 y B19; los otros dos se forman por cualquiera de los dos seleccionados de A6 Cys, Cys A7, All Cys y B7 Cys.
Ejemplo 12. Preparación de insulina humana recombinante B(l-2) -K-B(4-28) -E-E, A(l-20)-G Paso 1: Clonación y expresión de precursor de insulina humana recombinante B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-20) -G 1. Construcción del vector de expresión que comprende precursor de insulina humana recombinante B(l-2)-K-B (4-28) -E-E, (1-20) -G: Se mutó el precursor B ( 1-2 ) -K-B (4 -28 ) -E-E, A(l- 20) -G mediante mutagénesis dirigida al sitio al usar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Se sintetizaron dos fragmentos de ADN de hebra individual por Invitrogen y se usaron como cebadores para la mutagénesis dirigida al sitio, las secuencias de los cebadores son como sigue: Cebador 1: 5' GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3' SEQ ID NO. 74 Cebador 2: 5' CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3' SEC ID NO.75. El vector recombinante finalmente obtenido en el ejemplo 6 se usó como plantilla en el procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Equipo KOD (TOYOBO, Cat. KOD-201) se aplicó el sistema de 25µ??1: 2.5 L de amortiguador 10 x KOD, 2.5¿íL de dNTP 2 mM, 1 xL de cebador 1 (IOJUM) , 1J"L de cebador 2 (10µ?) , 0.5 u L de KOD plus, ljttL de MgS04 25 mM, 16 / L de ddHaO. El programa de amplificación fue como sigue: 94°C 2 min, 94°C 30 seg, 55°C 30 seg, 68°C llmin, durante 25 ciclos de amplificación, seguido por incubación durante 11 min a 68 °C. El producto de PCR se digirió durante 1 hora al adicionar 1 L de Dpnl ( EB, Cat. R0176L) directamente, entonces se transformó en células componentes TOP10 para obtener el plásmido de interés. El vector de expresión recombinante resultante se distribuyó Invitrogen para análisis de secuencia. 2. Resultados de análisis de secuencia El plásmido recombinante enlazado se analizó por Invitrogen. La secuencia del ADN obtenido que codifica para el precursor de insulina humana B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-20) -G fue como sigue: TTCGTCAAGCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGA GAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTGAAGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACC TCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG SEC ID NO.43. 3. Transformación de vector de expresión que comprende el precursor de insulina humana recombinante B(l-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-20) -G mediante electroporación: El vector de expresión que comprende el precursor de insulina humana recombinante B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-20) -G precursor se transformó como en el ejemplo 1. 4. Examen de clones precursor de insulina humana recombinante B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-20)-G mediante el uso de G418: Los clones con el precursor de insulina humana recombinante B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-20) -G se examinaron como en el ejemplo 1. 5. Identificación de clones con fragmentos insertados de precursor de insulina humana recombinante B(l-2) -K-B(4-28) -E-E, A (1-20) -G mediante PCR: Los clones insertados con fragmentos del precursor de insulina humana recombinante se verificaron como en el ejemplo 1. Se seleccionó el clon 093-15 para uso adicional . 6. Expresión y caracterización de precursor de insulina humana recombinante B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, (1-20) -G: Se expresó el precursor de insulina humana recombinante B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-20)-G y se identificó como en el ejemplo 1. Los resultados mostraron que el clon No. 093-15 expresó la proteína de interés, y se seleccionó para la siguiente fermentación.
Paso 2: Fermentación de precursor de insulina humana recombinante Se seleccionó el clon No. 093-15 para fermentación. El método de fermentación fue como se describe en el ejemplo 1.
Paso 3: Aislamiento y purificación de producto de fermentación El producto de fermentación se aisló y se purificó como se describe en el ejemplo 1. El producto de expresión resultante fue como sigue: FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO. 20.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 6060, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6060.
Paso 4 : Digestión enzimática y purificación de producto de fermentación Los métodos de digestión enzimática y purificación son como se describen en el ejemplo 1, Después de la optimización del sistema de reacción enzimática, los productos digeridos preparados por fase invertida fueron como sigue: Insulina humana B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-20)-G: FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE, SEQ ID NO.16 GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO. 2.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5793, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5793.6.
Paso 5 : Análisis de estructura de enlaces de disulfuro en productos escindidos La estructura del enlace de disulfuro en productos escindidos se analizó como se describe en el ejemplo 1.
Los resultados obtenidos del análisis de la estructura de enlace de disulfuro en insulina humana B(l-2)-K-B (4-28) -E-E, A(l-20)-G fueron como sigue: Estos resultados confirmaron configuraciones de los enlaces de disulfuro de insulina humana recombinante B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-20)-G son como sigue: uno se forma entre A20 y B19; los otros dos se forman por cualquiera de los dos seleccionados de A6 Cys, Cys A7, All Cys y B7 Cys .
Ejemplo 13. Preparación de insulina humana recombinante B(l-2) -D-B (4-29) -R, A(l-20)-G, B (1-2) -D-B (4-29) , A(l-20)-G y B(l-2) -D-B(4-29) , R-A(l-20)-G Paso 1: Clonación y expresión de precursores de insulina humana recombinante B (1-2) -D-B (4-29) -R, A(l-20)-G, B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G y B (1-2) -D-B (4-29) , R-A(l-20)-G 1. Construcción del vector de expresión que comprende precursores de insulina humana recombinante: Se mutaron B (1-2) -D-B (4-29) -R, A(l-20)-G, B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G y B (1-2 ) -D-B (4-29) , R-A(l-20)-G mediante de mutagénesis dirigida al sitio al usar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Se sintetizaron dos fragmentos de ADN de hebra individual por Invitrogen y se usaron como cebadores para la mutagénesis dirigida al sitio, las secuencias de los cebadores son como sigue: Cebador 1: 5' GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3' SEQ ID NO.76 Cebador 2: 5' CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3' SEC ID NO .67.
El vector recombinante finalmente obtenido en el ejemplo 10 se usó como plantilla en el procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio. Equipo KOD (TOYOBO, Cat . KOD-201) se aplicó el sistema de 25µ??: 2.5 µ,?· de amortiguador 10 x KOD, 2.5 ¿L dNTP 2 mM, 1/zL de cebador 1 (10/zM) , 1/¿L de cebador 2 (10µ?), 0.5/ÍL de KOD plus, 1 zL MgS04 25 mM, 16 I L de ddH20. El programa de amplificación fue como sigue: 94 °C 2 min, 94 °C 30 seg, 55 °C 30 seg, 68 "C llmin, durante 25 ciclos de amplificación, seguido por incubación durante 11 min a 68 °C. El producto de PCR se digirió durante 1 hora al adicionar de IAÍL de Dpnl (NEB, Cat. R0176L) directamente, entonces, se transformó en células competentes TOP10 para obtener el plásmido de interés. El vector de expresión recombinante resultante se distribuyó Invitrogen para análisis de secuencia. 2. Resultados de análisis de secuencia Los plásmidos recombinantes enlazados se analizaron por Invitrogen. Las secuencias del ADN obtenido que codifican para los precursores de insulina humana B(l-2) -D-B(4-29) -R, A(l-20)-G, B (1-2) -D-B (4-29) , A(l-20) -G y B (1-2) -D-B (4-29) , A-R(l-20)-T fueron como sigue: TTCGTCGATCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGA GAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTAAGAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATT TGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG SEQ ID NO.44. 3. Transformación para el vector de expresión de precursores de insulina humana recombinante B (1-2) -D-B (4-29)-R, A(l-20)-G, B (1-2) -D-B (4-29) , A(l-20)-G y B(l-2)-D-B(4-29), A-R(l-20)-G mediante electroporación: El vector de expresión del precursor de insulina humana recombinante se transformó como en el ejemplo 1. 4. Examen de clones de precursores de insulina humana recombinante B (1-2) -D-B (4-29) -R, A(l-20)-G, B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G y B (1-2) -D-B (4-29) , R-A(l-20)-G al usar G418: El clon con precursor de insulina humana recombinante se examinó como en el ejemplo 1. 5. Identificación de clones con fragmentos insertados de precursores de insulina humana recombinante B (1-2) -D-B (4-29) -R, A(l-20)-G, B (1-2) -D-B (4-29) , A(l-20)-G o B (1-2) -D-B (4-29) , R-A ( 1-20 ) -G mediante PCR: Los clones con fragmentos insertados del precursor de insulina humana recombinante se verificaron como en el ejemplo 1. Se seleccionó el clon 096-4 para uso adicional. 6. Expresión y caracterización de precursor de insulina humana recombinante B (1-2) -D-B (4-29) -R, A(l-20)-G, B(l-2) -D-B(4-29) , A(l-20) -G y B (1-2) -D-B (4-29) , R-A(l-20)-G: El precursor de insulina humana recombinante se expresó e identificó como en el ejemplo 1. Los resultados mostraron que el clon No. 096-4 expresó la protelna de interés, y se seleccionó para la siguiente fermentación.
Paso 2: Fermentación de precursor de insulina humana recombinante B (1-2) -D-B (4-29) -R, A(l-20)-G, B (1-2) -D-B (4-29), A(l-20)-G y B (1-2) -D-B (4-29) , R-A(l-20)-G Se seleccionó el clon No. 096-4 para fermentación. El método de fermentación fue como se describe en el ejemplo 1.
Paso 3: Aislamiento y purificación de producto de fermentación El producto de fermentación se aisló y purificó como se describe en el ejemplo 1. El precursor del producto de expresión resultante fue como sigue: FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO. 31.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5789, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5788.67.
Paso 4 : Digestión enzimática y purificación de producto de fermentación Los métodos de digestión enzimática y purificación son como se describen en el ejemplo 3. Después de la optimización del sistema de reacción enzimática, los productos digeridos preparados por fase invertida fueron como sigue: Insulina humana B (1-2) -D-B (4-29) -R, A(l-20) -G: FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKR, SEQ ID NO.17 GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO. 2.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5807, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5806.67.
Los métodos de digestión enzimática y purificación fueron como en el ejemplo 1. Después de la optimización del sistema de reacción enzimática, el producto digerido 2 obtenido por fase invertida preparativa fue como sigue: Insulina humana B (1-2) -D-B (4-29) , A(l-20)-G: FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK, SEQ ID NO.18 GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO. 2.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5651, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5650.48.
El producto del paso 3 (fermentación de 096-4) se digirió al usar el mismo método enzimático como se describe en el ejemplo 10. El producto digerido preparado por fase invertida fue como sigue: Insulina humana B (1-2) -D-B (4-29) , R-A(l-20) -G: FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK, SEQ ID NO.18 RGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO. 3.
El peso molecular del producto obtenido detectado por LC-MS es 5807, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 5806.7.
Paso 5 : Análisis de estructura de enlace de disulfuro en productos escindidos La estructura del enlace de disulfuro en los productos escindidos se analizó como se describe en el ejemplo 1.
Los resultados obtenidos del análisis de la estructura del enlace de disulfuro en insulina humana B(l-2) -D-B (4-29) -R, A(l-20)-G fueron como sigue: Estos resultados confirmaron configuraciones de los enlaces de disulfuro de insulina humana recombinante B (1-2) -D-B (4-29) -R, A(l-20)-G son como sigue: uno se forma entre A20 y B19; los otros dos se forman por cualquiera de los dos seleccionados de A6 Cys, Cys A7, All Cys y B7 Cys .
Resultados de los análisis de estructura de disulfuro de insulina humana B (1-2) -D-B (4-29) , A(l-20)-G: Estos resultados confirmaron configuraciones de los enlaces de disulfuro de insulina humana recombinante B (1-2) -D-B (4-29) -R, A(l-20) -G son como sigue: uno se forma entre A20 y B19; los otros dos se forman por cualquiera de los dos seleccionados de A6 Cys, Cys A7, All Cys y B7 Cys .
Resultados del análisis de la estructura de disulfuro de insulina humana B (1-2) -D-B (4-29) , R-A(l-20)-G: tos resultados confirmaron que configuraciones de los enlaces de disulfuro de insulina humana recombinante B (1-2) -D-B (4-29) -R, A(l-20)-G son como sigue: uno se forma entre A20 y B19; los otros dos se forman por cualquiera de los dos seleccionados de A6 Cys, Cys A7, All Cys y B7 Cys.
Ejemplo 14. Preparación de insulina humana B28D-N8B29 - ( "- (HOOC(CH2) i4CO) -?-Glu) -B30E (HS061) i. Preparación de metil-hexadecandioil-Glu (OSu) - OMe Se disolvió ácido hexadecanodioico (5.0 g, 17.48mmol) en metanol anhidro (50 mi), se enfrió con nitrógeno líquido a -10°C, luego se adicionó gota a gota cloruro de tionilo (3.2 mi, 43.7mmol), a -10°C durante 20 min, y la solución de reacción se calentó lentamente a reflujo durante 4 horas. Se terminó la reacción, y la solución de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró a sequedad, 5.15 g (94%) de ácido dimetil-hexadecanodioico.
Se disolvió el ácido dimetil-hexadecanodioico (5.0 g, 15.92mmol) en metanol anhidro (50 mi). Ba (OH) 2 · 8H2O (5.0 g, 15.8 mmol) disuelto en metanol se adicionó gota a gota en ácido dimetil-hexadecanodioico, y la solución de reacción se calentó lentamente a 30 °C y la mezcla se agitó durante 24 horas . Después de que el metanol se removió mediante concentración al vacío, el residuo se disolvió en acetato de etilo y se lavó tres veces con HC1 0.1 M, la fase orgánica se recolectó y se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y concentró a vacío y se secó en vacío, se obtuvo ácido monometil-hexadecanodioico 4.55 g (rendimiento 95%) .
Se disolvió ácido monometil-hexadecanodioico (2.0 g, 6.67mmol) en DCM (50 mi), seguido al adicionar HOSu (0.92 g, 8.0 mmol), luego se adicionó DCC (2.06 g, 10 mmol), se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. La solución de reacción se filtró, la fase orgánica se lavó tres veces con 200 mi de HCl 0.1 M y luego se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y concentró bajo vacío, se obtuvieron 2.45 g (92%) de succinimida de dimetil-cetano-diácido.
Se disolvió H-Glu-OMe (0.81 g, 5.04mmol) en 5 mL de agua purificada, la solución obtenida se adicionó a solución de THF (50 mL) disuelta con éster de succinimida de metil-cetano-diácido (1.0 g, 2.52mmol). Se adicionó DIEA (0.65 g, 5.04mmol) a la mezcla obtenida y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas . La solución de reacción se filtró y concentró bajo vacío. El residuo se disolvió en acetato de etilo, y la fase orgánica se lavó tres veces con 200 mL HCl 0.1 M, luego se recolectó la fase orgánica y se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, se concentró bajo vacío y se purificó por cromatografía líquida de alto desempeño de fase invertida, se obtuvieron 0.7 g (63%) de metil-hexadecandioil-Glu-OMe, ESI-MS: 444.3 ( [M+H] +) después de la concentración.
Se disolvió metil-hexadecandioil-Glu-OMe (0.3 g, 0.677mmol) en DCM (20 mL) , luego se adicionaron HOSu (85.7mg, 0.745mmol) y DCC (0.167 g, 0.812mmol), se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, se filtró, se lavó con HCl 0.1 M y la fase orgánica se recolectó, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y concentró bajo vacío, se secó en vacío para obtener 0.3 g (82%) de metil-hexadecandioil-Glu (OSu) - OMe, que tiene la fórmula estructural como sigue: 2. Preparación de precursor de insulina humana B28D-N£B29- (If- (HOOC (CHa) wCO) -?-Glu) -B30E Se disolvió insulina humana recombinante B(l-27)- D-K-E, A(l-21) (50 mg, 8., mmol) (ejemplo 7) en 10 mL de HCl 10 mM. El valor de pH de la solución se ajustó a aproximadamente 10.5 mediante NaOH 0.2 M. Se disolvió metil-hexadecandioil-Glu (OSu) -OMe (13.9mg, 25.6mmol) en 10 mL de acetonitrilo y después se adicionó a la solución de insulina humana (1-27) -D-K-E, A(l-21) anterior para iniciar la reacción durante 40min. El proceso de reacción se controló por RP-HPLC. 40 minutos más tarde, el valor del pH de la solución se ajustó a aproximadamente 2.2 con HCl al 10%, la reacción se terminó, y se obtuvo la solución precursora cruda . 3. Purificación del precursor de insulina humana B28D-N£B29- (N"- (HOOC (CH2) i4C0) -?-Glu) -B30E La solución precursora cruda anterior se diluyó con agua para llevar el contenido de fase orgánica a aproximadamente 30% (v:v) , después de que se filtra a través de una membrana de 0.45µp?, la solución se purificó con RP-HPLC, en donde la columna de fase invertida fue Luna C18, 250 x 25 mm, 5µp?, 100Á, la fase móvil A fue 0.1% de TFA/H2O, la fase móvil B fue 0.1% de TFA/ACN. El producto deseado se eluyó y recolectó con una fase gradiente B de 38% a 68% a una velocidad de flujo de 20mL/min en un período de 60min, ESI-MS: 1570.8 ( [M+4 H]+4), se obtuvo la solución precursora purificada . 4. Saponificación del precursor de insulina humana B28D-N£B29- (N01- ( HOOC ( CH2 ) uCO ) -?-Glu) -B30E Se removió acetonitrilo de la solución precursora purificada mediante concentración al vacío. Entonces, el valor pH de la solución se ajustó a 8.0 con solución de NaOH al 10% y se saponificó al adicionar un volumen igual de NaOH enfriado con hielo 0.2 M. El producto saponificado se analizó con RP-HPLC. La reacción se terminó al adicionar HCl al 10%. 5. Purificación y liofilización de solución saponificada de precursor de insulina humana B28D-NeB29- (N0-(HOOC(CH2) nCO ) -?-Glu) -B30E La solución precursora saponificado anterior se diluyó con acetonitrilo para llevar el contenido de la fase orgánica a aproximadamente 30% (v:v) , después de que se filtra a través de una membrana de 0.45/!m, la solución se purificó con RP-HPLC, en donde la columna de fase invertida fue Luna C18, 250 x 25 mm, 5 p?, 100 A, la fase móvil A fue 0.1% de TFA/HaO , la fase móvil B fue 0.1% de TFA/ACN. El producto deseado se eluyó y recolectó con una fase de gradiente B de 35% a 65% a una velocidad de flujo de 20mL/min en un periodo de 60min, se liofilizó y se obtuvieron 3.6 mg del producto (pureza 97.9%). El producto resultante tiene la estructura como sigue: 6. Confirmación de la estructura de insulina humana B28D-NEB29- (Na- (HOOC (CH2) _CO) -?-Glu) -B30E El peso molecular de insulina humana B28D-NeB29- (N"- (HOOC (CH2) 14CO) -?-Glu) -B30E detectado por ensayo de ESI-MS es 6251.65 que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6251.16.
La insulina humana B28D-NEB29- (Na- (HOOC (CH2) mCO) -y- Glu) -B30E se digirió con tripsina. Los productos digeridos se analizaron por LC-MS. El resultado mostró que los pesos moleculares de los dos fragmentos Fl y F2 fueron 4865 y 1403, respectivamente, consistentes con el peso molecular teórico de los productos digeridos. El fragmento F2 corresponde al fragmento de cadena B modificada. Los sitios modificados se probaron como los mismos como se espera.
Ejemplo 15. Preparación de insulina humana B28D N81329- (N0*-(HO(CH2)isCO) -?-Glu) -B30E (HS062) 1. 16-hidroxi-hexadecanoil-Glu (OSu) -OMe Se disolvió ácido 16 -hidroxi-hexadecanoico (3.0 g, 11.03mmol) en DCM (50 mL) , entonces se adicionaron 0- (N-succinimidilo) 1, 1, 3 , 3 -tetrametiluronio éster y N,N-diis-opropiletilamina (1.71 g, 13.2 mmol) . La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. Después de la filtración, la fase orgánica se lavó tres veces con HC1 0.1 M y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. La fase orgánica se concentró bajo vacío, se obtuvieron 3.5 g (70%) de 16-hidroxi-hexadecano- succinimida éster.
H-Glu-OMe (3.4 g, 21.64mmol) disuelto en 5 mL de agua purificada se adicionó a solución de THF (50 mL) disuelto con 16 -hidroxi-hexadecano- succinimida éster. Se adicionó DIEA (2,8 g, 21.64mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. La solución de reacción se filtró y concentró bajo vacío. El residuo se disolvió en acetato de etilo, y la fase orgánica se lavó tres veces con 200 mL de HC1 0.1 M. La fase orgánica se recolectó y se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, concentró bajo vacío y purificó por cromatografía líquida de alto desempeño de fase invertida, después de la concentración final, se obtuvieron 2.5 g (45%) de 16-hidroxi-hexadecanoil-Glu-OMe, ESI-MS: 417 ( [M+H] +) .
Se disolvió 16-hidroxi-hexadecanoil-Glu-OMe (1.0 , 2.4 mmol) en DCM (20 mL) , luego se adicionaron HOSu (0.305 g, 2.65 mmol) y EDOHC1 (0.69 g, 3.61mmol), se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, se filtró, se lavó con HCl 0.1 M y la fase orgánica se recolectó, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y concentró bajo vacío, se secó en vacío, se obtuvieron 0.9 g de 16-hidroxi-hexadecanoil-Glu (OSu) -OMe (pureza fue de 73%), que tiene la siguiente fórmula estructural: 2. Preparación de precursor de insulina humana B28D N8829- (N"- (HO(CH2 ) isCO) -?-Glu) -B30E (HS062) Se disolvió insulina humana recombinante B(l-27)-D-K-E , A(l-21) (50 mg, 8.5 mmol) en 10 mL de HCl 10 mM. El valor de pH de la solución se ajustó a aproximadamente 10.5 con NaOH 0.2 M. Se disolvió 16-hidroxi-hexadecanoil-Glu(OSu)-OMe (13.2mg, 25.5mmol) en 10 mL de acetonitrilo y luego se adicionó a la solución anterior de insulina humana B (1-27) -D-K-E, A (1-21) para iniciar reacción durante 40 min. El proceso de reacción se controló por RP-HPLC. 40 minutos más tarde, el valor de pH de la solución se ajustó a aproximadamente 2.2 con HCl al 10%, luego la reacción se terminó, y se obtuvo la solución precursora cruda. 3. Purificación del precursor de insulina humana B28D N6829- ( °- (HO (CH2) isCO) -?-Glu) -B30E (HS062) La solución precursora cruda anterior se diluyó con agua para llevar el contenido de fase orgánica a aproximadamente 30% (v:v) , después de que se filtra a través de una membrana de 0.45µ??, la solución se purificó con RP-HPLC, en donde la columna de fase invertida fue Luna C18, 250 x 25 mm, 5/ m, 100 Á, la fase móvil A fue 0.1% de TFA/H20, la fase móvil B fue 0.1% de TFA/ACN. El producto deseado se eluyó y recolectó con un fase gradiente B de 35% a 65% a una velocidad de flujo de 20mL/min en un periodo de 60min, ESI-MS: 1563.4 ( [M+4H] +4) , se obtuvo la solución precursora purificada. 4. Saponificación del precursor de insulina humana B28D í B29- (?a- (HO (CH2) isCO) -?-Glu) -B30E Se removió acetonitrilo de la solución precursora purificada mediante concentración al vacío. Entonces, el valor pH de la solución se ajustó a 8.0 con solución de NaOH al 10% y se saponificó durante 50 min al adicionar un volumen igual de NaOH enfriado con hielo 0.2 M. El producto saponificado se analizó con RP-HPLC. Después de 50 min, la reacción se terminó al adicionar HC1 al 10%. 5. Purificación y liofilización del precursor de insulina humana B28D N1*29- (N01- (HO (CHa) isCO) -?-Glu) -B30E La solución precursora saponificada anterior se diluyó con acetonitrilo para llevar al contenido de fase orgánica a aproximadamente 30% (v:v) , después de que se filtra a través de una membrana de 0.45im, la solución se purificó con RP-HPLC, en donde la columna de fase invertida fue Luna C18, 250 x 25 mm, 5 zm, 100 A, la fase móvil A fue 0.1% de TFA/H2O, la fase móvil B fue 0.1% de TFA/ACN. El producto deseado se eluyó y recolectó con un fase gradiente B de 35% a 65% a una velocidad de flujo de 20mL/min en un periodo de 60min, se liofilizó, se obtuvieron 10 mg de producto (pureza 94.3%). El producto resultante tiene la fórmula estructural como sigue: 6. Confirmación de la estructura de insulina humana B28D-NEB29- (Na- (HOOC(CH2) 14CO) -?-Glu) -B30E El peso molecular de la insulina humana B28D-NSB29-( 0*- (HOOC (CH2) 14CO) -?-Glu) -B30E detectada por ESI-MS es 6237.52, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6237.17.
Se dirigió la insulina humana B28D-N8B2S- (?a-(HOOC (CH2) 14CO) -?-Glu) -B30E con tripsina. Los productos digeridos se analizaron por LC-MS. El resultado mostró que los pesos moleculares de los dos fragmentos Fl y F2 fueron 4865 y 1389, respectivamente, consistentes con el peso molecular teórico de los productos digeridos. El fragmento F2 corresponde al fragmento de cadena B modificado. Los sitios modificados se probaron como los mismos como se espera.
Ejemplo 16. Preparación de Na- (HOOC ( CH2 ) 14CO) -N6 -(insulina humana OCCH2CH2CO- (?28?-?*"9-?30?) ) -Lys-OH (HS067 ) 1. Preparación de éster metílico de Na- (hexadecandiil-metil) -N8- (3-acil-ácido propiónico-OSu) -lisina H-Lys (Fmoc) -OMe (4.33 g, 11.29mmol) disuelto en 5 mL de agua purificada se adicionó a solución en THF (50 mL) disuelto con éster succinimidílico de ácido metil-hexadecanoico (3.0 g, 7.55mmol), se adicionó DIEA (1.46 g, 11.29mmol) y a temperatura ambiente durante 24 horas. La solución de reacción se filtró y concentró bajo vacío. El residuo se disolvió en acetato de etilo, y la fase orgánica se lavó tres veces con 200 mL de HC1 0.1 M, luego la fase orgánica se recolectó y secó sobre sulfato de sodio anhidro, después de la filtración y concentración al vacío, el producto se cristalizó al usar 200 mL de acetonitrilo : agua = 10:1 (v:v) , se obtuvieron 5.0 g (99.6%) de metil-hexadecandioil-Lys (Fmoc) -OMe.
Se disolvió metil-hexadecandioil-Lys (Fmoc) -OMe (5.0 g, 7.52mmol) en THF (80 mL) , y luego se adicionó hexahidro-piridina (20 mL) , se agitó a temperatura ambiente durante 20 min. La solución se concentró bajo vacío. El sólido resultante se disolvió en acetato de etilo (100 mL) , se lavó con agua tres veces, y la fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro durante 30 minutos. Después de la filtración y concentración al vacío, el sólido resultante se disolvió en cloroformo (100 mL) , en el cual se adicionaron anhídrido succínico (11.34g, 113.4mmol) y N, N-diisopropiletilamina (14.1 g, 113.4mmol), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se adicionó agua purificada a 100 °C (100 mL) a la solución de reacción tres veces para lavado. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro durante 30 minutos. Después de la filtración y concentración al vacío, el sólido obtenido se purificó por HPLC de fase invertida, después de la concentración, se obtuvieron 3.45 g (84.7%) de éster metílico de N0- (hexadecandioil-metil) - 6- (3-acil-ácido propiónico) -Lys, ESI-MS: 543.6 ( [M+H] +) .
Se disolvió éster metílico de Na- (hexadecandioil-metil) - 6- (3-acil-ácido propiónico) -lisina (0.5 g, 0.9 mmol) en DCM (50 mL) , se adicionaron HOSu (0.116 g, 2.0 mmol) y EDC- HC1 (0.265 g, 2.0 mmol), luego se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas, se filtró, luego se lavó con HC1 0.1 M, la fase orgánica se recolectó. La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro durante 30 minutos, después de la concentración y filtración al vacío, 0.36 g (63%) éster metílico de Na- (hexadecandioil-metil) -N6- (3-acil-ácido propiónico-OSu) -lisina que tiene la fórmula estructural como se muestra a continuación. 2. Preparación de precursor Na- (HOOC (CH2) 14CO) -N8 - (insulina humana OCCH2CH2CO- (B28D-N8B29-B30E) ) -Lys-OH) Se disolvió insulina humana recombinante B(l-27)- D-K-E, A(l-21) (50 mg, 8,5 mmol) en 10 mL de HCl 10 mM, luego el valor de pH se ajustó a aproximadamente 10.5 con NaOH 0.2 M. EL éster metílico de N0*- (hexadecandioil-metil) -?e- (3-acil-ácido propiónico-OSu) -lisina (16.4mg, 25.6mmol) disuelto en 10 mL de acetonitrilo se adicionó en la solución anterior de insulina humana B (1-27) -D- -E, A(l-21) para iniciar la reacción. El proceso de reacción se controló por RP-HPLC. El valor de pH de la solución se ajustó a aproximadamente 2.2 con HCl al 10%, después de 40 min la reacción se terminó y se obtuvo una solución precursora cruda . 3. Purificación de precursor N0*- (HOOC ( CH2 ) 14CO) -N8 (insulina humana OCCH2CH2CO- (B28D-NEB29-B30E) ) -Lys-OH) La solución precursora cruda anterior se diluyó con agua para llevar al contenido de la fase orgánica a aproximadamente 30% (v:v) , después de que se filtra a través de una membrana de 0.45/xm, la solución se purificó con RP-HPLC, en donde la columna de fase invertida fue Luna C18, 250 x 25 mm, 5µt?, 100 Á, la fase móvil A fue 0.1% de TFA/H2O , la fase móvil B fue 0.1% de TFA/ACN. El producto deseado se eluyó y recolectó con un fase gradiente B de 38% a 68% a una velocidad de flujo de 20mL/min en un período de 60min, ESI-MS: 1595 ([M+4HJ+4), se obtuvo una solución precursora purificada. 4. Saponificación de precursor Na- (HOOC ( CH2 ) 1 CO) - 8 -(insulina humana OCCH2CH2CO - (B28D- £B29-B30E) ) -Lys-OH) Se removió acetonitrilo de la solución precursora purificada mediante concentración al vacío. Entonces, el valor de pH a la solución se ajustó a 8.0 con solución de NaOH al 10% y se adicionó un volumen igual de NaOH 0.2 M enfriado con hielo para iniciar la saponificación. El producto saponificado se analizó con RP-HPLC. Después de 50 min, la reacción se terminó al adicionar HC1 al 10%. 5. Purificación y liofilización de solución de precursorNa- (HOOC(CH2) 14CO) -N8 -(insulina humana OCCH2CH2CO -(B28D-N£B29-B30E) ) -Lys-OH) saponificada La solución precursora saponificada anterior se diluyó con acetonitrilo para llevar al contenido de fase orgánica a aproximadamente 30% (v:v) , después de que se filtra a través de una membrana de 0.45/zm, la solución se purificó con RP-HPLC, en donde la columna de fase invertida fue Luna C18, 250 x 25 mm, 5µta, 100 Á, la fase móvil A fue 0.1% de TFA/mo, la fase móvil B fue 0.1% de TFA/ACN. El producto deseado se eluyó y recolectó con un fase gradiente B de 35% a 65% a una velocidad de flujo de 20mL/min en un periodo de 60min, se obtuvieron 4.0 mg del producto (pureza 94.5%). El producto obtenido tiene la siguiente estructura: (HOOC ( CH2 ) 1 CO) - 6- (insulina humana OCCH2CH2CO - (B28D-l B29-B30E) ) -Lys-OH El peso molecular de 01- (HOOC ( CH2 ) 14CO) - 8- (insulina humana OCCH2CH2CO - (B28D-NeB29-B30E) ) -Lys-OH detectado por ESI- MS es 6350.68, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6350.28. se digirió N01- (HOOC ( CH2 ) 14CO ) -N6- (insulina humana OCCH2CH2CO - (B28D-N6B29-B30E) ) -Lys-OH con tripsina. Los productos digeridos se analizaron por LC-MS. El resultado mostró que el peso molecular de los dos fragmentos Fl y F2 fue de 4865 y 1502, respectivamente, consistente con el peso molecular teórico de los productos digeridos . El fragmento F2 corresponde al fragmento de cadena B modificado. Los sitios modificados se probaron como que son los mismos como se espera.
Ejemplo 17. Preparación de insulina humana lsfB29- (Na- (HOOC(CH2)i4CO) -?-Glu) -B30) (HS060) El procedimiento de preparación del presente ejemplo fue como aquel para la preparación de insulina humana 8529 - (N°<- ( HOOC ( CH2 ) 14CO) -?-Glu) -B29E-B30E, como se describe en el ejemplo 14, excepto que la insulina humana B (1-27) -D-K-E, A(l-21) (secuencia 6) usada en el ejemplo 14 se reemplazó con insulina humana recombinante Des(B30) (50 mg, 8.76mmol) (ejemplo 2).
El peso molecular de 8529- (N01- (HOOC (CHs) 14CO) -?-Glu) -Des(B30) detectado por ESI-MS es 6103.9, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6103.5.
Se digirió insulina humana N**29- (N01- (HOOC ( CH2 ) i4C0) -?-Glu) -Des (B30) con tripsina. Los productos digeridos se analizaron por LC-MS. El resultado mostró que los pesos moleculares de los dos fragmentos Fl y F2 fueron 4865 y 1256, respectivamente, consistentes con el peso molecular teórico de los productos digeridos . El fragmento F2 corresponde al fragmento de cadena B modificado. Los sitios modificados se probaron que son los mismos como se espera.
El producto resultante tiene la estructura como sigue: Ejemplo 18. Preparación de insulina humana N653- (Na-(HOOC (CH2) i4C0) -?-Glu) -B29E-B30E (HS065) El procedimiento de preparación del presente ejemplo fue el mismo como aquel que para la preparación de N6133- ( 0- (HOOC (CH2) 14CO) -?-Glu) -B29E-B30E, como se describe en el ejemplo 14, excepto que la insulina humana B (1-27) -D- -E, A (1-21) usada en el ejemplo 14 se reemplazó con insulina humana recombinante B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-21) (27.2mg, 4.65 mmol) (ejemplo 6).
El peso molecular de precursor de insulina humana 833- (Na- (HOOC (CH2) 14CO) -?-Glu) -B29E-B30E detectado por ESI-MS es 6249, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6248.23.
Se digirió insulina humana N23- (N01- (HOOC(CH2) i4CO) -?-Glu) -B29E-B30E con tripsina. Los productos digeridos se analizaron por LC-MS. El resultado mostró que los pesos moleculares de los dos fragmentos Fl y F2 fue de 5277.2 y 989, respectivamente, consistente con el peso molecular teórico de los productos digeridos. El fragmento Fl corresponde al fragmento de cadena B modificado. Los sitios modificados se probaron como los mismos que se esperaba. El producto resultante tiene la estructura como sigue: Ejemplo 19. Preparación de N"- (HOQC (CH2) i4CP) -N6- (insulina humana OCCH2CH2CO - (NEB3-B29E-B30E) ) -Lys-OH (HS606) El procedimiento de preparación del presente ejemplo fue el mismo como aquel para la preparación de N01-(HOOC(CH2)i4CO) -N*- (insulina humana OCCH2CH2CO- (N£B3-B29E-B30E) ) -Lys-OH, como se describe en el ejemplo 16, excepto que la insulina humana B (1-27) -D-K-E, A(l-21) usada en el ejemplo 16 se reemplazó con insulina humana recombinante B(l-2) -K-B(4-28) -E-E, A(l-21) (25mg, 4.27mmol) (ejemplo 6).
El peso molecular de ?a- (HOOC ( CH2 ) 14CO) -tf- (insulina humana OCCH2CH2CO- (]S E3-B29E-B30E) ) -Lys-OH detectado por ESI- MS es 6248, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6247.4.
Se digirió N01- (HOOC ( CH2 ) 14CO ) -isf- ( insulina humana OCCH2CH2CO - ( e?3-?29?-?30?) ) -Lys-OH con tripsina. Los productos digeridos se analizaron por LC-MS. El resultado mostró que los pesos moleculares de los dos fragmentos Fl y F2 fueron 5376.3 y 989, respectivamente, consistentes con el peso molecular teórico de los productos digeridos . El fragmento Fl corresponde al fragmento de cadena B modificado. Los sitios modificados se probaron como los mismos como se espera. El producto resultante tiene la estructura como sigue: (HOC(CH2) isCO) -?-Glu) -B29E-B30E (HS607) El procedimiento de preparación del presente ejemplo fue el mismo como aquel para la preparación de insulina humana N™3- (Na- (HOC ( CH2 ) isCO ) -?-Glu) -B29E-B30E, como se describe en el ejemplo 15, excepto que la insulina humana B (1-27) -D-K-E, A(l-21) usada en el ejemplo 15 se reemplazó con insulina humana recombinante B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-21) (27.2mg, 4.65mmol) (ejemplo 6).
El peso molecular de insulina humana N*®3- (N0*-( HOC ( CH2 ) isCO) -?-Glu) -B29E-B30E detectado por ESI-MS es 6236, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6234.3.
Se digirió insulina humana e?3- ( 01- ( HOC ( CH2 ) isCO ) -?-Glu) -B29E-B30E con tripsina. Los productos digeridos se analizaron por LC-MS. El resultado mostró que los pesos moleculares de los dos fragmentos Fl y F2 fueron 5263.2 y 989, respectivamente, consistentes con el peso molecular teórico de los productos digeridos . El fragmento Fl corresponde al fragmento de cadena B modificado. Los sitios modificados se probaron iguales como se espera. El producto resultante tiene la estructura como sigue: Ejemplo 21. Preparación de insulina humana JSf33- (Na- (HOOC(CH2)i4CO) -?-Glu) -B29E-B30E, A21G (HS608) El procedimiento de preparación del presente ejemplo fue el mismo como aquel para la preparación de l B3- (N01- (HOOC (CH2) 14CO) -?-Glu) -B29E-B30E, A21G, como se describe en el ejemplo 14, excepto que la insulina humana B(l-27)-D- -E, A (1-21) usada en el ejemplo 14 se reemplazó con insulina humana recombinante B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-20) -G (24.3 mg, 4.19mmol) (ejemplo 12).
El peso molecular de insulina humana N683- (N0*- (HOOC(CH2)i4CO) -?-Glu) -B29E-B30E, A21G detectado por ESI-MS es 6192.5, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6190.5.
Se digirió insulina humana N*313- (N0*- (HOOC (CH2) 14CO) -?-Glu) -B29E-B30E, A21G con tripsina. Los productos digeridos se analizaron por LC-MS. El resultado mostró que los pesos moleculares de los dos fragmentos Fl y F2 fueron 5219.5 y 989, respectivamente, consistentes con el peso molecular teórico de los productos digeridos. El fragmento Fl fue correspondiente al fragmento de cadena B modificado. Se probaron los sitios modificados iguales como se espera. El producto resultante tiene la estructura como sigue : Ejemplo 22. Preparación de "- (HOOC( CH2 ) 14CO) - 6- ( OCCH2CH2CO -(insulina humana eE3-B29E-B30E, A21G) ) -Lys-OH (HS609) El procedimiento de preparación del presente ejemplo fue el mismo como aquel para la preparación de N01-(HOOC ( CH2 ) 14CO) -N6- ( OCCH2CH2CO- (insulina humana ?e?3-?29?-?30?, A21G) -Lys-OH como se describe en el ejemplo 16, excepto que la insulina humana B (1-27) -D-K-E, A(l-21) usada en el ejemplo 16 se reemplazó con insulina humana B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-20)-G (24.1mg, 4.16mmol) (ejemplo 12).
El peso molecular de Na- (HOOC ( CH2 ) 14CO ) - 6- ( OCCH2CH2CO - (insulina humana e?3-?29?-?30?, A21G) ) -Lys-OH detectado por ESI-MS es 6289, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6289.6.
Se digirió Na- (HOOC ( CH2 ) CO) - 6- ( OCCH2CH2CO -(insulina humana NeB3-B29E-B30E, A21G) ) -Lys-OH con tripsina. Los productos digeridos se analizaron por LC-MS. El resultado mostró que los pesos moleculares de los dos fragmentos Fl y F2 fueron 5318.5 y 989, respectivamente, consistentes con el peso molecular teórico de los productos digeridos. El fragmento Fl corresponde al fragmento de cadena B modificado. Se probaron que los sitios modificados son los mismos como se espera. El producto resultante tiene la estructura como sigue: Ejemplo 23. Preparation de insulina humana N653- (?01-(HOC(CH2) isCO) -?-Glu) -B29E-B30E,A21G (HS610) El procedimiento de preparación del presente ejemplo fue el mismo como aquel para la preparación de insulina humana 683- (N™- (HOC ( CH2 ) 15CO) -?-GlÜ) -B29E-B30E, A21G como se describe en el ejemplo 15, excepto que la humana insulina B (1-27) -D-K-E, A(l-21) usada en el ejemplo 15 se reemplazó con insulina humana recombinante B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-20)-G (24.8mg, 4.28mmol) (ejemplo 12).
El peso molecular de insulina humana N6"- ( 01-( HOC ( CH2 ) isCO ) -?-Glu) -B29E-B30E,A21G detectado por ESI-MS es de 6177, que es consistente con el peso molecular teóricamente previsto de 6176.5.
Se digirió insulina humana N8133- (N01- (HOC ( CH2 ) isCO ) -?- Glu) -B29E-B30E, A21G con tripsina. Los productos digeridos se analizaron por LC-MS. El resultado mostró que los pesos moleculares de los dos fragmentos Fl y F2 fueron 5205.4 y 989, respectivamente, consistentes con el peso molecular teórico de los productos digeridos. El fragmento Fl corresponde al fragmento de cadena B modificado. Se probaron que los sitios modificados son los mismos como se espera. El producto resultante tiene la estructura como sigue : Ejemplo 24. Preparación de insulina (20KD) PEGilada 1. PEGilación (20KD) de insulina B (1-27) -D-K-E, A(l-21) Se disolvieron 50 mg de insulina B (1-27) -D-K-E, A (1-21) en 25 mL de agua, se ajustó el valor de pH a 11.40 con a2C03 1.0 M, luego se adicionaron lentamente 500 mg de la solución de m-PEG-OSu (m-PEG-OSu se disolvió en solvente mezclado que tiene 10 mL de acetonitrilo y 6 mL de THF) , la solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego el valor del pH del sistema de reacción se ajustó a 6.0 con HCl 0.1 M para extinguir la reacción, el solvente orgánico se removió bajo presión reducida. La reacción se terminó, y la purificación se realizó al usar el gel de intercambio catiónico GE SP-Sefarosa. El producto de reacción final se diluyó 10 veces con la solución A (solución A, G1Y 20 mM, pH 3.0; solución B, Gly 20 mM, pH 3.0 NaCl 1 M) y se cargó, la columna se puso en equilibro con solución A en 5 volúmenes, y se eluyó en gradiente lineal de 0 a 100% de B/20 volúmenes de columna. Los picos eluidos se recolectaron, luego se desalaron y concentraron en un tubo de ultrafiltración atrapado de 10 kD, el producto deseado se obtuvo, referido como PEG (20 D) - 156. 2. Identificación de la posición modificada de PEG (20KD) de insulina B (1-27) -D-K-E, A(l-21) Antes y después de la PEGilación, se digirieron la insulina B (1-27) -D-K-E, A(l-21) y B (1-27) -D-K-E, A(l-21) PEGilado con Glu-C, respectivamente, y se sometieron a análisis de LC-MS. Los productos digeridos fueron como sigue ; Los productos enzimáticamente digeridos se compararon mediante análisis de HPLC. Se encontró que los fragmentos enzimáticamente digeridos F-I, F-II y F-III no alteran antes y después de la digestión enzimática, en tanto que la hidrofobicidad del fragmento F-IV, que se obtuvo de insulina B (1-27) -D-K-E, A(l-21) PEGilada enzimáticamente digerida se incrementó dramáticamente . Estos datos mostraron que la posición PEGgilado estuvo en B29K, la estructura de lo cual es como sigue: 3. Se preparó insulina PEGilada B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-21) como se describe en el paso 1 anterior, el producto diana se obtuvo, referido como PEG (20KD) -107. El producto resultante se identificó usando el método mostrado en el paso 2, se usó DTT (10 mM) para reducción del producto obtenido. No se detectó cambio en la cadena A. Se incrementó bastante la hidrofobicidad de la cadena B. Los datos demostraron que la posición modificada está en la posición B3K. La estructura molecular de los productos modificados obtenidos fue como sigue: Ejemplo 25. Preparación de insulina PEGilada (30KD) 1. PEGilación (30KD) de insulina B ( 1-2 ) -D-K-E, A(l-21) Se disolvieron 50mg de insulina B ( 1-27 ) -D-K-E, A(l-21) en 25ml de agua, el valor del pH se ajustó a 11.40 con a2C03 1.0M, luego se adicionaron lentamente 750mg de solución de m-PEG-OSu (30K) (se disolvió m-PEG-OSu en solvente mezclado de 10ml de acetonitrilo y 6ml de THF) , la solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2hrs. Entonces, el valor de pH del sistema de reacción se ajustó a 6.0 con HC1 0.1M para extinguir la reacción, el solvente orgánico se removió bajo presión reducida. La reacción se terminó y se realizó la purificación por gel de intercambio catiónico GE SP-Sepharose . El producto de reacción final se diluyó 10 veces con la solución A (solución A, Gly 20mM pH3.0; solución B, Gly 20mM pH 3.0 NaCl 1M) y se cargó, la columna se puso en equilibrio con la solución A en 5 volúmenes y se eluyó en gradiente lineal desde 0 a 100% de B/20 volúmenes de columna. Los picos eluidos se recolectaron, luego se desalinearon y concentraron en un tubo de ultrafiltración atrapado de 10KD, el producto deseado se obtuvo, referido como PEG (30KD)-156. 2. Identificación de la posición modificada con PEG (30KD) de insulina B ( 1-27 ) -D-K-E, A(l-21) Antes y después de la PEGilación, se digirieron la insulina B ( 1-27 ) -D-K-E, A(l-21) y PEGilada B ( 1-27 ) -D-K-E, A(l-21) con GLu-C, respectivamente. Los productos digeridos son como sigue: Cada uno de los productos digeridos se analizó por HPLC. Los resultados mostraron que no se detectó cambio en los fragmentos FI, F-II y F-III antes y después de la PEGilación. Sin embargo, se incrementó significativamente la hidrofobicidad del fragmento F-IV de producto digerido. Los datos demostraron que la posición de PEGilación está en B29K, la estructura de lo cual es como sigue: 3. Se preparó insulina (30KD) PEGilada B(l-2)-K-B (4-28) -E-E, A(l-21)como se describe en el Paso 1 anterior, el producto diana se obtuvo, referido como PEG (30KD)-107. El producto resultante se identificó usando el método mostrado en el Paso 2, se usó DTT (lOmM) para la reducción del producto obtenido. No se detectó cambio en la cadena A. Se incrementó bastante la hidrofobicidad de la cadena B. Se demostró que la posición modificada está en la posición B3K. La estructura molecular de los productos modificados obtenidos fue como sigue: Ejemplo 26. Preparación de insulina PEGilada (ramificada 40KD) 1. PEGilación (40KD) de insulina B ( 1-2 ) -D-K-E, A(l-21) ) Se disolvieron 50mg de insulina B ( 1-27 ) -D-K-E, A(l-21) en 25ml de agua, el valor del pH de la solución se ajustó a 11.40 con Na2CC>3 1.0M, luego se adicionaron lentamente lOOOmg de solución de m-PEG-OSu (40K) (se disolvió m-PEG-OSu en solvente mezclado de 10ml de acetonitrilo y 6ml de THF) , la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Entonces, el valor del pH del sistema de reacción se ajustó a 6.0 con HC1 0.1M para extinguir la reacción, el solvente orgánico se removió bajo presión reducida. La reacción se terminó y se realizó la purificación por gel de intercambio catiónico GE SP-Sepharose . El producto de reacción final se diluyó 10 veces con la solución A (solución A, Gly 20mM pH3.0; solución B, Gly 20mM pH3.0 NaCl 1M) , y se cargó, la columna se puso en equilibrio con la solución A en 5 volúmenes, y se eluyó en gradiente lineal de 0 a 100% de B/20 volúmenes de columna. Los picos eluidos se recolectaron, luego se desaliñaron y concentraron en un tubo de ultrafiltración atrapado de 10KD, el producto deseado se obtuvo, referido como PEG (40KD) -156. 2. Identificación de la posición modificada con PEG (40KD) de insulina B ( 1-27 ) -D-K-E, A(l-21) Antes y después de la PEGilacion, la insulina B(l-27) -D-K-E, A(l-21) y B ( 1-27 ) -D-K-E, A(l-21) PEGilada se digirieron con GLu-C, respectivamente. Los productos digeridos son como sigue: Se analizaron los productos digeridos por HPLC. Los resultados mostraron que no se detectó cambio en los fragmentos FI, F-II y F-III antes y después de la PEGilacion. Sin embargo, se incrementó significativamente la hidrofobicidad del fragmento F-IV del producto digerido. Los datos demostraron que el sitio PEGilado estás en B29K, la estructura del cual es como sigue: preparó insulina B ( 1-2 ) -K-B (4-28 ) -E-E, A(l 21) PEGilada (40KD) como se describe en el Paso 1 anterior, se obtuvo el producto diana, referido como PEG (40KD)-107. El producto resultante se identificó usando el método mostrado en el Paso 2, se usó DTT (lOmM) para la reducción del producto. No se detectó cambio en la cadena A. La hidrofobicidad de la cadena B se incrementó bastante. Se confirmó que la posición modificada está en B3K. La estructura molecular de los productos modificados obtenidos fue como sigue: Ensayos Biológicos Ejemplo 1 de Prueba: Ensayo de unión de análogo de insulina humana al receptor de insulina (IR) o al receptor 1 del factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF1-R) La intensidad de unión relativa del análogo de insulina humana de acuerdo a la presente invención al receptor de insulina o al receptor 1 del factor de crecimiento tipo insulina, se detectó por ensayo de unión competitiva del receptor.
Las membranas que expresan el receptor de insulina y el receptor del factor-1 de crecimiento tipo insulina se extrajeron de células IM-9 y H19-7 (ATCC) . Se recolectaron 5 x 108 células, se lavaron con PBS y se resuspendieron en amortiguador de lisis (Tris-HCl 50mM, pH7.8, NaCl 150mM, inhibidores de proteasa (Roche) ) en una densidad celular de 6 x 107 células/mL, las muestras se colocaron en hielo. Las muestras se homogenizaron por homogenizador eléctrico a 25000rpm 10 seg, dos veces, luego se centrifugaron a baja velocidad (2000g, 15min) , el sobrenadante se recolectó. La fracción precipitada se re-suspendió en una cantidad apropiada del amortiguador de lisis. El paso anterior se repitió tres veces y se mezcló el sobrenadante de cada vez. El sobrenadante mezclado se centrifugó a alta velocidad (4°C, 35000rpm, 60min) , luego el sobrenadante resultante se descartó, la fracción precipitada se re-suspendió en una cantidad apropiada del amortiguador de lisis celular, las proteínas de membrana experimentales se obtuvieron. La proteína de membrana extraída de la célula IM-9 fue el receptor de insulina, referido como proteína de membrana celular IM-9. La proteína de membrana extraída de la célula H19-7 fue el receptor del factor-1 de crecimiento tipo insulina, referido como proteínas de membrana celular H19-7. La concentración de la proteína se cuantificó para el método de Bradford.
En el experimento de unión al receptor de insulina, cada concavidad de una placa de 96 concavidades se adicionó con 4C^L de insulina con isótopo 125pM [ I] (Perkin Elmer, Cat. No 420010UC) , 3µ? de proteína de membrana celular IM-9 (50 L), y 10 L de diluciones gradientes de los análogos de insulina humana que se van a probar. Toda la solución anterior se preparó en una solución de reacción (Tris-HCl 50mM, pH7.8, NaCl 150mM, BSA al 0.1%). La mezcla anterior se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 1 hora. Las proteínas de membrana incubadas se recolectaron por el recolector FilterMate Havester (Perkin Elmer, Cat No S/N: DA12073369) a la membrana de MicroBeta Filtermat B (Perkin Elmer, Cat No 1450-521.), que se pre-humectó con PEI al 0.3%, luego se lavó con la solución de reacción durante tres veces y se secó en un horno a 60 °C durante lhr. La membrana de filtro seca se puso en una membrana de buen sello, se adicionó con 15mL de fluido de escintilación, y se selló. Finalmente, el resultado se leyó por contador de Placa Microbeta Counter (Perkin Elmer, Cat. No.1450).
En los experimentos de unión al receptor del factor-1 del crecimiento tipo insulina, cada concavidad de una placa de 96 concavidades se adicionó con 40µ1. de 125pM [125I] isótopo IGF-1, 9]iq de proteina de membrana celular H19-7 (50yL), y diluciones gradientes de 10iL de los análogos de insulina humana que se van a probar. Los pasos restantes fueron los mismos como aquellos en los experimentos de unión al receptor de insulina.
Los datos obtenidos en los experimentos anteriores se ajustaron de forma no lineal usando Graphpad Prism. Se obtuvieron valores de IC50 (nM) en los experimentos de unión competitiva de los análogos de insulina humana al receptor de insulina o al receptor del factor-1 de crecimiento tipo insulina. Los resultados se muestran en la tabla posterior .
Tabla 1: Ensayo de unión para insulina y análogos de la misma al receptor de insulina (IR) o el receptor 1 del factor de crecimiento tipo insulina (IGF1-R) Nota: hl, insulina humana; Des (B30)-hI, insulina humana que carece de B30, ambas de las cuales se usaron como control positivo.
Los datos demostraron que los análogos de insulina de la presente invención tienen una afinidad de unión comparativa como los controles positivos, en donde la afinidad de unión de B ( 1-2 ) '-K-B ( 4-28 ) -E-E, A(l-20)-G con IR es 1.9 veces tan potente como aquella del control positivo (hl), en tanto que su afinidad a IGF1-R se disminuyó un décimo menor que aquella de hl.
Ejemplo 2 de Prueba: Evaluación de actividad in vivo de análogos de insulina humana 1. Los ratones macho ICR usados en este experimento se compraron de SINO-BRITSH SIPPR/BK LAB. ANIMAL LTD., CO, 18-20g. Los ratones se alimentaron tres dias en un ambiente de laboratorio, temperatura 20-25°C; humedad de 40-60%. 2. El fármaco usado en este experimento, Humulin R (Lilly Egypt, HRE046. 100IU/mL) , se formuló a 1 IU / mL con HCl 0.05N (0.05 mg / kg) , luego se diluyó con NaCl al 0.9% a soluciones en concentraciones de 0, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.32, 0.64 IU / mL. 3. 40 ratones machos se ayunaron durante 16 horas antes de este experimento. Al comienzo, estos ratones se pesaron y los niveles básicos de glucosa sanguínea se midieron (corte de las colas y los niveles de glucosa sanguínea se detectaron al usar un glucómetro Roche y las tiras de prueba correspondientes, de manera similar de forma posterior) . En base a los valores de glucosa sanguínea, los ratones se dividieron al azar en ocho grupos, cinco ratones por grupo. Las dosis de administración a cada grupo fueron como sigue: 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2 IU / kg (el volumen de administración fue de 100 L por 20 g de peso corporal) . 4. El nivel de glucosa sanguínea (mmol/L) de cada ratón se determinó a 1 hora después de la administración. 5. Análisis de datos: El nivel medido de glucosa sanguínea se expresó como un porcentaje del nivel de glucosa sanguínea antes de la administración. La curva de reacciones de fármaco (hipoglicémica) se gráfico con Graphpad Prism 5, se obtuvo el valor ED50 (IU/kg o mg/kg) . El valor de ED5o significa la dosis de fármaco para inyección subcutánea requerida para alcanzar 50% del efecto hipoglicemico máximo. 6. Los valores ED5o de análogos de insulina se mostraron en la tabla a continuación: Tabla 2: Ensayo de actividad in vivo de análogos de insulina humana Nota: La actividad relativa se refiere a la relación del valor de ED50 del análogo de insulina humana versus el valor de ED50 de Des (B30)-hI. Se usó Des(B30)-hI como el control para cada experimento, y el valor de Des(B30)-hI se ajustó a 1.
Estos resultados anteriores indicaron que la actividad in vivo de los análogos de insulina humana de acuerdo a la presente invención fueron comparativos a aquel del control positivo. La actividad in vivo de algunos análogos de insulina humana, tal como B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A (1-20) -G, se incrementó más de 50% en comparación con hl (insulina humana) o Des (B30)-hI (insulina humana que carece de B30), y fue significativamente superior al control positivo .
Ejemplo 3 de Prueba: Ensayo de actividad de larga durante in vivo de derivados de insulina Las ratas SD, machos, usadas en este experimento, se compraron de SINO-BRITSH SIPPR/BK LAB. ANIMAL LTD., CO, Número de licencia: SCXK (Shanghai) 2008-0016, 18-20g . Las ratas se alimentaron en un ambiente de nivel de SPF. Ratones macho ICR se alimentaron tres dias en ambiente de laboratorio, a una temperatura de 20-25 °C, humedad de 40-60%. Los ratones ayunaron durante 8hrs antes del experimento. Se inyectaron de manera intraperitoneal 100 mg/kg de STZ para establecer modelos de rata que padecen de diabetes. Dos días después, se midieron los valores de glucosa sanguínea en ayunas. Las ratas, cuyos valores de glucosa sanguínea fueron mayores de ll.lmmol/1, se consideraron como ratas que padecen de diabetes. Al comienzo del experimento, las ratas se pesaron, y se midieron los niveles sanguíneos de glucosa (corte de colas y se detectaron los niveles sanguíneos de glucosa al usar el Glucómetro Roche y las correspondientes tiras de prueba, de manera similar a lo posterior) . En base a los valores sanguíneos de glucosa, las ratas se dividieron al azar en grupos, 43 ratas por grupo. El fármaco que se va a usar se preparó a las concentraciones requeridas. Después de la inyección subcutánea de los fármacos, los niveles sanguíneos de glucosa se midieron en múltiples puntos de tiempo. Se calculó el IP (índice de Prolongación) de acuerdo al nivel sanguíneo de glucosa.
Control Positivo: 1. Humulin R: una inyección de insulina humana recombinante comprada de Lilly. 2. Detemir: una inyección de insulina Determir compradas de Novo Nordisk. 3. HS060 es Degludec, una molécula en ensayo clínico fase III de Novo Nordisk, insulina humana N - (N -(HOOC (CH2) i4CO) -?-Glu) -Des (B30) , ver Ejemplo 17.
Los compuestos que se van a probar fueron derivados de insulina de los análogos acilados de insulina humana indicados como sigue: 1. HS061, B28D -?e?29- (?a- (HOOC (CH2) i4CO) -?-Glu) -B30E, ver Ejemplo 14. 2. HS062, ?280-?e?29- (N01- (HO (CH2) i5CO) -?-Glu) -B30E, ver Ejemplo 15. 3. HS067, Na- (HOOC(CH2) i4CO) -?e- (OCCH2 CH2CO- (B28D-?e?29-?30? insulina humana) ) -Lys-OH, ver Ejemplo 16.
Los resultados mostrados en la Tabla 3 demostraron que las actividades de acción prolongada de HS061 (IP: 117.9), HS062 (IP: 112.3), HS067 (IP: 132.9) son todas mejores que aquella de Detemir (IP: 100) o HS060 (IP: 105.9) (ambos son controles) . Específicamente, HS067 mantuvo el nivel sanguíneo básico de glucosa hasta 12 horas en este modelo (los resultados se muestran en la Figura 5) .
Tabla 3: Resultados in vivo de actividades de acción prolongada de HS06Q , HS061, HS062 HS067 Ejemplo 4 de Prueba: Ensayo de unión de insulina PEGilada al receptor de insulina (IR). 1. El método de prueba fue el mismo como se describe en el Ejemplo 1 de Prueba. 2. Los compuestos que se van a probar: Insulina PEGilada (20KD) : PEG (20KD)-107 representa la insulina B (1-2) -K-B(4-28) -E-E, A(l-21) PEGilada, en donde el peso molecular de PEG es 20KD; PEG (20KD)-156 representa la insulina B (1-27 ) -D-K-E, A(l-21) PEGilada, en donde el peso molecular de PEG es 20KD) . Ver de manera particular el Ejemplo 24. 3. En el ensayo de unión competitiva, en la Tabla 4 se mostraron los valores de IC50 (nM) de la unión de insulina PEGilada (20KD) al receptor de insulina. Se muestra que la secuencia preferida de acuerdo a la invención aún puede unirse al receptor de insulina (IR) después de la PEGilación.
Tabla 4: Ensayo de unión a insulina PEGilada al receptor de insulina (IR) Ejemplo 5 de Prueba: ensayo de actividad de acción prolongada in vivo de insulina PEGilada 1. Los métodos de prueba fueron como se describen en el Ejemplo 3 de Prueba. 2. Compuestos que se van a probar: 1) . Insulina PEGilada (20KD) : PEG (20KD)-107 representa la insulina PEGilada B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-21), en donde el peso molecular de PEG es 20KD; PEG (20KD)-156 representa la insulina B ( 1-27 ) -D-K-E, A(l-21) PEGilada (20KD) . Ver particularmente el Ejemplo 24. 2) . Insulina PEGilada (30KD) : PEG (30KD)-107 representa la insulina B ( 1-2 ) -K-B ( 4-28 ) -E-E, A(l-21) PEGilada (30KD) ; PEG ( 30KD) -156 representa la insulina B(l-27) -D-K-E, A(l-21) PEGilada (30KD) . Ver de manea particular Ejemplo 25. 3) . Insulina PEG (40KD) : PEG (40KD)-107 representa la insulina B ( 1-2 ) -K-B ( 4-28 ) -E-E, A ( 1-21 ) PEGilada (ramificada 40KD) ; PEG ( 40KD) -156 representa insulina B(l-27) -D-K-E, A(l-21) PEGilada (ramificada 40KD) . Ver de manera particular el Ejemplo 26. 3. Resultados de Prueba 1) . Los resultados de la evaluación in vivo de la actividad de larga duración de insulina PEGilada (20KD) se muestran en la siguiente Tabla 5 y en la Figura 6.
Tabla 5: Resultados de evaluación in vivo de actividad de larga duración de insulina B ( 1-27 ) -D-K-E, A(l-21) PEGilada (20KD) y de B (1-2) -K-B (4-28) -E-E, A(l-21) Conclusión: Los resultados en la Tabla 5 mostraron que PEG (20KD)-107 y PEG (20KD)-156 mantuvieron un nivel sanguíneo estable de glucosa hasta 32-46hrs, ver Figura 6. IP (índice de Prolongación) de los dos fue aproximado, fueron 207.36 y 204.26, respectivamente (ver Tabla 5), que fue significativamente mejor que aquel del control positivo. 2. Resultados de evaluaciones in vivo de la actividad de larga duración de insulina PEGilada (30KD) e insulina PEGilada (40KD) se muestran en la siguiente Tabla 6 y la Figura 7.
Tabla 6: Resultados de actividad de larga duración in vivo de PEG (30KD)-107, PEG (40KD)-107, PEG (30KD)-156 y PEG Conclusión: Los resultados en la tabla 6 y Figura 7 mostraron que PEG (30KD)-107 (IP: 282.5) mantuvo estable el nivel sanguíneo de glucosa hasta 48hrs en ratones; PEG (40KD)-107 (IP: 285.0) mantuvo estable el nivel sanguíneo de glucosa hasta 60hrs en ratones; PEG (30KD)-156 (IP: 289.8) mantuvo estable el nivel sanguíneo de glucosa hasta 56hrs en ratones; PEG (40KD)-156 (IP: 297.4) mantuvo estable el nivel sanguíneo de glucosa hasta 76hrs en ratones, que fue significativamente mejor que aquel del control positivo.

Claims (29)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un análogo de insulina humana y una sal fisiológicamente tolerable del mismo que tiene la cadena A y la cadena B como sigue: S S cadena A: A0GIVEQ C ICTSI CISLYQ LENYC A2i cadena B: en donde: A0 puede ser R o estar ausente; A2i puede ser N o G; B3 puede ser K, D o N; B27 puede ser E, T, D o K; B28 puede ser E, D, P o K; B29 puede ser E, K o P; B30 puede ser K, R, E, T o estar ausente; B3i,B32 puede ser R, opcionalmente uno está ausente o ambos están ausentes; con la condición que: cuando el Ao está ausente, y tanto A2i como B3 son N: B31B32 está ausente, B27B28B29B3o no es PKT, TKPT o TDKT; o B3o B31B32 está ausente, B27B28B29 no es TPK; cuando el A0 está ausente, A2i es N, B3 es K, y B31B32 está ausente, B27B28B29B3o no es TEKT; cuando el A0 está ausente, A2i es G, y B3 es N, B27B28B29B30 B31B32 no es TPKTRR; cuando B3 y B27-B30 son residuos de lisina, el grupo e-amino de los residuos de lisina se puede acilar; opcionalmente, -amino en la N' -terminal de la cadena A y la cadena B también se puede acilar. 2. El análogo de la insulina humana y una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque solo uno de los residuos de aminoácido B3 y B27-B30 es un residuo de lisina. 3. El análogo de la insulina humana y una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cuando el B3 en la cadena B es N: B28 se selecciona de K, P o D, B29 se selecciona de E, K o P, B3o se selecciona de R, E, T o está ausente, y B31 y B32 están ausentes. . El análogo de la insulina humana y una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque cuando el B30 B31B32 está ausente, B28B29 es KE. 5. El análogo de la insulina humana y una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cuando el B3 en la cadena B es D: B28 y B29 son P o K; B3o es R o T o está ausente; B31 y B32 son R o está ausente; Entre los cuales B28B29 es preferentemente PK. 6. El análogo de la insulina humana y una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cuando A0 está ausente y B3 en la cadena B es K: B28 y B29 son P o E; B30 es E o R; B3i es R o está ausente; y B32 está ausente; entre los cuales B28B29 es preferentemente PE. 7. El análogo de la insulina humana y una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las secuencias de la cadena A y la cadena B se seleccionan del grupo que consiste de : Cadena A: RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.4 Cadena B: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO.5 Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l Cadena B: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKER SEQ ID NO.6 Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l Cadena B: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKE SEQ ID NO.7 Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l Cadena B: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPE SEQ ID NO.8 Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l Cadena B: FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.9 Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l Cadena B: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE SEQ ID NO.10 Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2 Cadena B: FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR SEQ ID NO.11 Cadena A: RGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.3 Cadena B: FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTR SEQ ID NO.12 Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l Cadena B: FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPERR SEQ ID NO.13 Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l Cadena B: FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO.14 Cadena A: RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.4 Cadena B: FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO.14 Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2 Cadena B: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKE SEQ ID NO.15 Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2 Cadena B: FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.16 Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2 Cadena B: FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKR SEQ ID NO.17 Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2 Cadena B: FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO.18 Cadena A: RGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.3 Cadena B: FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO.18 Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2 Cadena B: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE SEQ ID NO.10 8. El análogo de insulina humana y una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el análogo de insulina humana está PEGilado. 9. El análogo de insulina humana y una sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el análogo de insulina humana se modifica por PEG; el peso molecular de la molécula de PEG es 5-100 KD, de manera preferente 10-80 KD, de manera más preferente 15-45KD, de manera mucho más preferente 20-40KD; y la molécula de PEG es del tipo de cadena recta o de cadena ramificada. 10. Un método para preparar el análogo de insulina humana o sal fisiológicamente tolerable del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque comprende construir un vector de expresión, expresar el vector transformado en las células hospedadoras, aislar y purificar el precursor expresado, liberar el análogo de insulina del vector expresado mediante métodos químicos y/o enzimáticos; opcionalmente el análogo de insulina humana está PEGilado, la PEGilación es preferentemente un método de modificación químicamente acilador, que comprende sintetizar un agente de acilación, acilar el grupo amino localizado en los análogos de insulina humana, y remover el grupo protector del grupo acilado. 11. Un precursor expresado, usado para la preparación del análogo de insulina humana o sal fisiológicamente tolerable del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que tiene la siguiente fórmula (I) : A-Rl-B (I) caracterizado porque: Rl es un fragmento peptidico que tiene de 0 a 5 residuos de aminoácido, el fragmento peptidico que consiste de alanina (A) , lisina (K) y arginina (R) ; A y B corresponden a la cadena A y a la cadena B del análogo de insulina humana, respectivamente. 12. El precursor expresado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el precursor expresado se selecciona del grupo que consiste de: SEQ ID NO.19: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN, SEQ ID NO.20: FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG, SEQ ID NO.21: FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN o SEQ ID NO.77: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG. 13. Un ADN (desoxiribonucleico) , caracterizado porque codifica para el precursor expresado como se reivindica en la reivindicación 11 o 12. 14. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende el ADN como se reivindica en la reivindicación 13. 15. Una célula hospedadora, caracterizada porque se transforma con el vector de expresión como se reivindica en la reivindicación 14. 16. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 15, la célula hospedadora está caracterizada porque es una bacteria, preferentemente Escherichia coli. 17. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la célula hospedadora es levadura, preferentemente Pichia pastoris o Saccharomyces cerevisiae. 18. Un derivado de insulina, caracterizado porque en que se forma insulina acilada al conectar un grupo acilado al grupo a-amino en la N-terminal de la cadena A y la cadena B, o al grupo e-amino en el residuo de lisina de B3, B27-B30, la insulina acilada tiene la siguiente fórmula: S- -X-Y-Z en donde S es insulina o análogo de insulina humana de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7; -W-X-Y-Z es un grupo acilado de análogo de insulina humana, en donde W se selecciona de - un grupo que tiene una estructura de dos acilos de -OC (CH2 ) mCO-, en donde m es un número entero entre 2 y 10, se forma un enlace de amida entre uno de los grupos carboxilicos en la estructura y el grupo a-amino en el residuo de aminoácido N-terminal de la cadena A o la cadena B de la insulina o análogo de origen del mismo o un grupo e-amino en un residuo de Lys que existe en la cadena B; un residuo de a-aminoácido con un grupo carboxilo en la cadena lateral o un péptido que tiene de 2 a 4 a-aminoácidos con un grupo carboxilico en la cadena lateral, en donde se forma un enlace de amida entre el residuo o el péptido o el grupo a-amino en la N-terminal de la cadena A o la cadena B de la insulina de origen o análogo de la misma o grupo e-amino en un residuo de Lys que existe en la cadena B; X se selecciona de -CO-; - un compuesto de diamPEGilaino que comprende un grupo carboxilico, en donde se forma un enlace de amida entre uno de los grupos a-amino del compuesto de diamino y el grupo carboxilico de W; a) cuando es un residuo de a-aminoácido o un péptido que tiene de 2 a 4 a-aminoácidos, el enlace de amida se forma entre el grupo amino de W y el -C0- de X; b) cuando W es un grupo que tiene una estructura de dos acilos, el grupo X se enlaza a la estructura de dos acilos mediante uno de sus grupos amino; Y se selecciona de -A(CH2)m-, en donde m es un número entero entre 6 y 32, y A está ausente o es C0-; - cadena de hidrocarburo bivalente que comprende un grupo acilo, que contiene 1, 2 o 3 grupos -CH = CH- y varios grupos -CH2- suficientes para obtener de forma total 10-32 átomos de carbono en la cadena; - cadena de hidrocarburo bivalente que tiene la fórmula de -B (CH2) vCeH4 (CH2) w-, en donde B está ausente o es CO-, v y w son números enteros o uno de ellos es 0, haciendo v y w en el intervalo de 6 a 30; a) cuando X es CO-, A o B está ausente; o b) cuando X es un compuesto de amino, A o B es CO-; Z se selecciona del grupo que consiste de-OH, -NH2, -COOH, -S03H, -PO3H. 19. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el grupo acilado -W-X-Y-Z se conecta al grupo e-amino en los residuos de lisina B3, B27 a B30 de insulina de origen. 20. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el grupo acilado -W-X-Y-Z se conecta al grupo a-amino en la N-terminal de la cadena A y la cadena B de la insulina de origen. 21. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque S es el análogo de insulina humana seleccionada del grupo que consiste de: Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID N10.1 Cadena B: FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE SEQ ID NO.10 Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l Cadena B: FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.9 Cadena A: GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2 Cadena B: FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.16. 22. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el grupo acilado -W- X-Y-Z se selecciona del grupo que consiste de: Na- (HOOC (CH2) i4CO) -?-Glu; Na- (HO (CH2) 15CO) -Y-G1U; Na- (HOOC (CH2) 14CO) -?e- (ácido 3-acil-propiónico *)-Lys, en el cual * es el punto de conexión para la insulina. 23. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 18, que se selecciona de del grupo que consiste de: B28D-N£B29-(Na-(HOOC(CH2)i4CO)-Y-Glu)-B30E insulina humana; ?28?-?e?29- (? - (HO (CH2) i5CO) -?-Glu) -B30E insulina humana; ?a- (HOOC (CH2) 14CO) -?e- (OCCH2CH2CO- (?28?-?e?29-?30? insulina humana; ) ) -Lys-OH; ?e?3- (?a- (HOOC (CH2) 14CO) -?-Glu) -B29E-B30E insulina humana; ?e?3- (Na- (HOC (CH2) 15CO) -?-Glu) -B29E-B30E insulina humana; Na- (HOOC (CH2) 14CO) -?e- (OCCH2CH2CO- (?e?3-?29E-B30E insulina humana; ) ) -Lys-OH; N - (?a- (HOOC (CH2) 14CO) -?-Glu) -B29E-B30E, A21G insulina humana; ?e?3- (N01- (HOC (CH2) 15CO) -?-Glu) -B29E-B30E, A21G insulina humana; Na- (HOOC (CH2) 14CO) -?e- (OCCH2CH2CO- (?e?3-?29?-?30?, A21G insulina humana; )) -Lys-OH . 24. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque comprende el análogo de insulina humana o sal fisiológicamente tolerable del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o que comprende derivados de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23. 25. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque comprende el análogo de insulina humana o una sal fisiológicamente aceptable del mismo en formas disuelta, amorfa y/o cristalina . 26. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque comprende un adyuvante a largo plazo, el adyuvante a largo plazo está presente junto con el medicamento en una manera de co-cristalización. 27. Una formulación inyectable que tiene actividad de insulina, caracterizada porque la solución comprende la formulación farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 24 presente en la forma disuelta. 28. Uso del análogo de insulina humana y/o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o derivado de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, la preparación de un medicamento para el tratamiento de diabetes tipo II, hiperglicemia, obesidad o síndrome de resistencia a insulina. 29. Uso de análogo de insulina humana y/o una sal fisiológicamente tolerable del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la preparación de una formulación farmacéutica de acción rápida y/o de acción prolongada que tiene actividad de insulina.
MX2014006698A 2011-12-15 2012-11-22 Analogo de insulina humana y derivado acilado del mismo. MX2014006698A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110422095 2011-12-15
PCT/CN2012/085054 WO2013086927A1 (zh) 2011-12-15 2012-11-22 人胰岛素类似物及其酰化衍生物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2014006698A true MX2014006698A (es) 2014-07-09

Family

ID=48611849

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014006698A MX2014006698A (es) 2011-12-15 2012-11-22 Analogo de insulina humana y derivado acilado del mismo.

Country Status (15)

Country Link
US (1) US9458219B2 (es)
EP (1) EP2784085A4 (es)
JP (1) JP6153206B2 (es)
KR (1) KR20140104994A (es)
CN (2) CN104788556A (es)
AU (1) AU2012350586B2 (es)
BR (1) BR112014013483A2 (es)
CA (1) CA2858253A1 (es)
HK (1) HK1188795A1 (es)
IN (1) IN2014MN00933A (es)
MX (1) MX2014006698A (es)
RU (1) RU2014127270A (es)
TW (1) TW201323439A (es)
WO (1) WO2013086927A1 (es)
ZA (1) ZA201404417B (es)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2996455A1 (en) 2015-08-25 2017-03-02 Novo Nordisk A/S Novel insulin derivatives and the medical uses hereof
CN106496322A (zh) * 2015-09-07 2017-03-15 江苏恒瑞医药股份有限公司 人胰岛素或其类似物的酰化衍生物的制备方法
CN105491227A (zh) * 2015-11-20 2016-04-13 努比亚技术有限公司 一种消息排列方法和终端
EP3260548A1 (en) 2016-06-21 2017-12-27 Enzypep B.V. Enzymatic coupling of (oligo)peptides to the b-chain of an insulin receptor ligand
TWI747929B (zh) * 2016-08-02 2021-12-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 一種人胰島素或其類似物的醯化衍生物
CA3090199A1 (en) * 2018-02-01 2019-08-08 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising acylated derivative of human insulin analog and preparation method thereof
WO2019154311A1 (zh) * 2018-02-09 2019-08-15 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种密码子优化的人胰岛素类似物前体基因和信号肽基因
AU2019398579A1 (en) 2018-12-11 2021-07-29 Sanofi Peptide binder
CN111909255A (zh) * 2019-05-10 2020-11-10 宁波鲲鹏生物科技有限公司 胰岛素衍生物及其制备方法
MX2022006251A (es) 2019-12-11 2022-06-22 Novo Nordisk As Analogos de insulina novedosos y usos de estos.
KR20220121833A (ko) 2019-12-30 2022-09-01 간 앤 리 파마슈티칼스 컴퍼니, 리미티드 인슐린 유도체
CN113773398B (zh) * 2020-06-10 2023-05-23 宁波鲲鹏生物科技有限公司 一种德谷胰岛素衍生物及其应用
KR20240013778A (ko) * 2021-05-24 2024-01-30 선샤인 레이크 파르마 컴퍼니 리미티드 신규한 아실화된 인슐린 유사체
WO2022268208A1 (zh) 2021-06-25 2022-12-29 甘李药业股份有限公司 含酰化胰岛素的药物组合物

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5008241A (en) 1985-03-12 1991-04-16 Novo Nordisk A/S Novel insulin peptides
PH25772A (en) * 1985-08-30 1991-10-18 Novo Industri As Insulin analogues, process for their preparation
DK257988D0 (da) 1988-05-11 1988-05-11 Novo Industri As Nye peptider
ATE93238T1 (de) 1988-07-20 1993-09-15 Novo Nordisk As Menschliche insulinanalage und zubereitungen daraus.
HUT56857A (en) 1988-12-23 1991-10-28 Novo Nordisk As Human insulin analogues
WO1995007931A1 (en) * 1993-09-17 1995-03-23 Novo Nordisk A/S Acylated insulin
CN1195777A (zh) 1997-05-28 1998-10-14 姚维明 电力拖动实验仪
CN100432104C (zh) * 1999-12-29 2008-11-12 诺沃挪第克公司 用于生产胰岛素前体和胰岛素前体类似物的方法
US7060675B2 (en) * 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
US6770625B2 (en) * 2001-09-07 2004-08-03 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7193035B2 (en) 2002-10-29 2007-03-20 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Crystals of insulin analogs and processes for their preparation
CN1780854A (zh) 2003-04-29 2006-05-31 伊莱利利公司 具有延长时间作用的胰岛素类似物
ES2472421T3 (es) * 2003-08-05 2014-07-01 Novo Nordisk A/S Nuevos derivados de insulina
PL2107069T3 (pl) * 2003-08-05 2013-06-28 Novo Nordisk As Nowe pochodne insuliny
CN101721712A (zh) * 2008-10-21 2010-06-09 何明磊 一种双链聚乙二醇－胰岛素复合物及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP6153206B2 (ja) 2017-06-28
RU2014127270A (ru) 2016-02-10
EP2784085A4 (en) 2015-07-08
AU2012350586A1 (en) 2014-07-03
IN2014MN00933A (es) 2015-05-01
CN104788556A (zh) 2015-07-22
KR20140104994A (ko) 2014-08-29
TW201323439A (zh) 2013-06-16
US9458219B2 (en) 2016-10-04
AU2012350586B2 (en) 2017-02-02
CA2858253A1 (en) 2013-06-20
US20140329745A1 (en) 2014-11-06
CN103443122A (zh) 2013-12-11
JP2015501819A (ja) 2015-01-19
BR112014013483A2 (pt) 2019-09-24
HK1188795A1 (zh) 2014-05-16
ZA201404417B (en) 2016-07-27
CN103443122B (zh) 2016-05-11
EP2784085A1 (en) 2014-10-01
WO2013086927A1 (zh) 2013-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
MX2014006698A (es) Analogo de insulina humana y derivado acilado del mismo.
JP5695909B2 (ja) 極度に遅延した時間作用プロファイルを有する新規なインスリン誘導体
RU2529952C2 (ru) Новые производные инсулина с сильно замедленным профилем время/действие
US7229964B2 (en) Insulin derivatives
US20090069215A1 (en) Acylated Single Chain Insulin
US20090099065A1 (en) Acylated Single Chain Insulin
JP2662390B2 (ja) インシユリン類似体
CZ289343B6 (cs) Inzulinový derivát a farmaceutický prostředek pro léčení diabetes
NZ231936A (en) Insulin analogues with lys or arg in position b28, and pharmaceutical compositions
CA2468100A1 (en) Insulin molecule having protracted time action
TW200817432A (en) Amidated insulin glargine
WO2007104736A2 (en) Acylated single chain insulin
WO2007104734A1 (en) Acylated single chain insulin
WO2012122860A1 (zh) 人胰岛素及其类似物的偶联物
AU2017296354A1 (en) Fusion proteins with extended serum half life
JPH0273100A (ja) 医薬用化合物
WO2021147869A1 (zh) 利拉鲁肽衍生物及其制备方法
WO2020187270A1 (zh) 含有荧光蛋白片段的融合蛋白及其用途
CN113166222B (zh) 长效胰岛素类似物及其复合物
US4732972A (en) Polypeptides having growth hormone releasing activity
CN116789801B (zh) 新型胰岛素衍生物及其用途
KR102646845B1 (ko) 클로스트리파인을 이용한 지속형 인슐린 아날로그 복합체의 활성형 제조방법
CN114685642A (zh) 一种肠促胰岛素类似物药学上可接受盐及制备方法和用途
MXPA97007056A (es) Derivados de insulina