KR20000029806A - 장기간-작용의약및이를포함한약제학적조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명 프로드러그 및 이의 약제학적으로 적합한 염은 약산에 민감한 작용기를 갖고 있으며, 생리학적 조건하에서 원래의 활성 의약으로 서서히 가수분해되는 능력이 있다. 상기 프로드러그는 바람직하게는, X - Y 화학식을 갖으며, 상기 화학식에서 Y는 자유 아미노, 카복실, 하이드록실 및/또는 메르캅토기에서 선택되는 최소 1종 이상의 작용기를 갖는 의약의 일부위; 그리고 X는 다음 화학식 (i) 내지 (iv)의 라디칼에서 선택되는 1종의 라디칼:
상기 화학식에서, R1및 R2는 서로 동일하거나 상이한 것으로서, 각각 수소, 알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 아릴, 알카릴, 아랄킬, 할로겐, 니트로, 설포, 아미노, 암모늄, 카복실, PO3H2또는 OPO3H2이고; R3및 R4는 서로 동일하거나 상이한 것으로서, 각각 수소, 알킬 또는 아릴이며; 그리고, A는 라디칼이 Y의 카복실 또는 메르캅토기에 결합되어 있는 경우에는 공유결합, 또는 라디칼이 Y의 아미노 또는 하이드록실기에 결합되어 있는 경우에는 OCO-이다. 상기 프로드러그의 예로서 Y가 인슐린, 인간 또는 소의 성장호르몬, 항생제, 프로파노롤 등의 일부로 있는 것이다.

Description

장기간-작용 의약 및 이를 포함한 약제학적 조성물{LONG-ACTING DRUGS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THEM}
인간의 치료 및 수의학적으로 이용되는 치료 의약은 여러 기준에 따라 구분될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 구조 단위체로 구성된 단백질성-펩티드성과 비-펩타이드성 분자로 구분이 될 수 있고, 또는 구조와는 무관하게 의약이 혈액의 흐름에 도달하는 기준에 따라 구강 흡수 의약과 다른 방법, 예컨대 주입, 비내 또는 국소투여 의약이 있다.
일반적으로, 구강흡수 화합물은 분자량이 작고, 비교적 안정하며, 친유성 (유성적)을 갖고 비-펩타이드성을 갖는다. 실질적으로, 모든 펩타이드성 및 단백질 의약은 그의 친수성 (비-친유성), 극성 및 대사적 불안정성 때문에 상기한 기준에 따라 구분될 수 없고, 항상 투입에 의해 투여되어야 한다. 더욱이, 상기 의약은 신체내에서 다양한 기작, 특히 단백질분해과정에 의해 신속하게 파괴되기 때문에, 보통 단기-생존 분자이다.
비-펩타이드성 의약은 매우 충분하게 소수성을 갖으며, 위장 통로를 통해 혈액의 흐름에 도달할 수 있다. 이의 상대적인 화학적 안정성 때문에, 비-펩타이드성 의약은 보통 장기-생존 분자이다.
단백질 및 펩타이드 의약은 중요하고 다양한 임상적 응용성을 갖는 바, 예컨대 당뇨병 치료에 있어서의 인슐린, 전립선암 치료에 이용되는 고나도트로핀-방출 호르몬 (GnRH) 상사체, 뼈-관련 장애의 치료에 있어서의 칼시토닌이 있다. 상기한 분자의 잠재성은 광대하나, 아직은 부분적으로만 연구되어 있다. 이와 같은 이유는 상기 분자의 단기-생존성 및 투여방법의 비편이성 때문이다. 항생제와 같은 비-펩타이드성 의약은 상대적으로 장기-생존성을 나타내나, 원하는 계속적 순환량을 유지하기 위해서는 일주일 또는 이보다 장기간에 걸쳐 하루에 수회의 투여를 하여야 한다.
의약의 구강 흡수는 인간 질병의 치료, 특히 장기간의 치료학적 치료에 있어서 숙원 목표이다. 의약의 구조적 변화는 구강 및 국소 흡수, 생안정성 및 궁극적으로 생물학적 유용성의 증대를 초래한다. 대부분의 접근 방법은 의약을 변형시키되, 이의 자연적 구조, 즉 생활성 구조를 보전하는 방식이다. 상기 자연적 구조는 의약의 작용지가 특별히 인지하는 것으로서 의약 효능의 전제요건이다. 그러나, 많은 경우에 있어, 상기 자연 구조는 '클리어링 머쉬너리 시스템'에 인지되어 파괴 또는 대사되고 결국 이의 처리가 가속된다. 따라서, 생활성 구조의 안정화는 종종 대사 안정성의 강화와 함께 연구된다. 상기한 목표를 달성하기 위해 포접화, 용해도 감소 및 화학적 변형과 같은 방법이 이용되고 있다.
항생제, 항바이러스제, 항고혈압제, 항염증제, 진통제, 항고콜레스테롤제, 항발암제, 항당뇨제, 성장-촉진제 및 기타 의약을 포함하는 유통되고 있거나 장래 개발될 많은 의약이, 만일 모든 펩타이드성 및 비-펩타이드성 의약이 해당되지 아니하여도, 반감기가 연장되는 것은 매우 바람직한 것이다. 특히, 특정 한계 농도 이상에서 독성을 나타내는 자연 의약과 관련된 프로드러그에 있어서 바람직하다.
따라서, 본 발명의 목적은 약 염기성 조건에 매우 민감하고 신체내 생리적 조건하에서 불활성 형태로부터 활성형태로 전환되는 것을 특징으로 하는 신규 프로드러그를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 자유 아미노, 카르복실, 하이드록실 및/또는 메르캅토기를 갖는 의약으로부터 유래되고, 본질적으로 생물학적 불활성을 나타내나 투여 후 자연적으로 서서히 본래의 활성 의약으로 전환되는 것을 특징으로 하는 프로드러그를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 개선된 대사 안정성 및 증대된 생유용성을 나타내는 프로드러그를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 의약 투여의 택일적 가능성, 예컨대 구강 또는 경피투여할 수 있고, 생리적 장벽, 예컨대 혈액-뇌 장벽을 투과할 수 있는 프로드러그를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신체내 손상부위에 특정 의약을 위치지울 수 있는 프로드러그를 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 자유 아미노, 카르복실, 하이드록실 및/또는 메르캅토기로 구성된 군으로부터 선택되는 의약의 1종 또는 2종 이상의 기가 염기에 민감하고 약 염기 조건, 예컨대 생리적 조건하에서 제거되는 작용기로 치환된 것을 특징으로 하는 신규 프로드러그에 관한 것이다.
서방성 의약에 대한 본 발명의 새로운 개념은 신규하고, 일반적으로 보다 소수성을 나타내는 의약 유도체로의 유도를 포함한다. 상기 접근 방법에 있어서, 자연 형태, 생물학적 효능 및 파괴시스템에 의한 의약의 인지는 유지되는 것보다 상실되는 것이 바람직하다. 한편, 상기 방법의 장점은 변형된 유도체가 생체내 조건하에서 자연적으로 서서히 가수분해되어 자연 활성 의약을 형성한다는 것이다.
본 발명의 구현예에 있어서, 프로드러그는 다음의 화학식으로 표현된다:
X - Y
상기 화학식에서,
Y는 자유 아미노, 카복실, 하이드록실 및/또는 메르캅토기에서 선택되는 최소 1종 이상의 작용기를 갖는 의약의 일부위; 그리고
X는 다음 화학식 (i) 내지 (iv)의 라디칼에서 선택되는 1종의 라디칼:
상기 화학식에서, R1및 R2는 서로 동일하거나 상이한 것으로서, 각각 수소, 알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 아릴, 알카릴, 아랄킬, 할로겐, 니트로, 설포, 아미노, 암모늄, 카복실, PO3H2또는 OPO3H2이고; R3및 R4는 서로 동일하거나 상이한 것으로서, 각각 수소, 알킬 또는 아릴이며; 그리고, A는 라디칼이 Y의 카복실 또는 메르캅토기에 결합되어 있는 경우에는 공유결합, 또는 라디칼이 Y의 아미노 또는 하이드록실기에 결합되어 있는 경우에는OCO-이다.
본 발명에 있어서, Y는 자유 아미노, 카르복실, 하이드록실 및/또는 메르캅토기로부터 선택되는 최소 1종 이상의 작용기를 갖는 인간 및 수의학적 용도의 의약의 일부위로서, 상기 의약은 다음과 같으나, 이에 한정되는 것은 아니다:
인슐린과 같은 항당뇨제; 인간성장호르몬, 소성장호르몬과 같은 성장 촉진제; 겐타마이신, 네오마이신 및 스트렙토마이신과 같은 아미노글리코시드, 아목시실린, 암피실린, 피페라실린 및 세팔로스포린 (예: 세파클로, 세프미녹스 및 세팔렉신)과 같은 페니실린과 같은 β-락탐, 카보마이신 및 에리스로마이신과 같은 마크로리드, 그리고 바시트라신, 그라미시딘 및 폴리믹신과 같은 폴리펩타이드 항생제; 트리메토프림, 피로미드산 및 설파메타진과 같은 합성 항균제; 아세트아미노펜, 아스피린, 이부페낙, 인도메타신과 같은 진통제 및 항염증제; 암렉사녹스 및 크로몰린과 같은 항알러지제 및 항천식제; 크로피브르산, 옥시니아크산 및 트리파라놀과 같은 항고콜레스테롤제; 부프라노롤, 카프토프릴, 인데노롤, 프로프라노롤 및 4-아미노부타노산과 같은 β-아드레날린성 차단제 및 항고혈압제; 다우노루비신, 아자시티딘, 6-메르캅토퓨린, 인터페론, 인터루킨-2, 메토트렉세이트, 택솔 및 빈블라스틴과 같은 항종양제; 아시클로비르, 간시클로비르, 아만타딘, 인터페론, AZT 및 리바비린과 같은 항바이러스제. 본 발명에 있어서 의약은 페로몬 또한 포함한다.
본원에서 R1, R2, R3및 R4의 정의에 이용되는 "알킬", "알콕시", "알콕시알킬", "아릴", "알카릴" 및 "아랄킬"은 탄소수 1-8, 바람직하게는 1-4의 알킬 라디칼, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 및 부틸 그리고, 탄소수 6-10의 아릴 라디칼, 예를 들어 페닐, 나프틸을 표현하는 데 사용된다. "할로겐"은 브로모, 플루오로, 클로로 및 요도를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 작용기는 라디칼 (i)이며, 이때 R1, R2, R3및 R4는 수소이고, A는 OCO-, 즉 공지된 9-플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc) 라디칼이며, 이는 펩티드 합성에서 아미노기의 일시적으로 가역적 보호하는데 널리 이용되는 것이다 (참조: L.A. Carpino, Acc. Chem. Res. (1987) 20, 401-407). Fmoc기는 펩티드 합성에 있어서 특히 적합한 바, 이는 도입 및 제거시 조작이 용이하고, 펩티드 합성에서 필수요건인 우수한 안정성을 갖으며, 정제가 용이하기 때문이다. 더욱이, 이와 연관된 9-플루오레닐메틸 (Fm)기는 예컨대 아미노산의 카르복실기의 가역적 마스킹에 유용하다. 생성물인 9-플루오레닐메틸 에스테르 (Fm-에스테르)는 약염기 처리에 따라 β-제거 반응경로에 의해 자유 카르복실 작용기를 형성하며, 따라서 의약의 카르복실기의 가역적 마스킹에 유사한 방법으로 이용될 수 있다. Fmoc-기는 또한 티로신, 세린 및 트레오닌의 하이드록실기의 가역적 보호에 유사한 용도를 갖는다.
R1및 R2중 최소 하나가 2 또는 7 위치에서 할로겐, 바람직하게는 염소 또는 브롬인 할로겐화 Fmoc 라디칼 (i); 2-클로로-1-인데닐메톡시카보닐 (CLIMOC) 라디칼 (ⅱ); 1-벤조[f]인데닐메톡시카보닐 우레탄 (BIMOC) 라디칼 (ⅲ); 우레탄 설폰 라디칼 (ⅳ) 및 상기 (i) 내지 (ⅳ)에 대응하는 A가 공유결합인 라디칼은 Fmoc 및 Fm과 유사하게 의약의 자유 아미노, 타복실, 하이드록실 및 메르캅토기의 치환에 이용될 수 있으며, 이에 생리적 조건과 같은 염기성 하에서 상기 작용기의 제거에 대한 광범위의 민감도를 제공할 수 있다. 사실, 상기 (i) 내지 (ⅳ)의 라디칼은 중성 또는 약염기 pH 및 약한 조건에서 가수분해되는 화합물의 일반적 군에 속하는 것으로서, 예를 들어 펩티드 합성에서 α- 및 ε-아미노기의 일시적인 가역적 보호에 이용되며 약염기성 조건 하에서 β-제거 반응에 의해 아미노기로부터 제거될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (i) 내지 (ⅳ)의 라디칼 바람지하게는 아미노 및/또는 하이드록실 부위에 공유결합된 Fmoc 또는 카복실 및/또는 메르캅토 부위에 공유결합된 Fm은 생체액내 생리적 조건, 즉 pH 7.4 및 37℃에서 가수분해 (β-제거를 통해) 되어 자유 아미노, 하이드로시, 메르캅토 또는 카복실 작용기로 되돌아 간다.
본 발명의 프로드러그는 의약과 상기 (i) 내지 (ⅳ)의 라디칼를 포함하는 적합한 시약의 반응에 의해 제조된다. 9-플루오레닐메틸 (Fm)의 여러 유도체가 이용될 수 있는 바, 예를 들어 아미노기에 매우 특이적인 9-플루오레닐메틸-N-하이드록시석시니마이드 (Fmoc-Osu); 아미노 및 하이드록실 라디칼과 반응하여 공유 결합하는 9-플루오레닐메톡시카보닐카보닐 클로라이드 (Fmoc-Cl); 메르캅토 라디칼과 반응하여 S-Fm 유도체 (Bodanszky and Bednar다, 1982)를 형성하는 9-플루오레닐메틸플루오렌 (Fm-Cl); 그리고 카복실기와 반응하여 에스테르화하는 9-플루오레닐메탄올 (Fm-OH)이 있다.
염기적 조건에 민감하고 아미노, 카복실, 하이드록실 또는 메르캅토기로부터 β-제거와는 다른 경로로 제거되는 작용기도 이용될 수 있으나, 이는 과도한 조작을 요구하여 의약의 보호화에는 적합하지 않다. 한편, 아미노기로부터 의 제거에 있어서 Fmoc와 유사한 용이성을 갖는 트리플루오로아세틸기 (TFA)는 강한 독성이 있어서 TFA-유도 의약은 치료용으로는 적합하지 않다. 이와는 반대로, Fmoc-아미노산, 예컨대 Fmoc-루이신은 실험용 동물 모델에서 낮은 독성을 나타내었다 (Burch et al., 1991).
본 발명은 또한 본 발명에 따른 프로드러그 및 약제학적으로 적합한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 신체내에서 불활성 형태로부터 생활성 형태로 화학적 변형이 가능하고, 약 염기성에 민감한 작용기를 갖는 신규한 장시간-작용 프로드러그에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 플루오레닐메톡시카보닐 (Fmoc)- 및 플루오레닐메틸 (Fm)-치환 프로드러그 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
도 1은 셀-프리 생물학적 분석 (인슐린 수용체 티로신 키나제의 농축액에 의한 [폴리(Glu4Tyr)]의 인산화)에 의한 LysB29-N-(Fmoc)1-인슐린 (폐쇄 사각형), PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린 (열린 사각형) 및 GlyA1, PheB1, LysB29-N-(Fmoc)3-인슐린 (모든 아미노기가 치환된 형태, 열린 원형)의 시간에 따른 활성 (pH 7.4, 37℃)을 나타낸 그래프,
도 2는 (Fmoc)2-인슐린 (10% DMSO 2 ㎖ 내 3 mg/래트) 및 NPH-인슐린 (3 mg/래트)의 단독 복강투여에 따른 정상 래트의 혈당량에 대한 효과를 나타내는 그래프,
도 3은 (Sulfmoc)2-인슐린 및 자연 인슐린 (둘 모두 1 ㎖ 물 내 3 mg/래트)의 단독 복강투여에 따른 정상 래트의 혈당량에 대한 효과를 나타내는 그래프,
도 4는 인슐린 (열린 사각형) 및 GlyA1, PheB1, LysB29-N-(Fmoc)3-인슐린 (폐쇄 마름모)의 트립신 및 카이모트립신의 혼합물에 의한 분해를 나타내는 그래프,
도 5는 GlyA1, PheB1, LysB29-N-(Fmoc)3-인슐린 (폐쇄 원형) 및 자연 인슐린 (열린 사각형) 투여에 따른 스트렙토조토신 (STZ)-처리 당뇨 래트의 혈당량을 나타낸 그래프,
도 6은 PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린의 단독 투여에 따른 STZ-처리 고혈당 래트의 혈당량 저하를 나타내는 그래프,
도 7은 N-Fmoc-프로프라노롤의 항온처리에 따른 활성 프로프라노롤의 생성에 의한 β-아드레날린성 길항력을 나타내는 그래프.
본 발명은 의약 투여의 보다 개선된 경로를 개발하고 이에 따른 의약 안정성 및 생활성을 개선하기 위한 새로운 개념에 따라 발명된 프로드러그에 관한 것이다. 본 발명의 새로운 접근에 따르면, 의약의 자연적 구조, 생물학적 효능 및 목적지-인식 능력은 보전되는 것보다 상실되는 것이 바람직하나, 적용후에는 상기 변형된 의약은 생체내에서 원래의 활성분자로 자연적으로 천천히 되돌아간다.
본 발명의 새로운 개념에 따르면, 현재의 많은 의약은 불활성 프로드러그로 변형이 가능한 바, 상기 프로드러그는 유기체내에서 일반적 및 수용체-매개 분해기작을 피함으로써 장기-생존성을 갖는다. 본 발명의 프로드러그는 생체내 생리학적 조건하에서 원래의 의약으로 균일하게 자연적으로 재생되도록 개발된 것이다. 본 발명 프로드러그의 생산에 유용한 다양한 화학적 방법을 통해 재활성 속도를 필요에 따라 빠르게 또는 느리게 할 수 있다. 따라서, 프로드러그는 용해도 감소와 같은 물리적 특성을 갖도록 제조될 수 있으며, 이에 흡수속도를 감소시킬 수 있다. 더욱이, 혈액순환계에서의 자연적 재활성 특징과 함께 프로드러그의 소수성 지표의 변화는 구강 비흡수 의약을 위장 투여 프로드러그로 전환시킬 수 있다.
본 발명 프로드러그는 변형된 곤충 페로몬 뿐만 아니라, 인간 및 동물용 변형 의약을 포함한다.
본 발명의 한 측면에 있어서, 프로드러그는 인슐린이다. 현재, 인슐린은 주로 당뇨병, 고혈당으로 특징되는 여러 질환, 지질, 탄수화물 및 단백질의 이상 대사 및 혈관질환으로 인한 합병증의 증가된 위험의 치료제로 이용되고 있다. 대부분의 환자들은 임상학적으로 인슐린-의존 (IDDM, 타입 Ⅰ) 또는 인슐린-비의존 (NIDDM, 타입 Ⅱ) 당뇨병으로 구분될 수 있다. 서구사회에 있어서 당뇨환자의 약 90%는 타입 Ⅱ이고 나머지는 타입 Ⅰ이다. 미국에 있어서 타입 Ⅱ 환자의 약 70%는 비만 증세가 있는 바, 상기 비만은 인슐린 내성을 야기시킬 수 있는 요소이다. 타입 Ⅰ 당뇨에 있어서는 췌장 β-세포의 고도하고 선택적인 손상이 있고 저인슐린증 상태가 된다. 한편, 타입 Ⅱ 당뇨환자의 경우에는 랑게르한스섬으로부터 β-세포의 과도한 손상이 발견되지 아니하며 24시간 동안 인슐린의 혈장내 농도는 정상적이거나 높게 나타나는 바, 이는 호르몬의 작용에 대한 주위적 내성 때문이다. 그럼에도 불구하고, 타입 Ⅱ 당뇨환자는 비교적 인슐린이 결핍되어 있는 바, 이는 정상적 췌장 β-세포는 고혈당증세에 대해서는 정상적인 경우보다 보다 많은 양의 인슐린을 분비하여야 하며, 이에 따라 인슐린에 대한 일반적 내성에서 유글리세미아를 유지하도록 해준다.
당뇨병의 모든 형태는 인슐린 순환양의 감소 (인슐린 결핍) 또는 인슐린에 대한 말초조직의 반응성 감소 (인슐린 내성)에 기인하며, 이는 인슐린의 작용의 반대적 작용을 하는 호르몬 (글루카곤, 성장 호르몬, 코르티솔 및 카테콜아민)의 과도한 양과 같이 발생된다. 상기 호르몬들의 이상은 탄수화물, 지질, 케톤 및 아미노산 대사의 변화를 야기하며, 이러한 증상의 중심에 있는 것은 고혈당증이다.
혈장에 있어서 인슐린의 반감기는 약 5-6분이다. 인슐린의 분해는 주로 간에서 발생되며 신장 및 근육에서도 다소 분해된다. 간에 도달한 인슐린의 약 50%는 문맥에서 파괴되며 일반적인 순환계에는 도달하지 못한다. 인슐린은 신장의 사구체에서 여과되며 신소관에서 재흡수되어 파괴된다.
간에서의 인슐린 단백질 분해는 주로 수용체 관여 기작에 의해 이루어진다. 인슐린이 수용체에 결합한 후 형성된 복합체는 엔도좀이라 불리는 작은 소낭 형태로 세포내로 들어오고 이 곳에서 파괴가 개시된다. 또한, 인슐린은 리소좀으로 운반되어 파괴되기도 한다. 간세포에 있어서 세포내로 들어온 약 50%의 인슐린이 파괴된다.
인슐린은 당뇨성 케톤산증의 치료, 고혈당성 비-케톤성 코마 및 타입 Ⅰ 및 Ⅱ 당뇨환자의 치료에 있어서 매우 중요하다. 인슐린의 피하투여는 음식 및/또는 저혈당제에 의해 적절하게 조절되지 않는 모든 타입 Ⅰ 및 대부분의 타입 Ⅱ 환자의 주치료 방법이다. 모든 경우에 있어서 목적은 저인슐린증 및 고혈당증에 의해 기인하는 불균형 대사의 모든 경우, 그리고 혈당을 정상화하는 것이다.
인슐린의 피하 투여에 따른 장기 치료는 영양분 섭취에 반응하여 신속하게 증감하는 것과 동일하지는 않으며, 간에 대한 작용보다는 말초적으로 작용을 하지만 상당한 성공을 이루고 있다.
피하투여에 이용되는 인슐린 제제는 전통적으로 작용기간에 따라 단기간, 중기간 또는 장기간-작용 인슐린으로 분류되며, 그 근원에 따라 분류되기도 한다. 인간 인슐린은 현재 광범위하게 적용이 되고 있으며, 이론적으로 인간 인슐린과 1-3개의 아미노산이 다른 돼지 및 소의 인슐린보다 덜 항원적이다. 그러나, 고도로 정제된 경우에는 상기 세 종류의 인슐린 모두 면역반응을 자극하는 정도가 낮다. 중성 pH에서 제제는 일반적으로 안정되고 실온에서 장기간 보관이 가능하다. 전통적인 치료목적을 위하여 인슐린의 투여량 및 농도는 단식 래비트에서 정상 혈당을 유도하는 데 필요로 하는 양에 따라 유니트 (U)로 표현한다. 인슐린의 균일한 제제는 약 25 U/mg을 포함한다. 상품화된 인슐린 제제는 거의 100 U/㎖의 용액상태로 공급된다.
단기간 또는 빠른-작용 인슐린은 중성 pH의 완충액에 용해된 아연 인슐린 결정의 용해성 제제로서, 이는 식사 30-45전에 일반적으로 투여된다. 상기 제제는 가장 빠른 작용개시를 나타내며 가장 짧은 생존을 나타낸다.
안정된 대사 조건하에서 조절된 인슐린은 일반적으로 중간체 또는 장기간-작용 제제와 함께 투여된다. 중기간-작용 인슐린은 수용액에서 용해도가 단기간-작용 인슐린보다 낮은 바, 이 인슐린은 피하투여후 더욱 천천히 파괴되며 이의 작용시간도 연장된다. 가장 많이 사용되는 두 종류 제제 NPH 인슐린 (NPH는 중성 프로타민 하게도른을 나타낸다), 즉 프로타민 설페이트의 첨가에 의해 변형된 인산염 완충액내의 아연-인슐린 결정의 현탁액, 그리고 렌테 인슐린, 즉 인슐린의 용해도를 최소화하기 위한 염화아연의 첨가에 의해 변형된 아세트산 완충액내의 인슐린 현탁액이 있다.
단기간-작용 인슐린은 0.4-7 시간 그리고 중기간-작용 인슐린은 1.5-20시간 작용이 기대되므로, 상기 두 종류 인슐린의 조합의 양 및 적합한 시간을 선택하기 위해서는 다양한 요소, 즉 영양상태, 야간 (단식) 저혈당증, 및 호르몬에 대한 길항-조절 호르몬의 활성이 증가할 때, 즉 조간 고혈당증 등을 고려하여야 한다. 고속-작용 및 장기간 또는 중기간-작용 인슐린이 동시에 투여되는 경우, 이러한 조합체의 단점은 혼합후 고속-작용 인슐린의 일부가 장기간 또는 중기간-작용 인슐린의 과량의 Zn2+또는 프로타민과 복합체를 형성하여 중기간 및 장기간-작용 인슐린으로 전환되는 것이다.
장기간-작용 인슐린, 예컨대 울트라렌테 인슐린 또는 아연-인슐린 또는 프로타민-아연-인슐린 현탁액 등은 아연, 아연과 프로타민이 인슐린의 불용성 제제를 얻기 위하여 과도하게 첨가된 것이다. 상기 인슐린은 아연-인슐린의 소립자의 현탁액이고 입자크기에 있어서만 서로 상이하고 이는 작용시간을 결정하는 요소이다. 조절 인슐린과는 다르게, 울트라렌테 인슐린은 작용 개시가 매우 느리고 긴 작용곡선 (평탄)을 나타낸다. 상기 인슐린은 하루동안 인슐린의 낮은 기본적 농도를 제공하지만, 이와 같은 장기간의 반감기는 최적 약물량의 결정을 어렵게 하고 정상-상태 농도를 달성하기 위해서는 치료 기간이 길어진다는 문제점이 있다. 소 및 돼지의 울트라렌테 인슐린은 인간 울트라렌테 인슐린보다 보다 장기화된 작용을 나타낸다. 로딩량으로서 1일 복용량으로 3회 치료를 개시하고, 이어 1회 또는 2회의 1일 주입을 행하는 것이 바람직하다.
인슐린에 있어서 변형이 가능한 것은 3개의 아미노기 및 6개의 카복실기가 있다. 본 발명의 인슐린 유도체는 A 및 B-사슬에서 상기 라디칼 (i) 내지 (iv) 중 1종 이상에 의해 치환된 것으로서 GlyA1및 PheB1의 말단 아미노기, LysB29의 ε-아미노기, AsnA21및 ThrB30의 말단 카복실기, 그리고/또는 GluA4, GluA17, GluB13, GluB21의 말단 카복실기 중 하나 이상에서 치환이 이루어진다. 더불어, 상기 치환된 카복실 및/또는 아미노 인슐린 유도체는 ThrA8, SerA9, SerA12, TyrA14, TyrA19, SerB9, TyrB16, TyrB26, ThrB27및 ThrB30의 자유 하이드록실기 중 하나 이상에서 상기 라디칼 (i) 내지 (iv)의 1종 이상에 의해 더욱 치환된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 인슐린 유도체는 GlyA1및 PheB1의 말단 자유 아미노기, 그리고/또는 LysB29의 ε-아미노기에서 하나 이상의 Fmoc 부위에 의해 치환되어, 인슐린 분자의 A1, B1및/또는 B29에서 1-3의 Fmoc 치환체를 갖는 인슐린 유도체를 얻으며, 특히, 상기 유도체는 GlyA1-N-(Fmoc)1-인슐린, PheB1-N-(Fmoc)1-인슐린, LysB29-N-(Fmoc)1-인슐린, GlyA1, PheB11-N-(Fmoc)2-인슐린, GlyA1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린, PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린 및 GlyA1, PheB1, LysB29-N-(Fmoc)3-인슐린이다.
활성 Fmoc, 예컨대 9-플루오레닐메틸-N-하이드록시석시니마이드 (Fmoc-OSu)와 인슐린과의 반응을 통해 모노-, 디- 및 트리-N-Fmoc-인슐린을 수득할 수 있으며 이는 HPLC 과정을 거쳐 용이하게 확인할 수 있고, 정제된 형태로 얻을 수 있다. 유일한 최종산물로서 디-N-Fmoc-인슐린을 얻기 위해서, 우선 자유 아미노기중 하나를 t-Boc기 등으로 보호하고, 이어 보호화된 인슐린 유도체를 과량의 Fmoc-OSu와 반응시킨 다음, 상기 보호기를 제거하여 원하는 디-N-Fmoc-OSu를 수득한다. 당뇨환자에게 투여하는 경우, 모노-, 디- 및 트리-N-Fmoc는 생체내에서 자연 인슐린으로 전환되어 장기간을 포함하는 다양한 시간동안 항당뇨 효과를 나타낸다.
인슐린의 카복실기 (C-Fm), 즉 말단 AsnA21및 ThrB30의 말단 카복실기, 그리고 GluA4, GluA17, GluB13, GluB21의 말단 카복실기의 치환하기 위해서는, 우선 t-Boc기 등으로 자유 아미노기를 보호화하고, 이어 3개의 단계를 수행하는 바, 이는 (1) 자유 카복실기를 o-니트로페놀 또는 N-하이드록시-석시니마이드 등과 반응시켜 활성 에스테르기로 전환시키고; (2) 상기 활성 에스테르기를 이미다졸의 존재하에서 9-플루오레닐메탄올과 반응시키며; 그리고 (3) 보호화 t-Boc기를 제거하는 것이다. 다른 택일적 방법은 카복실기를 하나의 단계로 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드, 9-플루오레닐메탄올 및 4-디메틸아미노피리딘과 반응시킨 다음 t-Boc기를 제거하는 것이다.
아미노 및 카복실기 양쪽에서 치환된 Fmoc-인슐린 치환체를 원하는 경우 (N-Fmoc, C-Fm), N-Fmoc 치환체가 Fmoc-OSu 및 N-Fmoc 인슐린과의 반응에 의해 우선적으로 제조되고 이어 N-Fmoc 인슐린은 활성 에스테르로 전환된 다음, 상기한 바와 같은 9-플루오레닐메탄올과의 반응을 실시한다.
카복실 및 하이드록실기가 치환된 Fm, Fmoc-인슐린 치환체 (C-Fm, O-Fmoc)를 제조하기 위해서는, 우선 아미노기를 t-Boc로 보호화하고, C-Fm 인슐린 유도체를 상기한 바와 같은 방법으로 제조한 다음, 9-플루오레닐메톡시카보닐 클로라이드와 반응시키고 보호화 N-t-Boc기를 제거한다.
아미노, 카복실 및 하이드록실기가 치환된 Fm, Fmoc-인슐린 치환체 (N, O-Fmoc, C-Fm)를 제조하기 위해서는, 상기한 방법에 따라 N-Fmoc, C-Fm 인슐린을 제조하고, 9-플루오레닐메톡시카보닐 클로라이드와 반응시킨다.
본 발명의 변형된 인슐린은 인간에게 유용한 인슐린으로부터 제조되는 것으로서, 예를 들어 자연, 재조합 또는 돌연변이된 인간, 소 또는 돼지의 인슐린 이다. 돌연변이된 인슐린의 예로서 B16-Tyr→His 인간 인슐린 유사체 (Kaarsholm 및 Ludvigsen, 1995) 및 자연에서 발견되는 B28 및 B29의 아미노산 서열이 역전된 LysB28ProB29인간 인슐린 유사체 (인슐린 리스프로)가 있다.
인슐린 리스프로는 인간 인슐린과 동등한 효능을 갖고 있으며 피하 주입 자리에서부터 보다 빠르게 흡수된다. 바람직한 구현예의 경우, 인슐린은 자연 또는 재조합 인간 인슐린이다.
본 발명의 모노-N-Fmoc-인슐린 유도체는 자연 인슐린의 생물학적 효능의 40-80%를 갖으며, 이는 [폴리(Glu4Tyr)] 인산화 분석법에 의해 결정된다. 디- 및 트리-N-Fmoc-인슐린 유도체는 각각 자연 인슐린의 생물학적 효능의 2-9% 및 1% 미만을 나타내며, 이는 [폴리(Glu4Tyr)] 인산화 분석법에 의해 결정된다. 상기 세가지 형태를 적합한 비율로 사용하는 경우에 있어서, 이는 당뇨병의 피하 치료에 전통적으로 사용되었던 단기간, 중기간 및 장기간-작용 인슐린의 혼합물을 대체할 수 있다. 인슐린과 관련하여, 본 발명은 본 발명의 1종 이상의 인슐린 유도체 및 약제학적으로 적합한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 장기간-작용 효과를 위해서, 바람직하게는 상기 조성물은 N-(Fmoc)3-인슐린 또는 N-(Fmoc)2-인슐린 단독을 포함하거나 또는 이의 혼합물을 포함한다. 상기 약제학적 조성물은 적합한 제형, 예컨대 구강제형 또는 피하주입용 등으로 제공된다.
본 발명의 다른 구현예는 본 발명의 인슐린 유도체 중 1종 이상의 효과량을 당뇨병 환자에게 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 치료방법이다. 바람직한 구현예로서, 상기 유도체는 자연 또는 재조합 인간 N-(Fmoc)3-인슐린 또는 N-(Fmoc)2-인슐린, 또는 이의 혼합물이고, 이를 5-8일 간격으로 투여한다. 필요한 경우에는 Fmoc-인슐린 유도체에 의한 치료는 단기간-작용 인슐린의 매일 투여에 의해 달성된다.
장기간-치료를 위한 경우, 인슐린은 주로 피하 주입으로 투여된다. 피하 투여되는 장기간-작용 인슐린에 의한 치료는 당뇨환자들에 있어서 흡수의 큰 차이 때문에 문제가 있는 바, 이는 첨가 물질이 피하 주입 위치에서부터 확산되기 때문이다. 본 발명은 인슐린 분자 자체내의 구조에 의한 감소된 용해도를 갖는 인슐린 유도체를 제공한다. 이는 인간에 있어서 피하 흡수의 큰 차이를 제거하고 유사체의 혼합에 따른 간섭을 최소화하거나 제거할 수 있다. 상기한 세종류의 N-(Fmoc)-인슐린의 적합한 혼합물은 단기간-작용 인슐린에 대한 요구가 N-(Fmoc)2-인슐린 및 N-(Fmoc)3-인슐린의 서방성 효과와 함께 하는 경우에는 작용 기간을 연장할 수 있으며, 상기 모든 인슐린 유도체는 간섭 현상 없이 혼합될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 본 발명의 조성물은 모노, 디 및 트리-N-Fmoc-인슐린 유도체의 혼합물을 포함한다. N-(Fmoc)3-인슐린은 기본적으로 장기간-작용 인슐린이고; N-(Fmoc)1-인슐린은 40-80% 생물학적 활성을 나타내며, 이는 [폴리(Glu4Tyr)] 인산화 분석법에 의해 결정되고, 또한 수용액에서 향상된 용해도를 나타내며; 그리고 N-(Fmoc)2-인슐린은 2-9%의 생물학적 활성을 나타내고, 이는 [폴리(Glu4Tyr)] 인산화 분석법에 의해 결정되며, 또한 수용액에서 감소된 용해도를 나타낸다. 상기 세종류의 유사체는 생리적 pH 및 37℃에서의 항온처리에 의하여 완전히 활성화된 인슐린으로 되돌아온다. 따라서, 상기 세종류의 적합한 혼합물은 단기간, 중기간 및 장기간-작용 효과를 나타내며, 이는 아연 및 프로타민을 포함하는 제제와 함께 규칙적으로 인슐린을 여러번 주입함으로써 달성된다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 프로드러그는 하기의 인간 또는 수의학적 용도의 의약으로부터 유도되는 것으로서, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다: 면역학적, 피부학적 및 신경학적 질환의 치료에 이용되는 의약, 그리고 항당뇨제, 항염증제, 항균제, 항바이러스제, 항종양제 및 항고혈압제.
본 발명의 약제학적 조성물은 프로드러그 또는 이의 약제학적으로 적합한 염 및 약제학적으로 적합한 담체를 포함한다. 인간 및 동물에 있어서 적합한 투여방법은 예컨대 전통적인 주사, 이식, 구강, 직장 또는 국부 투여가 있다. 제제는 당업자에게 공지된 전통적인 방법으로 제조되며, 예를 들어 "Remington's Pharmaceutical Science", A.R. Gennaro, ed., 17th edition, 1985, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA에 개시된 것이 있다.
본 발명은 다음의 비-제한적 실시예에 의해 상세히 설명된다.
생물학적 과정
(i) 스트렙토조토신 (STZ)-처리 래트의 제조
웅성 위스타 래트 (180-200 g)을 Department of Hormone Research, Weizman Institute of Science에서 제공받았다. 이어, 당뇨병을 유도하기 위하여 Meyerovitch et al., 1987에 개시된 방법에 따라 0.1M 시트르산 완충액 (pH 4.5)내 스트렙토조토신 (55 mg/kg 체중)의 새롭게 제조된 용액을 단독 정맥주사함으로써 달성하였다.
(ⅱ) 인슐린 수용체 티로신 키나제의 농축 제조
상기 효소를 Meyerovitch et al., 1990에 개시된 방법에 따라 래트 간 세포막으로부터 수득하였다. 우선, 간세포를 단백질 분해효소 억제제의 존재하에서 균질화하였고, 1% Trition X-100으로 용해화한 다음 원심분리하였다. 이어, 상등액을 맥아 아글루티닌 (WGA)-아가로스 컬럼 (Sigma)에 통과시켰다. 그런 다음, 흡착된 인슐린 수용체 부분을 0.1% Trition X-100, 10% 글리세롤 및 0.15M NaCl을 포함하는 50 mM HEPES 완충액, pH 7.4에 있는 0.3M N-아세틸-D-포도당 아민으로 용출하였다. 인슐린 및 인슐린 유도체의 생물학적 효능은 하기 (ⅲ) 및 (ⅳ)의 분석법에 따라 평가하였다.
(ⅲ) 지질발생 (표지된 포도당의 완전 지방세포내 지질내 삽입)
래트 지방세포는 Rodbell, 1964의 방법에 따라 제조하였다. 웅성 위스타 래트의 지방 패드를 가위를 이용하여 작은 조각으로 절단하였고, NaCl, 110mM; NaHCO3, 25mM; KCl, 5mM; KH2PO4, 1.2mM; CaCl2, 1.3mM; MgSO4, 1.3mM; 및 0.7% BSA(pH 7.4)을 포함하는 KRB 완충액 3㎖에 현탁하였다. 카보겐 (95% O2, 5% CO2) 대기하에서 25㎖ 유연성이 있는 플라스틱 병내에서 콜라게나제 (1mg/㎖)를 40분 동안 37℃에서 격렬하게 교반하면서 분해시켰다. 완충액 5㎖을 첨가하고 세포를 체 스크린에 통과시켰다. 이어 세포를 실온에서 15㎖ 플라스틱 시험관내에서 수분동안 정치시키고, 플로팅을 하였으며, 저부의 완충액을 제거하였다. 상기 과정 (현탁, 플로팅 및 저부 완충액의 제거)을 세 번 반복하여 실시하였다.
지방세포 현탁액 (3×105세포수/㎖)을 플라스틱 바이알 (바이알 당 0.5㎖)에 분리하고 인슐린의 첨가 또는 첨가하지 아니하고 0.2mM [U-14C]포도당과 함께 카보겐 대기하에서 60분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 지질생성은 톨루엔계 신틸레이션 용액 (바이알 당 1.0㎖)을 첨가함으로써 종료시켰고 추출된 지질의 방사능을 측정하였다 (Moody et al., 1974). 정형적인 실험에 있어서 인슐린-자극 지질생성은 기본값보다 4-5배정도 높았다 (기본값 2000cpm per 3×105세포수/시간; V인슐린8,000-10,000cpm per 3×105세포수/시간). 본 분석에서 인슐린은 ED50값 = 0.15±0.03ng/㎖정도로 지질생성을 자극하였다 (Shechter 및 Ron, 1986). ED50값 = 15ng/㎖을 나타내는 인슐린 유사체는 자연 인슐린의 생물학적 효능의 약 1%을 갖는 것으로 고려된다.
(ⅳ) 수용체 티로신 키나제 활성 측정
본 분석에서 인슐린은 자신의 수용체를 자극하여 L-글루탐산 및 L-티로신이 4:1 몰비 [폴리(Glu4Tyr)]로 포함된 무작위 공중합체을 인산화한다. 표준 효소 분석 혼합액 (최종부피가 60㎕이고, 0.1% Triton X-100을 포함하는 50mM Hepes내에 있음)은 WGA 정제된 인슐린 수용체 (5㎍ 단백질), 20mM MgCl2, 2mM MnCl2, 100μM ATP 및 다양한 농도 (1ng/㎖ - 10mg/㎖)의 인슐린 또는 인슐린 유도체를 포함한다. 22℃에서 30분동안 전항온처리한 다음, 폴리(Glu4Tyr) (최종 농도 0.7 mg/㎖)을 첨가하여 반응을 개시하였으며, 이는 22℃에서 20분 동안 진행시켰고, EDTA (20mM)을 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. 폴리Glu4Tyr내 포스포티로신의 양은 포스포티로신 (최종 희석 1:100,000)에 대한 특정 단일군 항체 및125I-BSA-포스포티로신 컨쥬게이트을 이용한 방사능-면역분석법을 이용하여 정량화하였다. 이 분석에 있어서 인슐린은 20±3ng/㎖의 농도에서 반-최대효과를 촉진시켰다. ED50값 = 2mg/㎖을 나타내는 인슐린 유사체는 자연 인슐린의 생물학적 효능의 약 1%을 갖는 것으로 고려된다.
실시예 1. N-Fmoc-인슐린 유도체의 제조
(a) 합성
인간 인슐린 (100mg, 17.2μmoles) (Biotechnology-General, Rehovot, 이스라엘에서 제공)을 17.4mg (172μmoles) 티리에틸아민을 포함하는 분석용 디메틸포름아미드 (DMF) 4㎖에 현탁하였다. 이어, Fmoc-OSu (58mg, 172μmoles)을 첨가하였다. 균일한 반응 혼합액을 25℃에서 20시간 동안 교반하고 용액이 흐려질 때까지 에틸아세테이트를 첨가하였으며, 이어 에테르를 첨가하여 침전을 완료하였다. 그런 다음, 용매를 원심분리에 의해 제거하였고 침전물을 에테르로 두 번 물로 두 번 세척하였다. 이 과정을 통해 모노, 디 및 트리-N-Fmoc-인슐린 혼합물이 수득되는 바, 이는 제조용 HPLC로 이용하여 분리 및 정제하였다. 모노변형 N-Fmoc-인슐린 유도체는 이소프로판올로 크루드 고체를 세척함으로써 디 및 트리변형 인슐린 유도체으로 분리된다.
(b) N-Fmoc-인슐린 유도체의 분리 및 정제
크루드 고체를 HPLC 프리팩 컬럼 (Merck, LIChrosorb RP-18 [7㎛]을 포함하는 LIChrosCART 250-10 mm)이 장착된 역상 HPLC (Spectra-Physics SP 8800 액체 크로마토그래피 시스템)에 투입하였다. 선상 구배는 H2O에 있는 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA) (용액 A) 및 아세토니트릴:H2O, 75:25에 있는 0.1% TFA (용액 B)를 가지고 형성시켰다. 유속은 1㎖/분으로 하였다. N-(Fmoc)1-인슐린 유도체는 보류시간 21.1, 21.9 및 22.8분에서 용출되었으며, N-(Fmoc)2-인슐린 유도체는 보류시간 26.3, 27.1 및 27.7분에서 N-(Fmoc)3-인슐린 유도체는 보류시간 31.5분에서 용출되었다. 보류시간 21-23분, 26-28분 및 31.5분에 해당하는 부분을 수집하고, 냉동건조한 후, 화학적 특성을 확인하였다. 보류시간 21-23분 (모노변형 인슐린) 및 26-28분 (디변형 인슐린)에 해당하는 부분은 더욱 정제하여 모노-Fmoc 및 디-Fmoc 인슐린 유도체을 각각 수득하였다. 인슐린 분자에 결합한 Fmoc기의 양은 CH2Cl2내 50% 피페리딘으로 N-Fmoc-인슐린 유도체의 알고 있는 양으로 처리한 다음, 301nm에서 분광광도기를 이용하여 결정하였다.
(c) N-Fmoc-인슐린 유도체의 화학적 특성
HPLC에 의한 분리과정에 이어, 7개의 N-Fmoc-인슐린 유도체를 수득하였다. 이는 3개의 모노변형, 3개의 디변형 및 1개의 트리변형 유도체를 각각 포함한다 (표 1). 각 화합물의 보류시간 및 수득율은 표 1에 제시하였다. 서로 상이한 N-Fmoc-인슐린 유도체는 실험실적 조건하에서 용이하게 분리 및 정제가 가능하였다. PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린 (보류시간 = 27.7분) 및 GlyA1, PheB1, LysB29-N-(Fmoc)3-인슐린은 매스 스펙트럼을 포함하는 여러 과정을 통해 그 특징을 확인하였다 (표 1).
(d) PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린의 합성
생물학적 분석에 따르면 PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린은 특히 장기간-작용 인슐린으로 적합한 바, 이를 합성할 수 있는 다른 방법을 강구하였다. GlyA1부위는 실험실적 조건하에서 디-터트-부틸디카보네이트 1당량 및 DMSO/Et3N, 20:1을 용매로하여 t-Boc기로 보호화하였다. HPLC 과정에 의한 분리후, GlyA1-N-Boc-인슐린을 과량의 Fmoc-OSu (10 당량), 용매로서 DMF 및 염기로서 DIEA를 이용하여 반응시켰다. TFA에 의한 처리 및 HPLCdp 의한 정제를 통해 우수한 수율 (약 50%)로 PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린을 제조하였다.
(e) N-Fmoc-인슐린 유도체의 생물학적 특성 조사
본 발명의 N-Fmoc-인슐린 유도체의 여러 특성을 표 2 및 3에 요약을 하였다. 수용액에서의 상기 유도체의 용해도는 변형이 증가할수록 감소하였다. N-(Fmoc)1-인슐린 유도체는 자연 인슐린보다 다소 낮은 용해도를 나타내었으며, N-(Fmoc)3-인슐린 유도체는 자연 호르몬보다 약 20배 정도 낮은 용해도를 나타내었다. 또한, 변형이 증가할수록 생물학적 효능도 감소하였다. 이에, 모노, 디 및 트리-N-Fmoc-인슐린은 각각 자연 인슐린의 생물학적 효능의 40-80%, 2-9% 및 ＜1%를 나타내었으며, 이는 [폴리(Glu4Tyr)] 인산화 분석으로 확인하였다. 완전한 래트 지방세포를 이용한 지방생성의 보다 민감한 생물학적 분석에 따르면, Fmoc-인슐린 유도체는 보다 낮은 생물학적 효능을 나타냄을 알 수 있다. 따라서, 지질생성 분석방법을 이용하여, GlyA1-N-Fmoc-인슐린 및 디-N-Fmoc-인슐린은 각각 자연 인슐린의 생물학적 효능의 4.7% 및 0.4-1.4%를 나타냄을 확인하였다 (표 3). 7개 유도체 모두는 pH 8.5에서 2일동안 항온처리함으로써 자연 호르몬으로 되돌아간다. 이는 생물학적 효능의 완전 회복 (표 2 및 3) 및 HPLC분석과정을 통한 유도체 피크의 소멸, 자연 호르몬 피크의 출현 (보류시간 = 15분)을 통해 확인할 수 있었다.
N-Fmoc-인슐린 유도체의 화학적 특성
유도체 보류시간 (HPLC), 분a) 수율b)(%) 몰 Fmoc/몰 인슐린 Fmoc 삽입 위치 매스스펙트럼 (분자량),[M+H]+로 계산
N-(Fmoc)1-인슐린 21.1 3 0.8 GlyA1
N-(Fmoc)1-인슐린 21.9 6 1.2 LysB29
N-(Fmoc)1-인슐린 22.8 4 0.9 PheB1
N-(Fmoc)2-인슐린 26.3 12 1.7 GlyA1, LysB29
N-(Fmoc)2-인슐린 27.1 6 2.14 GlyA1, PheB1
N-(Fmoc)2-인슐린 27.7 14 1.9 PheB1, LysB29 6252 6255
N-(Fmoc)3-인슐린 31.5 30 3.4 GlyA1, LysB29, PheB1 6474 6475
주: 아미노산 분석은 모든 Fmoc-인슐린 유도체의 바른 조성을 증명한다.
a) 60% 용액 A (물내에 있는 0.1% TFA) 및 40% 용액 B (75:25, 아세토니트릴:물내에 있는 0.1% TFA)로부터 100% 용액 B를 40분 (유속, 1㎖/분)동안에 걸쳐 선형구배되는 Merck, LiChrospher 100 RP-8 (5㎛) 칼럼을 이용하여 측정
b) HPLC에 따른 수득한 순수물을 기준
N-Fmoc-인슐린 유도체의 대표적 특성
유도체 기원 Fmoc 삽입 위치 완충수용액내 외형 완충수용액내 용해도 (pH 7.4, mg/㎖) 생물학적 효능 (%) 항온처리후 생물학적 효능 (2일, 37℃, pH 8.5)
자연 인슐린 인간 맑음 약 4 또는 그 이상 100 100
N-(Fmoc)1-인슐린 인간 GlyA1 거의 맑음 약 3 40±2 95
N-(Fmoc)1-인슐린 인간 LysB29 거의 맑음 약 3 78±4 94
N-(Fmoc)1-인슐린 인간 PheB1 거의 맑음 약 3 76±4 95
N-(Fmoc)2-인슐린 인간 GlyA1, LysB29 흐림 약 2 2±1 93
N-(Fmoc)2-인슐린 인간 GlyA1, PheB1 흐림 약 2 3±1 97
N-(Fmoc)2-인슐린 인간 PheB1, LysB29 흐림 약 2 9±2 95
N-(Fmoc)3-인슐린 인간 GlyA1, LysB29, PheB1 매우 흐림 약 0.2 ＜1 98
주: 인슐린 효능은 상기 실시예에서 개시된 두 가지 생물학적 분석법에 따라 실시하였다.
지질생성 분석 (완전한 패트 지방세포 이용)을 이용한 N-Fmoc-인슐린 유도체 활성의 시간 의존성 및 생물학적 효능
유도체 ED50지질생성 ng/㎖ 상대적 생물학적 효능 (%) 항온처리후 활성 (%; pH 8,5, 37℃)
9시간 20시간 45시간
자연 인슐린 0.2-0.4 100
GlyA1-N-(Fmoc)-인슐린 7 4.7 50 100
GlyA1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린 44 0.4 10 20 97
GlyA1, PheB11-N-(Fmoc)2-인슐린 30 1.1 18 40 100
PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린 12.3 1.4 10 20 98
실시예 2. N-Fmoc-인슐린의 생물학적 활성
(a) N-Fmoc-인슐린의 pH 7.4에서의 시간에 따른 활성
당뇨 래트에 있어서 N-Fmoc-인슐린의 항당뇨 효능에 대한 연구전에, 이의 재활성 (자연 호르몬으로의 전환) 속도를 시험관내에서 확인하였다. 유도체를 10% 디메틸설폭사이드 (DMSO)가 포함된 Hepes 완충액 (50mM, pH 7.4)에 용해한 다음, 37℃ (생리학적 pH 및 체온)에서 항온처리하였다. 일정시점에서 일부분을 수거하여 자연 인슐린에 대한 상대적 생물학적 효능을 결정하였다. 생물학적 활성은 인슐린 수용체 티로신 키나제 활성 (상기 (ⅳ)의 생물학적 과정에서 개시된 세포 프리 분석법) 및 상기 생물학적 과정, (ⅱ)에서 개시된 완전한 래트 지방세포에서의 지질생성의 자극시험을 통해 확인하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다. 반 최대활성은 N-(Fmoc)3-인슐린에 대해 t1/2= 14일에서 나타났으며, 21일 동안의 항온처리에 따라 거의 최대활성이 나타났다.
규칙적으로, pH 7.4에서의 N-(Fmoc)2-인슐린의 활성 속도는 증가하였다. N-(Fmoc)3-인슐린에서 관찰되는 6일 지연기간은 N-(Fmoc)2-인슐린에서는 관찰되지 아니하였다. 따라서, N-(Fmoc)3-인슐린은 재활성을 제한하는 보다 천천히 가수분해되는 Fmoc 부위를 갖는다는 것을 알 수 있었다. 상기 가수분해 후에는 활성 속도가 증가한다. 실제적인 관점에서 상기 두 유사체의 혼합물은 초기 및 말기를 포함하는 연장된 기간동안 활성 인슐린을 방출시킬 수 있음을 짐작할 수 있다. 상대적으로 활성이 있는 모노변형 Fmoc-인슐린은 pH 7.4 및 t1/2= 5일에서 최대 생물학적 효능을 회복하였다.
N-(Fmoc)2- 및 N-(Fmoc)3-인슐린이 순환계에 도달하면 장기간 호르몬의 낮은 기본적 농도를 제공할 것으로 추측된다. 이는 주로 불활성 유도체의 활성 단기간-생존 자연 호르몬으로의 전환 속도에 의해 결정된다. 다행하게도, N-(Fmoc)2,3-인슐린은 활성속도가 느리다 (참조 : 도 1). 빠른 속도 (몇분내)는 저혈당증을 초래한다.
PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린은 9% 생물학적 활성을 나타내며, 이는 [폴리(Glu4Tyr)] 인산화 분석으로 확인하고, 또한 자연 인슐린 및 N-(Fmoc)3-인슐린의 중간 정도의 용해도를 나타낸다. N-(Fmoc)3-인슐린과는 다르게, N-(Fmoc)2-인슐린의 자연 인슐린으로의 전환은 도 1에서 확인할 수 있듯이, 항온처리 후 바로 (몇시간내) 시작된다. 이에, N-(Fmoc)2-인슐린은 투여 후 작용 개시가 보다 빠르게 이루어짐을 추측할 수 있다. 따라서, N-(Fmoc)2- 및 N-(Fmoc)3-인슐린의 적합한 조합은 단독투여 후 작용의 빠른 개시 및 장기간의 지속으로 특징되는 기본적 인슐린의 방출을 위한 이상적인 조제를 제공하며, 이는 본 발명의 바람직한 구현예를 구성한다.
PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린의 단독 복강내 투여가 STZ 래트의 일간 중량 획득에 미치는 영향
군 기 술 일간 중량 획득/래트 (처음 3일동안)
A(n=5) 단지 부형제만을 투여한 STZ 래트 (2.0㎖, 20% DMSO/래트) 2.0±0.2
B(n=5) NPH-인간 인슐린의 단독 복강내 투여한 STZ 래트 (휴물린 N, 3mg/래트) 12.0±2
C(n=5) N-(Fmoc)2-인슐린의 단독 복강내 투여한 STZ 래트 (3mg/래트) 11.5±1.3
(b) PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린의 단독 복강내 투여가 정상 래트에 미치는 영향
(Fmoc)2-인슐린의 생리학적 조건하에서 자연 호르몬으로의 느린 전환에 기인한 장기간-작용 능력을 확인하기 위하여, 부가적인 생체내 분석을 실시하였다. 이 분석은 순환계내에서 인슐린 (또는 인슐린 유도체)의 피하투여 후 장기간-작용 특징을 나타내는 것이다. 정상 래트에 자연 인슐린, NPH-인슐린 및 (Fmoc)2-인슐린 (3mg/래트)을 단독 복강내 주입하고 혈당량을 3일에 걸쳐 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다. 자연 인슐린 (도 3) 및 NPH-인슐린 (도 2)은 각각 약 12시간 및 15시간동안 저혈당증을 유도하였다. 저혈당증으로부터의 회복은 각각 t1/2= 8시간 및 10시간에서 나타났다. (Fmoc)2-인슐린은 약 48시간동안 혈당량을 감소시켰으며, 저혈당증으로부터의 회복은 각각 t1/2= 26시간에서 발생하였다. 상기 결과는 (Fmoc)2-인슐린의 연장된 작용이 그의 내재적 특성 및 순환계로의 느린 진입에 의한 것을 뒷받침하며, NPH-인슐린의 전통적인 기작, 즉 주입 위치에서의 침전에 의한 것이 아님을 말해준다. 기대한 바와 같이, 자연 인슐린 및 NPH-인슐린의 혈당량 감소에 대한 능력의 차이는 피하 투여에 의한 경우와 비교하여 미소하다. 이러한 결과는 복강내 대량의 액체 및 아연-결정 인슐린의 단량체 형태로의 빠른 전환에 의한 것이다. 다른 두 개의 (Fmoc)2-인슐린 유도체, 즉 [GlyA1, LysB29] 및 [GlyA1, PheB11]을 합성하였고, 상기한 분석법을 행하였다. 그 결과 (기재하지 않음) 양 유도체에 대해 22-24시간의 t1/2을 나타냈으며, PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린과 유사한 장기간-작용 양상을 나타내었다.
(c) N-(Fmoc)3-인슐린의 단백질분해 저항성
자연 인슐린 또는 N-(Fmoc)3-인슐린 (50mM Hepes, pH 7.4, 10% DMSO내에 서 각각 1mg/㎖)을 37℃에서 항온처리하였다. 이어 키모트립신 및 트립신 (각각, 0.5%w/w)을 첨가하였다. 지정된 시간에 일부분을 회수하고 분석용 HPLC 과정을 수행하였다. 분해율은 자연 인슐린 (보류시간 15분) 또는 N-(Fmoc)3-인슐린 (보류시간 31.5분)의 피크 면적의 감소를 이용하여 결정하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
N-(Fmoc)3-인슐린은 pH 7.4에서 키모트립신 및 트립신의 혼합물에 의한 단백질분해에 강한 저항성을 나타냄을 알 수 있었다. 자연 인슐린 및 N-(Fmoc)3-인슐린 각각 0.5 시간 및 7.5 시간의 t1/2을 나타내며 단백질 분해가 진행되었다.
실시예 3. PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린 및 N-(Fmoc)3-인슐린의 단독 피하투여가 STZ-당뇨 래트에 미치는 영향
STZ 래트는 생체내 인슐린 치료의 우수한 모델이다. 이 모델에 있어서, β-세포의 약 90%가 스트렙토조토마이신에 의해 파괴되었으며, 이는 해부학적 검사를 통하여 확인하였다 (참조: Pederson et al, 1989). 래트는 저인슐린증 (정상 인슐린의 10-30%), 고혈당증 (300 mg/㎗ 초과; 대조군 래트의 정상 포도당량은 90-100mg/㎗)을 나타내었으며, 대사는 이화대사쪽이었다. 가시적 외형 증상으로서 병든 모습을 나타내었고, 수분 흡수 및 오줌의 배설은 3-4배 증가하였다. 일간 중량 획득은 대조군의 정상적 일간 중량 획득 (0.3-0.8g/일/래트)보다 10-20% 정도 감소하였다. STZ-래트의 조직에 있어서 병리학적 변화는 크게 발생하였다. 보다 명확한 생화학적 변화는 글리코겐 대사의 주요 효소의 감소, 간 글리코겐의 결핍, 말초조직에서의 포도당 운송체 수의 감소 및 인슐린에 대한 반응성 증가를 수반하지 않는 인슐린 결합 능력의 증가이다.
상기 당뇨 래트 모델에 있어서, 용이한 인슐린 치료는 일주일동안 인슐린 (5 유니트/일/래트)의 연속적 투여를 하는 것이다. 상기 치료방법은 혈당량을 정상화하고, 당뇨 래트를 동화대사쪽으로 회귀시키며, 고혈당증 및 저인슐린증에 의해 야기되는 많은 병리학적 증상을 감소시킨다. 신속-작용 (규칙적) 인슐린의 단독투여는 단지 여러 시간동안만 효과적이다. 또한, 7일 치료가 종료되며 고혈당증이 24-30 시간내에 재발한다.
N-(Fmoc)3-인슐린이 연장된 항당뇨 효과를 확인하기 위하여, 당뇨 유도후 2주일이 경과한 STZ-래트에 자연 인슐린 (A군, 25유니트, 10㎖ H20-10% DMSO에 용해된 1mg, n=4), 또는 N-(Fmoc)3-인슐린 (B군, 10㎖ H20-10% DMSO에 용해된 1mg, n=4)을 단독 피하주입하였다. 7일동안의 혈당량 및 일간 중량 획득을 관찰하였다.
그 결과는 도 5에 나타내었다. 각 점은 4마리 래트의 혈장 포도당의 산술평균±SEM을 나타내는 것이다. B군에서의 순환 포도당량은 크게 감소하였다. 투여후 이틀째부터 B군에서 혈당량이 90-110mg/㎗ 감소되었으며, 이 혈당량 감소는 6일째까지 계속되었다. 7일째에는 래트의 두군에서 순환 포도당량의 차이가 뚜렷하지 않았다. N-(Fmoc)3-인슐린을 투여한 래트는 그 외관이 건강하였다. 일간 중량 획득은 B군에서 거의 3배정도 증가하였고, A군 및 B군 각각에서 0.57±0.08 및 1.43±0.14g/래트/일이었다. 따라서, N-(Fmoc)3-인슐린의 단독투여는 4일 (약 2일의 지연된 개시에 이어서)동안 계속되는 연장된 항당뇨 작용을 나타냄을 알 수 있었다. 상기 생체내 장기-지속 효과는 유도체의 수용체-매개 엔도사이토시스 회피 능력 및 단백질 분해에 대한 저항성에 기인한 것이다. 더욱이, N-(Fmoc)3-인슐린은 대체로 수용액에서 불용성이다. 따라서, 인간의 경우, 종래 치료원칙, 즉 제조된 불용성 인슐린의 점진적 용해를 새로운 원칙의 피하투여, 즉 순환하는 장기간-생존 공유결합적으로 변형된 불활성 인슐린 유도체로 치환함으로써 전체 지속효과를 달성할 수 있으며, 상기 인슐린 유도체는 자연 호르몬으로 서서히 전환된다. 상기 인슐린 유도체는 활성이 없으므로, 보다 많은 양을 저혈당증에 대한 우려 없이 투여할 수 있다.
실험용 당뇨 래트, 즉 STZ-처리 래트의 혈당량 감소에 있어서, PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린의 효과를 확인하기 위하여, 당뇨 유도 9일 후, N-(Fmoc)3-인슐린 (A군, 2.0㎖의 20% DMSO에 용해된 3mg/래트, n=5), 또는 장기간-작용 인슐린 (NPH-인간 인슐린, 휴물린 N, HI-310) (B군, 래트당 0.75㎖ (3mg), n=5)을 단독 피하주입하였다. C군은 부형제 (2.0㎖의 20% DMSO)만을 투여한 것이다. 혈당량을 매일 측정하였다.
그 결과는 도 6에 나타내었는 바, 점선은 대조군 래트의 혈장 포도당의 산술적 평균을 의미한다. 도 6에서 확인할 수 있듯이, HPLC로 정제된 PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린의 단독 피하투여는 4일동안 정상혈당량을 유도하며, 이화성 STZ-래트의 일간 중량 획득을 증가시킴을 알 수 있다 (표 3). N-(Fmoc)2-인슐린은 상품화된 장기간-작용 (불용성) 제제만큼 효과적이었다. 단기간-작용 (용해성) 인슐린은 단지 7시간동안 혈당량 감소를 유도하였다. 상기 제제는 수용액 (pH 7.4)에서 잘 용해되는 바, 이는 불용성 N-(Fmoc)2-인슐린의 현탁액이 피하주입으로 정밀하게 투여될 수 없다는 측면에서 이점이 된다.
실시예 4. (2-설포)Fmoc-인슐린의 제조 및 생물학적 활성
(a) (2-설포)Fmoc-인슐린 (Sulfmoc-인슐린)의 합성
Fmoc-인슐린의 소수성 감소, 용해도 증가 및 인슐린으로의 재전환 속도를 변화시키기 위하여 Fmoc기 자체를 변형시켰다. 상기 변형은 극성, 바람직하게는 전하를 띤 기를 플루오렌 고리, 예컨대 할로겐, 니트로, 카복실, 아미노, 암모늄 및 설포기에 도입함으로써 이루어진다. 전자친화성 치환반응에 있어서, 플루오렌은 처음 2번 위치에서 공격당하며, 일반적으로 9번 위치에서의 치환체 (예: CH2OCO-OSu)의 성질은 치환의 방향성에 영향을 미치지 아니한다. Fmoc-OSu를 0℃에서 디클로로메탄 (DCM)내 클로로설폰산 0.9 당량으로 처리하여 고수율 (화학식 (ⅰ), 2번 위치에서 R1=SO3H이고, R2=R3=R4=H, A=OCO-OSu)로 (2-설포)Fmoc-OSu를 얻었다. 1당량 이상으로 처리하는 경우에는 플루오렌 고리의 7번 위치도 치환된다.
(2-설포)Fmoc기는 활성 (2-설포)Fmoc-OSu 에스테르를 인슐린의 아미노기와 커플링시킴으로써 인슐린으로 도입하였다. 상기 반응은 수용액 완충액 (pH 7.4) 및 과량의 시약 (약 20당량)의 조건하에서 수행하였다. 투석 및 냉동건조를 행한 후, 생성물은 수용성을 갖게되었다. HPLC 분석은 하나의 주 생성물을 보여 주었으며, 매스-스펙트럼 (m/z 6411)을 통하여 (Sulfmoc)2-인슐린임을 확인하였다. 반응을 아세토니트릴/물, 1:1 조건하에서 수행한 경우에는 주 생성물이 (Sulfmoc)3-인슐린이었고, 이는 매스-스펙트럼 (m/z 6713)으로 확인하였다.
(b) (2-설포)Fmoc-인슐린의 시간에 따른 활성
(Sulfmoc)2-인슐린은 pH 8.5 (0.1M NaHCO3) 및 37℃에서 36시간동안의 항온처리, 또는 pH 7.4 (50mM Hepes 완충액)에서 36시간동안의 항온처리에 의하여 자연 호르몬으로 완전히 전환되었고, 이때 t1/2은 각각 12-15시간 및 6일이었다. HPLC 분석 결과 인슐린 유도체 피크가 없어지고, 자연 호르몬 피크가 출현함을 관찰할 수 있었다. (Sulfmoc)2-인슐린의 자연 호르몬으로의 가수분해는 (Fmoc)2-인슐린의 가수분해 (pH 7.4, 37℃에서 21일)보다 빠르게 진행되었다.
(Sulfmoc)2-인슐린은 0.5%의 생물학적 활성을 갖으며, 물에서 우수한 용해도를 갖는다. pH 8.5 및 37℃에서의 항온처리시, (Sulfmoc)2-인슐린은 자연 호르몬으로 완전히 전환되었고, 이때 t1/2은 각각 4-6시간이었으며, 이는 생물학적 효능에서의 시간-의존 증가 (래트 지방세포에서의 지질생성 분석)로 확인하였다.
(c) (2-설포)Fmoc-인슐린의 단독 복강내 투여가 정상 래트에 미치는 영향
(Sulfmoc)2-인슐린의 장기간-작용능을 조사하기 위하여, 정상 래트에 자연 인슐린, NPH-인슐린 또는 (Sulfmoc)2-인슐린을 단독 복강내 주입하고 혈당량을 2일에 걸쳐 측정하였다. 도 3은 (Sulfmoc)2-인슐린이 24시간 동안 저혈당증을 유도함을 보여준다. 저혈당증으로부터의 복귀는 t1/2=14시에서 발생하였다. 단기간 및 NPH-인슐린의 경우, t1/2은 각각 8 (도 3) 및 10시 (도 2)이었다. 따라서, (Sulfmoc)2-인슐린의 단독투여는 중기간 항당뇨 작용을 나타내며, 이는 단기간 또는 NPH-인슐린보다 1.5-2시간 긴 것이다. 상기 결과는 시험관 내에서 Sulfmoc-인슐린이 가수분해 속도가 증가하는 것과 일치하는 것이다. 플루오렌 고리의 2번 위치에서의 설폰산은 9번 위치에서의 H+의 제거 속도를 2-3배 증가시키고, 이에 따라 Sulfmoc 부위의 가수분해 속도도 2-3배 증가하게 된다. 여러 염기의 sulfmoc기에 대한 영향에 대한 연구는 모시스템보다 보다 민감한 염기 민감도를 보여준다. 더욱이, 글리신으로부터 sulfmoc기의 방출속도 상수는 Fmoc기보다 크게 나타났다 (약 30배). 따라서, 인슐린에 sulfmoc기를 도입함에 따른 용해도 증가는 이 유도체의 장기간-지속 효과를 감소시킨다. 수용체-매개 엔도사이토시스 및 분해 기작을 회피함으로써 달성되는 장기간-지속 항당뇨 효과는 Sulfmoc-인슐린에도 적용되는 것이다.
인슐린으로부터 sulfmoc기 제거속도의 증가는 중기간 제제와 같은 인슐린 투여를 적용하는 경우에 이점이 된다. 이러한 제제는 상품화된 제제와는 반대로 수용액 완충액에서 완전히 용해됨으로써 이점을 갖게된다. 또한, 다양한 산도 또는 극성을 갖는 다른 작용기를 플루오렌 고리에 도입할 수 있다. 따라서, Fmoc기에 도입되는 작용기의 종류 및 수를 조절함으로써 변형 인슐린의 용해도 및 재활성 속도를 조절할 수 있다.
실시예 5. 아미노 및 카복실-말단 변형 인슐린의 제조 (N-Fmoc- 및 C-Fm-인슐린 유도체)
N-(Fmoc)3-인슐린 (64.5mg; 10μmol; 카복실 부위 60μmol, 즉 4개의 사슬내 Glu 및 2개의 C-말단 잔기)을 o-니트로페놀 (250 μmol; 35mg) 또는 N-하이드록시석시니마이드 (250 μmol; 28mg)가 있는 디메틸포르마이드 (DMF) (Lab. Scan., 더블린, 아일랜드) 8㎖에 용해한 다음 4℃로 냉각하였다. DMF 0.5㎖내의 N,N-디사이클로헥실카보디이미드 (DCC; 250mmol, 53mg) 용액을 첨가하고, 반응혼합물을 4℃에서 1시간 동안 방치하였으며, 이어 실온에서 6시간 동안 방치하였다. 침전된 N,N-디사이클로헥실 우레아를 원심분리기로 제거하고, 건조, 냉각, 에테르를 이용하여 N-(Fmoc)3-인슐린의 o-니트로페닐 또는 N-하이드록시석시니마이드 에스테르를 각각 침전시켰다. 그런 다음, 상기 고체를 건조된 에테르로 2회 세척하고, DMF 8㎖에 용해하였다. 그리고 나서, DMF 1㎖에 용해된 9-플루오레닐메탄올 (250μmol; 50mg) 및 이미다졸 (250μmol; 17mg)의 용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 정치하였다. 건조된 에테르에 의한 침전을 통해 N-(Fmoc)3, C-(Fm)n-인슐린 62mg을 수득하였다. 주 생성물은 N-(Fmoc)3-인슐린의 헥사-9-플루오레닐메틸 에스테르 C-(Fm)6(n=6)이다.
실시예 6. 카복실-말단 Fm-인슐린의 제조 (C-Fm-인슐린)
t-부틸옥시카보닐 (t-Boc)3-인슐린의 제조를 위하여, 디-터트-부틸디카보네이트 (56mg, 258μmol)을 얼음-냉각, 교반된 DMF (4㎖)내의 인슐린 (100mg, 17.2μmol) 및 트리에틸아민 현탁액 (174mg, 172μmol)에 첨가하였다. 상기 반응혼합물을 실온까지 가온한 다음, 5시간 동안 교반하였다 (점차적으로 맑아짐). 이어, 상기용액이 흐려질 때까지 에틸아세테이트를 첨가한 다음, 에테르를 첨가하고 침전물을 원심분리하였으며, 다시 에테르로 세척하였다. 이렇게하여 생성된 크루드 고체 (95mg)는 더 이상의 정제처리 없이 이용하였다. 분석용 HPLC를 통하여 27.5 분에서 주 생성물이 용출됨을 확인하였다.
생성물을 DMF 10㎖에 용해한 후, o-니트로페놀 또는 N-하이드록시석시니마이드로 처리하여 대응하는 활성 에스테르를 수득하였다. 이어, 상기 에스테르를 이미다졸의 존재하에 9-플루오레닐메탄올로 처리한 다음, 건조 에테르로 침전시킴으로써 분말 형태로 N-(t-Boc)3,C-(Fm)n-인슐린을 수득하였다 (87mg). 상기 분말을 P2O5상에서 진공으로 건조한 다음, N-말단 t-Boc 보호기를 제거하기 위하여 트리플루오로아세트산 5㎖을 실온에서 1시간동안 처리하였다. 상기 과정동안 인슐린 유도체의 대부분은 용해되었다. 이어, 얼음-냉각 및 건조된 에테르를 첨가하고, 원심분리하여 분말을 분리하였으며, 건조된 에테르로 격렬하게 세척하였다. 생성물은 주로 C-(Fm)6-인슐린으로서, 그 수율은 79mg이었다.
실시예 7. (Fmoc)1-인간 성장 호르몬 (Fmoc1-hGH)의 제조
정상적인 생리학적 조건하에서, 건강한 개체의 hGh양은 매일 수회에 걸쳐 맥동방식 (낮 및 밤에)으로 증가한다. hGH는 단기간-생존 호르몬이다. 현재 이용되는 치료방법은 hGH의 단독 매일 주입을 하는 것이며, 이는 단지 수시간 동안만 효과적이다. 따라서, 낮과 밤 24시간 동안 hGH의 역치-기본량을 공급할 수 있는 장기간-작용 (서방성) hGH 제제를 개발하는 것이 매우 바람직하다.
자연 hGH (Biotechnology General, Rehovot, 이스라엘; 9.2mg)을 0.1M NaHCO3(2.0㎖; pH 8.5)에 용해하고, DMSO (0.1㎖)를 첨가한 다음 (최종 DMSO의 농도, 약 5%), 0℃까지 냉각하였다. 이어, 10㎕의 Fmoc-OSu 1당량 (DMSO내 18.5mg/㎖의 스톡 용액으로부터 취함)을 첨가하고, 적당히 교반하면서 0℃에서 30분 동안 반응을 진행하였다. 그런 다음, 다시 10㎕의 Fmoc-OSu 1당량을 첨가하고, 30분 후 혼합물을 H2O에 대하여 7℃에서 하룻밤 동안 투석하였다. HPLC로 자연 hGH (전체의 약 20%; 보류시간 30분; RP-8 컬럼; 250×10mm; Merck) 및 변형된 Fmoc-hGH (전체의 약 80%; 보류시간 32분)에 해당하는 피크를 확인하였다.
표 5는 0.1M NaHCO3(pH 8.5)내 37℃에서 항온처리한 경우 Fmoc-hGH (1mg/㎖)가 자연 hGH로 전환하는 것을 보여준다. 지정된 시간에서 일부분을 회수하고 분석용 HPLC (RP-8 컬럼)를 수행하였다. Fmoc-hGH의 자연 hGH로의 전환은 자연 hGH에 해당하는 피크 면적이 증가를 통해 확인할 수 있었다.
표 5에서 볼 수 있듯이, Fmoc-hGH는 자연 호르몬의 수용체-결합력의 15%를 갖는다. Fmoc-hGH를 약 6일 동안 pH 8.5 (37℃) 또는 4일 동안 pH 10.5(37℃)에서 항온처리하여 완전히 활성화된 hGH를 수득하였으며, 이는 수용체 결합 분석 및 HPLC 분석으로 확인하였다.
항온처리시 (37℃) Fmoc-hGH로부터 자연 hGH의 생산
화합물 처 리 요오드화 호르몬 대체 능력1)(%) hGH로의 전환2)(%)
hGH 100
Fmoc-hGH 15
Fmoc-hGH 1일, pH 10.5 25
Fmoc-hGH 4일, pH 10.5 100
Fmoc-hGH 1일, pH 8.5 23
Fmoc-hGH 2일, pH 8.5 62
Fmoc-hGH 6일, pH 8.5 100
(1) 요오드화 호르몬 대체는 Gertler et al., 1984에 따라 실시하였다. 자연 hGH는 Fmoc-hGH에 적용된 조건 (pH 10.5, 37℃ 및 4일)에서 매우 안정하였다.
(2) Fmoc-hGH (1mg/㎖)을 0.1M NaHCO3(pH 8.5) 및 37℃에서 항온처리하였다. 지정된 시간에 일부분을 회수하고, 분석용 HPLC에 적용하였다. Fmoc-hGH로부터 자연 hGH로의 전환은 자연 hGH에 해당하는 피크 면적의 증가를 통해 측정하였다.
실시예 8. N-Fmoc-세파렉신 및 세파렉신-O-Fm 에스테르의 제조
세파렉신[7-(D-α-아미노페닐아세트아미도)데스아세톡시세파로스포란산]은 β-락탐 항생제로서 그람 (-) 및 그람 (+) 박테리아에 대해 넓은 활성 스펙트럼을 갖는다. 두 종류의 모노치환 세파렉신을 제조하였는 바, 이는 플루오레닐메틸 (Fm) 부위를 아미노기 (N-Fmoc-세파렉신) 또는 카복실기 (세파렉신-O-Fm)에 공유결합, 즉 에스테르화를 통해 제조된다.
(i)(a) N-Fmoc-세파렉신의 제조
세파렉신 수화물 (Sigma, 미국; 50mg, 0.144mmole) 및 디클로메탄 (DCM; 2.5㎖)내의 트리에틸아민 (29mg, 0.288mmole)의 교반된 현탁액에 DCM (2.5㎖) 내의 Fmoc-OSu (145mg, 0.432mmole) 용액을 5분 동안 점적하였다. 1시간 후 맑아진 상기 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반하였으며, 이는 다시 흐려지게 된다. 진공하에서 농축한 다음, 에테르를 첨가하였으며, 생성된 침전물을 여과하고 에테르로 두 번 세척하였다. 여과물은 DCM에 용해시켰고, 산성화된 물 (약 pH 2), 물 및 소금물로 추출하였으며, 무수 MgSO4상에서 건조시켰다. 이어, 여과 및 농축한 다음, 에테르를 첨가하였다. 침전물을 여과하고 에테르로 세척하여 순수한 Fmoc-세파렉신을 수득하였으며, 이는 TLC (1-부탄올:아세트산:물, 8:1:1) 및 분석용 HPLC (33분에서 용출, 자연 세파렉신은 동일한 조건하에서 6.5분에서 용출됨)로 확인하였다. 매스 스펙트럼 (Fast Atom Bombardement, FAB) 분석을 통해 N-Fmoc-세파렉신의 기대 분자량을 얻었다 (M/Z 570.1 [M+H]+).
(i)(b) Fmoc-세파렉신의 항균능
자연 세팍렉신 및 Fmoc-세파렉신의 항균능을 결정하기 위하여, 자연 세팍렉신 또는 Fmoc-세파렉신의 농도를 증가시키거나 또는 이를 첨가하지 않은 상태에서 스태파일로코커스 아우레우스(0.5㎖/유리관)의 묽은 현탁액을 포함하는 시험관을 37℃에서 6시간 동안 항온처리하였으며, 이어 표 6에 개시된 처리를 수행하였다. 지정된 시간에 일부분을 회수하여 스태파일로코커스 아우레우스에 대한 정균증을 분석하였다. 박테리아의 성장은 분광분석기로 700nm에서 증가된 혼탁도를 관찰함으로써 측정하였다.
자연 세파렉신 및 N-Fmoc-세파렉신의 항균능
화합물 항온처리 (pH 7.4, 37℃) 박테리아 성장의 50% 억제시 농도 (μM) (IC50) 항균능1)(%)
자연 세파렉신 --- 0.9 100
자연 세파렉신 1일 1.5 100
자연 세파렉신 3일 5.3 100
자연 세파렉신 6일 18 100
Fmoc-세파렉신 --- 23 6
Fmoc-세파렉신 1일 15 10
Fmoc-세파렉신 3일 9 59
Fmoc-세파렉신 6일 4.5 100
(1) 숫자는 분석시 대조군으로 이용되는 세파렉신의 효능을 나타내는 것이다. 항온처리는 50mM Hepes 완충액, 20% DMSO에서 자연 세파렉신 또는 N-Fmoc-세파렉신 (100㎍/㎖)을 가지고 pH 7.4에서 수행하였다.
상기 표 6에서 확인할 수 있듯이, N-Fmoc-세파렉신은 활성을 띠지 아니 하였다 (약 6%). 6일 동안의 전항온처리 (pH 7.4, 37℃)에 의해 자연 세파렉신이 형성되었으며, 이는 HPLC 및 모화합물의 항균능의 약 50% 회복을 통해 확인할 수 있었다. 자연 세파렉신은 항온처리시 상당한 시간-의존 자연적 불활성을 나타냈으나, N-Fmoc-세파렉신은 동일한 조건하에서 보다 안정된 특성을 보였다. 따라서, 생체내에서 N-Fmoc-세파렉신의 연장된 작용은 분해 기작을 회피하는 능력 이외에 생리학적 pH 및 온도하에서의 향상된 화학적 안정성에 기인한 것임을 알 수 있다. N-Fmoc-세파렉신은 모화합물보다 페니실리나제에 의한 가수분해에 대해 보다 향상된 안정성을 갖는다.
(ⅱ) 세파렉신-O-Fm 에스테르의 제조 (세파렉신 플루오레닐메틸에스테르)
(a) N-Boc-세파렉신
세파렉신 수화물 (50mg, 0.144mmole) 및 DCM (3㎖)내의 트리에틸아민 (29mg, 0.288mmole)이 교반된 얼음-냉각 현탁액에 DCM (2.5㎖) 내의 디-터트-부틸 디카보네이트 (94.2mg, 0.432mmole) 용액을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 TLC (1-부탄올:아세트산:물, 8:1:1)로 니하이드린-양성 출발물질이 검출되지 아니할 때까지 실온까지 가온하고 하룻밤 동안 교반하였다. 이어 상기 반응 혼합물을 DCM (2.5㎖)로 희석하고, 산성화된 물 (약 pH 2), 물 및 소금물로 추출하였으며, 무수 MgSO4상에서 건조시켰다. 농축한 다음, 석유 에테르 (비등점 40-60℃)를 첨가하여 침전시켰으며, 이어 여과하고 석유 에테르로 세척하였다. 생성물은 균일하였고, 이는 TLC 및 HPLC로 확인하였다.
(b) 세파렉신-O-Fm 에스테르
N-Boc-세파렉신 (25mg, 0.056mmole)의 얼음-냉각 교반된 용액에 DCM (2.5㎖) 내의 9-플루오레닐메탄올 (22mg, 0.112mmole) 및 4-디메틸아미노피리딘 (13.7mg, 0.112mmole)을 20분 동안 점적하였다. 이어, 혼합물을 실온에서 교반하고 디시클로헥실우레아를 제거하기 위하여 여과하였다. 여과액을 DCM (2.5㎖)으로 희석하고, 1M NaHCO3용액, 10% 시트르산, 물 및 소금물로 추출한 다음, 무수 MgSO4상에서 건조시켰다. 그런 다음, 용액을 증발하여 기름성의 고체를 얻었으며, 이를 석유 에테르로 분쇄하여 Boc-세파렉신-OFm을 수득하였다 (TLC 및 HPLC로 확인). 상기 Boc 부위는 TFA:DCM(1:1 v/v)의 1㎖ 용액에 크루드 고체 (25mg)을 용해시킴으로써 제거하였다. 실온에서 20분동안 정치한 다음, TFA를 증발하여 제거하였고, 고체 잔유물을 이소프로판올에 용해시킨 다음, 상기 이소프로판올을 증발시켰다. 상기한 과정을 두 번 반복한다. 크루드 고체를 석유 에테르로 분쇄하여 최종 순수 에스테르를 수득하였으며, 이는 TLC 및 HPLC로 확인하였다.
실시예 9. 디-9-(플루오레닐메톡시카보닐)폴리믹신 B [(Fmoc)2-PMXB]의 제조
폴리믹신 B (PMXB)는 사이클-펩타이드성 항생제의 한 군의 대표적 물질로서, 그람(-) 박테리아에 대해 효과적이다. PMXB는 디아미노부티르산 5 잔기를 포함하고 있으며, 상기 산은 4-(9-플루오레닐메톡시카보닐옥시)페닐-디메틸설포늄 메틸설페이트 (Fmoc-DSP)를 이용하여 Fmoc기를 삽입함으로써 변형시킬 수 있다. Fmoc-DSP 및 펩타이드의 몰비는 PMXB의 변형정도를 결정한다.
(Fmoc)2-PMXB를 제조하기 위하여, H2O (1㎖)내 PMXB (Sigma 미국; 10mg, 7.2μmole) 및 Fmoc-DSP (7.1mg, 14.4μmole)의 교반된 용액에 NaHCO3용액 (0.1M, 0.15㎖)을 점적하였다. 이어, 혼합물을 실온에서 하룻밤동안 교반하였으며, 이에 용액이 혼탁하게 되었다. 제조된 침전물을 원심분리하고, 물로 두 번 세척한 다음, DMF 소량에 용해시켰으며, 에테르로 침전시켜 백색의 크루드 고체를 수득하였다.
자연 PMXB 및 (Fmoc)2-PMXB의 항균능
화합물 처 리 박테리아 성장의 50% 억제시 농도 (μM) (IC50) 항균능1)(%)
자연 PMXB --- 0.05 100
자연 PMXB 3일, 37℃, pH 8.52) 0.1 100
자연 PMXB 6일, 37℃, pH 8.52) 0.2 100
자연 PMXB 3일, 37℃, pH 7.43) 0.055 100
자연 PMXB 6일, 37℃, pH 7.43) 0.228 100
(Fmoc)2-PMXB --- 5 1
(Fmoc)2-PMXB 3일, 37℃, pH 8.52) 0.125 80
(Fmoc)2-PMXB 6일, 37℃, pH 8.52) 0.2 100
(Fmoc)2-PMXB 3일, 37℃, pH 7.43) 0.227 25
(Fmoc)2-PMXB 6일, 37℃, pH 7.43) 0.35 64
(1) 숫자는 분석시 대조군으로 이용되는 PMXB의 효능을 나타내는 것이다.
(2) 항온처리는 1% DMSO를 포함하는 0.1M NaHCO3에서 PMXB 또는 (Fmoc)2-PMXB (100㎍/㎖)을 가지고 pH 8.5에서 수행하였다.
(3) 항온처리는 1% DMSO를 포함하는 50mM Hepes 완충액 (pH 7.4)에서 PMXB 또는 (Fmoc)2-PMXB (100㎍/㎖)을 가지고 pH 7.4에서 수행하였다.
70% 용액 A (물내에 있는 0.1% TFA) 및 30% 용액 B (75:25, 아세토니트릴:물내에 있는 0.1% TFA)로부터 100% 용액 B를 40분 (유속, 0.8㎖/분)동안에 걸쳐 선형구배되는 분석용 HPLC (RP-18; 250×4mm; Merck)는 39분에서 하나의 주 생성물이 용출됨을 보여주었다 (상기 조건하에서 PMXB의 보류시간은 13.5분). 크루드 고체를 정제용 HPLC에 적용하여 순수한 생성물을 얻었다. 매스 스펙트럼을 이용한 (Fmoc)2-PMXB의 분석을 통하여 기대되는 분자량을 얻었다 (M/Z 1647 [M-H]+).
(Fmoc)2-PMXB 및 자연 PMXB의 항균능을 다음과 같은 조건으로 분석하였다: 대장균의 희석된 현탁액 (유리관 당 0.5㎖)을 37℃에서 6시간동안 (Fmoc)2-PMXB 및 자연 PMXB의 증가된 농도의 첨가 또는 첨가없이 항온처리하였다. 지정시간에, 일부분을 회수하여 대장균에 대한 정균능을 분석하였으며, 박테리아의 성장은 700nm에서의 혼탁도를 측정함으로써 평가하였다.
표 7에서 볼 수 있듯이, (Fmoc)2-PMXB는 활성을 띠지 아니하였으며 (약 1%), pH 8.5 및 7.4에서 각각 약 3일 및 1일의 t1/2의 값을 보이면서 활성 PMXB로 가수분해되었다.
실시예 10. 피페라실린-플루오레닐메틸 에스테르 (피페파실린-O-Fm)의 제조
피페라실린 (4-에틸-2,3-디옥소피페라지네카보닐 암피실린)은 넓은 스펙트럼을 갖는 페니실린과 관계되는 반-합성 항생제로서, 구강투여시에는 효과가 없다.
피페라실린 (자유 카복실)은 에틸아세테이트에 의한 산성 추출에 의해 피페라실린 소듐 염 (Sigma, 미국)으로부터 제조하였다. 피페라실린-OFm을 상시 실시예 8에 개시된 세파렉신-OFm 에스테르의 제조방법에 따라 제조하였는 바, 카복실 1당량과 9-플루오레닐메탄올, 4-디메틸아미노피리딘 및 DCC 각각 2당량을 반응시킴으로써 제조하였다. 크루드 고체를 DCM-에테르로부터 재결정화 하였으며, 이에 순수한 생성물을 얻을 수 있었고, 이는 TLC 및 HPLC로 확인하였다.
실시예 11. Fmoc-프로프라노롤의 제조
프로프라노롤 [1-(이소프로필아미노)-3-(1-나프틸옥시)-2-프로파놀]은 β차단제군의 대표적 물질로서, 항고혈압제, 항부정맥제 및 항협심제로 이용되는 β-아드레날린성 길항제이다. 프로프라노롤은 β-아드레날린성 수용체에 결합하지만 이를 활성화하지는 않는다. β-아드레날린성 길항제와의 상기 위치에 대한 경쟁은 고혈압 증세를 약화시킨다. 프로프라노롤은 환자에게 매일 구강투여된다. 한편, 자연에서 발견되는 β-아드레날린성 길항제의 대부분은 비교적 친수성을 띠고 있으며, 구강으로 투여되는 경우에는 효과적으로 흡수되지 않으며, 그 예로서 아세틸부토롤, 아세노롤, 베탁소롤, 카르테오롤, 나도롤 및 소타롤이 있다.
Fmoc-프로프라노롤을 제조하기 위하여, DCM (2.5㎖)내의 Fmoc-OSu (170mg, 0.50mmole) 용액을 5분에 걸쳐 디클로로클로라이드 (DCM, 2.5㎖)에 용해되어 있는 트리에틸아민 (34mg, 0.34mmole) 및 (±)-프로프라노롤 하이드로클로라이드 (50mg, 0.17mmole)의 교반된 용액에 적가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반하고, 산성화된 물 (약 pH 2), 물 및 소금물로 추출하였으며, 무수 MgSO4상에서 건조시켰다. 이어, 용액을 증발시켜 크루드 고체를 얻었으며, 이를 헥산으로 분쇄하여 Fmoc-프로프라노롤을 수득하였다. 상기 생성물을 TLC (1-부탄올:아세트산:물, 8:1:1) 및 HPLC로 확인함으로써, 순수한 화합물임을 알 수 있었다 (동일 조건하에서, 프로프라노롤 및 Fmoc-프로프라노롤의 보류시간은 각각 16분 및 51분임). 매스 스펙트럼 (FAB)은 타당한 M/Z: 482.2[M+H]+를 나타내었다.
Fmoc-프로프라노롤의 β-아드레날린성 효능을 분석하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다. 신선하게 마련된 래트 지방세포를 이소프로테레놀 (최종 농도 1㎍/㎖, 4μM) 및 프로프라노롤 (원), Fmoc-프로프라노롤 (채워진 원)과 37℃에서 2시간동안 항온 처리하였고, pH 8.5 및 37℃에서 7일동안 Fmoc-프로프라노롤 (사각형)과 항온 처리하였다. 미디엄으로 배출된 글리세롤의 양은 Shechter, 1982에 개시된 방법에 따라 결정하였다. IC50은 이소프로테레놀-매개 글리세롤 방출의 최대속도를 1/2로 억제하는 프로프라노롤 또는 N-Fmoc-프로프라노롤 유도체의 양 (μM)이다.
도 7에서 볼 수 있듯이, Fmoc-프로프라노롤은 자연 프로프라노롤의 효능의 약 7%를 갖는다. Fmoc-프로프라노롤을 pH 8.5 (37℃)에서 7일 동안 항온처리한 경우에는 자연 의약 β-아드레날린성 효능의 50-70%를 야기한다. 상기 유도체는 위장 흡수를 촉진케 하는 특징인 상당한 소수성을 갖는다.
참조 문헌
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Claims (27)

  1. 생리적 조건하에서 본래의 활성 의약분자로 서서히 가수분해되고, 본래의 의약분자의 자유 아미노, 하이드록시, 메르캅토 및/또는 카르복실기 중 최소 1종 이상이, 약 염기에 민감하고 약 염기 조건하에서 제거되는 작용기로 치환된 것을 특징으로 하는 프로드러그 또는 이의 약제학적으로 적합한 염.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 프로드러그는 다음과 같은 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 프로드러그 또는 이의 약제학적으로 적합한 염:
    X - Y
    상기 화학식에서,
    Y는 자유 아미노, 카복실, 하이드록실 및/또는 메르캅토기에서 선택되는 최소 1종 이상의 작용기를 갖는 의약의 일부위; 그리고
    X는 다음 화학식 (i) 내지 (iv)의 라디칼에서 선택되는 1종의 라디칼:
    상기 화학식에서, R1및 R2는 서로 동일하거나 상이한 것으로서, 각각 수소, 알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 아릴, 알카릴, 아랄킬, 할로겐, 니트로, 설포, 아미노, 암모늄, 카복실, PO3H2또는 OPO3H2이고; R3및 R4는 서로 동일하거나 상이한 것으로서, 각각 수소, 알킬 또는 아릴이며; 그리고, A는 라디칼이 Y의 카복실 또는 메르캅토기에 결합되어 있는 경우에는 공유결합, 또는 라디칼이 Y의 아미노 또는 하이드록실기에 결합되어 있는 경우에는 OCO-이다.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 Y는 항당뇨제, 항생제, 합성 항균제, 진통제, 항염증제, 항알러지제, 항천식제, 항고콜레스테롤제, β-아드레날린성 차단제, 항고혈압제, 항종양제 및 항바이러스제로 구성된 군에서 선택되는 인간 또는 수의학적 용도의 의약의 일부위인 것을 특징으로 하는 프로드러그.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 Y는 R1이 수소 또는 설포 그리고 R2, R3및 R4가 수소인 라디칼 (i)로 구성된 최소 1종 이상의 라디칼 X로 치환된 것임을 특징으로 하는 프로드러그.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 Y는 자유 아미노 및/또는 카복실기 및 광학적 자유 하이드록실기가 상기 최소 1종 이상의 라디칼 (i)에 의해 치환된 인슐린 또는 인슐린 분자의 일부위인 것임을 특징으로 하는 프로드러그.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 인슐린은 하나 또는 둘 이상의 아미노기가 R1내지 R4가 수소이고 A가 OCO-인 9-플루오레닐메톡시카보닐 라디칼 (i)로 치환된 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체 (이하, N-(Fmoc)-인슐린이라 한다).
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 인슐린은 하나 또는 둘 이상의 카복실기가 R1내지 R4가 수소이고 A가 공유결합인 9-플루오레닐메틸 라디칼 (i)로 치환된 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체 (이하, C-(Fm)-인슐린이라 한다).
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 인슐린은 하나 또는 둘 이상의 아미노기가 Fmoc 라디칼에 의해 치환되고 하나 또는 둘 이상의 카복실기가 Fm 라디칼에 치환된 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체 (이하, N-(Fmoc), C-(Fm)-인슐린이라 한다).
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 인슐린은 하나 또는 둘 이상의 카복실기가 Fm 라디칼에 치환되고 하나 또는 둘 이상의 하이드록실기가 Fmoc 라디칼에 의해 치환된 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체 (이하, C-(Fm), O-(Fmoc)-인슐린이라 한다).
  10. 제 5 항에 있어서, 상기 인슐린은 하나 또는 둘 이상의 아미노 및 카복실기가 Fmoc 라디칼에 치환되고 하나 또는 둘 이상의 하이드록실기가 Fm 라디칼에 의해 치환된 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체 (이하, N,O-(Fmoc), C-(Fm)-인슐린이라 한다).
  11. 제 5 항에 있어서, 상기 인슐린은 GlyA1, PheB1또는 LysB29위치의 자유 아미노기에서 1 내지 3개의 Fmoc 치환기를 갖으며, 상기 A 및 B는 인슐린 분자의 사슬이고, GlyA1-N-(Fmoc)-인슐린, PheB1-N-(Fmoc)-인슐린, LysB29-N-(Fmoc)-인슐린, GlyA1, PheB11-N-(Fmoc)2-인슐린, GlyA1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린, PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-인슐린 및 GlyA1, PheB1, LysB29-N-(Fmoc)3-인슐린의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
  12. 제 5 항에 있어서, 상기 인슐린은 GlyA1, PheB1또는 LysB29위치의 자유 아미노기에서 1 내지 3개의 2-설포-Fmoc 치환기 (이하, Sulfmoc라 한다)를 갖으며, 상기 A 및 B는 인슐린 분자의 사슬이고, GlyA1-N-(Sulfmoc)-인슐린, PheB1-N-(Sulfmoc)-인슐린, LysB29-N-(Sulfmoc)-인슐린, GlyA1, PheB11-N-(Sulfmoc)2-인슐린, GlyA1, LysB29-N-(Sulfmoc)2-인슐린, PheB1, LysB29-N-(Sulfmoc)2-인슐린 및 GlyA1, PheB1, LysB29-N-(Sulfmoc)3-인슐린으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
  13. 제 5 항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인슐린은 자연, 재조합 또는 돌연변이된 인간, 소 또는 돼지의 (Fmoc, Sulfomoc 또는 Fm)-인슐린 유도체인 것을 특징으로 하는 인슐린 유도체.
  14. 인간 및 소 성장 호르몬으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 Fmoc-성장 호르몬.
  15. N-Fmoc-세파렉신 및 세파렉신 플루오레닐메틸 에스테르로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 Fmoc 세파렉신.
  16. 디-(플루오레닐메톡시카보닐)-폴리믹신 B.
  17. 피레라실린 플루오레닐메틸 에스테르.
  18. Fmoc-프로프라노롤.
  19. 제 1 항 내지 18항 중 어느 한 항의 프로드러그 또는 이의 약제학적으로 적합한 염 그리고 약제학적으로 적합한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 조성물은 제 5 항 내지 13항 중 어느 한 항의 N-(Fmoc)-인슐린을 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 조성물은 자연 또는 재조합 인간 N-(Fmoc)3-인슐린 및/또는 자연 및/또는 재조합 인간 N-(Fmoc)2-인슐린을 포함하는 약제학적 조성물.
  22. 제 19 항 내지 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 피하 주입, 경피 또는 경구 투여용인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  23. 약제학적 조성물의 제조에 이용되는 제 1 항 내지 18 항 중 어느 한 항의 프로드러그의 용도.
  24. 제 5 항 내지 13 항 중 어느 한 항의 인슐린 유도체 1종 이상의 효과량을 당뇨병 환자에게 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 치료방법.
  25. 제 24 항에 있어서, N-(Fmoc)2-인슐린 및 N-(Fmoc)3-인슐린의 효과량을 5-8일 간격으로 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료방법.
  26. 제 24 항 또는 25 항에 있어서, 상기 N-(Fmoc)-인슐린은 피하 주입하여 투여하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료방법.
  27. 제 24 항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 인슐린을 매일 주입하여 투여하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료방법.
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