MXPA97007056A

MXPA97007056A - Derivados de insulina

Info

Publication number: MXPA97007056A
Application number: MXPA/A/1997/007056A
Authority: MX
Inventors: Jonassen Ib; Markussen Jan; Havelund Svend; Hertz Hansen Per; Kurtzhals Peter; Brandt Jakob; Christian Kaarsholm Niels
Original assignee: Brandt Jakob; Hertz Hansen Per; Havelund Svend; Jonassen Ib; Christian Kaarsholm Niels; Kurtzhals Peter; Markussen Jan; Novo Nordisk A/S
Priority date: 1995-03-17
Filing date: 1997-09-17
Publication date: 1998-07-03

Abstract

Se describen los derivados de insulina en los cuales un grupo lipofílico que tiene de 12 a 40átomos de carbono estáunido al grupo (alfa)-amino del aminoácido N-terminal en la cadena B o al grupo carboxilo del aminoácido C-terminal en la cadena B, que tiene un perfil prolongado de acción.

Description

DERIVADOS DE INSULINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los nuevos derivados de insulina humana, los cuales son solubles y tienen un perfil prolongado de acción, a un método para la provisión de tales derivados, a las composiciones farmacéuticas que los contienen, y al uso de tales derivados de insulina en el tratamiento de la diabetes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Muchos pacientes diabéticos son tratados con múltiples inyecciones diarias de insulina en un régimen que comprende una o dos inyecciones diarias de una insulina prolongada, para cubrir el requerimiento basal, suplementado por inyecciones de bolo de una insulina de acción rápida, para cubrir los requerimientos relacionados al alimento. Las composiciones prolongadas de insulina son bien conocidas en la técnica. De este modo, un tipo principal de composiciones de insulina prolongada comprende suspensiones acuosas inyectables de cristales de insulina o insulina amorfa. En estas composiciones, M?? x 15670 los compuestos de insulina utilizados son típicamente protamina-insulina, zinc-insulina o protamina-zinc-insulina . Están asociados ciertos inconvenientes con el uso de las suspensiones de insulina. De este modo, con el fin de asegurar una dosificación precisa, las partículas de insulina deben de ser suspendidas homogéneamente por agitación suave antes de que se retire un volumen definido de la suspensión de un frasco o sea expedido desde un cartucho. También, para el almacenamiento de las suspensiones de insulina, la temperatura debe de ser mantenida dentro de limites más estrechos que para las soluciones de insulina, con el fin de evitar la formación de grumos o la coagulación. Mientras que antes se creía que las protaminas eran no inmunogénicas, se ha constatado que las protaminas pueden ser inmunogénicas en el humano, y que su uso para fines médicos puede conducir a la formación de anticuerpos (Samuel y colaboradores, Studies on the immunogenicity of protamines in humans and experimental animáis by means of a micro-complement fixation test, Clin. Exp. Immunol. 33., pp . 252-260 (1978)). También, se ha encontrado evidencia de que el complejo protamina-insulina es por sí mismo inmunogénico (Kurtz y colaboradores, Circulating IgG antibody to protamine in patients treated with protamine-insulins . Diabetologica 25, pp . 322-324 (1983)). Por lo tanto, con algunos pacientes el uso de las composiciones de insulina prolongadas que contienen protaminas, debe de ser evitado. Otro tipo de composiciones de insulina prolongada son soluciones que tienen un valor de pH por debajo del pH fisiológico a partir del cual la insulina se precipitará, debido a la elevación en el valor del pH cuando la solución es inyectada. Un inconveniente es que las partículas sólidas de la insulina actúan como un irritante local provocando inflamación del tejido en el sitio de la inyección. La patente 091/12817 (Novo Nordisk A/S) describe las composiciones de insulina solubles, prolongadas, que comprenden complejos de insulina de cobalto III. La prolongación de estos complejos es únicamente intermedia y la biodisponibilidad es reducida. La insulina humana tiene tres grupos amino primarios: el grupo N-terminal de la cadena A y de la cadena B y el grupo e-amino de Lys829. Los diversos derivados de insulina que están sustituidos en uno o más de estos grupos, son conocidos en la técnica anterior. De este modo, la Patente Norteamericana No. 3,528,960 (Eli Lilly) se refiere a las N-carboxiaroilinsulinas en las cuales uno, dos o tres grupos amino primarios de la molécula de insulina tienen un grupo carboxiaroilo . No se describen específicamente insulinas sustituidas en NeB29. De acuerdo a la Patente Británica No. 1,492,997 (Nat. Res. Dev. Corp.), se ha encontrado que la insulina con una sustitución de carbamilo en NßB29 tiene un perfil mejorado de efecto hipoglucémico. La solicitud de Patente Japonesa abierta No. 1- 254699 (Kodama Co., Ltd.) describe la insulina, en donde un ácido graso está unido al grupo amino del PheB1 o al grupo e-amino de LysB29 o a estos dos. El propósito establecido de la derivatización es obtener una preparación de insulina estable, farmacológicamente aceptable. Las insulinas, las cuales en la posición B30 tienen un aminoácido que tiene al menos cinco átomos de carbono que no pueden ser necesariamente codificadas por un triplete de nucleótidos, son descritas en la solicitud de Patente Japonesa abierta No. 57-067548 (Shionogi). Los análogos de insulina son reclamados como útiles en el tratamiento de la diabetes mellitus, particularmente en pacientes quienes son resistentes a la insulina debido a la generación de anticuerpos contra insulina bovina o de cerdo. La Patente Norteamericana No. 5,359,030 (Ekwuribe, Protein Delivery, Inc.) describe las composiciones polipeptídicas estabilizadas por conjugación para la administración oral o parenteral, que comprenden un polipéptido covalentemente acoplado con un polímero que incluye una porción de polietileno lineal y una porción lipofílica, dichas porciones acomodadas están acomodadas tan relacionadas una con la otra que el polipéptido tiene una resistencia mejorada in vi vo contra la degradación enzimática. La Patente Europea EP-511600 A2 se refiere por ejemplo a los derivados de proteína de la fórmula [pr teína] [Z] n en donde [proteína] representa una proteína que tiene n residuos de aminoácidos, cada uno derivable de un grupo amino mediante eliminación de uno de sus átomos de hidrógeno, en vez de los grupos amina, [Z] es un residuo representado por la fórmula -CO-W-COOH en donde es un grupo hidrocarburo de cadena larga, divalente el cual puede también contener ciertos heteroátomos, y n representa un promedio del número de enlaces amida entre [Z] y [proteína] . Se menciona que los derivados de proteína de la invención tienen una vida media en suero extremadamente prolongada, en comparación con las proteínas a partir de las cuales éstas son derivadas, y que no muestran antigenicidad. Se menciona también, que la insulina es una de las proteínas a partir de la cual pueden ser fabricados derivados de acuerdo a la invención, pero no se describen derivados específicos de insulina en la Patente Europea EP 511600 ni "existe ninguna indicación de una [Z] preferida o (una) posición o posiciones preferidas en las cuales [Z] debiera ser introducida con el fin de obtener derivados de insulina útiles. En la presente especificación, siempre que se utilice el término insulina en un sentido plural o en un sentido genérico, se pretende abarcar las insulinas de origen natural y los análogos de insulina y derivados de las mismas. Por "derivados de insulina" como se utiliza en la presente, se entiende un polipéptido que tiene una estructura molecular similar a aquella de la insulina humana, incluyendo los enlaces disulfuro entre CysA7 y CysB7 y entre C?sA20 y C?sB19 y un enlace disulfuro interno entre C?sA6 y C?sA11, y las cuales tienen actividad de insulina . No obstante, existe todavía una necesidad para composiciones prolongadas de insulina inyectable las cuales sean soluciones y contengan insulinas que permanezcan en solución después de la inyección, y posean propiedades inflamatorias e inmunogénicas mínimas . Un objetivo de la presente invención es proporcionar los derivados de insulina humana, con un perfil prolongado de acción, las cuales sean solubles a los valores de pH fisiológicos. Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprenda los derivados de insulina humana de acuerdo a la invención. Un objetivo más de la presente invención es proporcionar un método para la elaboración de derivados de insulina humana de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Sorprendentemente, se ha constatado que ciertos derivados de insulina, en donde el grupo amino del aminoácido N-terminal de la cadena B tiene un sustituyente lipofílico que comprende de 12 a 40 átomos de carbono acoplado, o en donde el grupo ácido carboxílico del aminoácido C-terminal de la cadena B tiene un sustituyente lipofílico que comprende de 12 a 40 átomos de carbono, acoplado, tienen un perfil prolongado de acción y son solubles a los valores de pH fisiológicos . En consecuencia, en su aspecto más amplio, la presente invención se refiere a un derivado de insulina que tiene la siguiente secuencia: Cadena A Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser- 8 10 11 12 Cadena B Xaa-Xaa-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Cadena A (continuación; 20 Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (SEQ ID No. 1) 13 14 15 16 17 18 19 21 Cadena B (continuación) Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe- 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Cadena B (continuación) Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID No. 2) 25 26 27 28 29 30 en donde Xaa en la posición A21 es cualquier aminoácido codificable, excepto Lys, Arg y Cys; Xaa en las posiciones Bl, B2, B3, B26, B27, B28 y B29 son, independientemente uno del otro, cualquier aminoácido codificable excepto Cys, o está suprimido; Xaa en la posición B30 es cualquier aminoácido codificable, excepto Cys, un dipéptido que no comprende Cys o Arg, un tripéptido que no comprende Cys o Arg, un tetrapéptido que no comprende Cys o Arg, o está suprimido; y cualquier grupo amino del aminoácido N-terminal de la cadena B tiene un grupo lipofílico, , acoplado a éste, cuyo grupo tiene de 12 a 40 átomos de carbono, y contiene opcionalmente un grupo que puede estar negativamente cargado o el grupo carboxilo del aminoácido C-terminal de la cadena B tiene un grupo lipofílico Z, acoplado a éste, cuyo grupo tiene de 12 a 40 átomos de carbono, y contiene opcionalmente un grupo que puede estar negativamente cargado, con la condición de que si uno o más de los aminoácidos en la posición Bl, B2 y B3 es (están) suprimidos, entonces el número de aminoácidos N-terminales se encuentra mediante el conteo hacia abajo desde CysB7, a la cual se le asigna siempre el número 7 y que a) cuando B1-B2-B3 es Phe-Val-Asn y A21 es Asn y B26-B27-B28-B29-B30 es Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr o Tyr-Thr-Pro- Lys-Ala, entonces W o Z contiene siempre un grupo que puede estar negativamente cargado; y b) cuando B29 y B30 están suprimidos, y un grupo Z como se define anteriormente está presente en el aminoácido C-terminal de la cadena B y no está suprimido ni Bl, B2 ni B3, entonces B1-B2 es diferente de Phe-Val o B26-B27-B28 es diferente de Tyr-Thr-Pro o B1-B2 y B26-B28 son diferentes de dichas secuencias; y c) cuando B29 y B30 están suprimidos, y un grupo Z como se define anteriormente está presente en el aminoácido C-terminal de la cadena B, y uno de Bl, B2 o B3 está suprimido, entonces el aminoácido N-terminal de la cadena B es diferente de Val o la secuencia B26-B27-B28 es diferente de Tyr-Thr-Pro, o el aminoácido N-terminal de la cadena B y la secuencia B26-B27-B28 son diferentes de Val y Tyr-Thr-Pro respectivamente. En una modalidad "preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina que tiene las siguientes secuencias: Cadena A S S j 7 1 Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser- 8 10 11 12 Cadena B Xaa-Xaa-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Cadena A (continuación] 20 Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (SEQ ID No. 1! 13 14 15 16 17 18 19 21 Cadena B (continuación) Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe- 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Cadena B (continuación) Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa iSEQ ID No. 2) 25 26 27 28 29 30 en donde Xaa en la posición A21 es cualquier aminoácido codificable, excepto Lys, Arg y Cys; Xaa en las posiciones Bl, B2, B3, B26, B27, B28, B29 y B30 son, independientemente uno del otro, cualquier aminoácido codificable excepto Cys, o está suprimido; y cualquier grupo amino del aminoácido N-terminal de la cadena B tiene un grupo lipofílico, , acoplado a éste, cuyo grupo tiene de 12 a 40 átomos de carbono y contiene opcionalmente un grupo que puede estar negativamente cargado o el grupo carboxilo del aminoácido C-terminal de la cadena B tiene un grupo lipofílico, Z, acoplado a éste, cuyo grupo tiene de 12 a 40 átomos de carbono y contiene opcionalmente un grupo que puede estar negativamente cargado, con la condición de que si uno o más de los aminoácidos en la posición Bl, B2, y B3 está (están) suprimidos., entonces el número del aminoácido N-terminal se encuentra mediante el conteo hacia abajo desde CysB7-, el cual es siempre asignado con el número 7 y que a) cuando B1-B2-B3 es Phe-Val-Asn y A21 es Asn y B26-B27-B28-B29-B30 es Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr o Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala, entonces o Z contiene siempre un grupo que puede estar negativamente cargado.; y b) cuando B29 y B30 están suprimidos, y un grupo Z como se define anteriormente está presente en el aminoácido C-terminal de la cadena B y no está suprimido ni Bl, B2 ni B3, entonces B1-B2 es diferente de Phe-Val o B26-B27-B28 es diferente de Tyr-Thr-Pro o B1-B2 y B26-B28 son diferentes de dichas secuencias; y c) cuando B29 y B30 están suprimidos, y un grupo Z como se define anteriormente está presente en el aminoácido C-terminal de la cadena B, . y uno de Bl, B2 o B3 está suprimido, entonces el aminoácido N-terminal de la cadena B es diferente de Val o la secuencia B26-B27-B28 » es diferente de Tyr-Thr-Pro, o el aminoácido N-terminal de la cadena B y la secuencia B26-B27-B28 son diferentes de Val y Tyr-Thr-Pro respectivamente. Cuando un grupo lipofílico, W, está acoplado al grupo a-amino del aminoácido N-terminal de la cadena B, entonces el enlace entre el grupo a-amino y es preferentemente un enlace amida en el cual el grupo amino N-terminal de la cadena B constituye la porción amino y un grupo contenido en W constituye la porción carboxilo. Cuando un grupo lipofílico, Z, está unido al grupo carboxilo del aminoácido C-terminal de la cadena B, entonces el enlace entre el grupo carboxilo y Z es preferentemente un enlace amida en el cual el grupo carboxilo C-terminal constituye la porción carboxilo, y un grupo amino contenido en Z constituye la porción amino. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a un derivado de insulina como se describe anteriormente, en donde un grupo lipofílico W está unido al grupo a-amino del aminoácido N-terminal de la cadena B. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a un derivado de insulina como se describe anteriormente, en donde un grupo lipofílico, Z, está acoplado al grupo carboxilo del aminoácido C-terminal de la cadena B. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a un derivado de insulina en donde el aminoácido en la posición A21 se selecciona del grupo que consiste de Ala, Asn, Gln, Glu, Gly y Ser. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde el aminoácido en la posición Bl es Phe. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a cualquier derivado de insulina en donde el aminoácido en la posición Bl está suprimido. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde el aminoácido en la posición B2 -se selecciona del grupo que comprende Ala y Val. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde el aminoácido en la posición B3 se selecciona del grupo que comprende Asn, Gln, Glu y Thr. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde el aminoácido en la posición B26 es Tyr. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde el aminoácidos B27 es Thr. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde el aminoácido en la posición B28 es Pro.

En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde el aminoácido en la posición B29 es Lys o Thr. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde el aminoácido en la posición B28 es Lys y el aminoácido en la posición B29 es Pro. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde el aminoácido en la posición B30 es Thr o Lys e-acilado. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde Xaa en la posición 30 en la SEQ ID No. 2 designa el dipéptido Thr-Lys. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde Xaa en la posición 30 en la SEQ ID No. 2 designa el dipéptido Gly-Lys. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde Xaa en la posición 30 en la SEQ ID No. 2 designa el tripéptido Glu-Ser-Lys. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde Xaa en la posición 30 en la SEQ ID No. 2 designa el tripéptido Thr-Gly-Lys. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde Xaa en la posición 30 en la SEQ ID No. 2 designa el tetrapéptido Thr-Gly-Gly-Lys . En otra modalidad " preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde Xaa en la posición 30 en la SEQ ID No. 2 designa el tetrapéptido Thr-Glu-Gly-Lys . En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde Xaa en la posición 30 en la SEQ ID No. 2 designa el tetrapéptido Gly-Asp-Thr-Lys . En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde el aminoácido C-terminal de la cadena B es Lys e-acilada y el aminoácido junto al aminoácido C-terminal es Gly. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde » la insulina progenitora es una des (B30) -insulina. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde la insulina progenitora es una des (B30) -insulina humana.

En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde la insulina progenitora es una des (B28-B30) -insulina. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde la insulina progenitora es una des (B27-B30) -insulina. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde la insulina progenitora es una des (B26-B30) -insulina. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina en donde el aminoácido en la posición B28 es Pro y el aminoácido en la posición B29 es Thr. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina el cual tiene un grupo, , como se mencionó anteriormente, unido al grupo a-amino N-terminal de su cadena B, siendo un grupo de la fórmula general CH3 (CH2) nCH (COOH) NH-CO(CH2)2CO- en donde n es un número entero de 9 a 15. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina el cual tiene un grupo, W, como se mencionó anteriormente, unido al grupo a-amino N-terminal de su cadena B, siendo W un grupo de la fórmula general CH3(CH2)rCO- NHCH (COOH) (CH2)2CO- en donde R es un número entero de 9 a 15. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un derivado de insulina el cual tiene un grupo, , como se mencionó anteriormente, unido al grupo a-amino N-terminal de su cadena B, siendo un grupo de la fórmula general CH3(CH2)sCO-NHCH ( (CH2) 2COOH) CO- en donde s es un número entero de 9 a 15. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a un derivado de insulina el cual tiene un grupo, Z, como se mencionó anteriormente, unido al aminoácido C-terminal de su cadena B, en donde Z es un grupo de la fórmula general -NHCH (COOH) (CH2) 4NH-CO(CH2)mCH3 en donde m es un número entero de 8 a 18, es decir, Z es un residuo de usina Ne-acilada. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a un derivado de insulina el cual tiene un grupo, Z, como se mencionó anteriormente, unido al aminoácido C-terminal de su cadena B, en donde Z es un grupo de la fórmula general -NHCH (COOH) (CH2)4NH-COCH( (CH2) 2COOH) NH-CO (CH2) PCH3 en donde p es un número entero de 10 a 16. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a un derivado de insulina el cual tiene un grupo, Z, como se mencionó anteriormente, unido al aminoácido C-terminal de su cadena B, en donde Z es un grupo de la fórmula general -NHCH (COOH) (CH2) 4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2) qCH3 en donde q es un número entero de 10 a 16. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a un derivado de insulina el cual tiene un grupo, Z, como se mencionó anteriormente, el cual comprende un esqueleto de ciclopentanofenantreno parcial o completamente hidrogenado. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a un derivado de insulina el cual tiene un grupo Z, como se mencionó anteriormente, el cual es un aminoácido acilado, en particular lisina acilada. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a insulina humana ThrB29 con un grupo Z, como se describió anteriormente, unido al aminoácido C-terminal de su cadena B. • En otra modalidad preferida, la invención se refiere a la des (B28-B30) -insulina humana con un grupo Z como se describe anteriormente unido al aminoácido C-terminal de su cadena B. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a la des (B27-B30) -insulina humana con un grupo Z como se describe anteriormente unido al aminoácido C-terminal de su cadena B. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a la des (B26-B30) -insulina humana con un grupo Z como se describe anteriormente unido al aminoácido C-terminal de su cadena B. En otra modalidad preferida, la invención se refiere al uso de un derivado de insulina de acuerdo a la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes en un paciente en necesidad de tal tratamiento, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un derivado de insulina de acuerdo a la invención, junto con un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes en un paciente en necesidad de tal tratamiento, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un derivado de insulina de acuerdo a la invención en mezcla con una insulina o análogo de insulina el cual tiene un inicio rápido de acción, junto con un portador farmacéuticamente aceptable . En otra modalidad preferida, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un derivado de insulina de acuerdo a la invención, el cual es soluble a valores de pH fisiológicos. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un derivado de insulina de acuerdo a la invención, el cual es soluble a valores de pH en el intervalo de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8.5. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a una composición farmacéutica prolongada que comprende un derivado de insulina de acuerdo a la invención. En otra modalidad preferida la invención se refiere a una composición farmacéutica la cual es una solución que comprende desde aproximadamente 120 nanomol/ml hasta aproximadamente 1200 nanomol/ml, preferentemente aproximadamente 600 nanomol/ml de un derivado de insulina de acuerdo a la invención. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a un método para el tratamiento de la diabetes en un paciente en necesidad de tal tratamiento, que comprende el administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un derivado de insulina de acuerdo a esta invención, junto con un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad preferida, la invención se refiere a un método para el tratamiento de la diabetes en un paciente en necesidad de tal tratamiento, que comprende el administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un derivado de insulina de acuerdo a esta invención, en mezcla con una insulina o un análogo de insulina el cual tiene un inicio rápido de acción, junto con un portador farmacéuticamente aceptable . Los ejemplos de derivados de insulina preferidos de acuerdo a la presente invención son los siguientes: (NeB30-tetradecanoil) -Thr329, LysB30-insulina humana, (NeB28-tetradecanoil) -Lys828 des(B29-B30) insulina humana, (NeB27-tetradecanoil) -Lys827 des(B28-B30) insulina humana y (NeB26-tetradecanoil) -Lys826 des(B27-B30) insulina humana. (NeB32-tetradecanoil) -Glu830, Ser831, LysB32-insulina humana, (N8B29-acetil,NßB32-tetradecanoil)-GluB30,SerB31,Lys832-insulina humana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención es además ilustrada con referencia a los dibujos anexos en donde: La Figura 1 muestra la construcción de los plásmidos pKV153, pKV159, pJB173, pJB174 y pJB175; La Figura 2a la cual es continuada en la Figura 2b, muestra la secuencia de pMT742, la posición 907 a la 1500, y los oligonucleótidos números #94, #593, #2371 y #3075 utilizados para PCR1A, PCR1B y PCR1C del Ejemplo 1. La secuencia de 138 aminoácidos correspondiente a la guía prepro MF alfa (aminoácidos Nos. 1-85) y un precursor de insulina, el cual tiene una secuencia de aminoácidos B ( 1-29) ÁlaAlaLysA( 1-21) en donde A(l-21) es la cadena A de la insulina humana y B(l-29) es la cadena B de la insulina humana, en la cual falta Thr(B30), se muestra abajo de la secuencia de codificación (aminoácidos Nos. 86-138).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Terminología Los códigos de tres letras y los códigos de una letra para los residuos de aminoácidos utilizados en la presente, son aquellos establecidos en J. Biol. Chem. 243, p. 3558 (1968) . En las secuencias de ADN, A es adenina, C es citosina, G es guanina, y T es timina. Se utilizan los siguientes acrónimos: DMSO para sulfóxido de dimetilo, DMF para dimetilformamida, Boc para ter-butoxicarbonilo, NMP para l-metil-2-pirrolidona, TFA para ácido trifluoroacético, X-OSu para un éster de N-hidroxisuccinimida, X para un grupo acilo, RP-HPLC para la cromatografía líquida de alta resolución, de fase inversa.

Preparación de los derivados lipofílicos de insulina Los derivados de insulina de acuerdo a la presente invención pueden ser preparados por ejemplo como se describe en lo siguiente: 1. Derivados de insulina que caracterizan en la posición B30 un residuo de aminoácido que puede ser codificado por el código genético, por ejemplo treonina (insulina humana) o alanina (insulina porcina) . 1.1 Insulinas modificadas mediante acoplamiento de un grupo lipofílico, W, al grupo amino N-terminal, comenzando a partir de la insulina humana.

La insulina humana es tratada con un reactivo Boc (por ejemplo, dicarbonato de di-ter-butilo) para formar (Al, B29) -diBoc-insulina humana, por ejemplo insulina humana en la cual el extremo N-terminal de la cadena A y el grupo e-amino de Lys829 están protegidos por un grupo Boc. Después de una purificación opcional, por ejemplo mediante HPLC, se introduce un grupo acilo en el grupo a-amino de Phe81 al permitir que el producto reaccione con un éster de N-hidroxisuccinimida de la fórmula -OSu en donde W es un grupo acilo como se define anteriormente, para ser introducido en el grupo a-amino N-terminal de la cadena B. En el paso final, se utiliza TFA para eliminar los grupos Boc y el producto, NaB1-W-insulina humana, es aislado. 2. Derivados de insulina sin residuos de aminoácidos en la posición B30, por ejemplo Tas des (B30) -insulinas . 2.1 Inicio a partir de la insulina humana o insulina porcina.

En el tratamiento con la carboxipeptidasa A en amortiguador de amonio, la insulina humana y la insulina porcina producen ambas des (B30) -insulina. Después de una purificación opcional, la des (B30) -insulina es tratada con un reactivo Boc (por ejemplo dicarbonato de di-ter-butilo) para formar la (Al, B29) -diBoc-des (B30) -insulina. Después de una purificación opcional, por ejemplo mediante HPLC, se introduce un grupo acilo en el grupo a-amino del aminoácido en la posición Bl, al permitir que el producto reaccione con un éster de N-hidroxisuccinimida de la fórmula W-OSu en donde W es el grupo acilo a ser introducido. En el paso final, se utiliza TFA para retirar los grupos Boc y se aisla el producto (Na8:- ) -des (B30) -insulina . 2.2 Inicio de un precursor de insulina humana de cadena simple .

Un precursor de insulina humana de cadena simple, el cual está extendido en la posición Bl con una extensión (Ext) la cual está conectada a Bl vía un residuo de arginina y el cual tiene un puente desde una lisina C-terminal en la posición B26, B27, B28 o B30 a Al, puede ser utilizado como material inicial. Preferentemente, el puente o enlace es un péptido de la fórmula Yn-Arg donde Y es un aminoácido codificable excepto cisteína, lisina y arginina, y n es cero o un número entero entre 1 y 35. Cuando n>l, las Y' s pueden designar diferentes aminoácidos. Los ejemplos preferidos del enlace desde Lys en la posición B26, B27, B28 o B30 hacia Al son: AlaAlaArg, SerArg, SerAspAspAlaArg y Arg (Patente Europea No. 163529). El tratamiento de tal precursor de la fórmula general Ext-Arg-B (1-Q) -Yn-Arg-A ( 1-21 ) , en donde Q es 26, 27, 28 o 30, con una lisil-endopeptidasa, por ejemplo proteasa de Achromobacter lyti cus, produce Ext-Arg-B (1-Q) -Yn-Arg-A(l-21 ) -insulina . La acilación de este intermediario con un éster de N-hidroxisuccinimida de la fórmula general X-OSu en donde X es un grupo acilo, introduce el grupo acilo X en el grupo e-amino de la Lys8Q, y en el grupo amino N-terminal de la cadena A y de la cadena B para dar (NeBQ-X) X-Ext-Arg-B ( 1-Q) -X-Yn-Arg-A( 1-21) -insulina. Este intermediario en el tratamiento con tripsina en mezcla con agua y un solvente orgánico apropiado, por ejemplo, DMF, DMSO o un alcohol inferior, da el derivado deseado, Z-insulina humana en donde Z es LyseBQ-X.

Composiciones farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas que contienen un derivado de insulina humana de acuerdo a la presente invención, pueden ser administradas parenteralmente a pacientes en necesidad de tal tratamiento. La administración parenteral puede ser realizada mediante inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa similar a un bolígrafo o pluma. Alternativamente, la administración parenteral puede ser realizada por una bomba de infusión. Una opción adicional es una composición que puede ser un polvo o un líquido para la administración del derivado de insulina humana en la forma de un rocío nasal.

Las composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de la presente invención pueden ser preparadas mediante técnicas convencionales, por ejemplo, como se describe en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 1985. De este modo, las composiciones inyectables de insulina humana de la invención pueden ser preparadas utilizando las técnicas convencionales de la industria farmacéutica, las cuales involucran la disolución y el mezclado de los ingredientes como sea apropiado para dar el producto final deseado. De este modo, de acuerdo a un procedimiento, el derivado de insulina humana se disuelve en una cantidad de agua que es algo menor que el volumen final de la composición a ser preparada. Se agrega un agente isotónico, un conservador y un amortiguador, como se requiera, y el valor de pH de la solución se ajusta -si es necesario- utilizando un ácido, por ejemplo, ácido clorhídrico, o una base, por ejemplo hidróxido de sodio acuoso, como se necesite. Finalmente, el volumen de la solución es ajustado con agua para dar la concentración deseada de los ingredientes. Los ejemplos de agentes isotónicos son cloruro de sodio, manitol y glicerol.

Los ejemplos de conservadores son fenol, m-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo y alcohol bencílico. Los ejemplos de amortiguadores apropiados son acetato de sodio y fosfato de sodio. Las composiciones farmacéuticas preferidas de las insulinas particulares de la presente invención, son complejos hexaméricos en solución. Típicamente, los complejos hexaméricos son estabilizados por dos o más iones zinc y tres o más moléculas de un compuesto fenólico como fenol o meta-cresol o mezclas de los mismos por hexámero. En una modalidad particular, se proporciona una composición la cual contiene dos diferentes insulinas, una que tiene un perfil prolongado de acción y una que tiene un inicio rápido de acción, en la forma de complejos hexaméricos solubles. Típicamente, los complejos hexaméricos son estabilizados por dos o más iones zinc y tres o más moléculas de un compuesto fenólico como el fenol o el meta-cresol, o mezclas de los mismos, por hexámero. Los complejos son mezclas de hexámeros de las insulinas particulares y hexámeros mixtos en los cuales la proporción entre las dos diferentes insulinas es de 1:5 a 5:1. Una composición para la administración nasal de un derivado de insulina de acuerdo a la presente invención puede ser preparado, por ejemplo, como se describe en la Patente Europea No. 272097 (a Novo Nordisk A/S) . Las composiciones de insulina de esta invención pueden ser utilizadas en el tratamiento de la diabetes. El nivel de dosis óptimo para cualquier paciente dependerá de una variedad d~e factores incluyendo la eficacia del derivado específico de insulina humana empleado, de la edad, del peso corporal, de la actividad física, y de la dieta del paciente, de la posible combinación con otros fármacos, y de la severidad del caso de diabetes. Se recomienda que la dosis diaria del derivado de insulina humana de esta invención, sea determinada para cada paciente individual por aquellos expertos en la técnica, de una manera similar como para las composiciones de insulina conocidas. Donde sea necesario, los derivados de insulina humana de esta invención pueden ser utilizados en mezcla con otros tipos de insulina, por ejemplo insulina humana, o insulina porcina o análogos de insulina con un inicio más rápido de acción. Los ejemplos de tales análogos de insulina se describen por ejemplo en las solicitudes de Patente Europea que tienen los números de publicación EP-214826 (Novo Nordisk A/S), EP 375437 (Novo Nordisk A/S) y EP 383472 (Eli Lilly & Co . ) .

La presente invención es además ilustrada por los siguientes ejemplos los cuales, no obstante, no deben de ser considerados como limitantes del alcance de la protección. Las características descritas en la descripción anterior y en los ejemplos siguientes pueden, ya sea separadamente y en cualquier combinación de los mismos, ser material para la realización de la invención en diversas formas de la misma.

EJEMPLOS Plásmidos y material de ADN Todos los plásmidos de expresión son del tipo cPOT. Tales plásmidos se describen en la „olicitud de patente No. 171,142 y están caracterizados por contener el gen de la triosa-fosfato-isomerasa de Schi zosaccharomyces pombe (POT) para fines de selección y estabilización de plásmidos. Un plásmido que contiene el gen POT es disponible de una cepa de E. coli depositada (ATCC 39685) . Los plásmidos contienen además el promotor y el terminador de la triosa-fosfato-isomerasa de S . cerevi si ae (PTP? y TTPI) . Éstos son idénticos a pMT742 (Egel-Mitani, M y colaboradores, Gene 73 (1988) 113-120) (ver Figura 1) excepto para la región definida por los sitios de restricción EcoRI-Xbal que abarcan la región de codificación para el guía/producto prepro MF alfa. El fragmento EcoRI/Xbal de pMT742 mismo codifica para la secuencia guía prepro alfa del Factor de Acoplamiento (MF) de Saccharomyces cerevi si ae seguido por el precursor de insulina MI3, el cual tiene un puente Ala-Ala-Lys que conecta B29 y Al (por ejemplo B (l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) ) (ver Figura 2). Los fragmentos de ADN sintético fueron sintetizados en un sintetizador automático de ADN (Applied Biosystems modelo 380A) utilizando la química de la fosfora idita y reactivos comercialmente disponibles (Beaucage, S.L. and Caruthers, M.H., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859-1869) . Todos los otros métodos y materiales utilizados son comunes en el estado del conocimiento de la técnica (ver, por ejemplo Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989) .

Analítico Las masas moleculares de los precursores de insulina preparados se obtuvieron mediante espectroscopia de masa (MS) , ya sea mediante espectrometría de masa de desorción de plasma (PDMS) utilizando un instrumento Bio-Ion 20 (Bio-Ion Nordic AB, Uppsala, Suecia) o espectrometría de masa por electrorrocío (ESMS) utilizando un Analizador de Masa Biomolecular API III (Perkin Elmer Sciex Instruments, Thornhill, Canadá) . La lipofilicidad de un derivado de insulina relacionado a la insulina humana, k'rß?, fue medido sobre una columna de HPLC LiChrosorb® RP18 (de 5 µm, 250 x 4 mm) mediante elución isocrática a 40°C utilizando mezclas de A) amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M, pH 7.3, que contenía 10% de acetonitrilo, y B) 50% de acetonitrilo en agua. La elución se verificó periódicamente mediante la absorción del eluido a 214 nm. El tiempo cero, to, se encontró mediante la inyección de nitrato de sodio 0.1 mM. El tiempo de retención para la insulina humana, thUana, se ajustó al menos a 2t mediante la variación de la proporción entre las soluciones A y B. K' re? es definido como (tderiado- t o ) / ( t hu ana - to ) • Como una medida de la prolongación de los compuestos de la invención, se estudió la velocidad de despejo en cerdos y se determinó el T50%. T50% es el tiempo cuando el 50% del análogo A14 marcado con Tyr(125I) ha desaparecido del sitio de inyección, como se mide con un contador ? externo (Ribel, U y colaboradores, The Pig as a Model for Subcutaneous Absorption in Man. En: M. Serrano-Rios and P.J. Lefebre (Eds): Diabetes 1985; 'Procedimientos del 12° Congreso de la Federación Internacional de Diabetes, Madrid, España, 1985 (Excerpta Medica, Amsterdam, (1986) 891-96) .

EJEMPLO 1 Síntesis del precursor Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu- Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-29) -Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21 ) -insulina a partir de la levadura cepa yKV153 utilizando la guía prepro MF alfa de S. cerevisiae.

Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos : #593 5' -CCAAGTACAAAGCTTCAACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAA CGAATCTTGTAGCCTTTGGTTCAGCTTCAGCTTCAGCTTCTTCTCTTTTAT CCAAAGAAACACC-3' #9 5 ' - T AAA C AT AAC T AC AAAAAAC ACATA- 3 ' #3075 5 ' -TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTAC ACTCCTAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTG-3' #2371 5' -TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3' Se realizaron las siguientes dos Reacciones en Cadena de Polimerasa (PCR) utilizando un equipo de reactivos para PCR Gene Amp (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT, EUA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante (ver Figura 2).

PCR1A: 0.2 µl de la plantilla plasmídica pMT742 4.0 µl del oligonucleótido #593 (100 pmol) 4.0 µl del oligonucleótido #94 (100 pmol) 10.0 µl de amortiguador de PCR lOx 10.0 µl de dNTP 2.5 mM 0.5 µl de la enzima Taq-polimerasa 71.3 µl de agua PCR1B: 0.2 µl de la plantilla plasmídica pMT742 4.0 µl del oligonucleótido #3075 (100 pmol) 4.0 µl del oligonucleótido #2371 (100 pmol) 10.0 µl de amortiguador de PCR lOx 10.0 µl de dNTP 2.5 mM 0.5 µl de la enzima Taq-polimerasa 71.3 µl de agua En ambos casos, se realizaron dos ciclos a 94°C por 1 minuto, 45°C por 1 minuto, y 72°C por 1 minuto, y subsecuentemente seguido por 11 ciclos: 94°C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto. Se cargaron 20 µl de cada mezcla de PCR sobre un gel de agarosa al 2% y se sujetaron a electroforesis utilizando técnicas estándares (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989) . Los fragmentos de ADN resultantes (de 452 pares de bases provenientes de PCR1A y 170 pares de bases provenientes de PCR1B) se cortaron del gel de agarosa y se aislaron utilizando el equipo Gene Clean (BiolOl Inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA, EUA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los fragmentos purificados de ADN se disolvieron en 100 µl de agua.

Se realizó la siguiente PCR PCR1C: 1.0 µl de fragmento de ADN proveniente de PCR1A 1.0 µl de fragmento de ADN proveniente de PCR1B 10.0 µl de amortiguador de PCR lOx 10.0 µl de dNTP 2.5 Mm 0.5 µl de la enzima Taq-polimerasa 69.5 µl de agua Se realizaron dos ciclos a 94°C por 1 minuto, 45°C por 1 minuto y 72°C por 1 minuto. Subsecuentemente se agregaron 4 µl del oligonucleótido #94 (100 pmol) y 4.0 µl del oligonucleótido #2371 (100 pmol) y se realizaron 15 ciclos a 94°C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto y 72°C por 1 minuto. La mezcla de PCR se cargó sobre un gel de agarosa al 1% y el fragmento resultante de 594 pares de bases se purificó utilizando el equipo Gene Clean como se describe. El fragmento de ADN de PCR purificado se disolvió en 20 µl de agua y en amortiguador de endonucleasa de restricción, y se cortó con las endonucleasas de restricción EcoRI y Xbal (New England * Biolabs, Inc. MA, EUA) . El fragmento de restricción resultante de 550 pares de bases EcoRI/Xbal fue corrido sobre gel de agarosa y aislado y purificado utilizando el equipo Gene Clean.

En dos digestiones de endonucleasa de restricción separadas el plásmido pMT742 fue cortado con i) las endonucleasas de restricción Apal y Xbal y ii) con las endonucleasas de restricción Apal y EcoRI . A partir de estas digestiones se aisló el fragmento de restricción Apal/Xbal de 8.6 kb y el fragmento de restricción Apal/EcoRI de 2.1 kb. Los tres fragmentos (por ejemplo, el fragmento de restricción EcoRI/Xbal de 550 pares de bases proveniente de PCRIC y el fragmento de restricción Apal/Xbal de 8.6 kb y el fragmento de restricción Apal/EcoRI de 2.1 kb proveniente de pMT742) se ligaron conjuntamente usando una ADN-ligasa T4 " y condiciones estándares (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989) (ver Figura 1). La mezcla de ligadura se transformó en células E. coli competentes (Apr~) seguido por selección para la resistencia a la ampicilina. Los plásmidos se aislaron de las colonias de E. coli resultantes utilizando la técnica miniprep de ADN estándar (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989) y se verificaron con endonucleasas de restricción apropiadas (por ejemplo, EcoRI, Apal y Xbal). El plásmido seleccionado, designado pKV153 fue mostrado por análisis de secuenciamiento de ADN (utilizando el equipo Sequenase de U.S. Biochemical Corp. De acuerdo a las recomendaciones del fabricante) para contener la secuencia correcta que codifica para el precursor guía prepro MF alfa/Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-29) -Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) -insulina. pKV153 se transformó en la cepa MT663 de S . cerevi si ae y se seleccionó para el crecimiento sobre glucosa como se describe en la solicitud de Patente Europea que tiene el No. de publicación 214826. La cepa de levadura resultante fue designada yKV153 y fue verificada para producir el precursor Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-29) -Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) -insulina en el medio de cultivo mediante HPLC y espectroscopia de masa.

EJEMPLO 2 Síntes *i s de Lys830 (Nß-tetradecanoi l ) -Thr829-insulina humana. 2a. Síntesis del precursor de Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B ( 1-28) -Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) -insulina a partir de la cepa de levadura yKV159, utilizando la guía prepro MF alfa de S . cerevi siae. Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos : #3881 5' -TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTAC ACTCCTACCAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTGTCG-3' #2371 5' -TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3' Se realizó Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) utilizando el equipo de reactivos de PCR Gene Amp como se describe anteriormente.

PCR2: 0.2 µl de la plantilla plasmídica pKV153 (del Ejemplo 1) 4.0 µl del oligonucleótido #3881 (100 pmol) 4.0 µl del oligonucleótido #2371 (100 pmol) 10.0 µl de amortiguador de PCR lOx 10.0 µl de dNTP 2.5 Mm 0.5 µl de la enzima Taq-polimerasa 71.3 µl de agua Los dos ciclos se realizaron a 94°C por 1 minuto, 45°C por 1 minuto y 72°C por 1 minuto y subsecuentemente seguido por 11 ciclos a 94°C por 1 minuto, 55°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto. La mezcla de PCR se cargó sobre un gel de agarosa al 2% y el fragmento resultante de 174 pares de bases fue purificado utilizando el equipo Gene Clean como se describe. El fragmento de ADN purificado por PCR se disolvió en 20 µl de agua y en amortiguador de endonucleasa de restricción, y se cortó con las endonucleasas de restricción HindIII y Xbal. El fragmento de restricción resultante HindIII/Xbal de 153 pares de bases fue corrido sobre gel de agarosa y aislado y purificado utilizando el equipo Gene Clean. En dos digestiones con endonucleasa de restricción separadas, se cortó pMT742 con las endonucleasas de restricción Apal y Xbal mientras que pKV153 (del Ejemplo 1) se cortó con las endonucleasas de restricción Apal y EcoRI . A partir de estas digestiones se aisló el fragmento de restricción Apal/Xbal de 8.6 kb a partir de pMT742 y el fragmento de restricción Apal/EcoRI de 2.1 kb a partir de pKV153. Los tres fragmentos (por ejemplo, el fragmento de restricción EcoRI/Xbal de 550 pares de bases proveniente de PCR2 y el fragmento de restricción Apal/Xbal de 8.6 kb proveniente de pMT748 y el fragmento de restricción Apal/EcoRI de 2.1 kb proveniente de pKV153) se ligaron conjuntamente utilizando la ADN-ligasa T4 como se describe anteriormente (ver Figura 1). La mezcla de ligadura se transformó en células E. coli competentes (Apr") seguido por la selección para la resistencia a la ampicilina. Los plásmidos se aislaron a partir de las colonias de E. coli resultantes y se verificaron para las endonucleasas de restricción apropiadas (por ejemplo, HindIII, Apal y Xbal) como se describe . Mediante análisis de secuenciamiento de ADN se mostró que el plásmido seleccionado, designado pKV159, contenía la secuencia correcta que codifica para el precursor guía prepro MF alfa/Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-28) -Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) -insulina. pKV159 fue transformado dentro de la cepa MT663 de S. cerevisiae y se seleccionó para el crecimiento sobre glucosa, como se describe. La cepa de levadura resultante fue designada yKV159 y se verificó que produce el precursor Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-28) -Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) -insulina en el medio de cultivo mediante HPLC y espectroscopia de masa. 2b. Aislamiento del precursor Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-28) -Thr-Lys-Ser-Asp-Asp- Ala-Arg-A(l-21) -insulina.

La cepa yKV159 fue fermentada por 72 horas y se recolectaron cinco litros de caldo. Las células de levadura se eliminaron mediante centrifugación, el valor de pH se ajustó a 3.0 utilizando ácido sulfúrico y el precursor de insulina se concentró sobre una columna Pharmacia Strealine® 50 empacada con 300 mi de intercambiador iónico Streamline® SP. Después del lavado con amortiguador de citrato 25 mM, valor pH 3.6, el precursor fue eluido por NH3 0.5 M y se recolectó la fracción desde 300 hasta 600 mi. El valor de pH se ajustó a 2.5 y el precursor fue purificado mediante RP-HPLC utilizando sílice esférica C18 de 15 µ de tamaño de poro de 100 Á y sulfato de sodio 0.2 M, ácido fosfórico 0.04 M como amortiguador, y utilizando un gradiente desde 23 hasta 33% de acetonitrilo. El precursor eluyó aproximadamente a 27-28% de acetonitrilo. El combinado que contenía el pico mayor central del precursor fue desalado mediante filtración en gel sobre Sephadex® G-50 F en ácido acético 0.5 M, y el precursor se aisló mediante liofilización. Rendimiento: 486 mg. 2c. Síntesis de Ala-Thr-Arg-B ( 1-28 ) -Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21 ) -insulina.

El precursor de cadena simple de 486 mg obtenido como se describe anteriormente, se disolvió en 30 mi de amortiguador de glutamato 0.05 M a pH 9.0, y se agregaron 3 mi del gel de proteasa de A . lyti cus inmovilizado (ver PCT/DK94/00347, página 45) . Después de la agitación suave por 5 horas a 30°C, el gel se eliminó mediante filtración y la insulina extendida de doble cadena se cristalizó mediante la adición de 10 mi de etanol, 845 mg de citrato trisódico dihidratado y 78 mg de cloruro de zinc. Después del ajuste del valor de pH a 6.1 y almacenamiento a 4°C toda la noche, los cristales se recolectaron mediante centrifugación, se lavaron dos veces con isopropanol y se secaron a vacío. Rendimiento: 450 mg. 2d. Síntesis de NaA"5, NaB'3, NeB30-tris ( tetradecanoil) -Ala-Thr-Arg-B (1-28) -Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21 ) -insulina. 450 mg de insulina extendida, de doble cadena, obtenida como se describe anteriormente, se disolvieron en una mezcla de 3.15 mi de DMSO y 0.69 mi de diisopropiletilamina 2 M en NMP. La solución se enfrió hasta 15°C y se agregaron 0.69 mi de éster de N-succínimida del ácido tetradecanoico 0.3 M en DMSO/NMP (1:1, v/v). Después de 2 horas a 15°C, la reacción se detuvo mediante la adición de 112 mi de amortiguador de glicina 0.01 M en etanol/agua (60:40, v/v) y el valor de pH se ajustó a 10.0. El intermediario triacilado no se aisló . 2e. Síntesis de Lys830 (Ns-tetradecanoil) -ThrB29-insulina humana .

A la solución proveniente del paso previo se agregaron 5 mi de gel de tripsina inmovilizado (ver PCT/DK94/00347, página 46) . Después de agitación suave a 15°C por 16 horas, ' el gel se eliminó mediante filtración, el valor de pH se ajustó a 9.0 y la solución se aplicó a una columna de 2.5 x 25 cm de QAE-Sephadex® A-25. La elución isocrática se realizó a una velocidad de 17.3 ml/hora utilizando un amortiguador de cloruro de amonio 0.12 M en etanol/agua (60:40, v/v) ajustado a pH 9.0 con NH3. El compuesto del título emergió de la columna después de 650 mi, y se recolectó un combinado desde 650 hasta 754 mi. Finalmente, el amortiguador se cambió a carbonato ácido de amonio 0.01 M mediante filtración en gel sobre Sephadex® G-50 Fine, y el producto se aisló en el estado seco mediante liofilización. Rendimiento: 91 mg. Masa molecular del compuesto del título, encontrada mediante espectroscopia de masa: 6020 ± 6, teórico: 6018. Masa molecular de la cadena B, encontrada mediante espectroscopia de masa: 3642 ± 5, teórico: 3640. Masa molecular del fragmento C-terminal de la cadena B digerido con proteasa V8, encontrada mediante espectroscopia de masa: 1326 ± 2, teórico: 1326. Lipofilicidad reactiva, k'rß? = 113. Vida media de despejo, T50%, después de la inyección subcutánea en cerdos: 20.3 ± 5.2 horas (n=6) . EJEMPLO 3 Síntesis de Lys828 (N€-tetradecanoil) -des (B29- B30) -insulina humana. 3a. Síntesis del precursor de Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-27) -Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) -insulina proveniente de la cepa de levadura yJB173 utilizando la guía prepro MF alfa de S . cerevisiae.

Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos : #627 5' -CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTC TACACTAAGTCTGACGATGCTAG-3' #2371 5'-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3' El ADN que codifica para Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B ( 1-27 ) -Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21 ) se construyó de la misma manera como se describe en el Ejemplo 2, mediante sustitución del oligonucleótido • #3881 con el oligonucleótido #627. El plásmido resultante fue designado pJB173 y la cepa de levadura que expresa Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-27) -Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) fue designado yJB173. 3b. Aislamiento del precursor Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-27) -Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) -insulina.

La cepa yJB173 fue fermentada por 72 horas y se recolectaron 4.8 litros de caldo. Las células de levadura se retiraron mediante centrifugación y el valor de pH se ajustó a 3.0 utilizando ácido sulfúrico. La conductividad fue de 7.8 mS/cm. El precursor de insulina se concentró utilizando una columna Pharmacia Streamline® 50 empacada con 300 mi de intercambiador iónico de Streamline® SP. Después de lavado con amortiguador de citrato 25 mM, valor de pH 3.6, el precursor se eluyó con amoniaco 0.5 M y se recolectó la fracción desde 300 hasta 600 mi. El amoniaco libre se evaporó a vacío a temperatura ambiente y el valor de pH de los 280 mi resultantes de solución, se ajustó a 9.0 con ácido clorhídrico. 3c. Síntesis de Ala-Thr-Arg-B ( 1-27) -Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) -insulina.

A los 280 mi de solución que contenía 118 mg del precursor de cadena simple, obtenido como se describe anteriormente, se agregaron 3 mi del gel de proteasa de A . lyti cus inmovilizada (ver PCT/DK94/00347, página 45) . Después de agitación suave por 24 horas a 30°C, el gel fue eliminado mediante filtración. El valor de pH se ajustó a 3.5 y la solución se filtró a través de un filtro Milipore® de 0.45 µ. La insulina extendida de doble cadena se purificó en dos corridas mediante RP-HPLC utilizando una columna de 2 x 20 cm empacada con sílice esférica C18 de 15 µ de tamaño de poro de 100 Á y sulfato de sodio 0.2 M, ácido fosfórico 0.04 M, pH 3.5 como amortiguador, y utilizando un gradiente desde 23 hasta 33% de acetonitrilo a una velocidad de 4 ml/minuto y una temperatura de columna de 40°C. La insulina extendida de doble cadena eluyó aproximadamente a 30-31% "de acetonitrilo. El acetonitrilo fue eliminado de los combinados de 70 mi mediante evaporación a vacío, y las sales se eliminaron mediante filtración en gel utilizando una columna de 5 x 47 cm de Sephadex G-25 en ácido acético 0.5 M. La insulina extendida de doble cadena fue aislada mediante liofilización. Rendimiento: 110 mg. 3d. Síntesis de NaA"5, NaB"3,NßB30-tris (tetradecanoil) -Ala-Thr-Arg-B (1-27) -Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A ( 1-21) -insulina . 110 mg de la insulina extendida de doble cadena, obtenida como se describe anteriormente, se disolvieron en una mezcla de 0.84 mi de DMSO y 0.275 mi de diisopropiletilamina 2 M en NMP. La solución se enfrió a 15°C y se agregaron 0.185 mi del éster de N-hidroxisuccinimida del ácido tetradecanoico 0.3 M en DMSO/NMP (1:1, v/v). Después de 2 horas a 15°C, la reacción se detuvo mediante la adición de 32.5 mi de amortiguador de glicina 0.01 M en etanol/agua (60:40, v/v) y el valor de pH se ajustó a 10.0. No se aisló el intermediario triacilado. 3e. Síntesis de Lys328 (N8-tetradecanoil) -des (B29-B30) -insulina humana.

A la solución resultante del paso previo se agregaron 1.5 mi de gel de tripsina inmovilizado (ver PCT/DK94/00347, página 46) . Después de agitación suave a 15°C por 18 horas, el gel se eliminó mediante filtración, el valor de pH se ajustó a 9.0 y la solución se aplicó a una columna de 1.5 x 21 cm de QAE-Sephadex® A-25. La elución isocrática se realizó a una velocidad de 10 ml/hora utilizando un amortiguador de cloruro de amonio 0.12 M en etanol/agua (60:40, v/v) ajustada a pH 9.0 con amoniaco. El compuesto del título emergió de la columna después de 250-390 mi, con un valor máximo de 330 mi. Finalmente, el amortiguador se cambió a carbonato ácido de amonio 0.01 M mediante filtración en gel utilizando Sephadex® G-50 Fine, y el producto se aisló en el estado anhidro mediante liofilización. Rendimiento: 47 mg.

Masa molecular del compuesto del título, encontrada mediante espectroscopia de masa: 5820 ± 2, teórico: 5819. Masa molecular de la cadena B, encontrada mediante espectroscopia de masa: 3444 ± 4, teórico: 3442. Masa molecular del fragmento C-terminal de la cadena B digerido con proteasa V8, encontrada mediante espectroscopia de masa: 1128 ± 2, teórico: 1128. Lipofilicidad relativa, k' re? = 121. Vida media de despejo, T50%, después de la inyección subcutánea en cerdos: 19.6 ± 3.6 h (n=4). EJEMPLO 4 Síntesis de Lys827 (Ne-tetradecanoil) -des (B28-B30) -insulina humana. 4a. Síntesis del precursor de insulina Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-26) -Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) a partir de la cepa de levadura yJB174 utilizando la guía prepro de MF S cerevi siae . Fueron sintetizados los siguientes oligonucleótidos : #628 5-'CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTC TACAAGTCTGACGATGCTAG-3 ' #2371 5' -TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3' El ADN que codifica para Glu-Glu-Ala-Glu-Ala- Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-26) -Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A (1-21 ) fue construido de la misma manera que se describe en el Ejemplo 2, mediante la sustitución del oligonucleótido #3881 con el oligonucleótido #628. El plásmido resultante fue designado pJB174 y la cepa de levadura que expresa Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-26) -Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) fue designada yJB174. 4b. Aislamiento del precursor de insulina Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-26) -Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) . La cepa yJB174 se fermentó por 72 horas y se recolectaron 3.5 litros de caldo. Las células de levadura fueron retiradas mediante centrifugación, , el valor de pH se ajustó a 3.0 utilizando ácido sulfúrico y la solución se diluyó con agua a 8 litros con el fin de disminuir la concentración salina. La conductividad resultante fue de 7.9 mS/cm. El precursor de insulina fue concentrado utilizando una columna Pharmacia Streamline® 50 empacada con 300 mi de intercambiador iónico Streamline® SP. Después del lavado con amortiguador de citrato 25 mM, pH 3.6, el precursor fue eluído con NH3 0.5 M y se recolectó la fracción desde 300 hasta 600 mi. El amoniaco libre se evaporó a vacío a temperatura ambiente y el valor de pH de los 280 mi resultantes fue ajustado a 9.0 con ácido clorhídrico. 4C. Síntesis de Ala-Thr-Arg-B (1-26) -Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) -insulina.

A los 280 mi de la solución del precursor de cadena simple obtenido como se describe anteriormente, se agregaron 3 mi de gel de proteasa de A. lyticus inmovilizado (ver PCT/DK94/00347, página 45) . Después de agitación suave por 13 horas a 30°C, el gel se retiró mediante filtración. El valor de pH se ajustó a 2.5 y la solución se filtró a través de un filtro Milipore® de 0.45 µ. La insulina extendida de cadena doble, fue purificada en 4 corridas mediante RP-HPLC utilizando una columna de 2x20 cm empacada con sílice esférica C18 de 15 µ de tamaño de poro de 100 Á y sulfato de sodio (Na2S04) 0.2 M, ácido fosfórico H3P04 0.04 M, pH 2.5 como amortiguador, y utilizando un gradiente desde 24 hasta 33% de acetonitrilo. La insulina extendida de cadena doble eluyó aproximadamente a 30-31% de acetonitrilo. El acetonitrilo fue eliminado de los combinados mediante evaporación a vacío y las sales se eliminaron mediante filtración en gel utilizando una columna de 5x47 c de Sephadex G-25 en ácido acético 0.5 M. La insulina extendida de cadena doble fue aislada mediante liofilización.

Rendimiento: 69 mg. 4d. Síntes is de NaA"5, Na8"\ NeB 7-tris ( tetradecanoil ) Ala- Thr-Arg-B ( 1-26 ) -Lys , Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A- ( 1-21 ) -insulina . 62 mg de la insulina extendida de cadena doble obtenida como se describe bajo 4e se disolvieron en una mezcla de 0.44 mi de DMSO y 0.15 mi de diisopropiletilamina 2 M en NMP. La solución se enfrió a 15°C y se agregaron 0.096 mi del éster de N-hidroxisuccinimida de ácido tetradecanoico 0.3 M en DMSO/NMP (1:1, v/v) después de 2 horas a 15°C, la reacción se detuvo mediante la adición de 17 mi de amortiguador de glicina 0.01 M en etanol/agua (60:40, v/v) y el valor de pH se ajustó a 10.0. El intermediario triacilado no se aisló. 4e. Síntesis de Lys827 (Ne-tetradecanoil) -des (B28-B30) -insulina humana.

A la solución del paso previo se agregó 1 mi de gel de tripsina inmovilizado (ver PCT/DK94/00347, página 46). Después de agitación suave a 15°C por 26 horas, el gel se eliminó mediante filtración, el valor de pH se ajustó a 9.0 y la solución se aplicó a una columna de 1.5 x 25.5 cm de QAE-Sephadex® A-25. La elución isocrática se realizó a una velocidad de 17.3 ml/h utilizando un amortiguador de cloruro de amonio 0.12 M en etanol/agua (60:40, v/v) ajustado a pH 9.0 con NH3. El compuesto del título emergió de la columna después de 360 mi, y se recolectó un combinado desde 272 hasta 455 mi. Finalmente, el amortiguador se cambió a carbonato ácido de amonio 0.01 M mediante filtración en gel sobre Sephadex® G-50 Fine, y el producto se aisló en el estado seco mediante liofilización. Rendimiento: 38 mg.

Masa molecular del compuesto del título, encontrado por espectroscopia de masa: 5720 ± 6, teórico: 5718.

Masa molecular de la cadena B encontrado mediante espectroscopia de masa 3342 ± 4, teórico: 3340. Masa molecular del fragmento C-terminal de la cadena B digerido por la proteasa V8, encontrado por EM 1027 ± 2, teórico: 1027. Lipofilicidad relativa, k'rei = 151. Vida media de despejo, T0%., después de la inyección subcutánea en cerdos: 15.2 ± 2.2 h (n=5) .

EJEMPLO 5 Síntesis de Lys826 (N'tetradecanoil) -des (B27-B30) -insulina humana. 5a. Síntesis del precursor de insulina de Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-25) -Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A- (1-21) a partir de la cepa de levadura yJB175 utilizando la guía prepro MF alfa de S. cerevi siae .

Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos: #629 5' -CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTC AAAGTCTGACGATGCTAG-3 ' #2371 5' -TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3' El ADN que codifica para Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-25) -Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) se construyó de la misma manera que se describe en el ejemplo 2 , mediante la sustitución del oligonucleótido #3881 con el oligonucleótido #629. El plásmido resultante fue designado pJB175 y la cepa de levadura que expresa Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Giu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-25) -Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) fue designada yJB175. 5b. Aislamiento del precursor de insulina Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-25) -Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) .

La ce?a yJB175 fue fermentada por 72 horas y se recolectaron 3.7 litros de caldo. Las células de levadura fueron retiradas mediante centrifugación, el valor de pH se ajustó a 3.0 utilizando ácido sulfúrico, y la solución, se diluyó con agua a 8.5 litros, con el fin de disminuir la concentración salina. La conductividad resultante fue de 7.7 mS/cm. El precursor de insulina se concentró utilizando una columna Pharmacia Strealine® 50 empacada con 300 mi de intercambiador iónico Streamline® SP. Después del lavado con amortiguador de citrato 25 mM, pH 3.6, el precursor se eluyó con amoniaco 0.5 M y se recolectó la fracción desde 300 hasta 600 mi. Se evaporó el amoniaco libre a vacío a temperatura ambiente, y el valor de pH de los 270 mi resultantes de solución, se ajustó a 9.0 con ácido clorhídrico. 5c. Síntesis de Ala-Thr-Arg-B ( 1-25) -Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) -insulina.

A la solución de 270 mi del precursor de cadena simple obtenido como se describe anteriormente, se agregaron 3 mi de gel de proteasa A. lyticus inmovilizado (ver PCT/DK94/00347, página 45) . Después de agitación por 23 horas a 30°C, el gel se eliminó mediante filtración. El valor de pH se ajustó a 2.5 y la solución se filtró a través de un filtro Milipore® 0.45 µ. La insulina extendida de cadena doble se purificó en 4 corridas mediante RP-HPLC utilizando una columna de 2 x 20 cm empacada con sílice esférica C18 de µ de un tamaño de poro de 100 Á y sulfato de sodio 0.2 M, ácido fosfórico 0.04 M, pH 3.5 como amortiguador, y utilizando un gradiente de 24 a 33% de acetonitrilo. La insulina extendida de cadena doble eluyó a aproximadamente 29-31% de acetonitrilo. El acetonitrilo se eliminó de los combinados mediante evaporación a vacío, y las sales se eliminaron mediante filtración en gel utilizando una columna de 5x47 cm de Sephadex® G-25 en ácido acético 0.5 M. La insulina extendida de cadena doble se aisló mediante liofilización. Rendimiento: 81 mg. 5d. Síntesis de NaA"5, Na8~3, NeB26-tris ( tetradecanoil) Ala- Thr-Arg-B (1-25) -Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) -insulina . 80 mg de la insulina extendida de cadena doble se disolvieron en una mezcla de 0.56 mi de DMSO y 0.19 mi de diisopropiletilamina 2 M en NMP. La solución se enfrió a 15°C y se agregaron 0.124 mi de N-hidroxisuccinimida del ácido tetradecanoico 0.3 M en DMSO/NMP (1:1 v/v). Después de 2 horas a 15°C la reacción se dejó mediante la adición de 21.8 mi de amortiguador de glicina 0.01 M en etanol/agua (60:40, v/v) y el valor de pH se ajustó a 10.0. No se aisló el intermediario triacilado. 5e. Síntesis de Lys326 (Ne-tetradecanoil) -des (B27-B30) -insulina humana.

A la solución proveniente del paso previo se agregó 1 mi de gel de tripsina inmovilizada (ver PCT/DK94/00347, página 46). Después de agitación suave a 15°C por 23 horas el gel se eliminó mediante filtración, el valor de pH se ajustó a 9.0 y la solución se aplicó a una columna de 1.5 x 25.5 cm de QAE-Sephadex® A-25. La elución isocrática se realizó a una velocidad de 19.3 ml/h utilizando un amortiguador de cloruro de amonio 0.12 M en etanol/agua (60:40, v/v) ajustado a pH 9.0 con amoniaco. El compuesto del título emergió de la columna después de 320 mi, y se recolectó una fracción desde 320 hasta 535 mi. Finalmente, el amortiguador se cambió a carbonato ácido de amonio 0.01 M mediante filtración en gel sobre Sephadex® G-50 Fine, y el producto se aisló en estado anhidro mediante liofilización. Rendimiento: 25 mg.

Masa molecular del compuesto del título encontrado mediante espectroscopia de masa: 5555 ± 6, teórico: 5555.

Masa molecular de la cadena B encontrada mediante espectroscopia masa: 3179 ± 4, teórico 3178.

Masa molecular del fragmento C-terminal de la cadena B digerida con la proteasa V8, encontrada mediante espectroscopia de masa: 864 ± 1, teórico: 863.5. Lipofilicidad relativa, k're? = 151.

Vida media del despejo T50%, después de la inyección subcutánea en cerdos: 14.4 ± 1.5 h (n = 5) . EJEMPLO 6 Síntesis de (N ( 1-carboxitridecil) -2-amidosuccinil) -PheaB1des (B30) -insulina humana.

La Al, B29-diBoc-des (B30) -insulina humana (200 mg, 0.33 mmol) se disolvió en DMF (15 mi) y se agregó trietilamina (20 µl) . Se agregó el éster de N-hidroxisuccinimida del ácido N ( 1-carbometoxitridecil) -2-amidosuccínico (16 mi, 0.033 mmol) y después de 4 horas a temperatura ambiente la mezcla de reacción se evaporó a vacío hasta sequedad. Los grupos Boc se eliminaron en el tratamiento por 30 min. a temperatura ambiente con ácido trifluoroacético (5 mi). El ácido trifluoroacético se eliminó mediante evaporación a vacío. El residuo se disolvió a 0°C en hidróxido de sodio 0.1 N (20 mi). La saponificación del éster metílico se logró después de una hora a 0°C. El valor de pH de la mezcla de reacción se ajustó a 5.0 mediante ácido acético y se agregó etanol (5 mi). El precipitado formado se aisló mediante centrifugación. El compuesto del título se purificó a partir del precipitado mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando una columna de 2.5 x 27 cm de QAE-Sephadex® A25. El precipitado se disolvió en etanol/agua (60:40, v/v) (25 mi) mediante ajuste de valor de pH a 9.8 utilizando amoniaco, y la solución se aplicó a la columna. La elución se llevó a cabo en amortiguador de NH3/NH4C1 a pH 9.0, utilizando un gradiente lineal desde 0.12 hasta 0.18 M de cloruro de amonio en etanol/agua (60:40 v/v) y un total de 1000 mi de eluyente. La absorbancia de UV del eluído se verificó periódicamente 280 mn y se recolectaron las fracciones de 10 mi. El compuesto del título emergió de la columna en las fracciones 62 a la 72. El compuesto del título se precipitó mediante la dilución del combinado con dos volúmenes de agua y ajustado el valor de pH 5.0.

Después de la centrifugación el precipitado se lavó con agua y después de una segunda centrifugación el producto se secó a vacío. Rendimiento 10 mg.

Peso molecular encontrado por PDMS : 6032, teórico: 6032. Lipofilicidad relativa k'C?? = 140. Vida media de despejo, T50%, después de inyección subcutánea en cerdos: 8.65 ± 1.65 horas (n = 5) . EJEMPLO 7 PheaB1-tetradecanoil-glutamil-glicil-des (B30 ) -insulina humana .

La Al, B29-diBoc-des (B30) -insulina humana (200 mg, 0.033 mmol) se disolvió en DMF (15 mi) y se agregó trietilamina (100 µl). El éster de N-hidroxisuccinimida de Myristoyl-Glu (?-OtBu) -Gly (95 mg, 0.17 mmol) fue agregado, y después de 4 horas a temperatura ambiente la mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad a vacío. Los grupos Boc y tBu fueron eliminados mediante tratamiento por 30 min. a temperatura ambiente con ácido trifluoroacético (5 mi).

El ácido trifluoroacético fue eliminado mediante evaporación a vacío. El compuesto del título se purificó a partir del precipitado mediante RP-HPLC utilizando una columna de sílice C18 y eluyendo con un gradiente lineal desde 16 hasta 64% de acetonitrilo en un amortiguador Tris-fosfato 50 mM que contenía sulfato de amonio 75 mM a pH 7. El compuesto del título emergió de la columna aproximadamente a 50% de acetonitrilo. El acetonitrilo se evaporó a vacío y se agregó etanol al 20% (v/v) . El ajuste de valor de pH a 5.0 provocó que el producto se precipitara. Después de la centrifugación el precipitado se disolvió en carbonato ácido de amonio 10 mM, se desaló mediante filtración en gel utilizando Sephadex G-25 y se liofilizó. Rendimiento: 97 mg . Masa molecular encontrada mediante PDMS: 6105, teórico 6104.

EJEMPLO 8 Síntesis de Gly328, Thr829, LysB30 (Ne-tetradecanoil) -insulina humana. 8a. Síntesis de precursor de Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-3 (1-27) -Gly-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) -insulina a partir de la cepa yKV195 de levadura utilizando la guía prepro MF alfa de S . cerevi siae .

Se sintetizaron" los siguientes oligonucleótidos: #4790 5'-TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTAC ACTGGTACCAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTGTCG-3' #2371 5' TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3' El ADN que codifica para Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-27) -Gly-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21 ) se construyó de la misma manera que se describe en el ejemplo 2, mediante la sustitución del oligonucleótido #3881 con el oligonucleótido #4790. El plásmido resultante fue designado pKV195, y la cepa de levadura que expresa Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-27) -Gly-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) fue designado yKV195. 8b. Aislamiento del precursor de Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-27) -Gly-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A (1-21) -insulina.

La cepa yKV195 fue fermentada por 72 horas y se recolectaron 4.4 litros de caldo. Las células de levadura se eliminaron mediante centrifugación, el valor de pH se ajustó a 3.0 utilizando ácido sulfúrico y 3.6 litros de agua se agregaron para diluir las sales hasta una conductividad de 7.7 mS/cm. El t precursor de insulina se concentró utilizando una columna Pharmacia Strealine 50 empacada con 300 mi de intercambiador iónico Streamline® SP. Después del lavado con 3 litros de amortiguador de citrato de 25 mM, pH 3.6, el precursor se eluyó utilizando amoniaco 0.5 M y la fracción de 300 hasta 600 mi se recolectó. El amoniaco libre se evaporó a vacío a temperatura ambiente y el valor de pH de los 280 mi resultantes se ajustó a 9.0 con ácido clorhídrico. 8c. Síntesis de Ala-Thr-Arg-B (1-27) -Gly-Thr-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) -insulina.

A los 280 mi de solución que contenía 300 mg del precursor de cadena simple se agregaron 3 mi de gel de proteasa de A. lyticus inmovilizada (ver PCT/DK94/00347, página 45) . Después de agitación suave por 17 horas a 30°C, el gel se eliminó mediante filtración. El valor de pH se ajustó a 3.5 y la solución se filtró a través de un filtro Milipore® 0.45 µ. La insulina extendida de cadena doble fue purificada en 3 corridas mediante RP-HPLC utilizando una columna de 2x20 cm empacada con sílice esférica C18 de 10 µ de tamaño de poro de 120 Á y sulfato de sodio 0.2 M, ácido fosfórico 0.04 M pH 3.5 como amortiguador, y utilizando un gradiente desde 23 hasta 33% de acetonitrilo a una velocidad de 4 ml/min. y a una temperatura de columna de 40°C. La insulina extendida de cadena doble eluyó aproximadamente a 30-31% de acetonitrilo. El acetonitrilo fue eliminado de los combinados de 70 mi mediante evaporación a vacío, y la sal se eliminó mediante filtración en gel utilizando una columna de 5x47 cm de Sephadex® G-25 y ácido acético 0.5 M. La insulina extendida de cadena doble fue aislada mediante liofilización. Rendimiento: 176 mg. 8d. Síntesis de NaA'5, Na8"3, Ne830-tris (tetradecanoil) -Ala-Thr-Arg-B (1-27) -Gly-Thr-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) -insulina. 176 mg de insulina extendida de cadena doble se disolvieron en una mezcla de 1.4 mi de DMSO y 0.275 mi de diisopropiletilamina 2 M en NMP. La solución se enfrió hasta 15°C y se agregaron 0.963 mi del éster N-hidroxisuccinimida del ácido tetradecanoico 0.3 M de DMSO/NMP (1:1 v/v). Después de 20 horas a 15°C la reacción se detuvo mediante la adición de 50 mi de amortiguador de glicina 0.01 M en etanol/agua (60:40, v/v) y el valor de pH se ajustó a 10.0. El intermediario triacilado no fue aislado. 8e. Síntesis de Gly828, Thr829, Lys830 (N-tetradecanoil) -insulina humana. A la solución del paso previo se agregaron 2.5 mi del gel de tripsina inmovilizado (ver PCT/DK94/00347, página 46) . Después de agitación suave a 15°C por 5 horas el gel se eliminó mediante filtración, el valor de pH se ajustó a 9.0 y la solución se aplicó a una columna de 1.5 x 26.5 cm de QAE-Sephadex® A-25. La elución isocrática se realizó a una velocidad 9.3 ml/h utilizando un amortiguador de cloruro de amonio 0.12 M en etanol/agua (60:40 v/v) ajustada a pH 9.0 con amoniaco. El compuesto del título emergió de la columna después de 325-455 mi, con un máximo a 380 mi. Finalmente, el amortiguador se cambió a carbonato ácido de amonio 0.01 M mediante filtración en gel utilizando Sephadex® G-50 Fine, y el producto se aisló en estado anhidro mediante liofilización. Rendimiento 50 mg.

Masa molecular del compuesto del título, encontrado mediante espectroscopia de masa: 5979 ± 6, teórico: 5977. Masa molecular de la cadena B, encontrada mediante espectroscopia de masa: 3600 ± 4, teórico 3600. Masa molecular del fragmento C-terminal de la cadena B digerida con proteasa V8, encontrada mediante espectroscopia de masa: 1286 ± 2, teórico: 1286. Lipofilicidad relativa, k'ce? = 103. Vida media de despejo, T50%, después de la inyección subcutánea en cerdos: 17 ± 2 h (n = 4) .

EJEMPLO 9.

Síntes is de Gl y828 , Lys829 (N-tetradecano i l ) insulina humana 9a. Síntesis del precursor de Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-27) -Gly-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) -insulina a partir de la cepa yKV196 de levadura utilizando la guía prepro MF alfa de S cerevisiae . Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos: #4791 5' -TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTAC ACCGGTAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTGTCG-3' #2371 5'-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3' El ADN que codifica para Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-27) -Gly-Lys-Ser-Asp-Asp-ala-Arg-A( 1-21) se construyó de la misma manera que se describe en el ejemplo 2, mediante la sustitución del oligonucleótido #3881 con el oligonucleótido #4791 El plásmido resultante fue designado pKV196 y la cepa de levadura que expresa Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B (1-27) -Glu-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) fue designada yKV196. 9b. Aislamiento del precursor Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu- Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B ( 1-27 ) -Glu-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) -insulina.

La cepa yKV196 fue fermentada por 72 horas y se recolectaron 3.6 litros de caldo. Las células de levadura fueron retiradas mediante centrifugación, el valor de pH se ajustó a 3.0 utilizando ácido sulfúrico, y se agregaron 3.4, litro de agua para diluir las sales hasta una conductividad de 7.7 mS/cm. El precursor de insulina se concentró a 300 mi utilizando el proceso descrito en el ejemplo 8b. 9c. Síntesis de Ala-Thr-Arg-B (1-27) -Gly-Lys, Ser-Asp-Asp- Ala-Arg-A( 1-21) -insulina.

A la solución de 300 mi a pH 9.0 que contenía 390 mg del precursor de cadena simple, se agregaron 5 mi de gel de proteasa de A. lyticus inmovilizado (ver PCT/DK94/00347, página 45) . Después de agitación suave por 40 horas a 30°C, el gel se eliminó mediante filtración. El valor de pH se ajustó a 3.5 y la solución se filtró a través de un filtro Milipore® de 0.45 µ. La insulina extendida de cadena doble se purificó en 3 corridas mediante RP-HPLC utilizando una columna de 2 x 20 cm empacada con sílice C18 esférica 10 µ, de tamaño de poro 120 Á y sulfato de sodio 0.2 M, ácido fosfórico 0.04 M, pH 3.5 como amortiguador, y utilizando un gradiente desde 23 hasta 33% de acetonitrilo a una velocidad de 4 ml/min. y a una temperatura de columna de 40°C. La insulina extendida de cadena doble se eluyó aproximadamente a 29% de acetonitrilo. El acetonitrilo fue eliminado de los combinados de 60 mi mediante evaporación a vacío, y la sal se eliminó mediante filtración en gel utilizando una columna de 5 x 47 cm de Sephadex® G-25 y ácido acético 0.5 M. La insulina extendida de cadena doble se aisló mediante liofilización. Rendimiento: 154 mg. 9d. Síntesis de NaA"5, NaB"3, Ne829-tris (tetradecanoil) Ala-Thr-Arg-B (1-27) -Gly-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21 ) -insulina . 154 mg de la insulina extendida de cadena doble se disolvieron en una mezcla de 1.05 mi de DMSO y 0.329 mi de diisopropiletilamina 2 M en NMP. La solución se enfrió a 15°C y se agregaron 0.22 mi del éster de N-hidroxisuccinimida del ácido tetradecanoico de 0.3 M en DMSO/NMP (1:1, v/v) después de 2 horas a 15°C, la reacción se detuvo mediante adición de 40 mi de amortiguador de glicina 0.01 M en etanol/agua (60:40, v/v) y el valor de pH se ajustó a 10.0. No se aisló el intermediario triacilado. 9e. Síntesis de Gly328, Lys829 (N' -tetradecanoil) -insulina humana .

A la solución del paso previo se agregaron 1.5 mi de gel de tripsina inmovilizada (ver PCT/DK94/00347, página 46) . Después de agitación suave a 15°C por 21 horas, el gel se eliminó mediante filtración, el valor de pH se ajustó a 9.0 y el producto en 43 mi de solución se aplicó a una columna de 1.5 x 26.0 cm de QAE-Sephadex® A-25. La elución isocrática se realizó a una velocidad de 9.5 ml/h utilizando un amortiguador de cloruro de amonio 0.12 M en etanol/agua (60:40, v/v) ajustado a pH 9.0 con amoniaco. El compuesto del título emergió de la columna después de 190-247 mi, con un máximo de 237 mi. Finalmente, el amortiguador se- cambió a carbonato ácido de amonio 0.01 M mediante filtración en gel utilizando Sephadex® G-50 Fine, y el producto se aisló en el estado anhidro mediante liofilización. Rendimiento 67 mg.

Masa molecular del compuesto del título, encontrado mediante espectroscopia de masa: 5877 ± 2, teórico: 5876.

Masa molecular de la cadena B, encontrado mediante espectroscopia de masa: 3499 ± 3, teórico: 3499. Masa molecular de fragmento C-terminal de la cadena B digerido con la proteasa V8, encontrado por espectroscopia de masa: 1184 ± 2, teórico: 1185. Lipofilicidad relativa, k're? = 118.5. Vida media de despejo T50%, después de la inyección subcutánea en cerdos: 25 ± 9 h (n = 4) .

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERALES: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Novo Nordisk A/S (B) CALLE: Novo Alié" (C) CIUDAD: DK-2880 Bagsvaerd (E) PAÍS: Dinamarca (G) TELÉFONO: +45 44448888 (H) TELEFAX: +45 44490555 (I) TELEX: 37173 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: INSULINA ACILADA (iii) NUMERO DE SECUENCIAS : 2 (iv) DOMICILIO DE CORRESPONDENCIA: (A) DOMICILIO: Novo Nordisk A/S Corporación de Patentes (B) CALLE: Novo Alié (C) CIUDAD: DK-2880 Bagsvaerd (E) CIUDAD: Dinamarca (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA (A) TIPO DE MEDIO: Disco Flexible (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión # 1.25 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: DK 0276/95 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 17-MARZO-1995 (viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE : (A) NOMBRE: Jorgensen, Dan y colaboradores (B) NÚMERO REFERENCIA/CASO: 4341-WO, DJ (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELÉFONO: +45 44448888 (B) FAX: +45 44493256 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 1 Gly He Val Glu Gln Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 2: Xaa Xaa Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes :

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un derivado de insulina que tiene la siguiente secuencia: Cadena A S S Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 Cadena B Xaa-Xaa-Xaa-Gln-His-Leu-Cys -Gly- Ser-His -Leu-Val - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Cadena A (continuación) 20 Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa SEQ ID No. 1) 13 14 15 16 17 18 19 21 S Cadena B (continuación) S Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe- 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Cadena B (continuación) Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID No. 2) 25 26 27 28 29 30 caracterizado porque Xaa en la posición A21 es cualquier aminoácido codificable, excepto Lys, Arg y Cys; Xaa en las posiciones Bl, B2, B3, B26, B27, B28 y B29 son, independientemente uno del otro, cualquier aminoácido codificable excepto Cys, o está suprimido; Xaa en la posición B30 es cualquier aminoácido codificable, excepto Cys, un dipéptido que no comprende Cys o Arg, un tripéptido que no comprende Cys o Arg, un tetrapéptido que no comprende Cys o Arg, o está suprimido; y cualquier grupo amino del aminoácido N-terminal de la cadena B tiene un grupo lipofílico, W, unido a éste, cuyo grupo tiene de 12 a 40 átomos de carbono, y contiene opcionalmente un grupo que puede estar negativamente cargado o el grupo carboxilo del aminoácido C-terminal de la cadena B tiene un grupo lipofílico, Z, unido a éste, cuyo grupo tiene de 12 a 40 átomos de carbono, y contiene opcionalmente un grupo que puede estar negativamente cargado, con la condición de que si uno o más de los aminoácidos en la posición Bl, B2 y B3 es (están) suprimido (s) , entonces el número del aminoácido N-terminal es encontrado mediante conteo hacia abajo desde Cys37, al cuai se le asigna siempre el número 7 y porque: a) cuando B1-B2-B3 es Phe-Val-Asn y A21 es Asn, y B26-327-B23-B29-B30 es Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr o Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala, entonces W o Z contiene siempre un grupo que puede estar negativamente cargado; y b) cuando B29 y B30 están suprimidos, y está presente un grupo Z como se define anteriormente en el aminoácido C-terminal de la cadena B y no está suprimido ni 6 r, B* o B3 etonce* B1 -8* e« dllt*?ntt dt Pht-V l o Bté -B27-B28 son diferentes de dichas secuencias; y c) cuando B29 y B30 están suprimidos, y está presente un grupo Z como se define anteriormente en el aminoácido C-terminal de la cadena B, y uno de Bl, B2 o B3 está suprimido, entonces el aminoácido N-terminal de la cadena B es diferente de Val o la secuencia B26-B27-B28 es diferente de Tyr-Thr-Pro, o el aminoácido N-terminal de la cadena B y la secuencia B26-B27-B28 son diferentes de Val y Tyr-Thr-Pro respectivamente.

2. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo lipofílico, W, está acoplado al grupo amino del aminoácido N-terminal en la cadena B.

3. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo lipofílico, Z, está acoplado al grupo carboxilo del aminoácido C-terminal en la cadena B.

4. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque Xaa en la posición A21 designa un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Ala, Asn, Gln, Glu, Gly y Ser.

5. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque Xaa en la posición Bl designa Phe o está suprimido.

6. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque Xaa en la posición B2 designa Ala o Val.

7. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque Xaa en la posición B3 designa un aminoácido seleccionado del grupo que comprende Asn, Gln, Glu, y Thr.

8. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque Xaa en la posición B26 designa Tyr.

9. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque Xaa en la posición B27 designa Thr.

10. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque Xaa en la posición B28 designa Pro.

11. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque Xaa en la posición B29 designa Lys o Thr.

12. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque Xaa en la posición B30 designa Thr o Lys e-acilada.

13. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque Xaa en la posición B30 está suprimido .

14. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque Xaa en la posición B28 designa Lys, y Xaa en la posición B29 designa Pro.

15. El derivado de insulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque Xaa en la posición B28 designa Pro, y Xaa en la posición B29 designa Thr.

16. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque W está unido al grupo amino del aminoácido N-terminal vía un enlace amida.

17. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque W es CH3 (CH2) nCH (COOH) H-CO (CH2) 2CO- y n es un número entero de 9 a 15.

18. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque Z está unido al grupo carboxilo del aminoácido C-terminal vía un enlace amida.

19. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque Z es -NHCH (COOH) (CH2) 4NH-CO(CH2)mCH3 y m es un número entero de 8 a 18.

20. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la insulina progenitora a la cual está unido Z es Thr829-insulina humana.

21. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la insulina progenitora a la cual está unido Z es des (B28-B30) -insulina humana.

22. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la insulina progenitora a la cual está unido Z es des (B27-B30) -insulina humana.

23. El derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la insulina progenitora a la cual está unido Z es des (B26-B30) -insulina humana.

24. Un derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el aminoácido C-terminal de la cadena B es Lys e-acilado y el aminoácido junto al aminoácido C-terminal es Gly.

25. Una composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes en un paciente en necesidad de tal tratamiento, caracterizado porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 1, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

26. Una composición farmacéutica para el tratamiento de diabetes en un paciente en necesidad de tal tratamiento, caracterizado porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un derivado de insulina de conformidad con la reivindicación 1, en mezcla con una insulina o un análogo de insulina el cual tiene un inicio rápido de acción, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.