CN1829738B - 新型胰岛素衍生物 - Google Patents

新型胰岛素衍生物 Download PDF

Info

Publication number
CN1829738B
CN1829738B CN2004800217338A CN200480021733A CN1829738B CN 1829738 B CN1829738 B CN 1829738B CN 2004800217338 A CN2004800217338 A CN 2004800217338A CN 200480021733 A CN200480021733 A CN 200480021733A CN 1829738 B CN1829738 B CN 1829738B
Authority
CN
China
Prior art keywords
insulin
des
glu
insulin human
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN2004800217338A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1829738A (zh
Inventor
I·约纳森
T·赫格-延森
S·哈韦伦德
U·里贝尔-马德森
T·M·塔格莫塞
P·马德森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36947523&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN1829738(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
Priority to CN201010514501.3A priority Critical patent/CN101955527B/zh
Priority claimed from PCT/DK2004/000511 external-priority patent/WO2005012347A2/en
Publication of CN1829738A publication Critical patent/CN1829738A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1829738B publication Critical patent/CN1829738B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及胰岛素衍生物，该胰岛素衍生物是在母体胰岛素B链N-末端氨基酸残基的α-氨基处或者在母体胰岛素B链上存在的Lys残基的ε-氨基处连接了侧链的天然存在的胰岛素或其类似物，该侧链具有如下一般通式：-W-X-Y-Z其中W、X、Y和Z如本说明书中所定义。

Description

新型胰岛素衍生物
发明领域
本发明涉及在生理pH值下可溶并具有延长的作用特性的新型人胰岛素衍生物。本发明还涉及提供这类衍生物的方法、含有它们的药物组合物、使用本发明的胰岛素衍生物治疗糖尿病和高血糖的方法以及这类胰岛素衍生物在治疗糖尿病和高血糖中的应用。 
发明背景 
目前，对糖尿病，包括1型糖尿病和2型糖尿病的治疗越来越依赖于所谓的强力胰岛素治疗。按照该方案，每天用多次胰岛素注射治疗患者，包括每天使用长效胰岛素注射一次或两次，以便覆盖基本胰岛素需求，并补充以大量浓注快速起效的胰岛素以覆盖与膳食相关的胰岛素需求。 
长效胰岛素组合物在本领域中是众所周知的。因此，一种主要类型的长效胰岛素组合物包括胰岛素晶体或非晶形胰岛素的可注射的水性混悬液。在这些组合物中，所用的胰岛素化合物一般为鱼精蛋白胰岛素、锌胰岛素或者精蛋白锌胰岛素。 
应用胰岛素混悬液有某些缺陷。因此，为了保证精确给药，必须通过适度振摇使胰岛素颗粒均匀混悬，然后才从小瓶中抽取或从药筒放出确定体积的混悬液。此外，就胰岛素混悬液的储存而言，必须将温度保持在比胰岛素溶液更窄的范围内以避免形成块或凝固。 
尽管先前认为鱼精蛋白是非免疫原性的，但是目前已证明鱼精蛋白在人体内可能是免疫原性的，且其在医疗目的中的应用可能导致抗体形成。此外，已有证据表明鱼精蛋白-胰岛素复合物自身为免疫原性的。因此，对某些患者而言，必须避免使用含有鱼精蛋白的长效胰岛素组合物。 
另一种类型的长效胰岛素组合物为具有低于生理pH的pH值的溶液，在注射该溶液时，胰岛素将因pH值升高而从其中沉淀。使用这些溶液的缺陷在于注射时组织中形成的沉淀的颗粒大小分布、进而该药物的释放特性会以某种不可预测的方式取决于注射部位处的血流和其它参数。另一个缺陷在于胰岛素的固体颗粒可以起局部刺激剂的作用，使注射部位处的组织产生炎症。 
WO 91/12817(Novo Nordisk A/S)中披露了包含钴(III)的胰岛素复合物的可溶性胰岛素组合物。这些复合物的作用特性仅为适度的延长，而生物利用度相对于人胰岛素而言有所下降。 
人胰岛素带有三个伯氨基：A-链和B-链的N-末端基团以及LysB29 的ε-氨基。在这些基团的一个或多个上被取代的几种胰岛素衍生物是现有技术中公知的。因此，美国专利US 3,528,960(Eli Lilly)涉及N-羧基芳酰基胰岛素，其中该胰岛素分子的1、2或3个伯氨基带有羧基芳酰基。 
GB专利号1.492.997(Nat.Res.Dev.Corp.)发现在NεB29上带有氨基甲酰基取代的胰岛素具有改善的降血糖作用特性。 
JP待审专利申请号1-254699(Kodama Co.，Ltd.)中披露了脂肪酸与PheB1的氨基或与LysB29的ε-氨基结合或与它们两者均结合的胰岛素。所述的衍生化的目的在于获得药理学上可接受的稳定胰岛素制剂。 
JP待审专利申请号57-067548(Shionogi)中描述了在B30位上带有含至少5个碳原子的氨基酸(其不一定由三联体核苷酸编码)的胰岛素。其中宣称这些胰岛素类似物可用于治疗糖尿病，特别是用于治疗因牛或猪胰岛素抗体的产生而为胰岛素抵抗的患者。 
WO 95/07931(Novo Nordisk A/S)中披露了人胰岛素衍生物，其中LysB29的ε-氨基带有亲脂性取代基。这些胰岛素衍生物具有延长的作用特性且在生理pH值下可溶。 
EP 894095中披露了胰岛素衍生物，其中B-链的N-末端基团和/或B28、B29或B30位上Lys的ε-氨基带有通式-CO-W-COOH的取代基，其中W可以为长链烃基。这些胰岛素衍生物具有延长的作用特性且在 生理pH值下可溶。 
然而，对具有比迄今为止已知的胰岛素衍生物具有更为延长的作用特性且同时在生理pH值下可溶、并且功效与人胰岛素相当的胰岛素仍然存在需求。 
发明概述 
本发明基于如下认识：胰岛素衍生物分子的总体疏水性在该衍生物的体内功效方面起重要作用。 
本发明在一个方面涉及胰岛素衍生物及其任意的Zn2+复合物，该胰岛素衍生物是在母体胰岛素B链的N-末端氨基酸残基的α-氨基处或者在母体胰岛素B链上存在的Lys残基的ε-氨基处连接了侧链的天然存在的胰岛素或其类似物，该侧链具有如下一般通式： 
                        -W-X-Y-Z 
其中W为： 
·在侧链上带有羧酸基团的α-氨基酸残基，该残基以其羧酸基团之一与母体胰岛素B链的N-末端氨基酸残基的α-氨基一起或者与母体胰岛素B链上存在的Lys残基的ε-氨基一起形成酰胺基； 
·由彼此通过酰胺键连接的2、3或4个α-氨基酸残基组成的链，该链通过酰胺键与母体胰岛素B链的N-末端氨基酸残基的α-氨基或者与母体胰岛素B链上存在的Lys残基的ε-氨基相连接，W的氨基酸残基选自带有中性侧链的氨基酸残基和在侧链上带有羧酸基团的氨基酸残基组成的组，使得W含有至少一个在侧链上含有羧酸基团的氨基酸残基；或者 
·X与母体胰岛素B链的N-末端氨基酸残基的α-氨基或者与母体胰岛素B链上存在的Lys残基的ε-氨基之间的共价键； 
X为： 
·-CO-； 
·-CH(COOH)CO-； 
·-N(CH2COOH)CH2CO-； 
·-N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2CO-； 
·-N(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-； 
·-N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-； 
·-NHCH(COOH)(CH2)4NHCO-； 
·-N(CH2CH2COOH)CH2CO-；或 
·-N(CH2COOH)CH2CH2CO-； 
a)当W为氨基酸残基或氨基酸残基链时，上述X通过由加下划线的羰基碳的键与W上的氨基形成酰胺键，或 
b)当W为共价键时，上述X通过来自加下划线的羰基碳的键与母体胰岛素B链上的N-末端α-氨基或者与母体胰岛素B链上存在的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键； 
Y为： 
·-(CH2)m-，其中m为6-32的整数； 
·二价烃链，它含有1、2或3个-CH＝CH-基团和其数目足以在链上获得10-32个碳原子总数的-CH2-基团； 
·通式-(CH2)vC6H4(CH2)W-的二价烃链，其中v和w为整数或其中之一为0，使得v与w之和在6-30的范围内；且 
Z为： 
·-COOH； 
·-CO-Asp； 
·-CO-Glu； 
·-CO-Gly； 
·-CO-Sar； 
·-CH(COOH)2； 
·-N(CH2COOH)2； 
·-SO3H；或 
·-PO3H； 
条件是当W为共价键且X为-CO-时，Z不是-COOH。 
在本发明的一个实施方案中，侧链-W-X-Y-Z与母体胰岛素B链的N-末端氨基酸残基的α-氨基连接。 
在本发明的另一个实施方案中，侧链-W-X-Y-Z与母体胰岛素B链上存在的Lys残基的ε-氨基连接。在该实施方案的一个更具体的方面中，侧链-W-X-Y-Z与B链28位上存在的Lys残基的ε-氨基连接。在该实施方案的另一个更具体的方面中，侧链-W-X-Y-Z与B链29位上存在的Lys残基的ε-氨基连接。在该实施方案的另一个更具体的方面中，侧链-W-X-Y-Z与B链30位上存在的Lys残基的ε-氨基连接。 
侧链-W-X-Y-Z的亚结构W可以为共价键。另一方面，W可以为在侧链上带有羧酸基团且含有总共4-10个碳原子的α-氨基酸的残基。特别地，W可以为能够由遗传密码编码的α-氨基酸的残基。因此，例如，W可以选自α-Asp、β-Asp、α-Glu和γ-Glu组成的组。W的其它选择例如为α-hGlu和δ-hGlu。 
在另一个实施方案中，W为由两个α-氨基酸残基组成的链，这两个α-氨基酸残基之一有4-10个碳原子，并且在侧链上有羧酸基团，而另一个α-氨基酸残基带有2-11个碳原子，但不含游离羧酸基团。不含游离羧酸基团的α-氨基酸残基可以为中性的可编码的α-氨基酸残基。该实施方案的W的实例为：α-Asp-Gly；Gly-α-Asp；β-Asp-Gly；Gly-β-Asp；α-Glu-Gly；Gly-α-Glu；γ-Glu-Gly；Gly-γ-Glu；α-hGlu-Gly；Gly-α-hGlu；δ-hGlu-Gly；和Gly-δ-hGlu。 
在另一个实施方案中，W为由两个α-氨基酸残基组成的链，这两个α-氨基酸残基独立地含有4-10个碳原子，并且两者均在侧链上带有羧酸基团。这些α-氨基酸残基之一或它们两者可以为可编码的α-氨基酸残基。该实施方案的W的实例为：α-Asp-α-Asp；α-Asp-α-Glu；α-Asp-α-hGlu；α-Asp-β-Asp；α-Asp-γ-Glu；α-Asp-δ-hGlu；β-Asp-α-Asp；β-Asp-α-Glu；β-Asp-α-hGlu；β -Asp-β-Asp；β-Asp-γ-Glu；β-Asp-δ-hGlu；α-Glu-α-Asp；α-Glu-α-Glu；α-Glu-α-hGlu；α-Glu-β-Asp；α-Glu-γ-Glu；α-Glu-δ-hGlu；γ-Glu-α-Asp；γ-Glu-α-Glu；γ-Glu-α-hGlu；γ-Glu-β-Asp；γ-Glu-γ-Glu；γ-Glu-δ-hGlu；α-hGlu-α-Asp；α-hGlu-α-Glu；α-hGlu-α-hGlu；α-hGlu-β-Asp；α-hGlu-γ-Glu；α-hGlu-δ-hGlu；δ-hGlu-α-Asp；δ-hGlu-α-Glu；δ-hGlu-α-hGlu；δ-hGlu-β-Asp；δ-hGlu-γ-Glu；和δ-hGlu-δ-hGlu。 
在另一个实施方案中，W为由三个独立地含有4-10个碳原子的α-氨基酸残基组成的链，该链的氨基酸残基选自带有中性侧链的残基和在侧链上带有羧酸基团的残基的组，使得该链含有至少一个在侧链上带有羧酸基团的残基。在一个实施方案中，所述的氨基酸残基为可编码的残基。 
在另一个实施方案中，W为由四个独立地含有4-10个碳原子的α-氨基酸残基组成的链，该链的氨基酸残基选自带有中性侧链的残基和在侧链上带有羧酸基团的残基的组，使得该链含有至少一个在侧链上带有羧酸基团的残基。在一个实施方案中，所述的氨基酸残基为可编码的残基。 
在一个实施方案中，W可以通过脲衍生物与B-链上的Lys残基的ε-氨基连接。 
侧链-W-X-Y-Z的亚结构X可以为通式-CO-的基团，它通过来自加下划线的羰基碳的键与W上的氨基形成酰胺键；或当W为共价键时，X通过来自加下划线的羰基碳的键与母体胰岛素B链上的N-末端α-氨基或与母体胰岛素B链上存在的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键。 
在另一个实施方案中，所述侧链的亚结构X可以为通式-CH(COOH)CO-的基团，它通过来自加下划线的羰基碳的键与W上的氨基形成酰胺键；或当W为共价键时，X通过来自加下划线的羰基碳的键与母体胰岛素B链上的N-末端α-氨基或与母体胰岛素B链上存在的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键。 
在另一个实施方案中，所述侧链的亚结构X可以为通式-N(CH2COOH)CH2CO-的基团，它通过来自加下划线的羰基碳的键与W上的氨基形成酰胺键；或当W为共价键时，X通过来自加下划线的羰基碳的键与母体胰岛素B链上的N-末端α-氨基或与母体胰岛素B链上存在的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键。 
在另一个实施方案中，所述侧链的亚结构X可以为通式-N(CH2CH2COOH)CH2CO-的基团，它通过来自加下划线的羰基碳的键与W上的氨基形成酰胺键；或当W为共价键时，它通过来自加下划线的羰基碳的键与母体胰岛素B链上的N-末端α-氨基或与存在于母体胰岛素B链上的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键。 
在另一个实施方案中，所述侧链的亚结构X可以为通式-N(CH2COOH)CH2CH2CO-的基团，它通过来自加下划线的羰基碳的键与W上的氨基形成酰胺键；或当W为共价键时，X通过来自加下划线的羰基碳的键与母体胰岛素B链上的N-末端α-氨基或与存在于母体胰岛素B链上的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键。 
在另一个实施方案中，所述侧链的亚结构X可以为通式-N(CH2COOH)CH2CON(CH2COOH)CH2CO-的基团，它通过来自加下划线的羰基碳的键与W上的氨基形成酰胺键；或当W为共价键时，它通过来自加下划线的羰基碳的键与母体胰岛素B链上的N-末端α-氨基或与存在于母体胰岛素B链上的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键。 
在另一个实施方案中，所述侧链的亚结构X可以为通式-N(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-的基团，它通过来自加下划线的羰基碳的键与W上的氨基形成酰胺键；或当W为共价键时，X通过来自加下划线的羰基碳的键与母体胰岛素B链上的N-末端α-氨基或与存在于母体胰岛素B链上的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键。 
在另一个实施方案中，所述侧链的亚结构X可以为通式-N(CH2CH2COOH)CH2CH2CON(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-的基团，它通过来自加下划线的羰基碳的键与W上的氨基形成酰胺键；或当W为共价键时，X通过来自加下划线的羰基碳的键与母体胰岛素B链上的N-末端α-氨基 或与存在于母体胰岛素B链上的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键。 
侧链-W-X-Y-Z的亚结构Y可以为通式-(CH2)m-的基团，其中m为6-32、8-20、12-20或12-16的整数。 
在另一个实施方案中，Y为二价烃链，它含有1、2或3个-CH＝CH-基团和数量足以在该链上获得6-32、10-32、12-20或12-16的碳原子总数的-CH2-基团。 
在另一个实施方案中，Y为通式-(CH2)vC6H4(CH2)W-的二价烃链，其中v和w为整数或其中之一为0，使得v与w之和在6-30、10-20或12-16的范围内。 
在一个实施方案中，侧链-W-X-Y-Z的亚结构Z为-COOH，条件是当W为共价键且X为-CO-时，Z不是-COOH。 
在另一个实施方案中，Z为-CO-Asp。 
在另一个实施方案中，Z为-CO-Glu。 
在另一个实施方案中，Z为-CO-Gly。 
在另一个实施方案中，Z为-CO-Sar。 
在另一个实施方案中，Z为-CH(COOH)2。 
在另一个实施方案中，Z为-N(CH2COOH)2。 
在另一个实施方案中，Z为-SO3H。 
在另一个实施方案中，Z为-PO3H。 
在另一个实施方案中，W选自由α-Asp、β-Asp、α-Glu和γ-Glu组成的组；X为-CO-或-CH(COOH)CO；Y为-(CH2)m-，其中m为12-18的整数且Z为-COOH或-CH(COOH)2。 
本发明胰岛素衍生物的胰岛素部分(在本文中也称作母体胰岛素)可以为天然存在的胰岛素，诸如人胰岛素或猪胰岛素。另一方面，母体胰岛素可以是胰岛素类似物。 
在一组母体胰岛素类似物中，A21位上的氨基酸残基是Asn。 
在另一组母体胰岛素类似物中，A21位上的氨基酸残基是Gly。来自该组类似物的具体实例有GlyA21人胰岛素、GlyA21des(B30)人胰岛 素和GlyA21ArgB31ArgB32人胰岛素。 
在另一组母体胰岛素类似物中，B1位上的氨基酸残基被缺失。该组母体胰岛素类似物的具体实例为des(B1)人胰岛素。 
在另一组母体胰岛素类似物中，B30位上的氨基酸残基被缺失。该组母体胰岛素类似物的具体实例为des(B30)人胰岛素。 
在另一组母体胰岛素类似物中，B28位上的氨基酸残基为Asp。该组母体胰岛素类似物的具体实例为AspB28人胰岛素。 
在另一组母体胰岛素类似物中，B28位上的氨基酸残基为Lys且B29位上的氨基酸残基为Pro。该组母体胰岛素类似物的具体实例为LysB28ProB29人胰岛素。 
在另一组母体胰岛素类似物中，B30位上的氨基酸残基是Lys且B29位上的氨基酸残基是除Cys、Met、Arg和Lys外的任意可编码的氨基酸。实例为其中B29位上的氨基酸残基为Thr且B30位上的氨基酸残基为Lys的胰岛素类似物。该组母体胰岛素类似物的具体实例为ThrB29LysB30 人胰岛素。 
在另一组母体胰岛素类似物中，B3位上的氨基酸残基是Lys且B29位上的氨基酸残基是Glu。该组母体胰岛素类似物的具体实例为LysB3GluB29人胰岛素。 
本发明胰岛素衍生物的实例有下列化合物： 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)15CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)17CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)18CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu-N-(γ-Glu))des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(Asp-OC(CH2)16CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(Glu-OC(CH2)14CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(Glu-OC(CH2)14CO-)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(Asp-OC(CH2)16CO-)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-α-Glu-N-(β-Asp))des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(Gly-OC(CH2)13CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(Sar-OC(CH2)13CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-β-Asp)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-α-Glu)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-D-Glu)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-β-D-Asp)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-β-D-Asp)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-IDA)des(B30)人胰岛素； 
NεB29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(羧乙基)-Gly]des(B30)人胰岛素； 
NεB29-[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧乙基)-Gly]des(B30)人胰岛素；和 
NεB29-[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧甲基)-β-Ala]des(B30)人胰岛素。 
可以以基本上不含锌的化合物形式或锌的复合物形式提供本发明的胰岛素衍生物。当提供本发明的胰岛素衍生物的锌复合物时，每个胰岛素六聚物可以结合2个Zn2+离子、3个Zn2+离子或4个Zn2+离子。胰岛素衍生物的锌复合物的溶液含有这类物质的混合物。 
在本发明的另一个方面中，可以提供包括治疗有效量的本发明胰岛素衍生物与药学上可接受的载体的药物组合物，用于对需要这种治疗的患者治疗1型糖尿病、2型糖尿病和其它导致血糖过高的状态。本发明的胰岛素衍生物可以用于制备治疗1型糖尿病、2型糖尿病和其它导致血糖过高的状态的药物组合物。 
本发明在另一个方面中提供了对需要这种治疗的患者治疗1型糖尿病、2型糖尿病和其它导致血糖过高的状态的药物组合物，其中包含治疗有效量的本发明胰岛素衍生物与具有快速起效的胰岛素类似物 或胰岛素的混合物和药学上可接受的载体和添加剂。 
本发明在一个实施方案中提供了药物组合物，它是本发明胰岛素衍生物与选自AspB28人胰岛素、LysB28ProB29人胰岛素和LysB3GluB29人胰岛素中的快速起效的胰岛素类似物的混合物。 
本发明在一个实施方案中提供了药物组合物，其中包含NεB29-(N α-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素和AspB28人胰岛素与药学上可接受的载体和添加剂。 
可以将本发明的胰岛素衍生物与快速起效的胰岛素类似物按照约90/10％，约70/30％或约50/50％的比例混合。 
本发明在另一个方面中提供了对需要这种治疗的患者治疗1型糖尿病、2型糖尿病和其它导致血糖过高的状态的方法，包括对所述患者给予治疗有效量的本发明胰岛素衍生物与药学上可接受的载体和药学上可接受的添加剂。 
本发明在另一个方面中提供了对需要这种治疗的患者治疗1型糖尿病、2型糖尿病和其它导致血糖过高的状态的方法，包括对所述患者给予治疗有效量的本发明胰岛素衍生物与胰岛素或具有快速起效的胰岛素类似物的混合物与药学上可接受的载体和药学上可接受的添加剂。 
本发明在另一个方面中涉及具有基本上与人胰岛素类似的总体疏水性的胰岛素衍生物。 
本发明在另一个方面中涉及疏水指数k′rel在约2-约200范围内的胰岛素衍生物。 
在另一个方面中，本发明的胰岛素衍生物具有的疏水指数k′rel 在约0.02-约10，约0.1-约5，约0.5-约5或约0.5-约2的范围内。 
本发明一个实施方案的胰岛素衍生物含有如上所述的侧链-W-X-Y-Z，它带有至少一个亲水区和至少一个疏水区。 
本发明另一个实施方案的胰岛素衍生物含有如上所述的侧链-W-X-Y-Z，它带有至少一个游离羧酸基团；按照进一步的实施方案，该侧链带有至少两个游离羧酸基团。 
在另一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其中包含在生理pH值下可溶的本发明胰岛素衍生物。 
在另一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其中包含在约6.5 
-约8.5区间内的pH值下可溶的本发明胰岛素衍生物。 
在另一个实施方案中，本发明涉及具有延长的作用特性的药物组合物，其中包含本发明胰岛素衍生物。 
在另一个实施方案中，本发明涉及溶液形式的药物组合物，该溶液含有约120nmol/ml-约2400nmol/ml，约400nmol/ml-约2400nmol/ml，约400nmol/ml-约1200nmol/ml，约600nmol/ml-约2400nmol/ml或约600nmol/ml-约1200nmol/ml的本发明胰岛素衍生物或本发明胰岛素衍生物与快速起效的胰岛素类似物的混合物。有关本发明胰岛素衍生物的疏水性数据 
使用LiChrosorb RP18(5μm，250x4mm)HPLC柱，通过在40℃下等度洗脱测定本发明胰岛素衍生物相对于人胰岛素的疏水性(疏水指数)k′rel，在洗脱中使用A)和B)的混合物作为洗脱剂：A)0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.3，含有10％乙腈；B)含50％乙腈的水。通过追踪214nm处洗脱物的UV吸收监测洗脱。通过注射0.1mM硝酸钠测出空隙时间t0。通过改变A与B溶液之间的比例将人胰岛素的保留时间t人调整到至少2t0。k′rel＝(t衍生物-t0)/(t人-t0)。对一些本发明胰岛素衍生物测出的k′rel如表1中所示。 
表1 
  胰岛素衍生物   k′rel
  NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素   0.87
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素   1.15
  NεB29-(N-HOOC(CH2)8CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素   0.45
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-Glu-N-(γ-Glu)des(B30)人胰岛素   1.17
  NεB29-(N-(Asp-OC(CH2)16CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素   0.70
  NεB29-(N-(Glu-OC(CH2)14CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素   0.33
  NεB29-(N-(Glu-OC(CH2)14CO-)des(B30)人胰岛素   1.17
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-Glu)-N-(β-Asp)des(B30)人胰岛素   1.11
  NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)13CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素   0.58
  NεB29-(N-(Sar-OC(CH2)13CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素   0.63
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-Glu)-N-(AspAsp)des(B30)人胰岛素   1.07
  NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)14CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素   0.88
  NεB29-(N-HOOC(CH2)15CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰岛素   1.13
  NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-β-L-Asp)des(B30)人胰岛素   0.69
  NεB29-(N-HOOC(CH2)13CO-β-L-Glu)des(B30)人胰岛素   0.54
  NεB29-(N-HOOC(CH2)13CO-β-L-Asp)des(B30)人胰岛素   0.47
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-δ-L-Aad)des(B30)人胰岛素   0.84
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-D-Glu)des(B30)人胰岛素   1.4
  NεB29-(N-HOOC(CH2)15CO-β-L-Asp)des(B30)人胰岛素   1.09
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Asp)des(B30)人胰岛素   1.49
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Glu)des(B30)人胰岛素   1.51
  NεB29-(N-(HOOC(CH2)14CO-ε-L-LysCO-)des(B30)人胰岛素   0.90
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-β-L-Asp)des(B30)人胰岛素   1.54
  NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)16CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰岛素   1.57
  NεB29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(羧甲基)-β-Ala]des(B30)人胰岛素   1.13
  NεB29-[Nα-(HOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-γ-L-Glu]des(B30)人胰岛素   0.42
药物组合物 
可以通过非肠道途径对需要治疗的患者给予含有本发明胰岛素衍生物的药物组合物。非肠道给药可以通过皮下、肌内或静脉内注射，借助于注射器，任选笔型注射器来进行。另一方面，非肠道给药可以通过输注泵来进行。其它选择包括通过鼻部或通过肺部，优选以特别为该目的设计的组合物、粉末或液体形式给予所述的胰岛素。 
可以使用制药工业的常规技术制备本发明胰岛素衍生物的可注射组合物，包括溶解和混合组分(如果需要)而得到所需终产品。因此，按照一种步骤，将本发明的胰岛素衍生物溶于一定量的水，其体积稍低于待制备的组合物的终体积。如果需要，加入等渗剂、防腐剂和缓冲剂，并且如果必要，则根据需要使用酸(例如盐酸)或碱(例如氢氧化钠水溶液)调节溶液的pH值。最终用水将溶液的体积调节至所需的组分浓度。 
在本发明的另一个实施方案中，缓冲剂选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、N-二(羟乙基)甘氨酸、N-(羟甲基)甲基甘氨酸、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些具体缓冲剂中的每一种构成了本发明的备选实施方案。 
在本发明的另一个实施方案中，所述制剂进一步包含药学上可接受的防腐剂，它可以选自苯酚、邻-甲酚、间-甲酚、对-甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苄醇、氯丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己定(chlorohexidine)、甲醋吡喃酮钠(sodium dehydroacetate)、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、苄索氯铵、氯苯甘醚(3p-氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂的存在浓度为0.1mg/ml-20mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂的存在浓度为0.1mg/ml-5mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂的存在浓度为5mg/ml-10mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂的存在浓度为10mg/ml-20mg/ml。这些具体防腐剂中的每一种构成了本发明的备选实施方案。在药物组合物中应用防腐剂是本领域技术人员众所周知的。为方便起见，参照Remington：《制药科学与实践》(The Science and Practice of Pharmacy)，第19版，1995。 
在本发明的另一个实施方案中，所述制剂进一步包括等渗剂，它 可以选自盐(例如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、醛糖醇(例如甘油(glycerol)(甘油(glycerine))、1，2-丙二醇(丙二醇)、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物组成的组。可以使用任意的糖，诸如单糖、二糖或多糖类或水溶性葡聚糖，包括：例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、普鲁兰、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。在一个实施方案中，糖添加剂为蔗糖。将糖醇定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，其包括例如甘露糖醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中，该糖醇添加剂为甘露糖醇。上述糖类或糖醇类可以单独使用或组合使用。对用量没有固定的限制，只要所述的糖或糖醇溶于液体制剂且不会对使用本发明方法获得的稳定化作用产生不良影响即可。在一个实施方案中，糖或糖醇的浓度为约1mg/ml-约150mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂的存在浓度为1mg/ml-50mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂的存在浓度为1mg/ml-7mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂的存在浓度为8mg/ml-24mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂的存在浓度为25mg/ml-50mg/ml。这些具体等渗剂中的每一种构成了本发明的备选实施方案。在药物组合物中应用等渗剂是本领域技术人员众所周知的。为方便起见，参照Remington：《制药科学与实践》(The Science and Practice of Pharmacy)，第19版，1995。 
典型的等渗剂为氯化钠、甘露糖醇、二甲亚砜和甘油，典型的防腐剂为苯酚、间-甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和苄醇。 
合适的缓冲剂的实例为乙酸钠、甘氨酰甘氨酸、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)和磷酸钠。 
例如，可以如欧洲专利EP272097(授予Novo Nordisk A/S)中所述制备用于鼻部给予本发明胰岛素衍生物的组合物。 
可以将含有本发明胰岛素的组合物用于治疗对胰岛素敏感的病 况。因此，它们可以用于治疗1型糖尿病、2型糖尿病和血糖过高，例如正如有时在受到严重损伤的人和进行了大外科手术的人中观察到的。用于任何患者的最佳剂量水平取决于各种因素，包括所用具体胰岛素衍生物的功效、患者的年龄、体重、身体活动和膳食；取决于与其它药物的可能的组合；并取决于所治疗情况的严重程度。建议由本领域技术人员按照与已知胰岛素组合物类似的方式针对每一患者个体确定本发明胰岛素衍生物的每日剂量。 
如在方便时，可以使用本发明胰岛素衍生物与其它类型的胰岛素，例如具有更快速起效作用的胰岛素类似物的混合物。这类胰岛素类似物的实例描述在例如公开号为EP 214826(Novo Nordisk A/S)、EP375437(Novo Nordisk A/S)和EP 383472(Eli Lilly & Co.)的欧洲专利申请中。 
通过下列实施例进一步解释本发明，但这些实施例并不用来限定本发明的范围。 
定义 
本文所用的″胰岛素类似物″指的是具有在形式上可以通过缺失和/或交换天然存在的胰岛素中存在的至少一个氨基酸残基和/或添加至少一个氨基酸残基而衍生自天然存在的胰岛素(例如人胰岛素)结构的分子结构的多肽。所添加和/或交换的氨基酸残基可以为可编码的氨基酸残基或其它天然存在的残基或纯属合成的氨基酸残基。胰岛素类似物可以为这类化合物，其中B链的28位可以由天然的Pro残基修饰成Asp、Lys或Ile之一。在另一个实施方案中，B29位上的Lys被修饰成Pro。在一个实施方案中，B30可以为Lys且B29可以为除Cys、Met、Arg和Lys外的任意可编码的氨基酸。 
此外，可以将A21位上的Asn修饰成Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，特别是修饰成Gly、Ala、Ser或Thr，优选修饰成Gly。此外，可以将B3位上的Asn修饰成Lys或Asp。胰岛素类似物的其它实例为：des(B30)人胰岛素；des(B30)人胰岛素类似物；其中PheB1已经缺失的胰岛素类似物；其中A-链和/ 
本文所用的术语″胰岛素衍生物″指的是已被化学方式修饰过的天然存在的胰岛素或胰岛素类似物，该修饰可以是例如在胰岛素骨架的一个或多个位置上引入侧链或者氧化或还原胰岛素上氨基酸残基的基团或者将游离羧基转化成酯基或酰化游离氨基或羟基。 
表达方式″可编码的氨基酸″或″可编码的氨基酸残基″用于表示可以由核苷酸三联体(″密码子″)编码的氨基酸或氨基酸残基。 
hGlu为高谷氨酸。 
α-Asp为-HNCH(CO-)CH2COOH的L-形式。 
β-Asp为-HNCH(COOH)CH2CO-的L-形式。 
α-Glu为-HNCH(CO-)CH2CH2COOH的L-形式。 
γ-Glu为-HNCH(COOH)CH2CH2CO-的L-形式。 
α-hGlu为-HNCH(CO-)CH2CH2CH2COOH的L-形式。 
δ-hGlu为-HNCH(COOH)CH2CH2CH2CO-的L-形式。 
β-Ala为-NH-CH2-CH2-COOH。 
Sar为肌氨酸(N-甲基甘氨酸)。 
表达方式″在侧链上具有羧酸基团的氨基酸残基″表示象Asp、Glu和hGlu之类的氨基酸残基。氨基酸可以为L-或D-构型。如果没有具体指明，则应理解氨基酸残基为L构型。 
表达方式″带有中性侧链的氨基酸残基″表示象Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Tyr、Asn和Gln之类的氨基酸残基。 
当将本发明的胰岛素衍生物描述为″在生理pH值下可溶″时，它指的是该胰岛素衍生物可以用于制备在生理pH值下完全溶解的可注射胰岛素组合物。这类有利溶解性可能仅是因胰岛素衍生物的内在特性所致，或是胰岛素衍生物与载体中包含的一种或多种组分之间的有利相互作用的结果。 
本说明书和实施例中使用下列缩写： 
Aad：α-氨基-己二酸(高谷氨酸) 
Bzl＝Bn：苄基 
DIEA：N，N-二异丙基乙胺 
DMF：N，N-二甲基甲酰胺 
IDA：亚氨基二乙酸 
Sar：肌氨酸(N-甲基-甘氨酸) 
tBu：叔丁基 
TSTU：O-(N-琥珀酰亚胺基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐 
THF：四氢呋喃 
EtOAc：乙酸乙酯 
DIPEA：二异丙基乙胺 
HOAt：1-羟基-7-氮杂苯并三唑 
TEA：三乙胺 
Su：琥珀酰亚胺基＝2，5-二氧代-吡咯烷-1-基 
TFA：三氟乙酸 
DCM：二氯甲烷 
DMSO：二甲亚砜 
TLC：薄层色谱法 
RT：室温 
                         实施例 
实施例1 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素的合成 
将200mg des(B30)人胰岛素溶于置于15℃水浴中的试管内包含的10ml 50mM Na2CO3(pH 10.2)中。将甲基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OMe(37.90mg，如下所述制备)溶于10ml乙腈，随后加入胰岛素溶液中。在30分钟后，通过添加3.8ml用稀HCl调节至pH9.0的0.2M乙醇胺终止反应。反应产率如RP-HPLC所测定的为37％。 在添加2.5体积的水并将pH调节至5.5后产物沉淀。然后将该沉淀溶于pH 8下的10ml水并放入冰中。向该溶液中加入10ml冰冷的0.2M NaOH以便皂化，并在用冰冷却的同时将该混合物保温40分钟，然后调节至pH 5.5以便沉淀产物。分离沉淀并将其溶于5ml A-缓冲液(参见下文)，用33ml的42.5％ w/w乙醇水溶液分三份稀释，进行阴离子交换色谱，其中使用ResourceTM 6ml阴离子交换柱，用由A-缓冲液和B-缓冲液组成的缓冲系统洗脱，其中A-缓冲液：Tris 0.24％w/w，NH4Ac 0.25％，42％乙醇w/w，pH 7.5；B-缓冲液：Tris 0.24％w/w，NH4Ac1.25％，42％乙醇w/w pH 7.5。以6ml/分钟的流速，在30分钟内以0-100％B-缓冲液的梯度洗脱样品。通过RP-HPLC鉴定含有所需化合物的级分。所需产物的产率为15.3mg(纯度：72.9％)。在真空中将含有所需化合物的合并级分的体积减少至20ml，然后通过RP-HPLC对该溶液进行纯化，其中使用反相HPLC柱Nucleosil，C4 250/10mm，10μm，300
Figure 10003_0
。缓冲系统由A-缓冲液：10mM Tris，15mM(NH4)2SO4，10％乙醇，pH 7.3和B-缓冲液：70％vol/vol乙醇组成。 
在120分钟内用10％-60％的B-缓冲液梯度以2ml/分钟的流速洗脱产物。合并合适的级分并沉淀化合物且冻干。产量为7.7mg(纯度：99.4％)。 
通过质谱测得分子量为6097.2，计算值为6104.1。在用金黄色葡萄球菌蛋白酶消化后得到含有侧链的B-末端肽。通过质谱测得分子量为1413.1，计算值为1413.5。 
甲基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OMe的制备 
使用1.0当量的NaOH在MeOH中皂化十六烷二酸二甲酯，在使用HCl酸化时通过从庚烷中重结晶分离单甲酯。 
将十六烷基二酸单甲酯(275mg，0.91mmol)溶于THF(3ml)，用四甲基脲鎓四氟硼酸琥珀酰亚胺盐(酯)(331mg，1.1mmol)和N，N-二异丙基乙胺(188μL，1.1mmol)处理，并将该混合物搅拌20小时。在真空中除去溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯，并用0.1M HCl(两次) 和水洗涤。用MgSO4干燥有机相，过滤并在真空中蒸发，得到350mg(96％)的十六烷二酸甲基琥珀酰亚胺基酯。 
1H-NMR(CDCl3)□：3.66(s，3H)，2.83(s，4H)，2.60(t，2H)，2.30(t，2H)，1.74(p，2H)，1.62(p，2H)，1.40(m，2H)，1.35-1.22(m，18H)。 
用GluOMe(93mg，0.58mmol)和N，N-二异丙基乙胺(200μL，1.16mmol)处理在二甲基甲酰胺(5ml)中的十六烷二酸甲基琥珀酰亚胺基酯(240mg，0.58mmol)。将该混合物搅拌20小时，然后在真空中蒸发。将残余物重新溶于乙酸乙酯。用0.1M HCl和水洗涤，随后干燥(MgSO4)并在真空中蒸发，得到226mg(88％)的甲基十六烷二酰基-Glu-Ome。 
1H-NMR□：6.22(d，1H)，4.65(m，1H)，3.76(s，3H)，3.66(s，3H)，2.42(t，2H)，2.29(m，4H)，2.22(t，2H)，1.97(m，2H)，1.62(m，4H)，1.35-1.22(m，20H)。 
将甲基十六烷二酰基-Glu-OMe(200mg，0.45mmol)溶于二氯甲烷(4ml)，用冰浴冷却，并用二环己基碳化二亚胺(93mg，0.45mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(52mg，0.45mmol)处理。将该混合物搅拌20小时，过滤并在真空中蒸发，得到243mg(100％)的所需中间体。 
1H-NMR(CDCl3)□：6.34(d，1H)，4.67(m，1H)，3.73(s，3H)，3.64(s，3H)，2.81(s，4H)，2.66(m，2H)，2.27(m，4H)，2.20(t，2H)，1.89(m，1H)，1.70(m，1H)，1.58(m，4H)，1.29-1.20(m，20H)。 
实施例2 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素的合成 
如实施例1中所述将300mg des(B30)人胰岛素酰化，纯化并分离，但在本实施例中将甲基十八烷二酰基-Glu(OSu)-OMe(如下所述制备)用作酰化剂，而不是实施例1中所用的甲基十六烷二酰基 -Glu(OSu)-OMe。得到25.5mg标题化合物(纯度：97.4％)。通过质谱测得分子量为6136.6，计算值为6132。在通过金黄色葡萄球菌蛋白酶消化后得到含有配体的B-末端肽。通过质谱测得分子量为1439.1，计算值为1442.5。 
甲基十八烷二酰基-Glu(OSu)-OMe的制备 
按照与实施例1中所述的十六烷二酰基衍生物类似的方式由十八烷二酸二甲酯制备该化合物。 
1H-NMR(CDCl3)□：6.20(d，1H)，4.70(m，1H)，3.78(s，3H)，3.67(s，3H)，2.84(s，4H)，2.70(m，2H)，2.30(m，4H)，2.22(t，2H)，1.93(m，1H)，1.70(m，1H)，1.62(m，4H)，1.33-1.23(m，24H)。 
实施例3 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-Glu-N-(γ-Glu))des(B30)人胰岛素的合成 
按照如实施例1中所述类似的方式，用甲基十八烷二酰基-Glu(Glu(OSu)-OMe)-OMe酰化300mg的des(B30)人胰岛素。如上所述进行阴离子交换纯化。然而，用100％B-缓冲液进行延长洗脱以便洗脱所需产物。通过RP-HPLC鉴定含有所需产物的级分，获得47.5mg产物，纯度为55％。在真空中减少含有所需产物的级分的体积，通过RP-HPLC对所得溶液进行纯化，其中使用来自Phenomerex的反相HPLCJupiter柱，C4 250/10mm，10μm，300
Figure 10003_1
。缓冲系统由A-缓冲液(0.1％TFA，10％ vol/vol乙醇)和B-缓冲液(80％ vol/vol乙醇)组成。用40℃的40％-60％的B-缓冲液梯度在120分钟内以2ml/分钟的流速洗脱样品。合并合适的级分并冻干，得到31.1mg的标题化合物(纯度：94％)。 
通过质谱测得标题化合物的分子量为6259.65，计算值为6261.2。在用金黄色葡萄球菌蛋白酶消化后得到的含有侧链的B-末端肽的分子量(根据质谱)的测定值为1569.88，计算值为1569.88。 
甲基十八烷二酰基-Glu(Glu(OSu)-OMe)-OMe的制备 
用GluOMe(62mg，0.39mmol)和N，N-二异丙基乙胺(90μL，53mmol)处理在二甲基甲酰胺(5ml)中的甲基十八烷二酰基-Glu(OSu)-OMe(如实施例2中所述制备，200mg，0.35mmol)，将该混合物搅拌20小时。在真空中除去溶剂，并将残余物溶于乙酸乙酯，用0.2M HCl、水和盐水洗涤两次。用MgSO4干燥并蒸发后，得到甲基十八烷二酰基-Glu(Glu-OMe)-OMe，180mg(83％)。 
将甲基十八烷二酰基-Glu(Glu-OMe)-OMe(180mg，0.29mmol)溶于THF(9ml)，用四甲基脲鎓四氟硼酸琥珀酰亚胺盐(酯)(106mg，0.35mmol)和N，N-二异丙基乙胺(60μL，0.35mmol)处理。将该混合物搅拌过夜，蒸发，重新溶于乙酸乙酯，并用2×0.1M HCl和水洗涤。用MgSO4干燥并蒸发后，得到190mg(93％)的所需中间体。 
1H-NMR(CDCl3)δ：6.73(d，1H)，6.43(d，1H)，4.69(m，1H)，4.56(m，1H)，3.77(s，3H)，3.74(s，3H)，3.66(s，3H)，2.85(s，4H)，2.72(m，2H)，2.41-2.12(m，8H)，2.95(m，2H)，1.72-1.56(m，6H)，1.35-1.22(m，22H)。 
实施例4 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-L-Glu)des(B30)人胰岛素的合成 
在室温下将des(B30)人胰岛素(500mg，0.088mmol)溶于100mMNa2CO3(5ml，pH 10.2)。将叔丁基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OtBu(66mg，0.105mmol，如下所述制备)溶于乙腈(5ml)，随后加入到胰岛素溶液中。30分钟后，加入0.2M甲胺(0.5ml)。用HCl将pH调节至5.5，通过离心收集等电沉淀，在真空中干燥后得到525mg。偶联产率为78％(RP-HPLC，C4柱；缓冲液A：在0.1％TFA-水中的10％ MeCN；缓冲液B：在0.1％ TFA-水中的80％ MeCN；梯度20％-90％ B，在16分钟内)。将被保护的产物溶于TFA(10ml)，保持30分钟并在真空中蒸发。将粗产物溶于水并冻干(610mg)。通过用C4-柱进行RP-HPLC 纯化0454，其中缓冲液A：20％ EtOH+0.1％ TFA，缓冲液B：80％EtOH+0.1％ TFA；梯度15-60％ B，随后用C4-柱进行HPLC，其中缓冲液A：10mM Tris+在20％ EtOH中的15mM硫酸铵，pH 7.3，缓冲液B：80％ EtOH，梯度15-60％ B。用Sep-Pak与70％乙腈+0.1％TFA对收集的级分脱盐，通过添加氨中和，冻干。未优化的产率为64mg，12％。通过HPLC评估的纯度为99.2％。LCMS 6102.9，C274H411N65O81S6理论值6104.1。在用金黄色葡萄球菌蛋白酶消化后得到含有侧链的B-末端肽(RGFFYTPK(Nε-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-L-Glu)。MALDI-MS：1413.1，计算值：1412.7。 
叔丁基十六烷二酰基-L-Glu(OSu)-OtBu的制备 
将十六烷二酸(40.0g，140mmol)悬浮于甲苯(250ml)中，并将该混合物加热至回流。在4小时内滴加N，N-二甲基甲酰胺二叔丁基缩醛(76.3g，375mmol)。将该混合物回流过夜。在50℃下真空中除去溶剂，将粗物质悬浮于DCM/AcOEt(500ml，1∶1)中，搅拌15分钟。通过过滤收集固体，并与DCM(200ml)一起研磨。在真空中蒸发滤液，得到十六烷二酸一叔丁酯粗品30克。将该物质悬浮于DCM(50ml)，用冰冷却10分钟并过滤。在真空中除去溶剂而得到25克十六烷二酸一叔丁酯粗品，使其从庚烷(200ml)中重结晶，得到十六烷二酸一叔丁酯15.9g(33％)。作为重结晶的备选，可以通过使用AcOEt/庚烷的硅胶色谱法纯化所述的一酯。 
1H-NMR(CDCl3)δ：2.35(t，2H)，2.20(t，2H)，1.65-1.55(m，4H)，1.44(s，9H)，1.34-1.20(m，20H)。 
将该一叔丁酯(2g，5.8mmol)溶于THF(20ml)，并用TSTU(2.1g，7.0mmol)和DIEA(1.2ml，7.0mmol)处理，搅拌过夜。过滤该混合物，在真空中蒸发滤液。将残余物溶于AcOEt，用冷0.1M HCl和水洗涤两次。用MgSO4干燥，在真空中蒸发，得到十六烷二酸琥珀酰亚胺基叔丁基酯2.02g(79％)。 
1H-NMR(CDCl3)δ：2.84(s，4H)，2.60(t，2H)，2.20(t，2H)，1.74(p，2H)，1.56(m，2H)，1.44(s，9H)，1.40(m，2H)，1.30-1.20(m，18H)。 
将十六烷二酸琥珀酰亚胺基叔丁基酯(1g，2.27mmol)溶于DMF(15ml)，用L-Glu-OtBu(0.51g，2.5mmol)和DIEA(0.58ml，3.41mmol)处理，将该混合物搅拌过夜。在真空中蒸发溶剂，将粗产物溶于AcOEt，用0.2M HCl洗涤两次，用水和盐水洗涤。用MgSO4干燥，在真空中蒸发，得到叔丁基十六烷二酰基-L-Glu-OtBu，1.2g(100％)。 
1H-NMR(CDCl3)δ：6.25(d，1H)，4.53(m，1H)，2.42(m，2H)，2.21(m，4H)，1.92(m，1H)，1.58(m，4H)，1.47(s，9H)，1.43(s，9H)，1.43-1.22(m，18H)。 
将叔丁基十六烷二酰基-L-Glu-OtBu(1.2g，2.27mmol)溶于THF(15ml)，用TSTU(0.82g，2.72mmol)和DIEA(0.47ml，2.72mmol)处理，搅拌过夜。过滤该混合物并在真空中蒸发滤液。将残余物溶于AcOEt，用冷0.1M HCl和水洗涤两次。用MgSO4干燥并在真空中蒸发后，得到叔丁基十六烷二酰基-L-Glu(OSu)-OtBu，1.30g(92％)。 
1H-NMR(CDCl3)δ：6.17(d，1H)，4.60(m，1H)，2.84(s，4H)，2.72(m，1H)，2.64(m，1H)，2.32(m，1H)，2.20(m，4H)，2.08(m，1H)，1.6(m，4H)，1.47(s，9H)，1.43(s，9H)，1.33-1.21(m，20H)。 
实施例5 
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-L-Glu)des(B30)人胰岛素的合成 
将desB30胰岛素(50mg，9μmol)溶于pH 10.5的0.1M Na2CO3水溶液(0.65ml)。将十八烷二酰基-L-Glu(OSu)(50.1mg，9.9μmol，如下所述制备)溶于乙腈(0.65ml)并加入到该胰岛素溶液中；pH为10.3。30分钟后，加入0.2M甲胺(50μl)。用HCl将pH调节至5.5，通过离心收集等电沉淀，在真空中干燥。HPLC显示粗偶联产率为52％(未优化)；C4柱；缓冲液A：在0.1％ TFA-水中的10％ MeCN，缓 冲液B：在0.1％ TFA-水中的80％ MeCN；梯度20％-90％ B，16分钟内)。LCMS 6133.2，C276H415N65O81S6理论值6132.2。 
十八烷二酰基-L-Glu(OSu)的制备 
将十八烷二酸(2.5g，8.0mmol)悬浮于DCM(60mL)，用三乙胺(1.16mL，8.3mmol)处理并用冰冷却。在氮气环境中滴加氯甲酸苄基酯(1.14mL)，将该混合物搅拌10分钟，此时加入DMAP(0,097g，0.80mmol)。在4℃下搅拌20分钟(TLC，1∶1 AcOEt∶庚烷)后，将该反应体系蒸发至干。将粗物质(3.9g)溶于DCM(60ml)，用二氧化硅(15g)处理并蒸发。将二氧化硅装载到硅胶柱(175g)上，并用AcOEt/庚烷1∶7-1∶1洗脱产物。蒸发所需级分，得到十八烷二酸一苄酯(1.15g，36％)。 
1H-NMR(CDCl3)δ：7.35(m，5H)，5.11(s，2H)，2.35(t，4H)，1.63(t，4H)，1.30-1.22(m，24)。 
将十八烷二酸一苄酯溶于DMF(3.5mL)和THF(7mL)中，并用冰浴冷却。加入DIEA(0.103mL)和TSTU，将该混合物在冰浴下搅拌1小时且在RT下搅拌过夜。在真空中蒸发溶剂，将残余物溶于AcOEt，用0.2N HCl、饱和NaHCO3洗涤两次，干燥，过滤并蒸发至干，得到琥珀酰亚胺基一苄基十八烷二酸酯(0.25g，100％)。 
1H-NMR(CDCl3)δ：7.35(m，5H)，5.11(s，2H)，2.83(s，4H)，2.60(t，2H)，2.35(t，2H)，1.80-1.60(m，4H)，1.40-1.20(m，24)。 
将琥珀酰亚胺基一苄基十八烷二酸酯(95mg，0.19mmol)溶于DMF(1.5ml)，并用L-Glu-OBzl(49mg，0.21mmol)和DIEA(50□l，0.28mmol)处理，将该混合物搅拌过夜。在真空中蒸发溶剂，将粗产物溶于AcOEt，用0.2M HCl洗涤两次、用水和盐水洗涤。用MgSO4干燥并在真空中蒸发，得到BzlO-十八烷二酰基-L-Glu-OBzl，114mg(97％)。 
1H-NMR(CDCl3)δ：7.35(m，5H)，6.22(d，2H)，5.17(s，2H)， 5.11(s，2H)，4.71(m，1H)，2.37(m，4H)，2.22(m，3H)，1.98(m，1H)，1.63(m，4H)，1.31-1.20(m，24H)。 
将BzlO-十八烷二酰基-L-Glu-OBzl(110g，0.18mmol)溶于THF(2ml)，并用TSTU(64mg，0.21mmol)和DIEA(36μl，0.21mmol)处理，搅拌过夜。过滤该混合物并在真空中蒸发滤液。将残余物溶于AcOEt，用冷0.1M HCl和水洗涤两次。用MgSO4干燥并在真空中蒸发，得到BzlO-十八烷二酰基-L-Glu(OSu)-OBzl，119g(94％)。 
1H-NMR(CDCl3)δ：7.36(m，5H)，6.40(d，2H)，5.19(s，2H)，5.11(s，2H)，4.75(m，1H)，2.82(s，4H)，2.68(m，1H)，2.59(m，1H)，2.35(t，2H)，2.19(t，2H)，1.62(m，4H)，1.32-1.21(m，24H)。 
将BzlO-十八烷二酰基-L-Glu(OSu)-OBzl(59mg，0.082mmol)溶于丙酮/0.1％ TFA(1ml)。加入Pd/C(20mg)。将烧瓶抽真空并充几次N2，连接充满H2的气囊。将该混合物在RT下搅拌3小时，然后通过C盐过滤。从庚烷中沉淀并蒸发残余溶剂，得到十八烷二酰基-L-Glu(OSu)(27mg，61％)。 
1H-NMR(CDCl3)δ：6.32(d，1H)，4.70(m，1H)，3.70(m，1H)，3.06(m，2H)，2.88(s，4H)，2.62(m，2H)，2.35(m，2H)，2.24(m，1H)，1.74(m，1H)，1.64(m，2H)，1.50-1.20(m，26H)。 
实施例6 
NεB29-(N-(L-Asp-OC(CH2)16CO)-γ-L-Glu)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使L-Asp(OtBu)-OtBu与十八烷二酸琥珀酰亚胺酯反应，随后用TSTU活化，与L-GluOtBu反应，用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。 
LCMS 6247.5，计算值6247.3。 
实施例7 
NεB29-(N-(L-Glu-OC(CH2)14CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使L-Glu(OtBu)-OtBu与十六烷二酸琥珀酰亚胺酯反应，随后用TSTU活化，与L-GluOtBu反应，用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6261.3，计算值6261.3。 
实施例8 
NεB29-(N-(L-Glu-OC(CH2)14CO-)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使L-Glu(OtBu)-OtBu与十六烷二酸琥珀酰亚胺酯反应，随后用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6130.8，计算值6132.2。 
实施例9 
NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Glu)-N-(β-L-Asp)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亚胺基酯与L-Glu(OtBu)反应，随后用TSTU活化，与L-AspOtBu反应，用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6246.9，计算值6247.3。 
实施例10 
NεB29-(N-HOOC(CH2)15CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使十七烷二酸叔丁基琥珀酰亚胺基酯(A.C.Cope，U.Axen，E.P. Burrows，J.Weinlich，《美国化学协会杂志》(J.Am.Chem Soc.)1966，88，4228)与L-GluOtBu反应，随后用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6118.3，计算值6118.1。 
实施例11 
NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)13CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使L-GlyOtBu与十五烷二酸琥珀酰亚胺酯反应，随后用TSTU活化，与L-GluOtBu反应，用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6147.5，计算值6147.1。 
实施例12 
NεB29-(N-(L-Sar-OC(CH2)13CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使L-Sar-OtBu与十五烷二酸琥珀酰亚胺酯反应，随后用TSTU活化，与L-GluOtBu反应，用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6161.0，计算值6161.1。 
实施例13 
NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Asp)-N-(β-L-Asp)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亚胺基酯与L-Asp(OtBu)反应，随后用TSTU活化，与L-AspOtBu反应，用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6233.8，计算值6233.2。 
实施例14 
NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)14CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使L-GlyOtBu与十六烷二酸琥珀酰亚胺酯反应，随后用TSTU活化，与L-GluOtBu反应，用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6160.7，计算值6161.1。 
实施例15 
NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-β-L-Asp)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使L-Asp(OtBu)与十六烷二酸叔丁基琥珀酰亚胺基酯反应，随后用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6089.8，计算值6089.8。 
实施例16 
NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-β-L-Asp)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亚胺基酯与L-Asp(OtBu)反应，随后用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6117.8，计算值6118.1。 
实施例17 
NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)16CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使L-GlyOtBu与十八烷二酸琥珀酰亚胺酯反应，随后用TSTU活化，与L-GluOtBu反应，用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6189.2，计算值6189.2。 
实施例18 
NεB29-(N-(HOOC(CH2)14CO-ε-L-LysCO-)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使十 六烷二酸叔丁基琥珀酰亚胺基酯与L-Lys(Z)-OtBu反应，随后用Pd/C氢化并在原位用氯甲酸4-硝基苯基酯活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6189.2，计算值6189.2。 
实施例19 
NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Glu)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亚胺基酯与L-Glu(OtBu)反应，随后用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6132.1，计算值6132.2。 
实施例20 
NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Asp)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亚胺基酯与L-Asp(OtBu)反应，随后用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6117.8，计算值6118.1。 
实施例21 
NεB29-(N-HOOC(CH2)15CO-β-L-Asp)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使十七烷二酸叔丁基琥珀酰亚胺基酯与L-AspOtBu反应，随后用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6104.2，计算值6104.1。 
实施例22 
NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-D-Glu)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亚胺基酯与D-GluOtBu反应，随后用TSTU活化， 与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6132.4，计算值6132.2。 
实施例23 
NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-δ-L-Aad)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亚胺基酯与L-AadOtBu(由商品L-Aad(OMe)，通过用AcOtBu/BF3.OEt2叔丁基化并对该甲酯皂化而制备)反应，随后用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6116.9，计算值6118.1。 
实施例24 
NεB29-(N-HOOC(CH2)13CO-β-L-Asp)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使十五烷二酸叔丁基琥珀酰亚胺基酯与L-AspOtBu反应，随后用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6074.7，计算值6076.1。 
实施例25 
NεB29-(N-HOOC(CH2)13CO-β-L-Glu)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使十五烷二酸叔丁基琥珀酰亚胺基酯与L-GluOtBu反应，随后用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。MALDI-MS 6080.6，计算值6076.1。 
实施例26 
NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-β-D-Asp)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使十六烷二酸叔丁基琥珀酰亚胺基酯与D-AspOtBu反应，随后用TSTU活化， 与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6089.1，计算值6090.1。 
实施例27 
NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-β-D-Asp)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使十八烷二酸叔丁基琥珀酰亚胺基酯与D-AspOtBu反应，随后用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6117.1，计算值6118.1。 
实施例28 
NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-IDA)des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例4类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使叔丁基3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪-3-基十六烷二酸酯与亚氨基二乙酸反应，随后用TSTU活化，与Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。LCMS 6089.1，计算值6090.1。 
实施例29 
NεB29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(羧甲基)-β-Ala]des(B30)人胰岛素的合成 
将A1N，B1N-diBoc DesB30人胰岛素(Kurtzhals P；Havelund S；Jonassen I；Kiehr B；Larsen UD；Ribel U；Markussen J《生物化学杂志》(Biochemical Journal)，1995，312，725-731)(186mg，0.031mmol)溶于DMSO(1.8ml)。加入叔丁基十八烷二酰基-N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OSu(27mg，0.04mmol)在THF(1.8ml)和三乙胺(0.045ml，0.31mmol)中的溶液(pH为10)。在室温下缓慢搅拌45分钟后，用0.2M在THF(0,20ml)中的甲胺使反应猝灭。加入水(5ml)并用1N HCl将pH调节至5.5。通过离心收集等电沉淀并冻干，得到150mg。偶联产率为74％(LCMS m/z：2148.9[(M+3)/3]，rt 5.04)。 将被保护的产物溶于TFA(2.5ml)并保持1小时，在真空中蒸发。通过用C4-柱进行RP-HPLC纯化粗产物，其中使用缓冲液A：0.1％ TFA，缓冲液B：MeCN+0.1％ TFA；梯度10-70％ B。冻干收集的级分。产率为75mg，52％。通过HPLC评估的纯度为97.2％。 
MALDI-MS：6132.1，计算值：6132.2。 
叔丁基十八烷二酰基-N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OSu的制备 
在115℃下将十八烷二酸(5.64g，17.9mmol)溶于甲苯(80ml)。在1.5小时内滴加N，N-二甲基甲酰胺二叔丁基缩醛(12.9ml，53.8mmol)。在回流3小时后，在20分钟内再加入N，N-二甲基甲酰胺二叔丁基缩醛(2.15ml)。持续回流过夜并在20分钟内再加入N，N-二甲基甲酰胺二叔丁基缩醛(2.15ml)。再搅拌2小时后，将该反应混合物冷却至RT。加入水和DCM。通过过滤除去二酸。用硅胶(40g)浓缩滤液并在1.5L硅胶柱上使用DCM/MeOH 14∶1进行纯化。分离到十八烷二酸一叔丁酯，产率为53％(3.52g)。 
LC-MS：393(M+Na)，rt 6.40. 
1H-NMR(DMSO-d6)：δ1.22(br s，24H)，1.38(s，9H)，1.47(m，4H)，2.14(t，2H)，2.18ppm(t，2H)。 
向十八烷二酸一叔丁酯(1,00g，2.7mmol)在无水THF(8ml)中的溶液中加入DIPEA(0,555ml，3.2mmol)，随后加入TSTU(1,00g，3.2mmol)。将该反应混合物在氮气环境中搅拌18小时。蒸发溶剂。将AcOEt加入到残余物中并过滤所得混悬液。用冷0.1M HCl(2x)和水洗涤滤液，干燥并浓缩，得到十八烷二酸琥珀酰亚胺基叔丁基酯，为白色固体。 
1H-NMR(CDCl3)：δ1.25(m s，20H)，1.39(m，2H)1.44(s，9H)，1.58(m，4H)，1.74(p，2H)，2.2(t，2H)，2.60(t，2H)，2,85ppm(m，2H)。 
向H-Gly-OtBu(1.00g，6.0mmol)在无水DMF(6ml)中的混悬液中加入三乙胺(0.835ml，6.0mmol)。观察到三乙胺盐酸盐沉淀。加入丙烯酸苄酯(0.910ml，6.0mmol)在DMF(6ml)中的溶液。将所得混悬液在室温下搅拌2天。通过过滤除去沉淀并浓缩滤液。将残余物溶于AcOEt并用饱和NaHCO3洗涤。干燥有机层(MgSO4)，过滤并浓缩得到澄清油状物，将其通过快速色谱法纯化，使用AcOEt/庚烷1∶3和1∶1作为洗脱剂。分离到N-叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OBn，产率为29％(0.505g)。 
1H-NMR(CDCl3)δ：ppm 1.43(s，9H)，2.55(t，2H)，2.92(t，2H)，3.30(s，2H)，5.15(s，2H)，7.65(m，5H)。 
将十八烷二酸琥珀酰亚胺基叔丁基酯(0.15g，0.32mmol)和N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OBn(0.10g，0,32mmol)溶于无水DMF(2.5ml)并加入DIEA(0,070ml，0.38mmol)。在氮气环境中搅拌30分钟后，加入HOAt(0,045g，0.32mmol)，该混合物变成黄色。出于便利考虑，在RT下氮气环境中持续搅拌13天。浓缩该反应混合物。将残余物溶于AcOEt，用0.1N HCl(2x)和水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩得到叔丁基十八烷二酰基-N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OBn，为白色油状物。205mg，产率99％。 
1H-NMR(CDCl3)δ：ppm 1.25(m，26H)，1.45(s，9H)，1.50(s，9H)，1.6(m，4H)，2.20(t，2H)，2.40(t，2H)，2.75(q，2H)，3.62(t，2H)，3.97(s，2H)，5.20(s，2H)；7.35(m，5H)。 
将叔丁基十八烷二酰基-N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OBn(200mg，0.31mmol)溶于EtOAc(10ml)和THF(5ml)。加入10％ Pd/C并将该混合物在1atm下氢化16小时。过滤该反应混合物，浓缩得到叔丁基十八烷二酰基-N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OH，为澄清油状物。产率180mg，100％。 
1H-NMR(CDCl3)δ：ppm 1.25(m，26H)，1.45(s，9H)，1.50(s，9H)， 1.6(m，4H)，2.20(t，2H)，2.40(t，2H)，2.70(m，2H)，3.65(m，2H)，4.05(s，2H)。 
将叔丁基十八烷二酰基-N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OH(0,110g，0.2mmol)溶于无水THF(2ml)。加入DIEA(0,045ml，0.24mmol)和TSTU(0,075g，0.24mmol)。将该混合物在氮气环境中搅拌18小时。过滤该反应混合物。将AcOEt加入到滤液中，用0.2M HCl(2x)、盐水(1x)洗涤，干燥(Na2SO4)，浓缩得到叔丁基十八烷二酰基-N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OSu，为澄清糖浆状物。产率124mg，96％。 
1H-NMR(CDCl3)δ：ppm 1.25(m，26H)，1.40(s，9H)，1.57(s，9H)，1.6(m，4H)，2.40(m，4H)，2.58(br s，4H)，3.0(t，2H)，3.7(t，2H)，4.03(s，2H)。 
实施例30 
NεB29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(2-羧乙基)-Gly]des(B30)人胰岛素的合成 
将A1N，B1N-diBoc DesB30人胰岛素(Kurtzhals P；Havelund S；Jonassen I；Kiehr B；Larsen UD；Ribel U；Markussen J《生物化学杂志》(Biochemical Journal)，1995，312，725-731)(120mg，0.020mmol)溶于DMSO(1.2ml)。加入叔丁基十八烷二酰基-N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OSu(16mg，0.025mmol)在THF(1.2ml)和三乙胺(0.033ml，0.24mmol)中的溶液(pH为10)。在室温下缓慢搅拌3小时20分钟后，加入水(4ml)并用1N HCl将pH调节至5.5。通过离心收集等电沉淀，用水洗涤并通过离心分离。冻干产物。通过用C18-柱进行RP-HPLC纯化粗产物，其中使用缓冲液A：0.1％ TFA，缓冲液B：MeCN+0.1％ TFA；梯度20-90％ B。冻干收集的级分。未优化的偶联产率为15mg，11％(MALDI-MS 6441，计算值6444.5)。将被保护的产物溶于TFA(1ml)并保持1小时，在真空中蒸发。通过下列步骤纯化粗产物：用C4-柱进行RP-HPLC，其中使用缓冲液A：0.1％ TFA， 缓冲液B：MeCN+0.1％ TFA；梯度10-80％ B；并用C4-柱进行RP-HPLC，其中使用缓冲液A：20％ EtOH+0.1％ TFA，缓冲液B：80％ EtOH+0.1％ TFA；梯度15-60％ B；随后使用C4-柱进行HPLC，其中使用缓冲液A：在20％ EtOH中的10mM Tris+15mM硫酸铵，pH 7.3，缓冲液B：80％ EtOH，梯度15-60％ B。在Sep-Pak上使用70％乙腈+0.1％TFA给收集的级分脱盐，通过添加氨中和并冻干。未优化的产率为1.8mg，13％。通过HPLC评估的纯度为96.4％。 
MALDI：6132.1，计算值：6132.2。 
叔丁基十八烷二酰基-N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OSu的制备 
将H-Gly-OBn，HCl(3.03g，15mmol)溶于无水DMF(15ml)并在冰浴上冷却。在TEA-盐酸盐沉淀中加入TEA(2.10，15mmol)。将该混悬液搅拌5分钟，此后加入丙烯酸叔丁酯(2.20ml，15mmol)。使冷却浴缓慢达到RT并在氮气环境中持续搅拌2天。过滤该反应混合物并浓缩滤液。将仍然含有DMF的残余物溶于AcOEt并用饱和NaHCO3(2x)水溶液和水(1x)洗涤。过滤有机层，此后干燥(Na2SO4)并浓缩至得到黄色油状物。通过快速色谱法或制备型HPLC纯化，得到N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OBn，为澄清油状物(0.739g，17％)。 
1H-NMR(CDCl3)δ：ppm 1.46(s，9H)2.50-2.61(m，2H)2.82-2.99(m，2H)3.31(s，2H)5.14(s，2H)7.29-7.43(m，5H)。 
将N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OBn(0,030g，0.1mmol)和十八烷二酸琥珀酰亚胺基叔丁基酯(如实施例29中所述，0,050mg，0.1mmol)悬浮于无水DMF(1ml)中。加入HOAt(0,014g，0.1mmol)和DIEA(0,21ml，1.2mmol)。将该黄色反应混合物在氮气环境中搅拌42小时。浓缩该反应混合物。将残余物重新溶于AcOEt并用0.1NHCl(2x)、水(1x)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到叔丁基十八烷二酰基-N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OBn，产率为85％(55mg)。 
1H-NMR(CDCl3)δ：ppm 1.3(m，26H)1.38(s，9H)，1.46(s，9H)， 1.6(m，4H)，2.2(m，2H)，2.35(m，2H)，2.65(m，2H)，2.85(s，2H)3.65(m，2H)，5.15(s，2H)7.35(m，5H)。 
将叔丁基十八烷二酰基-N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OBn(0,054g，0.08mmol)溶于THF(2ml)。加入10％披钯碳并在周末将该混合物在1atm和RT下氢化。将无水反应混合物溶于AcOEt并过滤3次以除去碳。浓缩滤液，得到叔丁基十八烷二酰基-N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OH，产率为80％(37mg)。 
1H-NMR(CDCl3)δ：ppm 1.3(m，26H)1.40(s，9H)，1.46(s，9H)，1.6(m，4H)，1.75(p，2H)，2.2(m，2H)，2.35(m，2H)，2.63(m，2H)，2.83(s，2H)。 
将叔丁基十八烷二酰基-N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OH(0.07mmol)溶于无水THF(2ml)。加入TSTU(24mg，0.08mmol)和DIPEA(15uL，0.08mmol)。在RT下和氮气环境中搅拌该混合物。19小时后，根据TLC(DCM/MeOH 10∶1)发现该反应未完成。再加入DIEA(20uL，0.11mmol)并持续搅拌。42小时后，过滤该反应混合物。用AcOEt稀释滤液并用0.1N HCl(2x)和盐水(1x)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到叔丁基十八烷二酰基-N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OSu，为白色固体，产率为84％(36mg)。 
1H-NMR(CDCl3)δ：ppm 1.3(m，26H)1.40(m，2H)，1.44(s，9H)，1.46(s，9H)，1.58(m，2H)，1.73(p，2H)，2.2(t，2H)，2.60(t，2H)，2.8(m，6H)。 
实施例31 
NεB29-[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧乙基)-Gly]des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例30类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使N-(2-(叔丁氧羰基)乙基)-Gly-OBn与十六烷二酸琥珀酰亚胺酯(如实施例4中所述)反应，随后脱苄基化，用TSTU活化，与 A1N，B1N-diBOC-Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。 
MALDI-MS：6093.0，计算值6104.1。 
实施例32 
NεB29-[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(羧甲基)-β-Ala]des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例29类似的方式，通过下列步骤制备该化合物：使N-(叔丁氧羰基甲基)-β-Ala-OBn与十六烷二酸琥珀酰亚胺酯(如实施例4中所述)反应，随后脱苄基化，用TSTU活化，与A1N，B1N-diBOC-Des(B30)人胰岛素偶联并用TFA脱保护。 
MALDI-MS：6097.6，计算值6104.1。 
实施例33 
NεB29-[Nα-(HOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO]-γ-L-Glu]des(B30)人胰岛素的合成 
如实施例1中所述，使用如下所述制备的(MeOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-Glu(OSu)-OMe作为酰化剂制备该化合物。 
LCMS(电雾化)：M+3：2049，计算值2050；M+4：1538，计算值1537.8；M+5：1231，计算值1230.4. 
MALDI-TOF MS：计算值：6147；测定值：6153. 
(MeOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-Glu(OSu)-OMe的制备 
将MeOH(40ml)冷却至0-5℃并在30分钟过程中通过搅拌滴加SOCl2(4ml)。加入12-氨基十二酸(3g，13.9mmol)并在0-5℃下搅拌所得混悬液，同时熔化冰浴中的冰且在16小时过程中温至室温。过滤该混合物并通过抽吸干燥固体，得到2.23g(60％)的12-氨基十二酸甲酯盐酸盐。从母液中再分离到一批0.92g(25％)。 
1H-NMR(DMSO-d6)δ：7.97(bs，3H)，3.58(s，3H)，2.73(m，2H，2.28(t，2H)，1.52(m，4H)，1.25(“s”，14H)。 
将12-氨基十二酸甲酯盐酸盐(1g，3.8mmol)悬浮于THF(15ml)中并加入戊二酸酐(1.29g，3.8mmol)和TEA(0.52ml，3.8mmol)，将所得混合物(混悬液)在室温下搅拌16小时。逐步加入水(75ml)。25ml后，得到溶液，此后出现混悬液。将该混合物在室温下搅拌1小时并过滤、用水洗涤固体并在真空中干燥。该步骤得到1.02g(80％)的12-(4-羧基丁酰氨基)十二酸甲酯。 
1H-NMR(DMSO-d6)δ：12(bs，1H)，7.73(t，1H)，3.57(s，3H)，3.00(q，2H)，2.28(t，2H)，2.18(t，2H)，2.06(t，2H)，1.69(p，2H)，1.50(p，2H)，1.36(p，2H)，1.23(“s”，14H)。 
将12-(4-羧基丁酰氨基)十二酸甲酯(0.33g，0.95mmol)溶于THF与DMF(2∶1，6ml)的混合物中并加入DIEA(0.178ml，1.04mmol)。将该混合物冷却至0-5℃并加入TSTU(0.314g，1.04mmol)。将该混合物在0-5℃下搅拌1小时并在室温下搅拌16小时。将该混合物在真空中浓缩至干。将残余物(OSu-活化的12-(4-羧基丁酰氨基)十二酸甲酯)溶于DMF(10ml)，并加入DIEA(0.24ml，1.4mmol)和H-Glu-OMe(0.168g，1.04mmol)，将该混合物在室温下搅拌16小时。在真空中浓缩该混合物并将残余物溶于AcOEt(100ml)，用0.2M盐酸(3×50ml)洗涤。干燥有机相(Na2SO4)并在真空中浓缩。该步骤得到0.358g(78％)的(MeOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-Glu-OMe。 
1H-NMR(DMSO-d6)，δ：12(bs，1H)，8.22(d，1H)，7.73(t，1H)，4.24(m，1H)，3.61(s，3H)，3.57(s，3H)，3.00(q，2H)，2.27(m，4H)，2.10(t，2H)，2.04(t，2H)，1.9(m，1H)，1.8(m，1H)，1.68(t，2H)，1.50(m，2H)，1.36(m，2H)，1.23(“s”，14H)。 
将(MeOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-Glu-OMe(0.36g，0.36mmol)溶 于THF(10ml)并冷却至0-5℃。加入DIEA(0.13ml)和TSTU(0.129g，0.43mmol)并将该混合物在0-5℃下搅拌几小时，在室温下搅拌3天。在真空中浓缩该混合物。将从残余物溶于AcOEt(100ml)并用0.2N盐酸(3×50ml)和饱和NaHCO3水溶液(3×100ml)洗涤。干燥(Na2SO4)并在真空中浓缩，得到0.17g(84％)的(MeOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-Glu(OSu)-OMe。 
1H-NMR(DMSO-d6)，选择的峰，δ：8.27(d，1H)，7.72(t，1H)，4.31(m，1H)，3.63(s，3H)，3.57(s，3H)，3.00(q，2H)，2.81(s，4H)，2.28(t，2H)，2.12(t，2H)，2.05(t，2H)，1.70(m，2H)，1.50(m，2H)，1.35(m，2H)，1.23(“s”，14H)。 
实施例34 
NεB29-[Nα-(HOOC(CH2)11)NHCO(CH2)2CO]-γ-L-Glu]des(B30)人胰岛素的合成 
按照与实施例1中所述类似的方式，使用(MeOOC(CH2)11)NHCO(CH2)2CO)-Glu(OSu)-OMe(它是按照与如实施例33中所述类似的方式，使用琥珀酸酐而非戊二酸酐制备的)作为酰化剂制备该化合物。 
MALDI-TOF MS：计算值：6133；测定值：6134。 
实施例35 
NεB29-[Nα-(HOOC(CH2)16CO)]-Gly-γ-L-Glu des(B30)人胰岛素的合成 
按照与如实施例4中所述类似的方式，使用如下所述制备的叔丁基十八烷二酰基-Gly-Glu(OSu)-OtBu作为酰化剂制备该化合物。 
MALDI-TOF MS：计算值：6189；测定值：6191。 
叔丁基十八烷二酰基-Gly-Glu(OSu)-OtBu的制备 
向Z-Gly-OH(1.0g，4.78mmol)中加入THF(10ml)、DIEA(0.98ml，5.74mmol)和TSTU(1.7g，5.74mmol)，将所得混合物在室温下搅拌2小时。加入AcOEt(100ml)并用0.2N盐酸(100ml)和水(2×100ml)洗涤该混合物。干燥有机相(Na2SO4)并在真空中浓缩，得到1.34g(92％)的Z-Gly-OSu，为油状物。 
1H-NMR(CDCl3)，δ：7.35(s，5H)，5.32(t，1H)，5.15(s，2H)，4.35(d，2H)，2.83(s，4H)。 
将Z-Gly-OSu(1.3g，4.25mmol)溶于DMF(15ml)并加入DIEA(1.82ml，10.6mmol)和H-Glu-OtBu(0.949g，4.67mmol)，将所得混合物在室温下搅拌16小时。加入AcOE(100ml)并用0.2N盐酸(100ml)和水(2×100ml)洗涤该混合物。干燥有机相(Na2SO4)并在真空中浓缩，得到1.7g(定量)的Z-Gly-Glu-OtBu，为油状物。 
1H-NMR(CDCl3)，δ：7.33(s，5H)，7.1(d，1H)，5.80(t，1H)，5.12(s，2H)，4.53(m，1H)，3.90(d，2H)，2.36(t，2H)，2.22(m，1H)，1.95(m，1H)，1.45(s，9H)。 
将Z-Gly-Glu-OtBu(1.7g，4.3mmol)溶于1，4-二噁烷(15ml)并在N2环境中加入10％钯黑(0.6g)。将该混合物在大气压下氢化5小时。过滤该混合物并将钯与水(200ml)一起搅拌2小时，过滤并冻干滤液。该步骤得到0.65g(58％)的H-Gly-Glu-OtBu。 
1H-NMR(DMSO-d6)，选择的峰，δ：8.31(d，1H)，2.20(t，2H)，1.91(m，1H)，1.80(m，1H)，1.40(s，9H)。 
将H-Gly-Glu-OtBu(0.15g，0.58mmol)悬浮于DMF(5ml)中并加入DIEA(0.15ml，0.86mmol)和十八烷二酸琥珀酰亚胺基叔丁基酯(0.27g，0.58mmol)，将所得混合物在室温下搅拌16小时。加入AcOEt(50ml)并用0.2N盐酸(100ml)和水(3×100ml)洗涤该混合物。干燥有机相(Na2SO4)并在真空中浓缩，得到0.34g(定量)的叔丁 基十八烷二酰基-Gly-Glu-OtBu。 
1H-NMR(CDCl3)，δ：7.11(d，1H)，6.55(t，1H)，4.55(dt，1H)，4.00(dq，2H)，2.40(t，2H)，2.26(t，2H)，2.20(t，4H)，2.00(m，1H)，1.57-1.65(m，5H)，1.47(s，9H)，1.44(s，9H)，1.25(“s”，22H，与HDO重叠)。 
将叔丁基十八烷二酰基-Gly-Glu-OtBu(0.32g，0.52mmol)溶于THF(5ml)并加入DIEA(0.11ml，0.63mmol)和TSTU(0.19g，0.63mmol)，将所得混合物在室温下和N2中搅拌3天。加入AcOEt(100ml)并用0.15N盐酸(100ml)和水(3×100ml)洗涤该混合物。干燥有机相(Na2SO4)并在真空中浓缩，得到0.3g(81％)的叔丁基十八烷二酰基-Gly-Glu(OSu)-OtBu。 
1H-NMR(CDCl3)，选择的峰，δ：6.89(d，1H)，6.44(t，1H)，4.60(m，1H)，3.95(dq，2H)，2.86(s，4H)，2.68(q，2H)，2.24(t，2H)，2.20(t，4H)，1.57-1.65(m，5H)，1.48(s，9H)，1.44(s，9H)，1.25(“s”，22H，与HDO重叠)。 
实施例36 
NεB29-[N-(HOOC(CH2)14CO)-N-(2-羧乙基)-β-Ala]des B30人胰岛素的合成 
按照与实施例1类似的方式制备该化合物，步骤如下：使15-[[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基)-乙基]-(2-甲氧羰基-乙基)-氨基甲酰基]-十五烷酸甲酯与Des(B30)人胰岛素偶联，并用NaOH脱保护。 
LC-MS：M+4.1530.3，计算值1529.5 
甲基十六烷二酰基N-(2-(甲氧羰基)乙基)-β-Ala-OSu的制备 
将H-β-Ala-OMe盐酸盐(5.45g，39mmol)溶于DMSO(100ml)，加入丙烯酸叔丁酯(5.71ml，39mmol)和DIEA(13.4ml，78mmol)， 将所得混合物在室温下搅拌6天。使该混合物在水(500ml)与AcOEt(2×250ml)之间分配。用饱和NH4Cl水溶液洗涤合并的有机相，干燥(MgSO4)并在真空中浓缩。该步骤得到7.24g(80％)的N-(2-(甲氧羰基)乙基)-β-Ala-OtBu。 
1H-NMR(CDCl3)δ：3.58(s，3H)，2.72(t，2H)，2.67(t，2H)，2.41(t，2H)，2.29(t，2H)，1.39(s，9H)。 
将十六烷二酸一甲酯(150mg，0.5mmol)溶于DMF(5mL)。加入HOAt(102mg，0.75mmol)和EDAC(143mg，0.75mmol)，将该反应体系在50℃下搅拌1小时。在冷却至室温后，加入DIEA(0.256mL，1.5mmol)和N-(2-(甲氧羰基)乙基)-β-Ala-OtBu(139mg，0.6mmol)。将该反应体系在室温下搅拌过夜。使该混合物在水(2×50mL)与AcOEt(100mL)之间分配。干燥有机相(Na2SO4)并在真空中浓缩，得到油状物。加入DCM(10mL)和TFA(10mL)，将该混合物在室温下搅拌1小时，在真空中除去溶剂，得到170mg(87％)的甲基十六烷二酰基N-(2-(甲氧羰基)乙基-β-Ala-OH。 
LC-MS：458(M+1)。 
将甲基十六烷二酰基N-(2-(甲氧羰基)乙基-β-Ala-OH(161mg，0.351mmol)溶于THF(10mL)。加入DIEA(0.073mL，0.42mmol)和TSTU(127mg，0.42mmol)。搅拌该混合物，同时用冰浴冷却30分钟，随后在室温下搅拌2小时。使该混合物分配在AcOEt(100mL)与HCl水溶液(0.2N，2×80mL)之间。干燥有机相(Na2SO4)并在真空中浓缩。该步骤得到140mg(72％)的甲基十六烷二酰基N-(2-(甲氧羰基)乙基)-β-Ala-OSu，为油状物。 
LC-MS：555(M+1)。 
实施例37 
NεB29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(2-羧乙基)-β-Ala]des B30人胰岛素的合成 
按照与实施例1和36类似的方式，通过使甲基十八烷二酰基N-(2-(甲氧羰基)乙基)-β-Ala-OSu与Des(B30)人胰岛素偶联并用NaOH脱保护而制备该化合物。 
甲基十八烷二酰基N-(2-(甲氧羰基)乙基)-β-Ala-OSu的制备 
按照与甲基十六烷二酰基N-(2-(甲氧羰基)乙基)-β-Ala-OSu类似的方式，使用十八烷二酸一甲酯合成该化合物。 
MALDI-TOF MS：计算值6146；测定值：6151 
LC-MS：583(M+1) 
                     药理学方法 
试验(I) 
本发明胰岛素衍生物的胰岛素受体结合 
通过SPA试验(闪烁近似测定法)微量滴定板抗体俘获试验测定本发明胰岛素类似物对人胰岛素受体的亲和性。将SPA-PVT抗体结合珠、抗-小鼠试剂(Amersham Biosciences，Cat No.PRNQ0017)与25ml结合缓冲液(100mM HEPES pH 7.8；100mM氯化钠，10mM MgSO4，0.025％Tween-20)混合。用于单一Packard Optiplate(Packard No.6005190)的试剂混合物由2.4μl的1∶5000稀释的纯化重组人胰岛素受体-外显子11、相当于5000cpm/100μl试剂混合物用量的A14 Tyr[125I]-人胰岛素储备溶液、12μl的1∶1000 F12抗体稀释液、3ml的SPA-珠和结合缓冲液总计达12ml所组成。然后加入总计100μl，由合适的样品制备一系列稀释液。随后向该稀释液中加入100μl试剂混合物，将样品保温16小时，同时适度振摇。然后通过离心1分钟分离各相并在Topcounter中对平板计数。使用非线性回归算法，用GraphPadPrism 2.01(GraphPad Software，San Diego，CA)拟合结合数据。 
单克隆mIR抗体的制备 
通过单克隆技术生产特异性抗体(F12)：通过皮下注射在FCA中的50μg纯化的mIR，随后注射两次在FIA中的20μgmIR，对RBF 小鼠进行免疫接种。对高应答者小鼠通过静脉内加强注射25μgmIR，在3天后取出脾。将脾细胞与骨髓瘤Fox细胞系(Khler，G & MilsteinC.(1976)，《欧洲免疫学杂志》(European J.Immunology)，6：511-19；Taggart RT等(1983)，《科学》(Science)219：1228-30)融合。在mIR特异性ELISA中筛选上清液的抗体产生。克隆阳性孔并在蛋白质印迹中测试。 
表2 
  产品  受体结合(人 胰岛素％)
  人胰岛素  100
  NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素  26
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素  9.2
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-Glu-N-(γ-Glu)des(B30)人胰岛素  11
  NεB29-(N-(Asp-OC(CH2)16CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素  13
  NεB29-(N-(Glu-OC(CH2)14CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素  13
  NεB29-(N-(Glu-OC(CH2)14CO-)des(B30)人胰岛素  9.4
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-Glu)-N-(β-Asp)des(B30)人胰岛素  11
  NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)13CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素  22
  NεB29-(N-(Sar-OC(CH2)13CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素  20
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Asp)-N-(β-L-Asp)des(B30)人胰岛素  14
  NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)14CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素  32
  NεB29-(N-HOOC(CH2)15CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰岛素  4
  NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-β-L-Asp)des(B30)人胰岛素  16
  0525 NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-β-D-Asp)des(B30)人胰岛素  37
  NεB29-(N-HOOC(CH2)13CO-β-L-Glu)des(B30)人胰岛素  15
  NεB29-(N-HOOC(CH2)13CO-β-L-Asp)des(B30)人胰岛素  11
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-δ-L-Aad)des(B30)人胰岛素  7
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-D-Glu)des(B30)人胰岛素  13
  NεB29-(N-HOOC(CH2)15CO-β-L-Asp)des(B30)人胰岛素  5.4
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Asp)des(B30)人胰岛素  13
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-L-Glu)des(B30)人胰岛素  16
  NεB29-(N-(HOOC(CH2)14CO-ε-L-LysCO-)des(B30)人胰岛素  5.7
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-β-L-Asp)des(B30)人胰岛素  11
  NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)16CO-γ-L-Glu)des(B30)人胰岛素  9.1
  NεB29-[N-(HOOC(CH2)16CO)-N-(羧甲基)-β-Ala]des(B30)人胰岛素  9.4
  NεB29-[Nα-(HOOC(CH2)11)NHCO(CH2)3CO)-γ-L-Glu]des(B30)人胰岛素  46
[0402] 试验(II) 
本发明胰岛素衍生物相对于人胰岛素的功效 
将在实验当天称重为238-383g的Sprague Dawley雄性大鼠用于卡钳实验。使大鼠在受控的环境条件下自由摄食并在卡钳实验前禁食过夜(从3pm开始)。 
实验方案 
在实施外科手术前使大鼠适应动物设施至少1周。在卡钳实验前约1周，在氟烷麻醉条件下将Tygon导管插入颈静脉(用于输注)和颈动脉(用于采集血样)，取出并固定在颈背上。手术后对大鼠给予Streptocilin vet.(Boehringer Ingelheim；0.15ml/大鼠，肌内)并在恢复期过程中将其放入动物护理装置内(25℃)。为了获得止痛作用，在麻醉过程中给予Anorphin(0.06mg/大鼠，皮下)，并在从麻醉状态完全恢复后(2-3小时)给予卡洛芬(1.5mg/kg，s.c.)，并再每天一次给予2天。 
采用来自(1)所用的卡钳技术。将在实验当天的7am时，对禁食过夜(从前一天的3pm开始)的大鼠称重，并与取样注射器和输注系统Harvard 22 Basic泵，Harvard，和Perfectum皮下玻璃注射器，Aldrich)连接，然后将其放入各自的卡钳笼，在那里使它们静止约45分钟，此后开始实验。大鼠能够在整个实验过程中在其常用的衬垫上自由运动，并可以自由饮水。30分钟基础期(在此过程中以10分钟间隔测定血糖水平)后，以恒定速率将测试的胰岛素衍生物和人胰岛素(1个剂量水平/大鼠，n＝6-7/剂量水平)输注(静脉内)300分钟。自始至终以10分钟间隔测定血糖水平，并相应地调节20％葡萄糖水溶液的输注以便维持血糖正常。将来自每只大鼠的重悬浮红细胞样品合并，并通过颈动脉导管以约
Figure A20048002173300541
体积返回。 
在每一实验天时，在卡钳实验前和该实验结束时取测试的各胰岛素衍生物溶液和人胰岛素溶液的样品，并通过HPLC证实肽类的浓度。在研究前和结束时的相关时间点处测定大鼠胰岛素和C-肽以及待测试的胰岛素衍生物和人胰岛素的血浆浓度。在实验结束时使用超剂量 的戊巴比妥处死大鼠。 
测试化合物和剂量：从含有在pH 7.7的5mM磷酸盐中的97μM胰岛素衍生物的储备溶液稀释待测试的胰岛素。备用溶液中的终浓度为0.45μM胰岛素衍生物、5mM磷酸盐、100mM氯化钠、0.007％聚山梨酸酯20。pH为7.7，静脉内输注速率为15和20pmol·min-1·kg-1。 
在类似介质中配制用作参比化合物的人胰岛素的储备溶液，并以6、15或30pmol·min-1·kg-1通过静脉内输注。 
将两种储备溶液储存在-20℃下，并在使用前于4℃下融化过夜。在转移到输注注射器前15分钟将这些溶液缓慢地上下翻转几次。 
表3 
  胰岛素衍生物   与人胰岛素  相比的功效
  NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素   ＞50％
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素   ＞50％
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-Glu-N-(γ-Glu)des(B30)人胰岛素   ＞50％
  NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-β-L-Asp)des(B30)人胰岛素   ＞50％
  NεB29-(N-(Gly-OC(CH2)14CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素   ＞50％
  NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-β-L-Asp)des(B30)人胰岛素   ＞50％
试验(III) 
本发明胰岛素衍生物在猪体内的T50％的测定 
T50％是当50％注射量的A14 Tyr[125I]标记的测试胰岛素衍生物从注射部位消失时的时间(使用外部γ-计数器所测定)。 
遵循实验室动物的护理原则，使用特定的不含病原体的LYYD、非糖尿病型雌性猪，丹麦长白猪、Yorkshire和Duroc杂交猪(Holmenlund，Haarloev，Denmark)进行药动学和药效学研究。这些猪是有意识的，4-5个月龄且体重为70-95kg。在实验前使动物禁食过夜18小时。 
如上所述将用125I在TyrA14上标记的胰岛素衍生物的配制制剂经皮 下注入猪(Ribel，U.，J
Figure 10003_3
rgensen，
Figure A20048002173300561
K，Brange，J，和Henriksen，U.《作为用于人皮下胰岛素吸收的模型的猪》(The pig as a model forsubcutaneous insulin absorption in man.)Serrano-Rios，M和Lefèbvre，P.J.891-896.1985.Amsterdam；New York；Oxford，Elsevier Science Publishers.1985(会刊))。 
在实验开始时，将60nmol剂量的本发明胰岛素衍生物(测试化合物)和60nmol剂量的胰岛素detemir(均在Tyr A14上用125I标记)注射在每只猪颈上两个单独的部位上。 
使用传统外部γ-计数法的改进方法监测放射性标记从皮下注射部位上的消失(Ribel，U.《胰岛素类似物的皮下吸收》(Subcutaneousabsorption of insulin analogues)Berger，M.和Gries，F.A.70-77(1993).Stuttgart；New York，Georg Thime Verlag(会刊))。使用这种改进的方法，能够应用无绳便携式装置(ScancysLaboratorieteknik，V
Figure 10003_4
rlse，
Figure A20048002173300562
DK-3500，Denmark)连续地测定放射性从皮下储存处的消失达数天。以1-分钟的间隔进行测定，并将计数的值对背景活性校准。 
在表4中，″测试/detemir″一栏表示在同一实验中对每种测试化合物(″测试″)测定的T50％和对胰岛素detemir测定的T50％(″detemir″)。 
表4 
  胰岛素衍生物   T50％，小时  测试/detemir
  NεB29-(N-HOOC(CH2)14CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素   9.0/9.5
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-Glu)des(B30)人胰岛素   10.6/9.7
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-γ-Glu-N-(γ-Glu)des(B30)人胰岛素   7.8/7.4
  NεB29-(N-(Asp-OC(CH2)16CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素   3.5/7.4
  NεB29-(N-(Asp-OC(CH2)16CO-)des(B30)人胰岛素   4.1/7.4
  NεB29-(N-HOOC(CH2)16CO-α-Glu)-N-(β-Asp)des(B30)人胰岛素   8.7/9.1

Claims (10)

1.胰岛素衍生物或其任意的Zn2+复合物，该胰岛素衍生物是在des(B30)人胰岛素B链N-末端氨基酸残基的α-氨基处或者在des(B30)人胰岛素B链上存在的Lys残基的ε-氨基处连接了侧链的胰岛素类似物，该侧链具有如下通式：
-W-X-Y-Z
其中W为：
·在侧链上带有羧酸基团的α-氨基酸残基，该氨基酸为γ-Glu，该残基以其羧酸基团之一和des(B30)人胰岛素B链N-末端氨基酸残基的α-氨基或者des(B30)人胰岛素B链上存在的Lys残基的ε-氨基一起形成酰胺基；
X为：
·-CO-；
y为：
·-(CH2)m-，其中m为6-16的整数；且
Z为：
·-COOH。
2.权利要求1的胰岛素衍生物或其任意的Zn2+复合物，其中侧链-W-X-Y-Z与des(B30)人胰岛素B链上存在的Lys残基的ε-氨基连接。
3.权利要求1或2的胰岛素衍生物或其任意的Zn2+复合物，其中Y为-(CH2)m-，其中m为12-16的整数。
4.权利要求1的胰岛素衍生物或其任意的Zn2+复合物，其中所述胰岛素衍生物是：
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素；
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)15CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素；
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-y-Glu)des(B30)人胰岛素；或
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)13CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素。
5.权利要求1或2的胰岛素衍生物或其任意的Zn2+复合物，它是Zn2+复合物，其中每个胰岛素六聚物结合2个锌离子、3个锌离子或4个锌离子。
6.用于对需要治疗的患者治疗糖尿病的药物组合物，其中包含治疗有效量的权利要求1-4任意一项的胰岛素衍生物和药学上可接受的载体。
7.用于对需要治疗的患者治疗糖尿病的药物组合物，其中包含治疗有效量的权利要求1-4任意一项的胰岛素衍生物与具有快速起效的胰岛素类似物的混合物以及药学上可接受的载体，其中所述具有快速起效的胰岛素类似物选自AspB28人胰岛素、LysB28ProB29人胰岛素和LysB3GluB29人胰岛素。
8.权利要求1-4任意一项的胰岛素衍生物在制备对需要治疗的患者治疗糖尿病的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求1-4任意一项的胰岛素衍生物与药学上可接受的载体。
9.权利要求1-4任意一项的胰岛素衍生物在制备对需要治疗的患者治疗糖尿病的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求1-4任意一项的胰岛素衍生物与具有快速起效的胰岛素类似物的混合物以及药学上可接受的载体，其中所述具有快速起效的胰岛素类似物选自AspB28人胰岛素、LysB28ProB29人胰岛素和LysB3GluB29人胰岛素。
10.权利要求8或9的用途，其中所述胰岛素衍生物是：NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素。
CN2004800217338A 2003-08-05 2004-07-22 新型胰岛素衍生物 Active CN1829738B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201010514501.3A CN101955527B (zh) 2003-08-05 2004-07-22 新型胰岛素衍生物

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200301129 2003-08-05
DKPA200301129 2003-08-05
US49545103P 2003-08-14 2003-08-14
US60/495,451 2003-08-14
PCT/DK2004/000511 WO2005012347A2 (en) 2003-08-05 2004-07-22 Novel insulin derivatives

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201010514501.3A Division CN101955527B (zh) 2003-08-05 2004-07-22 新型胰岛素衍生物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1829738A CN1829738A (zh) 2006-09-06
CN1829738B true CN1829738B (zh) 2012-07-04

Family

ID=36947523

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2004800217338A Active CN1829738B (zh) 2003-08-05 2004-07-22 新型胰岛素衍生物
CN201010514501.3A Active CN101955527B (zh) 2003-08-05 2004-07-22 新型胰岛素衍生物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201010514501.3A Active CN101955527B (zh) 2003-08-05 2004-07-22 新型胰岛素衍生物

Country Status (10)

Country Link
EP (3) EP2275439B1 (zh)
KR (1) KR101186851B1 (zh)
CN (2) CN1829738B (zh)
DK (2) DK2107069T3 (zh)
ES (2) ES2472421T3 (zh)
PL (1) PL2275439T3 (zh)
PT (2) PT2107069E (zh)
RU (1) RU2352581C2 (zh)
SI (1) SI2107069T1 (zh)
ZA (1) ZA200600846B (zh)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0413276B8 (pt) 2003-08-05 2021-05-25 Novo Nordisk As derivado de insulina, complexo de zinco do mesmo, e, composição farmacêutica
EP1704165B1 (en) 2003-12-18 2010-03-17 Novo Nordisk A/S Glp-1 compounds
PL1969004T3 (pl) 2005-12-28 2012-01-31 Novo Nordisk As Kompozycje zawierające acylowaną insulinę i cynk oraz sposób wytwarzania tych kompozycji
WO2008152106A1 (en) 2007-06-13 2008-12-18 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical formulation comprising an insulin derivative
CN101157725B (zh) * 2007-10-24 2012-07-25 中国药科大学 人胰岛素类似物的制备方法及用途
US9603904B2 (en) 2008-10-30 2017-03-28 Novo Nordisk A/S Treating diabetes melitus using insulin injections with less than daily injection frequency
AR081066A1 (es) * 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
KR20130092972A (ko) * 2010-05-10 2013-08-21 노보 노르디스크 에이/에스 인슐린-아연 복합체의 제조 방법
US20130261051A1 (en) * 2010-10-27 2013-10-03 Thue Johansen Treating Diabetes Melitus Using Insulin Injections Administered With Varying Injection Intervals
BR112013010345A2 (pt) 2010-10-27 2017-07-25 Novo Nordisk As tratamento de diabetes melitus usando as injeções de insulina administradas com intervalos de variação da injeção
AU2012350586B2 (en) * 2011-12-15 2017-02-02 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Human insulin analogue and acylated derivative thereof
CA2872083A1 (en) 2012-05-01 2013-11-07 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition
CN105188736A (zh) * 2013-03-20 2015-12-23 诺和诺德股份有限公司 胰岛素给药方案
WO2014177623A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Novo Nordisk A/S Novel administration regime
CN103467594A (zh) * 2013-09-12 2013-12-25 深圳先进技术研究院 胰岛素修饰物及其制备方法和应用
CN105001140B (zh) * 2015-06-29 2018-01-05 珠海联邦制药股份有限公司 一种制备脂肪二酸衍生物的方法及其应用
CN106496322A (zh) * 2015-09-07 2017-03-15 江苏恒瑞医药股份有限公司 人胰岛素或其类似物的酰化衍生物的制备方法
WO2018024186A1 (zh) * 2016-08-02 2018-02-08 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种人胰岛素或其类似物的酰化衍生物
US10335464B1 (en) 2018-06-26 2019-07-02 Novo Nordisk A/S Device for titrating basal insulin
CN111518009B (zh) * 2019-02-01 2023-06-23 鲁南制药集团股份有限公司 一种脂肪酸衍生物及其合成方法
WO2021185304A1 (zh) * 2020-03-18 2021-09-23 东莞市东阳光生物药研发有限公司 制备长脂肪链二酸衍生物的方法及其应用
CN114075275A (zh) * 2020-08-17 2022-02-22 成都奥达生物科技有限公司 一种长效胰岛素类似物
CN116903512A (zh) * 2023-06-05 2023-10-20 浙江湃肽生物股份有限公司深圳分公司 一种德谷胰岛素中间体及其德谷胰岛素的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5898067A (en) * 1997-02-07 1999-04-27 Novo Nordisk A/S Crystallization of proteins
US6251856B1 (en) * 1995-03-17 2001-06-26 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives
EP0894095B1 (en) * 1996-02-21 2003-05-28 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives and their use

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3528960A (en) 1968-10-07 1970-09-15 Lilly Co Eli N-carboxyaroyl insulins
GB1492997A (en) 1976-07-21 1977-11-23 Nat Res Dev Insulin derivatives
JPS5767548A (en) 1980-10-14 1982-04-24 Shionogi & Co Ltd Insulin analog and its preparation
PH25772A (en) 1985-08-30 1991-10-18 Novo Industri As Insulin analogues, process for their preparation
NZ222907A (en) 1986-12-16 1990-08-28 Novo Industri As Preparation for intranasal administration containing a phospholipid absorption enhancing system
JPH01254699A (ja) 1988-04-05 1989-10-11 Kodama Kk インスリン誘導体及びその用途
JPH04502465A (ja) 1988-12-23 1992-05-07 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ ヒトインシュリン類似物質
NZ232375A (en) 1989-02-09 1992-04-28 Lilly Co Eli Insulin analogues modified at b29
DK45590D0 (zh) 1990-02-21 1990-02-21 Novo Nordisk As
RU2164520C2 (ru) * 1993-09-17 2001-03-27 Ново Нордиск А/С Производное инсулина, растворимая пролонгированная фармацевтическая композиция, способ пролонгирования гипогликемического действия при лечении диабета
EP0938502B1 (en) * 1996-07-11 2004-10-06 Novo Nordisk A/S Selective acylation method
DE19726167B4 (de) 1997-06-20 2008-01-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung
IL135400A0 (en) * 1997-10-24 2001-05-20 Novo Nordisk As Aggregates of human insulin derivatives
US20020155994A1 (en) 1997-10-24 2002-10-24 Svend Havelund Aggregates of human insulin derivatives

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6251856B1 (en) * 1995-03-17 2001-06-26 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives
EP0894095B1 (en) * 1996-02-21 2003-05-28 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives and their use
US5898067A (en) * 1997-02-07 1999-04-27 Novo Nordisk A/S Crystallization of proteins

Also Published As

Publication number Publication date
CN101955527B (zh) 2016-04-20
CN101955527A (zh) 2011-01-26
RU2352581C2 (ru) 2009-04-20
EP2275439A3 (en) 2011-03-23
PT2275439E (pt) 2014-06-25
DK2275439T3 (da) 2014-05-12
EP2275439A2 (en) 2011-01-19
RU2006103280A (ru) 2007-09-20
CN1829738A (zh) 2006-09-06
SI2107069T1 (sl) 2013-04-30
ES2402592T3 (es) 2013-05-07
KR20120026629A (ko) 2012-03-19
EP2264066A3 (en) 2011-07-27
EP2287184A3 (en) 2011-08-10
DK2107069T3 (da) 2013-04-15
PT2107069E (pt) 2013-04-23
ZA200600846B (en) 2007-04-25
EP2264066A2 (en) 2010-12-22
PL2275439T3 (pl) 2014-09-30
ES2472421T3 (es) 2014-07-01
EP2287184A2 (en) 2011-02-23
EP2275439B1 (en) 2014-03-26
KR101186851B1 (ko) 2012-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1829738B (zh) 新型胰岛素衍生物
KR101159559B1 (ko) 신규의 인슐린 유도체
ES2548304T3 (es) Análogos de la insulina que contienen una fracción acilo y alquilenglicol
CN101389650B (zh) 包含酰化胰岛素和锌的组合物以及制备所述组合物的方法
KR101441444B1 (ko) 인슐린 유도체
WO2010080606A1 (en) Insulin analogs

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CI02 Correction of invention patent application

Correction item: Priority

Correct: 2003.08.14 US 60/495,451

False: Lack of priority second

Number: 36

Page: The title page

Volume: 22

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: PRIORITY; FROM: MISSING THE SECOND ARTICLE OF PRIORITY TO: 2003.8.14 US 60/495,451

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CI01 Publication of corrected invention patent application

Correction item: Grant text

Correct: Correct

False: Error

Number: 27

Volume: 28

CI03 Correction of invention patent

Correction item: Grant text

Correct: Correct

False: Error

Number: 27

Page: Description

Volume: 28

ERR Gazette correction

Free format text: CORRECT: AUTHORIZED TEXT; FROM: ERROR TO: CORRECT

RECT Rectification
CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Denmark bagsvaerd

Patentee after: NOVO NORDISK A/S

Address before: Denmark bagsvaerd

Patentee before: Novo Nordisk A/S

IP01 Partial invalidation of patent right
IP01 Partial invalidation of patent right

Commission number: 4W113742

Conclusion of examination: Continue to maintain the validity of the patent on the basis of claims 1-6 submitted by the patentee on March 8, 2022

Decision date of declaring invalidation: 20230530

Decision number of declaring invalidation: 562083

Denomination of invention: New insulin derivatives

Granted publication date: 20120704

Patentee: NOVO NORDISK A/S