ES2252787T3 - Principios activos de efecto prolongado y composciones farmaceuticas que los incluyen. - Google Patents
Principios activos de efecto prolongado y composciones farmaceuticas que los incluyen.Info
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Abstract
Un compuesto de la fórmula: X ¿ Y donde Y es una fracción de un fármaco que lleva al menos un grupo funcional seleccionado entre amino, carboxilo, hidroxilo y/o mercapto, libres, y X es un radical seleccionado de los radicales de las fórmulas (i) a (iv): donde R1 y R2, iguales o diferentes, son, cada uno, hidrógeno, alquilo, alcoxi, alcoxialquilo, arilo, alquilarilo, aralquilo, halógeno, nitro, sulfo, amino, amonio, carboxilo, PO3H2, o OPO3H2; R3 y R4, iguales o diferentes, son, cada uno, hidrógeno, alquilo o arilo; y A es un enlace covalente cuando el radical se une a grupo carboxilo o mercapto del fármaco Y, o A es OCO- cuando el radical se une a un grupo amino o hidroxilo de Y, y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, siempre que cuando R1 a R4 son hidrógeno y A es OCO-, Y no es una fracción de un fármaco que contiene un grupo O-maloniltirosilo
Description
Principios activos de efecto prolongado y
composiciones farmacéuticas que los incluyen.
La presente invención se refiere a nuevos
pro-fármacos de acción prolongada capaces de sufrir
una transformación química en el organismo desde una forma inactiva
a una forma bioactiva, llevando los citados
pro-fármacos grupos funcionales sensibles a medios
básicos suaves, más en particular se refiere a los
pro-fármacos con sustitución de
fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) y fluorenilmetilo (FM) así como a
composiciones farmacéuticas que los comprenden.
Los fármacos terapéuticos que se utilizan
actualmente en tratamientos terapéuticos médicos y en veterinaria se
clasifican con arreglo a varios criterios. Por ejemplo, los fármacos
pueden considerarse como moléculas que tienen un carácter
proteináceo-peptídico, es decir, moléculas
compuestas por unidades estructurales de amino ácido, o de carácter
no-peptídico, o puede atenderse a criterios no
relacionados con la estructura tales como fármacos que se absorben
oralmente o que se administran de otro modo, es decir, por
inyección, vía intranasal o tópica, para que alcancen la corriente
circulatoria sanguínea.
Los compuestos que se absorben oralmente son, en
general, de bajo peso molecular, bastante estables, lipófilos
("oleosos") y de naturaleza no-peptídica.
Virtualmente, todos los fármacos peptídicos y proteínicos, debido a
sus características intrínsecas hidrófilas
(no-lipófilas) y polares y a su inestabilidad
metabólica, no obedecen a estos criterios y la mayoría deben
administrarse por inyección. Además, como estas moléculas se
degradan rápidamente en el cuerpo por diversos mecanismos,
especialmente proteolisis, son normalmente de vida corta.
Los fármacos no peptídicos son muy frecuentemente
suficientemente hidrófobos y pueden llegar a la circulación
sanguínea a través del tracto gastrointestinal. Debido a su relativa
estabilidad química, los fármacos no-peptídicos son
normalmente especies de vida larga.
Los fármacos proteína y péptido tienen
aplicaciones importantes y numerosas, por ejemplo la insulina en el
tratamiento de la diabetes, análogos de hormona de liberación de
gonadotropina (GnRH) en la terapia de cáncer de próstata,
calcitonina en el tratamiento de trastornos relacionados con los
huesos. El potencial de esta importante familia de moléculas es
vasto, pero solo ha sido explorado de manera parcial por no decir
marginal. Esto se debe en gran medida a su corta vida en el
organismo y al modo inconveniente de administración. Los fármacos
no-peptídicos, tales como antibióticos, aunque
tienen una vida relativamente larga, han de administrarse varias
veces al día durante un período de una semana, o más, para mantener
los deseados niveles continuos en la circulación.
La absorción oral de fármacos es una meta muy
deseable en el tratamiento de enfermedades humanas, en particular en
tratamientos terapéuticos prolongados. La alteración estructural de
los fármacos puede llevar a un aumento de la absorción oral y
tópica, bioestabilidad y, eventualmente, a biodisponibilidad.
Actualmente, los mayores esfuerzos han sido dirigidos hacia estas
metas. La mayoría de los métodos incluyen modificaciones de fármacos
de manera que se conserve su arquitectura natural, es decir, la
estructura bioactiva. Esta estructura natural es la reconocida
específicamente por la diana a la que se dirige el fármaco y es un
pre-requisito de la potencia del fármaco.
Desgraciadamente, sin embargo, en muchos casos, la estructura
natural es reconocida también por el "sistema de mecanismo de
desalojo", que es capaz de unirse al fármaco, degradarlo o
metabolizarlo y acelerar así su eliminación. Según esto,
frecuentemente se intenta conseguir al mismo tiempo la
estabilización de la estructura bioactiva y la potenciación de la
estabilidad metabólica. Para conseguir este objetivo han sido
empleados métodos tales como la encapsulación, solubilidad reducida
y modificación química.
Sería deseable prolongar la vida media de
virtualmente muchos, si no todos los fármacos peptídicos así como
los no-peptídicos que existen en el mercado o que
puedan desarrollarse en el futuro, incluyendo antibióticos,
antivirales, antihipertensivos, antiinflamatorios, analgésicos,
anticolesteronemia, anticancirogénicos, antidiabéticos, promotores
del crecimiento, y otros fármacos. Pro-fármacos
relacionados con fármacos naturales que son tóxicos por encima de
ciertas concentraciones umbral pueden ser particularmente
beneficiosos.
Por tanto, un objeto de la presente invención es
proporcionar pro-fármacos caracterizados por su
elevada sensibilidad a medios básicos suaves y su capacidad de
sufrir transformación desde una forma inactiva a una forma
bioactiva, en condiciones fisiológicas, en el organismo.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar pro-fármacos derivados de fármacos que
tienen grupos libres amino, carboxilo, hidroxilo y/o mercapto,
siendo los citados pro-fármacos esencialmente no
activos biológicamente sino capaces de conversión lenta y espontánea
a la molécula de fármaco activo original, en el organismo, después
de su administración.
Es aún otro objeto de la presente invención
proporcionar pro-fármacos que presentan una mayor
estabilidad metabólica y biodisponibilidad aumentada.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar profármacos que representan posibilidades alternativas
para administración de fármaco, por ejemplo oral y transdérmica, y
que son además capaces de penetrar a través de barreras
fisiológicas, por ejemplo la barrera
sangre-cerebro.
Aún otro objeto de la presente invención es
proporcionar profármacos que permiten una inserción dirigida del
fármaco específico del fármaco a los lugares del organismo
afectados.
La presente invención se refiere, según esto, a
pro-fármacos derivados de un fármaco en que uno o
más grupos de la molécula de dicho fármaco seleccionados entre
grupos libres amino, carboxilo, hidroxilo y/o mercapto, están
sustituidos con grupos funcionales sensibles a bases y separables en
condiciones básicas suaves, por ejemplo, fisiológicas.
El nuevo concepto de la invención para fármacos
de liberación lenta incluye la obtención de derivados nuevos del
fármaco, generalmente más hidrófobos. En este método se prefiere
perder, en vez de conservar, la conformación natural, la potencia
biológica y la identidad de reconocimiento del fármaco por los
sistemas que degradan. Una ventaja de este método, sin embargo, está
en el hecho de que el derivado así modificado puede hidrolizarse
lenta y espontáneamente al fármaco activo natural bajo condiciones
in vivo.
Los profármacos de la invención son de la
fórmula:
X-Y
donde
Y es una fracción del fármaco que lleva al menos
un grupo funcional seleccionado entre amino, carboxilo, hidroxilo
y/o mercapto, libres, y
X es un radical seleccionado entre radicales de
las fórmula (i) a (iv):
donde R_{1} y R_{2}, iguales o
diferentes, son, cada uno e ellos, hidrógeno, alquilo, alcoxi,
alcoxialquilo, arilo, alquilarilo, aralquilo, halógeno, nitro,
sulfo, amino, amonio, carboxilo, PO_{3}H_{2}, o
OPO_{3}H_{2}; R_{3} y R_{4}, iguales o diferentes, son, cada
uno, hidrógeno, alquilo o arilo; y A es un enlace covalente cuando
el radical se une a grupo carboxilo o mercapto del fármaco Y, o A es
OCO- cuando el radical se une a un grupo amino o hidroxilo de Y,
siempre que cuando R_{1} a R_{4} son hidrógeno y A es OCO-, Y no
es una fracción de un fármaco que contiene un grupo
O-maloniltirosilo.
Según la presente invención, Y es una fracción de
un fármaco para uso médico o veterinario que lleva al menos un grupo
funcional seleccionado de amino, carboxilo, hidroxilo y/o mercapto,
libre, tales al como, sin que quede limitado a ellos, fármacos
antidiabéticos, por ejemplo insulina; promotores del crecimiento,
por ejemplo hormona humana del crecimiento, hormona bovina del
crecimiento; antibióticos tales como aminoglicósidos, por ejemplo
gentamicina, neomicina y estreptomicina,
\beta-lactamas, tales como penicilinas, por
ejemplo, amoxicilina, ampicilina, piperacilina, y cefalosporinas,
por ejemplo cefaclor, cefminox y cefalexina, macrólidos, por
ejemplo, carbomicina y eritromicina, y antibióticos polipeptídicos,
por ejemplo bacitracina, gramicidinas y polimixinas; antibacterianos
sintéticos, por ejemplo trimetroprim, ácido piromídico, y
sulfametazina; analgésicos y fármacos
anti-inflamatorios, por ejemplo, acetaminofen,
aspirina, ibufenac, indometacina; fármacos antialérgicos y
antiasmáticos, por ejemplo amlexanox y cromolin; fármacos
antihipercolesterolémicos, por ejemplo ácido clofíbrico, ácido
oxiniácico y triparanol; bloqueantes
\beta-adrenérgicos y fármacos antihipertensores,
por ejemplo bupranolol, captopril, indenolol, propanolol y ácido
4-aminobutanoico; fármacos antineoplásicos, por
ejemplo, daunorubicina, azacitidina,
6-mercaptopurina, interferones,
interleucina-2, taxol y vinblastina; fármacos
antivíricos, por ejemplo acyclovir, ganciclovir, amantadine,
interferones, AZT y ribavirin, etc. Se entiende que el término
fármaco según la invención abarca también las
feromonas.
feromonas.
Los términos "alquilo", "alcoxi",
"alcoxialquilo", "arilo", "alcarilo" y
"aralquilo" en las definiciones de R_{1}, R_{2}, R_{3} y
R_{4} aquí utilizadas se refieren a radicales alquilo de
1-8, preferiblemente 1-4 átomos de
carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo y butilo, y
radicales arilo de 6-10 átomos de carbono, por
ejemplo fenilo y naftilo. El término "halógeno" incluye bromo,
flúor, cloro o yodo.
En un modo de realización preferido de la
invención, el grupo funcional es el radical (i) donde R_{1},
R_{2}, R_{3} y R_{4} son hidrógeno y A es OCO-, es decir, el
conocido radical 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc)
que se emplea mucho en síntesis de péptidos para protección temporal
reversible de grupos amino (para una revisión, véase L.A. Carpino,
Acc. Chem. Res. (1987) 20, 401-407). El grupo
Fmoc es particularmente adecuado para síntesis de péptidos debido a
la manipulación sintética favorable para su introducción y
separación, y estabilidad preferente como
pre-requisito para síntesis de péptidos y
purificación conveniente. Además, el grupo
9-fluorenilmetilo (Fm) relacionado es aplicable
también para enmascaramiento reversible de funciones carboxílicas,
por ejemplo de aminoácidos. Los ésteres fluorenilmetílicos (ésteres
Fm) resultantes generan las funciones carboxílicas libres del
progenitor después del paso de reacción de
\beta-eliminación en tratamiento básico suave y
por tanto puede emplearse similarmente para enmascaramiento
reversible de funciones carboxílicas de fármacos. El grupo Fmoc es
de además de uso potencial similar en la protección reversible de
grupos hidroxilo de tirosina, serina y treonina.
Los radicales Fmoc halogenados (i), donde al
menos uno entre R_{1} y R_{2} en la posición 2 o en la posición
7 es halógeno, preferiblemente Cl o Br, el radical
2-cloro-1-indenilmetoxicarbonilo
(CLIMOC) (ii), el radical
1-benzo[f]indenil-metoxicarbonil
uretano (BIMOC) (iii), el radical uretano sulfona (iv) y los
correspondientes radicales (i) a (iv) donde A es un enlace covalente
se pueden utilizar igual que Fmoc y Fm para sustitución en
funciones libres amino, carboxilo, hidroxilo y mercapto de
fármacos, proporcionando así un amplio intervalo de sensibilidad
hacia la separación de tales grupos en condiciones alcalinas, por
ejemplo, fisiológicas. De hecho, los radicales (i) a (iv) pertenecen
a una familia general de entidades químicas raras que sufren
hidrólisis a pH neutro o ligeramente alcalino y condiciones suaves y
pueden utilizarse por tanto para protección reversible temporal de
grupos \alpha- y \varepsilon-amino, por ejemplo
en síntesis de péptidos, y pueden separarse de la función amino,
por una reacción de \beta-eliminación en
condiciones básicas suaves.
Según la invención, los radicales (i) a (iv),
preferiblemente Fmoc unido covalentemente a amino y/o fracciones
hidroxilo, o Fm unido covalentemente a fracciones carboxilo y/o
mercapto, sufren hidrólisis (vía
\beta-eliminación) para volver a las funciones
libres amino, hidroxi, mercapto o carboxilo, en condiciones
fisiológicas en el fluido corporal, es decir, a pH 7,4 y 37ºC.
Los pro-fármacos de la invención
se pueden preparar por reacción de la molécula de fármaco con un
reactivo adecuado que comprende un radical (i) a (iv). Existen
varios derivados de 9-fluorenilmetil (Fm)
disponibles, tales como
9-fluorenilmetil-N-hidroxisuccinimida
(Fmoc-OSu), un reactivo muy específico para
funciones amino; cloruro de
9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc-Cl)
que reacciona con radicales amino e hidroxilo, a los que se une
covalentemente; 9-clorometilfluoreno
(Fm-Cl) que reacciona con radicales mercapto para
dar derivados de S-Fm (Bodanszky y Bednarek, 1982);
y 9-fluorenilmetanol (FM-OH) que
reacciona con funciones carboxilo a las que esterifica.
También están disponibles los grupos funcionales
sensibles a condiciones básicas que pueden separarse desde las
funciones amino, carboxilo, hidroxilo o mercapto siguiendo trayectos
diferentes de eliminación \beta, pero requieren normalmente
manipulaciones extensas que no son adecuadas para la protección de
fármacos. Una excepción conocida es el grupo trifluoroacetilo (TFA)
que es bastante similar a Fmoc en cuanto a su fácil separación desde
grupos amino, pero es potencialmente tóxico, y por eso los fármacos
derivados de TFA no son recomendables para propósitos terapéuticos.
Por otra parte, Fmoc-aminoácidos, por ejemplo,
Fmoc-leucina, han mostrado tener bajo índice de
toxicidad en modelos animales experimentales (Burch y col.,
1991).
La invención se refiere además a composiciones
farmacéuticas que comprenden un profármaco según la invención y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
La Figura 1 muestra el curso del tiempo de
activación (pH 7,4, 37ºC) de
Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{1}-insulina
(cuadrados llenos), Phe^{B1}, Lys
^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina
(cuadrados blancos ) y Gly^{A1}, Phe^{B1},
Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{3}-insulina
(sustituida en los tres grupos amino, círculos abiertos), como se
determina por ensayo biológico libre de células (fosforilación de
[poli(Glu_{4}Tyr)] por preparación enriquecida de tirosina
cinasa de receptor de insulina).
La Figura 2 muestra el efecto de la
administración intraperitoneal única de
(Fmoc)_{2}-insulina (3 mg/rata en 2 ml de
DMSO al 10%) y NPH-insulina (3 mg/rata) sobre el
nivel de glucosa en sangre de ratas normales.
La Figura 3 muestra el efecto de una sola
administración intraperitoneal de
(Sulfmoc)_{2}-insulina e insulina natural
(en ambos casos 3 mg/rata en 1 ml de agua) sobre el nivel de glucosa
en sangre de ratas normales.
La Figura 4 muestra la degradación de insulina
(cuadrados blancos) y Gly^{A1}, Phe^{B1},
Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{3}-insulina
(rombos llenos) por una mezcla de tripsina y quimotripsina.
La Figura 5 muestra el efecto de una sola
administración de Gly^{A1}, Phe^{B1},
Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{3}-insulina
(círculos llenos) sobre niveles de glucosa en sangre de ratas
diabéticas tratadas con estreptozotocina (STZ) en comparación con
la administración de insulina natural (cuadrados blancos).
La Figura 6 muestra que una administración única
de Phe^{B1},
Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina
a ratas hiperglucémicas tratadas con STZ induce un efecto prolongado
en la reducción de los niveles de glucosa en sangre.
La Figura 7 muestra la potencia antagonista
\beta-adrenérgica de
N-Fmoc-propanolol a través de la
generación de propanolol activo en la incubación.
La presente invención se refiere a profármacos
diseñados según un nuevo concepto para desarrollo de caminos mejores
de administración de fármacos y por consiguiente de estabilidad y
bioactividad del fármaco potenciadas. Según el nuevo método de la
presente invención, se prefiere perder, en lugar de conservar, la
estructura natural del fármaco, la potencia biológica y la capacidad
del reconocimiento de la diana pero, después de la aplicación, el
fármaco así modificado volverá a convertirse espontánea y
lentamente, dentro del organismo, en la molécula activa
original.
Según el nuevo concepto de la presente invención,
numerosos fármacos que se aplican actualmente se pueden convertir en
profármacos inactivos que son especies de vida larga que evaden la
degradación general y la mediada por receptor, en el organismo. Los
profármacos de la invención están diseñados para sufrir una
regeneración espontánea a los fármacos originales en condiciones
fisiológicas in vivo y de forma homogénea. El amplio espectro
de procedimientos químicos disponibles para la producción de los
profármacos de la invención permite obtener una velocidad rápida o
lenta de reactivación según sea necesario. De esta manera se pueden
preparar profármacos dados con atributos físicos tales como
solubilidad disminuida y, por tanto, una velocidad más lenta de
absorción subcutánea. Además, la alteración del índice de
hidrofobicidad de profármacos, combinada con la característica de
regeneración espontánea en la circulación sanguínea, permite
convertir fármacos que no se absorben oralmente en profármacos
permeables gastrointestinales.
Los profármacos según la invención incluyen
fármacos modificados para su utilización en humanos y animales así
como feromonas de insectos modificadas.
En un aspecto de la invención, el profármaco es
insulina modificada. Actualmente, la insulina es el fármaco
predominante para diabetes mellitus, un grupo de síndromes
caracterizados por hiperglucemia, metabolismo alterado de lípidos,
hidratos de carbono y proteínas y un riesgo incrementado de
complicaciones de enfermedades vasculares. La mayoría de los
pacientes se pueden clasificar clínicamente como pacientes que
sufren diabetes méllitus dependiente de insulina (Tipo I,
IDDM) o independiente de insulina (Tipo II, NIDDM). En Occidente,
aproximadamente un 90% de pacientes diabéticos tiene diabetes Tipo
II y la mayor parte de los restantes tiene la de Tipo I.
Aproximadamente el 70% de los diabéticos de Tipo II en los Estados
Unidos son también obesos, un factor que contribuye
significativamente a la resistencia a insulina. En la diabetes Tipo
I, hay una pérdida extensa y selectiva de células \beta del
páncreas y un estado de hipoinsulinemia. En cambio, en los grupos de
pacientes diabéticos del Tipo II no hay pérdida significativa de
células \beta, pacientes en los cuales la concentración media en
plasma de insulina en un período de 24 horas es esencialmente normal
o incluso elevada debido a la resistencia periférica a la acción de
la hormona. No obstante, individuos con diabetes Tipo II son
relativamente deficientes en insulina. Esto se debe a que una célula
\beta pancreática normal será capaz de secretar cantidades de
insulina que son considerablemente mayores que las normales cuando
se enfrentan a una hiperglucemia, permitiendo así a un individuo
mantener euglucemia en la fase de resistencia moderada a
insulina.
Virtualmente, todas las formas de diabetes
méllitus son debidas a una reducción en la concentración de
insulina (deficiencia de insulina) o a una disminución de la
respuesta de los tejidos periféricos a la insulina (resistencia a
insulina), en asociación con un exceso de hormonas con acciones
opuestas a las de insulina (glucagon, hormona del crecimiento,
cortisol, y catecolaminas). Estas anormalidades hormonales conducen
a alteraciones del metabolismo de hidratos de carbono, lípidos,
cetonas y aminoácidos. El rasgo central del síndrome es la
hiperglucemia.
La vida media de insulina en plasma es de
aproximadamente 5-6 minutos. La degradación de
insulina tiene lugar principalmente en el hígado y en menor medida
en el riñón y músculos. Aproximadamente el 50% de la insulina que
alcanza el hígado en la vena portal es destruida y no alcanza la
circulación general. La insulina es filtrada por los glomérulos
renales y reabsorbida por los túbulos que también la degradan.
La degradación proteolítica de insulina en el
hígado es principalmente mediada por receptor. Después de la unión a
receptor de insulina, el complejo se internaliza en pequeñas
vesículas llamadas endosomas donde se inicia la degradación. Parte
de la insulina es suministrada también a lisosomas para degradación.
En los hepatocitos se degrada aproximadamente un 50% de insulina
internalizada.
La insulina es crítica para gestión de la
cetoacidosis de diabetes, y es importante en el tratamiento del coma
hiperglucémico no-cetónico, y en el control
peri-operativo de pacientes diabéticos tanto del
Tipo I como del Tipo II. La administración subcutánea de insulina
(s.c.) es el principal tratamiento para todos los pacientes
diabéticos del Tipo I y la mayoría del Tipo II que no son
adecuadamente controlados por la dietay/o agentes hipoglucémicos
orales. En estos casos, el objetivo es normalizar, no solamente la
glucosa en sangre, sino también otros aspectos del metabolismo
desequilibrado que resulta de hipoinsulemia e hiperglucemia.
Un tratamiento a largo plazo basado
principalmente en administración s.c. de insulina no mimetiza la
rápida elevación y declinación normal de la secreción de insulina en
respuesta a nutrientes inyectados, y posee preferencialmente efectos
periféricos en lugar de efectos hepáticos de insulina, no obstante
el considerable éxito alcanzado con este tratamiento.
\newpage
Las preparaciones de insulina utilizadas
tradicionalmente para aplicación por vía subcutánea se clasifican de
acuerdo con su duración de acción en insulinas de actuación corta,
intermedia y larga, y según el origen de la especie. La insulina
humana está ahora disponible ampliamente, y en teoría es de esperar
que sea menos inmunogénica que las insulinas porcina o bovina ya que
las dos últimas difieren de la insulina humana en uno y tres
aminoácidos respectivamente. Sin embargo, cuando se purifican mucho,
las tres insulinas tienen capacidad baja, pero mensurable, para
estimular la respuesta inmune. Las preparaciones a valores de pH
neutro son en general estables y permiten el almacenamiento durante
largos períodos de tiempo a temperatura ambiente. Para propósitos
tradicionales y terapéuticos, las dosis y concentraciones de
insulina se expresan en unidades (U), basadas en la cantidad
requerida para inducir normoglucemia en conejos en ayunas. Las
preparaciones homogéneas de insulina contienen aproximadamente 25
U/mg. Casi todas las preparaciones comerciales de insulina se
suministran en solución a una concentración de 100 U/ml.
Las insulinas de actuación corta o rápida son
preparaciones solubles de insulina zinc cristalina disuelta en un
agente tampón de pH neutro, normalmente inyectada
30-45 minutos antes de las comidas. Estas
preparaciones tienen el comienzo de actuación más rápido y la
duración de actuación más corta.
En condiciones metabólicas estables, las
insulinas regulares se administran habitualmente junto con
preparaciones de actuación intermedia o larga. Las insulinas de
actuación intermedia se diseñan para ser menos solubles en
soluciones acuosas, con lo que se disuelven más gradualmente en
administración subcutánea y su duración de acción es más larga. Las
dos preparaciones más frecuentemente utilizadas son Insulina NPH
(NPH son las siglas de Neutral Protamina Hagedorn), una suspensión
de cristales de zinc-insulina en tampón fosfato
modificado por adición de sulfato de protamina, e Insulina Lente,
una suspensión de insulina en tampón acetato modificado por adición
de cloruro de zinc para reducir la solubilidad de insulina.
Dado de que es de esperar que la insulina de
actuación corta cubra un período de 0,4-7 horas y la
insulina de actuación intermedia pueda cubrir un intervalo de
1,5-20 horas, el cálculo correcto del tiempo y dosis
de la combinación de las dos insulinas debe tomar en consideración
los parámetros variables tales como comportamiento nutricional,
hipoglucemia nocturna (en ayunas) e hiperglucemia matutina, cuando
la actividad de las hormonas contra-reguladoras
(para insulina) se incrementa. Si las preparaciones de insulina de
actuación rápida y actuación intermedia o larga se coadministran
juntas, una desventaja común de tales combinaciones es que, al
mezclarse, parte de las insulinas de actuación rápida puede formar
complejos con el exceso de Zn^{2+} o protamina de la preparación
de actuación larga o intermedia, convirtiéndose así en una insulina
de actuación intermedia e incluso de actuación larga.
Las insulinas de actuación larga, tales como
Insulina Ultralente o suspensiones de insulina-zinc
extendida o de
protamina-zinc-insulina son
preparaciones de insulina en las que el zinc o zinc más protamina se
han añadido en exceso con el fin de conseguir preparaciones
insolubles de insulina. Son suspensiones de partículas menudas de
zinc-insulina y difieren solo en el tamaño de
partícula que determina la duración de su acción. A diferencia de
una insulina regular, las Insulinas Ultralente tienen un comienzo
muy lento y un máximo de acción prolongado ("plano"). Se
considera que proporcionan una baja concentración basal de insulina
a lo largo del día, pero su vida media larga hace difícil determinar
la dosis óptima y los días de tratamiento requeridos antes de poder
alcanzarse la concentración de estado estacionario. La Insulina
Ultralente bovina y porcina tiene un curso de acción más prolongado
que la Insulina Ultralente humana. Se recomienda iniciar la terapia
con tres veces la dosis diaria normal como dosis de carga, seguido
de inyecciones de una o dos veces al día.
La insulina tiene tres aminoácidos y seis grupos
carboxilo disponibles para modificación. Los derivados de insulina
de la invención están sustituidos en las cadenas A y B de insulina
por uno o más de los radicales (i) a (iv) anteriores en uno o más de
los grupos amino terminales de los radicales Gly^{A1} y
Phe^{B1}, en el grupo de \varepsilon-amino de la
Lys^{B29}, en los grupos carboxilo terminales de Asn^{A21} y
Thr^{B30} y/o en los grupos carboxilo libres de Glu^{A4}.
Glu^{A17}, Glu^{B13}, Glu^{B21}. Además de los derivados de
insulina así sustituidos en carboxilo y/o amino se pueden también
sustituir con uno o más de los grupos funcionales (i) a (iv) en uno
o más de los grupos hidroxilo libres de los radicales Thr^{A8},
Ser^{A9}, Ser^{A12}, Tyr^{A14}, Tyr^{A19}, Ser^{B9},
Tyr^{B16}, Tyr^{B26}, Thr^{B27} y Thr^{B30}.
En un modo de realización preferido de la
presente invención, los derivados de insulina están sustituidos con
una o más fracciones Fmoc en los grupos amino terminales libres de
Gly^{A1} y Phe^{B1}, y/o en el grupo
\varepsilon-amino de Lys^{B29}, obteniendose así
derivados de insulina que tienen de 1 a 3 sustituyentes Fmoc en las
posiciones A^{1}, B^{1} y/o B^{29} de la molécula de insulina,
en particular Gly^{A1}-N-(Fmoc)_{1}-,
Phe^{B1}-N(Fmoc)_{1}- y
Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{1}-insulina,
Gly^{A1},Phe^{B1}-N-(Fmoc)_{2}-,
Gly^{A1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}- y
Phe^{B1},
Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina,
y Gly^{A1}, Phe^{B1},
Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{3}-insulina.
La reacción de insulina con Fmoc activado, por
ejemplo con
9-fluorenmetil-N-hidroxisuccinimida
(Fmoc-OSu) produce mono-, di- y
tri-N-Fmoc-insulinas
que se pueden resolver fácilmente por procedimientos de HPLC y
obtenerlas individualmente en forma pura. Para obtener una
di-N-Fmoc-insulina
como único producto, se protege primero uno de los grupos amino
libres, por ejemplo con grupo t-Boc, se hace
reaccionar el derivado de insulina protegido con exceso de
Fmoc-OSu, y se separa entonces el grupo protector,
resultando la
di-N-Fmoc-insulina
deseada. Cuando se administra a pacientes diabéticos, las mono-, di-
y tri-N-Fmoc se convierten en
insulina natural in vivo lo que conduce a efectos
antidiabéticos a lo largo de diversos períodos de tiempo incluyendo
períodos de tiempo prolongados.
Para sustitución solamente de los grupos
carboxilo de insulina (C-Fm), es decir, en
Asn^{A21} y Thr^{B30} terminales y en los radicales Glu^{A4},
Glu^{A17}, Glu^{B13} y Glu^{B21}, se protegen primero los
grupos amino libres de la molécula de insulina, por ejemplo, con
grupos t-Boc, y se lleva a cabo entonces una
reacción en etapas, donde (1) los grupos carboxilo libres se
convierten en grupos éster activos por reacción, por ejemplo, con un
o-nitrofenol o
N-hidroxi-succinimida; (2) reacción
de los grupos éster activados con 9-fluorenilmetanol
en presencia de imidazol; y (3) separación de los grupos
t-Boc protectores. Un procedimiento alternativo
supone una esterificación directa en una etapa de los grupos
carboxílicos con N,N'-diciclohexilcarbodiimida,
9-fluorenilmetanol y
4-dimetilaminopiridina, seguido de la separación de
los grupos t-Boc.
Cuando se desean los derivados de
Fmoc-insulina sustituidos en ambos grupos amino y
carboxilo (N-Fmoc, C-Fm), se prepara
primero el derivado F-moc con
Fmoc-OSu y se convierte entonces la
N-Fmoc insulina en ésteres activos seguido de
reacción con 9-fluorenilmetanol como se ha descrito
antes.
Para la preparación de los derivados Fm,
Fmoc-insulina sustituidos en las funciones carboxilo
e hidroxilo (CFm, O-Fmoc), se protegen primero los
grupos amino con t-Boc, se prepara el derivado
C-Fm insulina como antes, seguido de reacción con
cloruro de 9-fluorenilmetoxicarbonilo y se separan
los grupos N-t-Boc protectores.
Para la preparación de derivados de Fm,
Fmoc-insulina sustituidos en las funciones amino,
carboxilo e hidroxilo (N, OFmoc, CFm), se prepara la
N-Fmoc, C-Fm insulina como antes y
se hace reaccionar entonces con cloruro de
9-fluorenilmetoxicarbonilo.
Las insulinas modificadas según la invención se
pueden preparar a partir de una insulina apropiada para uso humano,
tal como insulina humana, porcina o bovina natural, recombinante o
mutada. Entre los ejemplos de insulinas mutadas están análogo de
insulina humana B16-Tir \rightarrow His (Kaarsholm
y Ludvigsen, 1995) y el análogo de insulina humana
Lys^{828}Pro^{829} (insulina lispro), en la que está invertida
la secuencia natural de aminoácidos en las posiciones B28 y B29. La
insulina lispro es equipotente a la insulina humana y aún es
absorbida más rápidamente desde los lugares de inyección subcutánea
(Campbell y col., 1996). En un modo de realización preferido, la
insulina es insulina humana, ya sea natural o recombinante.
Los derivados de
mono-N-Fmoc-insulina
de la presente invención tienen una potencia biológica del
40-80% de la potencia biológica de la insulina
natural, como se determina por el ensayo de fosforilación
[poli(Glu_{4}Tyr)]. Los derivados di- y
tri-N-Fmoc-insulina
tienen 2-9% y <1% de la potencia biológica de la
insulina natural, respectivamente, como se determina por el ensayo
de fosforilación [poli(Glu_{4}Tyr)]. Cuando se utiliza
apropiadamente, en las proporciones correctas, estos tres prototipos
pueden sustituir en principio a las mezclas tradicionales de
insulinas de actuación rápida, intermedia y larga aplicadas
actualmente a la terapia subcutánea de la diabetes. En el aspecto
relacionado con la insulina, la invención proporciona composiciones
farmacéuticas que comprenden uno o más derivados de insulina de la
invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Para un efecto
de actuación prolongada, la composición comprenderá preferiblemente
ya sea el derivado N-(Fmoc)_{3}-insulina o
el derivado N-(Fmoc)_{2}-insulina solos o
mezcla de ambos. La composición farmacéutica puede presentarse en
cualquier forma adecuada, por ejemplo como formulación oral o para
inyección subcutánea.
En otro modo de realización de este mismo
aspecto, la invención se refiere a un método para el tratamiento de
diabetes que comprende administrar a un paciente diabético una dosis
eficaz de uno o más derivados de insulina de la invención. En modos
de realización preferidos el derivado es
N-(Fmoc)_{3}-insulina o
N-(Fmoc)_{2}-insulina humana natural o
recombinante, o una mezcla de ambas, administrada en
5-8 intervalos al día. Si es necesario, se completa
el tratamiento con el derivado Fmoc-insulina con la
administración diaria de insulina de actuación rápida.
Para tratamiento a largo plazo, la insulina se
administra principalmente por inyecciones subcutáneas, El
tratamiento actual con insulinas de actuación larga administradas
subcutáneamente está expuesto a grandes variaciones en la absorción
entre pacientes diabéticos individuales, debido al hecho de que las
substancias añadidas pueden difundirse potencialmente fuera del
lugar de la inyección subcutánea. La presente invención proporciona
derivados de insulina con solubilidad reducida de "incorporado"
dentro de la propia molécula de insulina. Es de esperar que esto
elimine en los pacientes humanos la gran variación de absorción
subcutánea y que reduzca al mínimo o incluso elimine las
interferencias al mezclar los análogos también. La mezcla apropiada
de los tres prototipos de N-(Fmoc)-insulina puede
cubrir una larga duración de actuación ya que combina la necesidad
de insulina de actuación rápida junto con los efectos de liberación
lenta de N-(Fmoc)_{2} y
N-(Fmoc)_{3}-insulina, todas las cuales
pueden mezclarse sin efectos de interferencia.
En otro modo de realización de este mismo
aspecto, la composición de la invención comprende una mezcla de
derivados mono-, di y
tri-N-Fmoc-insulina.
La N-(Fmoc)3-insulina es, básicamente, una
insulina de actuación larga; las
N-(Fmoc)1-insulinas son
40-80% biológicamente activas, como se determina por
el ensayo de fosforilación [poli(Glu_{4}Tyr)] y presentan
una mayor solubilidad en soluciones acuosas, y las
N-(Fmoc)_{2}-insulinas son
2-9% biológicamente activas, como se determina por
el ensayo de fosforilación [poli(Glu_{4}Tyr)] y son menos
solubles en soluciones acuosas. Los tres análogos vuelven a ser
insulinas completamente activas al incubarlos a 37ºC a valores de
pH fisiológicos. Según esto, la propia mezcla de los tres análogos
puede dar un efecto de actuación rápida, intermedia y larga,
alcanzado ahora por múltiples inyecciones de insulina regular junto
con preparaciones que contienen zinc y protamina.
En otros aspectos de la presente invención, los
profármacos derivan de los fármacos para uso médico o veterinario
que incluyen, pero no queda limitado solo a ellos, fármacos
antidiabéticos, antiinflamatorios, antibacterianos, antivirales,
antineoplásicos y antihipertensivos, así como fármacos para
tratamiento de trastornos inmunológios, dermatológicos y
neurológicos.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
comprenden el profármaco o una sal farmacéuticamente aceptable del
mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Cualquier vía de
administración adecuada de fármacos a personas o a animales es
contemplada por la invención, por ejemplo la administración
convencional vía inyectable, vía de implante, vía oral,
administración rectal o tópica. Estas preparaciones se pueden
obtener por los métodos convencionales conocidos por los
especialistas en la técnica, por ejemplo como se describe en
"Remington's Pharmaceutical Science", A.R. Gennaro, ed. 17
edición, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pa, EEUU.
La invención se ilustra a continuación con los
siguientes Ejemplos no-limitativos.
Se utilizaron ratas Wistar macho
(180-200 g) suministradas por el Departamento de
Investigación de Hormonas del Instituto Weizman de la Ciencia. Se
indujo diabetes por una sola inyección intravenosa de una solución
preparada reciente de estreptozotocina (55 mg/kg corporal) en tampón
citrato 0,1 N (pH 4,5) según Meyerovitcg y col., 1987.
(ii) Preparación enriquecida de tirosina
cinasa de receptor de insulina obtenida de membranas de hígado
de rata como describen Meyerovits y col., 1990. Brevemente, se
homogeneizó el hígado en la presencia de inhibidores de proteinasa,
se solubilizó con 1% de Triton X-100 y se
centrifugó. Se hizo pasar el sobrenadante a través de una columna
(Sigma) de aglutinina de germen de trigo (WGA) -agarosa. La porción
de receptor de insulina adsorbida se eluyó con
N-acetil-D-glucosa
amina 0,3 M en tampón HEPES 50 mM, pH 7,4, que contenía 0,1% de
Triton X-100, 10% de glicerina y NaCl 0,15 M. Las
potencias biológicas de insulina y derivados de insulina se
evaluaron por los ensayos (iii) y (iv) dados a continuación.
Se prepararon adipocitos de rata siguiendo
esencialmente el método de Rodbell, 1964. Se cortó panículo adiposo
de ratas Wistar macho en pequeñas piezas con unas tijeras y se
suspendió en 3 ml de tampón KRB que contenía NaCl, 110 mM;
NaHCO_{3}, 25 mM; KCl, 5 mM; KH_{2}PO_{4}, 1,2 mM;
CaCl_{2}, 1,3 mM; MgSO_{4}, 1,3 mM; y 0,7% de BSA (pH 7,4). Se
llevó a cabo digestión con colagenasa (1 mg/ml) en una botella de
plástico flexible bajo atmósfera de carbogeno (95% de O_{2}, 5%
de CO_{2}) durante 40 minutos a 37ºC con sacudidas vigorosas. Se
añadieron entonces cinco mililitros de agente tampón y se hicieron
pasar las células a través de un tamiz de mallas. Se dejaron reposar
entonces las células durante varios minutos en un tubo de ensayo de
plástico de 15 ml a temperatura ambiente, flotando, y se separó el
agente tampón de debajo. Se repitió el proceso (suspensión,
flotación, y separación del agente tampón de debajo) tres veces.
Se dividieron las suspensiones de adipocitos
(3x10^{5} células/ml) en viales de plástico (0,5 ml por vial) y se
incubaron durante 60 minutos a 37ºC bajo atmósfera de carbogeno con
[U-^{14}C]glucosa 0,2 mM en presencia o
ausencia de insulina. Se terminó la lipogénesis por adición de
fluido de centelleo basado en tolueno (1,0 ml por vial) y se hizo el
conteo de la radiactividad en los lípidos extraídos (Moody y col.,
1974). En un experimento típico, la lipogénesis estimulada por
insulina era 4-5 veces más alta que la basal (basal
''2000 cpm por 3x10^{5} células/h; V_{insulina}
8.000-10.000 cpm por 3x10^{5} células/h). En este
ensayo, la insulina estimula la lipogénesis con el índice ED_{50}
= 0,15\pm0,03 ng/ml (Shechter y Ron, 1986). Un análogo de
insulina que presenta un valor de ED_{50} = 15 ng/ml se considera
que tiene \sim1% de la potencia biológica de la hormona
natural.
En este ensayo, la insulina activa su propio
receptor para fosforilar un copolímero al azar que contiene ácido
L-glutámico y L-tirosina a una
relación molar de 4:1 [Poli(Glu_{4}Tyr)]. La mezcla de
ensayo de enzima convencional (volumen final 60 \mul en Hepes 50
mM, pH 7,4-0,1% de Tritón X-100)
contenía receptor de insulina purificado WGA (5 \mug de proteína),
MgCl_{2} 20 mM, MnCl_{2} 2 mM, ATP 100 \muM y concentraciones
variables (de 1 ng/ml a 10 mg/ml) de insulina o derivado de
insulina. Después de 30 minutos de preincubación a 22ºC, la reacción
se inició por adición de [Poli(Glu_{4}Tyr)] (concentración
final 0,7 mg/ml), siguió durante 20 minutos a 22ºC y se terminó por
adición de EDTA (20 mM). Se determinó cuantitativamente el contenido
de fosfotirosina en Poli(Glu_{4}Tyr) por un procedimiento
de radio-inmunoensayo utilizando anticuerpos
monoclonales específicos para fosfotirosina (dilución final
1:100.000) y conjugado de
^{125}[-BSA-fosfotirosina. En este ensayo
particular la insulina facilita la mitad del efecto máximo a una
concentración de 20\pm3 ng/ml. Un análogo de insulina que presenta
un valor de ED50 = 2 mg/ml se considera que tiene \sim1% de la
potencia biológica de la hormona natural.
Se suspendió insulina humana (100 mg, 17,2
\mumoles) (donada amablemente por
Biotechnology-General Rehovot, Israel) en 4 ml de
dimetilformamida (DMF) de calidad analítica que contenía 17,4 mg
(172 \mumoles) de trietilamina. Se añadió entonces
Fmoc-OSu (58 mg, 172 \mumoles). La mezcla de
reacción homogénea se agitó a 25ºC durante 20 horas y se añadió
luego acetato de etilo hasta turbidez de la solución, seguido de la
adición de éter para completar la precipitación. El disolvente se
separó por centrifugación y el precipitado se lavó dos veces con
éter y dos veces con agua. Este procedimiento condujo a una mezcla
de derivados mono, di y
tri-N-Fmoc-insulina
que se separaron y purificaron por cromatografía HPLC preparativa.
Los derivados N-Fmoc-insulina
mono-modificados pueden separarse de los derivados
di y tri-modificados por lavado con isopropanol del
sólido bruto
Se sometió el sólido bruto a HPLC de fase inversa
(sistema de cromatografía de líquidos
Spectra-Physics SP 8800) equipado con columna
pre-empaquetada de HPLC (Merck, LIChrosCART
250-10 mm que contenía LlChrosorb
RP-18 [7 \mum]. Se formó un gradiente lineal
desde ácido trifluoroacético 0,1% (TFA) en H_{2}O (solución A) y
0,1% de TFA en acetonitrilo: H_{2}O, 75:25 (solución B). La
velocidad de flujo fue de 1 ml/min. El derivado
N-(Fmoc)_{1}-insulina emergió de la columna
con tiempos de retención de 21,1, 21,9 y 22,8 minutos, los derivados
N-(Fmoc)_{2}-insulina con tiempos de
retención de 26,3, 27,1 y 27,7 minutos, y la
N-(Fmoc)_{3}-insulina con retención de 31,5
minutos. Las fracciones correspondientes a 21-23
minutos, 26-28 minutos y 31,5 minutos se acumularon,
se liofilizaron y se caracterizaron químicamente. Las fracciones
correspondientes a 21-23 minutos (insulinas
monomodificadas) y a 26-28 minutos (insulinas
di-modificadas) se purificaron además para dar los
derivados mono-Fmoc y
di-Fmoc-insulina individuales,
respectivamente. Las cantidades de grupos Fmoc unidos a la molécula
de insulina se determinaron espectrofotométricamente a 301 nm
siguiendo el tratamiento de cantidades conocidas de derivados de
N-Fmoc-insulina con piperidina al
50% en CH_{2}Cl_{2}.
Después de la separación preparativa por un
procedimiento de HPLC, se obtuvieron siete derivados de
N-Fmoc-insulina. Estos incluyen tres
derivados mono-modificados, tres
di-modificados y uno tri-modificado,
respectivamente (Tabla I). Los tiempos de retención y los
rendimientos de cada compuesto individual se dan en la Tabla I. Las
diferentes N-Fmoc-insulinas se
pueden resolver fácilmente entre sí y obtenerse en forma purificada
bajo las condiciones experimentales aplicadas aquí. Se
caracterizaron Phe^{B1},
Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina
(tiempo de retención = 27,7 minutos) y Gly^{A1}, Phe^{B1} y
Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{3}-insulina
por varios procedimientos incluyendo los espectros de masas (Tabla
I).
Dado que los bio-ensayos
revelaron que Phe^{B1},
Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina
es especialmente adecuada como insulina de actuación larga, se
diseñó un procedimiento alternativo para sintetizarla. Se protegió
especialmente la fracción Gly^{A1} con grupo t-Boc
bajo condiciones experimentales especificadas, utilizando un
equivalente de dicarbonato de
di-terc-butilo y DMSO/Et_{3}N,
20:1, como disolvente. Después de la separación por el procedimiento
HPLC, se hizo reaccionar
Gly^{A1}-N-Boc-insulina
con un exceso de Fmoc-OSu (10 equivalentes),
utilizando DMF como disolvente y DIEA como base: El tratamiento con
TFA y purificación por HPLC produjo Phe^{B1},
Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina,
con buen rendimiento (\sim50%).
En las Tablas II y III se recogen varias
características de los derivados
N-Fmoc-insulina de la presente
invención. La solubilidad de los derivados en soluciones acuosas
decrece al incrementarse la modificación,
N-(Fmoc)-insulina es solamente ligeramente menos
soluble que la insulina natural mientras que la
N-(Fmoc)_{3}-insulina es aproximadamente 20
veces menos soluble que la hormona natural. Las potencias biológicas
disminuyen a medida que se incrementa la derivación. Así, las di y
tri-N-Fmoc-insulinas
presenta 40-80%, 2,9% y <1% de la potencia
biológica de insulina natural, respectivamente, como se deduce del
ensayo de fosforilación de [poli(Glu_{4}Tyr)]. Según el más
sensible ensayo biológico de lipogénesis con adipocitos intactos de
ratas, los derivados Fmoc-insulina presentan
potencias biológicas muy inferiores. Según esto, la
Gly^{A1}-N-Fmoc-insulina
y
di-N-Fmoc-insulinas
presentan una potencia biológica que es el 4,7% y
0,4-1,4% de la potencia biológica de insulina
natural, respectivamente, utilizando el ensayo de lipogénesis (Tabla
III). Los siete derivados, todos ellos, revierten a la hormona
natural al incubarlos durante 2 días a pH 8,5. Esto quedaba probado
por la recuperación de la potencia biológica completa (Tablas II y
III) y por la desaparición de los picos de los derivados, junto con
la aparición del pico de hormona natural (tiempo de retención = 15
minutos) en la separación por el procedimiento de HPLC
analítica.
derivado | Tiempo de | Rendimiento^{b} | Moles de | Posición de la | Espectro de masas |
retención | (%) | Fmoc/ | inserción del Fmoc | (peso molecular) | |
(HPLC) | moles de | calculado encontrado | |||
minutos^{a} | insulina | [M+H]^{+} | |||
N-(Fmoc)_{1}-insulina | 21,1 | 3 | 0,8 | Gly^{A1} | |
N-(Fmoc)_{1}-insulina | 21,9 | 6 | 1,2 | Lys^{B29} | |
N-(Fmoc)_{1}-insulina | 22,8 | 4 | 0,9 | Phe^{B1} | |
N-(Fmoc)_{2}-insulina | 26,3 | 12 | 1,7 | Gly^{A1}, Lys^{B29} | |
N-(Fmoc)_{2}-insulina | 27,1 | 6 | 2,1 | Gly^{A1}. Phe^{B1} | |
N-(Fmoc)_{2}-insulina | 27,7 | 14 | 1,9 | Phe^{B1}, Lys^{B29} | 6252 \hskip0,5cm 6255 |
N-(Fmoc)_{3}-insulina | 31,5 | 30 | 3,4 | Gly^{A1}, Lys^{B29}, Phe^{B1} | 6474 \hskip0,5cm 6475 |
Nota: \begin{minipage}[t]{150mm} Se utilizó el análisis de aminoácidos para verificar la composición correcta de todos los derivados de Fmoc \end{minipage} | |||||
\hskip0,6cm^{a} \begin{minipage}[t]{150mm} Establecido con columna LiChrospher 100 RP-8 Merck (5 \mu m), empleando un gradiente lineal formado desde 60% de solución A (0,1% de TFA en agua) y 40% de solución B (0,1% TFA en acetonitrilo:agua, 75:25), a 100% de solución B en 40 minutos (velocidad de flujo de 1 ml/minuto\end{minipage} | |||||
\hskip0,6cm^{b} Basado en el material puro obtenido después de HPLC | |||||
Derivado | Origen | Posición de la | Aspecto en | Solubilidad | Potencia | Potencia biológica |
inserción de | tampón | en tampón | biológica | tras incubación | ||
F(moc) | acuoso | acuoso | (%) | (2 días a 37º | ||
(pH 7,4) | (pH 7,4, | pH 8,5) | ||||
mg/ml) | ||||||
Insulina natural | humano | transparente | \sim4 o más | 100 | 100 | |
N-(Fmoc)_{1}-insulina | humano | Gly^{A1} | casi | \sim3 | 40\pm2 | 95 |
transparente | ||||||
N-(Fmoc)_{1}-insulina | humano | Lys^{B29} | casi | \sim3 | 78\pm4 | 94 |
transparente | ||||||
N-(Fmoc)_{1}-insulina | humano | Phe^{B1} | casi | \sim3 | 76\pm4 | 95 |
transparente | ||||||
N-(Fmoc)_{2}-insulina | humano | Gly^{A1}, Lys^{B29} | turbio | \sim2 | 2\pm1 | 93 |
N-(Fmoc)_{2}-insulina | humano | Gly^{A1}, Phe^{B1} | turbio | \sim2 | 3\pm1 | 97 |
N-(Fmoc)_{2}-insulina | humano | Phe^{B1}, Lys^{B29} | turbio | \sim2 | 9\pm2 | 95 |
N-(Fmoc)_{3}-insulina | humano | Gli^{A1}, Lys^{B29}, Phe^{B1} | muy turbio | \sim0,2 | <1 | 98 |
Nota: La potencia tipo insulina se determinó por los dos ensayos biológicos descritos en la parte experimental |
Derivado | ED_{50} | Potencia | Actividad tras incubación a pH 8,5, 37ºC(%) | ||
lipogénesis | biológica | ||||
(ng/ml) | relativa (%) | 9 horas | 20 horas | 45 horas | |
Insulina natural | 0,2-0,4 | 100 | |||
Gly^{A1}-N-Fmoc-insulina | 7 | 4,7 | 50 | 100 | |
Gly^{A1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina | 44 | 0,4 | 10 | 20 | 97 |
Gly^{A1}, Phe^{B1}-N-(Fmoc)_{2}-insulina | 30 | 1,1 | 18 | 40 | 100 |
Phe^{B1}, Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina | 12,3 | 1,4 | 10 | 20 | 98 |
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de estudiar las potencias antidiabéticas de
N-Fmoc-insulinas en ratas
diabéticas, se ensayó su velocidad de reactivación (que representa
su conversión a hormona natural) en el tubo de ensayo. Los derivados
se había disuelto en tampón Hepes (50 mM, pH 7,4) que contenía
dimetilsulfóxido (DMSO) al 10% y se incubaron a 37ºC (es decir, a
pH fisiológico y temperatura corporal). En los puntos de tiempo
indicados, se tomaron partes alícuotas para determinar la potencia
biológica con respecto a la insulina natural. Se evaluaron las
actividades biológicas por activación de tirosina cinasa de receptor
de insulina (un ensayo libre de células como se describe en los
Procedimientos Biológicos anteriores, sección (iv) y por
estimulación de la lipogénesis en adipocitos de ratas intactos como
se describe en los Procedimientos Biológicos, sección (ii). Los
resultados se muestran en la Figura 1. La activación máxima mitad
que tiene lugar para N-(Fmoc)_{3}-insulina
a t1/2=14 días y la activación casi completa era evidente a los 21
días de incubación.
Por regla general, la velocidad de activación de
N-(Fmoc)_{2}-insulina a pH 7,4 era más
rápida. El periodo de retraso de seis días observado con
N-Fmoc)_{3}-insulina no se
vio con N-(Fmoc)_{2}-insulina. Según esto,
N-(Fmoc)_{3}-insulina parece tener una
fracción de Fmoc hidrolizable más lenta que limita la reactivación
del análogo. Después de su hidrólisis, se incrementa la velocidad de
activación. Desde un punto de vista práctico, esto implica que la
mezcla de los dos análogos puede liberar la insulina activa a lo
largo de un período prolongado de tiempo, al cubrir los períodos de
tiempo más tempranos y más tardíos. La Fmoc-insulina
mono-modificada relativamente activa recuperaba la
potencia biológica completa a pH 7,4 con t1/2 = 5 días.
Una vez que las N-(Fmoc)_{2}- y
N-(Fmoc)_{3}-insulinas llegan a la
circulación es de esperar que proporcionen una concentración basal
baja de la hormona a lo largo de períodos prolongados. Esto puede
estar dictado principalmente por la velocidad de conversión del
derivado inactivo a la hormona natural de vida activa corta.
Afortunadamente, las N-(Fmoc)2,3-insulinas
presentan velocidades lentas de activación (como muestra la Figura
1). Una velocidad rápida (instantánea; es decir dentro de minutos en
vez de horas) podría dar por resultado episodios de
hipoglucemia.
La
Phe^{B1},Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}
insulina es un 9% biológicamente activa, como se determina por el
ensayo de fosforilación [poli(Glu_{4}Tyr], y presenta
solubilidad intermedia entre la insulina natural y
N-(Fmoc)_{3}-insulina. A diferencia de la
N-(Fmoc)-insulina, la conversión de
N-(F-moc)_{2}-insulina a
hormona natural comienza enseguida (en horas) de la incubación, como
se muestra en la Figura 1. Según esto, es de esperar que la
N-(Fmoc)_{2}-insulina (que es a
priori más activa) tenga un comienzo más rápido de acción
después de la administración. Según esto, una combinación apropiada
de N-(Fmoc)_{2}- y N-(Fmoc)_{3} insulinas puede
ser una fórmula ideal para liberar insulina basal que se caracteriza
por un rápido comienzo y larga duración de acción, después de una
sola administración, y constituye un modo de realización preferido
de la invención.
Grupo | Descripción | Ganancia diaria de peso |
(gramos/rata) en los 3 | ||
primeros días | ||
A (n=5) | ratas STZ que reciben solo vehículo (2,0 ml, DMSO al 20%/rata | 2,0\pm0,2 |
B (n=5) | ratas STZ que reciben una sola administración s.c. de insulina | 12,0\pm0,2 |
NPH-humana (Humulina N)(3 mg/rata) | ||
C (n=5) | ratas STZ que reciben una sola inyección s.c. de N-(Fmoc)_{2} | 11,0\pm1,3 |
insulina (3 mg/rata) |
Con el fin de confirmar que la capacidad de
actuación larga de (Fmoc)_{2}-insulina es
debida a su lenta conversión a la hormona natural en condiciones
fisiológicas, se diseñó un ensayo adicional in vivo. Este
ensayo refleja las características de actuación larga
post-subcutáneas de insulina (o derivado de
insulina) dentro de la circulación. Las ratas normales recibieron
una sola inyección intraperitoneal de insulina natural,
NPH-insulina y
(Fmoc)_{2}-insulina (3 mg/rata), y se hizo
el seguimiento de sus niveles de glucosa en sangre a lo largo de un
período de tres días. Los resultados se muestran en la Figura 2.
Según esto, la insulina natural (Figura 3) y la
NPH-insulina (Figura 2) inducían hipoglucemia en un
período de aproximadamente 12 y 15 horas, respectivamente. La
recuperación desde hipoglucemia tenía lugar con un t1/2 de 8 y 10
horas, respectivamente. La
(Fmoc)_{2}-insulina reducía los niveles de
glucosa en sangre en un período de aproximadamente 48 horas, y la
recuperación desde hipoglucemia tenía lugar en un t1/2 de 26 horas.
Estos resultados apoyan la idea de los autores de que es indudable
que la acción prolongada de
(Fmoc)_{2}-insulina emerge de sus
características intrínsecas, y no se debe al mecanismo convencional
de NPH-insulina, es decir precipitación en el lugar
de inyección y su lenta disolución - entrada en la circulación.
Como es de esperar, las diferencias en las capacidades de insulina
natural y NPH-insulina para reducir los niveles de
glucosa en sangre en este ensayo son menores al compararlas con los
de administración por vía subcutánea. Este hecho es debido al gran
volumen de líquidos existentes en la cavidad peritoneal y de aquí la
conversión rápida de la insulina cristalina-Zn para
dar la forma monomérica. Los otros dos derivados de
(Fmoc)_{2}-insulina, [Gly^{A1},
Lys^{B29}] y [Gly^{A1}, Phe^{B1}] se sintetizaron y se
evaluaron también en este ensayo. Los resultados (no mostrados)
presentaban modelos de actuación larga similares a los de
Phe^{B1},
Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina,
con t1/2 de 22-24 horas para los dos derivados.
La insulina natural o la N-(Fmoc)_{3}
insulina (1mg/ml de cada una en Hepes 50 mM, pH 7,4, DMSO al 10%) se
incubaron a 37ºC. Se añadieron entonces quimotripsina y tripsina
(0,5% peso/peso de cada una). En los momentos indicados, se sacaron
y se sometieron a cromatografía HPLC analítica. El porcentaje de
degradación se determinó por la reducción del área del pico de
insulina natural (tiempo de retención 15 minutos) y del pico de la
N-(Fmoc)_{3}-insulina (tiempo de retención
31,5 minutos). Los resultados se muestran en la Figura 4.
Se encontró que la N-(Fmoc)_{3} insulina
era altamente resistente a proteolisis por una mezcla de
quimotripsina y tripsina a un pH de 7,4. La proteolisis tenía lugar
con valores del t1/2 de 0,5 y 7,5 horas para insulina natural y
N-(Fmoc)_{3}insulina, respectivamente.
La rata STZ es un excelente modelo para evaluar
in vivo la terapia con insulina. En este modelo había sido
destruido aproximadamente el 90% de la función de células \beta
por estreptozotocina (STZ), según muestran los estudios histológicos
(como describen Pederson y col, 1989). Las ratas son
hipoinsulinémicas (que tienen 10-30% del nivel
normal de insulina), hiperglucémicas (>300 mg/dl; el nivel normal
de glucosa de las ratas control es de 90-100 mg/dl),
y catabólicas. Los síntomas externos visibles son aspecto
"mareado" y tres a cuatro veces de incremento de ingesta de
líquidos y excreción de orina. La ganancia en peso disminuye un
10-20% (0,3-0,8 gramos/día/rata) de
la ganancia normal de peso de las ratas control. Los cambios
patológicos en los tejidos de ratas STZ son enormes. Algunas de las
más prominentes alteraciones bioquímicas son actividad decrecida de
enzimas clave de metabolismo de glicógeno, agotamiento del glicógeno
del hígado, reducción en el número de transportadores de glucosa, en
tejidos periféricos, y un incremento en la capacidad de unión a
insulina que no va acompañada de aumento de capacidad de respuesta a
insulina.
En este modelo de rata diabética una terapia de
insulina conveniente es la administración continua de insulina (5
unidades/día/rata) a lo largo de un período de una semana: Este
tratamiento normaliza los niveles de glucosa en sangre, vuelve las
ratas diabéticas al estado anabólico, y mejora muchos de los efectos
patológicos inducidos por hiperglucemia e hipoinsulemia. Una sola
administración de insulina de actuación rápida (regular) es eficaz
a lo largo de un periodo de varias horas solamente. Además, después
de terminación del protocolo de terapia de siete días, vuelve a
aparecer la hiperglucemia en 24-30 horas.
Para evaluar si la
N-(Fmoc)_{3}-insulina tiene prolongado
efecto antidiabético, se administró a las ratas-STZ,
dos semanas después de la inducción de diabetes una sola inyección
subcutánea de insulina natural (Grupo A, 25 unidades, 1 mg, disuelto
en 1,0 ml de H_{2}O-10% DMSO, n=4), o de
N-(Fmoc)_{3}-insulina (Grupo B, 1 mg,
disuelto en 1,0 ml de H_{2}O-10% DMSO, n=4). Se
hizo un seguimiento de los niveles de glucosa en sangre y de las
ganancias diarias de peso a lo largo de un período de siete
días.
Los resultados se muestran en la Figura 5. Cada
punto representa la media aritmética \pm SEM (error típico) de
glucosa en plasma para 4 ratas. Los niveles de glucosa circulantes
del Grupo B son significativamente más bajos. Según esto, los
niveles de glucosa eran 90-110 mg/dl más bajos en el
Grupo B, comenzando dos días después de la administración, y estos
niveles de glucosa más bajos se mantenían hasta el día seis. El día
siete, no había diferencia significativa entre los dos grupos de
ratas en los niveles de glucosa en la circulación. Las ratas que
recibieron N-(Fmoc)3insulina tenían un aspecto "más
sano". La ganancia diaria de peso era casi tres veces más alta
en el Grupo B y ascendía a 0,57\pm0,08 y 1,43\pm0,14 g/rata/día,
en los Grupo A y B, respectivamente (no mostrado). Según esto, una
sola administración de
N-(Fmoc)_{3}-insulina proporcionaba una
actividad antidiabética prolongada y satisfactoria que duraba un
período de cuatro días (a continuación de un comienzo retrasado de
aproximadamente dos días). Este efecto de larga duración in
vivo puede explicarse por la capacidad del derivado de escapar
de endocitosis mediada por receptor, y también por su resistencia a
proteolisis. Además, la N-(Fmoc)_{3} insulina es muy
insoluble en soluciones acuosas. Según esto, en humanos, el efecto
de duración global puede tener lugar por sustitución del viejo
principio terapéutico, esto es, disolución gradual de insulina
insoluble "incorporada", después de administración subcutánea
junto con el nuevo principio, es decir, derivado de insulina
inactivo modificado covalentemente de vida larga en circulación que
se convierte lentamente en la hormona natural. Como este derivado de
insulina es inactivo, se pueden administrar grandes dosis sin temor
a episodios hipoglucémicos.
Para ensayar el efecto de Phe^{B1}, Lys
B^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina
para rebajar niveles de glucosa en sangre en ratas diabéticas
experimentales, se trataron ratas-STZ, 9 días
después de la inducción de diabetes, con una única inyección s.c. de
N-Fmoc_{2}-insulina (Grupo A, 3
mg/rata, en 2,0 ml de DMSO al 20%, n=5), o una sola inyección s.c.
de insulina de actuación larga (NPH-insulina humana,
Humulina N, HI-310) (Grupo B, 0,75 ml (3 mg) por
rata, n=5). El Grupo C (n=5) recibió solo vehículo (2,0 ml de DMSO
al 20%). Los niveles de glucosa en sangre se determinaron
diariamente.
Los resultados se muestran en la Figura 6 en que
la línea de puntos horizontal indica la media aritmética de glucosa
en plasma para ratas de control. Como se muestra en la Figura 6, una
sola administración subcutánea de Phe^{B1},
Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina
purificada por HPLC inducía normoglucemia en un período de 4 días e
incrementaba la ganancia de peso diaria de estos modelos de ratas
STZ catabólicas (Tabla III). La
N-(Fmoc)_{2}-insulina era tan eficaz como
la preparación comercial de actuación larga (insoluble). La insulina
de actuación rápida (soluble) es eficaz para rebajar los niveles de
glucosa en sangre en este sistema experimental a lo largo de un
período de varias horas solamente (no mostrado). Esta preparación es
bastante soluble en solución acuosa (a pH 7,4), un hecho que puede
ser ventajoso sobre la
N-(Fmoc)_{3}-insulina insoluble, porque las
suspensiones no pueden administrarse con precisión por inyección
s.c.
El propio grupo Fmoc se modificó con el fin de
reducir la hidrofobicidad de Fmoc-insulina y
aumentar consiguientemente su solubilidad en agentes tampón acuosos,
así como para modificar la velocidad de reconversión a insulina.
Esto puede hacerse por introducción de grupos polares o,
preferiblemente, grupos cargados en el anillo de fluoreno, tales
como grupo halógeno, nitro, carboxilo, amino, amonio y sulfo. En
reacciones de sustitución electrófilas, el fluoreno es sustituido
primero en la posición 2 y, generalmente, la naturaleza del
sustituyente en posición 9 (por ejemplo
CH_{2}OCO-OSu) no tiene efecto alguno sobre la
orientación de la sustitución: Según esto, el tratamiento de
Fmoc-OSu con 0,9 equivalentes de ácido
clorosulfónico en diclorometano (DCM) a 0ºC, dio
(2-sulfo)Fmoc-OSu con alto
rendimiento (fórmula (i), R_{1}=SO_{3}H en la posición 2,
R_{2}=R_{3}=R_{4}=H, A=OCO-OSu). El
tratamiento con más de un equivalente dará por resultado una
sustitución también en la posición 7 del anillo de fluoreno.
Los grupos (2-sulfo)Fmoc
se introdujeron en insulina por copulación de éster
(2-sulfo)Fmoc-OSu activo para
los grupos amino de insulina. La reacción se llevó a cabo en agentes
tampón acuosos (pH 7,4) y exceso de reactivo (\sim20
equivalentes). Después de la diálisis y liofilización, el producto
volvió a ser soluble en agua. El análisis de HPLC mostró predominio
de un producto principal, aparentemente
(Sulfomoc)_{2}-insulina, determinado por
espectros de masas (m/z 6411). Cuando la reacción se llevaba a cabo
en acetonitrilo/agua, 1:1, el producto principal era
(Sulfmoc)_{3}-insulina, como se determina
por espectro de masas (m/z 6713).
La (Sulfmoc)2-insulina
revertió por completo a la hormona natural al incubarse a 37ºC
durante 36 horas a pH 8,5 (NaHCO_{3} 0,1 M), o durante 10 días a
pH 7,4 (tampón Hepes 50 mM) con valores de t1/2 de
12-15 horas y 6 días, respectivamente. Esto quedaba
probado por la desaparición del pico del derivado de insulina, junto
con la aparición del pico de la hormona natural utilizando el
procedimiento cromatográfico HPLC analítica. Hay que señalar que la
hidrólisis de (Sulfmoc)_{2}-insulina a la
hormona natural es más rápida comparada con la hidrólisis de
(Fmoc)_{2}-insulina (21 días a pH 7,4,
37ºC).
(Sulfmoc)2-insulina es
0,5% biológicamente activa y presenta una buena solubilidad en agua.
En la incubación a pH 8,5, 37ºC,
(Sulfmoc)_{2}-insulina vuelve a insulina
natural enteramente activa con valor del t1/2 de 4-6
horas a juzgar por el incremento dependiente del tiempo en potencia
biológica (ensayo de lipogénesis en adipocitos de ratas).
Para evaluar la capacidad de actuación larga de
(Sulfmoc)2-insulina, descendente en cuanto
absorción subcutánea, se administró a ratas normales una inyección
intraperitoneal única de insulina natural,
NPH-insulina, o
(Sulfmoc)_{2}-insulina. Los niveles de
glucosa en sangre se siguieron durante dos días. La Figura 3 muestra
que (Sulfmoc)_{2}-insulina inducía
hipoglucemia a lo largo de un período de 24 horas. La recuperación
desde hipoglucemia tenía lugar con un valor de t1/2 = 14 horas. En
el caso de insulina rápida y NHP-insulina, estos
valores de t1/2 ascendían a 8 (Figura 3) y 10 horas (Figura 2),
respectivamente. Según esto, una administración única de
(Sulfmoc)_{2}-insulina daba una actuación
antidiabética intermedia, que es 1,5-2 veces más
larga que la de NPH-insulina rápida. Estos
resultados están de acuerdo con la velocidad acelerada de hidrólisis
de la Sulfmoc-insulina encontrada previamente in
vitro. Según esto, el grupo ácido sulfónico en posición 2 del
anillo de fluoreno aumentaba la velocidad de abstracción de
protones en posición 9 y por lo tanto la hidrólisis de la fracción
de Sulfmoc, en 2-3 veces. Estudios previos
realizados sobre la labilidad del grupo sulfmoc ante varias bases,
mostraba una mayor sensibilidad a base que el sistema progenitor.
Además, la constante de velocidad para la liberación del grupo
Sulfmoc desde glicina, por ejemplo, era mucho más alta que la del
grupo Fmoc (factor de aproximadamente 30). Por lo tanto, el aumento
de solubilidad por introducción del grupo Sulfmoc en insulina,
reduce recíprocamente el efecto a largo plazo de este derivado.
Según esto, el principio antidiabético de larga duración, por escape
a la endocitosis mediada por receptor y degradación, se mantiene
también para los derivados de sulfmoc-insulina.
La velocidad potenciada de separación del grupo
Sulfmoc desde insulina puede ser ventajosa en ciertas aplicaciones
de administración de insulina tal como preparaciones intermedias.
Estas preparaciones tendrán obviamente el beneficio de ser
completamente solubles en tampón acuoso, en contraste con las
preparaciones comerciales disponibles. Además, se pueden introducir
otros grupos, con diversa acidez o polaridad en el anillo de
fluoreno. Por lo tanto, el control del tipo y número de grupos
introducidos en el grupo Fmoc puede determinar el grado de
solubilidad y la velocidad de reactivación de la insulina
modificada.
Se disolvió
N-(Fmoc)_{3}-insulina (64,5 mg; 10
\mumoles; 60 \mumoles de fracciones carboxílicas, es decir,
pertenecientes a 4 Glu intracadena y 2 radicales de terminal C) en 8
ml de dimetilformamida (DMF) (Lab. Scan., Dublin, Irlanda) junto con
o-nitrofenol (250 \mumol; 35 mg) ó
N-hidroxisuccinimida (250 \mumoles; 28 mg) y la
solución se enfrió a 4ºC. Se añadió una solución de
N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC; 250 mmoles; 53
mg) en 0,5 ml de DMF y la mezcla de reacción se mantuvo 1 hora a
4ºC y después 6 horas a temperatura ambiente. La
N,N-diciclohexil urea precipitada se separó por
centrifugación y los ésteres con o-nitrofenilo o
N-hidroxisuccinamida, respectivamente, de
N-(Fmoc)_{3}-insulina se hicieron
precipitar con éter seco enfriado con hielo. Se lavó dos veces el
sólido con éter seco, se secó y se disolvió en 8 ml de DMF. Se
añadió una solución de 9-fluorenilmetanol (250
\mumol; 50 mg) e imidazol (250 \mumoles; 17 mg) en DMF. Se dejó
reposar la mezcla de reacción durante toda la noche a temperatura
ambiente. La precipitación con éter seco condujo a 62 mg de
N-(Fmoc)_{3},C-(Fm)_{n}-insulina.
El productoprincipal de reacción fue éster
hexa-9-fluorenilmetílico de
C-(Fm)_{6} o N-(Fmoc)_{3}-insulina
(n=6).
Para la preparación de
t-butiloxicarbonil
(t-Boc)_{3}-insulina, se
añadió dicarbonato de
di-terc-butilo (56 mg, 258
\mumoles) a una suspensión enfriada con hielo, agitada, de
insulina (100 mg, 17,2 \mumoles) y trietilamina (174 mg, 172
\mumoles) en DMF (4 ml). Se dejó templar la mezcla de reacción a
temperatura ambiente y se agitó durante 5 horas (gradualmente se
hizo transparente). Se añadió entonces acetato de etilo hasta que la
solución se volvió turbia, se añadió a continuación éter, y el
precipitado se centrifugó y se lavó dos veces con éter. El sólido
bruto resultante (95 mg) se utilizó después sin purificación. La
HPLC analítica mostró un producto principal que eluía a los
27,5
minutos.
minutos.
\newpage
El producto se disolvió en 10 ml de DMF y se
trató con o-nitrofenol o
N-hidroxisuccinamida, como antes, para dar los
correspondientes ésteres activos. Estos se hicieron reaccionar con
9-fluorenilmetanol, en presencia de imidazol, como
antes, y se obtuvo N-(t-Boc)3,
C(Fm)_{n}-insulina como un polvo (87
mg) después de precipitación con éter seco. El polvo se secó al
vacío sobre P_{2}O_{5} y después se trató durante 1 hora a
temperatura ambiente con 5 ml de ácido trifluoroacético para separar
los grupos protectores t-Boc de terminal N. Durante
este proceso, se disolvió la mayor parte de la insulina. La adición
de éter seco enfriado con hielo condujo a un polvo que se aisló por
centrifugación y se lavó cuidadosamente con éter seco. El
rendimiento del producto, principalmente
C-(Fm)_{6}-insulina, era 79 mg.
En condiciones fisiológicas normales, los niveles
de hGH en sujetos sanos se incrementan diariamente de una manera
pulsátil varias veces (de día y de noche). La hGH (hormona humana
del crecimiento) es una especie de vida corta. El protocolo
terapéutico actual incluye una inyección única diaria de hGH y es
probablemente eficaz durante varias horas solamente. Es muy deseable
una preparación de hGH (de liberación lenta) de actuación larga que
suministre un nivel basado en un umbral de hGH durante 24 horas del
día y de la noche.
Se disolvió hGH natural (Biotecnology General,
Rehovot, Israel; 9,2 mg) en NaHCO_{3} 0,1 M (2,0 ml; pH 8,5), se
añadió DMSO (0,1 ml) (concentración de DMSO final, \sim5%) y la
solución se enfrió a 0ºC. Se añadió entonces un equivalente de
Fmoc-OSu en 10 \mul (tomados de una solución de
reserva de 18,5 mg/ml en DMSO) y la reacción tuvo lugar durante 30
minutos a 0ºC, bajo agitación moderada. Se añadieron entonces otros
10 \mul (que contenían 1 equivalente de Fmoc-OSu)
y al cabo de 30 minutos se dializó la mezcla durante toda la noche a
7ºC frente a H_{2}O. La HPLC semipreparativa condujo a dos picos
de proteína principales que correspondían a hGH natural (\sim20%
del total; tiempo de retención 30 minutos; columna
RP-8; 250 x 10 mm; Merck) y Fmoc-hGH
modificada (\sim80% del total; tiempo de retención 32
minutos).
La Tabla V muestra la conversión de
Fmoc-hGH (1 mg/ml) a hGH natural al incubar a 37ºC
en NaHCO_{3} 0,1 M (pH 8,5). A los puntos de tiempo indicados, se
tomaron partes alícuotas y se sometieron al procedimiento de HPLC
analítica (columna RP-8). La conversión de
Fmoc-hGH a hGH natural se evaluó por el incremento
del área del pico correspondiente a hGH natural.
Como se muestra en la Tabla V,
Fmoc-hGH tiene un 15% de la potencia de unión a
receptor de la hormona natural. La incubación de
Fmoc-hGH a pH 8,5 (37ºC) durante aproximadamente 6
días o a pH 10,5 (37ºC) durante cuatro días condujo a hGH natural
completamente activa, como se ve en el análisis HPLC y por ensayos
de unión a receptor.
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto | Tratamiento | Capacidad de desplazar | Conversión a hGH^{2} |
hormona yodada^{(1)} (%) | (%) | ||
hGH | 100 | ||
Fmoc-hGH | 15 | ||
Fmoc-hGH | 1 día, pH 10,5 | 25 | |
Fmoc-hGH | 4 días, pH 10,5 | 100 | |
Fmoc-hGH | 1 día, pH 8,5 | 23 | |
Fmoc-hGH | 2 días, pH 8,5 | 62 | |
Fmoc-hGH | 6 días, pH 8,5 | 100 | |
(1) \begin{minipage}[t]{145mm} Desplazamiento de hGH yodada llevado a cabo según Gertler y col., 1984. La hGH natural era completamente estable bajo las condiciones aplicadas a Fmoc-hGH (pH 10,5, 37^{o}C, 4 días).\end{minipage} | |||
(2) \begin{minipage}[t]{145mm} Se incubó Fmoc-hGH (1 mg/ml) a 37^{o}C en NaHCO_{3} 0,1 M (pH 8,5). En los puntos de tiempo indicados, se sacaron partes alícuotas y se sometieron a HPLC analítica. La conversión de Fmoc-hGH a hGH natural se evaluó por incremento del área del pico correspondiente a hGH natural \end{minipage} | |||
La cefalexina [ácido
7-(D-\alpha-aminofenilacetamido)desacetoxi-efalosporánico]
es un antibiótico \beta-lactámico con un amplio
espectro de actividad frente a bacterias
Gram-negativas y Gram-ositivas. Se
prepararon dos cefalexinas monosustituidas por unión covalente de
una fracción de fluorenilmetilo (Fm) al grupo amino
(N-Fmoc-cefalexina) o al grupo
carboxílico via esterificación
(cefalexina-O-Fm).
A una suspensión agitada de hidrato de cefalexima
(Sigma, EEUU; 50 mg, 0,144 mmoles) y trietilamina (29 mg, 0,288
mmoles) en diclorometano (DCM; 2,5 ml), se añadió, gota a gota, una
solución de Fmoc-OSu (145 mg, 0,432 mmoles) en DCM
(2,5 ml) a lo largo de 5 minutos. La mezcla de reacción, que se hizo
transparente al cabo de 1 hora, se agitó durante toda la noche a
temperatura ambiente, tiempo durante el cual se volvió turbia.
Después de concentrar al vacío, se añadió éter a la mezcla, y el
precipitado resultante se filtró y se lavó dos veces con éter. Se
disolvió el filtrado en DCM y se extrajo con agua acidulada (pH
\sim2), agua y salmuera, y se secó sobre MgSO_{4}. anhidro
Después de filtración y concentración de la solución, se añadió
éter. El producto precipitado se filtró y lavó con éter para dar
Fmoc-cefalexina como producto puro tal como se
determina por TLC (cromatografía en capa fina)
(1-butanol:ácido acético:agua, 8:1:1) y por el
procedimiento de HPLC analítica (elía a los 33 minutos, mientras
que, en condiciones similares, la cefalexina natural eluye a los 6,5
minutos). El análisis por espectro de masas (Fast Atom
Bombardement, FAB - Bombardeo de átomos rápidos, BAR) dio el peso
molecular esperado para
N-Fmoc-cafalexina (m/z 570,1
[M+H]^{+}).
Para la determinación de las potencias
antibacterianas de cefalexina natural y
Fmoc-cefalexina, se incubaron tubos que contenían
una suspensión diluida de Staphylococcus aureus (0,5 ml/tubo
de vidrio) durante 6 horas a 37ºC en la ausencia y presencia de
concentraciones incrementadas de cefalexina natural o
Fmoc-cefalexina, antes y a continuación del
tratamiento especificado en la Tabla VI. En los puntos de tiempo
indicados, se tomaron partes alícuotas y se analizaron en cuanto a
su potencia para detener el crecimiento de Staphylococcus
aureus. El crecimiento bacteriano se evaluó entonces por el
incremento de la turbidez medida espectroscópicamente a
700 nm.
700 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto | Incubación a pH | Concentración que inhibe el 50% | Potencia antimicrobiana^{(1)} |
7,4, 37ºC | del crecimiento bacteriano | (%) | |
(\muM) (IC_{50}) | |||
cefalexina natural | \hskip0,5cm - - - - - - - - | 0,9 | 100 |
cefalexina natural | 1 día | 1,5 | 100 |
cefalexina natural | 3 días | 5,3 | 100 |
cefalexina natural | 6 días | 18 | 100 |
Fmoc-cefalexina | \hskip0,5cm - - - - - - - - | 23 | 6 |
Fmoc-cefalexina | 1 día | 15 | 10 |
Fmoc-cefañexina | 3 días | 9 | 59 |
Fmoc-cefalexina | 6 días | 4,5 | 100 |
(1) Los números se refieren a la potencia de la cefalexina empleada como control en todos los ensayos. |
\newpage
Se llevaron a cabo incubaciones a pH 7,4 con
cefalexina natural o con
N-Fmoc-cefalexina (100 \mug/ml) en
agente tampon Hepes 50 mM, DMSO al 20%.
Como se muestra en la Tabla VI, la
N-Fmoc-cefalexina es inactiva
(\sim6%). La preincubación a lo largo de un período de 6 días (pH
7,4, 37ºC) genera cefalexina natural como queda comprobado por
seguimiento con HPLC, y por recuperación de aproximadamente el 50%
de la potencia antibacteriana del compuesto progenitor. La
cefalexina natural sufre una inactivación espontánea substancial
dependiente del tiempo en la incubación, mientras que la
N-Fmoc-cefalexina es
significativamente más estable en las mismas condiciones. Según
esto, la acción prolongada esperada de
N-Fmoc-cefalexina in vivo es
probable que se origine tanto por una mayor estabilidad química a pH
y temperatura fisiológicos como también por escapar a la degradación
La N-Fmoc-cefalexina es más estable
a hidrólisis por penicilinasa que el compuesto progenitor (no
mostrado).
\vskip1.000000\baselineskip
A una suspensión enfriada con hielo y agitada de
hidrato de cefalexina (50 mg, 0,144 mmoles) y trietilamina (29 mg,
0288 mmoles) en DCM (3 ml), se añadió una solución de dicarbonato de
di-terc-butilo (94,2 mg, 0,432
mmoles) en DCM (2 ml). La mezcla de reacción se dejó templar a
temperatura ambiente y se dejó agitando durante toda la noche hasta
que no se observaba material de partida positivo a ninhidrina por
cromatografía TLC (1-butanol; ácido acético;
H_{2}O, 8:1:1). La mezcla de reacción se diluyó entonces con DMC
(2,5 ml), se extrajo con agua acidulada (pH-2),
agua y salmuera, y se secó sobre MgSO_{4}. Después de concentrar,
se hizo precipitar el producto con éter de petróleo (punto de
ebullición 40-60ºC), se filtró y se lavó de nuevo
con éter de petróleo. El producto era homogéneo como se confirmó por
procedimientos cromatográficos de TLC y HPLC.
A una solución agitada enfriada con hielo de
N-Boc-cefalexina (25 mg, 0,056
mmoles), 9-fluorenilmetanol (22 mg, 0112 mmoles) y
4-dimetilaminopiridina (13,7 mg, 0,112 mmoles) en
DCM (2 ml), se añadió una solución de DCC (23,1 mg, 0,112 mmoles) en
DCM (1 ml), gota a gota, a lo largo de 20 minutos. La mezcla
resultante se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente y
la solución se filtró para separar diciclohexilurea. El filtrado se
diluyó con DCM (2,5 ml) y después se extrajo dos veces con solución
de NaHCO_{3} 1 M, ácido cítrico al 10%, agua y salmuera, y se secó
sobre MgSO_{4} anhidro. Se evaporó la solución para dar un sólido
oleoso, que se trituró con éter de petróleo para obtener el producto
Boc-cefalexina-OFm (como se confirmó
por TLC y HPLC). La fracción Boc se separó por disolución del sólido
bruto (25 mg) en 1 ml de solución de TFA:DCM (1:1 v/v). Después de
reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente, se separó el TFA
por evaporación y se disolvió el residuo sólido en isopropanol que
se evaporó entonces. Este procedimiento se repitió dos veces. El
sólido bruto fue triturado con éter de petróleo para formar el éster
puro final, como se comprueba con los procedimientos cromatográficos
TLC y
HPLC.
HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
La polimixina B (PMXB), un miembro representativo
de la familia de antibióticos ciclo-peptídicos, es
eficaz contra bacterias gram-negativas. La PMXB
contiene 5 radicales de ácido diaminobutírico que pueden modificarse
por inserción de grupos Fmoc utilizando el reactivo metilsulfato de
4-(9-fluorenilmetoxicarboniloxi)fenil-dimetilsulfonio
(Fmoc-DSP). La relación molar de reactivo
Fmoc-DSP y péptido determinará la extensión de la
modificación de la molécula de PMXB.
Para la preparación de
(Fmoc)_{2}-PMXB, se añadió, gota a gota, a
una solución agitada de PMXB (Sigma, EEUU; 10 mg, 7,2 \mumoles) y
(Fmoc)-DSP; (7,1 mg, 14,4 \mumoles) en H_{2}O (1
ml), una solución de NaHCO_{3} (0,1 M, 0,15 ml). La mezcla de
reacción que se enturbió gradualmente se mantuvo agitada toda la
noche a temperatura ambiente. Se centrifugó el precipitado
resultante, se lavó dos veces con agua, se disolvió en un pequeño
volumen de DMF y se hizo precipitar con éter para dar un sólido
bruto blanco.
Compuesto | Tratamiento | Concentración que inhibe | Potencial anti-microbiano^{(1)} |
el 50% del crecimiento | (%) | ||
bacteriano (\muM) | |||
PMXB natural | - - - - - - | 0,05 | 100 |
PMXB natural | 3 d, 37ºC, pH 8,5^{(2)} | 0,1 | 100 |
PMXB natural | 3 d, 37ºC, pH 8,5^{(2)} | 02 | 100 |
PMXB natural | 3 d, 37ºC, pH 7,4^{(3)} | 0,055 | 100 |
PMXB natural | 3 d, 37ºC, pH 7,4^{(3)} | 0,228 | 100 |
(Fmoc)_{2}-PMBX | \hskip0,5cm - - - - - - - - - | 5 | 1 |
(Fmoc)_{2}-PMBX | 3 d, 37ºC, pH 8,5^{(2)} | 0,125 | 80 |
(Fmoc)_{2}-PMBX | 6 d, 37ºC, pH 8,5^{(2)} | 0,2 | 100 |
(Fmoc)_{2}-PMBX | 3 d, 37ºC, pH 7,4^{(3)} | 0,227 | 25 |
(Fmoc)_{3}-PMBX | 3 d, 37ºC, pH 7,4^{(3)} | 0,35 | 64 |
(1) \begin{minipage}[t]{145mm} Los números se refieren a la potencia de la PMXB empleada como control a través de todos los ensayos \end{minipage} | |||
(2) \begin{minipage}[t]{145mm} La incubación se llevó a cabo a pH 8,5 con PMXB, ó (Fmoc)_{2}-PMXB (100 \mu g/ml) en NaHCO_{3} 0,1 M que contenía DMSO al 1%. \end{minipage} | |||
(3) \begin{minipage}[t]{145mm} La incubación se llevó a cabo a un pH 7,4 con PMXB, ó (Fmoc)_{2}PMXB (100 \mu g/ml) en agente tampón Hepes 50 mM (pH 7,4) que contenía DMSO al 1%. \end{minipage} |
La HPLC analítica (RP-18; 250 x 4
mm; Merck) empleando un gradiente lineal formado de 70% solución A
(0,1% de TFA en agua) y 30%. de solución B (0,1% de TFA en
acetonitrilo:agua, 75:25) hasta 100% de solución B en 40 minutos
(velocidad de flujo de 0,8 ml/minuto), mostraba un producto
principal eluido a los 39 minutos (tiempo de retención de PMXB bajo
estas condiciones es 13,5 minutos). El sólido bruto se aplicó a HPLC
preparativa para proporcionar un producto puro. El análisis de
(Fmoc)_{2}. PMXB por espectro de masas (Bombardeo atómico
rápido BAR), dio el peso molecular esperado para este compuesto (m/z
1647 [M-H]^{+})
Las potencias antibacterianas de
(Fmoc)_{2}-PMXB y de PMXB natural se
ensayaron bajo varias condiciones experimentales como sigue:
Se incubó una suspensión diluida de E.
coli (0,5 ml por tubo de ensayo de vidrio) durante 6 horas a
37ºC sin o con concentraciones incrementadas de
(Fmoc)_{2}-PMXB y PMXB natural. En los
puntos de tiempo indicados se sacaron partes alícuotas y se
analizaron en cuanto a su potencia para detener el crecimiento de
E. coli, y se evaluó entonces el crecimiento bacteriano por
medida de la turbidez a 700 nm.
Como se muestra en la Tabla VII,
(Fmoc)_{2}-PMXB es inactivo (\sim1%) y se
hidroliza ampliamente a PMXB activa con valores de t1/2 de \sim3 y
\sim1 día a pH 8,5 y 7,4 respectivamente.
La piperacilina
(4-etil-2,3-dioxopiperazincarbonil
ampicilina) es un antibiótico semi-sintético de
amplio espectro relacionado con la penicilina, que no es eficaz
cuando se administra por vía oral.
La piperacilina (carboxilo libre) se preparó a
partir de sal sódica de piperacilina (Sigma, EEUU) por extracción
ácida con acetato de etilo. La piperacilina-OFm se
sintetizó como se ha descrito para el éster de cefalexina en el
Ejemplo 8 anterior, por reacción de 1 equivalente de carboxilo con 2
equivalentes, de cada uno de 9-fluorenilmetanol,
4-dimetilaminopiridina y DCC. El sólido bruto se
recristalizó en DCM-éter, dando un producto puro como se confirma
por los procedimientos cromatográficos TLC y HPLC.
El propanolol
[(1-(isopropilamino)-3-(1-naftiloxi)-2-propanol],
un miembro representativo de la familia de beta bloqueantes, es un
antagonista \beta-adrenérgico utilizado como
antihipertensor, antianginal y anti-arrítmico. El
propanolol se une, pero no activa, al recptor
\beta-adrenérgico. La competición por estos
lugares con antagonistas \beta-adrenérgicos reduce
los estados de hipertensión patológicos. Los pacientes reciben
propanolol por vía oral sobre base diaria. Sin embargo, existe una
amplia mayoría de antagonistas \beta-adrenérgicos
que son de naturaleza hidrófila y no son adsorbidos eficazmente
cuando se administran por vía oral, por ejemplo acetilbutolol,
atenolol, betaxolol, carteolol, nadolol y sotalol.
Para la preparación de
F-moc-propanolol, se añadió, gota a
gota a lo largo de 5 minutos, una solución de
Fmoc-OSu (170 mg, 0,50 mmoles) en DCM (2,5 ml) a una
solución agitada de hidrocloruro de
(\pm)-propanolol (50 mg, 0,17 mmoles) y
trietilamina (34 mg, 0,34 mmoles) en diclorometano (DCM, 2,5
ml).
Después de agitar durante toda la noche a
temperatura ambiente, la mezcla de reacción se extrajo con agua
acidulada (pH \sim2), agua y salmuera, y se secó sobre MgSO_{4}
anhidro. La solución se evaporó para obtener un sólido bruto que se
trituró entonces con hexano para dar
Fmoc-propanolol. El producto se examinó por TLC (1
butanol: ácido acético: agua, 8:1:1) y HPLC, y demostró ser puro
(los tiempos de retención de propanolol y
Fmoc-propanolol, bajo las mismas condiciones, son 16
y 51 minutos, respectivamente). El espectro de masas (BAR) dio la
M/Z: 482,2[M+H]^{+}
correcta.
correcta.
Se analizó la potencia
\beta-adrenérgica de
Fmoc-propanolol. Los resultados se muestran en la
Figura 7. Se incubaron adipocitos de rata recién preparados durante
2 horas a 37ºC, con isoprotenerol (concentración final 1 \mug/ml,
4 \muM) y las concentraciones indicadas de propanolol (círculos),
Fmoc-propanolol (círculos llenos) o
Fmoc-propanolol que se incubó durante 7 días a 37ºC,
pH 8,5 (cuadrados). La cantidad de glicerina liberada al medio se
determinó entonces según Sechter, 1982. La IC_{50} es la cantidad
de propanolol o derivado
N-Fmoc-propanolol (en \muM) que
inhibe la mitad del máximo de liberación de glicerina mediada por
isoproterenol.
Como se muestra en la Figura 7, el
Fmoc-propanolol tiene \sim7% de la potencia de
propanolol natural. La incubación de Fmoc-propanolol
durante 7 días a pH 8,5 (37ºC) generaba 50-70% de la
potencia \beta-adrenérgica del fármaco natural. El
derivado es substancialmente hidrófobo, una característica que puede
ayudar en la absorción gastro-intestinal.
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Claims (22)
1. Un compuesto de la fórmula:
X -
Y
donde
Y es una fracción de un fármaco que lleva al
menos un grupo funcional seleccionado entre amino, carboxilo,
hidroxilo y/o mercapto, libres,y
X es un radical seleccionado de los radicales de
las fórmulas (i) a (iv):
donde R_{1} y R_{2}, iguales o
diferentes, son, cada uno, hidrógeno, alquilo, alcoxi,
alcoxialquilo, arilo, alquilarilo, aralquilo, halógeno, nitro,
sulfo, amino, amonio, carboxilo, PO_{3}H_{2}, o
OPO_{3}H_{2}; R_{3} y R_{4}, iguales o diferentes, son, cada
uno, hidrógeno, alquilo o arilo; y A es un enlace covalente cuando
el radical se une a grupo carboxilo o mercapto del fármaco Y, o A es
OCO- cuando el radical se une a un grupo amino o hidroxilo de Y, y
sales farmacéuticamente aceptables del mismo, siempre que cuando
R_{1} a R_{4} son hidrógeno y A es OCO-, Y no es una fracción de
un fármaco que contiene un grupo
O-maloniltirosilo
2. Un compuesto según la reivindicación 1,
donde Y es una fracción de un fármaco para utilización en medicina o
veterinaria seleccionado del grupo que comprende fármacos
antidiabéticos, antibióticos, antibacterianos sintéticos, fármacos
analgésicos y anti-inflamatorios, fármacos
antialérgicos y antiasmáticos, fármacos antihipercolesterolémicos,
bloqueantes \beta-adrenérgicos y fármacos
antihipertensores, fármacos antineoplásicos y fármacos
antivirales.
3. El compuesto según la reivindicación
1 donde la fracción Y está sustituida con al menos un radical X que
consiste en un radical (i) donde R_{1} es hidrógeno o sulfo y
R_{2}, R_{3} y R_{4} son hidrógeno.
4. El compuesto según la reivindicación
3 en que Y es una fracción de insulina en que los grupos amino y/o
carboxilo libres, y opcionalmente los grupos hidroxilo libres, de la
molécula de insulina, están sustituidos con al menos uno de dichos
radicales (i).
5. Un derivado de insulina según la
reivindicación 4, donde uno o más grupos amino están sustituidos con
el radical 9-fluorenilmetoxicarbonilo (i) donde
R_{1} a R_{4} son hidrógeno y A es OCO- (aquí
N-Fmoc-insulina).
6. Un derivado de insulina según la
reivindicación 4, donde uno o más grupos carboxilo están sustituidos
con el radical 9-fluorenilmetilo (i) donde R_{1} a
R_{4} son hidrógeno y A es un enlace covalente (de aquí en
adelante C-Fm-insulina).
7. Un derivado de insulina según la
reivindicación 4, donde uno o más grupos amino están sustituidos con
el radical Fmoc y uno o más grupos carboxilo están sustituidos por
el radical Fm (aquí N-Fmoc,
C-(Fm)-insulina).
8. Un derivado de insulina según la
reivindicación 4, donde uno o más grupos carboxilo están sustituidos
con el radical Fm y uno o más grupos hidroxilo están sustituidos con
el radical Fmoc (aquí C-(Fm),
O-(Fmoc)-insulina).
\newpage
9. Un derivado de insulina según la
reivindicación 4, donde uno o más grupos amino e hidroxilo están
sustituidos por el radical Fmoc y uno o más grupos carboxilo están
sustituidos por el radical Fm (aquí N, O-(Fmoc),
C-(Fm)-insulina).
10. Un derivado de insulina según la
reivindicación 4 que tiene 1 a 3 sustituyentes Fmoc en los grupos
amino libres en las posiciones Gly^{A1}, Phe^{B1} o Lys^{B29}
donde A y B son las cadenas de la molécula de insulina, seleccionado
del grupo de derivados de insulina que consisten en Gly
^{A1}-N-(Fmoc)-insulina,
Phe^{B1}-N-(Fmoc)-insulina,
Lys^{B29}-N-(Fmoc)-insulina,
Gly^{A1},Phe^{B1}-N-(Fmoc)-insulina,
Gly^{A1},Lys
^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina,
Phe^{B1},Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{2}-insulina,
y Gly^{B1}, Phe^{B1},
Lys^{B29}-N-(Fmoc)_{3}-insulina.
11. Un derivado de insulina según la
reivindicación 4 que tiene 1 a 3 sustituyentes
2-sulfo-Fmoc (aquí Sulfmoc) en los
grupos amino libres en las posiciones Gly^{A1}, Phe^{B1}o Lys
^{B29} donde A y B son las cadenas de la molécula de insulina,
seleccionado del grupo de derivados de insulina que consisten en
Gly^{A1}-N(Sulfmoc)insulina,
Phe^{B1}-N-(Sulfmoc)-insulina,
Lys^{B29}-N-(Sulfmoc)-insulina,
Gly^{A1}, Phe^{B1}
N-(Sulfmoc)_{2}-insulina, Gly^{A1},
Lys^{B29}-N-(Sulfmoc)_{2}-insulina,
Phe^{B1},
Lys^{B29}-N-(Sulfmoc)_{2}-insulina
y Gly^{B1}, Phe^{B1},
Lys^{B29}-N-(Sulfmoc)_{3}-insulina.
12. Un derivado (Fmoc, Sulfmoc o
Fm)-insulina según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 11 donde la insulina es insulina humana, bovina
o porcina natural, recombinante o mutada.
13. Una Fmoc-hormona del
crecimiento seleccionada de hormona del crecimiento humana y
bovina.
14. Una Fmoc cefalexina seleccionada de
N-Fmoc-cefalexina y éster
fluorenilmetílico de cefalexina.
15. Di-(fluorenilmetoxicarbonil)polimixina
B.
16. Ester fluorenilmetílico de piperacilina
17. Fmoc-propanolol.
18. Una composición farmacéutica que comprende
un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o una
sal farmacéuticamente aceptable de la misma, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
19. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 18 que comprende una
N-(Fmoc)-insulina según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 12.
20. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 19 que comprende
N-(Fmoc)_{3}-insulina humana natural o
recombinante y/o N-(Fmoc)_{2}-insulina
humana natural o recombinante.
21. Una composición farmacéutica según cualquiera
de las reivindicaciones 18 a 20 para inyección subcutánea,
administración transdérmica u oral.
22. Utilización de un compuesto según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 17 para la manufactura de una
composición farmacéutica.
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