ES2252787T3 - Principios activos de efecto prolongado y composciones farmaceuticas que los incluyen. - Google Patents

Principios activos de efecto prolongado y composciones farmaceuticas que los incluyen.

Info

Publication number
ES2252787T3
ES2252787T3 ES97933828T ES97933828T ES2252787T3 ES 2252787 T3 ES2252787 T3 ES 2252787T3 ES 97933828 T ES97933828 T ES 97933828T ES 97933828 T ES97933828 T ES 97933828T ES 2252787 T3 ES2252787 T3 ES 2252787T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
insulin
fmoc
radical
lys
phe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES97933828T
Other languages
English (en)
Inventor
Matityahu Fridkin
Yoram Shechter
Eytan Gershonov
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yeda Research and Development Co Ltd
Original Assignee
Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yeda Research and Development Co Ltd filed Critical Yeda Research and Development Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2252787T3 publication Critical patent/ES2252787T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/02—Local antiseptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un compuesto de la fórmula: X ¿ Y donde Y es una fracción de un fármaco que lleva al menos un grupo funcional seleccionado entre amino, carboxilo, hidroxilo y/o mercapto, libres, y X es un radical seleccionado de los radicales de las fórmulas (i) a (iv): donde R1 y R2, iguales o diferentes, son, cada uno, hidrógeno, alquilo, alcoxi, alcoxialquilo, arilo, alquilarilo, aralquilo, halógeno, nitro, sulfo, amino, amonio, carboxilo, PO3H2, o OPO3H2; R3 y R4, iguales o diferentes, son, cada uno, hidrógeno, alquilo o arilo; y A es un enlace covalente cuando el radical se une a grupo carboxilo o mercapto del fármaco Y, o A es OCO- cuando el radical se une a un grupo amino o hidroxilo de Y, y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, siempre que cuando R1 a R4 son hidrógeno y A es OCO-, Y no es una fracción de un fármaco que contiene un grupo O-maloniltirosilo

Description

Principios activos de efecto prolongado y composiciones farmacéuticas que los incluyen.
La presente invención se refiere a nuevos pro-fármacos de acción prolongada capaces de sufrir una transformación química en el organismo desde una forma inactiva a una forma bioactiva, llevando los citados pro-fármacos grupos funcionales sensibles a medios básicos suaves, más en particular se refiere a los pro-fármacos con sustitución de fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) y fluorenilmetilo (FM) así como a composiciones farmacéuticas que los comprenden.
Los fármacos terapéuticos que se utilizan actualmente en tratamientos terapéuticos médicos y en veterinaria se clasifican con arreglo a varios criterios. Por ejemplo, los fármacos pueden considerarse como moléculas que tienen un carácter proteináceo-peptídico, es decir, moléculas compuestas por unidades estructurales de amino ácido, o de carácter no-peptídico, o puede atenderse a criterios no relacionados con la estructura tales como fármacos que se absorben oralmente o que se administran de otro modo, es decir, por inyección, vía intranasal o tópica, para que alcancen la corriente circulatoria sanguínea.
Los compuestos que se absorben oralmente son, en general, de bajo peso molecular, bastante estables, lipófilos ("oleosos") y de naturaleza no-peptídica. Virtualmente, todos los fármacos peptídicos y proteínicos, debido a sus características intrínsecas hidrófilas (no-lipófilas) y polares y a su inestabilidad metabólica, no obedecen a estos criterios y la mayoría deben administrarse por inyección. Además, como estas moléculas se degradan rápidamente en el cuerpo por diversos mecanismos, especialmente proteolisis, son normalmente de vida corta.
Los fármacos no peptídicos son muy frecuentemente suficientemente hidrófobos y pueden llegar a la circulación sanguínea a través del tracto gastrointestinal. Debido a su relativa estabilidad química, los fármacos no-peptídicos son normalmente especies de vida larga.
Los fármacos proteína y péptido tienen aplicaciones importantes y numerosas, por ejemplo la insulina en el tratamiento de la diabetes, análogos de hormona de liberación de gonadotropina (GnRH) en la terapia de cáncer de próstata, calcitonina en el tratamiento de trastornos relacionados con los huesos. El potencial de esta importante familia de moléculas es vasto, pero solo ha sido explorado de manera parcial por no decir marginal. Esto se debe en gran medida a su corta vida en el organismo y al modo inconveniente de administración. Los fármacos no-peptídicos, tales como antibióticos, aunque tienen una vida relativamente larga, han de administrarse varias veces al día durante un período de una semana, o más, para mantener los deseados niveles continuos en la circulación.
La absorción oral de fármacos es una meta muy deseable en el tratamiento de enfermedades humanas, en particular en tratamientos terapéuticos prolongados. La alteración estructural de los fármacos puede llevar a un aumento de la absorción oral y tópica, bioestabilidad y, eventualmente, a biodisponibilidad. Actualmente, los mayores esfuerzos han sido dirigidos hacia estas metas. La mayoría de los métodos incluyen modificaciones de fármacos de manera que se conserve su arquitectura natural, es decir, la estructura bioactiva. Esta estructura natural es la reconocida específicamente por la diana a la que se dirige el fármaco y es un pre-requisito de la potencia del fármaco. Desgraciadamente, sin embargo, en muchos casos, la estructura natural es reconocida también por el "sistema de mecanismo de desalojo", que es capaz de unirse al fármaco, degradarlo o metabolizarlo y acelerar así su eliminación. Según esto, frecuentemente se intenta conseguir al mismo tiempo la estabilización de la estructura bioactiva y la potenciación de la estabilidad metabólica. Para conseguir este objetivo han sido empleados métodos tales como la encapsulación, solubilidad reducida y modificación química.
Sería deseable prolongar la vida media de virtualmente muchos, si no todos los fármacos peptídicos así como los no-peptídicos que existen en el mercado o que puedan desarrollarse en el futuro, incluyendo antibióticos, antivirales, antihipertensivos, antiinflamatorios, analgésicos, anticolesteronemia, anticancirogénicos, antidiabéticos, promotores del crecimiento, y otros fármacos. Pro-fármacos relacionados con fármacos naturales que son tóxicos por encima de ciertas concentraciones umbral pueden ser particularmente beneficiosos.
Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar pro-fármacos caracterizados por su elevada sensibilidad a medios básicos suaves y su capacidad de sufrir transformación desde una forma inactiva a una forma bioactiva, en condiciones fisiológicas, en el organismo.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar pro-fármacos derivados de fármacos que tienen grupos libres amino, carboxilo, hidroxilo y/o mercapto, siendo los citados pro-fármacos esencialmente no activos biológicamente sino capaces de conversión lenta y espontánea a la molécula de fármaco activo original, en el organismo, después de su administración.
Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar pro-fármacos que presentan una mayor estabilidad metabólica y biodisponibilidad aumentada.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar profármacos que representan posibilidades alternativas para administración de fármaco, por ejemplo oral y transdérmica, y que son además capaces de penetrar a través de barreras fisiológicas, por ejemplo la barrera sangre-cerebro.
Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar profármacos que permiten una inserción dirigida del fármaco específico del fármaco a los lugares del organismo afectados.
La presente invención se refiere, según esto, a pro-fármacos derivados de un fármaco en que uno o más grupos de la molécula de dicho fármaco seleccionados entre grupos libres amino, carboxilo, hidroxilo y/o mercapto, están sustituidos con grupos funcionales sensibles a bases y separables en condiciones básicas suaves, por ejemplo, fisiológicas.
El nuevo concepto de la invención para fármacos de liberación lenta incluye la obtención de derivados nuevos del fármaco, generalmente más hidrófobos. En este método se prefiere perder, en vez de conservar, la conformación natural, la potencia biológica y la identidad de reconocimiento del fármaco por los sistemas que degradan. Una ventaja de este método, sin embargo, está en el hecho de que el derivado así modificado puede hidrolizarse lenta y espontáneamente al fármaco activo natural bajo condiciones in vivo.
Los profármacos de la invención son de la fórmula:
X-Y
donde
Y es una fracción del fármaco que lleva al menos un grupo funcional seleccionado entre amino, carboxilo, hidroxilo y/o mercapto, libres, y
X es un radical seleccionado entre radicales de las fórmula (i) a (iv):
1
donde R_{1} y R_{2}, iguales o diferentes, son, cada uno e ellos, hidrógeno, alquilo, alcoxi, alcoxialquilo, arilo, alquilarilo, aralquilo, halógeno, nitro, sulfo, amino, amonio, carboxilo, PO_{3}H_{2}, o OPO_{3}H_{2}; R_{3} y R_{4}, iguales o diferentes, son, cada uno, hidrógeno, alquilo o arilo; y A es un enlace covalente cuando el radical se une a grupo carboxilo o mercapto del fármaco Y, o A es OCO- cuando el radical se une a un grupo amino o hidroxilo de Y, siempre que cuando R_{1} a R_{4} son hidrógeno y A es OCO-, Y no es una fracción de un fármaco que contiene un grupo O-maloniltirosilo.
Según la presente invención, Y es una fracción de un fármaco para uso médico o veterinario que lleva al menos un grupo funcional seleccionado de amino, carboxilo, hidroxilo y/o mercapto, libre, tales al como, sin que quede limitado a ellos, fármacos antidiabéticos, por ejemplo insulina; promotores del crecimiento, por ejemplo hormona humana del crecimiento, hormona bovina del crecimiento; antibióticos tales como aminoglicósidos, por ejemplo gentamicina, neomicina y estreptomicina, \beta-lactamas, tales como penicilinas, por ejemplo, amoxicilina, ampicilina, piperacilina, y cefalosporinas, por ejemplo cefaclor, cefminox y cefalexina, macrólidos, por ejemplo, carbomicina y eritromicina, y antibióticos polipeptídicos, por ejemplo bacitracina, gramicidinas y polimixinas; antibacterianos sintéticos, por ejemplo trimetroprim, ácido piromídico, y sulfametazina; analgésicos y fármacos anti-inflamatorios, por ejemplo, acetaminofen, aspirina, ibufenac, indometacina; fármacos antialérgicos y antiasmáticos, por ejemplo amlexanox y cromolin; fármacos antihipercolesterolémicos, por ejemplo ácido clofíbrico, ácido oxiniácico y triparanol; bloqueantes \beta-adrenérgicos y fármacos antihipertensores, por ejemplo bupranolol, captopril, indenolol, propanolol y ácido 4-aminobutanoico; fármacos antineoplásicos, por ejemplo, daunorubicina, azacitidina, 6-mercaptopurina, interferones, interleucina-2, taxol y vinblastina; fármacos antivíricos, por ejemplo acyclovir, ganciclovir, amantadine, interferones, AZT y ribavirin, etc. Se entiende que el término fármaco según la invención abarca también las
feromonas.
Los términos "alquilo", "alcoxi", "alcoxialquilo", "arilo", "alcarilo" y "aralquilo" en las definiciones de R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} aquí utilizadas se refieren a radicales alquilo de 1-8, preferiblemente 1-4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo y butilo, y radicales arilo de 6-10 átomos de carbono, por ejemplo fenilo y naftilo. El término "halógeno" incluye bromo, flúor, cloro o yodo.
En un modo de realización preferido de la invención, el grupo funcional es el radical (i) donde R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} son hidrógeno y A es OCO-, es decir, el conocido radical 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) que se emplea mucho en síntesis de péptidos para protección temporal reversible de grupos amino (para una revisión, véase L.A. Carpino, Acc. Chem. Res. (1987) 20, 401-407). El grupo Fmoc es particularmente adecuado para síntesis de péptidos debido a la manipulación sintética favorable para su introducción y separación, y estabilidad preferente como pre-requisito para síntesis de péptidos y purificación conveniente. Además, el grupo 9-fluorenilmetilo (Fm) relacionado es aplicable también para enmascaramiento reversible de funciones carboxílicas, por ejemplo de aminoácidos. Los ésteres fluorenilmetílicos (ésteres Fm) resultantes generan las funciones carboxílicas libres del progenitor después del paso de reacción de \beta-eliminación en tratamiento básico suave y por tanto puede emplearse similarmente para enmascaramiento reversible de funciones carboxílicas de fármacos. El grupo Fmoc es de además de uso potencial similar en la protección reversible de grupos hidroxilo de tirosina, serina y treonina.
Los radicales Fmoc halogenados (i), donde al menos uno entre R_{1} y R_{2} en la posición 2 o en la posición 7 es halógeno, preferiblemente Cl o Br, el radical 2-cloro-1-indenilmetoxicarbonilo (CLIMOC) (ii), el radical 1-benzo[f]indenil-metoxicarbonil uretano (BIMOC) (iii), el radical uretano sulfona (iv) y los correspondientes radicales (i) a (iv) donde A es un enlace covalente se pueden utilizar igual que Fmoc y Fm para sustitución en funciones libres amino, carboxilo, hidroxilo y mercapto de fármacos, proporcionando así un amplio intervalo de sensibilidad hacia la separación de tales grupos en condiciones alcalinas, por ejemplo, fisiológicas. De hecho, los radicales (i) a (iv) pertenecen a una familia general de entidades químicas raras que sufren hidrólisis a pH neutro o ligeramente alcalino y condiciones suaves y pueden utilizarse por tanto para protección reversible temporal de grupos \alpha- y \varepsilon-amino, por ejemplo en síntesis de péptidos, y pueden separarse de la función amino, por una reacción de \beta-eliminación en condiciones básicas suaves.
Según la invención, los radicales (i) a (iv), preferiblemente Fmoc unido covalentemente a amino y/o fracciones hidroxilo, o Fm unido covalentemente a fracciones carboxilo y/o mercapto, sufren hidrólisis (vía \beta-eliminación) para volver a las funciones libres amino, hidroxi, mercapto o carboxilo, en condiciones fisiológicas en el fluido corporal, es decir, a pH 7,4 y 37ºC.
Los pro-fármacos de la invención se pueden preparar por reacción de la molécula de fármaco con un reactivo adecuado que comprende un radical (i) a (iv). Existen varios derivados de 9-fluorenilmetil (Fm) disponibles, tales como 9-fluorenilmetil-N-hidroxisuccinimida (Fmoc-OSu), un reactivo muy específico para funciones amino; cloruro de 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc-Cl) que reacciona con radicales amino e hidroxilo, a los que se une covalentemente; 9-clorometilfluoreno (Fm-Cl) que reacciona con radicales mercapto para dar derivados de S-Fm (Bodanszky y Bednarek, 1982); y 9-fluorenilmetanol (FM-OH) que reacciona con funciones carboxilo a las que esterifica.
También están disponibles los grupos funcionales sensibles a condiciones básicas que pueden separarse desde las funciones amino, carboxilo, hidroxilo o mercapto siguiendo trayectos diferentes de eliminación \beta, pero requieren normalmente manipulaciones extensas que no son adecuadas para la protección de fármacos. Una excepción conocida es el grupo trifluoroacetilo (TFA) que es bastante similar a Fmoc en cuanto a su fácil separación desde grupos amino, pero es potencialmente tóxico, y por eso los fármacos derivados de TFA no son recomendables para propósitos terapéuticos. Por otra parte, Fmoc-aminoácidos, por ejemplo, Fmoc-leucina, han mostrado tener bajo índice de toxicidad en modelos animales experimentales (Burch y col., 1991).
La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden un profármaco según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La Figura 1 muestra el curso del tiempo de activación (pH 7,4, 37ºC) de Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{1}-insulina (cuadrados llenos), Phe^{B1}, Lys ^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina (cuadrados blancos ) y Gly^{A1}, Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{3}-insulina (sustituida en los tres grupos amino, círculos abiertos), como se determina por ensayo biológico libre de células (fosforilación de [poli(Glu_{4}Tyr)] por preparación enriquecida de tirosina cinasa de receptor de insulina).
La Figura 2 muestra el efecto de la administración intraperitoneal única de (Fmoc)_{2}-insulina (3 mg/rata en 2 ml de DMSO al 10%) y NPH-insulina (3 mg/rata) sobre el nivel de glucosa en sangre de ratas normales.
La Figura 3 muestra el efecto de una sola administración intraperitoneal de (Sulfmoc)_{2}-insulina e insulina natural (en ambos casos 3 mg/rata en 1 ml de agua) sobre el nivel de glucosa en sangre de ratas normales.
La Figura 4 muestra la degradación de insulina (cuadrados blancos) y Gly^{A1}, Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{3}-insulina (rombos llenos) por una mezcla de tripsina y quimotripsina.
La Figura 5 muestra el efecto de una sola administración de Gly^{A1}, Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{3}-insulina (círculos llenos) sobre niveles de glucosa en sangre de ratas diabéticas tratadas con estreptozotocina (STZ) en comparación con la administración de insulina natural (cuadrados blancos).
La Figura 6 muestra que una administración única de Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina a ratas hiperglucémicas tratadas con STZ induce un efecto prolongado en la reducción de los niveles de glucosa en sangre.
La Figura 7 muestra la potencia antagonista \beta-adrenérgica de N-Fmoc-propanolol a través de la generación de propanolol activo en la incubación.
La presente invención se refiere a profármacos diseñados según un nuevo concepto para desarrollo de caminos mejores de administración de fármacos y por consiguiente de estabilidad y bioactividad del fármaco potenciadas. Según el nuevo método de la presente invención, se prefiere perder, en lugar de conservar, la estructura natural del fármaco, la potencia biológica y la capacidad del reconocimiento de la diana pero, después de la aplicación, el fármaco así modificado volverá a convertirse espontánea y lentamente, dentro del organismo, en la molécula activa original.
Según el nuevo concepto de la presente invención, numerosos fármacos que se aplican actualmente se pueden convertir en profármacos inactivos que son especies de vida larga que evaden la degradación general y la mediada por receptor, en el organismo. Los profármacos de la invención están diseñados para sufrir una regeneración espontánea a los fármacos originales en condiciones fisiológicas in vivo y de forma homogénea. El amplio espectro de procedimientos químicos disponibles para la producción de los profármacos de la invención permite obtener una velocidad rápida o lenta de reactivación según sea necesario. De esta manera se pueden preparar profármacos dados con atributos físicos tales como solubilidad disminuida y, por tanto, una velocidad más lenta de absorción subcutánea. Además, la alteración del índice de hidrofobicidad de profármacos, combinada con la característica de regeneración espontánea en la circulación sanguínea, permite convertir fármacos que no se absorben oralmente en profármacos permeables gastrointestinales.
Los profármacos según la invención incluyen fármacos modificados para su utilización en humanos y animales así como feromonas de insectos modificadas.
En un aspecto de la invención, el profármaco es insulina modificada. Actualmente, la insulina es el fármaco predominante para diabetes mellitus, un grupo de síndromes caracterizados por hiperglucemia, metabolismo alterado de lípidos, hidratos de carbono y proteínas y un riesgo incrementado de complicaciones de enfermedades vasculares. La mayoría de los pacientes se pueden clasificar clínicamente como pacientes que sufren diabetes méllitus dependiente de insulina (Tipo I, IDDM) o independiente de insulina (Tipo II, NIDDM). En Occidente, aproximadamente un 90% de pacientes diabéticos tiene diabetes Tipo II y la mayor parte de los restantes tiene la de Tipo I. Aproximadamente el 70% de los diabéticos de Tipo II en los Estados Unidos son también obesos, un factor que contribuye significativamente a la resistencia a insulina. En la diabetes Tipo I, hay una pérdida extensa y selectiva de células \beta del páncreas y un estado de hipoinsulinemia. En cambio, en los grupos de pacientes diabéticos del Tipo II no hay pérdida significativa de células \beta, pacientes en los cuales la concentración media en plasma de insulina en un período de 24 horas es esencialmente normal o incluso elevada debido a la resistencia periférica a la acción de la hormona. No obstante, individuos con diabetes Tipo II son relativamente deficientes en insulina. Esto se debe a que una célula \beta pancreática normal será capaz de secretar cantidades de insulina que son considerablemente mayores que las normales cuando se enfrentan a una hiperglucemia, permitiendo así a un individuo mantener euglucemia en la fase de resistencia moderada a insulina.
Virtualmente, todas las formas de diabetes méllitus son debidas a una reducción en la concentración de insulina (deficiencia de insulina) o a una disminución de la respuesta de los tejidos periféricos a la insulina (resistencia a insulina), en asociación con un exceso de hormonas con acciones opuestas a las de insulina (glucagon, hormona del crecimiento, cortisol, y catecolaminas). Estas anormalidades hormonales conducen a alteraciones del metabolismo de hidratos de carbono, lípidos, cetonas y aminoácidos. El rasgo central del síndrome es la hiperglucemia.
La vida media de insulina en plasma es de aproximadamente 5-6 minutos. La degradación de insulina tiene lugar principalmente en el hígado y en menor medida en el riñón y músculos. Aproximadamente el 50% de la insulina que alcanza el hígado en la vena portal es destruida y no alcanza la circulación general. La insulina es filtrada por los glomérulos renales y reabsorbida por los túbulos que también la degradan.
La degradación proteolítica de insulina en el hígado es principalmente mediada por receptor. Después de la unión a receptor de insulina, el complejo se internaliza en pequeñas vesículas llamadas endosomas donde se inicia la degradación. Parte de la insulina es suministrada también a lisosomas para degradación. En los hepatocitos se degrada aproximadamente un 50% de insulina internalizada.
La insulina es crítica para gestión de la cetoacidosis de diabetes, y es importante en el tratamiento del coma hiperglucémico no-cetónico, y en el control peri-operativo de pacientes diabéticos tanto del Tipo I como del Tipo II. La administración subcutánea de insulina (s.c.) es el principal tratamiento para todos los pacientes diabéticos del Tipo I y la mayoría del Tipo II que no son adecuadamente controlados por la dietay/o agentes hipoglucémicos orales. En estos casos, el objetivo es normalizar, no solamente la glucosa en sangre, sino también otros aspectos del metabolismo desequilibrado que resulta de hipoinsulemia e hiperglucemia.
Un tratamiento a largo plazo basado principalmente en administración s.c. de insulina no mimetiza la rápida elevación y declinación normal de la secreción de insulina en respuesta a nutrientes inyectados, y posee preferencialmente efectos periféricos en lugar de efectos hepáticos de insulina, no obstante el considerable éxito alcanzado con este tratamiento.
\newpage
Las preparaciones de insulina utilizadas tradicionalmente para aplicación por vía subcutánea se clasifican de acuerdo con su duración de acción en insulinas de actuación corta, intermedia y larga, y según el origen de la especie. La insulina humana está ahora disponible ampliamente, y en teoría es de esperar que sea menos inmunogénica que las insulinas porcina o bovina ya que las dos últimas difieren de la insulina humana en uno y tres aminoácidos respectivamente. Sin embargo, cuando se purifican mucho, las tres insulinas tienen capacidad baja, pero mensurable, para estimular la respuesta inmune. Las preparaciones a valores de pH neutro son en general estables y permiten el almacenamiento durante largos períodos de tiempo a temperatura ambiente. Para propósitos tradicionales y terapéuticos, las dosis y concentraciones de insulina se expresan en unidades (U), basadas en la cantidad requerida para inducir normoglucemia en conejos en ayunas. Las preparaciones homogéneas de insulina contienen aproximadamente 25 U/mg. Casi todas las preparaciones comerciales de insulina se suministran en solución a una concentración de 100 U/ml.
Las insulinas de actuación corta o rápida son preparaciones solubles de insulina zinc cristalina disuelta en un agente tampón de pH neutro, normalmente inyectada 30-45 minutos antes de las comidas. Estas preparaciones tienen el comienzo de actuación más rápido y la duración de actuación más corta.
En condiciones metabólicas estables, las insulinas regulares se administran habitualmente junto con preparaciones de actuación intermedia o larga. Las insulinas de actuación intermedia se diseñan para ser menos solubles en soluciones acuosas, con lo que se disuelven más gradualmente en administración subcutánea y su duración de acción es más larga. Las dos preparaciones más frecuentemente utilizadas son Insulina NPH (NPH son las siglas de Neutral Protamina Hagedorn), una suspensión de cristales de zinc-insulina en tampón fosfato modificado por adición de sulfato de protamina, e Insulina Lente, una suspensión de insulina en tampón acetato modificado por adición de cloruro de zinc para reducir la solubilidad de insulina.
Dado de que es de esperar que la insulina de actuación corta cubra un período de 0,4-7 horas y la insulina de actuación intermedia pueda cubrir un intervalo de 1,5-20 horas, el cálculo correcto del tiempo y dosis de la combinación de las dos insulinas debe tomar en consideración los parámetros variables tales como comportamiento nutricional, hipoglucemia nocturna (en ayunas) e hiperglucemia matutina, cuando la actividad de las hormonas contra-reguladoras (para insulina) se incrementa. Si las preparaciones de insulina de actuación rápida y actuación intermedia o larga se coadministran juntas, una desventaja común de tales combinaciones es que, al mezclarse, parte de las insulinas de actuación rápida puede formar complejos con el exceso de Zn^{2+} o protamina de la preparación de actuación larga o intermedia, convirtiéndose así en una insulina de actuación intermedia e incluso de actuación larga.
Las insulinas de actuación larga, tales como Insulina Ultralente o suspensiones de insulina-zinc extendida o de protamina-zinc-insulina son preparaciones de insulina en las que el zinc o zinc más protamina se han añadido en exceso con el fin de conseguir preparaciones insolubles de insulina. Son suspensiones de partículas menudas de zinc-insulina y difieren solo en el tamaño de partícula que determina la duración de su acción. A diferencia de una insulina regular, las Insulinas Ultralente tienen un comienzo muy lento y un máximo de acción prolongado ("plano"). Se considera que proporcionan una baja concentración basal de insulina a lo largo del día, pero su vida media larga hace difícil determinar la dosis óptima y los días de tratamiento requeridos antes de poder alcanzarse la concentración de estado estacionario. La Insulina Ultralente bovina y porcina tiene un curso de acción más prolongado que la Insulina Ultralente humana. Se recomienda iniciar la terapia con tres veces la dosis diaria normal como dosis de carga, seguido de inyecciones de una o dos veces al día.
La insulina tiene tres aminoácidos y seis grupos carboxilo disponibles para modificación. Los derivados de insulina de la invención están sustituidos en las cadenas A y B de insulina por uno o más de los radicales (i) a (iv) anteriores en uno o más de los grupos amino terminales de los radicales Gly^{A1} y Phe^{B1}, en el grupo de \varepsilon-amino de la Lys^{B29}, en los grupos carboxilo terminales de Asn^{A21} y Thr^{B30} y/o en los grupos carboxilo libres de Glu^{A4}. Glu^{A17}, Glu^{B13}, Glu^{B21}. Además de los derivados de insulina así sustituidos en carboxilo y/o amino se pueden también sustituir con uno o más de los grupos funcionales (i) a (iv) en uno o más de los grupos hidroxilo libres de los radicales Thr^{A8}, Ser^{A9}, Ser^{A12}, Tyr^{A14}, Tyr^{A19}, Ser^{B9}, Tyr^{B16}, Tyr^{B26}, Thr^{B27} y Thr^{B30}.
En un modo de realización preferido de la presente invención, los derivados de insulina están sustituidos con una o más fracciones Fmoc en los grupos amino terminales libres de Gly^{A1} y Phe^{B1}, y/o en el grupo \varepsilon-amino de Lys^{B29}, obteniendose así derivados de insulina que tienen de 1 a 3 sustituyentes Fmoc en las posiciones A^{1}, B^{1} y/o B^{29} de la molécula de insulina, en particular Gly^{A1}-N-(Fmoc)_{1}-, Phe^{B1}-N(Fmoc)_{1}- y Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{1}-insulina, Gly^{A1},Phe^{B1}-N-(Fmoc)_{2}-, Gly^{A1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}- y Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina, y Gly^{A1}, Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{3}-insulina.
La reacción de insulina con Fmoc activado, por ejemplo con 9-fluorenmetil-N-hidroxisuccinimida (Fmoc-OSu) produce mono-, di- y tri-N-Fmoc-insulinas que se pueden resolver fácilmente por procedimientos de HPLC y obtenerlas individualmente en forma pura. Para obtener una di-N-Fmoc-insulina como único producto, se protege primero uno de los grupos amino libres, por ejemplo con grupo t-Boc, se hace reaccionar el derivado de insulina protegido con exceso de Fmoc-OSu, y se separa entonces el grupo protector, resultando la di-N-Fmoc-insulina deseada. Cuando se administra a pacientes diabéticos, las mono-, di- y tri-N-Fmoc se convierten en insulina natural in vivo lo que conduce a efectos antidiabéticos a lo largo de diversos períodos de tiempo incluyendo períodos de tiempo prolongados.
Para sustitución solamente de los grupos carboxilo de insulina (C-Fm), es decir, en Asn^{A21} y Thr^{B30} terminales y en los radicales Glu^{A4}, Glu^{A17}, Glu^{B13} y Glu^{B21}, se protegen primero los grupos amino libres de la molécula de insulina, por ejemplo, con grupos t-Boc, y se lleva a cabo entonces una reacción en etapas, donde (1) los grupos carboxilo libres se convierten en grupos éster activos por reacción, por ejemplo, con un o-nitrofenol o N-hidroxi-succinimida; (2) reacción de los grupos éster activados con 9-fluorenilmetanol en presencia de imidazol; y (3) separación de los grupos t-Boc protectores. Un procedimiento alternativo supone una esterificación directa en una etapa de los grupos carboxílicos con N,N'-diciclohexilcarbodiimida, 9-fluorenilmetanol y 4-dimetilaminopiridina, seguido de la separación de los grupos t-Boc.
Cuando se desean los derivados de Fmoc-insulina sustituidos en ambos grupos amino y carboxilo (N-Fmoc, C-Fm), se prepara primero el derivado F-moc con Fmoc-OSu y se convierte entonces la N-Fmoc insulina en ésteres activos seguido de reacción con 9-fluorenilmetanol como se ha descrito antes.
Para la preparación de los derivados Fm, Fmoc-insulina sustituidos en las funciones carboxilo e hidroxilo (CFm, O-Fmoc), se protegen primero los grupos amino con t-Boc, se prepara el derivado C-Fm insulina como antes, seguido de reacción con cloruro de 9-fluorenilmetoxicarbonilo y se separan los grupos N-t-Boc protectores.
Para la preparación de derivados de Fm, Fmoc-insulina sustituidos en las funciones amino, carboxilo e hidroxilo (N, OFmoc, CFm), se prepara la N-Fmoc, C-Fm insulina como antes y se hace reaccionar entonces con cloruro de 9-fluorenilmetoxicarbonilo.
Las insulinas modificadas según la invención se pueden preparar a partir de una insulina apropiada para uso humano, tal como insulina humana, porcina o bovina natural, recombinante o mutada. Entre los ejemplos de insulinas mutadas están análogo de insulina humana B16-Tir \rightarrow His (Kaarsholm y Ludvigsen, 1995) y el análogo de insulina humana Lys^{828}Pro^{829} (insulina lispro), en la que está invertida la secuencia natural de aminoácidos en las posiciones B28 y B29. La insulina lispro es equipotente a la insulina humana y aún es absorbida más rápidamente desde los lugares de inyección subcutánea (Campbell y col., 1996). En un modo de realización preferido, la insulina es insulina humana, ya sea natural o recombinante.
Los derivados de mono-N-Fmoc-insulina de la presente invención tienen una potencia biológica del 40-80% de la potencia biológica de la insulina natural, como se determina por el ensayo de fosforilación [poli(Glu_{4}Tyr)]. Los derivados di- y tri-N-Fmoc-insulina tienen 2-9% y <1% de la potencia biológica de la insulina natural, respectivamente, como se determina por el ensayo de fosforilación [poli(Glu_{4}Tyr)]. Cuando se utiliza apropiadamente, en las proporciones correctas, estos tres prototipos pueden sustituir en principio a las mezclas tradicionales de insulinas de actuación rápida, intermedia y larga aplicadas actualmente a la terapia subcutánea de la diabetes. En el aspecto relacionado con la insulina, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más derivados de insulina de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Para un efecto de actuación prolongada, la composición comprenderá preferiblemente ya sea el derivado N-(Fmoc)_{3}-insulina o el derivado N-(Fmoc)_{2}-insulina solos o mezcla de ambos. La composición farmacéutica puede presentarse en cualquier forma adecuada, por ejemplo como formulación oral o para inyección subcutánea.
En otro modo de realización de este mismo aspecto, la invención se refiere a un método para el tratamiento de diabetes que comprende administrar a un paciente diabético una dosis eficaz de uno o más derivados de insulina de la invención. En modos de realización preferidos el derivado es N-(Fmoc)_{3}-insulina o N-(Fmoc)_{2}-insulina humana natural o recombinante, o una mezcla de ambas, administrada en 5-8 intervalos al día. Si es necesario, se completa el tratamiento con el derivado Fmoc-insulina con la administración diaria de insulina de actuación rápida.
Para tratamiento a largo plazo, la insulina se administra principalmente por inyecciones subcutáneas, El tratamiento actual con insulinas de actuación larga administradas subcutáneamente está expuesto a grandes variaciones en la absorción entre pacientes diabéticos individuales, debido al hecho de que las substancias añadidas pueden difundirse potencialmente fuera del lugar de la inyección subcutánea. La presente invención proporciona derivados de insulina con solubilidad reducida de "incorporado" dentro de la propia molécula de insulina. Es de esperar que esto elimine en los pacientes humanos la gran variación de absorción subcutánea y que reduzca al mínimo o incluso elimine las interferencias al mezclar los análogos también. La mezcla apropiada de los tres prototipos de N-(Fmoc)-insulina puede cubrir una larga duración de actuación ya que combina la necesidad de insulina de actuación rápida junto con los efectos de liberación lenta de N-(Fmoc)_{2} y N-(Fmoc)_{3}-insulina, todas las cuales pueden mezclarse sin efectos de interferencia.
En otro modo de realización de este mismo aspecto, la composición de la invención comprende una mezcla de derivados mono-, di y tri-N-Fmoc-insulina. La N-(Fmoc)3-insulina es, básicamente, una insulina de actuación larga; las N-(Fmoc)1-insulinas son 40-80% biológicamente activas, como se determina por el ensayo de fosforilación [poli(Glu_{4}Tyr)] y presentan una mayor solubilidad en soluciones acuosas, y las N-(Fmoc)_{2}-insulinas son 2-9% biológicamente activas, como se determina por el ensayo de fosforilación [poli(Glu_{4}Tyr)] y son menos solubles en soluciones acuosas. Los tres análogos vuelven a ser insulinas completamente activas al incubarlos a 37ºC a valores de pH fisiológicos. Según esto, la propia mezcla de los tres análogos puede dar un efecto de actuación rápida, intermedia y larga, alcanzado ahora por múltiples inyecciones de insulina regular junto con preparaciones que contienen zinc y protamina.
En otros aspectos de la presente invención, los profármacos derivan de los fármacos para uso médico o veterinario que incluyen, pero no queda limitado solo a ellos, fármacos antidiabéticos, antiinflamatorios, antibacterianos, antivirales, antineoplásicos y antihipertensivos, así como fármacos para tratamiento de trastornos inmunológios, dermatológicos y neurológicos.
Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden el profármaco o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Cualquier vía de administración adecuada de fármacos a personas o a animales es contemplada por la invención, por ejemplo la administración convencional vía inyectable, vía de implante, vía oral, administración rectal o tópica. Estas preparaciones se pueden obtener por los métodos convencionales conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo como se describe en "Remington's Pharmaceutical Science", A.R. Gennaro, ed. 17 edición, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pa, EEUU.
La invención se ilustra a continuación con los siguientes Ejemplos no-limitativos.
Ejemplos Procedimientos biológicos (i) Preparación de ratas tratadas con estreptozotocina (STZ)
Se utilizaron ratas Wistar macho (180-200 g) suministradas por el Departamento de Investigación de Hormonas del Instituto Weizman de la Ciencia. Se indujo diabetes por una sola inyección intravenosa de una solución preparada reciente de estreptozotocina (55 mg/kg corporal) en tampón citrato 0,1 N (pH 4,5) según Meyerovitcg y col., 1987.
(ii) Preparación enriquecida de tirosina cinasa de receptor de insulina obtenida de membranas de hígado de rata como describen Meyerovits y col., 1990. Brevemente, se homogeneizó el hígado en la presencia de inhibidores de proteinasa, se solubilizó con 1% de Triton X-100 y se centrifugó. Se hizo pasar el sobrenadante a través de una columna (Sigma) de aglutinina de germen de trigo (WGA) -agarosa. La porción de receptor de insulina adsorbida se eluyó con N-acetil-D-glucosa amina 0,3 M en tampón HEPES 50 mM, pH 7,4, que contenía 0,1% de Triton X-100, 10% de glicerina y NaCl 0,15 M. Las potencias biológicas de insulina y derivados de insulina se evaluaron por los ensayos (iii) y (iv) dados a continuación.
(iii) Lipogénesis (incorporación de glucosa marcada a lípidos de adipocitos intactos)
Se prepararon adipocitos de rata siguiendo esencialmente el método de Rodbell, 1964. Se cortó panículo adiposo de ratas Wistar macho en pequeñas piezas con unas tijeras y se suspendió en 3 ml de tampón KRB que contenía NaCl, 110 mM; NaHCO_{3}, 25 mM; KCl, 5 mM; KH_{2}PO_{4}, 1,2 mM; CaCl_{2}, 1,3 mM; MgSO_{4}, 1,3 mM; y 0,7% de BSA (pH 7,4). Se llevó a cabo digestión con colagenasa (1 mg/ml) en una botella de plástico flexible bajo atmósfera de carbogeno (95% de O_{2}, 5% de CO_{2}) durante 40 minutos a 37ºC con sacudidas vigorosas. Se añadieron entonces cinco mililitros de agente tampón y se hicieron pasar las células a través de un tamiz de mallas. Se dejaron reposar entonces las células durante varios minutos en un tubo de ensayo de plástico de 15 ml a temperatura ambiente, flotando, y se separó el agente tampón de debajo. Se repitió el proceso (suspensión, flotación, y separación del agente tampón de debajo) tres veces.
Se dividieron las suspensiones de adipocitos (3x10^{5} células/ml) en viales de plástico (0,5 ml por vial) y se incubaron durante 60 minutos a 37ºC bajo atmósfera de carbogeno con [U-^{14}C]glucosa 0,2 mM en presencia o ausencia de insulina. Se terminó la lipogénesis por adición de fluido de centelleo basado en tolueno (1,0 ml por vial) y se hizo el conteo de la radiactividad en los lípidos extraídos (Moody y col., 1974). En un experimento típico, la lipogénesis estimulada por insulina era 4-5 veces más alta que la basal (basal ''2000 cpm por 3x10^{5} células/h; V_{insulina} 8.000-10.000 cpm por 3x10^{5} células/h). En este ensayo, la insulina estimula la lipogénesis con el índice ED_{50} = 0,15\pm0,03 ng/ml (Shechter y Ron, 1986). Un análogo de insulina que presenta un valor de ED_{50} = 15 ng/ml se considera que tiene \sim1% de la potencia biológica de la hormona natural.
(iv) Medida de la actividad de tirosina cinasa de receptor
En este ensayo, la insulina activa su propio receptor para fosforilar un copolímero al azar que contiene ácido L-glutámico y L-tirosina a una relación molar de 4:1 [Poli(Glu_{4}Tyr)]. La mezcla de ensayo de enzima convencional (volumen final 60 \mul en Hepes 50 mM, pH 7,4-0,1% de Tritón X-100) contenía receptor de insulina purificado WGA (5 \mug de proteína), MgCl_{2} 20 mM, MnCl_{2} 2 mM, ATP 100 \muM y concentraciones variables (de 1 ng/ml a 10 mg/ml) de insulina o derivado de insulina. Después de 30 minutos de preincubación a 22ºC, la reacción se inició por adición de [Poli(Glu_{4}Tyr)] (concentración final 0,7 mg/ml), siguió durante 20 minutos a 22ºC y se terminó por adición de EDTA (20 mM). Se determinó cuantitativamente el contenido de fosfotirosina en Poli(Glu_{4}Tyr) por un procedimiento de radio-inmunoensayo utilizando anticuerpos monoclonales específicos para fosfotirosina (dilución final 1:100.000) y conjugado de ^{125}[-BSA-fosfotirosina. En este ensayo particular la insulina facilita la mitad del efecto máximo a una concentración de 20\pm3 ng/ml. Un análogo de insulina que presenta un valor de ED50 = 2 mg/ml se considera que tiene \sim1% de la potencia biológica de la hormona natural.
Ejemplo 1 Preparación de derivados de N-Fmoc-insulina (a) Síntesis
Se suspendió insulina humana (100 mg, 17,2 \mumoles) (donada amablemente por Biotechnology-General Rehovot, Israel) en 4 ml de dimetilformamida (DMF) de calidad analítica que contenía 17,4 mg (172 \mumoles) de trietilamina. Se añadió entonces Fmoc-OSu (58 mg, 172 \mumoles). La mezcla de reacción homogénea se agitó a 25ºC durante 20 horas y se añadió luego acetato de etilo hasta turbidez de la solución, seguido de la adición de éter para completar la precipitación. El disolvente se separó por centrifugación y el precipitado se lavó dos veces con éter y dos veces con agua. Este procedimiento condujo a una mezcla de derivados mono, di y tri-N-Fmoc-insulina que se separaron y purificaron por cromatografía HPLC preparativa. Los derivados N-Fmoc-insulina mono-modificados pueden separarse de los derivados di y tri-modificados por lavado con isopropanol del sólido bruto
(b) Aislamiento y purificación de derivados N-Fmoc-insulina
Se sometió el sólido bruto a HPLC de fase inversa (sistema de cromatografía de líquidos Spectra-Physics SP 8800) equipado con columna pre-empaquetada de HPLC (Merck, LIChrosCART 250-10 mm que contenía LlChrosorb RP-18 [7 \mum]. Se formó un gradiente lineal desde ácido trifluoroacético 0,1% (TFA) en H_{2}O (solución A) y 0,1% de TFA en acetonitrilo: H_{2}O, 75:25 (solución B). La velocidad de flujo fue de 1 ml/min. El derivado N-(Fmoc)_{1}-insulina emergió de la columna con tiempos de retención de 21,1, 21,9 y 22,8 minutos, los derivados N-(Fmoc)_{2}-insulina con tiempos de retención de 26,3, 27,1 y 27,7 minutos, y la N-(Fmoc)_{3}-insulina con retención de 31,5 minutos. Las fracciones correspondientes a 21-23 minutos, 26-28 minutos y 31,5 minutos se acumularon, se liofilizaron y se caracterizaron químicamente. Las fracciones correspondientes a 21-23 minutos (insulinas monomodificadas) y a 26-28 minutos (insulinas di-modificadas) se purificaron además para dar los derivados mono-Fmoc y di-Fmoc-insulina individuales, respectivamente. Las cantidades de grupos Fmoc unidos a la molécula de insulina se determinaron espectrofotométricamente a 301 nm siguiendo el tratamiento de cantidades conocidas de derivados de N-Fmoc-insulina con piperidina al 50% en CH_{2}Cl_{2}.
(c) Caracterización química de derivados de N-Fmoc-insulina
Después de la separación preparativa por un procedimiento de HPLC, se obtuvieron siete derivados de N-Fmoc-insulina. Estos incluyen tres derivados mono-modificados, tres di-modificados y uno tri-modificado, respectivamente (Tabla I). Los tiempos de retención y los rendimientos de cada compuesto individual se dan en la Tabla I. Las diferentes N-Fmoc-insulinas se pueden resolver fácilmente entre sí y obtenerse en forma purificada bajo las condiciones experimentales aplicadas aquí. Se caracterizaron Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina (tiempo de retención = 27,7 minutos) y Gly^{A1}, Phe^{B1} y Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{3}-insulina por varios procedimientos incluyendo los espectros de masas (Tabla I).
(d) Síntesis de Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-Fmoc)_{2}-insulina
Dado que los bio-ensayos revelaron que Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina es especialmente adecuada como insulina de actuación larga, se diseñó un procedimiento alternativo para sintetizarla. Se protegió especialmente la fracción Gly^{A1} con grupo t-Boc bajo condiciones experimentales especificadas, utilizando un equivalente de dicarbonato de di-terc-butilo y DMSO/Et_{3}N, 20:1, como disolvente. Después de la separación por el procedimiento HPLC, se hizo reaccionar Gly^{A1}-N-Boc-insulina con un exceso de Fmoc-OSu (10 equivalentes), utilizando DMF como disolvente y DIEA como base: El tratamiento con TFA y purificación por HPLC produjo Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina, con buen rendimiento (\sim50%).
(e) Caracterización biológica de derivados de N-Fmoc-insulina
En las Tablas II y III se recogen varias características de los derivados N-Fmoc-insulina de la presente invención. La solubilidad de los derivados en soluciones acuosas decrece al incrementarse la modificación, N-(Fmoc)-insulina es solamente ligeramente menos soluble que la insulina natural mientras que la N-(Fmoc)_{3}-insulina es aproximadamente 20 veces menos soluble que la hormona natural. Las potencias biológicas disminuyen a medida que se incrementa la derivación. Así, las di y tri-N-Fmoc-insulinas presenta 40-80%, 2,9% y <1% de la potencia biológica de insulina natural, respectivamente, como se deduce del ensayo de fosforilación de [poli(Glu_{4}Tyr)]. Según el más sensible ensayo biológico de lipogénesis con adipocitos intactos de ratas, los derivados Fmoc-insulina presentan potencias biológicas muy inferiores. Según esto, la Gly^{A1}-N-Fmoc-insulina y di-N-Fmoc-insulinas presentan una potencia biológica que es el 4,7% y 0,4-1,4% de la potencia biológica de insulina natural, respectivamente, utilizando el ensayo de lipogénesis (Tabla III). Los siete derivados, todos ellos, revierten a la hormona natural al incubarlos durante 2 días a pH 8,5. Esto quedaba probado por la recuperación de la potencia biológica completa (Tablas II y III) y por la desaparición de los picos de los derivados, junto con la aparición del pico de hormona natural (tiempo de retención = 15 minutos) en la separación por el procedimiento de HPLC analítica.
TABLA 1 Caracterización química de derivados N-Fmoc-insulina
derivado Tiempo de Rendimiento^{b} Moles de Posición de la Espectro de masas
retención (%) Fmoc/ inserción del Fmoc (peso molecular)
(HPLC) moles de calculado encontrado
minutos^{a} insulina [M+H]^{+}
N-(Fmoc)_{1}-insulina 21,1 3 0,8 Gly^{A1}
N-(Fmoc)_{1}-insulina 21,9 6 1,2 Lys^{B29}
N-(Fmoc)_{1}-insulina 22,8 4 0,9 Phe^{B1}
N-(Fmoc)_{2}-insulina 26,3 12 1,7 Gly^{A1}, Lys^{B29}
N-(Fmoc)_{2}-insulina 27,1 6 2,1 Gly^{A1}. Phe^{B1}
N-(Fmoc)_{2}-insulina 27,7 14 1,9 Phe^{B1}, Lys^{B29} 6252 \hskip0,5cm 6255
N-(Fmoc)_{3}-insulina 31,5 30 3,4 Gly^{A1}, Lys^{B29}, Phe^{B1} 6474 \hskip0,5cm 6475
Nota: \begin{minipage}[t]{150mm} Se utilizó el análisis de aminoácidos para verificar la composición correcta de todos los derivados de Fmoc \end{minipage}
\hskip0,6cm^{a} \begin{minipage}[t]{150mm} Establecido con columna LiChrospher 100 RP-8 Merck (5 \mu m), empleando un gradiente lineal formado desde 60% de solución A (0,1% de TFA en agua) y 40% de solución B (0,1% TFA en acetonitrilo:agua, 75:25), a 100% de solución B en 40 minutos (velocidad de flujo de 1 ml/minuto\end{minipage}
\hskip0,6cm^{b} Basado en el material puro obtenido después de HPLC
TABLA II Varias características representativas de derivados Fmoc-insulina
Derivado Origen Posición de la Aspecto en Solubilidad Potencia Potencia biológica
inserción de tampón en tampón biológica tras incubación
F(moc) acuoso acuoso (%) (2 días a 37º
(pH 7,4) (pH 7,4, pH 8,5)
mg/ml)
Insulina natural humano transparente \sim4 o más 100 100
N-(Fmoc)_{1}-insulina humano Gly^{A1} casi \sim3 40\pm2 95
transparente
N-(Fmoc)_{1}-insulina humano Lys^{B29} casi \sim3 78\pm4 94
transparente
N-(Fmoc)_{1}-insulina humano Phe^{B1} casi \sim3 76\pm4 95
transparente
N-(Fmoc)_{2}-insulina humano Gly^{A1}, Lys^{B29} turbio \sim2 2\pm1 93
N-(Fmoc)_{2}-insulina humano Gly^{A1}, Phe^{B1} turbio \sim2 3\pm1 97
N-(Fmoc)_{2}-insulina humano Phe^{B1}, Lys^{B29} turbio \sim2 9\pm2 95
N-(Fmoc)_{3}-insulina humano Gli^{A1}, Lys^{B29}, Phe^{B1} muy turbio \sim0,2 <1 98
Nota: La potencia tipo insulina se determinó por los dos ensayos biológicos descritos en la parte experimental
TABLA III Potencias biológicas y curso del tiempo de activación de varias N-Fmoc insulinas utilizando ensayos lipogenéticos (con adipocitos de rata intactos))
Derivado ED_{50} Potencia Actividad tras incubación a pH 8,5, 37ºC(%)
lipogénesis biológica
(ng/ml) relativa (%) 9 horas 20 horas 45 horas
Insulina natural 0,2-0,4 100
Gly^{A1}-N-Fmoc-insulina 7 4,7 50 100
Gly^{A1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina 44 0,4 10 20 97
Gly^{A1}, Phe^{B1}-N-(Fmoc)_{2}-insulina 30 1,1 18 40 100
Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina 12,3 1,4 10 20 98 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Actividad biológica de N-Fmoc-insulinas (a) Curso del tiempo de activación de N-Fmoc-insulinas a pH 7,4
Antes de estudiar las potencias antidiabéticas de N-Fmoc-insulinas en ratas diabéticas, se ensayó su velocidad de reactivación (que representa su conversión a hormona natural) en el tubo de ensayo. Los derivados se había disuelto en tampón Hepes (50 mM, pH 7,4) que contenía dimetilsulfóxido (DMSO) al 10% y se incubaron a 37ºC (es decir, a pH fisiológico y temperatura corporal). En los puntos de tiempo indicados, se tomaron partes alícuotas para determinar la potencia biológica con respecto a la insulina natural. Se evaluaron las actividades biológicas por activación de tirosina cinasa de receptor de insulina (un ensayo libre de células como se describe en los Procedimientos Biológicos anteriores, sección (iv) y por estimulación de la lipogénesis en adipocitos de ratas intactos como se describe en los Procedimientos Biológicos, sección (ii). Los resultados se muestran en la Figura 1. La activación máxima mitad que tiene lugar para N-(Fmoc)_{3}-insulina a t1/2=14 días y la activación casi completa era evidente a los 21 días de incubación.
Por regla general, la velocidad de activación de N-(Fmoc)_{2}-insulina a pH 7,4 era más rápida. El periodo de retraso de seis días observado con N-Fmoc)_{3}-insulina no se vio con N-(Fmoc)_{2}-insulina. Según esto, N-(Fmoc)_{3}-insulina parece tener una fracción de Fmoc hidrolizable más lenta que limita la reactivación del análogo. Después de su hidrólisis, se incrementa la velocidad de activación. Desde un punto de vista práctico, esto implica que la mezcla de los dos análogos puede liberar la insulina activa a lo largo de un período prolongado de tiempo, al cubrir los períodos de tiempo más tempranos y más tardíos. La Fmoc-insulina mono-modificada relativamente activa recuperaba la potencia biológica completa a pH 7,4 con t1/2 = 5 días.
Una vez que las N-(Fmoc)_{2}- y N-(Fmoc)_{3}-insulinas llegan a la circulación es de esperar que proporcionen una concentración basal baja de la hormona a lo largo de períodos prolongados. Esto puede estar dictado principalmente por la velocidad de conversión del derivado inactivo a la hormona natural de vida activa corta. Afortunadamente, las N-(Fmoc)2,3-insulinas presentan velocidades lentas de activación (como muestra la Figura 1). Una velocidad rápida (instantánea; es decir dentro de minutos en vez de horas) podría dar por resultado episodios de hipoglucemia.
La Phe^{B1},Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2} insulina es un 9% biológicamente activa, como se determina por el ensayo de fosforilación [poli(Glu_{4}Tyr], y presenta solubilidad intermedia entre la insulina natural y N-(Fmoc)_{3}-insulina. A diferencia de la N-(Fmoc)-insulina, la conversión de N-(F-moc)_{2}-insulina a hormona natural comienza enseguida (en horas) de la incubación, como se muestra en la Figura 1. Según esto, es de esperar que la N-(Fmoc)_{2}-insulina (que es a priori más activa) tenga un comienzo más rápido de acción después de la administración. Según esto, una combinación apropiada de N-(Fmoc)_{2}- y N-(Fmoc)_{3} insulinas puede ser una fórmula ideal para liberar insulina basal que se caracteriza por un rápido comienzo y larga duración de acción, después de una sola administración, y constituye un modo de realización preferido de la invención.
TABLA IV Efecto de una sola administración de Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)2-insulina en la ganancia diaria en peso de ratas STZ
Grupo Descripción Ganancia diaria de peso
(gramos/rata) en los 3
primeros días
A (n=5) ratas STZ que reciben solo vehículo (2,0 ml, DMSO al 20%/rata 2,0\pm0,2
B (n=5) ratas STZ que reciben una sola administración s.c. de insulina 12,0\pm0,2
NPH-humana (Humulina N)(3 mg/rata)
C (n=5) ratas STZ que reciben una sola inyección s.c. de N-(Fmoc)_{2} 11,0\pm1,3
insulina (3 mg/rata)
(b) Efecto de una administración única de Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina a ratas normales
Con el fin de confirmar que la capacidad de actuación larga de (Fmoc)_{2}-insulina es debida a su lenta conversión a la hormona natural en condiciones fisiológicas, se diseñó un ensayo adicional in vivo. Este ensayo refleja las características de actuación larga post-subcutáneas de insulina (o derivado de insulina) dentro de la circulación. Las ratas normales recibieron una sola inyección intraperitoneal de insulina natural, NPH-insulina y (Fmoc)_{2}-insulina (3 mg/rata), y se hizo el seguimiento de sus niveles de glucosa en sangre a lo largo de un período de tres días. Los resultados se muestran en la Figura 2. Según esto, la insulina natural (Figura 3) y la NPH-insulina (Figura 2) inducían hipoglucemia en un período de aproximadamente 12 y 15 horas, respectivamente. La recuperación desde hipoglucemia tenía lugar con un t1/2 de 8 y 10 horas, respectivamente. La (Fmoc)_{2}-insulina reducía los niveles de glucosa en sangre en un período de aproximadamente 48 horas, y la recuperación desde hipoglucemia tenía lugar en un t1/2 de 26 horas. Estos resultados apoyan la idea de los autores de que es indudable que la acción prolongada de (Fmoc)_{2}-insulina emerge de sus características intrínsecas, y no se debe al mecanismo convencional de NPH-insulina, es decir precipitación en el lugar de inyección y su lenta disolución - entrada en la circulación. Como es de esperar, las diferencias en las capacidades de insulina natural y NPH-insulina para reducir los niveles de glucosa en sangre en este ensayo son menores al compararlas con los de administración por vía subcutánea. Este hecho es debido al gran volumen de líquidos existentes en la cavidad peritoneal y de aquí la conversión rápida de la insulina cristalina-Zn para dar la forma monomérica. Los otros dos derivados de (Fmoc)_{2}-insulina, [Gly^{A1}, Lys^{B29}] y [Gly^{A1}, Phe^{B1}] se sintetizaron y se evaluaron también en este ensayo. Los resultados (no mostrados) presentaban modelos de actuación larga similares a los de Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina, con t1/2 de 22-24 horas para los dos derivados.
(c) La N-(Fmoc)3 insulina es resistente a proteolisis
La insulina natural o la N-(Fmoc)_{3} insulina (1mg/ml de cada una en Hepes 50 mM, pH 7,4, DMSO al 10%) se incubaron a 37ºC. Se añadieron entonces quimotripsina y tripsina (0,5% peso/peso de cada una). En los momentos indicados, se sacaron y se sometieron a cromatografía HPLC analítica. El porcentaje de degradación se determinó por la reducción del área del pico de insulina natural (tiempo de retención 15 minutos) y del pico de la N-(Fmoc)_{3}-insulina (tiempo de retención 31,5 minutos). Los resultados se muestran en la Figura 4.
Se encontró que la N-(Fmoc)_{3} insulina era altamente resistente a proteolisis por una mezcla de quimotripsina y tripsina a un pH de 7,4. La proteolisis tenía lugar con valores del t1/2 de 0,5 y 7,5 horas para insulina natural y N-(Fmoc)_{3}insulina, respectivamente.
Ejemplo 3 Efecto de una sola administración subcutánea de Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}- y N-(Fmoc)_{3}insulina a ratas diabéticas STZ
La rata STZ es un excelente modelo para evaluar in vivo la terapia con insulina. En este modelo había sido destruido aproximadamente el 90% de la función de células \beta por estreptozotocina (STZ), según muestran los estudios histológicos (como describen Pederson y col, 1989). Las ratas son hipoinsulinémicas (que tienen 10-30% del nivel normal de insulina), hiperglucémicas (>300 mg/dl; el nivel normal de glucosa de las ratas control es de 90-100 mg/dl), y catabólicas. Los síntomas externos visibles son aspecto "mareado" y tres a cuatro veces de incremento de ingesta de líquidos y excreción de orina. La ganancia en peso disminuye un 10-20% (0,3-0,8 gramos/día/rata) de la ganancia normal de peso de las ratas control. Los cambios patológicos en los tejidos de ratas STZ son enormes. Algunas de las más prominentes alteraciones bioquímicas son actividad decrecida de enzimas clave de metabolismo de glicógeno, agotamiento del glicógeno del hígado, reducción en el número de transportadores de glucosa, en tejidos periféricos, y un incremento en la capacidad de unión a insulina que no va acompañada de aumento de capacidad de respuesta a insulina.
En este modelo de rata diabética una terapia de insulina conveniente es la administración continua de insulina (5 unidades/día/rata) a lo largo de un período de una semana: Este tratamiento normaliza los niveles de glucosa en sangre, vuelve las ratas diabéticas al estado anabólico, y mejora muchos de los efectos patológicos inducidos por hiperglucemia e hipoinsulemia. Una sola administración de insulina de actuación rápida (regular) es eficaz a lo largo de un periodo de varias horas solamente. Además, después de terminación del protocolo de terapia de siete días, vuelve a aparecer la hiperglucemia en 24-30 horas.
Para evaluar si la N-(Fmoc)_{3}-insulina tiene prolongado efecto antidiabético, se administró a las ratas-STZ, dos semanas después de la inducción de diabetes una sola inyección subcutánea de insulina natural (Grupo A, 25 unidades, 1 mg, disuelto en 1,0 ml de H_{2}O-10% DMSO, n=4), o de N-(Fmoc)_{3}-insulina (Grupo B, 1 mg, disuelto en 1,0 ml de H_{2}O-10% DMSO, n=4). Se hizo un seguimiento de los niveles de glucosa en sangre y de las ganancias diarias de peso a lo largo de un período de siete días.
Los resultados se muestran en la Figura 5. Cada punto representa la media aritmética \pm SEM (error típico) de glucosa en plasma para 4 ratas. Los niveles de glucosa circulantes del Grupo B son significativamente más bajos. Según esto, los niveles de glucosa eran 90-110 mg/dl más bajos en el Grupo B, comenzando dos días después de la administración, y estos niveles de glucosa más bajos se mantenían hasta el día seis. El día siete, no había diferencia significativa entre los dos grupos de ratas en los niveles de glucosa en la circulación. Las ratas que recibieron N-(Fmoc)3insulina tenían un aspecto "más sano". La ganancia diaria de peso era casi tres veces más alta en el Grupo B y ascendía a 0,57\pm0,08 y 1,43\pm0,14 g/rata/día, en los Grupo A y B, respectivamente (no mostrado). Según esto, una sola administración de N-(Fmoc)_{3}-insulina proporcionaba una actividad antidiabética prolongada y satisfactoria que duraba un período de cuatro días (a continuación de un comienzo retrasado de aproximadamente dos días). Este efecto de larga duración in vivo puede explicarse por la capacidad del derivado de escapar de endocitosis mediada por receptor, y también por su resistencia a proteolisis. Además, la N-(Fmoc)_{3} insulina es muy insoluble en soluciones acuosas. Según esto, en humanos, el efecto de duración global puede tener lugar por sustitución del viejo principio terapéutico, esto es, disolución gradual de insulina insoluble "incorporada", después de administración subcutánea junto con el nuevo principio, es decir, derivado de insulina inactivo modificado covalentemente de vida larga en circulación que se convierte lentamente en la hormona natural. Como este derivado de insulina es inactivo, se pueden administrar grandes dosis sin temor a episodios hipoglucémicos.
Para ensayar el efecto de Phe^{B1}, Lys B^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina para rebajar niveles de glucosa en sangre en ratas diabéticas experimentales, se trataron ratas-STZ, 9 días después de la inducción de diabetes, con una única inyección s.c. de N-Fmoc_{2}-insulina (Grupo A, 3 mg/rata, en 2,0 ml de DMSO al 20%, n=5), o una sola inyección s.c. de insulina de actuación larga (NPH-insulina humana, Humulina N, HI-310) (Grupo B, 0,75 ml (3 mg) por rata, n=5). El Grupo C (n=5) recibió solo vehículo (2,0 ml de DMSO al 20%). Los niveles de glucosa en sangre se determinaron diariamente.
Los resultados se muestran en la Figura 6 en que la línea de puntos horizontal indica la media aritmética de glucosa en plasma para ratas de control. Como se muestra en la Figura 6, una sola administración subcutánea de Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina purificada por HPLC inducía normoglucemia en un período de 4 días e incrementaba la ganancia de peso diaria de estos modelos de ratas STZ catabólicas (Tabla III). La N-(Fmoc)_{2}-insulina era tan eficaz como la preparación comercial de actuación larga (insoluble). La insulina de actuación rápida (soluble) es eficaz para rebajar los niveles de glucosa en sangre en este sistema experimental a lo largo de un período de varias horas solamente (no mostrado). Esta preparación es bastante soluble en solución acuosa (a pH 7,4), un hecho que puede ser ventajoso sobre la N-(Fmoc)_{3}-insulina insoluble, porque las suspensiones no pueden administrarse con precisión por inyección s.c.
Ejemplo 4 Preparación y actividad biológica de (2-sulfo)Fmoc-insulina (a) Síntesis de (2-sulfo)Fmoc-insulina (Sulfomoc-insulina)
El propio grupo Fmoc se modificó con el fin de reducir la hidrofobicidad de Fmoc-insulina y aumentar consiguientemente su solubilidad en agentes tampón acuosos, así como para modificar la velocidad de reconversión a insulina. Esto puede hacerse por introducción de grupos polares o, preferiblemente, grupos cargados en el anillo de fluoreno, tales como grupo halógeno, nitro, carboxilo, amino, amonio y sulfo. En reacciones de sustitución electrófilas, el fluoreno es sustituido primero en la posición 2 y, generalmente, la naturaleza del sustituyente en posición 9 (por ejemplo CH_{2}OCO-OSu) no tiene efecto alguno sobre la orientación de la sustitución: Según esto, el tratamiento de Fmoc-OSu con 0,9 equivalentes de ácido clorosulfónico en diclorometano (DCM) a 0ºC, dio (2-sulfo)Fmoc-OSu con alto rendimiento (fórmula (i), R_{1}=SO_{3}H en la posición 2, R_{2}=R_{3}=R_{4}=H, A=OCO-OSu). El tratamiento con más de un equivalente dará por resultado una sustitución también en la posición 7 del anillo de fluoreno.
Los grupos (2-sulfo)Fmoc se introdujeron en insulina por copulación de éster (2-sulfo)Fmoc-OSu activo para los grupos amino de insulina. La reacción se llevó a cabo en agentes tampón acuosos (pH 7,4) y exceso de reactivo (\sim20 equivalentes). Después de la diálisis y liofilización, el producto volvió a ser soluble en agua. El análisis de HPLC mostró predominio de un producto principal, aparentemente (Sulfomoc)_{2}-insulina, determinado por espectros de masas (m/z 6411). Cuando la reacción se llevaba a cabo en acetonitrilo/agua, 1:1, el producto principal era (Sulfmoc)_{3}-insulina, como se determina por espectro de masas (m/z 6713).
(b) Curso del tiempo de activación de (2-sulfo)Fmoc-insulina
La (Sulfmoc)2-insulina revertió por completo a la hormona natural al incubarse a 37ºC durante 36 horas a pH 8,5 (NaHCO_{3} 0,1 M), o durante 10 días a pH 7,4 (tampón Hepes 50 mM) con valores de t1/2 de 12-15 horas y 6 días, respectivamente. Esto quedaba probado por la desaparición del pico del derivado de insulina, junto con la aparición del pico de la hormona natural utilizando el procedimiento cromatográfico HPLC analítica. Hay que señalar que la hidrólisis de (Sulfmoc)_{2}-insulina a la hormona natural es más rápida comparada con la hidrólisis de (Fmoc)_{2}-insulina (21 días a pH 7,4, 37ºC).
(Sulfmoc)2-insulina es 0,5% biológicamente activa y presenta una buena solubilidad en agua. En la incubación a pH 8,5, 37ºC, (Sulfmoc)_{2}-insulina vuelve a insulina natural enteramente activa con valor del t1/2 de 4-6 horas a juzgar por el incremento dependiente del tiempo en potencia biológica (ensayo de lipogénesis en adipocitos de ratas).
(c) Efecto de una administración intraperitoneal única de (2-sulfo)Fmoc-insulina a ratas normales
Para evaluar la capacidad de actuación larga de (Sulfmoc)2-insulina, descendente en cuanto absorción subcutánea, se administró a ratas normales una inyección intraperitoneal única de insulina natural, NPH-insulina, o (Sulfmoc)_{2}-insulina. Los niveles de glucosa en sangre se siguieron durante dos días. La Figura 3 muestra que (Sulfmoc)_{2}-insulina inducía hipoglucemia a lo largo de un período de 24 horas. La recuperación desde hipoglucemia tenía lugar con un valor de t1/2 = 14 horas. En el caso de insulina rápida y NHP-insulina, estos valores de t1/2 ascendían a 8 (Figura 3) y 10 horas (Figura 2), respectivamente. Según esto, una administración única de (Sulfmoc)_{2}-insulina daba una actuación antidiabética intermedia, que es 1,5-2 veces más larga que la de NPH-insulina rápida. Estos resultados están de acuerdo con la velocidad acelerada de hidrólisis de la Sulfmoc-insulina encontrada previamente in vitro. Según esto, el grupo ácido sulfónico en posición 2 del anillo de fluoreno aumentaba la velocidad de abstracción de protones en posición 9 y por lo tanto la hidrólisis de la fracción de Sulfmoc, en 2-3 veces. Estudios previos realizados sobre la labilidad del grupo sulfmoc ante varias bases, mostraba una mayor sensibilidad a base que el sistema progenitor. Además, la constante de velocidad para la liberación del grupo Sulfmoc desde glicina, por ejemplo, era mucho más alta que la del grupo Fmoc (factor de aproximadamente 30). Por lo tanto, el aumento de solubilidad por introducción del grupo Sulfmoc en insulina, reduce recíprocamente el efecto a largo plazo de este derivado. Según esto, el principio antidiabético de larga duración, por escape a la endocitosis mediada por receptor y degradación, se mantiene también para los derivados de sulfmoc-insulina.
La velocidad potenciada de separación del grupo Sulfmoc desde insulina puede ser ventajosa en ciertas aplicaciones de administración de insulina tal como preparaciones intermedias. Estas preparaciones tendrán obviamente el beneficio de ser completamente solubles en tampón acuoso, en contraste con las preparaciones comerciales disponibles. Además, se pueden introducir otros grupos, con diversa acidez o polaridad en el anillo de fluoreno. Por lo tanto, el control del tipo y número de grupos introducidos en el grupo Fmoc puede determinar el grado de solubilidad y la velocidad de reactivación de la insulina modificada.
Ejemplo 5 Preparación de insulina modificada en terminal amino y carboxilo (Derivados N-Fmoc- y C-Fmoc-insulina)
Se disolvió N-(Fmoc)_{3}-insulina (64,5 mg; 10 \mumoles; 60 \mumoles de fracciones carboxílicas, es decir, pertenecientes a 4 Glu intracadena y 2 radicales de terminal C) en 8 ml de dimetilformamida (DMF) (Lab. Scan., Dublin, Irlanda) junto con o-nitrofenol (250 \mumol; 35 mg) ó N-hidroxisuccinimida (250 \mumoles; 28 mg) y la solución se enfrió a 4ºC. Se añadió una solución de N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC; 250 mmoles; 53 mg) en 0,5 ml de DMF y la mezcla de reacción se mantuvo 1 hora a 4ºC y después 6 horas a temperatura ambiente. La N,N-diciclohexil urea precipitada se separó por centrifugación y los ésteres con o-nitrofenilo o N-hidroxisuccinamida, respectivamente, de N-(Fmoc)_{3}-insulina se hicieron precipitar con éter seco enfriado con hielo. Se lavó dos veces el sólido con éter seco, se secó y se disolvió en 8 ml de DMF. Se añadió una solución de 9-fluorenilmetanol (250 \mumol; 50 mg) e imidazol (250 \mumoles; 17 mg) en DMF. Se dejó reposar la mezcla de reacción durante toda la noche a temperatura ambiente. La precipitación con éter seco condujo a 62 mg de N-(Fmoc)_{3},C-(Fm)_{n}-insulina. El productoprincipal de reacción fue éster hexa-9-fluorenilmetílico de C-(Fm)_{6} o N-(Fmoc)_{3}-insulina (n=6).
Ejemplo 6 Preparación de Fm-insulinas de terminal carboxilo (C-Fm-insulinas)
Para la preparación de t-butiloxicarbonil (t-Boc)_{3}-insulina, se añadió dicarbonato de di-terc-butilo (56 mg, 258 \mumoles) a una suspensión enfriada con hielo, agitada, de insulina (100 mg, 17,2 \mumoles) y trietilamina (174 mg, 172 \mumoles) en DMF (4 ml). Se dejó templar la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se agitó durante 5 horas (gradualmente se hizo transparente). Se añadió entonces acetato de etilo hasta que la solución se volvió turbia, se añadió a continuación éter, y el precipitado se centrifugó y se lavó dos veces con éter. El sólido bruto resultante (95 mg) se utilizó después sin purificación. La HPLC analítica mostró un producto principal que eluía a los 27,5
minutos.
\newpage
El producto se disolvió en 10 ml de DMF y se trató con o-nitrofenol o N-hidroxisuccinamida, como antes, para dar los correspondientes ésteres activos. Estos se hicieron reaccionar con 9-fluorenilmetanol, en presencia de imidazol, como antes, y se obtuvo N-(t-Boc)3, C(Fm)_{n}-insulina como un polvo (87 mg) después de precipitación con éter seco. El polvo se secó al vacío sobre P_{2}O_{5} y después se trató durante 1 hora a temperatura ambiente con 5 ml de ácido trifluoroacético para separar los grupos protectores t-Boc de terminal N. Durante este proceso, se disolvió la mayor parte de la insulina. La adición de éter seco enfriado con hielo condujo a un polvo que se aisló por centrifugación y se lavó cuidadosamente con éter seco. El rendimiento del producto, principalmente C-(Fm)_{6}-insulina, era 79 mg.
Ejemplo 7 Preparación de (Fmoc)_{1}-Hormona humana del crecimiento (F-moc)_{1}-hGH)
En condiciones fisiológicas normales, los niveles de hGH en sujetos sanos se incrementan diariamente de una manera pulsátil varias veces (de día y de noche). La hGH (hormona humana del crecimiento) es una especie de vida corta. El protocolo terapéutico actual incluye una inyección única diaria de hGH y es probablemente eficaz durante varias horas solamente. Es muy deseable una preparación de hGH (de liberación lenta) de actuación larga que suministre un nivel basado en un umbral de hGH durante 24 horas del día y de la noche.
Se disolvió hGH natural (Biotecnology General, Rehovot, Israel; 9,2 mg) en NaHCO_{3} 0,1 M (2,0 ml; pH 8,5), se añadió DMSO (0,1 ml) (concentración de DMSO final, \sim5%) y la solución se enfrió a 0ºC. Se añadió entonces un equivalente de Fmoc-OSu en 10 \mul (tomados de una solución de reserva de 18,5 mg/ml en DMSO) y la reacción tuvo lugar durante 30 minutos a 0ºC, bajo agitación moderada. Se añadieron entonces otros 10 \mul (que contenían 1 equivalente de Fmoc-OSu) y al cabo de 30 minutos se dializó la mezcla durante toda la noche a 7ºC frente a H_{2}O. La HPLC semipreparativa condujo a dos picos de proteína principales que correspondían a hGH natural (\sim20% del total; tiempo de retención 30 minutos; columna RP-8; 250 x 10 mm; Merck) y Fmoc-hGH modificada (\sim80% del total; tiempo de retención 32 minutos).
La Tabla V muestra la conversión de Fmoc-hGH (1 mg/ml) a hGH natural al incubar a 37ºC en NaHCO_{3} 0,1 M (pH 8,5). A los puntos de tiempo indicados, se tomaron partes alícuotas y se sometieron al procedimiento de HPLC analítica (columna RP-8). La conversión de Fmoc-hGH a hGH natural se evaluó por el incremento del área del pico correspondiente a hGH natural.
Como se muestra en la Tabla V, Fmoc-hGH tiene un 15% de la potencia de unión a receptor de la hormona natural. La incubación de Fmoc-hGH a pH 8,5 (37ºC) durante aproximadamente 6 días o a pH 10,5 (37ºC) durante cuatro días condujo a hGH natural completamente activa, como se ve en el análisis HPLC y por ensayos de unión a receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA V Generación de hGH natural a partir de Fmoc-hGH por incubación a 37ºC
Compuesto Tratamiento Capacidad de desplazar Conversión a hGH^{2}
hormona yodada^{(1)} (%) (%)
hGH 100
Fmoc-hGH 15
Fmoc-hGH 1 día, pH 10,5 25
Fmoc-hGH 4 días, pH 10,5 100
Fmoc-hGH 1 día, pH 8,5 23
Fmoc-hGH 2 días, pH 8,5 62
Fmoc-hGH 6 días, pH 8,5 100
(1) \begin{minipage}[t]{145mm} Desplazamiento de hGH yodada llevado a cabo según Gertler y col., 1984. La hGH natural era completamente estable bajo las condiciones aplicadas a Fmoc-hGH (pH 10,5, 37^{o}C, 4 días).\end{minipage}
(2) \begin{minipage}[t]{145mm} Se incubó Fmoc-hGH (1 mg/ml) a 37^{o}C en NaHCO_{3} 0,1 M (pH 8,5). En los puntos de tiempo indicados, se sacaron partes alícuotas y se sometieron a HPLC analítica. La conversión de Fmoc-hGH a hGH natural se evaluó por incremento del área del pico correspondiente a hGH natural \end{minipage}
Ejemplo 8 Preparación de N-Fmoc-cefalexina y éster Cefalexin-O-Fm
La cefalexina [ácido 7-(D-\alpha-aminofenilacetamido)desacetoxi-efalosporánico] es un antibiótico \beta-lactámico con un amplio espectro de actividad frente a bacterias Gram-negativas y Gram-ositivas. Se prepararon dos cefalexinas monosustituidas por unión covalente de una fracción de fluorenilmetilo (Fm) al grupo amino (N-Fmoc-cefalexina) o al grupo carboxílico via esterificación (cefalexina-O-Fm).
(i) (a) Preparación de N-Fmoc-cefalexina
A una suspensión agitada de hidrato de cefalexima (Sigma, EEUU; 50 mg, 0,144 mmoles) y trietilamina (29 mg, 0,288 mmoles) en diclorometano (DCM; 2,5 ml), se añadió, gota a gota, una solución de Fmoc-OSu (145 mg, 0,432 mmoles) en DCM (2,5 ml) a lo largo de 5 minutos. La mezcla de reacción, que se hizo transparente al cabo de 1 hora, se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente, tiempo durante el cual se volvió turbia. Después de concentrar al vacío, se añadió éter a la mezcla, y el precipitado resultante se filtró y se lavó dos veces con éter. Se disolvió el filtrado en DCM y se extrajo con agua acidulada (pH \sim2), agua y salmuera, y se secó sobre MgSO_{4}. anhidro Después de filtración y concentración de la solución, se añadió éter. El producto precipitado se filtró y lavó con éter para dar Fmoc-cefalexina como producto puro tal como se determina por TLC (cromatografía en capa fina) (1-butanol:ácido acético:agua, 8:1:1) y por el procedimiento de HPLC analítica (elía a los 33 minutos, mientras que, en condiciones similares, la cefalexina natural eluye a los 6,5 minutos). El análisis por espectro de masas (Fast Atom Bombardement, FAB - Bombardeo de átomos rápidos, BAR) dio el peso molecular esperado para N-Fmoc-cafalexina (m/z 570,1 [M+H]^{+}).
(i) (b) Potencial antibacteriano de Fmoc.cefalexina
Para la determinación de las potencias antibacterianas de cefalexina natural y Fmoc-cefalexina, se incubaron tubos que contenían una suspensión diluida de Staphylococcus aureus (0,5 ml/tubo de vidrio) durante 6 horas a 37ºC en la ausencia y presencia de concentraciones incrementadas de cefalexina natural o Fmoc-cefalexina, antes y a continuación del tratamiento especificado en la Tabla VI. En los puntos de tiempo indicados, se tomaron partes alícuotas y se analizaron en cuanto a su potencia para detener el crecimiento de Staphylococcus aureus. El crecimiento bacteriano se evaluó entonces por el incremento de la turbidez medida espectroscópicamente a
700 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA VI Potencias antibacterianas de cefalexina natural y NFmoc-cefalexina
Compuesto Incubación a pH Concentración que inhibe el 50% Potencia antimicrobiana^{(1)}
7,4, 37ºC del crecimiento bacteriano (%)
(\muM) (IC_{50})
cefalexina natural \hskip0,5cm - - - - - - - - 0,9 100
cefalexina natural 1 día 1,5 100
cefalexina natural 3 días 5,3 100
cefalexina natural 6 días 18 100
Fmoc-cefalexina \hskip0,5cm - - - - - - - - 23 6
Fmoc-cefalexina 1 día 15 10
Fmoc-cefañexina 3 días 9 59
Fmoc-cefalexina 6 días 4,5 100
(1) Los números se refieren a la potencia de la cefalexina empleada como control en todos los ensayos. 
\newpage
Se llevaron a cabo incubaciones a pH 7,4 con cefalexina natural o con N-Fmoc-cefalexina (100 \mug/ml) en agente tampon Hepes 50 mM, DMSO al 20%.
Como se muestra en la Tabla VI, la N-Fmoc-cefalexina es inactiva (\sim6%). La preincubación a lo largo de un período de 6 días (pH 7,4, 37ºC) genera cefalexina natural como queda comprobado por seguimiento con HPLC, y por recuperación de aproximadamente el 50% de la potencia antibacteriana del compuesto progenitor. La cefalexina natural sufre una inactivación espontánea substancial dependiente del tiempo en la incubación, mientras que la N-Fmoc-cefalexina es significativamente más estable en las mismas condiciones. Según esto, la acción prolongada esperada de N-Fmoc-cefalexina in vivo es probable que se origine tanto por una mayor estabilidad química a pH y temperatura fisiológicos como también por escapar a la degradación La N-Fmoc-cefalexina es más estable a hidrólisis por penicilinasa que el compuesto progenitor (no mostrado).
\vskip1.000000\baselineskip
(ii) Preparación de éster cefalexina-O-Fm (éster fluorenilmetílico de cefalexina) (a) N-Boc-cefalexina
A una suspensión enfriada con hielo y agitada de hidrato de cefalexina (50 mg, 0,144 mmoles) y trietilamina (29 mg, 0288 mmoles) en DCM (3 ml), se añadió una solución de dicarbonato de di-terc-butilo (94,2 mg, 0,432 mmoles) en DCM (2 ml). La mezcla de reacción se dejó templar a temperatura ambiente y se dejó agitando durante toda la noche hasta que no se observaba material de partida positivo a ninhidrina por cromatografía TLC (1-butanol; ácido acético; H_{2}O, 8:1:1). La mezcla de reacción se diluyó entonces con DMC (2,5 ml), se extrajo con agua acidulada (pH-2), agua y salmuera, y se secó sobre MgSO_{4}. Después de concentrar, se hizo precipitar el producto con éter de petróleo (punto de ebullición 40-60ºC), se filtró y se lavó de nuevo con éter de petróleo. El producto era homogéneo como se confirmó por procedimientos cromatográficos de TLC y HPLC.
(b) Ester de cefalexina-OFmoc
A una solución agitada enfriada con hielo de N-Boc-cefalexina (25 mg, 0,056 mmoles), 9-fluorenilmetanol (22 mg, 0112 mmoles) y 4-dimetilaminopiridina (13,7 mg, 0,112 mmoles) en DCM (2 ml), se añadió una solución de DCC (23,1 mg, 0,112 mmoles) en DCM (1 ml), gota a gota, a lo largo de 20 minutos. La mezcla resultante se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente y la solución se filtró para separar diciclohexilurea. El filtrado se diluyó con DCM (2,5 ml) y después se extrajo dos veces con solución de NaHCO_{3} 1 M, ácido cítrico al 10%, agua y salmuera, y se secó sobre MgSO_{4} anhidro. Se evaporó la solución para dar un sólido oleoso, que se trituró con éter de petróleo para obtener el producto Boc-cefalexina-OFm (como se confirmó por TLC y HPLC). La fracción Boc se separó por disolución del sólido bruto (25 mg) en 1 ml de solución de TFA:DCM (1:1 v/v). Después de reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente, se separó el TFA por evaporación y se disolvió el residuo sólido en isopropanol que se evaporó entonces. Este procedimiento se repitió dos veces. El sólido bruto fue triturado con éter de petróleo para formar el éster puro final, como se comprueba con los procedimientos cromatográficos TLC y
HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9 Preparación de di-9-(fluorenilmetoxicarbonil)polimixina B [Fmoc)_{2}-PMXB]
La polimixina B (PMXB), un miembro representativo de la familia de antibióticos ciclo-peptídicos, es eficaz contra bacterias gram-negativas. La PMXB contiene 5 radicales de ácido diaminobutírico que pueden modificarse por inserción de grupos Fmoc utilizando el reactivo metilsulfato de 4-(9-fluorenilmetoxicarboniloxi)fenil-dimetilsulfonio (Fmoc-DSP). La relación molar de reactivo Fmoc-DSP y péptido determinará la extensión de la modificación de la molécula de PMXB.
Para la preparación de (Fmoc)_{2}-PMXB, se añadió, gota a gota, a una solución agitada de PMXB (Sigma, EEUU; 10 mg, 7,2 \mumoles) y (Fmoc)-DSP; (7,1 mg, 14,4 \mumoles) en H_{2}O (1 ml), una solución de NaHCO_{3} (0,1 M, 0,15 ml). La mezcla de reacción que se enturbió gradualmente se mantuvo agitada toda la noche a temperatura ambiente. Se centrifugó el precipitado resultante, se lavó dos veces con agua, se disolvió en un pequeño volumen de DMF y se hizo precipitar con éter para dar un sólido bruto blanco.
TABLA VII Potencias antibacterianas de (Fmoc)_{2}-PMXB y PMXB natural
Compuesto Tratamiento Concentración que inhibe Potencial anti-microbiano^{(1)}
el 50% del crecimiento (%)
bacteriano (\muM)
PMXB natural - - - - - - 0,05 100
PMXB natural 3 d, 37ºC, pH 8,5^{(2)} 0,1 100
PMXB natural 3 d, 37ºC, pH 8,5^{(2)} 02 100
PMXB natural 3 d, 37ºC, pH 7,4^{(3)} 0,055 100
PMXB natural 3 d, 37ºC, pH 7,4^{(3)} 0,228 100
(Fmoc)_{2}-PMBX \hskip0,5cm - - - - - - - - - 5 1
(Fmoc)_{2}-PMBX 3 d, 37ºC, pH 8,5^{(2)} 0,125 80
(Fmoc)_{2}-PMBX 6 d, 37ºC, pH 8,5^{(2)} 0,2 100
(Fmoc)_{2}-PMBX 3 d, 37ºC, pH 7,4^{(3)} 0,227 25
(Fmoc)_{3}-PMBX 3 d, 37ºC, pH 7,4^{(3)} 0,35 64
(1) \begin{minipage}[t]{145mm} Los números se refieren a la potencia de la PMXB empleada como control a través de todos los ensayos \end{minipage}
(2) \begin{minipage}[t]{145mm} La incubación se llevó a cabo a pH 8,5 con PMXB, ó (Fmoc)_{2}-PMXB (100 \mu g/ml) en NaHCO_{3} 0,1 M que contenía DMSO al 1%. \end{minipage}
(3) \begin{minipage}[t]{145mm} La incubación se llevó a cabo a un pH 7,4 con PMXB, ó (Fmoc)_{2}PMXB (100 \mu g/ml) en agente tampón Hepes 50 mM (pH 7,4) que contenía DMSO al 1%. \end{minipage}
La HPLC analítica (RP-18; 250 x 4 mm; Merck) empleando un gradiente lineal formado de 70% solución A (0,1% de TFA en agua) y 30%. de solución B (0,1% de TFA en acetonitrilo:agua, 75:25) hasta 100% de solución B en 40 minutos (velocidad de flujo de 0,8 ml/minuto), mostraba un producto principal eluido a los 39 minutos (tiempo de retención de PMXB bajo estas condiciones es 13,5 minutos). El sólido bruto se aplicó a HPLC preparativa para proporcionar un producto puro. El análisis de (Fmoc)_{2}. PMXB por espectro de masas (Bombardeo atómico rápido BAR), dio el peso molecular esperado para este compuesto (m/z 1647 [M-H]^{+})
Las potencias antibacterianas de (Fmoc)_{2}-PMXB y de PMXB natural se ensayaron bajo varias condiciones experimentales como sigue:
Se incubó una suspensión diluida de E. coli (0,5 ml por tubo de ensayo de vidrio) durante 6 horas a 37ºC sin o con concentraciones incrementadas de (Fmoc)_{2}-PMXB y PMXB natural. En los puntos de tiempo indicados se sacaron partes alícuotas y se analizaron en cuanto a su potencia para detener el crecimiento de E. coli, y se evaluó entonces el crecimiento bacteriano por medida de la turbidez a 700 nm.
Como se muestra en la Tabla VII, (Fmoc)_{2}-PMXB es inactivo (\sim1%) y se hidroliza ampliamente a PMXB activa con valores de t1/2 de \sim3 y \sim1 día a pH 8,5 y 7,4 respectivamente.
Ejemplo 10 Preparación de éster de piperacilina-fluorenilmetilo (Piperacilin.O-Fm)
La piperacilina (4-etil-2,3-dioxopiperazincarbonil ampicilina) es un antibiótico semi-sintético de amplio espectro relacionado con la penicilina, que no es eficaz cuando se administra por vía oral.
La piperacilina (carboxilo libre) se preparó a partir de sal sódica de piperacilina (Sigma, EEUU) por extracción ácida con acetato de etilo. La piperacilina-OFm se sintetizó como se ha descrito para el éster de cefalexina en el Ejemplo 8 anterior, por reacción de 1 equivalente de carboxilo con 2 equivalentes, de cada uno de 9-fluorenilmetanol, 4-dimetilaminopiridina y DCC. El sólido bruto se recristalizó en DCM-éter, dando un producto puro como se confirma por los procedimientos cromatográficos TLC y HPLC.
Ejemplo 11 Preparación de Fmoc-propanolol
El propanolol [(1-(isopropilamino)-3-(1-naftiloxi)-2-propanol], un miembro representativo de la familia de beta bloqueantes, es un antagonista \beta-adrenérgico utilizado como antihipertensor, antianginal y anti-arrítmico. El propanolol se une, pero no activa, al recptor \beta-adrenérgico. La competición por estos lugares con antagonistas \beta-adrenérgicos reduce los estados de hipertensión patológicos. Los pacientes reciben propanolol por vía oral sobre base diaria. Sin embargo, existe una amplia mayoría de antagonistas \beta-adrenérgicos que son de naturaleza hidrófila y no son adsorbidos eficazmente cuando se administran por vía oral, por ejemplo acetilbutolol, atenolol, betaxolol, carteolol, nadolol y sotalol.
Para la preparación de F-moc-propanolol, se añadió, gota a gota a lo largo de 5 minutos, una solución de Fmoc-OSu (170 mg, 0,50 mmoles) en DCM (2,5 ml) a una solución agitada de hidrocloruro de (\pm)-propanolol (50 mg, 0,17 mmoles) y trietilamina (34 mg, 0,34 mmoles) en diclorometano (DCM, 2,5 ml).
Después de agitar durante toda la noche a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se extrajo con agua acidulada (pH \sim2), agua y salmuera, y se secó sobre MgSO_{4} anhidro. La solución se evaporó para obtener un sólido bruto que se trituró entonces con hexano para dar Fmoc-propanolol. El producto se examinó por TLC (1 butanol: ácido acético: agua, 8:1:1) y HPLC, y demostró ser puro (los tiempos de retención de propanolol y Fmoc-propanolol, bajo las mismas condiciones, son 16 y 51 minutos, respectivamente). El espectro de masas (BAR) dio la M/Z: 482,2[M+H]^{+}
correcta.
Se analizó la potencia \beta-adrenérgica de Fmoc-propanolol. Los resultados se muestran en la Figura 7. Se incubaron adipocitos de rata recién preparados durante 2 horas a 37ºC, con isoprotenerol (concentración final 1 \mug/ml, 4 \muM) y las concentraciones indicadas de propanolol (círculos), Fmoc-propanolol (círculos llenos) o Fmoc-propanolol que se incubó durante 7 días a 37ºC, pH 8,5 (cuadrados). La cantidad de glicerina liberada al medio se determinó entonces según Sechter, 1982. La IC_{50} es la cantidad de propanolol o derivado N-Fmoc-propanolol (en \muM) que inhibe la mitad del máximo de liberación de glicerina mediada por isoproterenol.
Como se muestra en la Figura 7, el Fmoc-propanolol tiene \sim7% de la potencia de propanolol natural. La incubación de Fmoc-propanolol durante 7 días a pH 8,5 (37ºC) generaba 50-70% de la potencia \beta-adrenérgica del fármaco natural. El derivado es substancialmente hidrófobo, una característica que puede ayudar en la absorción gastro-intestinal.
Referencias
1. Bodanszky, M. y Bednarek, M (1982) Int. L. Peptido Protein Res, 20434-37)
2. Burch, R.M.., Weitzberg, M. Blok, N., Muhlhauser, R., Martin, D., Farmer, S. G., Bator, J.M., Connor, J.R., Ko, C., Kuhn, W. McMillan, B.A., Maureen, R., Shearer, B.G., Tiffany, C. y Wilkins, D.E. (1991) Proc. Nat. Acad. Sci EE.UU 88, 355-359.
3. Campbell, R.K., Campbell L.K., White, J.R. (1996) Ann. Pharmacother 30,1263-71.
4. Gertler, A. Ashkenazi, A. y Madar, Z. (1984) Mol. Cell Endocrinol 34, 51-57
5. Kaarsholm, N.C. y Ludvigens, S. (1995) Receptor 5, 1-8.
6. Meyerovitch, J. Farfel, Z., Sack, J. y Shechter, Y. (1987) J. Biol. Chem. 262, 6658-6662.
7. Meyerovitch, J., Kahn, C.R. y Shechter, Y. (1990) Biochemistry 29, 3654-3660.
8. Moody, A.J., Stan, M.A. Stan, M. y Gliemann, J. (1974) Horm. Metab. Res., 12-16.
9. Pederson, R., A.Ramanadham, S. Buchan, A.M.J. y McNeill, J.H. (1989) Diabetes 38, 1390-1395.
10. Rodbell, M. (1964). J. Biol. Chem., 239, 375-380.
11. Schechter, Y. (1982) Endocrinology 110, 1579-1583.
12. Shechter, Y. y Ron, A. (1986) J. Biol. Chem. 261, 14945-14950.

Claims (22)

1. Un compuesto de la fórmula:
X - Y
donde
Y es una fracción de un fármaco que lleva al menos un grupo funcional seleccionado entre amino, carboxilo, hidroxilo y/o mercapto, libres,y
X es un radical seleccionado de los radicales de las fórmulas (i) a (iv):
2
donde R_{1} y R_{2}, iguales o diferentes, son, cada uno, hidrógeno, alquilo, alcoxi, alcoxialquilo, arilo, alquilarilo, aralquilo, halógeno, nitro, sulfo, amino, amonio, carboxilo, PO_{3}H_{2}, o OPO_{3}H_{2}; R_{3} y R_{4}, iguales o diferentes, son, cada uno, hidrógeno, alquilo o arilo; y A es un enlace covalente cuando el radical se une a grupo carboxilo o mercapto del fármaco Y, o A es OCO- cuando el radical se une a un grupo amino o hidroxilo de Y, y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, siempre que cuando R_{1} a R_{4} son hidrógeno y A es OCO-, Y no es una fracción de un fármaco que contiene un grupo O-maloniltirosilo
2. Un compuesto según la reivindicación 1, donde Y es una fracción de un fármaco para utilización en medicina o veterinaria seleccionado del grupo que comprende fármacos antidiabéticos, antibióticos, antibacterianos sintéticos, fármacos analgésicos y anti-inflamatorios, fármacos antialérgicos y antiasmáticos, fármacos antihipercolesterolémicos, bloqueantes \beta-adrenérgicos y fármacos antihipertensores, fármacos antineoplásicos y fármacos antivirales.
3. El compuesto según la reivindicación 1 donde la fracción Y está sustituida con al menos un radical X que consiste en un radical (i) donde R_{1} es hidrógeno o sulfo y R_{2}, R_{3} y R_{4} son hidrógeno.
4. El compuesto según la reivindicación 3 en que Y es una fracción de insulina en que los grupos amino y/o carboxilo libres, y opcionalmente los grupos hidroxilo libres, de la molécula de insulina, están sustituidos con al menos uno de dichos radicales (i).
5. Un derivado de insulina según la reivindicación 4, donde uno o más grupos amino están sustituidos con el radical 9-fluorenilmetoxicarbonilo (i) donde R_{1} a R_{4} son hidrógeno y A es OCO- (aquí N-Fmoc-insulina).
6. Un derivado de insulina según la reivindicación 4, donde uno o más grupos carboxilo están sustituidos con el radical 9-fluorenilmetilo (i) donde R_{1} a R_{4} son hidrógeno y A es un enlace covalente (de aquí en adelante C-Fm-insulina).
7. Un derivado de insulina según la reivindicación 4, donde uno o más grupos amino están sustituidos con el radical Fmoc y uno o más grupos carboxilo están sustituidos por el radical Fm (aquí N-Fmoc, C-(Fm)-insulina).
8. Un derivado de insulina según la reivindicación 4, donde uno o más grupos carboxilo están sustituidos con el radical Fm y uno o más grupos hidroxilo están sustituidos con el radical Fmoc (aquí C-(Fm), O-(Fmoc)-insulina).
\newpage
9. Un derivado de insulina según la reivindicación 4, donde uno o más grupos amino e hidroxilo están sustituidos por el radical Fmoc y uno o más grupos carboxilo están sustituidos por el radical Fm (aquí N, O-(Fmoc), C-(Fm)-insulina).
10. Un derivado de insulina según la reivindicación 4 que tiene 1 a 3 sustituyentes Fmoc en los grupos amino libres en las posiciones Gly^{A1}, Phe^{B1} o Lys^{B29} donde A y B son las cadenas de la molécula de insulina, seleccionado del grupo de derivados de insulina que consisten en Gly ^{A1}-N-(Fmoc)-insulina, Phe^{B1}-N-(Fmoc)-insulina, Lys^{B29}-N-(Fmoc)-insulina, Gly^{A1},Phe^{B1}-N-(Fmoc)-insulina, Gly^{A1},Lys ^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina, Phe^{B1},Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina, y Gly^{B1}, Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{3}-insulina.
11. Un derivado de insulina según la reivindicación 4 que tiene 1 a 3 sustituyentes 2-sulfo-Fmoc (aquí Sulfmoc) en los grupos amino libres en las posiciones Gly^{A1}, Phe^{B1}o Lys ^{B29} donde A y B son las cadenas de la molécula de insulina, seleccionado del grupo de derivados de insulina que consisten en Gly^{A1}-N(Sulfmoc)insulina, Phe^{B1}-N-(Sulfmoc)-insulina, Lys^{B29}-N-(Sulfmoc)-insulina, Gly^{A1}, Phe^{B1} N-(Sulfmoc)_{2}-insulina, Gly^{A1}, Lys^{B29}-N-(Sulfmoc)_{2}-insulina, Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Sulfmoc)_{2}-insulina y Gly^{B1}, Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Sulfmoc)_{3}-insulina.
12. Un derivado (Fmoc, Sulfmoc o Fm)-insulina según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11 donde la insulina es insulina humana, bovina o porcina natural, recombinante o mutada.
13. Una Fmoc-hormona del crecimiento seleccionada de hormona del crecimiento humana y bovina.
14. Una Fmoc cefalexina seleccionada de N-Fmoc-cefalexina y éster fluorenilmetílico de cefalexina.
15. Di-(fluorenilmetoxicarbonil)polimixina B.
16. Ester fluorenilmetílico de piperacilina
17. Fmoc-propanolol.
18. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
19. Una composición farmacéutica según la reivindicación 18 que comprende una N-(Fmoc)-insulina según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12.
20. Una composición farmacéutica según la reivindicación 19 que comprende N-(Fmoc)_{3}-insulina humana natural o recombinante y/o N-(Fmoc)_{2}-insulina humana natural o recombinante.
21. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 para inyección subcutánea, administración transdérmica u oral.
22. Utilización de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para la manufactura de una composición farmacéutica.
ES97933828T 1996-08-07 1997-08-05 Principios activos de efecto prolongado y composciones farmaceuticas que los incluyen. Expired - Lifetime ES2252787T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL11902996A IL119029A0 (en) 1996-08-07 1996-08-07 Long-acting drugs and pharamaceutical compositions comprising them
IL11902996 1996-08-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2252787T3 true ES2252787T3 (es) 2006-05-16

Family

ID=11069166

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES97933828T Expired - Lifetime ES2252787T3 (es) 1996-08-07 1997-08-05 Principios activos de efecto prolongado y composciones farmaceuticas que los incluyen.

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6504005B1 (es)
EP (1) EP1019089B1 (es)
JP (1) JP4416184B2 (es)
KR (1) KR20000029806A (es)
CN (1) CN1227501A (es)
AT (1) ATE308998T1 (es)
AU (1) AU725468B2 (es)
BR (1) BR9711045A (es)
CA (1) CA2261835C (es)
CZ (1) CZ36999A3 (es)
DE (1) DE69734607T2 (es)
DK (1) DK1019089T3 (es)
ES (1) ES2252787T3 (es)
HU (1) HUP0000809A2 (es)
IL (3) IL119029A0 (es)
NO (1) NO990518L (es)
NZ (1) NZ333845A (es)
WO (1) WO1998005361A2 (es)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL139400A0 (en) * 2000-11-01 2001-11-25 Yeda Res & Dev Long-acting cytokine derivatives and pharmaceutical compositions comprising them
WO2002047716A2 (en) * 2000-12-13 2002-06-20 Eli Lilly And Company Chronic treatment regimen using glucagon-like insulinotropic peptides
CN101785861B (zh) 2001-10-19 2014-08-13 爱德士实验室公司 用于药理活性化合物的可控释放的可注射组合物
US6946137B2 (en) * 2001-10-19 2005-09-20 Idexx Laboratories, Inc. Methods for the controlled delivery of pharmacologically active compounds
US20030171285A1 (en) * 2001-11-20 2003-09-11 Finn Rory F. Chemically-modified human growth hormone conjugates
BE1015608A6 (fr) * 2003-07-15 2005-06-07 Messadek Jallal Traitement des arterites.
JP4033382B2 (ja) * 2002-04-08 2008-01-16 久光製薬株式会社 インスリン投与装置
US20060051879A9 (en) * 2003-01-16 2006-03-09 Hubert Koster Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions
CA2521784C (en) * 2003-04-08 2012-03-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Reversible pegylated drugs
ES2278314T3 (es) * 2003-04-17 2007-08-01 Jallal Messadek Formulaciones orales para la liberacion controlada de la betaina.
EP2264065B1 (en) * 2003-08-05 2017-03-08 Novo Nordisk A/S Novel insulin derivatives
BE1016128A6 (fr) * 2004-07-22 2006-03-07 Messadek Jallal Combinaisons therapeutiques
US7282487B2 (en) * 2004-10-28 2007-10-16 Idexx Laboratories Method for treating bacterial infections in horses or pigs with tilmicosin
WO2006050581A2 (en) * 2004-11-10 2006-05-18 Jallal Messadek Betaine as agent against arthropod - or mosquito -borne diseases
BRPI0610249A2 (pt) * 2005-04-27 2010-06-08 Jallal Messadek associação ou combinação farmacêutica, composição farmacêutica, processo de co-cristalização e o uso de insulina ou análogo de insulina
CN101389650B (zh) * 2005-12-28 2012-10-10 诺沃-诺迪斯克有限公司 包含酰化胰岛素和锌的组合物以及制备所述组合物的方法
WO2008152106A1 (en) 2007-06-13 2008-12-18 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical formulation comprising an insulin derivative
WO2009065193A1 (en) * 2007-11-21 2009-05-28 Jallal Messadek Treatment of aspirin resistance with betaine and/or betaine enriched molasses
JP5749155B2 (ja) 2008-03-18 2015-07-15 ノボ・ノルデイスク・エー／エス プロテアーゼ安定化アシル化インスリンアナログ
EP2306986B1 (en) 2008-06-26 2018-03-21 Prolynx Llc Prodrugs and drug-macromolecule conjugates having controlled drug release rates
WO2010033220A2 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Nektar Therapeutics Modified therapeutics peptides, methods of their preparation and use
WO2010033240A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Nektar Therapeutics Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof
CA2740904C (en) 2008-10-21 2019-01-15 Baxter International Inc. Methods for determining active ingredients in pro-drug peg protein conjugates with releasable peg reagents (in vitro de-pegylation)
ES2607003T3 (es) * 2008-10-30 2017-03-28 Novo Nordisk A/S Tratamiento de diabetes mellitus utilizando inyecciones de insulina con una frecuencia de inyección inferior a la diaria
MX2011008963A (es) 2009-03-05 2012-02-01 Ascendis Pharma As Profarmacos portadores de interferon alfa.
WO2011013128A2 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Vectors for delivery of neurotherapeutics to the central nervous system
ES2584381T3 (es) * 2010-05-05 2016-09-27 Prolynx Llc Liberación controlada de compuestos activos desde conjugados macromoleculares
BR112013010345A2 (pt) 2010-10-27 2017-07-25 Novo Nordisk As tratamento de diabetes melitus usando as injeções de insulina administradas com intervalos de variação da injeção
EP2490378B1 (en) 2011-02-18 2014-07-09 NTT DoCoMo, Inc. Apparatus and method for determining a control unit using feasibility requests and feasibility responses
US10166295B2 (en) 2011-06-02 2019-01-01 Opko Biologics Ltd. Pegylated OXM variants
BR112013030933A2 (pt) 2011-06-02 2018-04-24 Prolor Biotech Inc agonistas do receptor de glp-1/glucágon de ação prolongada
MX2014012096A (es) 2012-04-11 2014-11-21 Novo Nordisk As Formulaciones de insulina.
CN109096387B (zh) 2012-06-04 2021-11-30 奥普科生物制品有限公司 聚乙二醇化的oxm变体
US20150111820A1 (en) 2012-07-09 2015-04-23 Novo Nordisk A/S Novel use of insulin derivatives
EP2991672A1 (en) 2013-04-30 2016-03-09 Novo Nordisk A/S Novel administration regime
ES2886837T3 (es) 2016-12-16 2021-12-21 Novo Nordisk As Composiciones farmacéuticas que contienen insulina
US10335464B1 (en) 2018-06-26 2019-07-02 Novo Nordisk A/S Device for titrating basal insulin
EP3924369A1 (en) 2019-02-11 2021-12-22 OPKO Biologics Ltd. Long-acting glp-2 analogs

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU206890B (en) 1986-10-13 1993-01-28 Sandoz Ag Process for producing sugar-modified somatostatin peptide derivatives and pharmaceutical compositions containing them as active components
GB8717446D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Merck Sharp & Dohme Chemical compounds
US6313094B1 (en) * 1990-12-11 2001-11-06 Japan Energy Corporation β-amino-α-hydroxycarboxylic acid derivatives and HIV protease inhibitors
JPH0687887A (ja) * 1992-08-19 1994-03-29 Upjohn Co:The ペプチドのエナミン誘導体およびそれをプロドラッグとして含有するペプチド製剤
WO1995000546A1 (fr) 1993-06-25 1995-01-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Peptide a effet antagoniste de l'endotheline
US5880131A (en) * 1993-10-20 1999-03-09 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
DE4437604A1 (de) * 1994-10-21 1996-04-25 Basf Ag Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung
US5955434A (en) 1995-02-09 1999-09-21 Brigham & Women's Hospital Gel-forming polypeptide derivatives
AU5377296A (en) * 1995-03-30 1996-10-16 Southpac Trust International, Inc. Self-erecting container which is collapsible to be substanti ally flat
US5688992A (en) 1995-03-31 1997-11-18 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services O-malonyltryrosyl compounds, O-malonyltryrosyl compound-containing peptides, and use thereof
US5846934A (en) * 1996-02-20 1998-12-08 American Cyanamid Company Pure somatostatin antagonist and methods of use thereof
US6057297A (en) * 1996-08-06 2000-05-02 Polifarma S.P.A. Inhibitor compounds of zinc-dependent metalloproteinases associated with pathological conditions, and therapeutic use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CA2261835C (en) 2008-07-29
AU3706097A (en) 1998-02-25
BR9711045A (pt) 1999-08-17
DE69734607D1 (de) 2005-12-15
JP2000515542A (ja) 2000-11-21
IL128274A (en) 2006-08-01
NZ333845A (en) 2000-09-29
DK1019089T3 (da) 2006-03-13
CN1227501A (zh) 1999-09-01
HUP0000809A2 (hu) 2000-11-28
ATE308998T1 (de) 2005-11-15
DE69734607T2 (de) 2006-08-03
AU725468B2 (en) 2000-10-12
KR20000029806A (ko) 2000-05-25
EP1019089A2 (en) 2000-07-19
IL128274A0 (en) 1999-11-30
WO1998005361A2 (en) 1998-02-12
CZ36999A3 (cs) 1999-07-14
NO990518L (no) 1999-04-06
US6504005B1 (en) 2003-01-07
IL119029A0 (en) 1996-11-14
JP4416184B2 (ja) 2010-02-17
EP1019089B1 (en) 2005-11-09
NO990518D0 (no) 1999-02-04
WO1998005361A3 (en) 1998-06-18
CA2261835A1 (en) 1998-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2252787T3 (es) Principios activos de efecto prolongado y composciones farmaceuticas que los incluyen.
US8828923B2 (en) Insulin derivatives
ES2402592T3 (es) Nuevos derivados de insulina
ES2548304T3 (es) Análogos de la insulina que contienen una fracción acilo y alquilenglicol
ES2526924T3 (es) Insulinas con una fracción acilo que comprende unidades repetitivas de aminoácidos que contienen alquilenglicol
ES2371361T3 (es) Composiciones que comprenden una insulina acilada y zinc y método de producción de dichas composiciones.
ES2542146T3 (es) Insulinas extendidas PEGiladas.
ES2287930T3 (es) Compuestos farmaceuticos activos hepatoselectivos.
ES2428510T3 (es) Derivados de insulina