ES2472421T3 - Nuevos derivados de insulina - Google Patents

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Abstract

Derivado de insulina de la des(B30) insulina humana que posee una cadena lateral fijada al grupo ε-amino de un residuo de Lys presente en la cadena B de des(B30) insulina humana, la cadena lateral tiene la fórmula general: -W-X-Y-Z donde W es: * un residuo de α-aminoácido con un grupo de ácido carboxílico en la cadena lateral, este aminoácido está seleccionado del grupo que consiste en "-Asp, -Asp, "-Glu, $-Glu, "-hGlu y %-hGlu y este residuo forma, con uno de sus grupos de ácido carboxílico, un grupo de amida con el grupo ε-amino de un residuo de Lys presente en la cadena B de la des(B30) insulina humana; X es: * -CO-; Y es: * -(CH2)m donde m es un número entero en el intervalo de 12 a 16; y Z es: * -COOH; y cualquier complejo Zn2+ de los mismos.

Description

Nuevos derivados de insulina
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere a nuevos derivados de insulina humana que son solubles en valores de pH fisiológico y tienen un perfil de acción prolongado. La invención también se refiere a métodos para proveer tales derivados, en composiciones farmacéuticas que los contienen, para un método de tratamiento de la diabetes e hiperglucemia usando los derivados de insulina de la invención y al uso de tales derivados de insulina en el tratamiento de diabetes e hiperglicemia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] Habitualmente, el tratamiento de la diabetes, tanto la diabetes de tipo 1 como la diabetes de tipo 2, se basa cada vez más en el tratamiento denominado intensivo de insulina. Según este tratamiento, los pacientes se tratan con varias inyecciones de insulina diarias comprendiendo una o dos inyecciones diarias de una insulina de acción prolongada para cubrir la necesidad de insulina basal complementada por inyecciones en bolo de una insulina de acción rápida para cubrir la necesidad de insulina relacionada con las comidas.
[0003] Las composiciones de insulina de acción prolongada son conocidas en la técnica. De este modo, un tipo principal de composiciones de insulina de acción prolongada comprende suspensiones acuosas inyectables de cristales de insulina o de insulina amorfa. En estas composiciones, los compuestos de insulina utilizados típicamente son insulina protamina, insulina zinc o insulina zinc-protamina.
[0004] Algunos inconvenientes se asocian al uso de suspensiones de insulina. As�, para asegurar una dosificación precisa, las partículas de insulina se deben suspender homog�neamente por agitaci�n suave antes de que un volumen definido de la suspensión se retire de un vial o se expulse de un cartucho. Además, para el almacenamiento de las suspensiones de insulina, la temperatura se debe mantener dentro de límites más estrechos que para las soluciones de insulina para evitar la formación de grumos o la coagulación.
[0005] Mientras que en el pasado se creía que las protaminas no eran inmunog�nicas, hoy en día se ha descubierto que las protaminas pueden ser inmunog�nicas en el ser humano y que su uso con fines m�dicos puede llevar a la formación de anticuerpos. También hay evidencias de que el complejo protamina-insulina es en s� mismo inmunog�nico. Por lo tanto, con algunos pacientes se debe evitar el uso de composiciones de insulina de acción prolongada que contienen protaminas.
[0006] Otro tipo de composiciones de insulina de acción prolongada son soluciones que tienen un valor de pH inferior al pH fisiológico a partir del cual la insulina se precipitar� debido al aumento en el valor del pH cuando se inyecta la solución. Un inconveniente derivado de estas soluciones es que la distribución del tamaño de las partículas del precipitado formado en el tejido durante la inyección, y de este modo, el perfil de liberación de la medicaci�n, depende del flujo sanguíneo en el sitio de inyección y de otros parámetros bastante imprevisibles. Otro inconveniente es que las partículas sólidas de la insulina pueden actuar como irritante local causando una inflamación del tejido en el sitio de inyección.
[0007] WO 91/12817 (Novo Nordisk A/S) divulga composiciones de insulina soluble que comprenden complejos de insulina de cobalto (III). El perfil de acción de estos complejos se prolonga sólo moderadamente y la biodisponibilidad se reduce con respecto a la insulina humana.
[0008] La insulina humana tiene tres grupos amino primarios: el grupo N-terminal de la cadena A y de la cadena B y el grupo �-amino de LysB29. Varios derivados de insulinas que se sustituyen en uno o más de estos grupos se conocen por la técnica anterior. De este modo, la patente US n�: 3.528.960 (Eli Lilly) se refiere a insulinas de N-carboxiaroil en las que uno, dos o tres grupos amino primarios de la molécula de insulina presentan un grupo carboxiaroil.
[0009] Según la patente GB n�: 1.492.997 (Nat. Res. Dev. Corp.), se ha descubierto que la insulina con una sustitución de carbamilo en N�B29 tiene un perfil mejorado de efecto hipogluc�mico.
[0010] La solicitud de patente pública JP n�: 1-254699 (Kodama Co., Ltd.) divulga una insulina donde un ácido graso est� ligado al grupo amino de PheB1 o al grupo �-amino de LysB29 o a ambos. El objetivo declarado de la derivación es obtener una preparación de insulina estable farmacol�gicamente aceptable.
[0011] Las insulinas que en su posición B30 tienen un amino�cido con al menos cinco átomos de carbono que no tienen que ser codificados necesariamente por un triplete de nucleótidos, se describen en la solicitud de patente pública JP n�: 57-067548 (Shionogi). Se reivindica que los análogos de insulina son útiles en el tratamiento de la diabetes mellitus, particularmente en pacientes que son insulino-resistentes debido a la generación de anticuerpos de insulina bovina o porcina.
[0012] WO 95/07931 (Novo Nordisk A/S) divulga derivados de insulina humana en los que el grupo �-amino de LysB29 tiene un sustituyente lipof�lico. Estos derivados de insulina tienen un perfil de acción prolongada y son solubles en valores de pH fisiológico.
[0013] EP 894095 divulga derivados de insulina en los que el grupo N-terminal de la cadena B y/o el grupo �-amino de Lys en la posición B28, B29 o B30 tiene un sustituyente de la fórmula -CO-W-COOH, donde W puede ser un grupo hidrocarburo de cadena larga. Estos derivados de insulina tienen un perfil de acción prolongada y son solubles en valores de pH fisiológico.
[0014] WO 99/21888 divulga agregados hidrosolubles de derivados de insulina humana que tienen un perfil de acción prolongado.
[0015] No obstante, sigue existiendo la necesidad de insulinas con un perfil de acción más prolongado que los derivados de insulina conocidos hasta hoy y que sean al mismo tiempo solubles en valores de pH fisiológico y presenten una potencia comparable a la de la insulina humana.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0016] La presente invención se basa en el reconocimiento de que la hidrofobicidad global de una molécula de derivado de insulina tiene una función importante para la potencia in vivo del derivado.
[0017] En un aspecto, la presente invención se refiere a un derivado de insulina de des(B30) insulina humana que tiene una cadena lateral unida al grupo �-amino de un residuo de Lys presente en la cadena B de la des(B30) insulina humana, la cadena lateral siendo la fórmula general:
-W-X-Y-Z
donde W es:
• un residuo de a-amino�cido con un grupo de ácido carbox�lico en la cadena lateral, este amino�cido est� seleccionado del grupo que consiste en a-Asp, �-Asp, a-Glu, y-Glu, a-hGlu y o-hGlu y este residuo forma, con uno de sus grupos de ácido carbox�lico, un grupo de amida con el grupo �-amino de un residuo de Lys presente en la cadena B de la des(B30) insulina humana;
X es:
• -CO-;
Y es:
• -(CH2)m donde m es un número entero en el intervalo de 12 a 16; y
Z es:
• -COOH;
y cualquier complejo Zn2+ de los mismos.
[0018] En una forma de realización, la cadena lateral -W-X-Y-Z se une al grupo �-amino de un residuo de Lys presente en la posición 28 de la cadena B. En otro aspecto más específico de esta forma de realización, la cadena lateral -W-X-Y-Z se une al grupo �-amino de un residuo de Lys presente en la posición 29 de la cadena B. En otro aspecto más específico de esta forma de realización, la cadena lateral -W-X-Y-Z se une al grupo �-amino de un residuo de Lys presente en la posición 30 de la cadena B.
[0019] En una forma de realización W se puede conectar al grupo �-amino del residuo de Lys presente en la cadena B a través de un derivado de urea.
[0020] La subestructura X de la cadena lateral -W-X-Y-Z puede ser un grupo de la fórmula -CO- que, por medio de un enlace a partir del carbono de carbonilo subrayado, forma un enlace amida con un grupo amino en W.
[0021] En otra forma de realización, la subestructura X de la cadena lateral puede ser un grupo que consiste en a-Asp, [-Asp, a-Glu, and y-Glu; X es -CO-; Y es -(CH2)m-, donde m es un número entero en el intervalo de 12 a 16 y Z es -COOH.
[0022] La fracción de insulina, también denominada insulina progenitora en el presente texto, de un derivado de insulina según la invención es un análogo de insulina.
[0023] El análogo de insulina progenitor es des(B30) insulina humana.
[024] Ejemplos de derivados de insulina según la invención son los siguientes compuestos:
N�B29
-(Na-(HOOC(CH2)14CO)-y-Glu) des(B30) insulina humana; N�B29
-
(Na-(HOOC(CH2)15CO)-y-Glu) des(B30) insulina humana;
N�B29
-
(Na-(HOOC(CH2)16CO)-y-Glu) des(B30) insulina humana;
N�B29
-
(Na-(HOOC(CH2)13CO)-y-Glu) des(B30) insulina humana;
N�B29
-
(Na-(HOOC(CH2)13CO)--Glu) des(B30) insulina humana;
N�B29
-
(Na-(HOOC(CH2)13CO)-a-Glu) des(B30) insulina humana;
N�B29
-(Na-(HOOC(CH2)16CO)-y-D-Glu) des(B30) insulina humana; N�B29
-
(Na-(HOOC(CH2)14CO)--D-Asp) des(B30) insulina humana;
N�B29
-
(Na-(HOOC(CH2)16CO)--D-Asp) des(B30) insulina humana;
[0025] Los derivados de insulina según la invención se pueden proveer en forma de compuestos esencialmente desprovistos de zinc o en forma de complejos de zinc. Cuando se proveen complejos de zinc de un derivado de insulina según la invención, dos iones de Zn2+, tres iones de Zn2+ o cuatro iones de Zn2+ se pueden ligar a cada hex�mero de insulina. Las soluciones de complejos de zinc de los derivados de insulina contendrán mezclas de estas especies.
[0026] En otro aspecto de la invención, se puede proveer una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un derivado de insulina según la invención junto con un soporte farmac�uticamente aceptable para el tratamiento de la diabetes de tipo 1, la diabetes de tipo 2 y otros estados que causan hiperglucemia en pacientes que necesitan este tratamiento. Un derivado de insulina según la invención se puede usar para producir una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2 y otros estados que causan hiperglucemia.
[0027] En otro aspecto de la invención, se provee una composición farmacéutica para tratar la diabetes de tipo 1, la diabetes de tipo 2 y otros estados que causan hiperglucemia en un paciente que necesita dicho tratamiento, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un derivado de insulina según la invención mezclado con una insulina o un análogo de insulina que tiene un inicio rápido de acción, junto con soportes y aditivos farmac�uticamente aceptables.
[0028] En una forma de realización, la invención provee una composición farmacéutica que es una mezcla de un derivado de insulina según la invención y un análogo de insulina de acción rápida seleccionado del grupo que consiste en insulina humana AspB28; insulina humana LysB28ProB29 e insulina humana LysB3GluB29 .
[0029] En una forma de realización, la invención provee una composición farmacéutica que comprende N�B29-(Na(HOOC(CH2)14CO)-y-Glu) des(B30) insulina humana e insulina humana AspB28 junto con soportes y aditivos farmac�uticamente aceptables.
[0030] El derivado de insulina según la invención y el análogo de insulina de acción rápida se pueden mezclar en una proporción de aproximadamente 90 /10%, aproximadamente 70/30% o aproximadamente 50/50%.
[0031] En otro aspecto de la invención, se provee un método para tratar la diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2 y otros estados que causan hiperglucemia en un paciente que necesita tal tratamiento, que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un derivado de insulina según la invención junto con un soporte y aditivos farmac�uticamente aceptables.
[0032] En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para tratar la diabetes de tipo 1, la diabetes de tipo 2 y otros estados que causan hiperglucemia en un paciente que requiere tal tratamiento, que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un derivado de insulina según la invención mezclado con una insulina o un análogo de insulina que tiene un inicio rápido de acción, junto con un soporte farmac�uticamente aceptable y aditivos farmacéuticos aceptables.
[0033] En otro aspecto, la presente invención se refiere a derivados de insulina que tienen una hidrofobicidad global que es esencialmente similar a la de la insulina humana.
[0034] En otro aspecto, la presente invención se refiere a derivados de insulina que tienen un índice hidrof�bico, k'rel, que est� en el rango de aproximadamente 2 a aproximadamente 200.
[0035] En otro aspecto, los derivados de insulina de la presente invención tienen un índice hidrof�bico, k'rel, que est� en el rango de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 10, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2.
5 [0036] Según una forma de realización de la presente invención, los derivados de insulina comprenderán una cadena lateral W-X-Y-Z, tal como se ha definido anteriormente, que tiene al menos una región hidrof�lica y al menos una región hidrof�bica.
[0037] Según otra forma de realización de la presente invención, los derivados de insulina comprenderán una cadena
10 lateral -W-X-Y-Z, tal como se ha definido anteriormente, que tiene al menos un grupo de ácido carbox�lico libre y según otra forma de realización, la cadena lateral tendr� al menos dos grupos de ácido carbox�lico libres.
[0038] En otra forma de realización, la invención se refiere a una composición farmacéutica comprendiendo un derivado de insulina según la invención que es soluble en valores de pH fisiológico.
15 [0039] En otra forma de realización, la invención se refiere a una composición farmacéutica comprendiendo un derivado de insulina según la invención soluble en valores de pH en el intervalo de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,5.
[0040] En otra forma de realización, la invención se refiere a una composición farmacéutica con un perfil de acción 20 prolongada que comprende un derivado de insulina según la invención.
[0041] En otra forma de realización, la invención se refiere a una composición farmacéutica que es una solución que contiene de aproximadamente 120 nmol/ml a aproximadamente 2400 nmol/ml, de aproximadamente 400 nmol/ml a aproximadamente 2400 nmol/ml, de aproximadamente 400 nmol/ml a aproximadamente 1200 nmol/ml, de
25 aproximadamente 600 nmol/ml a aproximadamente 2400 nmol/ml, o de aproximadamente 600 nmol/ml a aproximadamente 1200 nmol/ml de un derivado de insulina según la invención o de una mezcla del derivado de insulina según la invención con un análogo de insulina de acción rápida.
Datos de hidrofobicidad en derivados de insulina según la invención.
30 [0042] Se midió la hidrofobicidad (índice hidrof�bico) de los derivados de insulina de la invención con respecto a la insulina humana, k'rel, en una columna de HPLC LiChrosorb RP18 (51m, 250x4 mm) por eluci�n isocr�tica a 40 �C usando mezclas de A) 0,1 M de tampón de fosfato sádico, pH 7,3, conteniendo 10% de acetonitrilo, y B) 50% de acetonitrilo en agua como eluyentes. La eluci�n se monitoriz� siguiendo la absorción de UV del eluato a 214 nm. El
35 tiempo cero, to, se descubrió durante la inyección de 0,1 mM de nitrato sádico. El tiempo de retención para la insulina humana, thumana, se ajust� en al menos 2t0 mediante la variación de la proporción entre las soluciones A y B. k'rel = (tderivado -t0)/(thumana -t0). Los k'rel encontrados para varios derivados de insulina según la invención se muestran en la Tabla 1.
40 Tabla 1
Derivado de insulina
k’rel
N�B29-(N-HOOC(CH2)14CO-y-Glu) des(B30) insulina humana
0,87
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-y-Glu) des(B30) insulina humana
1,15
N�B29-(N-HOOC(CH2)8CO-y-Glu) des(B30) insulina humana
0,45
N�B29-(N-HOOC(CH2)26CO-y-Glu-N-(y-Glu) des(B30) insulina humana
1.17
N�B29-(N-(Asp-OC(CH2)16CO)-y-Glu) des(B30) insulina humana
0.70
N�B29-(N-(Glu-OC(CH2)14CO-y-Glu) des(B30) insulina humana
0,33
N�B29-(N-(Glu-OC(CH2)14CO-) des(B30) insulina humana
1,17
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-a-Glu)-N-([-Asp) des(B30) insulina humana
1,11
N�B29-(N-(Gly-OC(CH2)13CO-y-Glu) des(B30) insulina humana
0,58
N�B29-(N-(Sar-OC(CH2)13CO-y-Glu) des(B30) insulina humana
0,63
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-a-Glu)-N-(AspAsp) des(B30) insulina humana
1,07
N�B29-(N-(Gly-OC(CH2)14CO-y-Glu) des(B30) insulina humana
0,88
N�B29-(N-HOOC(CH2)15CO-y-L-Glu) des(B30) insulina humana
1,13
N�B29-(N-HOOC(CH2)14CO-[-L-Asp) Des(B30) insulina humana
0,69
N�B29-(N-HOOC(CH2)13CO-[-L-Glu) des(B30) insulina humana
0,54
N�B29-(N-HOOC(CH2)13CO-[-L-Asp) des(B30) insulina humana
0,47
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-o-L-Aad) des(B30) insulina humana
0,84
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-y-D-Glu) des(B30) insulina humana
1,4
N�B29-(N-HOOC(CH2)15CO-[-L-Asp) des(B30) insulina humana
1,09
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-a-L-Asp) des(B30) insulina humana
1,49
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-a-L-Glu) des(B30) insulina humana
1,51
N�B29-(N-(HOOC(CH2)14CO-�-L-LysCO-) des(B30) insulina humana
0,90
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-[-L-Asp) des(B30) insulina humana
1,54
N�B29-(N-(Gly-OC(CH2)16CO-y-L-Glu) des(B30) insulina humana
1,57
N�B29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(carboximetil)-[-Ala] des(B30) insulina humana
1,13
N�B29-[Na-(HOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-y-L-Glu] des(B30) insulina humana
0,42
Composiciones farmacéuticas
[0043] Las composiciones farmacéuticas que contienen un derivado de insulina según la presente invención se pueden administrar parenteralmente a pacientes que necesitan tal tratamiento. La administración parenteral se puede realizar por inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular mediante una jeringa, opcionalmente una jeringa tipo pluma. Alternativamente, la administración parenteral se puede realizar mediante una bomba de infusión. Otras opciones son la administración de la insulina nasal o pulmonarmente, preferiblemente en composiciones, polvos o líquidos, específicamente diseñados para este propósito.
[0044] Las composiciones inyectables de los derivados de insulina de la invención se pueden preparar usando las técnicas convencionales de la industria farmacéutica que implican la disolución y la mezcla de los ingredientes de forma apropiada para producir el producto final deseado. As�, según un procedimiento, un derivado de insulina según la invención se disuelve en una cantidad de agua que es un tanto inferior al volumen final de la composición que se va a preparar. Se añade un agente isot�nico, un conservante y un tampón según las necesidades y se ajusta el valor de pH de la solución, si se requiere, mediante el uso de un ácido, por ejemplo ácido clorhídrico, o de una base, por ejemplo hidróxido sádico acuoso, según las necesidades. Finalmente, se ajusta el volumen de la solución con agua para producir la concentración deseada de los ingredientes.
[0045] En otra forma de realización de la invención el tampón se selecciona en el grupo que consiste en acetato sádico, carbonato de sodio, citrato, glicil-glicina, histidina, glicina, lisina, arginina, fosfato dihidrogenado de sodio, fosfato hidrogenado de disodio, fosfato sádico y tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido m�lico, succinato, ácido maleico, ácido fum�rico, ácido tartárico, ácido asp�rtico o mezclas de estos. Cada uno de estos tampones específicos constituye una forma de realización alternativa de la invención.
[0046] En otra forma de realización de la invención la formulación comprende también un conservante farmac�uticamente aceptable que se puede seleccionar del grupo que consiste en fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, phidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, alcohol benc�lico, clorobutanol y tiomersal, bronopol, ácido benzoico, imidurea, clorhexidina, deshidroacetato de sodio, clorocresol, p-hidroxibenzoato etílico, cloruro de bencetonio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-1,2-diol) o mezclas de estos. En otra forma de realización de la invención, el conservante est� presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. En otra forma de realización de la invención, el conservante est� presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. En otra forma de realización de la invención, el conservante est� presente en una concentración de 5 mg/ml a 10 mg/ml. En otra forma de realización de la invención, el conservante est� presente en una concentración de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada uno de estos conservantes específicos constituye una forma de realización alternativa de la invención. El uso de un conservante en composiciones farmacéuticas es bien conocido por el experto en la materia. Por conveniencia se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
[0047] En otra forma de realización de la invención, la formulación comprende también un agente isot�nico que se puede seleccionar del grupo que consiste en una sal (p. ej. cloruro sádico), un azúcar o alcohol de azúcar, un amino�cido (p. ej. L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido asp�rtico, tript�fano, treonina), un alditol (p. ej. glicerol (glicerina), 1,2- propanodiol (propilenglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenoglicol (p. ej. PEG400) o mezclas de éstos. Se puede utilizar cualquier azúcar, tal como mono-, di- o polisac�ridos, o glucanos solubles en agua, incluyendo, por ejemplo, fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, almidón soluble, almidón de hidroxietilo y carboximetilcelulosa-Na. En una forma de
realizaci�n, el aditivo de azúcar es sacarosa. El alcohol de azúcar se define como un hidrocarburo C4-C8 con al menos un grupo -OH e incluye por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En una forma de realización, el aditivo de alcohol de azúcar es manitol. Los azúcares o alcoholes de azúcar mencionados más arriba se pueden utilizar individualmente o en combinación. No hay límite fijado que determine la cantidad usada, siempre que el azúcar o el alcohol de azúcar sean solubles en la preparación líquida y no actúen de forma adversa en los efectos estabilizantes conseguidos mediante el uso de los métodos de la invención. En una forma de realización, la concentración de azúcar o de alcohol de azúcar se sitúa entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 150 mg/ml. En otra forma de realización de la invención, el agente isot�nico est� presente en una concentración de 1 mg/ml a 50 mg/ml. En otra forma de realización de la invención, el agente isot�nico est� presente en una concentración de 1 mg/ml a 7 mg/ml. En otra forma de realización de la invención, el agente isot�nico est� presente en una concentración de 8 mg/ml a 24 mg/ml. En otra forma de realización de la invención, el agente isot�nico est� presente en una concentración de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada uno de estos agentes específicos isot�nicos constituye una forma de realización alternativa de la invención. El uso de un agente isot�nico en composiciones farmacéuticas es bien conocido por el experto en la materia. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
[0048] Agentes isot�nicos t�picos son cloruro sádico, manitol, dimetil sulfona y glicerol y unos conservantes t�picos son fenol, m-cresol, p-hidroxibenzoato met�lico y alcohol benc�lico.
[0049] Ejemplos de tampones adecuados son acetato sádico, glicil-glicina, HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1piperazinaetanosulf�nico) y fosfato sádico.
[0050] Una composición para una administración nasal de un derivado de insulina según la presente invención se puede preparar por ejemplo tal y como se describe en la patente europea n�: 272097 (de Novo Nordisk A/S).
[0051] Las composiciones que contienen las insulinas de esta invención se pueden usar para el tratamiento de estados que son sensibles a la insulina. De este modo, se pueden utilizar para el tratamiento de la diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2 e hiperglucemia, por ejemplo, como se ha visto a veces, en personas gravemente heridas y en personas sometidas a una cirugía mayor. El nivel de dosis óptimo para cualquier paciente depender� de una variedad de factores que incluyen: la eficacia del derivado de insulina específico empleado, la edad, el peso corporal, la actividad física y la dieta del paciente, una combinación posible con otros fármacos y la gravedad del estado para ser tratado. Se recomienda que la dosificación diaria del derivado de insulina de esta invención se determine para cada paciente por expertos en la técnica de una manera similar a las composiciones de insulina conocidas.
[0052] En caso de ser conveniente, los derivados de insulina de esta invención se pueden utilizar en una mezcla con otros tipos de insulina, por ejemplo, análogos de insulina con un inicio de acción más rápido. Ejemplos de tales análogos de insulina se describen, por ejemplo, en las solicitudes de patentes europeas cuyos números de publicación son: EP 214826 (Novo Nordisk A/S), EP 375437 (Novo Nordisk A/S) y EP 383472 (Eli Lilly & Co.).
[0053] La presente invención se ilustra más en detalle en los siguientes ejemplos que, no obstante, no se deben interpretar como una limitación del ámbito de la protección.
[0054] La invención se resume en los siguientes párrafos:
1. Derivado de insulina que es des(B30) insulina humana que tiene una cadena lateral unida al grupo �-amino de un residuo de Lys presente en la cadena B de la des(B30) insulina humana, la cadena lateral siendo de la fórmula general:
-W-X-Y-Z
donde W es:
• un residuo de a-amino�cido con un grupo de ácido carbox�lico en la cadena lateral, este amino�cido est� seleccionado del grupo que consiste en a-Asp, -Asp, a-Glu, y-Glu, a-hGlu y o-hGlu y este residuo forma, con uno de sus grupos de ácido carbox�lico, un grupo de amida con el grupo �-amino de un residuo de Lys presente en la cadena B de la des(B30) insulina humana;
X es:
• -CO-;
Y es:
• -(CH2)m donde m es un número entero en el intervalo de 12 a 16; y
Z es:
• -COOH;
5 y cualquier complejo Zn2+ de los mismos.
10. Derivado de insulina según el párrafo 1 seleccionado del grupo que consiste en N�B29-(Na-(HOOC(CH2)14CO)-y-Glu)
des(B30) insulina humana; N�B29-(Na-(HOOC(CH2)15CO)-y-Glu) des(B30) insulina humana; N�B29-(Na-(HOOC(CH2)16CO) (N�B29 N�B29
y-Glu) des(B30) insulina humana;-(Na-(HOOC(CH2)13CO)-P-Asp) des(B30) insulina humana;-(Na10 (HOOC(CH2)13CO)-a-Glu) des(B30) insulina humana; N�B29-(Na-(HOOC(CH2)13CO)-a-Glu) des(B30) insulina humana;
N�B29 N�B29
-
(Na-(HOOC(CH2)16CO)-y-D-Glu) des(B30) insulina humana;-(Na-(HOOC(CH2)14CO)--D-Asp) des(B30) insulina humana; N�B29-(Na-(HOOC(CH2)16CO)--D-Asp) des(B30) insulina humana;
11. Complejo de zinc de un derivado de insulina según cualquiera de los párrafos anteriores donde cada hex�mero de 15 insulina se enlaza a dos iones de zinc, tres iones de zinc o cuatro iones de zinc.
12. Composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes en un paciente que necesita este tratamiento, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un derivado de insulina según el párrafo 1 junto con un soporte farmac�uticamente aceptable.
13. Composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes en un paciente que necesita este tratamiento, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un derivado de insulina según el párrafo 1 en mezcla con una insulina o un análogo de insulina que tiene un inicio de acción rápido, junto con un soporte farmac�uticamente aceptable.
14. Método para tratar la diabetes en un paciente que necesita este tratamiento, que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un derivado de insulina según el párrafo 1 junto con un soporte farmac�uticamente aceptable.
30 15. Método para tratar la diabetes en un paciente que necesita este tratamiento, que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un derivado de insulina según el párrafo 1 en mezcla con una insulina o un análogo de insulina que tiene un inicio de acción rápido, junto con un soporte farmac�uticamente aceptable.
35 DEFINICIONES
[0055] Por "análogo de insulina", como se utiliza en este caso, se entiende un polip�ptido cuya estructura molecular puede derivar formalmente de la estructura de una insulina de origen natural, por ejemplo la estructura de la insulina humana, mediante la eliminación y/o el cambio de al menos un residuo de amino�cido presente en la insulina de origen
40 natural y/o por la adición de al menos un residuo de amino�cido. Los residuos de amino�cidos añadidos y/o cambiados pueden ser residuos de amino�cidos codificables u otros residuos de origen natural o residuos de amino�cidos puramente sintéticos. Ejemplos de análogos de insulina son des(B30) insulina humana; análogos de des(B30) insulina humana.
45 [0056] Por "derivado de insulina", como se utiliza en la presente, se entiende una insulina de origen natural o un análogo de insulina que ha sido modificado químicamente, por ejemplo, por introducción de una cadena lateral en una o más posiciones de la estructura de insulina o por oxidación o reducción de los grupos de residuos de amino�cidos presentes en la insulina o por conversión de un grupo carbox�lico libre en un grupo de éster o por acilaci�n de un grupo amino libre
o grupo hidroxi.
50 [0057] La expresión " amino�cido codificable" o "residuo de amino�cido codificable" se utiliza para indicar un amino�cido
o un residuo de amino�cido que puede ser codificado por un triplete ("cod�n") de nucleótidos.
[0058] hGlu es ácido homoglut�mico.
55 [0059] a-Asp es la forma L de -HNCH(CO-)CH2COOH.
[0060] [-Asp es la forma L de -HNCH(COOH)CH2CO-.
60 [0061] a-Glu es la forma L de -HNCH(CO-)CH2CH2COOH.
[0062] y-Glu es la forma L de -HNCH(COOH)CH2CH2CO
[0063] a-hGlu es la forma L de -HNCH(CO-)CH2CH2CH2COOH. 65
[0064] o-hGlu es la forma L de -HNCH(COOH)CH2CH2CH2CO-.
[0065] [-Ala es -NH-CH2-CH2-COOH.
[0066] Sar es sarcosina (N-metilglicina).
[0067] La expresión "residuo de amino�cido con un grupo de ácido carbox�lico en la cadena lateral" designa residuos de amino�cidos tales como Asp, Glu y hGlu. Los amino�cidos pueden presentar una configuración L o D. Si no se especifica nada, se entiende que el residuo de amino�cido tiene la configuración L.
[0068] La expresión "residuo de amino�cido con una cadena lateral neutra" se refiere a residuos de amino�cidos tales como Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ser, Thr, Cys, Met, Tyr, Asn y Gln.
[0069] Cuando un derivado de insulina según la invención se define como "soluble en valores de pH fisiológicos" significa que el derivado de insulina se puede usar para preparar composiciones de insulina inyectables que se disuelven completamente en valores de pH fisiológico. Tal solubilidad favorable se puede deber a las propiedades inherentes del derivado de insulina solo o bien ser el resultado de una interacción favorable entre el derivado de insulina y uno o más ingredientes contenidos en el vehículo.
[0070] Se ha utilizado las siguientes abreviaturas en la especificación y ejemplos:
Aad: ácido alfa-amino-ad�pico (ácido homoglut�mico) Bzl = Bn: bencilo DIEA: N,N-diisopropiletilamina DMF: N,N-dimetilformamida IDA: ácido iminodiac�tico Sar: sarcosina (N-metil-glicina) tBu: tert-butilo TSTU: O-(N-succinimidil)-1,1,3,3-tetrametiluronio tetrafluoroborato THF: tetrahidrofurano EtOAc: acetato etílico DIPEA: diisopropiletilamina HOAt: 1-Hidroxi-7-azabenzotriazola TEA: trietilamina Su: succinimidil= 2,5-dioxo-pirrolidin-1-il TFA: ácido trifluorac�tico DCM: diclorometano DMSO: dimetil sulf�xido TLC: cromatograf�a en capa fina RT: temperatura ambiente
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
S�ntesis de N�B29-(Na-(HOOC(CH2)14CO)-y-Glu) des(B30) insulina humana
[0071] Se disolvieron 200 mg de des(B30) insulina humana en 10 ml de 50 mM de Na2CO3 (pH 10,2) contenidos en un tubo que se colocó al baño maría a 15�C. El metil hexadecandioil-Glu(OSu)-OMe (37,90 mg, preparado tal y como se describe más abajo), se disolvió en 10 ml de acetonitrilo y posteriormente se a�adi� a la solución de insulina. La reacción se detuvo después de 30 min por la adición de 3,8 ml de 0,2 M de etanolamina ajustada a pH 9,0 con HCl diluido. El rendimiento de la reacción fue de 37% según se determin� por RP-HPLC. El producto se precipit� después de la adición de 2,5 volúmenes de agua y del ajuste de pH a 5,5. El precipitado se disolvió después en 10 ml de agua a pH 8 y se colocó en hielo. A esta solución se le a�adi� 10 ml de 0,2 M de NaOH helado para la saponificaci�n y la mezcla se incub� durante 40 min con enfriamiento en hielo y se ajust� luego a pH 5,5 para precipitar el producto. El precipitado se aisl� y se disolvió en 5 ml de tampón A (véase más adelante) y se diluyó con 33 ml de 42,5% p/p de etanol acuoso dividido entre tres y se sometió a una cromatograf�a de intercambio ani�nico mediante el uso de una columna de intercambio ani�nico Resource™ de 6 ml eluida con un sistema de tampón que consistía en un tampón A: Tris 0,24% p/p, NH4Ac 0,25%, 42% etanol p/p, pH 7,5 y tampón B: Tris 0,24% p/p, NH4Ac 1,25%, 42% etanol p/p pH 7,5. La muestra fue elu�da por un flujo de 6 ml/min en un gradiente de 0 a 100% de tampón B durante 30 min. Las fracciones que contenían el compuesto deseado fueron identificadas por RP-HPLC. El rendimiento del producto deseado era de 15,3 mg (pureza: 72,9%). El volumen de las fracciones agrupadas que contenían el compuesto deseado se redujo a 20 ml en condiciones de vacío y esta solución se sometió después a una purificación por RP-HPLC utilizando una columna HPLC de fase inversa Nucleosil, C4 250/10 mm, 101m, 300A. El sistema de tampón consistía en un tampón A: 10 mM Tris, 15mM (NH4)2SO4, 10% etanol, pH 7,3 y tampón B: 70% vol/vol de etanol.
[0072] El producto se eluy� con un gradiente de 10% a 60% de tampón B durante 120 min en un flujo de 2 ml/min. Las fracciones apropiadas se agruparon y se precipit� y se liofilizó el compuesto. El rendimiento era de 7,7 mg (pureza: 99,4%).
[0073] El peso molecular, determinado por espectroscopia de masas: 6097,2, calculado 6104,1. El p�ptido B-terminal que contiene la cadena lateral se obtuvo después de la digestión con proteasa de Staphylococcus aureus. Peso molecular, determinado por espectroscopia de masas: 1413,1, calculado: 1413,5.
Preparaci�n de metil hexadecandioil-Glu(OSu)-OMe
[0074] Se saponific� hexadecandioato dimet�lico en MeOH usando 1,0 de equivalente de NaOH, y se aisl� el éster mono-met�lico bajo acidificaci�n de HCl por recristalizaci�n de heptano.
[0075] Se disolvió hexadecandioato mono-met�lico (275 mg, 0,91 mmol) en THF (3 ml) y se trat� con succinimidil tetrametiluroniotetrafluoroborato (331 mg, 1,1 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (188 1L, 1,1 mmol) y la mezcla se agit� durante 20 horas. El solvente se elimin� in vacuo y el residuo se disolvió en acetato de etilo y se lav� con 0,1 M de HCl (dos veces) y agua. La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtr� y se evapor� in vacuo para producir 350 mg (96 %) de metil succinimidil hexadecandioato.
[0076] 1H-NMR (CDCl3): 3,66 (s; 3H), 2,83 (s; 4H), 2,60 (t; 2H), 2,30 (t; 2H), 1,74 (p; 2H), 1,62 (p; 2H), 1,40 (m; 2H), 1,35-1,22 (m, 18 H).
[0077] El metil succinimidil hexadecandioato (240 mg, 0,58 mmol) en dimetilformamida (5 ml) se trat� con GluOMe (93 mg, 0,58 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (200 1L, 1,16 mmol). La mezcla se agit� durante 20 horas y se evapor� después in vacuo. El residuo se redisolvi� en acetato de etilo. Mediante el lavado con 0,1 M de HCl y agua, seguido del secado (MgSO4) y la evaporación in vacuo, se produjo 226 mg (88%) de metil hexadecandioil-Glu-OMe. 1H-NMR: 6,22 (d; 1H), 4,65 (m; 1H), 3,76 (s; 3H), 3,66 (s; 3H), 2,42 (t; 2H), 2,29 (m; 4H), 2,22 (t; 2H), 1,97 (m; 2H), 1,62 (m; 4H), 1,35-1,22 (m, 20 H).
[0078] El metil hexadecandioil-Glu-OMe (200 mg, 0,45 mmol) se disolvió en diclorometano (4 ml), se enfri� con un baño de hielo y se trat� con diciclohexilcarbodiimida (93 mg, 0,45 mmol) y N-hidroxisuccinimida (52 mg, 0,45 mmol). La mezcla se agit� durante 20 horas, se filtr� y se evapor� in vacuo, para producir 243 mg (100 %) del intermedio deseado. 1H-RMN (CDCl3): 6,34 (d; 1H), 4,67 (m; 1H), 3,73 (s; 3H), 3,64 (s; 3H), 2,81 (s; 4H), 2,66 (m; 2H), 2,27 (m; 4H), 2,20 (t; 2H), 1,89 (m; 1H), 1,70 (m; 1H), 1,58 (m; 4H), 1,29-1,20 (m, 20 H).
EJEMPLO 2
S�ntesis de N�B29-(Na-(HOOC(CH2)16CO)-y-Glu) des(B30) insulina humana
[0079] 300 mg de des(B30) insulina humana fueron acilados, purificados y aislados como se describe en el Ejemplo 1, excepto que en el presente ejemplo el metil octadecandioil-Glu(OSu)-OMe (preparado como se describe más abajo) se us� como agente acilante en vez del metil hexadecandioil-Glu(OSu)-OMe usado en el Ejemplo 1. Se obtuvo 25,5 mg del compuesto del título (pureza: 97,4%). Peso molecular, determinado por espectroscopia de masas: 6136,6, calculado: 6132. El p�ptido B-terminal que contiene el ligando fue obtenido después de la digestión por proteasa de Staphylococcus aureus. Peso molecular, determinado por espectroscopia de masas: 1439,1, calculado: 1442,5.
Preparaci�n de metil octadecandioil-Glu(OSu)-OMe
[0080] Este compuesto se obtuvo a partir de dimetil octadecandioato en analogía con el derivado de hexadecandioil descrito en el Ejemplo 1. 1H-NMR (CDCl3): 6,20 (d; 1H), 4,70 (m; 1H), 3,78 (s; 3H), 3,67 (s; 3H), 2,84 (s; 4H), 2,70 (m; 2H), 2,30 (m; 4H), 2,22 (t; 2H), 1,93 (m; 1H), 1,70 (m; 1H), 1,62 (m; 4H), 1,33-1,23 (m, 24 H).
EJEMPLO 3
S�ntesis de N�B29-(Na-(HOOC(CH2)16CO)-y-Glu-N-(y-Glu)) des(B30) insulina humana
[0081] De manera similar a lo que se describe en el Ejemplo 1, 300 mg de des(B30) insulina humana fue acilada con metil octadecandioil-Glu(Glu(OSu)-OMe)-OMe. Se realizó la purificación por intercambio ani�nico tal como se ha descrito anteriormente. No obstante, se realizó la eluci�n prolongada con 100% de tampón B a fin de eluir el producto deseado. Las fracciones que contenían el producto deseado se identificaron por RP-HPLC y se obtuvo 47,5 mg con una pureza del 55%. El volumen de las fracciones que contenían el producto deseado se redujo in vacuo y la solución obtenida fue sometida a purificación por RP-HPLC mediante el uso de una columna de HPLC de fase inversa Jupiter, C4 250/10 mm, 10 1m, 300 A de Phenomerex. El sistema de tampón consistía en tampón A: 0,1% TFA, 10% vol/vol
etanol y tampón B: 80% vol/vol etanol. La muestra se eluy� por medio de un gradiente de 40% a 60% de tampón B a 40 �C durante 120 min con un flujo de 2 ml/min. Las fracciones apropiadas se agruparon y se liofilizaron y se obtuvo 31,1 mg del compuesto del título (pureza: 94%).
[0082] Peso molecular del compuesto del título determinado por espectroscopia de masas: 6259,65, calculado: 6261,2. El peso molecular (por espectroscopia de masas) del p�ptido B-terminal que contiene la cadena lateral, obtenido después de la digestión con proteasa de Staphylococcus aureus result� ser 1569,88, calculado: 1569,88.
Preparaci�n de metil octadecandioil-Glu(Glu(OSu)-OMe)-OMe
[0083] El metil octadecandioil-Glu(OSu)-OMe (preparado tal y como se describe en el Ejemplo 2, 200 mg, 0,35 mmol) en dimetilformamida (5 ml) se trat� con GluOMe (62 mg, 0,39 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (90 1L, 53 mmol) y la mezcla se agit� durante 20 horas. El solvente se elimin� in vacuo y el residuo se disolvió en acetato de etilo y se lav� dos veces con 0,2 M HCl, agua y solución salina. Mediante el secado sobre MgSO4 y la evaporación se produjo el metil octadecandioil-Glu(Glu-OMe)-OMe, 180 mg (83 %).
[0084] Se disolvió metil octadecandioil-Glu(Glu-OMe)-OMe (180 mg, 0,29 mmol) en THF (9 ml) y se trat� con succinimidil tetrametiluroniotetrafluoroborato (106 mg, 0,35 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (60 1L, 0,35 mmol). La mezcla se agit� durante toda la noche, se evapor�, se redisolvi� en acetato de etilo y se lav� con 2x 0,1 M HCl y agua. Mediante el secado sobre MgSO4 y la evaporación se produjo 190 mg (93%) del intermedio deseado. 1H-NMR (CDCl3)o: 6,73 (d; 1H), 6,43 (d; 1H), 4,69 (m; 1H), 4,56 (m; 1H), 3,77 (s; 3H), 3,74 (s; 3H), 3,66 (s; 3H), 2,85 (s; 4H), 2,72 (m; 2H), 2,41-2,12 (m; 8H), 2,95 (m; 2H), 1,72-1,56 (m; 6H), 1,35-1,22 (m, 22 H).
EJEMPLO 4
S�ntesis de N�B29(Na-(HOOC(CH2)14CO)-y-L-Glu) des(B30) insulina humana
[0085] Se disolvió des(B30) insulina humana (500 mg, 0,088 mmol) en 100 mM de Na2CO3 (5 ml, pH 10,2) a temperatura ambiente. El tert-butil hexadecandioil-Glu(OSu)-OtBu (66 mg, 0,105 mmol, preparado tal y como se describe más abajo), se disolvió en acetonitrilo (5 ml) y posteriormente se a�adi� a la solución de insulina. Después de 30 min, se agregó 0,2 M de metialemina (0,5 ml). El pH se ajust� por HCl a 5,5 y el precipitado isoel�ctrico se recogió por centrifugado y se secó in vacuo para producir 525 mg. El rendimiento de acoplamiento era del 78% (RP-HPLC, columna C4; tampón A: 10 % MeCN en 0,1 % de TFA-agua, tampón B: 80 % de MeCN en 0,1 % de TFA-agua; gradiente 20% a 90 % B en 16 minutos). El producto protegido se disolvió en TFA (10 ml), se dej� 30 min y se evapor� in vacuo. El producto bruto se disolvió en agua y se liofilizó (610 mg). 0454 se purificó por RP-HPLC en la columna C4, tampón A: 20 % EtOH + 0,1 % TFA, tampón B: 80 % EtOH + 0,1 % TFA; gradiente 15-60 % B, seguido de HPLC en la columna C4, tampón A: 10 mM Tris + 15 mM sulfato de amonio en 20 % EtOH, pH 7,3, tampón B: 80 % EtOH, gradiente 15-60 % B. Las fracciones recogidas se desalaron en el Sep-Pak con 70% de acetonitrilo + 0,1% de TFA, se neutralizaron mediante la adición de amoníaco y se liofilizaron. El rendimiento no optimizado era de 64 mg, 12 %. La pureza evaluada por HPLC era de 99,2 %. LCMS 6102,9; C274H411N65O81S6 requiere 6104,1. El p�ptido B-terminal que comprende la cadena lateral (RGFFYTPK(N�-(Na-(HOOC(CH2)14CO)-y-L-Glu) se obtuvo después de la digestión con proteasa de Staphylococcus aureus. MALDI-MS: 1413,1, calculado: 1412,7.
Preparaci�n de tert-butil hexadecandioil-L-Glu(OSu)-OtBu
[0086] Se suspendió ácido hexadecadioico (40,0 g, 140 mmol) en tolueno (250 ml) y la mezcla se calentó a reflujo. N,Ndimetilformamida di-tert-butil acetal (76,3 g, 375 mmol) se a�adi� gota a gota durante más de 4 horas. La mezcla se sometió a reflujo durante toda la noche. El solvente se elimin� in vacuo a 50 �C y el material bruto se suspendió en DCM/AcOEt (500 ml, 1:1) y se agit� durante 15 min. Los sólidos se recogieron por filtración y se trituraron con DCM (200 ml). El filtrado se evapor� in vacuo para producir mono-tert-butil hexadecandioato bruto, 30 gramos. Este material se suspendió en DCM (50 ml), se enfri� con hielo durante 10 min y se filtr�. El solvente se elimin� in vacuo para producir 25 gramos de mono-tert-butil hexadecandioato crudo, que se recristaliz� a partir de heptano (200 ml) para producir mono-tert-butil hexadecandioato, 15,9 g (33 %). De forma alternativa a la recristalizaci�n, el mono-éster se puede purificar por cromatograf�a de sílice en AcOEt/heptano.1H-NMR (CDCl3)o: 2,35 (t; 2H), 2,20 (t; 2H), 1,65-1,55 (m; 4H), 1,44 (s; 9H), 1,34-1,20 (m, 20 H).
[0087] El mono éster de tert-butilo (2 g, 5,8 mmol) se disolvió en THF (20 ml) y se trat� con TSTU (2,1 g, 7,0 mmol) y DIEA (1,2 ml, 7,0 mmol) y se agit� durante toda la noche. La mezcla se filtr� y el filtrado se evapor� in vacuo. El residuo se disolvió en AcOEt y se lav� dos veces con 0.1 M HCl frío y con agua. Mediante el secado sobre MgSO4 y la evaporación in vacuo se produjo succinimidil tert-butil hexadecandioato, 2,02 g (79%). 1H-NMR (CDCl3)o: 2,84 (s; 4H), 2,60 (t; 2H), 2,20 (t; 2H), 1,74 (p; 2H), 1,56 (m; 2H), 1,44 (s; 9H), 1,40 (m; 2H), 1,30-1,20 (m, 18H)). Se disolvió el succinimidil tert-butil hexadecandioato (1 g, 2,27 mmol) en DMF (15 ml) y se trat� con L-Glu- OtBu (0,51 g, 2,5 mmol) y DIEA (0,58 ml, 3,41 mmol) y la mezcla se agit� durante toda la noche. El solvente se evapor� in vacuo y el producto bruto se disolvió en AcOEt y se lav� dos veces con 0,2M HCl, agua y solución salina. Mediante el secado sobre MgSO4 y la evaporación in vacuo se produjo tert-butil hexadecandioil-L-Glu-OtBu, 1,2 g (100%).
1H-NMR (CDCl3)o: 6,25 (d; 1H), 4,53 (m; 1H), 2,42 (m; 2H), 2,21 (m; 4H), 1,92 (m; 1H), 1,58 (m; 4H), 1,47 (s; 9H), 1,43 (s; 9H), 1,43-1,22 (m, 18H).
[0088] El tert-butil hexadecandioil-L-Glu-OtBu (1,2 g, 2,27 mmol) se disolvió en THF (15 ml) y se trat� con TSTU (0,82 g, 2,72 mmol) y DIEA (0,47 ml, 2,72 mmol) y se agit� durante toda la noche. La mezcla se filtr� y el filtrado se evapor� in vacuo. El residuo se disolvió en AcOEt y se lav� dos veces con 0,1 M HCl frío y con agua. Mediante el secado sobre MgSO4 y la evaporación in vacuo se produjo tert-butil hexadecandioil-L-Glu(OSu)-OtBu, 1,30 g (92%). 1H-NMR (CDCl3)o: 6,17 (d; 1H), 4,60 (m; 1H), 2,84 (s; 4H), 2,72 (m; 1H), 2,64 (m; 1H), 2,32 (m; 1H), 2,20 (m; 4H), 2.08 (m; 1H), 1.6 (m; 4H), 1.47 (s; 9H), 1.43 (s; 9H), 1.33-1.21 (m, 20 H).
EJEMPLO 5
S�ntesis de N�B29-(Na-(HOOC(CH2)16CO)-y-L-Glu) des(B30) insulina humana
[0089] Se disolvió insulina desB30 (50 mg, 9 1mol) en 0,1 M de Na2CO3 acuoso (0,65 ml), pH 10,5. Se disolvió octadecandioil- L-Glu(OSu) (50,1 mg, 9,9 1mol, preparado tal y como se describe más abajo) en acetonitrilo (0,65 ml) y se a�adi� a la solución de insulina; el pH era de 10,3. Después de 30 min, se a�adi� 0,2 M de metialemina (50 1l). El pH se ajust� por HCl a 5,5 y el precipitado isoel�ctrico se recogió por centrifugado y se secó in vacuo. HPLC mostr� que el rendimiento de acoplamiento bruto era del 52% (no optimizado); columna C4; tampón A: 10 % MeCN en 0,1 % TFAagua, tampón B: 80 % MeCN en 0,1 % TFA-agua; gradiente 20% a 90 % B en 16 minutos). El LCMS 6133,2; C276H415N65O81S6 requiere 6132,2.
Preparaci�n de octadecandioil-L-Glu(OSu)
[0090] Se suspendió ácido octadecanodioico (2,5 g, 8,0 mmol) en DCM (60 mL), tratado con trietilamina (1,16 mL, 8,3 mmol) y se enfri� en hielo. Se a�adi� bencilcloroformato (1,14 mL) gota a gota bajo nitrógeno y se agit� la mezcla durante 10 min, cuando se a�adi� DMAP (0,097 g, 0,80 mmol). Después de la agitaci�n de 20 min a 4�C (TLC, 1:1 AcOEt:heptano), la reacción se evapor� hasta quedar seca. El material bruto (3,9 g) se disolvió en DCM (60 ml), se trat� con sílice (15 g) y se evapor�. El sílice se cargó en una columna de sílice (175 g) y el producto se eluy� con AcOEt/heptano 1:7 a 1:1. La evaporación de las fracciones deseadas produjo octadecandioato de mono-bencilo (1,15 g, 36 %). 1H-NMR (CDCl3)o: 7,35 (m; 5H), 5,11 (s; 2H), 2,35 (t; 4H), 1,63 (t; 4H), 1,30-1,22 (m, 24).
[0091] Se disolvió octadecandioato de mono-bencilo en DMF (3,5 mL) y THF (7 mL) y se enfri� con un baño de hielo. Se a�adi� DIEA (0,103 mL) y TSTU y se agit� la mezcla durante 1 h en un baño de hielo y a temperatura ambiente durante toda la noche. El solvente se evapor� in vacuo y el residuo se disolvió en AcOEt y se lav� dos veces con 0,2 N HCl, NaHCO3 saturado, éste se secó, se filtr� y se evapor� hasta quedar seco para producir succinimidil mono-bencil octadecandioato (0,25 g, 100 %). 1H-NMR (CDCl3)o: 7,35 (m; 5H), 5,11 (s; 2H), 2,83 (s; 4H), 2,60 (t; 2H), 2,35 (t; 2H), 1,80-1,60 (m; 4H), 1,40-1,20 (m, 24).
[0092] Se disolvió succinimidil mono-bencil octadecandioato (95 mg, 0,19 mmol) en DMF (1,5 ml) y se trat� con L-Glu- OBzl (49 mg, 0,21 mmol) y DIEA (50 l, 0,28 mmol) y la mezcla se agit� durante toda la noche. El solvente se evapor� in vacuo y el producto bruto se disolvió en AcOEt y se lav� dos veces con 0,2M HCl, agua y solución salina. Mediante el secado sobre MgSO4 y la evaporación in vacuo se produjo BzIO-octadecandioil-L-Glu-OBzl, 114 mg (97%). 1H-NMR (CDCl3) o: 7,35 (m; 5H), 6,22 (d; 2H), 5,17 (s; 2H), 5,11 (s; 2H), 4,71 (m; 1H), 2,37 (m; 4H), 2,22 (m; 3H), 1,98 (m; 1H), 1,63 (m; 4H), 1,31-1,20 (m, 24H).
[0093] Se disolvió BzIO-octadecandioil-L-Glu-OBzl (110 g, 0,18 mmol) en THF (2 ml) y se trat� con TSTU (64 mg, 0,21 mmol) y DIEA (36 1l, 0,21 mmol) y se agit� durante toda la noche. La mezcla se filtr� y el filtrado se evapor� in vacuo. El residuo se disolvió en AcOEt y se lav� dos veces con 0,1 M HCl frío y agua. Mediante el secado sobre MgSO4 y la evaporación in vacuo se produjo BzIO-octadecandioil-L-Glu(OSu)-OBzl, 119 g (94%). 1H-NMR (CDCl3)o: 7,36 (m; 5H), 6,40 (d; 2H), 5,19 (s; 2H), 5,11 (s; 2H), 4,75 (m; 1H), 2,82 (s; 4H), 2,68 (m; 1H), 2,59 (m; 1H), 2,35 (t; 2H), 2,19 (t; 2H), 1,62 (m; 4H), 1,32-1,21 (m, 24H).
[0094] Se disolvió BzIO-octadecandioil-L-Glu(OSu)-OBzl (59 mg, 0,082 mmol) en acetona/0,1 % TFA (1 ml). Se a�adi� Pd/C (20 mg). El matraz se evacu� y se rellen� varias veces con N2 y se conect� un globo lleno de H2. La mezcla se agit� a temperatura ambiente durante 3 h y se filtr� después a través de celita. Con la precipitación a partir de heptano y la evaporación de solventes residuales se produjo octadecandioil-L-Glu(OSu) (27 mg, 61%). 1H-NMR (CDCl3)o: 6,32 (d; 1H), 4,70 (m; 1H), 3,70 (m; 1H), 3,06 (m; 2H), 2,88 (s; 4H), 2,62 (m; 2H), 2,35 (m; 2H), 2,24 (m; 1H), 1,74 (m; 1H), 1,64 (m; 2H), 1,50-1,20 (m, 26 H).
EJEMPLO 6
S�ntesis de N�B29-(N-(L-Asp-OC(CH2)16CO)-y-L-Glu) des(B30) insulina humana
[0095] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de L-Asp(OtBu)-OtBu con succinimidil octadecandioato seguido de la activación con TSTU, reacción con L-GluOtBu, activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6247,5, calculado 6247,3.
EJEMPLO 7
S�ntesis de N�B29-(N-(L-Glu-OC(CH2)14CO-y-L-Glu) des(B30) insulina humana
10 [0096] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de L-Glu(OtBu)-OtBu con succinimidil hexadecandioato seguido de la activación con TSTU, reacción con L-GluOtBu, activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6261,3, calculado 6261,3.
EJEMPLO 8
15 Síntesis de N�B29-(N-(L-Glu-OC(CH2)14CO-) des(B30) insulina humana
[0097] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de L-Glu(OtBu)-OtBu con succinimidil hexadecandioato seguido de la activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y 20 desprotecci�n por TFA. LCMS 6130,8, calculado 6132,2.
EJEMPLO 9
S�ntesis de N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-a-L-Glu)-N-([-L-Asp) des(B30) insulina humana
25 [0098] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil succinimidil octadecandioato con L-Glu(OtBu) seguido de la activación con TSTU, reacción con L-AspOtBu, activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6246,9, calculado 6247,3.
30 EJEMPLO 10
S�ntesis de N�B29-(N-HOOC(CH2)15CO-y-L-Glu) des(B30) insulina humana
[0099] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil succinimidil
35 heptadecandioato (A.C. Cope, U. Axen, E.P. Burrows, J. Weinlich, J. Am. Chem Soc. 1966, 88, 4228) con L-GluOtBu seguido de la activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6118,3, calculado 6118,1.
EJEMPLO 11
40 Síntesis de N�B29-(N-(Gly-OC(CH2)13CO-y-L-Glu) des(B30) insulina humana
[0100] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de L-GlyOtBu con succinimidil pentadecandioato seguido de la activación con TSTU, reacción con L-GluOtBu, activación con TSTU, acoplamiento con 45 des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6147,5, calculado 6147,1.
EJEMPLO 12
S�ntesis de N�B29-(N-(L-Sar-OC(CH2)13CO-y-L-Glu) des(B30) insulina humana
50 [0101] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de L-Sar-OtBu con succinimidil octadecandioato, seguido de la activación con TSTU, reacción con L-GluOtBu, activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6161,0, calculado 6161,1.
55 EJEMPLO 13
S�ntesis de N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-a-L-Asp)-N-([-L-Asp) des(B30) insulina humana
[0102] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil succinimidil 60 octadecandioato con L-Asp(OtBu) seguido de la activación con TSTU, reacción con L-AspOtBu, activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6233,8, calculado 6233,2.
EJEMPLO 14
65 Síntesis de N�B29-(N-(Gly-OC(CH2)14CO-y-L-Glu) des(B30) insulina humana [0103] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de L-GlyOtBu con succinimidil hexadecandioato seguido de la activación con TSTU, reacción con L-GluOtBu, activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6160,7, calculado 6161,1.
EJEMPLO 15
S�ntesis de N�B29-(N-HOOC(CH2)14CO-[-L-Asp) des(B30) insulina humana
10 [0104] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil succinimidil hexadecandioato con L-AspOtBu seguido de la activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6089,8, calculado 6089,8.
EJEMPLO 16
15 Síntesis de N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-[-L-Asp) des(B30) insulina humana
[0105] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil succinimidil octadecandioato con L-AspOtBu seguido de la activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y
20 desprotecci�n por TFA. LCMS 6117,8, calculado 6118,1.
EJEMPLO 17
S�ntesis de N�B29-(N-(Gly-OC(CH2)16CO-y-L-Glu) des(B30) insulina humana
25 [0106] Este compuesto se prepar� en analogía con el Ejemplo 4, mediante la reacción de L-GlyOtBu con succinimidil octadecandioato seguido de la activación con TSTU, reacción con L-GluOtBu, activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6189,2, calculado 6189,2.
30 EJEMPLO 18
S�ntesis de N�B29-(N-(HOOC(CH2)14CO -�-L-LysCO-) des(B30) insulina humana
[0107] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil succinimidil
35 hexadecandioato con L-Lys(Z)-OtBu, seguido de la hidrogenación sobre Pd/C y la activación in situ por 4-nitrofenil cloroformato, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6189,2, calculado 6189,2.
EJEMPLO 19
40 Síntesis de N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-a-L-Glu) des(B30) insulina humana
[0108] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil succinimidil octadecandioato con L-Glu(OtBu) seguido de la activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6132,1, calculado 6132,2.
EJEMPLO 20
S�ntesis de N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-a-L-Asp) des(B30) insulina humana
50 [0109] Este compuesto se prepar� en analogía con el Ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil succinimidil octadecandioato con L-Asp(OtBu), seguido de la activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6117,8, calculado 6118,1.
EJEMPLO 21
55 Síntesis de N�B29-(N-HOOC(CH2)15CO-[-L-Asp) des(B30) insulina humana
[0110] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil succinimidil heptadecandioato con L-AspOtBu, seguido de la activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y
60 desprotecci�n por TFA. LCMS 6104,2, calculado 6104,1.
EJEMPLO 22
S�ntesis de N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-y-D-Glu) des(B30) insulina humana 65
[0111] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil succinimidil octadecandioato con D-GluOtBu, seguido de la activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6132,4, calculado 6132,2.
5 EJEMPLO 23
S�ntesis de N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-o-L-Aad) des(B30) insulina humana
[0112] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil succinimidil
10 octadecandioato con L-AadOtBu (obtenido a partir de L-Aad(OMe) comercial por tert-butilaci�n con AcOtBu/BF3.OEt2 y saponificaci�n del éster met�lico), seguido de la activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6116,9, calculado 6118,1.
EJEMPLO 24
15 Síntesis de N�B29-(N-HOOC(CH2)13CO-[-L-Asp) des(B30) insulina humana
[0113] Este compuesto se prepar� en analogía con el Ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil succinimidil pentadecandioato con L-AspOtBu, seguido de la activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y
20 desprotecci�n por TFA. LCMS 6074,7, calculado 6076,1.
EJEMPLO 25
S�ntesis de N�B29-(N-HOOC(CH2)13CO-[-L-Glu) des(B30) insulina humana
25 [0114] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil succinimidil pentadecandioato con L-GluOtBu, seguido de la activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. MALDI-MS 6080,6, calculado 6076,1.
30 EJEMPLO 26
S�ntesis de N�B29-(N-HOOC(CH2)14CO-[-D-Asp) des(B30) insulina humana
[0115] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil succinimidil
35 hexadecandioato con D-AspOtBu, seguido de la activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6089,1, calculado 6090,1.
EJEMPLO 27
40 Síntesis de N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-[ -D-Asp) des(B30) insulina humana
[0116] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil succinimidil octadecandioato con D-AspOtBu, seguido de la activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6117,1, calculado 6118,1.
EJEMPLO 28
S�ntesis de N�B29-(N-HOOC(CH2)14CO-IDA) des(B30) insulina humana
50 [0117] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 4, mediante la reacción de tert-butil 3,4-dihidro-4-oxo1,2,3- benzotriacina-3-il hexadecandioato con ácido iminodiac�tico, seguido de la activación con TSTU, acoplamiento con des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. LCMS 6089,1, calculado 6090,1.
EJEMPLO 29
55 Síntesis de N�B29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(carboximetil)-[-Ala] des(B30) insulina humana
[0118] La A1 N, B1N-diBoc DesB30 insulina humana (Kurtzhals P; Havelund S; Jonassen I; Kiehr B; Larsen UD; Ribel U; Markussen J Biochemical Journal, 1995, 312, 725-731) (186 mg, 0,031 mmol) se disolvió en DMSO (1,8 ml). Una
60 solución de tert-butil octadecandioil-N-(tert-butoxicarbonilmetil)-[-Ala-OSu (27 mg, 0,04 mmol) en THF (1,8 ml) y se a�adi� trietilamina (0,045 ml, 0,31 mmol) (el pH fue 10). Después de una agitaci�n lenta a temperatura ambiente durante 45 min, la reacción se enfri� con 0,2M de metilamina en THF (0,20 ml). Se a�adi� agua (5 ml) y el pH se ajust� a 5,5 con 1 N de HCl. El precipitado isoel�ctrico se recogió por centrifugado y se liofilizó para producir 150 mg. El rendimiento de acoplamiento era del 74% (LCMS m/z: 2148,9 [(M+3)/3], rt 5,04). El producto protegido se disolvió en
65 TFA (2,5 ml) se dej� durante 1 h y se evapor� in vacuo. El producto bruto se purificó por RP-HPLC en la columna C4,
tamp�n A: 0,1 % TFA, tampón B: MeCN + 0,1 % TFA; gradiente 10-70 % B. Las fracciones recogidas se liofilizaron. El rendimiento era de 75 mg, 52 %. La pureza determinada por HPLC era de 97,2 %. MALDI-MS: 6132,1, calculado: 6132,2.
Preparaci�n de tert-butil octadecandioil-N-(tert-butoxicarbonilmetil)-[-Ala-OSu
[0119] Se disolvió ácido octadecanodioico (5,64 g, 17. 9 mmol) en tolueno (80 ml) a 115�C. Se a�adi� N,Ndimetilformamida di-tert-butilacetal (12,9 ml, 53,8 mmol) gota a gota durante 1,5 h. Después del reflujo durante 3 h, se a�adi� más N, N-dimetilformamida di-tert-butilacetal (2,15 ml) durante 20 min. El reflujo continu� durante toda la noche y se a�adi� más N, N-dimetilformamida di-tert-butilacetal (2,15 ml) durante 20 min. Después de la agitaci�n durante otras 2 h., la mezcla reactiva se enfri� a temperatura ambiente. Se a�adi� agua y DCM. El di�cido se elimin� por filtración. El filtrado se concentr� en gel de sílice (40 g) y se purificó en una columna de silicagel de 1,5 L usando DCM/MeOH 14:1. Se aisl� el mono-tert-butil éster de ácido octadecanodioico en 53% de rendimiento (3,52 g). LC-MS: 393 (M+Na), rt 6,40. 1H-NMR (DMSO-d6): o 1,22 (br s, 24H), 1,38 (s; 9H),1,47 (m; 4H), 2,14 (t.2H), 2,18 ppm (t, 2H).
[0120] A una solución de octadecanedioato mono-tert-but�lico (1,00 g, 2,7 mmol) en THF seco (8 ml), se a�adi� DIPEA (0,555 ml, 3,2 mmol) seguido de TSTU (1,00 g, 3,2 mmol). La mezcla reactiva se agit� bajo nitrógeno durante 18 h. El solvente se había evaporado. AcOEt se a�adi� al residuo y la suspensión resultante se filtr�. El filtrado se lav� con 0,1 M de HCl frío (2x) y agua, se secó y se concentr� para producir succinimidil tert-butil octadecandioato en forma de sólido blanco. 1H-NMR (CDCl3): o 1,25 (m s, 20H), 1,39 (m, 2H)1,44 (s; 9H),1,58 (m; 4H), 1,74 (p; 2H), 2,2 (t.2H), 2,60 (t; 2H), 2,85 ppm (m, 2H).
[0121] A una suspensión de H-Gly-OtBu (1,00 g, 6,0 mmol) en seco DMF (6 ml) se a�adi� trietilamina (0,835 ml, 6,0 mmol). Se observ� una precipitación de hidrocloruro de trietilamina. Se a�adi� una solución de acrilato de bencilo (0,910 ml, 6,0 mmol) en DMF (6 ml). Se agit� la suspensión obtenida a temperatura ambiente durante 2 días. El precipitado se elimin� por filtración y se concentr� el filtrado. El residuo se disolvió en AcOEt y se lav� con NaHCO3 saturado. La capa orgánica se secó (MgSO4), se filtr� y se concentr� para producir un aceite claro, que se purificó por cromatograf�a flash mediante el uso de AcOEt/heptano 1:3 y 1:1 en forma de eluyente. Se aisl� el N-tert-butoxicarbonilmetil)-[-Ala-OBn en un rendimiento de 29% (0,505 g). 1H-NMR (CDCl3)o: ppm 1,43 (s; 9H), 2,55 (t; 2H), 2,92 (t; 2H), 3,30 (s; 2H), 5,15 (s; 2H), 7,65 (m, 5H).
[0122] El succinimidil tert-butil octadecandioato (0,15 g, 0,32 mmol) y N-(tert-butoxicarbonilmetil)-[-Ala-OBn (0,10 g, 0,32 mmol) se disolvió en DMF seco (2,5 ml), se a�adi� DIEA (0,070 ml, 0,38 mmol). Después de una agitaci�n bajo nitrógeno durante 30 min, se a�adi� HOAt (0,045 g, 0,32 mmol) y la mezcla se volvió amarilla. Se continu� la agitaci�n a temperatura ambiente bajo nitrógeno por cuestiones prácticas durante 13 días. La mezcla reactiva se concentr�. El residuo se disolvió en AcOEt, se lav� con 0,1 N HCl (2x) y con agua, se secó (Na2SO4) y se concentr� para producir tert-butil octadecandioil-N-(tert- butoxicarbonilmetil)-[-Ala-OBn en forma de aceite blanco. 205 mg, rendimiento de 99%. 1H-NMR (CDCl3)o: ppm 1,25 (m; 26H), 1,45 (s; 9H), 1,50 (s; 9H), 1,6 (m; 4H), 2,20 (t; 2H), 2,40 (t; 2H), 2,75 (q; 2H), 3,62 (t; 2H), 3,97 (s; 2H), 5,20 (s, 2H); 7,35 (m; 5H)
[0123] El tert-butil octadecandioil-N-(tert-butoxicarbonilmetil)-[-Ala-OBn (200 mg, 0,31 mmol) se disolvió en EtOAc (10 ml) y THF (5 ml). Se a�adi� 10% de Pd/C y la mezcla se hidrogen� a 1 atm durante 16 h. La mezcla reactiva se filtr� y se concentr� para producir tert-butil octadecandioil-N-(tert-butoxicarbonilmetil)-[-Ala-OH en forma de aceite claro. Rendimiento 180 mg, 100%. 1H-NMR (CDCl3)o: ppm 1,25 (m; 26H), 1,45 (s; 9H), 1,50 (s; 9H), 1,6 (m; 4H), 2,20 (t; 2H), 2,40 (t; 2H), 2,70 (m; 2H), 3,65 (m; 2H), 4,05 (s, 2H).
[0124] El tert-butil octadecandioil-N-(tert-butoxicarbonilmetil)-[-Ala-OH (0,110 g, 0,2 mmol) se disolvió en THF seco (2 ml). DIEA (0,045 ml, 0,24 mmol) y TSTU (0,075 g, 0,24 mmol) se añadieron. La mezcla se agit� bajo nitrógeno durante 18 h. La mezcla reactiva se filtr�. Se a�adi� AcOEt al filtrado y se lav� con 0,2 M HCl (2x), solución salina (1x), se secó (Na2SO4) y se concentr� para producir tert-butil octadecandioil-N-(tert-butoxicarbonilmetil)-[-Ala-OSu en forma de jarabe claro. Rendimiento 124 mg, 96%. 1H-NMR (CDCl3)o: ppm 1,25 (m; 26H), 1,40 (s; 9H), 1,57 (s; 9H), 1,6 (m; 4H), 2,40 (m; 4H), 2,58 (br s, 4H), 3,0 (t; 2H), 3,7 (t; 2H), 4,03 (s, 2H).
Ejemplo 30
S�ntesis de N�B29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(2-carboxietil)-Gly] des(B30) insulina humana
[0125] La A1N, B1N-diBoc desB30 insulina humana (Kurtzhals P; Havelund S; Jonassen I; Kiehr B; Larsen UD; Ribel U; Markussen J Biochemical Journal, 1995, 312, 725-731) (120 mg, 0,020 mmol) se disolvió en DMSO (1,2 ml). Se a�adi� una solución de tert-butil octadecandioil-N-(2-(tert-butoxicarbonil)etil)-Gly-OSu (16 mg, 0,025 mmol) en THF (1,2 ml) y trietilamina (0,033 ml, 0,24 mmol) (el pH era de 10). Después de una agitaci�n lenta a temperatura ambiente durante 3h y 20 min, se a�adi� agua (4 ml) y el pH se ajust� a 5,5 con 1 N de HCl. El precipitado isoel�ctrico se recogió por
centrifugado, se lav� con agua y se aisl� por centrifugado. El producto se liofilizó. El producto bruto se purificó por RP-HPLC en columna C18, tampón A: 0,1 % TFA, tampón B: MeCN + 0,1 % TFA; gradiente 20-90 % B. Las fracciones recogidas se liofilizaron. El rendimiento de acoplamiento no optimizado era de 15 mg, 11% (MALDI-MS 6441, calculado: 6444,5). El producto protegido se disolvió en TFA (1 ml) y se dej� durante 1 h y se evapor� in vacuo. El producto bruto se purificó por RP-HPLC en columna C4, tampón A: 0,1 % TFA, tampón B: MeCN + 0,1 % TFA; gradiente 10-80 % B, y por RP-HPLC en columna C4, tampón A: 20 % EtOH + 0,1 % TFA, tampón B: 80 % EtOH + 0,1 % TFA; gradiente 15-60 % B, seguido de HPLC en columna C4, tampón A: 10 mM Tris + 15 mM sulfato de amonio en 20 % EtOH, pH 7,3, tampón B: 80 % EtOH, gradiente 15-60 % B. Las fracciones recogidas se desalaron en Sep-Pak con 70% de acetonitrilo
+ 0,1% de TFA, se neutralizaron por adición de amoníaco y se liofilizaron. El rendimiento no optimizado era de 1,8 mg, 13 %. La pureza determinada por HPLC era de 96,4 %. MALDI: 6132,1, calculado: 6132,2.
Preparaci�n de tert-butil octadecandioil-N-(2-(tert-butoxicarbonil)etil)-Gly-OSu
[0126] H-Gly-OBn, HCl (3,03 g, 15 mmol) se disolvió en DMF seco (15 ml) y se enfri� en un baño de hielo. Se a�adi� TEA (2,10, 15 mmol) bajo precipitación de TEA-hidrocloruro. La suspensión se agit� durante 5 min antes de la adici�nn de acrilato de t-butilo (2,20 ml, 15 mmol). Se dej� el baño de enfriamiento hasta alcanzar lentamente la temperatura ambiente y se continu� la agitaci�n bajo nitrógeno durante 2 días. La mezcla reactiva se filtr� y se concentr� el filtrado. El residuo, que seguía conteniendo DMF, se disolvió en AcOEt y se lav� con NaHCO3 saturado acuoso (2x) y con agua (1x). La capa orgánica se filtr� antes de su secado (Na2SO4) y concentración para obtener un aceite amarillo. La purificación por cromatograf�a flash o HPLC preparatoria produjo N-(2-(tert-butoxicarbonil)etil)-Gly-OBn en forma de aceite claro (0,739 g, 17%).1H-NMR (CDCl3)o: ppm 1,46 (s; 9H) 2,50 - 2,61 (m, 2H) 2,82 - 2,99 (m; 2H) 3,31 (s, 2H) 5,14 (s; 2H) 7,29 - 7,43 (m, 5 H).
[0127] Se suspendió N-(2-(tert-butoxicarbonil)etil)-Gly-OBn (0,030 g, 0,1 mmol) y succinimidil tert-butiloctadecanedioato (descrito en el ejemplo 29, 0,050 mg, 0,1 mmol) en DMF seco (1 ml). Se a�adi� HOAt (0,014 g, 0,1 mmol) y DIEA (0,21 ml, 1,2 mmol). Se agit� la mezcla reactiva amarilla bajo nitrógeno durante 42 h. La mezcla reactiva se concentr�. El residuo se redisolvi� en AcOEt y se lav� con 0,1 N HCl (2x), agua (1x), se secó (Na2SO4) y se concentr� para obtener tert-butil octadecandioil-N-(2-(tert-butoxicarbonil)etil)-Gly-OBn en un rendimiento de 85% (55 mg).1H-NMR (CDCl3) o: ppm 1,3 (m; 26H) 1,38 (s, 9H), 1,46 (s, 9 H), 1,6 (m; 4H), 2,2 (m; 2H), 2,35 (m, 2 H), 2,65 (m; 2H), 2,85 (s, 2 H) 3,65 (m; 2H), 5,15 (s, 2 H) 7,35 (m, 5 H).
[0128] Se disolvió tert-butil octadecandioil-N-(2-(tert-butoxicarbonil)etil)-Gly-OBn (0,054 g, 0,08 mmol) en THF (2 ml). Se a�adi� 10% de paladio en carbón y la mezcla se hidrogen� en 1 atm y a temperatura ambiente durante todo el fin de semana. La mezcla reactiva seca se disolvió en AcOEt y se filtr� 3 veces para eliminar el carbono. El filtrado se concentr� para producir tert-butil octadecandioil-N-(2-(tert-butoxicarbonil)etil)-Gly-OH en un rendimiento del 80% (37 mg).1H-NMR (CDCl3)o: ppm 1,3 (m; 26H) 1,40 (s, 9H), 1,46 (s, 9 H), 1,6 (m; 4H), 1,75 (p; 2H), 2,2 (m; 2H), 2,35 (m, 2 H), 2,63 (m; 2H), 2,83 (s, 2 H).
[0129] El tert-butil octadecandioil-N-(2-(tert-butoxiocarbonil)etil)-Gly-OH (0,07 mmol) se disolvió en THF seco (2 ml). Se a�adi� TSTU (24 mg, 0,08 mmol) y DIPEA (15 uL, 0,08 mmol). La mezcla se agit� a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Después de 19 h, la reacción no había finalizado según TLC (DCM/MeOH 10:1). Se a�adi� más DIEA (20 uL, 0,11 mmol) y se continu� la agitaci�n. Después de 42 h, la mezcla reactiva se filtr�. El filtrado se diluyó con AcOEt y se lav� con 0,1 N HCl (2x) y una solución salina (1x), se secó (Na2SO4) y se concentr� para producir tert-butil octadecandioil-N-(2-(tert- butixocarbonil)etil)-Gly-OSu en forma de sólido blanco en un rendimiento del 84% (36 mg).1H-NMR (CDCl3) o: ppm 1,3 (m; 26H) 1,40 (m, 2H), 1,44 (s; 9H), 1,46 (s, 9 H), 1,58 (m; 2H), 1,73 (p; 2H), 2,2 (t; 2H), 2,60 (t; 2H), 2,8 (m, 6 H).
EJEMPLO 31
S�ntesis de N�B29-[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(carboxietil)-Gly] des(B30) insulina humana
[0130] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 30, mediante la reacción de N-(2-(tert-butoxicarbonil)etil)- Gly-OBn con succinimidil hexadecandioato (descrito en el ejemplo 4), seguido de una desbencilaci�n, activación con TSTU, acoplamiento con A1N,B1N-diBOC-Des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. MALDI-MS: 6093,0, calculado 6104,1.
EJEMPLO 32
S�ntesis de N�B29-[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(carboximetil)-[-Ala] des(B30) insulina humana
[0131] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 29 mediante la reacción de N-(tert-butoxicarbonilmetil)-[- Ala-OBn con succinimidil hexadecandioato (descrito en el ejemplo 4), seguido de una desbencilaci�n, activación con TSTU, acoplamiento con A1N, B1N-diBOC-Des(B30) insulina humana y desprotecci�n por TFA. MALDI-MS: 6097,6, calculado 6104,1.
EJEMPLO 33
S�ntesis de N�B29-[Na-(HOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-y-L-Glu] des(B30) insulina humana
5 [0132] Este compuesto se prepar� de forma similar a lo que se describe en el ejemplo 1, mediante el uso de (MeOOC CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-Glu(OSu)-OMe, preparado tal y como se describe más abajo, en forma de agente acilante. LCMS (electroespray): M+3: 2049, calculado 2050 M+4: 1538, calculado 1537,8 M+5: 1231, calculado 1230,4. MALDI-TOF MS: calculado: 6147; determinado: 6153.
10 Preparación de (MeOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-Glu(OSu)-OMe
[0133] Se enfri� MeOH (40 ml) a 0-5 �C y se a�adi� gota a gota SOCl2 (4 ml) en agitaci�n durante 30 minutos. Se a�adi� ácido 12-aminododecan�ico (3 g, 13,9 mmol) y se agit� la suspensión obtenida a 0-5 �C mientras que el hielo del
15 baño de enfriamiento se derret�a y permitía el calentamiento a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla se filtr� y el sólido se secó por succión para proveer 2,23 g (60%) de hidrocloruro de éster met�lico de ácido 12aminododecan�ico. Se aisl� otro lote del licor madre de 0,92 g (25%).1H-NMR (DMSO-d6) o: 7,97 (bs; 3H), 3,58 (s; 3H), 2,73 (m, 2H, 2,28 (t; 2H), 1,52 (m; 4H), 1,25 ("s", 14H).
20 [0134] El hidrocloruro de éster met�lico de ácido 12-aminododecanoico (1 g, 3,8 mmol) se suspendió en THF (15 ml) y se a�adi� anh�drido de ácido glut�rico (1,29 g, 3,8 mmol) y TEA (0,52 ml, 3,8 mmol) y la mezcla resultante (suspensión) se agit� a temperatura ambiente durante 16 horas. Se a�adi� agua (75 ml) gradualmente. Después de 25 ml, se obtuvo una solución y más tarde apareció una suspensión. La mezcla se agit� a temperatura ambiente durante 1 hora y se filtr�. El sólido se lav� con agua y se secó in vacuo. Esto produjo 1,02 g (80%) de éster met�lico de ácido dodecanoico
25 12-(4-carboxibutirilamino). 1H-NMR (DMSO-d6)o: 12 (bs; 1H), 7,73 (t; 1H), 3,57 (s; 3H), 3,00 (q; 2H), 2,28 (t; 2H), 2,18 (t; 2H), 2,06 (t; 2H), 1,69 (p; 2H), 1,50 (p; 2H), 1,36 (p; 2H),1,23 ("s", 14H).
[0135] El éster met�lico de ácido dodecan�ico 12-(4-carboxibutirilamino) (0,33 g, 0,95 mmol) se disolvió en una mezcla 30 de THF y DMF (2:1,6 ml) y se a�adi� DIEA (0,178 ml, 1,04 mmol). La mezcla se enfri� a 0-5 �C y se a�adi� TSTU
(0.314 g, 1.04 mmol). La mezcla se agit� a 0-5 �C durante 1 hora y a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla se concentr� hasta su secado in vacuo. El residuo (éster met�lico ácido dodecan�ico OSu-activado 12-(4carboxibutirilamino)) se disolvió en DMF (10 ml) y se a�adi� DIEA (0,24 ml, 1,4 mmol) y H-Glu-OMe (0,168 g, 1,04 mmol) y la mezcla se agit� a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla se concentr� in vacuo y el residuo se
35 disolvió en AcOEt (100 ml) y se lav� con 0,2M de ácido clorhídrico (3 x 50 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO4) y se concentr� in vacuo. Esto produjo 0,358 g (78%) de (MeOOC CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-Glu-OMe. 1H-NMR (DMSO-d6), o: 12 (bs; 1H), 8,22 (d; 1H), 7,73 (t; 1H), 4,24 (m; 1H), 3,61 (s; 3H), 3,57 (s; 3H), 3,00 (q; 2H), 2,27 (m; 4H), 2,10 (t; 2H), 2,04 (t; 2H), 1,9 (m; 1H), 1,8 (m; 1H), 1,68 (t; 2H), 1,50 (m; 2H), 1,36 (m; 2H), 1,23 ("s", 14H).
40 [0136] (MeOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-Glu-OMe (0,36 g, 0,36 mmol) se disolvió en THF (10 ml) y se enfri� a 0-5 �C. Se a�adi� DIEA (0,13 ml) y TSTU (0,129 g, 0,43 mmol) y la mezcla se agit� a 0-5 �C durante unas horas y a temperatura ambiente durante 3 días. La mezcla se concentr� in vacuo. El residuo se disolvió en AcOEt (100 ml) y se lav� con 0,2N de ácido clorhídrico (3 x 50 ml) y NaHCO3 saturado acuoso (3 x 100 ml). Se secó (Na2SO4) y la concentración in vacuo proporcion� 0,17 g (84%) de (MeOOC CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-Glu(OSu)-OMe.
45 1H-NMR (DMSO-d6), picos seleccionados, o: 8,27 (d; 1H), 7,72 (t; 1H), 4,31 (m; 1H), 3,63 (s; 3H), 3,57 (s; 3H), 3,00 (q; 2H), 2,81 (s; 4H), 2,28 (t; 2H), 2,12 (t; 2H), 2,05 (t; 2H), 1,70 (m; 2H), 1,50 (m; 2H), 1,35 (m; 2H), 1,23 ("s", 14H).
EJEMPLO 34
50 Síntesis de N�B29-[Na-(HOOC(CH2)11)NHCO(CH2)2CO)-y-L-Glu] des(B30) insulina humana
[0137] Este compuesto se prepar� de forma similar a lo que se describe en el ejemplo 1 mediante el uso de (MeOOC(CH2)11)NHCO(CH2)2CO)-Glu(OSu)-OMe, el cual a su vez se prepar� de forma similar a lo que se describe en el ejemplo 33, mediante el uso de anh�drido de ácido succ�nico en vez de anh�drido de ácido glut�rico como agente
55 acilante. MALDI-TOF MS: calculado: 6133: determinado: 6134.
EJEMPLO 35
60 Síntesis de N�B29-[ Na-(HOOC(CH2)16CO)]-Gly-y-L-Glu des(B30) insulina humana
[0138] Este compuesto se prepar� de forma similar a lo que se describe en el ejemplo 4, usando tert-butil octadecandioil-Gly-Glu(OSu)-OtBu, preparado tal y como se describe más abajo, en forma de agente acilante.
65 [0139] MALDI-TOF MS: calculado: 6189: determinado: 6191.
Preparaci�n de tert-butil octadecandioil-Gly-Glu(OSu)-OtBu
[0140] A Z-Gly-OH (1,0 g, 4,78 mmol) se a�adi� THF (10 ml), DIEA (0,98 ml, 5,74 mmol) y TSTU (1,7 g, 5,74 mmol) y la
5 mezcla obtenida se agit� a temperatura ambiente durante 2 horas. AcOEt (100 ml) se a�adi� y la mezcla se lav� con 0,2N de ácido clorhídrico (100 ml) y agua (2 x 100 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO4) y se concentr� in vacuo para proporcionar 1,34 g (92%) de Z-Gly-OSu en forma de aceite.1H-NMR (CDCl3), o: 7,35 (s; 5H), 5,32 (t; 1H), 5,15 (s; 2H), 4,35 (d; 2H), 2,83 (s, 4H).
10 [0141] Z-Gly-OSu (1,3 g, 4,25 mmol) se disolvió en DMF (15 ml) y DIEA (1,82 ml, 10,6 mmol) y se a�adi� H-Glu-OtBu (0,949 g, 4,67 mmol), la mezcla obtenida se agit� a temperatura ambiente durante 16 horas. Se a�adi� AcOEt (100 ml) y se lav� la mezcla con 0,2N de ácido clorhídrico (100 ml) y agua (2 x 100 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO4) y se concentr� in vacuo para proporcionar 1,7 g (cant.) de Z-Gly-Glu-OtBu en forma de aceite. 1H-NMR (CDCl3), o: 7,33 (s; 5H), 7,1 (d; 1H), 5,80 (t; 1H), 5,12 (s; 2H), 4,53 (m; 1H), 3,90 (d; 2H), 2,36 (t; 2H), 2,22 (m;
15 1H), 1,95 (m; 1H), 1,45 (s, 9H).
[0142] Se disolvió Z-Gly-Glu-OtBu (1,7 g, 4,3 mmol) en 1,4-dioxano (15 ml) y se a�adi� 10% de paladio negro (0,6 g) bajo N2. La mezcla se hidrogen� bajo presión atmosférica durante 5 horas. La mezcla se filtr� y se agit� el paladio con agua (200 ml) durante 2 horas, se filtr� y se liofilizó el filtrado. Esto produjo 0,65 g (58%) de H-Gly-Glu-OtBu.
20 1H-NMR (DMSO-d6), picos seleccionados, o: 8,31 (d; 1H), 2,20 (t; 2H), 1,91 (m; 1H), 1,80 (m; 1H), 1,40 (s, 9H).
[0143] Se suspendió H-Gly-Glu-OtBu (0,15 g, 0,58 mmol) en DMF (5 ml) y DIEA (0,15 ml, 0,86 mmol) y se a�adi� succinimidil tert-butil octadecandioato (0,27 g, 0,58 mmol), la mezcla obtenida se agit� a temperatura ambiente durante 16 horas. Se a�adi� AcOEt (50 ml) y se lav� la mezcla con 0,2N de ácido clorhídrico (100 ml) y agua (3 x 100 ml). La
25 fase orgánica se secó (Na2SO4) y se concentr� in vacuo para proporcionar 0,34 g (cant.) de tert-butil octadecandioil-Gly-Glu- OtBu. 1H-NMR (CDCl3), o: 7,11 (d; 1H), 6,55 (t; 1H), 4,55 (dt; 1H), 4,00 (dq; 2H), 2,40 (t; 2H), 2,26 (t; 2H), 2,20 (t; 4H), 2,00 (m; 1H), 1,57-1,65 (m; 5H), 1,47 (s; 9H), 1,44 (s; 9H), 1,25 ("s", 22H, superposición con HDO).
30 [0144] Se disolvió el tert-butil octadecandioil-Gly-Glu-OtBu (0,32 g, 0,52 mmol) en THF (5 ml) y se a�adi� DIEA (0,11 ml, 0,63 mmol) y TSTU (0,19 g, 0,63 mmol), la mezcla obtenida se agit� a temperatura ambiente bajo N2 durante 3 días. Se a�adi� AcOEt (100 ml) y la mezcla se lav� con 0,15N de ácido clorhídrico (100 ml) y agua (3 x 100 ml). La fase orgánica se secó (Na2SO4) y se concentr� in vacuo para proporcionar 0,3 g (81 %) de tert-butil octadecandioil-Gly-Glu(OSu)-
Ot
Bu. 35 1H-NMR (CDCl3), picos seleccionados, o: 6,89 (d; 1H), 6,44 (t; 1H), 4,60 (m; 1H), 3,95 (dq; 2H), 2,86 (s; 4H), 2,68 (q; 2H), 2,24 (t; 2H), 2,20 (t; 4H), 1,57-1,65 (m; 5H), 1,48 (s; 9H), 1,44 (s; 9H), 1,25 ("s", 22H, superposición con HDO).
EJEMPLO 36
40 Síntesis de N�B29-[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(2-carboxietil)-[-Ala] insulina humana desB30
[0145] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 1, mediante el acoplamiento de 15-[[2-(2,5-dioxopirrolidina-1-iloxicarbonil)-etil]-(2-metoxicarbonil-etil)-carbamoil]-éster met�lico de ácido pentadecan�ico con des(B30)
45 insulina humana y la desprotecci�n por NaOH. LC-MS: M+4. 1530,3, calculado 1529,5
Preparaci�n de metil hexadecandioil N-(2-(metoxicarbonil)etil)-[-Ala-OSu
50 [0146] Se disolvió hidrocloruro H-[-Ala-OMe (5,45 g, 39 mmol) en DMSO (100 ml) y se a�adi� acrilato tert-but�lico (5,71 ml, 39 mmol) y DIEA (13,4 ml, 78 mmol), la mezcla obtenida se agit� a temperatura ambiente durante 6 días. La mezcla se repartió en agua (500 ml) y AcOEt (2 x 250 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NH4Cl saturado acuoso, se secaron (MgSO4) y se concentraron in vacuo. Esto produjo 7,24 g (80%) de N-(2- (metoxicarbonil)etil)-[-Ala-OtBu.
55 1H-NMR (CDCl3), o: 3,58 (s; 3H), 2,72 (t; 2H), 2,67 (t; 2H), 2,41 (t; 2H), 2,29 (t; 2H),1,39 (s, 9H).
[0147] Se disolvió éster de monometil de ácido hexadecanodi�ico (150 mg, 0,5 mmol) en DMF (5 mL). HOAt (102 mg, 0,75 mmol), se a�adi� EDAC (143 mg, 0,75 mmol) y la reacción se agit� a 50�C durante 1 hora. Tras el enfriamiento a temperatura ambiente, se a�adi� DIEA (0,256 mL, 1,5 mmol) y N-(2-(metoxicarbonil)etil)-[-Ala-OtBu (139 mg, 0,6
60 mmol). Se agit� la reacción durante toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla se repartió en agua (2 x 50 mL) y AcOEt (100 mL). La fase orgánica se secó (Na2SO4) y se concentr� in vacuo en un aceite. Se a�adi� DCM (10 mL) y TFA (10 mL) y la mezcla se agit� durante 1 hora a temperatura ambiente, se elimin� el solvente in vacuo para proporcionar 170 mg (87 %) de metil hexadecandioil N-(2-(metoxicarbonil)etil-[-Ala-OH. LC-MS: 458 (M+1).
65 [0148] Se disolvió el metil hexadecandioil N-(2-(metoxicarbonil)etil-[-Ala-OH (161 mg, 0,351 mmol) en THF (10 mL), se a�adi� DIEA (0,073 mL, 0,42 mmol) y TSTU (127 mg, 0,42 mmol). Se agit� la mezcla durante su enfriamiento en un baño de hielo durante 30 min, seguido de una agitaci�n durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se repartió en AcOEt (100 mL) y HCl acuoso (0,2 N, 2x 80 mL). La fase orgánica se secó (Na2SO4) y se concentr� in vacuo. Esto
5 produjo 140 mg (72 %) de metilo hexadecandioil N-(2-(metoxicarbonil)etil)-[-Ala-OSu como un aceite. LC-MS: 555 (M+1).
EJEMPLO 37
10 Síntesis de N�B29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(2-carboxietil)-[-Ala] insulina humana des B30
[0149] Este compuesto se prepar� en analogía con el ejemplo 1 y 36 mediante el acoplamiento de metil octadecandioil N-(2- (metoxicarbonil)etil)-[-Ala-OSu con des(B30) insulina humana y la desprotecci�n por NaOH.
15 Preparación de metil octadecandioil N-(2-(metoxicarbonil)etil)-[-Ala-OSu
[0150] Este compuesto se sintetizó en analogía con el metil hexadecandioil N-(2-(metoxicarbonil)etil)-[-Ala-OSu mediante el uso de éster mono met�lico de ácido octadecanodi�ico. MALDI-TOF MS: calculado 6146; determinado: 6151
20 LC-MS: 583 (M+1)
M�TODOS FARMACOL�GICOS
Ensayo (I)
Uni�n de receptor de insulina de los derivados de insulina de la invención
[0151] La afinidad de los análogos de insulina de la invención con el receptor de insulina humana se determin� mediante un ensayo SPA (ensayo de proximidad de centelleo) ensayo de captura de anticuerpos en placa de microtitulaci�n. Se 30 mezclaron perlas de unión al anticuerpo SPA-PVT y reactivo anti-ratón (Amersham Biosciences, Cat No. PRNQ0017) con 25 ml de tampón de unión (100 mM HEPES pH 7,8,100 mM cloruro sádico, 10 mM MgSO4, 0,025% Tween-20). La mezcla reactiva para un único Packard Optiplate (Packard No. 6005190) se compone de 2,4 1l de un receptor - ex�n 11 de insulina humana recombinante purificada diluido a 1:5000, una cantidad de una solución madre de insulina humana A14 Tyr[125I] correspondiente a 5000 cpm por 100 1l de mezcla reactiva, 12 1l de una dilución a 1:1000 de anticuerpo
35 F12, 3 ml de perlas SPA y tampón de unión hasta un total de 12 ml. Un total de 100 1l se añadieron después y se realizó una serie de diluciones a partir de muestras apropiadas. A la serie de diluciones se a�adi� después 100 1l de mezcla reactiva y las muestras se incubaron durante 16 horas en agitaci�n suave. Las fases se separaron después por centrifugado durante 1 min y las placas se contaron en un Topcounter. Los datos de unión se ajustaron mediante el uso del algoritmo de regresión no lineal en el GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, San Diego, CA).
Preparaci�n de anticuerpos mIR monoclonales
[0152] Se produjeron anticuerpos específicos (F12) mediante una técnica monoclonal: se inmunizaron ratones RBF por inyección de 50 1g de mIR purificado en FCA seguido de dos inyecciones subcutáneas con 20 1g de mIR en FIA. Los
45 ratones de respuesta alta fueron estimulados por vía intravenosa con 25 1g de mIR y se retiraron los bazos después de 3 días. Las células de bazo se fusionaron con la línea celular de mieloma de zorro (K�hler, G & Milstein C. (1976), European J. Immunology, 6:511-19; Taggart RT et al (1983), Science 219:1228-30). Se seleccionaron sobrenadantes para la producción de anticuerpos en una técnica ELISA específica mIR. Se clonaron los pocillos positivos y se evaluaron mediante la técnica de transferencia Western.
50 Tabla 2
Producto
Unión al receptor (% de insulina humana)
Insulina humana
100
N�B29-(N-HOOC(CH2)14CO-y-Glu) Des(B30) insulina humana
26
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-y-Glu) Des(B30) insulina humana
9,2
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-y-Glu-N-(y-Glu) Des(B30) insulina humana
11
N�B29-(N-(Asp-OC(CH2)16CO)-y-Glu) Des(B30) insulina humana
13
N�B29-(N-(Glu-OC(CH2)14CO-y-Glu) Des(B30) insulina humana
13
N�B29-(N-(Glu-OC(CH2)14CO-) Des(B30) insulina humana
9,4
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-a-Glu)-N-([-Asp) Des(B30) insulina humana
11
N�B29-(N-(Gly-OC(CH2)13CO-y-Glu) Des(B30) insulina humana
22
N�B29-(N-(Sar-OC(CH2)13CO-y-Glu) Des(B30) insulina humana
20
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-a-L-Asp)-N-([-L-Asp) Des(B30) insulina humana
14
N�B29-(N-(Gly-OC(CH2)14CO-y-Glu) Des(B30) insulina humana
32
N�B29-(N-HOOC(CH2)15CO-y-L-Glu) Des(B30) insulina humana
4
N�B29-(N-HOOC(CH2)14CO-[-L-Asp) Des(B30) insulina humana
16
N�B29-(N-HOOC(CH2)14CO-[-D-Asp) Des(B30) insulina humana
37
N�B29-(N-HOOC(CH2)13CO-[-L-Glu) Des(B30) insulina humana
15
N�B29-(N-HOOC(CH2)13CO-[-L-Asp) Des(B30) insulina humana
11
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-o-L-Aad) Des(B30) insulina humana
7
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-y-D-Glu) Des(B30) insulina humana
13
N�B29-(N-HOOC(CH2)15CO-[-L-Asp) Des(B30) insulina humana
5,4
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-a-L-Asp) Des(B30) insulina humana
13
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-a-L-Glu) Des(B30) insulina humana
16
N�B29-(N-(HOOC(CH2)14CO-�-L-LysCO-) Des(B30) insulina humana
5,7
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-[-L-Asp) Des(B30) insulina humana
11
N�B29-(N-(Gly-OC(CH2)16CO-y-L-Glu) Des(B30) insulina humana
9,1
N�B29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(carboximetil)-[-Ala] Des(B30) insulina humana
9,4
N�B29-[Na-(HOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-y-L-Glu] Des(B30) insulina humana
46
Ensayo (II)
Potencia de los derivados de insulina de la invención con respecto a la insulina humana
5 [0153] Para el experimento de fijación se us� ratas macho Sprague Dawley con un peso de 238-383 g el día del experimento. Las ratas tenían acceso libre a alimentos en condiciones ambientales controladas y se quedaron en ayuno durante toda una noche (desde las 3 pm) antes del experimento de fijación.
10 Protocolo Experimental
[0154] Las ratas se aclimataron a las instalaciones para animales durante al menos 1 semana antes del procedimiento quirúrgico. Aproximadamente 1 semana antes del experimento de fijación se insertaron catéteres Tygon bajo anestesia con halotano en la vena yugular (para infusión) y la arteria carótida (para muestra de sangre) y éstos se exteriorizaron y
15 se fijaron en la parte posterior del cuello. Las ratas recibieron Streptocilin vet. (Boehringer Ingelheim; 0,15 ml/rata, i.m.) post-quirúrgicamente y se dispusieron en una unidad de cuidado animal (25 �C) durante el periodo de recuperación. Para obtener analgesia, se administr� Anorfina (0,06 mg/rata, s.c.) durante la anestesia y se administr� Rimadyl (1,5 mg/kg, s.c.) después de la recuperación completa de la anestesia (2-3 h) y de nuevo una vez al día durante 2 días.
20 [0155] La técnica de fijación empleada se adapt� según (1). A las 7 am el día del experimento, en ayuno durante toda la noche (desde las 3 pm del día anterior), se pesaron las ratas y éstas se conectaron a las jeringas de toma de muestras y al sistema de infusión (bombas básicas Harvard 22, de Harvard, y jeringa de vidrio Perfectum Hypodermic, de Aldrich) y éstas se colocaron después en jaulas de fijación individuales en las que permanecieron durante aprox. 45 min antes del inicio del experimento. Las ratas podían moverse libremente en su lecho habitual durante todo el experimento y
25 tenían acceso libre al agua potable. Después de un periodo basal de 30 min durante el cual se midieron los niveles de glucosa en sangre en intervalos de 10 min, el derivado de insulina que se iba a experimentar y la insulina humana (una dosis por rata, n = 6-7 por nivel de dosis) se inyectaron (i.v.) a una velocidad constante durante 300 min. Los niveles de glucosa en sangre se midieron en intervalos de 10 min y se ajust� la infusión de 20% de glucosa acuosa en ese sentido para mantener la euglucemia. Se agruparon muestras de eritrocitos resuspendidos de cada rata y se restituyeron en
30 aproximadamente Y ml de volúmenes a través del catéter car�tido.
[0156] Cada día del experimento, se tomaron muestras de las soluciones de los derivados de insulina individuales que se tenían que evaluar y la solución de insulina humana antes y al final de los experimentos de fijación, y las concentraciones de los p�ptidos se confirmaron por HPLC. Las concentraciones de plasma de insulina de rata y de
5 p�ptido C, al igual que las del derivado de insulina a evaluar y de insulina humana, se midieron en momentos pertinentes antes y al final de los estudios. Se mataron las ratas al final de experimento mediante una sobredosis de pentobarbital.
[0157] Compuestos y dosis de prueba: las insulinas que se tenían que someter a prueba se diluyeron a partir de una
10 solución madre comprendiendo 97 1M del derivado de insulina en 5mM de fosfato pH 7,7. La concentración final de la solución lista para el uso era de 0,45 1M del derivado de insulina, 5 mM de fosfato, 100 mM de cloruro sádico, 0,007% de polisorbato 20. El pH era 7,7 y la velocidad de infusión i.v. de 15 y 20 pmol�min-1�kg-1.
[0158] Una solución madre de insulina humana usada en forma de compuesto de referencia se formul� en un medio 15 similar y se inyect� i.v. en 6, 15 o 30 pmol�min-1�kg-1.
[0159] Ambas soluciones madre se almacenaron a -20 �C y se descongelaron durante toda la noche a 4 �C antes de ser usadas. Se voltearon despacio las soluciones boca abajo varias veces durante 15 min antes de transferirlas a las jeringas de infusión.
20 Tabla 3
Derivado de insulina
Potencia con respecto a la insulina humana
N�B29-(N-HOOC(CH2)14CO-y-Glu) des(B30) insulina humana
>50%
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-y-Glu) des(B30) insulina humana
>50%
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-y-Glu-N-(y-Glu) des(B30) insulina humana
>50%
N�B29-(N-HOOC(CH2)14CO-[-L-Asp) des(B30) insulina humana
>50%
N�B29-(N-(Gly-OC(CH2)14CO-y-Glu) des(B30) insulina humana
>50%
N�B29-(N-HOOC(CH2)14CO-O-L-Asp) des(B30) insulina humana
>50%
Ensayo (III)
Determinaci�n en cerdos de T50% de los derivados de insulina de la invención
[0160] T50% es el tiempo en el que el 50% de una cantidad inyectada del derivado marcado A14 Tyr[125I] de una insulina que se debe evaluar desapareció del sitio de inyección según la medición con un y-contador externo.
30 [0161] Se siguieron los principios de cuidados de animales de laboratorio, se usaron cerdos hembra no diabéticos sin pat�genos específicos LYYD, cruzados con Danish Landrace, Yorkshire y Duroc (Holmenlund, Haarloev, Dinamarca) para estudios farmacodin�micos y farmacocin�ticos. Las cerdas estaban conscientes, tenían de 4-5 meses de edad y un peso de 70-95 kg. Los animales estuvieron en ayunas toda una noche durante 18 h antes del experimento.
[0162] Las preparaciones formuladas de derivados de insulina marcados en TyrA14 con I se inyectaron s.c. en las cerdas tal como se ha descrito anteriormente (Ribel, U., J�rgensen, K, Brange, J, and Henriksen, U. The pig as a model for subcutaneous insulin absorption in man. Serrano-Rios, M and Lef�bvre, P. J. 891-896. 1985. Amsterdam; New York; Oxford, Elsevier Science Publishers. 1985 (Conference Proceeding)).
40 [0163] Al inicio de los experimentos se inyect� una dosis de 60 nmol del derivado de insulina según la invención (compuesto de prueba) y una dosis de 60 nmol de insulina detemir (ambos 125I marcados en Tyr A14) en dos sitios separados del cuello de cada cerda.
45 [0164] La desaparición del marcador radiactivo del sitio de inyección sc. se monitoriz� mediante una modificación del método de conteo gamma externo tradicional (Ribel, U. Subcutaneous absorption of insulin analogues. Berger, M. and Gries, F. A. 70-77 (1993). Stuttgart; New York, Georg Thime Verlag (Conference Proceeding)). Con este método modificado se pudo medir continuamente la desaparición de la radioactividad de un depósito subcutáneo durante varios días mediante el uso de un dispositivo portátil inalámbrico (Scancys Laboratorieteknik, V�rl�se, DK-3500, Dinamarca).
50 Las mediciones se realizaron en intervalos de 1 min y los valores contados se corrigieron para una actividad de fondo.
[0165] En la tabla 4, la columna "ensayo/detemir" muestra el T50% determinado para cada uno de los compuestos probados ("prueba") y el T50% determinado para la insulina detemir ("detemir") en el mismo experimento.
Tabla 4
Derivado de insulina
T50%, horas prueba/detemir
N�B29-(N-HOOC(CH2)14CO-y-Glu) Des(B30) insulina humana
9,0/9,5
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-y-Glu) Des(B30) insulina humana
10,6/9,7
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-y-Glu-N-(y-Glu) Des(B30) insulina humana
7,8/7,4
N�B29-(N-(Asp-OC(CH2)16CO-y-Glu) Des(B30) insulina humana
3,5/7,4
N�B29-(N-(Asp-OC(CH2)16CO-) Des(B30) insulina humana
4,1/7,4
N�B29-(N-HOOC(CH2)16CO-a-Glu)-N-([-Asp) Des(B30) insulina humana
8,7/9,1

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Derivado de insulina de la des(B30) insulina humana que posee una cadena lateral fijada al grupo �-amino de
    un residuo de Lys presente en la cadena B de des(B30) insulina humana, la cadena lateral tiene la fórmula 5 general:
    -W-X-Y-Z
    donde W es:
    • un residuo de a-amino�cido con un grupo de ácido carbox�lico en la cadena lateral, este amino�cido est� seleccionado del grupo que consiste en a-Asp, -Asp, a-Glu, y-Glu, a-hGlu y o-hGlu y este residuo forma, con uno de sus grupos de ácido carbox�lico, un grupo de amida con el grupo �-amino de un residuo de Lys presente en la cadena B de la des(B30) insulina humana;
    15 X es:
    • -CO-;
    Y es:
    • -(CH2)m donde m es un número entero en el intervalo de 12 a 16; y
    25 Z es:
    • -COOH;
    y cualquier complejo Zn2+ de los mismos.
  2. 2. Derivado de insulina según la reivindicación 1, donde el derivado de insulina consiste en N�B29-(Na(HOOC(CH2)14CO)-y-Glu) des(B30) insulina humana.
  3. 3. Complejo de zinc de un derivado de insulina según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde cada 35 hex�mero de insulina se enlaza con dos iones de zinc.
  4. 4.
    Complejo de zinc de un derivado de insulina según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 donde cada hex�mero de insulina se enlaza con tres iones de zinc.
  5. 5.
    Complejo de zinc de un derivado de insulina según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 donde cada hex�mero de insulina se enlaza con cuatro iones de zinc
  6. 6.
    Composici�n farmacéutica para el tratamiento de la diabetes en un paciente que necesita tal tratamiento, que
    comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un derivado de insulina según la reivindicación 1 junto con 45 un soporte farmac�uticamente aceptable.
  7. 7. Composición farmacéutica para el tratamiento de la diabetes en un paciente que necesita tal tratamiento, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un derivado de insulina según la reivindicación 1 mezclado con una insulina o un análogo de insulina que presenta un inicio rápido de acción, junto con un soporte farmac�uticamente aceptable.
    N�B29
  8. 8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, donde el derivado de insulina es-(Na(HOOC(CH2)14CO)-y-Glu) des(B30) insulina humana y el análogo de insulina que presenta un inicio rápido de acción es insulina humana AspB28 .
  9. 9.
    Derivado de insulina según la reivindicación 1 para su uso en forma de medicamento para tratar la diabetes en un paciente que necesita tal tratamiento, que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un derivado de insulina según la reivindicación 1 junto con un soporte farmac�uticamente aceptable.
  10. 10.
    Derivado de insulina según la reivindicación 1 para su uso en forma de medicamento para tratar la diabetes en un paciente que necesita tal tratamiento, que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un derivado de insulina según la reivindicación 1 mezclado con una insulina o un análogo de insulina que tiene un inicio rápido de acción, junto con un soporte farmac�uticamente aceptable.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0413276B8 (pt) 2003-08-05 2021-05-25 Novo Nordisk As derivado de insulina, complexo de zinco do mesmo, e, composição farmacêutica
AU2004298424A1 (en) 2003-12-18 2005-06-30 Novo Nordisk A/S Novel GLP-1 compounds
ES2371361T3 (es) 2005-12-28 2011-12-30 Novo Nordisk A/S Composiciones que comprenden una insulina acilada y zinc y método de producción de dichas composiciones.
EP2167032B1 (en) 2007-06-13 2019-08-07 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical formulation comprising an insulin derivative
CN101157725B (zh) * 2007-10-24 2012-07-25 中国药科大学 人胰岛素类似物的制备方法及用途
BRPI0919946A2 (pt) * 2008-10-30 2016-02-16 Novo Nordisk As tratamento de diabetes melito usando injeções de insulina com frequência de injeção menor que diariamente
AR081066A1 (es) * 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
CA2795091A1 (en) * 2010-05-10 2011-11-17 Novo Nordisk A/S Process for the preparation of insulin-zinc complexes
RU2013123515A (ru) 2010-10-27 2014-12-10 Ново Нордиск А/С Лечение сахарного диабета с помощью инъекций инсулина, вводимых с различными интервалами
PL2632478T3 (pl) * 2010-10-27 2020-03-31 Novo Nordisk A/S Leczenie cukrzycy z zastosowaniem zastrzyków insuliny podawanych w różnych odstępach czasu
RU2014127270A (ru) * 2011-12-15 2016-02-10 Шанхай Хэнжуй Фармасьютикал Ко., Лтд. Аналог человеческого инсулина и его ацилированное производное
AU2013255880B2 (en) 2012-05-01 2017-07-20 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition
US20160296602A1 (en) * 2013-03-20 2016-10-13 Novo Nordisk A/S Dosing Regimen
US10137172B2 (en) 2013-04-30 2018-11-27 Novo Nordisk A/S Administration regime
CN103467594A (zh) * 2013-09-12 2013-12-25 深圳先进技术研究院 胰岛素修饰物及其制备方法和应用
CN105001140B (zh) * 2015-06-29 2018-01-05 珠海联邦制药股份有限公司 一种制备脂肪二酸衍生物的方法及其应用
CN106496322A (zh) * 2015-09-07 2017-03-15 江苏恒瑞医药股份有限公司 人胰岛素或其类似物的酰化衍生物的制备方法
EP3495384A4 (en) 2016-08-02 2020-02-26 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. ACYLATED DERIVATIVE OF HUMAN INSULIN OR ANALOGUE OF IT
US10335464B1 (en) 2018-06-26 2019-07-02 Novo Nordisk A/S Device for titrating basal insulin
CN111518009B (zh) * 2019-02-01 2023-06-23 鲁南制药集团股份有限公司 一种脂肪酸衍生物及其合成方法
WO2021185304A1 (zh) * 2020-03-18 2021-09-23 东莞市东阳光生物药研发有限公司 制备长脂肪链二酸衍生物的方法及其应用
CN114075275A (zh) * 2020-08-17 2022-02-22 成都奥达生物科技有限公司 一种长效胰岛素类似物
CN116903512A (zh) * 2023-06-05 2023-10-20 浙江湃肽生物股份有限公司深圳分公司 一种德谷胰岛素中间体及其德谷胰岛素的制备方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3528960A (en) 1968-10-07 1970-09-15 Lilly Co Eli N-carboxyaroyl insulins
GB1492997A (en) 1976-07-21 1977-11-23 Nat Res Dev Insulin derivatives
JPS5767548A (en) 1980-10-14 1982-04-24 Shionogi & Co Ltd Insulin analog and its preparation
PH25772A (en) 1985-08-30 1991-10-18 Novo Industri As Insulin analogues, process for their preparation
NZ222907A (en) 1986-12-16 1990-08-28 Novo Industri As Preparation for intranasal administration containing a phospholipid absorption enhancing system
JPH01254699A (ja) 1988-04-05 1989-10-11 Kodama Kk インスリン誘導体及びその用途
JPH04502465A (ja) 1988-12-23 1992-05-07 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ ヒトインシュリン類似物質
NZ232375A (en) 1989-02-09 1992-04-28 Lilly Co Eli Insulin analogues modified at b29
DK45590D0 (es) 1990-02-21 1990-02-21 Novo Nordisk As
BR9407508A (pt) 1993-09-17 1997-01-07 Novo Nordisk As Derivado de insulina composição farmaceutica e processo para o tratamento de diabete em um paciente com necessidade deste tratamento
US6251856B1 (en) * 1995-03-17 2001-06-26 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives
US6451970B1 (en) * 1996-02-21 2002-09-17 Novo Nordisk A/S Peptide derivatives
AU3255297A (en) * 1996-07-11 1998-02-09 Novo Nordisk A/S Selective acylation method
US5898067A (en) * 1997-02-07 1999-04-27 Novo Nordisk A/S Crystallization of proteins
DE19726167B4 (de) 1997-06-20 2008-01-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung
ATE243711T1 (de) * 1997-10-24 2003-07-15 Novo Nordisk As Aggregate von menschlichen insulinderivaten
US20020155994A1 (en) 1997-10-24 2002-10-24 Svend Havelund Aggregates of human insulin derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
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