KR101205272B1 - 아실화된 ｇｌｐ-1 화합물 - Google Patents

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Abstract

지연형 GLP-1 화합물 및 이것의 치료학적 사용.
GLP-1 화합물, GLP-1 유사체, 지연형, 작용시간, 아실화, 당뇨병, 치료

Description

아실화된 ＧＬＰ-1 화합물{ACYLATED GLP-1 COMPOUNDS}
본 발명은 치료학적 펩티드 분야, 즉 새로운 지연형 GLP-1 화합물에 관한 것이다.
생체내에서 더욱 긴 작용 지속기간을 제공하기 위하여 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1) 화합물의 구조를 변형하는데 있어서 많은 상이한 접근법들이 사용되었다. WO 96/29342는 C-말단 아미노산 잔기 또는 N-말단 아미노산 잔기에 친유성 치환기를 도입함으로써 모 펩티드 호르몬을 변형시킨 펩티드 호르몬 유도체를 개시한다. WO 98/08871은 모 펩티드의 적어도 1개의 아미노산 잔기에 친유성 치환기가 부착된 GLP-1 유도체를 개시한다. WO 99/43708은 C-말단 아미노산 잔기에 친유성 치환기가 부착된 GLP-1(7-35) 및 GLP-1(7-36) 유도체를 개시한다. WO 00/34331은 아실화된 GLP-1 유사체를 개시한다. WO 00/69911은 환자에게 주사되는 활성화 인슐린분비 펩티드를 개시하는데, 이것은 혈액 성분과 반응하여 콘쥬게이트를 형성하고, 주장에 따르면 이로써 생체내에서 더욱 긴 작용 지속기간을 제공할 것으로 생각된다. WO 02/46227은 생체내 반감기를 연장하기 위하여 사람 혈청 알부민과 융합된 GLP-1 및 엑센딘-4 유사체를 개시한다.
특히 2형 당뇨병 부문에서 많은 당뇨병 환자들은 소위 "바늘-공포증"을 경험 하는데, 즉 자신에게 주사를 놓는 것에 대해 실질적인 공포를 느낀다. 2형 당뇨병 부문에서 대부분의 환자들은 경구 혈당강하제로 치료되며, GLP-1 화합물은 이들 환자들에 투여될 최초의 주사가능한 제품인 것으로 기대되므로, 주사에 대한 공포는 임상적으로 매우 유망한 GLP-1 화합물의 광범한 사용에 심각한 장애가 될 수 있다. 따라서, 1일 1회 미만으로, 예를 들어 2일마다 1회 또는 3일마다 1회, 바람직하게는 1주에 1회 투여되면서 용인가능한 임상 프로파일을 유지할 수 있는 새로운 GLP-1 화합물을 개발할 필요가 있다.
발명의 개요
본 발명은 서열 GLP-1(7-37)(SEQ ID No. 1)에 관하여 위치 7 및/또는 8에 있는 적어도 하나의 비-프로테오제닉(non-proteogenic) 아미노산 잔기가 변형된 GLP-1 유사체를 제공하며, 이 유사체는 위치 26에 있는 리신 잔기에서 적어도 2개의 산성 기를 포함하는 부분으로 아실화되고, 그 중 1개의 산성 기는 말단에 부착된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 제약 조성물, 및 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 본 발명에 따른 화합물의 사용을 제공한다.
본 발명은 환자에서 GLP-1 유사체의 작용시간을 증가시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 GLP-1 유사체를, 상기 GLP-1 유사체의 위치 26에 있는 리신 잔기 상에서, 전술한 청구항 중 어느 한 항에 개시된 부분 B-U'로 아실화하는데 특징이 있다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에서 다음의 용어들은 나타낸 의미를 가진다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 5개의 구성 아미노산으로 이루어진 화합물을 의미한다. 구성 아미노산은 유전암호에 의해 암호화된 아미노산들의 군으로부터 유래될 수 있고, 이것들은 유전암호에 의해 암호화되지 않는 천연 아미노산일 수도 있고, 그뿐만 아니라 합성 아미노산일 수도 있다. 유전암호에 의해 암호화되지 않는 천연 아미노산은, 예를 들어 γ-카르복시글루타메이트, 오르니틴, 포스포세린, D-알라닌 및 D-글루타민이다. 합성 아미노산은 화학적 합성에 의해 제조된 아미노산들, 즉 D-알라닌 및 D-로이신과 같은 유전암호에 의해 암호화된 아미노산의 D-이성질체, Aib(α-아미노이소부티르산), Abu(α-아미노부티르산), Tle(tert-부틸글리신), β-알라닌, 3-아미노메틸벤조산, 안트라닐산을 포함한다.
22개의 프로테오제닉(proteogenic) 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 시스틴, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 히드록시프롤린, 이소로이신, 로이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린이다.
이와 같이, 비-프로테오제닉 아미노산은 펩티드 결합에 의해 펩티드에 포함될 수는 있지만 프로테오제닉 아미노산은 아닌 부분이다. 예들은 γ-카르복시글루타메이트, 오르니틴, 포스포세린, D-알라닌 및 D-글루타민과 같은 D-아미노산류이다. 합성 비-프로테오제닉 아미노산은 화학적 합성에 의해 제조된 아미노산들, 즉 D-알라닌 및 D-로이신과 같은 유전암호에 의해 암호화된 아미노산의 D-이성질체들, Aib(α-아미노이소부티르산), Abu(α-아미노부티르산), Tle(tert-부틸글리신), 3-아미노메틸벤조산, 안트라닐산, 데스-아미노-히스티딘, β-알라닌 등과 같은 아미노산의 베타 유사체, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, Nα-아세틸-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌, (1-아미노시클로프로필)카르복실산, (1-아미노시클로부틸)카르복실산, (1-아미노시클로펜틸)카르복실산, (1-아미노시클로헥실)카르복실산, (1-아미노시클로헵틸)카르복실산 또는 (1-아미노시클로옥틸)카르복실산을 포함한다.
본원에서 폴리펩티드를 언급하며 사용된 용어 "유사체"는 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고 및/또는 펩티드로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되고 및/또는 펩티드로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되고 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩티드에 추가된 변형된 펩티드를 의미한다. 아미노산 잔기의 이러한 추가 또는 결실은 펩티드의 N-말단 및/또는 펩티드의 C-말단에서 발생할 수 있다. 유사체를 설명하기 위해서 간단한 시스템이 주로 사용된다: 예를 들어, [Arg34]GLP-1(7-37)Lys은 위치 34에 있는 자연발생 리신이 아르기닌으로 치환되고 말단 아미노산 잔기, 즉 Gly37에 리신이 추가된 GLP-1(7-37) 유사체를 나타낸다. 광학 이성질체를 언급하지 않은 모든 아미노산은 L-이성질체를 의미함이 이해되어야 한다. 본 발명의 구체예에서, 최대 17개의 아미노산이 변형된다. 본 발명의 구체예에서, 최대 15개의 아미노산이 변형된다. 본 발명의 구체예에서, 최대 10개의 아미노산이 변형된다. 본 발명의 구체예에서, 최대 8개의 아미노산이 변형된다. 본 발명의 구체예에서, 최대 7개의 아미노산이 변형된다. 본 발명의 구체예에서, 최대 6개의 아미노산이 변형된다. 본 발명의 구체예에서, 최대 5개의 아미노산이 변형된다. 본 발명의 구체예에서 최대 4개의 아미노산이 변형된다. 본 발명의 구체예에서, 최대 3개의 아미노산이 변형된다. 본 발명의 구체예에서, 최대 2개의 아미노산이 변형된다. 본 발명의 구체예에서, 1개의 아미노산이 변형된다.
펩티드와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "유도체"는 미변형 펩티드 또는 그 유사체에는 적어도 하나의 치환기가 존재하지 않는 화학적으로 변형된 펩티드 또는 그 유사체, 즉 공유 변형된 펩티드를 의미한다. 전형적인 변형은 아미드, 탄수화물, 알킬기, 아실기, 에스테르 등이다. GLP-1(7-37)의 유도체의 예는 Nε26-((4S)-4-(헥사데카노일아미노)-카르복시-부타노일)[Arg34,Lys26]GLP-1-(7-37)이다.
본원에서 사용된 용어 "GLP-1 펩티드"는 GLP-1(7-37)(SEQ ID No. 1), GLP-1(7-37) 유사체, GLP-1(7-37) 유도체 또는 GLP-1(7-37) 유사체의 유도체를 의미한다. 한 구체예에서, GLP-1 펩티드는 인슐린분비제이다.
본원에서 사용된 용어 "인슐린분비제"는 사람 GLP-1 수용체의 작용제인 화합물, 즉 사람 GLP-1 수용체를 함유하는 적합한 배지에서 cAMP의 형성을 자극하는 화합물을 의미한다(한 이러한 배지가 하기 개시된다). 인슐린분비제의 효능은 하기 설명된 대로 용량-반응 곡선으로부터 EC50 값을 계산함으로써 측정된다:
클론된 사람 GLP-1 수용체를 발현하는 어린 햄스터 신장(BHK) 세포(BHK-467-12A)를 100IU/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신, 5% 태아소 혈청 및 0.5mg/mL Geneticin G-418(Life Technologies)이 첨가된 DMEM 배지에서 성장시켰다. 세포를 식염수 완충 포스페이트로 2번 세척하고 Versene을 사용, 채집했다. Ultraturrax를 사용하여 버퍼 1(20mM HEPES-Na, 10mM EDTA, pH 7.4) 중에서 균질화하여 세포로부터 원형질막을 제조했다. 균질물을 4℃에서 15분간 48,000 x g로 원심분리했다. 펠릿을 버퍼 2(20mM HEPES-Na, 0.1mM EDTA, pH 7.4) 중에서 균질화하여 현탁한 다음, 4℃에서 15분간 48,000 x g로 원심분리했다. 세척 과정을 한번 더 반복했다. 펠릿을 버퍼 2 중에 현탁하여 바로 분석에 사용하거나, -80℃에 보관했다.
인슐린분비제에 의한 자극에 대한 반응으로서 순환 AMP(cAMP)를 측정함으로써 기능적 수용체 분석을 수행했다. AlphaScreen™ cAMP 키트(Perkin Elmer Life Sciences)로 형성된 cAMP를 정량했다. 반-면적 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 1mM ATP, 1μM GTP, 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX), 0.01% Tween-20, 0.1% BSA, 6㎍ 막 제제, 15㎍/mL 어셉터 비즈, 6nM 비오티닐-cAMP와 함께 예비 인큐베이션된 20㎍/mL 도너 비즈와 함께 총 부피 50㎕의 버퍼 3(50mM 트리스-HCl, 5mM HEPES, 10mM MgCl2, pH 7.4) 중에서 인큐베이션했다. 작용제 활성에 대해 시험될 화합물을 버퍼 3에 용해하여 희석시켰다. GTP는 실험마다 새로 제조했다. 플레이트를 실온의 암소에서 느리게 교반하면서 3시간 동안 인큐베이션한 후, Fusion™ 기기(Perkin Elmer Life Sciences)에서 계수했다. 각 화합물에 대한 농도-반응 곡선을 그렸고, Prism v. 4.0(GraphPad, Carlsbad, CA)의 4개 매개변수 논리모델을 이용하여 EC50 값을 추정했다.
본원에서 폴리펩티드를 언급하며 사용된 용어 "DPP-IV 보호된"은 혈장 펩티다제 디펩티딜 아미노펩티다제-4(DPP-IV)에 대한 저항성을 부여하기 위하여 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 의미한다. 혈장 중의 DPP-IV 효소는 몇몇 펩티드 호르몬, 예를 들어 GLP-1, GLP-2, 엑센딘-4 등의 변성에 연관된다고 알려져 있다. 따라서, DPP-IV에 의한 변성 속도를 감소시킬 목적으로 DPP-IV 매개 가수분해에 민감한 폴리펩티드의 유사체 및 유도체를 개발하려는 상당한 노력이 있어 왔다. 한 구체예에서, DPP-IV 보호된 펩티드는 GLP-1(7-37) 또는 엑센딘-4(1-39)에 비해 DPP-IV에 더욱 저항성이다.
디펩티딜 아미노펩티다제 IV에 의한 변성에 대한 펩티드의 저항성은 다음의 변성 분석에 의해 측정된다:
펩티드(5nmol)의 알리쿼트를 5mU의 효소 활성에 해당하는 1㎕의 정제된 디펩티딜 아미노펩티다제 IV와 함께 0.1M 트리에틸아민-HCl 버퍼, pH 7.4 100㎕ 중에서 37℃에서 10-180분간 인큐베이션한다. 10% 트리플루오로아세트산 5㎕를 가하여 효소반응을 종결시키고, 펩티드 변성 산물을 분리하여 HPLC 분석을 이용, 정량한다. 이 분석을 수행하는 한 방법은 다음과 같다: 혼합물을 Vydac C18 와이드포어 (30nm 기공, 5㎛ 입자) 250 x 4.6mm 칼럼 위로 적용하고, Siegel 등, Regul. Pept. 1999; 79:93-102 및 Mentlein 등, Eur. J. Biochem. 1993; 214:829-35에 따라서 0.1% 트리플루오로아세트산 중 아세토니트릴의 단계적 선형 구배(0% 아세토니트릴 3분, 0-24% 아세토니트릴 17분, 24-48% 아세토니트릴 1분)로 1mL/분의 유속으로 용출한다. 펩티드와 그 변성 산물은 220nm(펩티드 결합) 또는 280nm(방향족 아미노산)에서의 흡광도에 의해 모니터될 수 있으며, 표준물질의 피크 면적에 관하여 이것들의 피크 면적을 적분함으로써 정량된다. 디펩티딜 아미노펩티다제 IV에 의한 펩티드 가수분해 속도는 10% 미만의 펩티드가 가수분해된 인큐베이션 시간에서 추정된다.
본원에서 사용된 용어 "C1 -6-알킬"은 1 내지 6개 탄소 원자를 갖는 포화, 분지형, 직쇄상 또는 환상 탄화수소기를 의미한다. 대표적인 예들은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸, n-헥실, 이소헥실, 시클로헥산 등을 포함하나, 이것들에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "제약학적으로 허용되는"은 일반적인 제약학적 용도에 적합하다는 의미로서, 즉 환자 등에서 부작용이 일어나지 않는다는 의미이다.
본원에서 사용된 용어 "부형제"는 제약 조성물에 통상 첨가되는 화학적 화합물, 예를 들어 버퍼, 등장제, 보존제 등을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "유효량"은 치료하지 않은 것에 비하여 환자의 치료에 효과적인 충분한 용량을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "제약 조성물"은 활성 화합물 또는 그 염을 버퍼, 보존제, 및 선택적으로 장성 변형제 및/또는 안정제와 같은 제약학적 부형제와 함께 포함하는 생성물을 의미한다. 따라서, 제약 조성물은 본 분야에서 제약 제제라고도 공지된다.
본원에서 사용된 용어 "질환의 치료"는 질환, 상태 또는 장애가 발생한 환자의 관리 및 돌봄을 의미한다. 치료의 목적은 질환, 상태 또는 장애에 대항하는 것이다. 치료는 활성 화합물을 투여하여 질환, 상태 또는 장애를 제거하거나 제어하는 것뿐만 아니라, 질환, 상태 또는 장애와 관련된 증상이나 합병증을 완화하는 것을 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 알부민과 GLP-1 수용체에 동시에 결합할 수 있는 아실화된 GLP-1 유사체에 관한 것이다.
다른 양태로서, 본 발명은 2% 알부민의 존재하에 100nM 이하, 바람직하게는 30nM 이하의 친화력으로 GLP-1 수용체와 결합하는 아실화된 GLP-1 유사체에 관한 것이다.
다른 양태로서, 본 발명은 매우 낮은 농도(예를 들어, 0.005% 내지 0.2%)의 사람 알부민의 존재하의 친화력과 2% 사람 알부민의 존재하의 친화력을 비교했을 때, GLP-1 수용체에 대한 친화력이 단지 부분적으로만 감소되는 아실화된 GLP-1 유사체에 관한 것이다. 이들 조건하에서 결합 친화력의 이동은 50배 미만, 바람직하게는 30배 이하, 더 바람직하게는 10배 이하이다.
본원에서 사용된 용어 "알부민 결합 부분"은 사람 혈청 알부민에 비-공유 결합하는 잔기를 의미한다. 치료학적 폴리펩티드에 부착된 알부민 결합 잔기는 전형적으로 사람 혈청 알부민에 대해 10μM 이하, 바람직하게는 1μM 이하의 친화력을 가진다. 알부민 결합 잔기의 범위는 4-40개 탄소 원자를 함유하고 말단 산성 기를 갖는 선형 및 분지형 친유성 부분으로서 공지되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "친수성 링커"는 적어도 5개의 비-수소 원자를 포함하며, 이들 중 30-50%가 N 또는 O인 화학적 부분을 갖는, 알부민 결합 잔기와 펩티드를 분리하는 스페이서를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "산성 기"는 생리학적 pH에서 완전히 또는 부분적으로 음으로 하전되는 유기 화학기를 의미한다. 이러한 기들의 pKa 값은 7 이하, 바람직하게는 5 이하이다. 이것들은 생리학적 pH에서 완전히 또는 부분적으로 음으로 하전되는 카르복실산, 술폰산, 인산 또는 헤테로환 고리 시스템을 포함하나, 이것들에 제한되는 것은 아니다.
하기 구조 식 II에서, 부분 U는 말단 기 B와 펩티드에 있는 리신 아미노산의 아미노기에 2가지 상이한 방식으로 부착될 수 있는 디-라디칼이다. 본 발명의 구체예에서, 구조 식 II에서 U의 알킬 사슬 단부에는 B 기가 부착되고, 나머지 단부에는 펩티드가 부착된다.
하기 식들에서, 부착된 기들에서의 말단 결합은 부착 결합으로서 간주하며, 다른 언급이 없다면 메틸렌기에서 끝나지 않는 것으로 간주한다.
하기 식들에서,
Figure 112007054394073-pct00001
은 GLP-1 유사체의 H2N-His-Aib-N-말단을 의미한다.
한 구체예에서, 본 발명은 비-천연 아미노산 링커에 의해 위치 26의 리신 잔기에 부착된 적어도 2개의 자유 산성 화학기를 함유하는 친유성 알부민 결합 부분으로 아실화된 GLP-1 유사체를 제공한다.
구체예에서, 자유 산성 화학기란 용어는 본원에서 사용된 "산성 기"와 동일한 의미로서 이해되어야 한다.
한 구체예에서, 본 발명은 서열 GLP-1(7-37)(SEQ ID No. 1)에 관하여 위치 7 및 8에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 변형에 의하여 DPP-IV에 대해 안정화된 아실화된 GLP-1 유사체를 제공하며, 상기 아실화는 선택적으로 비-천연 아미노산 친수성 링커에 의하여 위치 26의 리신 잔기에 부착된 2산이다.
본 발명의 한 구체예에서, GLP-1 유사체는 서열 GLP-1(7-37)(SEQ ID No. 1)에 관하여 위치 7 및/또는 8에 있는 적어도 하나의 비-프로테오제닉 아미노산 잔기가 변형되고, 위치 26의 리신 잔기에서 적어도 2개의 산성 기를 포함하는 부분으로 아실화되며, 그 중 1개의 산성 기는 말단 부착된다.
구체예는 상기 구체예들에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 위치 26에 부착된 부분은 친수성 링커를 포함한다.
구체예는 상기 구체예들에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 친수성 링커는 적어도 5개의 비-수소 원자를 포함하며, 이들 중 30-50%가 N 또는 O이다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 위치 26에 부착된 부분은 친수성 링커에 의해 펩티드로부터 분리된 알부민 결합 부분을 포함한다.
구체예는 상기 구체예들에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 알부민 결합 부분은 4-40개 탄소 원자를 함유하고 말단 산성 기를 갖는 선형 또는 분지형 친유성 부분이다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 아실화된 부분은 B-U'이며, 여기서 U'는 하기 구조들로부터 선택되고,
Figure 112007054394073-pct00002
B는 하기 구조들로부터 선택된 산성 기이다:
Figure 112007054394073-pct00003
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 이것은 식 I의 화합물(SEQ ID No. 2)이다:
(식 I)
Figure 112007054394073-pct00004
상기 식에서,
Xaa7은 L-히스티딘, 이미다조프로피오닐, α-히드록시-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, Nα-아세틸-히스티딘, Nα-포르밀-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌이고;
Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Thr, Ser, Lys, Aib, (1-아미노시클로프로필)카르복실산, (1-아미노시클로부틸)카르복실산, (1-아미노시클로펜틸)카르복실산, (1-아미노시클로헥실)카르복실산, (1-아미노시클로헵틸)카르복실산 또는 (1-아미노시클로옥틸)카르복실산이고;
Xaa16은 Val 또는 Leu이고;
Xaa18은 Ser, Lys 또는 Arg이고;
Xaa19는 Tyr 또는 Gln이고;
Xaa20은 Leu 또는 Met이고;
Xaa22는 Gly, Glu 또는 Aib이고;
Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이고;
Xaa25는 Ala 또는 Val이고;
Xaa27은 Glu 또는 Leu이고;
Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이고;
Xaa33은 Val 또는 Lys이고;
Xaa34는 Lys, Glu, Asn 또는 Arg이고;
Xaa35는 Gly 또는 Aib이고;
Xaa36은 Arg, Gly 또는 Lys이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Pro, Lys이거나, 또는 존재하지 않고;
B와 U'는 함께 아실화된 부분이며,
여기서 U'는 하기 구조들로부터 선택되고,
Figure 112007054394073-pct00005
B는 하기 구조들로부터 선택된 산성 기이다:
Figure 112007054394073-pct00006
한 구체예에서, 본 발명은 식 II의 화합물(SEQ ID No. 3)인 화합물을 제공한다:
(식 II)
Figure 112007054394073-pct00007
식 II는 상기 구체예에서 언급된 식 I과 동일한데, 식 II에서는 부분 B-U가 B-U'를 대신한다. U'에는 카르복시기가 포함되지만 U에는 부착 카르복시기가 없다는 점에만 차이가 있다.
식 II에서 각 Xaa들은 다음을 의미한다:
Xaa7은 L-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, Nα-아세틸-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌이고;
Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, (1-아미노시클로프로필)카르복실산, (1-아미노시클로부틸)카르복실산, (1-아미노시클로펜틸)카르복실산, (1-아미노시클로헥실)카르복실산, (1-아미노시클로헵틸)카르복실산 또는 (1-아미노시클로옥틸)카르복실산이고;
Xaa16은 Val 또는 Leu이고;
Xaa18은 Ser, Lys 또는 Arg이고;
Xaa19는 Tyr 또는 Gln이고;
Xaa20은 Leu 또는 Met이고;
Xaa22는 Gly, Glu 또는 Aib이고;
Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이고;
Xaa25는 Ala 또는 Val이고;
Xaa27은 Glu 또는 Leu이고;
Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이고;
Xaa33은 Val 또는 Lys이고;
Xaa34는 Lys, Glu, Asn 또는 Arg이고;
Xaa35는 Gly 또는 Aib이고;
Xaa36은 Arg, Gly 또는 Lys이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Pro, Lys이거나, 또는 존재하지 않고;
Xaa38은 Lys, Ser, 아미드이거나, 또는 존재하지 않고;
여기서 U는 하기 구조들로부터 선택된 스페이서이고,
Figure 112007054394073-pct00008
B는 하기 구조들로부터 선택된 산성 기이다:
Figure 112007054394073-pct00009
하기 구체예들에서, 식 I에서 U'를 언급할 때, 그것은 또한 식 II 및 U를 언급하는 것으로서도 이해되어야 하며, 이때의 유일한 차이는 카르복시기이다.
구체예는 상기 구체예들에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 U'는 하기 구조들로부터 선택된다:
Figure 112007054394073-pct00010
구체예는 상기 구체예들에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 B-U'는 다음과 같다:
Figure 112007054394073-pct00011
상기에 따른 한 구체예에서,
I는 14, 15, 16, 17 또는 18이고,
p는 1, 2, 3, 4 또는 11이고,
s는 0, 1 또는 2이고,
t는 0 또는 1이다.
구체예는 상기 구체예들에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 B-U'는 다음과 같다:
Figure 112007054394073-pct00012
상기 구체예들 중 어느 것에 따른 한 구체예에서, B는
Figure 112007054394073-pct00013
이다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 B는
Figure 112007054394073-pct00014
이다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 s는 1이다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 n은 1이다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 I는 14, 15 또는 16이다. 구체예에서, I는 17, 18, 19 또는 20이다. 구체예에서, I는 15, 16 또는 17이다. 구체예에서, I는 18, 19 또는 20이다. 구체예에서, I는 14이다. 구체예에서, I는 16이다. 구체예에서, I는 18이다. 구체예에서, I는 20이다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 p는 1이다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 p는 2이다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 p는 3이다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 p는 4이다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 B-U'는 다음과 같다:
Figure 112007054394073-pct00015
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 B-U'는
Figure 112007054394073-pct00016
이다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 B-U'는
이다.
구체예는 상기 식 I에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서
Xaa7은 His 또는 데스아미노-히스티딘이고;
Xaa8는 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys 또는 Aib이고;
Xaa16은 Val이고;
Xaa18은 Ser이고;
Xaa19는 Tyr이고;
Xaa20는 Leu이고;
Xaa22는 Gly, Glu 또는 Aib이고;
Xaa23은 Gln 또는 Glu이고;
Xaa25는 Ala이고;
Xaa27은 Glu이고;
Xaa30은 Ala 또는 Glu이고;
Xaa33은 Val이고;
Xaa34는 Lys 또는 Arg이고;
Xaa35는 Gly 또는 Aib이고;
Xaa36은 Arg 또는 Lys이고;
Xaa37은 Gly, 아미드이거나, 또는 존재하지 않는다.
구체예는 상기 식 I에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서
Xaa7은 His이고;
Xaa8은 Gly 또는 Aib이고;
Xaa16은 Val이고;
Xaa18은 Ser이고;
Xaa19는 Tyr이고;
Xaa20는 Leu이고;
Xaa22는 Glu 또는 Aib이고;
Xaa23은 Gln이고;
Xaa25는 Ala이고;
Xaa27은 Glu이고;
Xaa30은 Ala이고;
Xaa33은 Val이고;
Xaa34는 Lys 또는 Arg이고;
Xaa35는 Gly 또는 Aib이고;
Xaa36은 Arg이고;
Xaa37은 Gly이다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 하나에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 상기 GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37) 서열의 위치 7에 있는 N-말단 L-히스티딘의 변형을 포함한다.
구체예는 상기 구체예에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 상기 GLP-1 유사체는 이미다조프로피오닐7, α-히드록시-히스티딘7 또는 N-메틸-히스티딘7, D-히스티딘7, 데스아미노-히스티딘7, 2-아미노-히스티딘7, β-히드록시-히스티딘7, 호모히스티딘7, Nα-아세틸-히스티딘7, α-플루오로메틸-히스티딘7, α-메틸-히스티딘7, 3-피리딜알라닌7, 2-피리딜알라닌7 또는 4-피리딜알라닌7을 포함한다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 하나에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 상기 GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37) 서열의 위치 8의 L-알라닌이 다른 아미노산 잔기로 치환된 것을 포함한다.
구체예는 상기 구체예에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 상기 GLP-1 유사체는 Aib8, Gly8, Val8, Ile8, Leu8, Ser8, Thr8, (1-아미노시클로프로필)카르복실산, (1-아미노시클로부틸)카르복실산, (1-아미노시클로펜틸)카르복실산, (1-아미노시클로헥실)카르복실산, (1-아미노시클로헵틸)카르복실산 또는 (1-아미노시클로옥틸)카르복실산을 포함한다.
구체예는 상기 구체예 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 상기 GLP-1 유사체는 Aib8을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 GLP-1 유사체는 Aib8,Arg34-GLP-1(7-37) 또는 Aib8,22,Arg34-GLP-1(7-37)이다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 상기 GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37)(SEQ ID No. 1)과 비교하여, 교환, 추가 또는 결실된 15개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다.
구체예는 상기 구체예에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 GLP-1(7-37) (SEQ ID No. 1)과 비교하여, 10개 이하의 아미노산 잔기가 교환, 추가 또는 결실된다.
구체예는 상기 구체예에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 상기 GLP-1 유사체는 GLP-1(7-37)(SEQ ID No. 1)과 비교하여, 교환, 추가 또는 결실된 6개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 상기 GLP-1 유사체는 유전암호에 의해 암호화되지 않는 3개 이하의 아미노산 잔기를 포함한다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 여기서 상기 GLP-1 유사체는 오직 1개의 리신 잔기만을 포함한다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 GLP-1 유사체를 제공하며, 이것은 다음과 같다:
Aib8,Arg34-GLP-1(7-37)
Aib8 ,22,Arg34-GLP-1(7-37)
Arg34-GLP-1(7-37)
[3-(4-이미다졸릴)프로피오닐7,Arg34]GLP-1-(7-37)펩티드
Gly8,Arg34-GLP-1(7-37)
Aib8,Arg34,Pro37-GLP-1(7-37)
Aib8 ,22,27,30,35,Arg34,Pro37-GLP-1(7-37)아미드,
이것들은 모두 위치 26에서 B-U'로 치환된다.
구체예는 하기 구조들로부터 선택되는 전술한 구체예들 중 어느 하나에 따른 GLP-1 유사체를 제공한다:
Figure 112007054394073-pct00018
N-ε26-(17-카르복시헵타데카노일)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드,
Figure 112007054394073-pct00019
N-ε26-(19-카르복시노나데카노일)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드,
Figure 112007054394073-pct00020
N-ε26-(4-{[N-(2-카르복시에틸)-N-(15-카르복시펜타데카노일)아미노]메틸}벤조일)[Arg34]GLP-1-(7-37),
Figure 112007054394073-pct00021
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)펩티드,
Figure 112007054394073-pct00022
Figure 112007054394073-pct00023
Figure 112007054394073-pct00024
구체예는 환자에서 GLP-1 유사체의 작용시간을 증가시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 GLP-1 유사체의 위치 26에 있는 리신 잔기 상에서 전술한 구체예들 중 어느 것에 개시된 것과 같은 부분 B-U로 상기 GLP-1 유사체를 아실화하는 것에 특징이 있다.
구체예는 환자에서 GLP-1 유사체의 작용시간을 약 40시간 이상까지 증가시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 GLP-1(7-37) 펩티드 또는 그 유사체의 위치 7 및 8에 있는 아미노산 잔기 중 적어도 하나를 변형하고, 상기 GLP-1 유사체의 위치 26에 있는 리신 잔기 상에서 전술한 구체예들 중 어느 것에 개시된 것과 같은 부분 B-U'-로 상기 GLP-1 유사체를 아실화하는데 특징이 있다.
구체예는 상기 구체예들 중 어느 하나에 따른 화합물과 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
구체예는 비경구 경로에 의해 투여하기 적합한 상기 구체예에 따른 제약 조성물을 제공한다.
구체예는 의약의 제조를 위한 상기 구체예들 중 어느 한 항에 따른 화합물의 사용을 제공한다.
구체예는 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능장애, 1형 당뇨병, 비만, 고혈압, X 증후군, 이상지질혈증, 인지장애, 죽상경화증, 심근경색, 관상동맥 심질환 및 기타 심혈관 장애, 뇌졸중, 염증성 장 증후군, 소화불량 및 위궤양의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조를 위한 상기 구체예들 중 어느 하나에 따른 화합물의 사용을 제공한다.
구체예는 2형 당뇨병의 질환 진행을 지연 또는 예방하기 위한 의약의 제조를 위한 상기 구체예들 중 어느 하나에 따른 화합물의 사용을 제공한다.
구체예는 음식섭취 감소, β-세포 세포자살 감소, β-세포 기능 및 β-세포 질량 증가, 및/또는 β-세포의 글루코오스 민감성의 회복을 위한 의약의 제조를 위한 상기 구체예들 중 어느 하나에 따른 화합물의 사용을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명은 상기 구체예들에 따른 화합물을 제공하며, 여기서 상기 GLP-1 유사체는 링커 B-U'에 부착된 Aib8,Arg34-GLP-1(7-37) 또는 Aib8 ,22,Arg34-GLP-1(7-37)이다.
식 II의 구체예에서, B-U는 하기 구조들을 나타낸다.
Figure 112007054394073-pct00025
구체예에서, 본 발명은 상기 구체예들 중 어느 하나에 따른 화합물을 제공하며, 여기서 상기 2산은 디카르복실산을 포함한다.
구체예에서, 본 발명은 상기 구체예들 중 어느 하나에 따른 화합물을 제공하며, 여기서 아실화 기는 직쇄형 또는 분지형 알칸 α,ω-디카르복실산을 포함한다.
구체예에서, 본 발명은 상기 구체예에 따른 화합물을 제공하며, 여기서 아실화 기는 구조 HOOC-(CH2)nCO-를 포함하고, 여기서 n은 12 내지 20이다.
구체예에서, 본 발명은 상기 구체예에 따른 화합물을 제공하며, 여기서 아실화 기는 HOOC-(CH2)14CO-, HOOC-(CH2)15CO-, HOOC-(CH2)16CO-, HOOC-(CH2)17CO-, 및 HOOC-(CH2)18CO-로부터 선택된 구조를 포함한다.
구체예에서, 본 발명은 상기 구체예에 따른 화합물을 제공하며, 여기서 아실화 기는 구조 HOOC-(CH2)16CO-를 포함한다.
본 발명의 다른 목적은, 본 발명에 따른 화합물이 0.1mg/mL 내지 25mg/mL의 농도로 존재하고, pH가 3.0 내지 9.0인 제약 제제를 제공하는 것이다. 이 제제는 버퍼 시스템, 보존제(들), 등장제(들), 킬레이트화제(들), 안정제 및 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 제약 제제는 수성 제제, 즉 물을 포함하는 제제이다. 이러한 제제는 전형적으로 용액 또는 현탁액이다. 본 발명의 더 이상의 구체예에서, 제약 제제는 수성 용액이다. 용어 "수성 제제"는 적어도 50% w/w의 물을 포함하는 제제로서 정의된다. 마찬가지로, 용어 "수성 용액"은 적어도 50% w/w의 물을 포함하는 용액으로서 정의되고, "수성 현탁액"은 적어도 50% w/w의 물을 포함하는 현탁액으로서 정의된다.
다른 구체예에서, 제약 제제는 냉동건조 제제이며, 의사 또는 환자는 사용하기 전에 제제에 용매 및/또는 희석제를 첨가한다.
다른 구체예에서, 제약 제제는 어떤 사전 용해 없이 바로 사용할 수 있는 건조 제제(예를 들어, 냉동건조 또는 분무건조)이다.
더 이상의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물과 버퍼의 수성 용액을 포함하는 제약 제제에 관한 것이며, 여기서 상기 화합물은 0.1mg/mL 이상의 농도로 존재하고, 상기 제제는 약 3.0 내지 약 9.0의 pH를 가진다.
본 발명의 다른 구체예에서, 제제의 pH는 약 7.0 내지 약 9.5이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 제제의 pH는 약 3.0 내지 약 7.0이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 제제의 pH는 약 5.0 내지 약 7.5이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 제제의 pH는 약 7.5 내지 약 9.0이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 제제의 pH는 약 7.5 내지 약 8.5이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 제제의 pH는 약 6.0 내지 약 7.5이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 제제의 pH는 약 6.0 내지 약 7.0이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 제제의 pH는 약 8.0 내지 약 8.5이다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 버퍼는 나트륨 아세테이트, 나트륨 카보네이트, 시트레이트, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 소듐디히드로겐 포스페이트, 디소듐히드로겐 포스페이트, 나트륨 포스페이트 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 바이신, 트리신, 말산, 숙시네이트, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산 또는 이것들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 이들 명시된 버퍼들의 각 하나하나는 본 발명의 다른 구체예를 구성한다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 제제는 제약학적으로 허용되는 보존제를 추가로 포함한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 보존제는 페놀, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 메틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 부틸 p-히드록시벤조에이트, 2-페녹시에탄올, 벤질알코올, 클로로부탄올 및 티오메로살, 브로노폴, 벤조산, 이미듀레아, 클로로헥시딘, 나트륨 디히드로아세테이트, 클로로크레졸, 에틸 p-히드록시벤조에이트, 염화벤제토늄, 클로르페네신(3p-클로르페녹시프로판-1,2-디올) 또는 이것들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 보존제는 페놀 또는 m-크레졸이다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 보존제는 0.1mg/mL 내지 20mg/mL의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 보존제는 0.1mg/mL 내지 5mg/mL의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 보존제는 5mg/mL 내지 10mg/mL의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 보존제는 10mg/mL 내지 20mg/mL의 농도로 존재한다. 이들 명시된 보존제의 각 하나하나는 본 발명의 다른 구체예를 구성한다. 제약 조성물에 보존제의 사용은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 편의를 위하여 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19판, 1995년을 참조한다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 제제는 등장제를 추가로 포함한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 등장제는 염(예를 들어, 염화나트륨), 당 또는 당 알코올, 아미노산(예를 들어, L-글리신, L-히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소로이신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 알디톨(예를 들어, 글리세롤(글리세린), 1,2-프로판디올(프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 1,3-부탄디올), 폴리에틸렌글리콜(예를 들어 PEG400) 또는 이것들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 등장제는 프로필렌글리콜이다. 단당, 이당 또는 다당류와 같은 어떤 당, 또는 프럭토스, 글루코오스, 만노스, 소르보스, 크실로스, 말토스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 덱스트란, 풀룰란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 가용성 녹말, 히드록시에틸 녹말 및 카르복시메틸셀룰로오스-Na를 포함하는 수용성 글루칸이 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 당 첨가제는 수크로스이다. 당 알코올은 적어도 하나의 -OH 기를 갖는 C4-C8 탄화수소로서 정의되며, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 크실리톨 및 아라비톨을 포함한다. 한 구체예에서, 당 알코올 첨가제는 만니톨이다. 상기 언급된 당 또는 당 알코올은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 당 또는 당 알코올이 액체 제조물에서 가용성이고, 본 발명의 방법을 사용하여 달성된 안정화 효과에 불리한 효과를 미치지 않는다면, 사용량에 정해진 제한은 없다. 한 구체예에서, 당 또는 당 알코올의 농도는 약 1mg/mL 내지 약 150mg/mL이다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 등장제는 1mg/mL 내지 50mg/mL의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 등장제는 1mg/mL 내지 7mg/mL의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 등장제는 5mg/mL 내지 7mg/mL의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 등장제는 8mg/mL 내지 24mg/mL의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 등장제는 25mg/mL 내지 50mg/mL의 농도로 존재한다. 이들 명시된 등장제의 각 하나하나는 본 발명의 다른 구체예를 구성한다. 제약 조성물에 등장제의 사용은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 편의를 위하여 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19판 1995년을 참조한다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 제제는 킬레이트화제를 추가로 포함한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 킬레이트화제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 시트르산 및 아스파르트산의 염들, 및 이것들의 혼합물로부터 선택된다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 킬레이트화제는 0.1mg/mL 내지 5mg/mL의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 킬레이트화제는 0.1mg/mL 내지 2mg/mL의 농도로 존재한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 킬레이트화제는 2mg/mL 내지 5mg/mL의 농도로 존재한다. 이들 명시된 킬레이트화제의 하나하나는 본 발명의 다른 구체예를 구성한다. 제약 조성물에 킬레이트화제의 사용은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 편의를 위하여 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19판 1995년을 참조한다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 제제는 안정제를 추가로 포함한다. 제약 조성물에 안정제의 사용은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 편의를 위하여 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19판 1995년을 참조한다.
더 구체적으로, 본 발명의 조성물은 안정화된 액체 제약 조성물이며, 이것의 치료학적 활성 성분은 액체 제약 제제로 보관하는 도중에 응집체 형성을 나타낼 가능성이 있는 폴리펩티드를 포함한다. "응집체 형성"은 폴리펩티드 분자들 간의 물리적인 상호작용을 의미하며, 그 결과 가용성을 유지할 수도 있는 올리고머가 형성되거나, 또는 용액으로부터 침전하는 커다란 눈에 보이는 응집체가 형성되기도 한다. "보관하는 도중"은 액체 제약 조성물 또는 제제가 일단 제조된 다음, 피험자에게 곧바로 투여되지 않는 것을 의미한다. 오히려, 제조 후, 그것은 액체 형태, 냉동 상태, 또는 액체 형태 또는 피험자에게 투여하기 적합한 다른 형태로 추후에 복원되는 건조 형태로 보관을 위해 포장된다. "건조 형태"는 냉동건조(즉, 동결건조; 예를 들어 Williams 및 Polli(1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59를 참조), 분무건조(Masters(1991), Spray-Drying Handbook(5판; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead 등(1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; 및 Mumenthaler 등(1994) Pharm. Res. 11:12-20을 참조), 또는 공기건조(Carpenter 및 Crowe(1988) Cryobiology 25:459-470; 및 Roser(1991) Biopharm. 4:47-53을 참조)에 의하여 건조된 액체 제약 조성물 또는 제제를 의미한다. 액체 제약 조성물의 보관 도중 폴리펩티드에 의한 응집체의 형성은 이 폴리펩티드의 생물학적 활성에 불리한 영향을 미칠 수 있으며, 그 결과 제약 조성물의 치료학적 효능이 손실될 수 있다. 더욱이, 응집체 형성은 폴리펩티드-함유 제약 조성물이 주입 시스템을 이용하여 투여될 때, 관, 막 또는 펌프의 막힘과 같은 다른 문제들을 야기할 수도 있다.
본 발명의 제약 조성물은 조성물의 보관 도중 폴리펩티드에 의한 응집체 형성을 감소시키기에 충분한 양의 아미노산 염기를 더 포함할 수도 있다. "아미노산 염기"는 아미노산 또는 아미노산의 조합을 의미하며, 이때 어떤 주어진 아미노산은 그것의 자유 염기 형태 또는 그것의 염 형태 중 어느 하나로 존재한다. 아미노산 조합이 사용될 경우에, 모든 아미노산이 자유 염기 형태로 존재할 수도 있고, 모든 아미노산이 염 형태로 존재할 수도 있고, 또는 일부는 자유 염기 형태로 존재하고 나머지는 염 형태로 존재할 수도 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물의 제조에 사용할 수 있는 아미노산은 하전된 측쇄를 지닌 것들, 예를 들어 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 및 글루탐산이다. 특정 아미노산이 자유 염기 형태 또는 염 형태 중 어느 하나로 존재하기만 한다면, 특정 아미노산(예를 들어, 메티오닌, 히스티딘, 이미다졸, 아르기닌, 리신, 이소로이신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌 및이것들의 혼합물)의 어떤 입체이성질체(즉, L, D 또는 이것들의 혼합물) 또는 이들 입체이성질체의 조합이 본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있다. 한 구체예에서, L-입체이성질체가 사용된다. 또한, 본 발명의 조성물은 이들 아미노산의 유사체를 사용하여 조제될 수도 있다. "아미노산 유사체"는 본 발명의 액체 제약 조성물의 보관 도중 폴리펩티드에 의한 응집체 형성을 감소시키는 바람직한 효과를 지닌 자연발생 아미노산의 유도체를 의미한다. 적합한 아르기닌 유사체는, 예를 들어 아미노구아니딘, 오르니틴 및 N-모노에틸 L-아르기닌을 포함하고, 적합한 메티오닌 유사체는 에티오닌 및 부티오닌을 포함하고, 적합한 시스테인 유사체는 S-메틸-L-시스테인을 포함한다. 다른 아미노산과 마찬가지로, 아미노산 유사체도 그것의 자유 염기 형태 또는 염 형태로 조성물에 포함된다. 본 발명의 더 이상의 구체예에서, 아미노산 또는 아미노산 유사체는 단백질의 응집을 방지 또는 지연하기에 충분한 농도로 사용된다.
본 발명의 더 이상의 구체예에서, 치료제로서 작용하는 폴리펩티드가 산화에 민감한 적어도 하나의 메티오닌 잔기를 포함하는 폴리펩티드일 때, 메티오닌(또는 다른 황-함유 아미노산 또는 아미노산 유사체)이 메티오닌 잔기의 메티오닌 술폭시드로의 산화를 억제할 목적으로 첨가될 수 있다. "억제"는 시간 경과에 따른 메티오닌 산화 종의 최소한의 축적을 의미한다. 메티오닌 산화의 억제 결과, 폴리펩티드는 그것의 적절한 분자 형태를 더 오래 보유하게 된다. 메티오닌의 어떤 입체이성질체(L 또는 D) 또는 이것들의 조합이 사용될 수 있다. 첨가량은 메티오닌 잔기의 산화를 억제하기에 충분한 양이어야 하며, 이로써 메티오닌 술폭시드의 양은 규제기관에 의해 용인가능한 정도가 되어야 한다. 전형적으로, 이것은 조성물이 약 10% 내지 약 30% 이하의 메티오닌 술폭시드를 함유함을 의미한다. 일반적으로, 이것은 첨가된 메티오닌 대 메티오닌 잔기의 비가 약 1:1 내지 약 1000:1, 예를 들어 10:1 내지 약 100:1의 범위에 있도록 메티오닌을 첨가함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 제제는 고분자량 중합체 또는 저분자량 화합물의 군으로부터 선택된 안정제를 더 포함한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 안정제는 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, PEG 3350), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈, 카르복시-/히드록시셀룰로오스 또는 그 유도체(예를 들어, HPC, HPC-SL, HPC-L 및 HPMC), 시클로덱스트린, 모노티오글리세롤, 티오글리콜산 및 2-메틸티오에탄올과 같은 황-함유 물질, 및 다른 염들(예를 들어, 염화나트륨)로부터 선택된다. 이들 명시된 안정제의 각 하나하나는 본 발명의 다른 구체예를 구성한다.
또한, 제약 조성물은 그 안의 치료학적 활성 폴리펩티드의 안정성을 더욱 증진시키는 추가의 안정제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 특히 관심 있는 안정제는 메티오닌 산화에 대해 폴리펩티드를 보호하는 메티오닌 및 EDTA, 그리고 냉동-해동 또는 기계적 전단과 관련된 응집에 대해 폴리펩티드를 보호하는 비이온성 계면활성제를 포함하나, 이것들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 제제는 계면활성제를 더 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 제약 조성물은 2가지 상이한 계면활성제를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "계면활성제"는 수용성(친수성) 부분인 머리와 지용성(친유성) 부분으로 이루어진 어떤 분자 또는 이온을 말한다. 계면활성제는 바람직하게는 계면에 모이는데, 친수성 부분은 물을 향해 배향되고, 친유성 부분은 기름- 또는 소수성 상(즉, 유리, 공기, 기름 등)을 향해 배향된다. 계면활성제가 미셀을 형성하기 시작하는 농도는 임계 미셀 농도 또는 CMC로서 공지되어 있다. 더욱이, 계면활성제는 액체의 표면장력을 저하시킨다. 또한, 계면활성제는 양친매성 화합물이라고도 알려져 있다. 용어 "세제"는 일반적으로 계면활성제와 동의어이다.
음이온성 계면활성제는 케노데옥시콜산, 케노데옥시콜산 나트륨염, 콜산, 디히드로콜산, 데옥시콜산, 데옥시콜산 메틸에스테르, 디지토닌, 디지톡시게닌, N,N-디메틸도데실아민 N-옥시드, 도쿠세이트 나트륨, 글리코케노데옥시콜산 나트륨, 글리코콜산 수화물, 글리코데옥시콜산 일수화물, 글리코데옥시콜산 나트륨염, 글리코데옥시콜산 나트륨염, 글리코리토콜산 3-황산 2나트륨염, 글리코리토콜산 에틸에스테르, N-라우로일사르코신 나트륨염, N-라우로일사르코신 나트륨염, N-라우로일사르코신, N-라우로일사르코신, 리튬 도데실술페이트, 루골, 1-옥탄술폰산 나트륨염, 1-옥탄술폰산 나트륨염, 나트륨 1-부탄술포네이트, 나트륨 1-데칸술포네이트, 나트륨 1-도데칸술포네이트, 나트륨 1-헵탄술포네이트, 나트륨 1-헵탄술포네이트, 나트륨 1-노난술포네이트, 나트륨 1-프로판술포네이트 일수화물, 나트륨 2-브로모에탄술포네이트, 나트륨 콜레이트 수화물, 황소 또는 양의 담즙, 나트륨 콜레이트 수화물, 나트륨 콜레이트, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 도데실술페이트, 나트륨 도데실술페이트, 나트륨 헥산술포네이트, 나트륨 옥틸술페이트, 나트륨 펜탄술포네이트, 나트륨 타우로콜레이트, 타우로케노데옥시콜산 나트륨염, 타우로데옥시콜산 나트륨염 일수화물, 타우로리토콜산 3-황산 2나트륨염, 타우로우르소데옥시콜산 나트륨염, Trizma
Figure 112007054394073-pct00026
도데실술페이트, DSS(도쿠세이트 나트륨, CAS 레지스트리 no [577-11-7], 도쿠세이트 칼슘, CAS 레지스트리 no [128-49-4], 도쿠세이트 칼륨, CAS 레지스트리 no [7491-09-0]), SDS(나트륨 도데실술페이트 또는 나트륨 라우릴술페이트), 도데실포스포콜린(FOS-콜린-12), 도데실포스포콜린(FOS-콜린-10), 노닐포스포콜린(FOS-콜린-9), 디팔미토일 포스파티드산, 나트륨 카프릴레이트, 및/또는 우르소데옥시콜산의 군으로부터 선택될 수 있다.
양이온성 계면활성제는 브롬화 알킬트리메틸암모늄, 염화 벤잘코늄, 염화 벤잘코늄, 염화 벤질디메틸헥사데실암모늄, 염화 벤질디메틸테트라데실암모늄, 벤질트리메틸암모늄 테트라클로로요데이트, 브롬화 디메틸디옥타데실암모늄, 브롬화 도데실에틸디메틸암모늄, 브롬화 도데실트리메틸암모늄, 브롬화 도데실트리메틸암모늄, 브롬화 에틸헥사데실디메틸암모늄, 브롬화 헥사데실트리메틸암모늄, 브롬화 헥사데실트리메틸암모늄, 폴리옥시에틸렌(10)-N-탈로우-1,3-디아미노프로판, 브롬화톤조늄 및/또는 브롬화 트리메틸(테트라데실)암모늄의 군으로부터 선택될 수 있다.
비이온성 계면활성제는 BigCHAP, 비스(폴리에틸렌 글리콜 비스[이미다졸카르보닐]), 폴리에틸렌옥시드/폴리프로필렌옥시드 블록 공중합체와 같은 블록 공중합체, 예를 들어 폴록사머류, 폴록사머 188 및 폴록사머 407, Brij
Figure 112007054394073-pct00027
35, Brij
Figure 112007054394073-pct00028
56, Brij
Figure 112007054394073-pct00029
72, Brij
Figure 112007054394073-pct00030
76, Brij
Figure 112007054394073-pct00031
92V, Brij
Figure 112007054394073-pct00032
97, Brij
Figure 112007054394073-pct00033
58P, Cremophor
Figure 112007054394073-pct00034
EL, 데카에틸렌글리콜 모노도데실 에테르, N-데카노일-N-메틸글루카민, n-도데카노일-N-메틸글루카미드, 알킬-폴리글루코시드류, 에톡시화 피마자유, 헵타에틸렌글리콜 모노데실 에테르, 헵타에틸렌글리콜 모노도데실 에테르, 헵타에틸렌글리콜 모노테트라데실 에테르, 헥사에틸렌글리콜 모노도데실 에테르, 헥사에틸렌글리콜 모노헥사데실 에테르, 헥사에틸렌글리콜 모노옥타데실 에테르, 헥사에틸렌글리콜 모노테트라데실 에테르, Igepal CA-630, Igepal CA-630, 메틸-6-0-(N-헵틸카르바모일)-베타-D-글루코피라노시드, 노나에틸렌글리콜 모노도데실 에테르, N-노나노일-N-메틸글루카민, N-노나노일-N-메틸글루카민, 옥타에틸렌글리콜 모노데실 에테르, 옥타에틸렌글리콜 모노도데실 에테르, 옥타에틸렌글리콜 모노헥사데실 에테르, 옥타에틸렌글리콜 모노옥타데실 에테르, 옥타에틸렌글리콜 모노테트라데실 에테르, 옥틸-β-D-글루코피라노시드, 펜타에틸렌글리콜 모노데실 에테르, 펜타에틸렌글리콜 모노도데실 에테르, 펜타에틸렌글리콜 모노헥사데실 에테르, 펜타에틸렌글리콜 모노헥실 에테르, 펜타에틸렌글리콜 모노옥타데실 에테르, 펜타에틸렌글리콜 모노옥틸 에테르, 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜 에테르, 폴리에틸렌글리콜 에테르 W-1, 폴리옥시에틸렌 10 트리데실 에테르, 폴리옥시에틸렌 100 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 20 이소헥사데실 에테르, 폴리옥시에틸렌 20 올레일 에테르, 폴리옥시에틸렌 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 50 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 8 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 비스(이미다졸릴카르보닐), 폴리옥시에틸렌 25 프로필렌글리콜 스테아레이트, Quillaja bark 사의 사포닌, Span
Figure 112007054394073-pct00035
20, Span
Figure 112007054394073-pct00036
40, Span
Figure 112007054394073-pct00037
60, Span
Figure 112007054394073-pct00038
65, Span
Figure 112007054394073-pct00039
80, Span
Figure 112007054394073-pct00040
85, Tergitol, Type 15-S-12, Tergitol, Type 15-S-30, Tergitol, Type 15-S-5, Tergitol, Type 15-S-7, Tergitol, Type 15-S-9, Tergitol, Type NP-10, Tergitol, Type NP-4, Tergitol, Type NP-40, Tergitol, Type NP-7, Tergitol, Type NP-9, 테트라데실-β-D-말토시드, 테트라에틸렌글리콜 모노데실에테르, 테트라에틸렌글리콜 모노도데실에테르, 테트라에틸렌글리콜 모노테트라데실에테르, 트리에틸렌글리콜 모노데실에테르, 트리에틸렌글리콜 모노도데실에테르, 트리에틸렌글리콜 모노헥사데실에테르, 트리에틸렌글리콜 모노옥틸에테르, 트리에틸렌글리콜 모노테트라데실에테르, Triton CF-21, Triton CF-32, Triton DF-12, Triton DF-16, Triton GR-5M, Triton QS-15, Triton QS-44, Triton X-100, Triton X-102, Triton X-15, Triton X-151, Triton X-200, Triton X-207, Triton
Figure 112007054394073-pct00041
X-100, Triton
Figure 112007054394073-pct00042
X-114, Triton
Figure 112007054394073-pct00043
X-165 용액, Triton
Figure 112007054394073-pct00044
X-305 용액, Triton
Figure 112007054394073-pct00045
X-405, Triton
Figure 112007054394073-pct00046
X-45, Triton
Figure 112007054394073-pct00047
X-705-70, TWEEN
Figure 112007054394073-pct00048
20, TWEEN
Figure 112007054394073-pct00049
40, TWEEN
Figure 112007054394073-pct00050
60, TWEEN
Figure 112007054394073-pct00051
6, TWEEN
Figure 112007054394073-pct00052
65, TWEEN
Figure 112007054394073-pct00053
80, TWEEN
Figure 112007054394073-pct00054
81, TWEEN
Figure 112007054394073-pct00055
85, 틸록사폴, 스핑고포스포리피드류(스핑고미엘린), 및 스핑고글리코리피드류(세라마이드류, 강글리코시드류), 인지질류, 및/또는 n-운데실 β-D-글루코피라노시드의 군으로부터 선택될 수 있다.
양쪽성 이온 계면활성제는 CHAPS, CHAPSO, 3-(데실디메틸암모니오)프로판술포네이트 내부 염, 3-(도데실디메틸암모니오)-프로판술포네이트 내부 염, 3-(도데실디메틸암모니오)프로판술포네이트 내부 염, 3-(N,N-디메틸미리스틸암모니오)프로판술포네이트, 3-(N,N-디메틸옥타데실암모니오)-프로판술포네이트, 3-(N,N-디메틸옥틸암모니오)프로판술포네이트 내부 염, 3-(N,N-디메틸팔미틸암모니오)프로판술포네이트, N-알킬-N,N-디메틸암모니오-1-프로판술포네이트, 3-콜아미도-1-프로필디메틸암모니오-1-프로판술포네이트, 도데실포스포콜린, 미리스토일, 리소포스파티딜콜린, Zwittergent 3-12(N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트), Zwittergent 3-10(3-(데실디메틸암모니오)-프로판술포네이트 내부 염), Zwittergent 3-08(3-(옥틸디메틸암모니오)프로판술포네이트), 글리세로포스포리피드류(레시틴류, 케팔린류, 포스파티딜 세린), 글리세로글리코리피드류(갈락토피라노시드), 리소포스파티딜 및 포스파티딜콜린류의 알킬, 알콕실(알킬 에스테르), 알콕시(알킬 에테르)-유도체, 예를 들어 리소포스파티딜콜린의 라우로일 및 미리스토일 유도체들, 디팔미토일포스파티딜콜린, 및 극성 머리기의 변형들, 즉 콜린류, 에탄올아민류, 포스파디드산, 세린류, 트레오닌류, 글리세롤, 이노시톨, 리소포스파티딜세린 및 리소포스파티딜트레오닌, 아실카르니틴류 및 유도체들, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘의 N베타-아실화 유도체들, 또는 리신 또는 아르기닌의 측쇄 아실화 유도체들, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘과 중성 또는 산성 아미노산의 어떤 조합을 포함하는 디펩티드류의 N베타-아실화 유도체들, 중성 아미노산과 2가 하전된 아미노산의 어떤 조합을 포함하는 트리펩티드의 N베타-아실화 유도체들의 군으로부터 선택될 수 있으며, 또는 이 계면활성제는 이미다졸린 유도체들, C6-C12의 장쇄 지방산류 및 그 염들(예를 들어, 올레산 및 카프릴산), N-헥사데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트, 음이온성 (알킬-아릴-술포네이트류) 1가 계면활성제들, 팔미토일 리소포스파티딜-L-세린, 리소포스포리피드류(예를 들어, 에탄올아민, 콜린, 세린 또는 트레오닌의 1-아실-sn-글리세로-3-포스페이트 에스테르류), 또는 이것들의 혼합물의 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에서 용어 "알킬-폴리글루코시드"는 말토시드, 당류 등과 같은 하나 이상의 글루코시드 부분으로 치환된 직쇄형 또는 분지형 C5 -20-알킬, -알케닐 또는 -알키닐 사슬과 관련하여 사용된다. 이들 알킬-폴리글루코시드의 구체예는 C6 -18-알킬-폴리글루코시드를 포함한다. 이들 알킬-폴리글루코시드의 특정한 구체예는 C6, C8, C10, C12, C14, C16, C18 및 C20 알킬 사슬과 같은 짝수의 탄소-사슬을 포함한다. 글루코시드 부분의 특정한 구체예는 피라노시드, 글루코피라노시드, 말토시드, 말토트리오시드 및 수크로스를 포함한다. 본 발명의 구체예에서, 6개 미만의 글루코시드 부분이 알킬기에 부착된다. 본 발명의 구체예에서, 5개 미만의 글루코시드 부분이 알킬기에 부착된다. 본 발명의 구체예에서, 4개 미만의 글루코시드 부분이 알킬기에 부착된다. 본 발명의 구체예에서, 3개 미만의 글루코시드 부분이 알킬기에 부착된다. 본 발명의 구체예에서, 2개 미만의 글루코시드 부분이 알킬기에 부착된다. 알킬-폴리글루코시드의 특정한 구체예는 알킬 글루코시드류, 예를 들어 n-데실 β-D-글루코피라노시드, 데실 β-D-말토피라노시드, 도데실 β-D-글루코피라노시드, n-도데실 β-D-말토시드, n-도데실 β-D-말토시드, n-도데실 β-D-말토시드, 테트라데실 β-D-글루코피라노시드, 데실 β-D-말토시드, 헥사데실 β-D-말토시드, 데실 β-D-말토트리오시드, 도데실 β-D-말토트리오시드, 테트라데실 β-D-말토트리오시드, 헥사데실 β-D-말토트리오시드, n-도데실-수크로스, n-데실-수크로스, 수크로스 모노카프레이트, 수크로스 모노라우레이트, 수크로스 모노미리스테이트, 및 수크로스 모노팔미테이트이다.
제약 조성물에 계면활성제의 사용은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 편의를 위하여 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19판 1995년을 참조한다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 제제는 프로테아제 억제제를 더 포함하는데, 이것은 EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산) 및 벤자미딘 HCl 등이 있고, 다른 상업적으로 이용가능한 프로테아제 억제제도 사용될 수 있다. 프로테아제 억제제의 사용은 자가촉매작용을 억제하기 위한 프로테아제의 지모겐을 포함하는 제약 조성물에서 특히 유용하다.
다른 성분들이 본 발명의 펩티드 제약 제제에 존재할 수도 있다. 이러한 추가의 성분들은 습윤제, 유화제, 항산화제, 벌크화제, 장성 변형제, 킬레이트화제, 금속이온, 유성 부형제, 단백질(예를 들어, 사람 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질류) 및 양쪽성 이온(예를 들어, 베타인, 타우린, 아르기난, 글리신, 리신 및 히스티딘과 같은 아미노산)을 포함할 수 있다. 이러한 추가 성분들은 물론 본 발명의 제약 제제의 전체적인 안정성에 불리한 영향을 미치지 않아야 한다.
본 발명에 따른 화합물을 함유하는 제약 조성물은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 몇몇 부위에서, 예를 들어 국소적 부위에서, 예를 들어 피부 및 점막 부위에서, 흡수를 우회하는 부위에서, 예를 들어 동맥내, 정맥내, 심장내 투여 경로로, 그리고 흡수를 수반하는 부위에서, 예를 들어 피부내, 피부하, 근육내 또는 복부내 경로로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 제약 조성물의 투여는 몇 가지 투여 경로, 예를 들어 혀, 혀밑, 볼, 구강내, 경구, 위장내, 비강, 폐, 예를 들어 기관지 및 허파꽈리 또는 이것들의 조합을 통해, 표피, 진피, 경피, 질, 직장, 안구, 예를 들어 결막을 통해, 요로, 및 비경구 경로를 통하여 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 몇 가지 제형으로, 예를 들어 용액, 현탁액, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 멀티플 에멀젼, 포말, 고약, 페이스트, 플라스터, 연고, 정제, 코팅 정제, 린스, 캡슐, 예를 들어 경질 젤라틴 캡슐 및 연질 젤라틴 캡슐, 좌약, 직장 캡슐, 드롭, 겔, 스프레이, 분말, 에어로졸, 흡입제, 점안제, 안과용 연고, 안과용 린스, 질 페서리, 질 고리, 질 연고, 주사액, 인시튜 변환액, 예를 들어 인시튜 겔화, 인시튜 경화, 인시튜 침전화, 인시튜 결정화, 주입 용액, 및 임플란트로서 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은, 본 발명의 화합물의 안정성을 더욱 증진시키고, 생체이용률을 증가시키고, 용해도를 증가시키고, 부작용을 감소시키고, 당업자에게 잘 알려진 크로노테라피를 달성하고, 환자 순응성을 증가시키거나, 또는 이것들의 어떤 조합을 달성할 목적으로, 예를 들어 공유, 소수성 및 정전기 상호작용을 통해 약물 담체, 약물 송달 시스템 및 진보된 약물 송달 시스템과 추가 화합되거나 부착될 수 있다. 담체, 약물 송달 시스템 및 진보된 약물 송달 시스템의 예들은 중합체, 예를 들어 셀룰로오스 및 유도체, 다당류, 예를 들어 덱스트란 및 유도체, 녹말 및 유도체, 폴리(비닐 알코올), 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 중합체, 폴리락트산 및 폴리글리콜산 및 이것들의 블록 공중합체, 폴리에틸렌글리콜, 담체 단백질, 예를 들어 알부민, 겔, 예를 들어 열 겔화 시스템, 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 블록 공중합체 시스템, 미셀, 리포솜, 마이크로스피어, 나노미립자, 액정 및 그 분산물, 지질-물 시스템에서의 상 거동이 당업자에게 잘 알려진 L2 상 및 그 분산물, 중합체 미셀, 멀티플 에멀젼, 자기-유화, 자기-마이크로유화, 시클로덱스트린 및 그 유도체, 및 덴드리머를 포함하나, 이것들에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물은, 예를 들어 계량 용량 흡입기, 건조 분말 흡입기 및 분무기를 이용한 본 발명의 화합물의 폐 경로 투여를 위한 고체, 반고체, 분말 및 용액의 제제에 유용하며, 이들 장치는 모두 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본 발명의 조성물은 제어, 지속, 지연, 지체, 및 서행 방출 약물 송달 시스템의 제제에서 특히 유용하다. 더 구체적으로, 제한되지는 않지만, 조성물은 비경구 제어 방출 및 지속 방출 시스템(두 시스템은 모두 투여 횟수의 많은 감소를 가져온다)에서 유용하며, 이것에 대해서는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 더욱 바람직하게, 제어 방출 및 지속 방출 시스템은 피하 투여된다. 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니지만, 유용한 제어 방출 시스템 및 조성물의 예는 하이드로겔, 유성 겔, 액정, 중합체 미셀, 마이크로스피어, 나노입자이다. 본 발명의 조성물에 유용한 제어 방출 시스템의 제조 방법은 결정화, 응축, 공-결정화, 침전, 공-침전, 유화, 분산, 고압 균질화, 캡슐화, 분무건조, 마이크로 캡슐화, 액적형성, 상 분리, 용매증발에 의한 마이크로스피어 제조, 압출 및 초임계 유체 과정을 포함하나, 이것들에 제한되지는 않는다. 일반적으로 Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D. L. 편저, Marcel Dekker, New York, 2000) 및 Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E. J. 편저, Marcel Dekker, New York, 2000)를 참조한다.
비경구 투여는 주사기, 선택적으로는 펜-형 주사기를 이용한 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 수행될 수 있다. 대안으로서, 비경구 투여는 주입 펌프를 이용하여 수행될 수 있다. 추가의 선택사항은 비강 또는 폐 경로용 액체 또는 분말 스프레이의 형태의 본 발명의 화합물의 투여를 위한 용액 또는 현탁액 또는 분말일 수 있는 조성물이다. 더 이상의 선택사항으로서, 본 발명의 화합물을 함유하는 제약 조성물은 또한 경피 투여, 예를 들어 무바늘 주사 또는 패치, 선택적으로는 이온침투형 패치, 또는 경점막, 예를 들어 볼 경로에 의한 투여에 적합하게 될 수 있다.
본 발명의 화합물은 폐 경로 약물 송달에 적합한 공지된 종류의 장치 중 어느 것을 이용하여 폐 경로에 의해 부형제 중에서 용액, 현탁액 또는 건조 분말로서 투여될 수 있다. 이것들의 예는, 제한은 없지만, 폐 경로 약물 송달을 위한 3가지 일반적인 종류의 에어로졸-발생을 포함하며, 제트 또는 초음파 분무기, 계량 용량 흡입기, 또는 건조 분말 흡입기를 포함할 수 있다(Yu J., Chien Y. W., Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453를 참조한다).
표준화된 시험법에 기초하여, 입자의 공기역학적 직경(da)은 단위 밀도(1g/㎤)의 기준 표준 구형 입자의 기하학적 등가직경으로서 정의된다. 가장 간단한 경우로서, 구형 입자에 대하여, da는 밀도비의 제곱근의 함수로서 기준 직경(d)과 관련되며, 이것은 다음에 의해 설명된다:
비-구형 입자에서는 이 관계가 변형된다(Edwards DA, Ben-Jebria A., Langer R., Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385 참조). "MMAD" 및 "MMEAD"는 당업자에게 잘 설명되고 알려져 있는 용어로서(Edwards D.A., Ben-Jebria A., Langer R. 참조), 공기역학적 입도 분포의 평균값의 단위를 표시한다(Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). 질량 평균 공기역학적 직경(MMAD) 및 질량 평균 유효 공기역학적 직경(MMEAD)은 상호교환하여 사용되는 통계적 매개변수로서, 에어로졸 입자의 크기를 실제 모양, 크기 또는 밀도와는 관계없이 폐에 부착될 가능성과 관련하여 실험적으로 설명한다(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R., Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J. Appl. Physiol. 84(2) (1998) 379-385). MMAD는 통상 공기 중 입자의 관성거동을 측정하는 기기인 임팩터에 의한 측정치로부터 계산된다.
추가의 구체예에서, 제제는 분무 기술과 같은 어떤 공지된 에어로졸화 기술에 의해 에어로졸화될 수 있으며, 이로써 10㎛ 미만, 더 바람직하게는 1-5㎛, 가장 바람직하게는 1-3㎛의 에어로졸 입자의 MMAD가 달성된다. 바람직한 입도는 단백질이 가장 잘 흡수되는 폐 깊숙이 약물을 송달하기 위한 가장 효과적인 크기를 기준으로 한다(Edwards D.A., Ben-Jebria A, Langer A., Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J. Appl. Physiol. 84(2) (1998) 379-385 참조).
본 발명의 화합물을 포함하는 폐 경로 제제가 폐 깊숙이 부착되는 것은 선택사항으로서, 이것은 흡입 기술의 변형, 제한은 없지만, 예를 들어 느린 흡입 유동(예를 들어, 30L/분), 호흡 중지 및 가동 타이밍을 이용하여 더욱 최적화될 수 있다.
용어 "안정화된 제제"는 물리적 안정성, 화학적 안정성 또는 물리적 및 화학적 안정성이 증가된 제제를 말한다.
본원에서 사용된 단백질 제제의 "물리적 안정성"이란 용어는 단백질의 열-기계적 스트레스에의 노출 및/또는 불안정하게 만드는 계면 및 표면, 예를 들어 소수성 표면 및 계면과의 상호작용의 결과로서 단백질의 생물학적 불활성 및/또는 불용성 응집체를 형성하려는 단백질의 경향을 말한다. 수성 단백질 제제의 물리적 안정성은 적합한 용기(예를 들어, 카트리지 또는 바이알)에 채워진 제제를 다양한 시간 기간 동안 상이한 온도에서 기계적/물리적 스트레스(예를 들어, 교반)에 노출한 후에, 육안 검사 및/또는 탁도 측정에 의해 평가된다. 제제의 육안 검사는 어두운 배경에서 한 곳에만 집중되는 빛으로 수행된다. 제제의 탁도는 탁도의 정도에 등급을 매기는 육안 점수를 특징으로 하는데, 예를 들어 0 내지 3의 점수이다(탁도를 나타내지 않는 제제는 육안 점수 0에 해당하고, 일광에서 육안 탁도를 나타내는 제제는 육안 점수 3에 해당한다. 제제가 일광에서 육안 탁도를 나타낼 경우, 제제는 단백질 응집과 관련하여 물리적으로 불안정한 것으로 분류된다.
또는 다르게는, 제제의 탁도는 당업자에게 잘 공지된 간단한 탁도 측정에 의해 평가될 수 있다. 또한, 수성 단백질 제제의 물리적 안정성은 단백질의 입체형태 상태에 대한 분광 제제 또는 프로브를 이용하여 평가될 수 있다. 프로브는 바람직하게는 단백질의 본래 형태이성질체가 아닌 것과 우선적으로 결합하는 소분자이다. 단백질 구조에 대한 소분자 분광 프로브의 한 예는 티오플라빈 T이다. 티오플라빈 T는 아밀로이드 원섬유의 검출에 광범하게 사용되고 있는 형광 염료이다. 원섬유의 존재하에, 그리고 아마 다른 단백질 입체배치도 존재하겠지만, 티오플라빈 T는 약 450nm에서 새로운 여기 최고점을 일으키고, 원섬유 단백질 형태와 결합되었을 때는 약 482nm에서 증진된 방출을 일으킨다. 미결합 티오플라빈 T는 이 파장들에서 본질적으로 비형광성이다.
다른 소분자들이 단백질 구조가 본래 상태에서 비-본래 상태로 변화하는 것에 대한 프로브로서 사용될 수 있다. 예를 들어, "소수성 패치"는 단백질의 노출된 소수성 패치에 우선적으로 결합하는 프로브이다. 소수성 패치는 일반적으로 단백질의 본래 상태에서는 단백질의 3차 구조 안에 묻혀 있지만, 단백질이 접히거나 변성하기 시작함에 따라 노출된다. 이들 소분자 분광 프로브의 예들은 방향족 소수성 염료, 예를 들어 안트라센, 아크리딘, 페난트롤린 등이다. 다른 분광 프로브는 금속-아미노산 복합체, 예를 들어 페닐알라닌, 로이신, 이소로이신, 메티오닌, 및 발린과 같은 소수성 아미노산의 코발트 금속 복합체 등이다.
본원에서 사용된 단백질 제제의 "화학적 안정성"이란 용어는 화학적 변성 산물을 형성하며, 그 결과 본래 단백질 구조와 비교했을 때 생물학적 효능의 잠재적 손실 및/또는 면역원성 특성의 잠재적 증가를 초래하는 단백질 구조에 있어서의 화학적 공유 변화를 말한다. 본래 단백질의 종류 및 성질과 단백질이 노출된 환경에 따라서 다양한 화학적 변성 산물이 형성될 수 있다. 화학적 변성의 제거는 대부분 아마도 완벽히 회피될 수는 없고, 당업자에게 잘 알려진 대로, 보관하는 동안과 단백질 제제를 사용하는 동안 화학적 변성 산물의 양이 증가하는 것을 대체로 볼 수 있다. 대부분의 단백질은 글루타미닐 또는 아스파라기닐 잔기의 측쇄 아미드기가 가수분해되어 자유 카르복실산을 형성하는 과정인 탈아미드화하려는 경향이 있다. 다른 변성 경로는 2개 이상의 단백질 분자가 교차 아미드화 및/또는 이황화 상호작용을 통해 서로 공유 결합되어 공유 결합된 다이머, 올리고머 및 폴리머 변성 산물을 형성하는, 고분자량 변환 산물의 형성을 수반한다(Stability of Protein Phar-maceuticals, Ahem. T.J. & Manning M. C, Plenum Press, New York 1992). 화학적 변성의 다른 변형으로서는 산화(예를 들어, 메티오닌 잔기의 산화)가 언급될 수 있다. 단백질 제제의 화학적 안정성은 상이한 환경 조건에 노출한 후에 다양한 시간 지점에서 화학적 변성 산물의 양을 측정함으로써 평가될 수 있다(변성 산물의 형성은 대체로, 예를 들어 온도를 증가시킴으로써 가속될 수 있다). 주로, 각종 크로마토그래피 기술(예를 들어, SEC-HPLC 및/또는 RP-HPLC)을 이용하여 분자 크기 및/또는 전하에 따라 변성 산물을 분리함으로써 각 개별 변성 산물의 양이 측정된다.
이와 같이, 상기 간략히 설명한 대로, "안정화된 제제"는 물리적 안정성, 화학적 안정성 또는 물리적 및 화학적 안정성이 증가된 제제를 말한다. 일반적으로, 제제는 유통기한에 도달할 때까지 사용 및 보관 도중에 안정해야 한다(추천된 사용 및 보관 조건에 따를 경우).
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 제제는 6주 이상 사용 및 3년 이상 보관 동안 안정하다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 제제는 4주 이상 사용 및 3년 이상 보관 동안 안정하다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 제제는 4주 이상 사용 및 2년 이상 보관 동안 안정하다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 제제는 2주 이상 사용 및 2년 이상 보관 동안 안정하다.
다른 양태로서, 본 발명은 의약의 제조를 위한 본 발명에 따른 화합물의 사용에 관한 것이다.
어떤 구체예에서, 본 발명에 따른 화합물은 고혈당증, 2형 당뇨병, 내당능장애, 1형 당뇨병, 비만, 고혈압, X 증후군, 이상지질혈증, 인지장애, 죽상경화증, 심근경색, 뇌졸중, 관상동맥 심질환 및 기타 심혈관 장애, 염증성 장 증후군, 소화불량 및 위궤양의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에 사용된다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따른 화합물은 2형 당뇨병의 질환 진행을 지연 또는 예방하기 위한 의약의 제조에 사용된다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따른 화합물은 음식섭취 감소, β-세포 세포자살 감소, β-세포 기능 및 β-세포 질량 증가, 및/또는 β-세포에 글루코오스 민감성의 회복을 위한 의약의 제조에 사용된다.
또한, 본 발명에 따른 화합물을 사용한 치료는 2차 물질 또는 약리학적으로 더욱 활성인 물질과 조합될 수 있으며, 이러한 물질은, 예를 들어 항당뇨병제, 항비만제, 식욕조절제, 항고혈압제, 당뇨병으로 인한 또는 당뇨병과 관련된 합병증의 치료 및/또는 예방용 제제, 및 비만으로 인한 또는 비만과 관련된 합병증 및 장애의 치료 및/또는 예방용 제제로부터 선택된다. 이들 약리학적 활성 물질의 예들은 인슐린, 술포닐유레아, 비구아나이드, 메글리티나이드, 글루코시다제 억제제, 글루카곤 길항제, DPP-IV(디펩티딜 펩티다제-IV) 억제제, 글루코오스신합성 및/또는 글리코겐증의 자극에 연관된 간 효소의 억제제, 글루코오스 흡수 조정제, HMG CoA 억제제(스타틴류)인 항고지혈증제와 같은 지질대사를 변경하는 화합물, 억제성 위 폴리펩티드(GIP 유사체류), 음식섭취를 줄이는 화합물, RXR 작용제 및 β-세포 ATP-의존성 칼륨 채널에 대해 작용하는 제제; 콜레스티라민, 콜레스티폴, 클로피브레이트, 겜피브로질, 로바스타틴, 프라바스타틴, 심바스타틴, 프로부콜, 덱스트로티록신, 네테글리나이드, 레파글리나이드; β-차단제류, 예를 들어 알프레놀올, 아테놀올, 티몰올, 핀돌올, 프로프라놀올 및 메토프롤올, ACE(안지오텐신 전환효소) 억제제류, 예를 들어 베나제프릴, 캡토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 알라트리오프릴, 퀴나프릴 및 라미프릴, 칼슘 채널 차단제류, 예를 들어 니페디핀, 펠로디핀, 니카르디핀, 이스라디핀, 니모디핀, 딜티아젬 및 베라파밀, 그리고 α-차단제류, 예를 들어 독사조신, 우라피딜, 프라조신 및 테라조신; CART(코카인 암페타민 조절 전사) 작용제, NPY(뉴로펩티드 Y) 길항제, PYY 작용제, PYY2 작용제, PYY4 작용제, PPY2/PYY4 혼성작용제, MC4(멜라노코르틴 4) 작용제, 오렉신 길항제, TNF(종양괴사인자) 작용제, CRF(코르티코트로핀 방출 인자) 작용제, CRF BP(코르티코트로핀 방출 인자 결합 단백질) 길항제, 유로코르틴 작용제, β3 작용제, MSH(멜라닌세포-자극 호르몬) 작용제, MCH(멜라닌세포-농축 호르몬) 길항제, CCK(콜레시스토키닌) 작용제, 세로토닌 재흡수 억제제, 세로토닌 및 노르아드레날린 재흡수 억제제, 세로토닌 및 노르아드레날린 혼성 화합물, 5HT(세로토닌) 작용제, 봄베신 작용제, 갈라닌 길항제, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 화합물, TRH(티레오트로핀 방출 호르몬) 작용제, UCP 2 또는 3(커플링 해제 단백질 2 또는 3) 조정제, 렙틴 작용제, DA 작용제(브로모크립틴, 도프렉신), 리파제/아밀라제 억제제, RXR(레티노이드 X 수용제) 조정제, TR β 작용제; 히스타민 H3 길항제, 억제성 위 폴리펩티드 작용제 또는 길항제(GIP 유사체류), 가스트린 및 가스트린 유사체이다.
또한, 본 발명에 따른 화합물을 사용한 치료는 수술과 조합될 수 있는데, 수술은 위 밴드 삽입술 또는 위 우회술과 같은 글루코오스 수준 및/또는 지질 항상성에 영향을 미치는 수술이다.
본 발명에 따른 화합물과 상기 언급된 화합물들 중 하나 이상 및 선택적으로 하나 이상의 추가의 약리학적 활성 물질의 어떤 적합한 조합이 본 발명의 범위로서 고려됨이 이해되어야 한다.
본 발명은 다음의 실시예들에 의해 더 예시되며, 그러나 실시예들은 본 발명의 보호 범위를 제한하지는 않는다. 전술한 설명 및 하기 실시예에 개시된 특징들은 모두 독자적으로 그리고 그것들의 어떤 조합으로서 다양한 형태의 본 발명을 실현하기 위한 재료일 수 있다.
사용된 약자
r.t.: 실온
DIPEA: 디이소프로필에틸아민
H2O: 물
CH3CN: 아세토니트릴
DMF: NN 디메틸포름아미드
HBTU: 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트
Fmoc: 9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐
Boc: tert-부틸옥시카르보닐
OtBu: tert-부틸에스테르
tBu: tert-부틸
Trt: 트리페닐메틸
Pmc: 2,2,5,7,8-펜타메틸-크로만-6-술포닐
Dde: 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)에틸
ivDde: 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)-3-메틸부틸
Mtt: 4-메틸트리틸
Mmt: 4-메톡시트리틸
DCM: 디클로로메탄
TIS: 트리이소프로필실란
TFA: 트리플루오로아세트산
Et2O: 디에틸에테르
NMP: 1-메틸-피롤리돈-2-온
DIPEA: 디이소프로필에틸아민
HOAt: 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸
HOBt: 1-히드록시벤조트리아졸
DIC: 디이소프로필카르보디이미드
A: 수지 결합 펩티드의 합성
Applied Biosystems 433 펩티드 합성장치에서 NMP(N-메틸피롤리돈) 중에서의 HBTU(2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄헥사플루오로포스페이트) 또는 HATU(O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트) 매개 커플링을 이용하는 제조자가 공급한 FastMoc UV 프로토콜을 사용하여 Fmoc 전략에 따라서 0.25mmol 또는 1.0mmol 규모로 보호된 펩티딜 수지를 합성하고, Fmoc 보호기의 탈보호를 UV 모니터했다. GLP-1 펩티드 아미드의 합성에 사용된 출발 수지는 Rink-Amide 수지였고, 카르복실 C-말단을 갖는 GLP-1 펩티드에는 Wang 또는 클로로트리틸 수지 중 하나를 사용했다. 사용된 보호된 아미노산 유도체는 ABI433A 합성장치에 알맞은 미리 무게를 잰 카트리지에 넣어 공급되는 표준형 Fmoc-아미노산(예를 들어, Anaspec 또는 Novabiochem에서 공급되는 것)이었고, 단 Fmoc-Aib-OH(Fmoc-아미노이소부티르산)과 같은 비-천연 아미노산은 제외한다. N-말단 아미노산은 알파 아미노기에서 Boc 보호했다(예를 들어, N-말단에 His가 있는 펩티드에 대해 Boc-His(Boc)OH를 사용했다). 위치 26에 있는 리신의 엡실론 아미노기는 알부민 결합 부분 및 스페이서의 부착 경로에 따라 Mtt, Mmt, Dde, ivDde, 또는 Boc 중 하나로 보호했다. 일부 경우 펩티드의 합성은 디펩티드 아미드 결합 이 산성 조건에서 절단될 수 있는 기로 보호된 디펩티드를 사용하여 개선될 수 있으며, 제한은 아니지만 이러한 기의 예로서 2-Fmoc-옥시-4-메톡시벤질 또는 2,4,6-트리메톡시벤질이 있다. 펩티드에 세린 또는 트레오닌이 존재하는 경우에는 슈도프롤린 디펩티드를 사용할 수 있다(예를 들어, Novobiochem 2002/2003 카탈로그 또는 최신 버전 카탈로그, 또는 W. R. Sampson (1999), J. Pep. Sci. 5, 403 참조).
ivDde 또는 Dde -보호 제거 과정:
수동 쉐이커/여과 장치에 수지(0.25mmol)를 넣고 N-메틸피롤리돈 중의 2% 히드라진으로 처리하여(20mL, 2 x 12분) Dde 또는 ivDde 기를 제거하고 N-메틸피롤리돈(4 x 20mL)으로 세척했다.
Mtt 또는 Mmt -보호 제거 과정:
수동 쉐이커/여과 장치에 수지(0.25mmol)를 넣고 DCM 중의 2% TFA 및 2-3% TIS로 처리하여(20mL, 5-10분씩 6-12회 반복) Mtt 또는 Mmt 기를 제거하고 DCM(2 x 20mL), DCM 중의 10% MeOH 및 5% DIPEA(2 x 20mL) 및 N-메틸피롤리돈(4 x 20mL)으로 세척했다.
리신 잔기에 측쇄 부착 과정:
제한은 아니지만 DIC, HOBt/DIC, HOAt/DIC 또는 HBTU와 같은 표준 아실화 시약을 사용하여 수지 결합 펩티드를 아실화하거나 또는 용액 중에서 미보호 펩티드를 아실화함으로써 알부민 결합 잔기(식 I의 B-U- 측쇄)를 GLP-1 펩티드에 부착할 수 있다.
수지 결합 펩티드에의 부착:
경로 I
옥타데칸디오산 모노-(2,5-디옥소-피롤리돈-1-일)에스테르(EP511600, Ebashi 등, 수지 결합 펩티드에 대해 4몰 당량)와 같은 활성화(활성 에스테르 또는 대칭형 무수물) 알부민 결합 수지(식 I의 B-U- 측쇄)를 NMP(25mL)에 용해시켜 수지에 가하고 실온에서 하룻밤 흔들었다. 반응 혼합물을 여과하고, 수지를 NMP, 디클로로메탄, 2-프로판올, 메탄올 및 디에틸에테르로 광범하게 세척했다.
경로 II
N-메틸피롤리돈/염화메틸렌(1:1, 10mL)에 알부민 결합 수지(식 I의 B-U- 측쇄)를 용해했다. 히드록시벤조트리아졸(HOBt)(수지에 대해 4몰 당량) 및 디이소프로필카르보디이미드(수지에 대해 4몰 당량)와 같은 활성화 시약을 가하고, 이 용액을 15분간 교반했다. 용액을 수지에 가하고, 디이소프로필에틸아민(수지에 대해 4몰 당량)을 가했다. 수지를 실온에서 2 내지 24시간 흔들었다. 수지를 N-메틸피롤리돈(2 x 20mL), N-메틸피롤리돈/염화메틸렌(1:1)(2 x 20mL) 및 염화메틸렌(2 x 20mL)으로 세척했다.
경로 III
옥타데칸디오산 모노-(2,5-디옥소-피롤리돈-1-일)에스테르(EP511600, Ebashi 등, GLP-1 펩티드에 대해 1-1.5몰 당량)과 같은 활성화(활성 에스테르 또는 대칭형 무수물) 알부민 결합 잔기(식 I의 B-U- 측쇄)를 아세토니트릴, THF, DMF 또는 DMSO 등의 유기용매 또는 물/유기용매(1-2mL)의 혼합물에 용해하고, 펩티드와 10몰 당량의 DIPEA가 물(10-20mL)에 함께 용해된 용액에 가했다. 알부민 결합 잔기에 tert- 부틸과 같은 보호기가 있는 경우, 반응 혼합물을 O/N 동결건조했고, 그 후 분리된 조 펩티드를 탈보호했다 - tert-부틸기의 경우 펩티드를 트리플루오로아세트산, 물 및 트리이소프로필실란(90:5:5)의 혼합물에 용해했다. 30분 후 혼합물을 진공에서 증발시키고, 최종 펩티드를 예비 HPLC로 정제했다.
Fmoc -보호 제거 과정:
수동 쉐이킹 장치의 필터 플라스크에 수지(0.25mmol)를 넣고 N-메틸피롤리돈/염화메틸렌(1:1)(2 x 20 mL)과 N-메틸피롤리돈(1 x 20mL), N-메틸피롤리돈 중의 20% 피페리딘 용액(3 x 20mL, 각각 10분)으로 처리했다. 수지를 N-메틸피롤리돈(2 x 20mL), N-메틸피롤리돈/염화메틸렌(1:1)(2 x 20mL) 및 염화메틸렌(2 x 20mL)으로 세척했다.
수지로부터 펩티드의 절단 과정:
트리플루오로아세트산, 물 및 트리이소프로필실란(95:2.5:2.5 내지 92:4:4)의 혼합물과 함께 실온에서 180분간 교반하여 수지로부터 펩티드를 절단했다. 절단 혼합물을 여과하고, 여과물을 질소 스트림에 의해 기름이 될 때까지 농축했다. 45mL 디에틸에테르를 사용하여 이 기름으로부터 조 펩티드를 침전시키고, 45mL 디에틸에테르로 1 내지 3회 세척했다.
정제:
조 펩티드를 5μ 또는 7μ C-18 실리카로 충진된 20mm x 250mm 칼럼 상에서 반예비 HPLC에 의해 정제했다. 펩티드에 따라 1회 또는 2회의 정제 시스템을 사용했다.
TFA: 건조한 후, 조 펩티드를 5mL 50% 아세트산 H2O에 용해하고, H2O로 20mL까지 희석하여 칼럼에 주입한 다음, 40℃에서 10mL/분으로 0.1% TFA 중의 40-60% CH3CN의 구배로 50분간 용출시켰다. 펩티드를 함유하는 분획들을 수집했다. 용출액을 물로 희석한 후, 정제된 펩티드를 동결건조했다.
황산 암모늄: 진한 H2SO4를 사용하여 pH를 2.5로 조정한 0.05M (NH4)2SO4 중의 40% CH3CN으로 칼럼을 평형화했다. 건조한 후, 조 펩티드를 5mL 50% 아세트산 H2O에 용해하고, H2O로 20mL까지 희석하여 칼럼에 주입한 다음, 40℃에서 10mL/분으로0.05M (NH4)2SO4, pH 2.5 중의 40-60% CH3CN의 구배로 50분간 용출시켰다. 펩티드를 함유하는 분획들을 수집하고, 3부피의 H2O로 희석한 후, 0.1% TFA로 평형화시켜 둔 Sep-Pak
Figure 112007054394073-pct00056
카트리지(Waters part. #:51910)를 통과시켰다. 다음에, 0.1% TFA를 함유하는 70% CH3CN으로 용출시키고, 용출액을 물로 희석한 후, 정제된 펩티드를 동결건조에 의해 분리했다.
얻어진 최종 산물을 분석 RP-HPLC(체류시간) 및 LCMS로 특성화했다.
RP-HPLC 분석은 UV 검출기를 이용하여 214nm에서, 그리고 42℃에서 1mL/분으로 용출시켜 둔 Vydac 218TP54 4.6mm x 250mm 5μ C-18 실리카 칼럼을 이용하여 수행했다. 두 상이한 용출 조건을 사용했다:
A1: 진한 H2SO4로 pH 2.5로 조정한 0.1M (NH4)2SO4로 구성된 버퍼로 칼럼 평형 화, 동일한 버퍼 중에서 0%에서 60% CH3CN의 구배로 50분간 용출
B1: 0.1% TFA/H2O로 칼럼 평형화, 0% CH3CN/0.1% TFA/H2O에서 60% CH3CN/0.1% TFA/H2O의 구배로 50분간 용출
B6: 0.1% TFA/H2O로 칼럼 평형화, 0% CH3CN/0.1% TFA/H2O에서 90% CH3CN/0.1% TFA/H2O의 구배로 50분간 용출
또는 달리, RP-HPLC 분석은 UV 검출기에서 214nm에서, 그리고 42℃에서 1mL/분으로 용출시켜 둔 Symmetry300, 3.6mm x 150mm, 3.5μ C-18 실리카 칼럼(Waters)을 이용하여 수행했다.
B4: 0.05% TFA/H2O로 칼럼 평형화, 5% CH3CN/0.05% TFA/H2O에서 95% CH3CN/ 0.05% TFA/H2O의 구배로 15분간 용출
다음의 기기 구성을 사용했다:
LCMS 를 Sciex API 100 싱글 쿼드로폴 질량분광기, Perkin Elmer Series 200 Quard 펌프, Perkin Elmer Series 200 오토샘플러, Applied Biosystems 785A UV 검출기, Sedex 75 증기화 광산란 검출기로 구성된 장치에서 수행했다.
기기제어 및 데이터 수집은 윈도우 2000 컴퓨터에서 가동되는 Sciex 샘플 콘트롤 소프트웨어로 수행했다.
HPLC 펌프는 두 용리액 저장소에 연결되며, 이것은 각각 다음을 함유한다:
A: 0.05% 트리플루오로아세트산 수용액
B: 0.05% 트리플루오로아세트산 아세토니트릴 용액
분석은 실온에서 아세토니트릴로 구배 용출되고 있는 칼럼 위로 적당한 부피의 샘플(바람직하게는 20㎕)을 주입하여 수행한다. 사용된 HPLC 조건, 검출기 설정 및 질량분광기 설정은 다음 표에 제공된다.
칼럼: Waters Xterra MS C-18 X 3mm 내경 5㎛
구배: 1.5mL/분으로 7.5분간 5% - 90% 아세토니트릴 선형 구배
검출: 210nm (DAD로부터 나온 유사체)
ELS (ELS로부터 나온 유사체), 40℃
MS 이온화 모드 API-ES
또는 달리, LCMS 는 Hewlett Packard series 1100 G1312A Bin 펌프, Hewlett Packard series 1100 칼럼 격벽, Hewlett Packard series 1100 G1315A DAD 다이오드 어레이 검출기, Hewlett Packard series 1100 MSD 및 HP Chemstation 소프트웨어에 의해 제어되는 Sedere 75 증기화 광산란 검출기로 구성된 장치에서 수행했다. HPLC 펌프는 두 용리액 저장소에 연결되며, 이것은 각각 다음을 함유한다:
A: 10mM NH4OH 수용액
B: 10mM NH4OH 90% 아세토니트릴 용액
분석은 23℃에서 A 및 B로 구배 용출되고 있는 칼럼 위로 적당한 부피의 샘플(바람직하게는 20㎕)을 주입하여 수행했다. 사용된 HPLC 조건, 검출기 설정 및 질량분광기 설정은 다음 표에 제공된다.
칼럼: Waters Xterra MS C-18 X 3mm 내경 5㎛
구배: 1.5mL/분으로 6.5분간 5% - 100% 아세토니트릴 선형 구배
검출: 210nm (DAD로부터 나온 유사체)
ELS (ELS로부터 나온 유사체)
MS 이온화 모드 API-ES
0.1 amu 씩 100-1000 amu 스캔
사람 GLP-1 수용체를 발현하는 원형질막에 결합된 방사성 리간드
사람 GLP-1 수용체를 함유하는 정제된 원형질막을 사용하여 결합 분석을 수행했다. 수용체를 함유하는 원형질막을 안정하게 발현한 BHK tk-ts 13 세포로부터 정제했다. 이 막을 최종 단백질 농도 0.2mg/mL 단백질까지 분석 버퍼(50mM HEPES, 5mM EGTA, 5mM MgCl2, 0.005% Tween 20, pH=7.4)로 희석하고, 0.3% PEI로 미리 코팅한 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 분배했다. 막을 0.05nM [125I]GLP-I의 존재하에 미표지 리간드의 농도를 증가시키면서 상이한 농도의 HSA(0.005%, 0.05% 및 2%)와 함께 30℃에서 2시간 인큐베이션했다. 인큐베이션 후 진공-매니폴드를 통해 여과하여 미결합 리간드와 결합 리간드를 분리한 다음, 얼음으로 차게 한 분석 버퍼로 100㎕씩 2번 세척했다. 필터를 실온에서 하룻밤 건조하고 구멍을 뚫어 γ-계수기에서 정량했다.
실시예 1
Figure 112007054394073-pct00057
N-ε26-(17-카르복시헵타데카노일)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드
제조자의 가이드라인에 따라 ABI433A 기계에서 수지(Fmoc-Gly-NovaSyn TGT, 0.22mmol/g, Novabiochem 0.25mmole)를 사용하여 주 서열을 만들었다. 모든 보호기는 산 불안정했으며, 위치 26에서 사용된 잔기(FmocLys(ivDde)-OH, Novabiochem)는 어떤 다른 리신보다도 이 리신의 특이적 탈보호를 허용했다.
과정
수지(0.09mmole)를 수동 쉐이커/여과 장치에 넣고, N-메틸피롤리돈 중의 4% 히드라진(4 x 10분. 4 x 4mL)으로 처리하여 ivDde 기를 제거했다. 수지를 N-메틸피롤리돈으로 세척했다(3 x 4mL). 옥타데칸디오산 모노-(2,5-디옥소-피롤리돈-1-일)에스테르)(수지에 대해 4몰 당량)을 DMF(4mL)에 용해했다. 이 용액을 수지에 가하고, 디이소프로필에틸아민(수지에 대해 8몰 당량)을 가했다. 수지를 실온에서 24시간 흔들었다. 수지를 N-메틸피롤리돈(4 x 4mL) 및 DCM(4 x 4mL)로 세척했다. 트리플루오로아세트산, 물 및 트리이소프로필실란(92.5:5.0:2.54mL)의 혼합물과 함께 실온에서 180분간 교반하여 수지로부터 펩티드를 절단했다. 절단 혼합물을 여과하고, 40mL 디에틸에테르를 사용하여 조 펩티드를 침전시키고, 45mL 디에틸에테르로 3번 세척했다. 조 펩티드를 7μ C-18 실리카로 충진된 20mm x 250mm 칼럼 상 에서 예비 HPLC에 의해 정제했다. 조 펩티드를 5mL 50% 아세트산 수용액에 용해하고, H2O로 20mL까지 희석하여 칼럼에 주입한 다음, 실온에서 20mL/분으로 25-65% (0.1% TFA를 함유한 CH3CN 수용액)의 구배로 40분간 용출시켰다. 펩티드를 함유하는 분획들을 수집했다. 용출액을 물로 희석한 후, 정제된 펩티드를 동결건조했다.
HPLC (방법 B4): RT = 9.94분 (91%)
LCMS: m/z = 1232(MH3 3 +), (MH3 3 +)의 이론값 = 1232
실시예 2
Figure 112007054394073-pct00058
N-ε26-(19-카르복시노나데카노일)-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드
실시예 1과 같이 "합성 방법"에 따라서 제조한다.
HPLC (방법 B4): RT = 10.42분 (91%)
LCMS: m/z = 1242(MH3 3 +), (MH3 3 +)의 이론값 = 1242
실시예 3
Figure 112007054394073-pct00059
N-ε26-(4-{[N-(2-카르복시에틸)-N-(15-카르복시펜타데카노일)아미노]메틸}벤조일[Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드
THF(1mL) 중의 4-(N-(2-(tert-부톡시카르보닐)에테르)-N-(15-(tert-부톡시카르보닐)펜타데카노일)아미노메틸)벤조산(36mg, 60μmol)의 용액에 DIPEA(7㎕)와 O-(1-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(TSTU, 17mg, 56㎕)를 가했다. 실온에서 1시간 교반한 후, 혼합물을 THF(1mL)로 희석하고, 결과의 용액 1mL를 [Arg34]GLP-1-(7-37) 펩티드(약 100mg)와 DIPEA(103㎕) 수용액(5mL)에 가했다. 0.5시간 이상 후에 아실화제의 THF 용액(0.4mL)을 가했다. 실온에서 총 1.5시간 교반한 후, 반응 혼합물을 여과하고 예비 HPLC(35-55% MeCN/55-35% 물/1% TFA를 함유한 10% 물로 구배 용출)에 적용했다. 원하는 산물을 함유하는 분획들을 합쳐서 동결건조했다. 다음에, 이 산물을 실온에서 15분간 TFA와 물(95/5 부피)의 혼합물 25mL로 처리하고 농축한 다음, HPLC로 한번 더 정제했다. 표제 화합물 15.4mg이 얻어졌다.
HPLC (방법 B4): RT = 9.41분 (99%)
LCMS: m/z = 1287(MH3 3 +), (MH3 3 +)의 이론값 = 1287
실시예 4
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GL P-1-(7-37)-펩티드
Figure 112007054394073-pct00060
[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드를 표준형 Fmoc-고체상 펩티드 합성에 의해 제조하고 예비 HPLC로 정제했다. [Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드를 물(15mL)에 용해하고 DIPEA(5OuL)을 가했다. 17-((S)-1-tert-부톡시카르보닐-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일옥시카르보닐메톡시)에톡시]에틸카르보닐}메톡시)에톡시]에틸카르보닐}프로필카르바모일)헵타데칸산 tert-부틸에스테르(21mg)를 아세토니트릴/물 2:1(1.5mL)에 용해하고 조금씩 가했다. HPLC로 반응을 모니터했다. [Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드가 더 이상 발견되지 않았을 때 반응 혼합물을 O/N 동결건조했다. 분리된 화합물에 90% TFA/5% TIS/5% 물을 10mL를 가하고, 반응 혼합물을 2시간 정치하고, 진공에서 증발시킨 후 헵탄과 함께 공-증발시켰다. 잔류한 기름을 1% NH3-aq를 함유하는 물 15mL에 용해하고 예비 HPLC로 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
HPLC (방법 B4): RT = 9.60분 (100%)
LCMS: m/z = 1372(MH3 3 +), (MH3 3 +)의 이론값 = 1372
실시예 5
Figure 112007054394073-pct00061
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(19-카르복시노나데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드
"A. 수지 결합 펩티드의 합성"에 따라서 펩티드를 제조했다. 제조자의 가이드라인에 따라 ABI433A 기계에서 0.25mmol 규모로 Fmoc-Gly-Wang 수지(0.66mmol/g Novabiochem)를 사용하여 주 서열을 만들었다. 모든 보호기는 산 불안정했고, 위치 26에서 사용된 잔기(FmocLys(Mtt)-OH, Novabiochem)는 고도로 산 불안정하여 어떤 다른 리신보다도 이 리신의 특이적 탈보호를 허용했다.
Mtt-보호 제거 과정: 수지(0.25mmol)를 수동 쉐이커/여과 장치에 넣고, DCM 중의 2% TFA, 3% TIS로 처리하여(20mL, 5-10분씩 6-12회 반복) Mtt 기를 제거하고 DMF로 세척했다. 경로 II에 따라서 리신 잔기에 측쇄를 부착하는 과정과 Fmoc-보호를 제거하는 적합한 과정을 사용하여 합성을 계속했다. 최종 탈보호, HPLC-정제 및 HPLC와 LC-MS에 의한 분석도 앞선 과정을 따라서 수행했다.
HPLC (방법 B6): RT = 34.56분 (100%)
LCMS: m/z = 1381.8(MH3 3 +), (M+H+)의 이론값 = 4142.7
실시예 6
Figure 112007054394073-pct00062
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][3-(4-이미다졸릴)프로피오닐7,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드
실시예 5와 같이 "합성 방법"에 따라서 제조한다.
HPLC (방법 B6): RT = 32.89분 (100%)
LCMS: m/z = 1362.3(MH3 3 +), (M+H+)의 이론값 = 4085.6
실시예 7
Figure 112007054394073-pct00063
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-(카르복시메틸-아미노)아세틸아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드
실시예 5와 같이 "합성 방법"에 따라서 제조한다.
HPLC (방법 B6): RT = 32.67분 (100%)
LCMS: m/z = 1367.3(MH3 3 +), (M+H+)의 이론값 = 4100.6
실시예 8
Figure 112007054394073-pct00064
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-3(S)-술포프로피오닐아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드
실시예 5와 같이 "합성 방법"에 따라서 제조한다.
HPLC (방법 B6): RT = 32.04분 (100%)
LCMS: m/z = 1379.8(MH3 3 +), (M+H+)의 이론값 = 4136.7
실시예 9
Figure 112007054394073-pct00065
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Gly8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드
Advanced Chemtech 사의 Apex396을 이용하여 Fmoc-고체상 펩티드 합성에 의해 150mg 염화 2-클로로트리틸 수지(1.4mmol/g)로부터 출발하여 [Gly8,Arg34]GLP-1(1-37) 펩티드를 제조했다. 위치 26에 있는 Lys 잔기를 Lys(ivDde)로서 보호하는 한편, 나머지 다른 아미노산들의 기능성 측쇄들은 표준 산 불안정성 보호기로 보호했다. Lys 잔기를 NMP 중에서 3% 히드라진/3% 피페리딘을 사용하여 1시간 탈보호했다. 다음에, DIC/HOAt를 사용하여 수지 부착 펩티드에 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산, γ-글루탐산 및 옥타데칸디오산을 2 유닛을 커플링시켰다. 마지막으로, 펩티드를 탈보호한 다음, TFA/TIS/H2O/티오아니솔(90/5/3/2)을 사용하여 수지로부터 절단했다. 펩티드를 LC-MS로 분리했다.
HPLC: 46% 아세토니트릴에서 용출
MALDI: 4087 (MH+)
실시예 10
Figure 112007054394073-pct00066
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-아미드
Advanced Chemtech 사의 Apex396을 이용하여 Fmoc-고체상 펩티드 합성에 의해 200mg Tentagel RAM S 수지(0.26mmol/g)로부터 출발하여 [Aib8,34]GLP-1(1-37) 아미드를 제조했다. 위치 26에 있는 Lys 잔기를 Lys(ivDde)로서 보호하는 한편, 나머지 다른 아미노산들의 기능성 측쇄들은 표준 산 불안정성 보호기로 보호했다. Lys 잔기를 NMP 중에서 3% 히드라진/3% 피페리딘을 사용하여 1시간 탈보호했다. 다음에, DIC/HOAt를 사용하여 수지 부착 펩티드에 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산, γ-글루탐산 및 옥타데칸디오산을 2 유닛을 커플링시켰다. 마지막으로, 펩티드를 탈보호한 다음, TFA/TIS/H2O/티오아니솔(90/5/3/2)을 사용하여 수지로부터 절단했다. 펩티드를 LC-MS로 분리했다.
HPLC: 49% 아세토니트릴에서 용출
MALDI: 4114 (MH+)
실시예 11
Figure 112007054394073-pct00067
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34,Pro37]GLP-1-(7-37)-아미드
Rink 아미드 수지(0.70mmol/g Novabiochem) 상에서 펩티드를 합성했으며, 그 밖의 것은 실시예 5와 동일하게 "합성 방법"에 따라서 했다.
HPLC (방법 B6): RT = 32.13분 (100%), (방법 A1): RT = 44.33분 (98.4%)
LCMS: m/z = 1385.3(MH3 3 +), (M+H+)의 이론값 = 4153.8
실시예 12
Figure 112007054394073-pct00068
Aib8,Lys26(N-ε26-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(펜타데카노일아미노)-4-카르복시부티릴아미노)에톡시)에톡시]아세틸)에톡시)에톡시)아세틸)}),Arg34)GLP-1 H(7-37)-OH
HPLC (방법 B6): RT = 30.41분
LCMS: m/z = 1362.9(MH3 3 +), (M+)의 이론값 = 4085.61
실시예 13
Figure 112007054394073-pct00069
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-{[N-(2-카르복시에틸)-N-(17-카르복시헵타데카노일)아미노]메틸}벤조일)아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1(7-37)
Advanced Chemtech 사의 Apex396을 이용하여 Fmoc-고체상 펩티드 합성에 의해 150mg 염화 2-클로로트리틸 수지(1.4mmol/g)로부터 출발하여 [Aib8,Arg34]GLP- 1(1-37) 펩티드를 제조했다. 위치 26에 있는 Lys 잔기를 Lys(ivDde)로서 보호하는 한편, 나머지 다른 아미노산들의 기능성 측쇄들은 표준 산 불안정성 보호기로 보호했다. Lys 잔기를 NMP 중에서 3% 히드라진/3% 피페리딘을 사용하여 1시간 탈보호했다. 다음에, DIC/HOAt를 사용하여 수지 부착 펩티드에 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산 및 4{[(2-tert-부톡시카르보닐에틸)-(17-tert-부톡시카르보닐헵타데카노일)아미노]메틸}벤조산을 2 유닛을 커플링시켰다. 마지막으로, 펩티드를 탈보호한 다음, TFA /TIS/H2O/티오아니솔(90/5/3/2)을 사용하여 수지로부터 절단했다. 예비 LC-MS로 펩티드를 분리했다.
HPLC: 52% 아세토니트릴에서 용출
MALDI: 4191 (MH+)
실시예 14
Figure 112007054394073-pct00070
N-α7-포르밀,N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드
HPLC (방법 B6): RT = 32.6분
LCMS: m/z = 1377.3(MH3 3 +), (M+)의 이론값 = 4128.0
실시예 15
Figure 112007054394073-pct00071
N-ε2626-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Glu22,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드
Advanced Chemtech 사의 Apex396을 이용하여 Fmoc-고체상 펩티드 합성에 의해 150mg Fmoc-Gly-Wang 수지(0.66mmol/g)로부터 출발하여 [Aib8,Glu22,Arg34]GLP-1(1-37) 펩티드를 제조했다. 위치 26에 있는 Lys 잔기를 Lys(Mtt)로서 보호하는 한편, 나머지 다른 아미노산들의 기능성 측쇄들은 표준 산 불안정성 보호기로 보호했다. Lys 잔기를 DCM 중에서 2% TFA/2% TIS를 사용하여 5분씩 4번 탈보호했다. 다음에, DIC/HOAt를 사용하여 수지 부착 펩티드에 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산, γ-글루탐산 및 옥타데칸산 tert-부틸에스테르를 2유닛을 커플링시켰다. 마지막으로, 펩티드를 탈보호한 다음 TFA/TIS/H2O/티오아니솔(90/5/3/2)을 사용하여 수지로부터 절단했다. LC-MS로 펩티드를 분리했다.
HPLC: 50% 아세토니트릴에서 용출
MALDI: 4187 (MH+)
실시예 16
Figure 112007054394073-pct00072
N-ε26-{3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-[4-(15-(N-((S)-1,3-디카르복시프로필)카르바모일)펜타데카노일아미노)-(S)-4-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]프로피오닐}[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드
방법 및 분석
실시예 3과 같이 "합성 방법"에 따라서 제조한다.
HPLC (방법 B4): RT = 10.29분 (92%)
LCMS: m/z = 1450(MH3 3 +), (MH3 3 +)의 이론값 = 1450
실시예 17
Figure 112007054394073-pct00073
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-{[N-(2-카르복시에틸)-N-(17-카르복시헵타데카노일)아미노]메틸}벤조일)아미노](4(S)-카르복시부티릴아미노)에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1(7-37)
Advanced Chemtech 사의 Apex396을 이용하여 Fmoc-고체상 펩티드 합성에 의해서 150mg Fmoc-Gly-Wang 수지(0.66mmol/g)로부터 출발하여 [Aib8,Arg34]GLP-1(1-37) 펩티드를 제조했다. 위치 26에 있는 Lys 잔기를 Lys(Mtt)로서 보호하는 한편, 나머지 다른 아미노산들의 기능성 측쇄들은 표준 산 불안정성 보호기로 보호했다. Lys 잔기를 DCM 중에서 2% TFA/2% TIS를 사용하여 5분씩 4번 탈보호했다. 다음에, DIC/HOAt를 사용하여 수지 부착 펩티드에 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산, γ-글루탐산 및 4{[(2-tert-부톡시카르보닐에틸)-(17-tert-부톡시카르보닐헵타데카노일)아미노]메틸}벤조산을 2유닛을 커플링시켰다. 마지막으로, 펩티드를 탈보호한 다음 TFA/ TIS/H2O/티오아니솔(90/5/3/2)을 사용하여 수지로부터 절단했다. 예비 LC-MS로 펩티드를 분리했다.
HPLC: 51% 아세토니트릴에서 용출
MALDI: 4320 (MH+)
실시예 18
Figure 112007054394073-pct00074
N-ε26-{(S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-((S)-4-카르복시-4-(19-카르복시노나데카노일아미노)부티릴아미노)부티릴아미노)부티릴아미노)부티릴아미노}[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)
Liberty Microwave Peptide 합성장치(CEM Corporation)에서 Fmoc 화학을 이 용하여 펩티드를 합성했다. 0.66mmol/g이 로딩된 Gly-Wang 수지(Novabiochem) 상에서 합성을 수행했으며, 커플링을 위해서 4배 과량의 아미노산을 사용했다. N-말단 히스티딘을 Boc-보호했고, 변형될 리신은 Mtt-보호했다. 펩티드 백본을 합성한 후에, DCM 중에서 3% TFA를 사용하여 Mtt 기를 제거하고, Liberty에서 표준 펩티드 합성 프로토콜을 이용하여 측쇄를 구성했다. 마지막 단계에서 모노-t-부틸에스테르로서 지방 2산을 가했다.
TFA/TIS/물(95:2.5:2.5)을 사용하여 절단한 후, 펩티드를 50% 아세토니트릴 중에서 DIPEA를 첨가하여 용해하고, 실온에서 구동되는 7.8 x 300mm X-Terra Prep MS C18 10㎛ 칼럼을 사용하는 Waters LC-MS 시스템에서 정제했다. 4mL/분으로 30% CH3CN, 0.08% TFA를 5분간 흘린 후, 칼럼을 40분에 걸쳐 30%에서 70% CH3CN의 선형 구배로 용출시켰다. 원하는 화합물을 함유하는 분획들을 수집하고, 용출액 중 펩티드의 농도를 280nm에서 UV 흡광도를 판정하여 측정했는데, 이때 티로신과 트립토판의 몰 흡광계수는 각각 1280 및 3690로 가정했다. 화합물 및 순도를 MALDI로 확인했다. 농도 측정 후, 용출물을 원하는 양을 함유하는 바이알에 알리쿼트로 나누어 담고, 진공 원심분리에 의해 건조했다.
HPLC: 52% 아세토니트릴에서 용출
MALDI: 4239 (MH+)
실시예 19
Figure 112007054394073-pct00075
N-ε26-4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴-[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드
방법 및 분석
실시예 4와 같이 "합성 방법"에 따라서 제조한다.
HPLC (방법 B4): Rt = 9.64분 (97%)
LCMS: m/z = 1276(MH3 3 +), (MH3 3 +)의 이론값 = 1276
실시예 20
Figure 112007054394073-pct00076
N-ε26-{3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]에톡시}에톡시)에톡시]프로피오닐}[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드
LCMS*: m/z = 1417(MH3 3 +), (MH3 3 +)의 이론값 = 1417
*HPLC (42℃에서 0.5mL/분으로 용출, 5 --> 80% 아세토니트릴, 85 --> 10% 물 및 1.0% 트리플루오로아세트산의 10% 용액을 50분에 걸쳐 선형 구배로)
(방법 B4): Rt = 32.09분 (95%)
실시예 21
Figure 112007054394073-pct00077
N-ε26-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4-카르복시부티릴아미노)에톡시)에톡시]아세틸)에톡시)에톡시)아세틸)}-[Aib8,22,27,30,35,Arg34,Pro37,Lys26]GLP-1(7-37)-아미드
HPLC (방법 B6): RT = 35.0분
LCMS: m/z = 1394.0(MH3 3 +), (M+)의 이론값 = 4180.0
실시예 22
Figure 112007054394073-pct00078
N-ε26-[2-(2-[2-[4-(21-카르복시운에이코사노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)
실시예 19에서와 동일한 방법을 이용하여 제조한다.
HPLC: 53.4% 아세토니트릴에서 용출
MALDI: 4025 (MH+)
본 발명의 다른 화합물들은 다음의 것들을 포함한다:
Figure 112007054394073-pct00079
N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-카르복시운에이코사노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드
Figure 112007054394073-pct00080
N-α1-포르밀-N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(19-카르복시노나데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Arg34]GLP-1-(7-37)-펩티드
Figure 112007054394073-pct00081
Figure 112007054394073-pct00082
db/db 마우스를 이용한 약물역학 연구
본 발명의 한 양태에서, GLP-1 작용제는 db/db 마우스에게 30nmol/kg의 용량으로 투여된 후 적어도 24시간의 작용 지속기간을 가진다. db/db 마우스에서 효능 및 작용 지속기간을 측정한다. 8-10주령의 수컷 db/db 마우스는 덴마크 타코닉으로부터 배로 가져온다. 도착하자마자 마우스를 24℃에서 표준 조건하에 우리에 가둔다. 마우스를 우리 당 10마리씩 넣고 실험 때까지 정상적인 낮/조명 사이클(오 전 6시에 조명을 켠다) 하에 표준식(Altromin, Brogaarden APS., Denmark)과 수돗물을 자유롭게 섭취하도록 한다. 마우스는 3주 동안 주 당 1회 실험에 사용한다. 이후 마우스를 안락사시킨다.
1주일의 적응기간 후에, 꼬리 끝 모세관으로부터 샘플링하여 혈액 글루코오스를 측정한다. 간단히 말해서, 5㎕ 혈액을 헤파린 유리 모세관에 샘플링하고, 바로 이어서 1.5mL 에펜드로프 튜브에서 250㎕ EBIO 버퍼 용액(Eppendorf, Germany)에 현탁한다. EBIO 플러스 자동 분석기(Eppendorf, Germany)에서 글루코오스 옥시다제법에 의해 혈액 글루코오스 농도를 측정한다.
혈액 글루코오스 값의 컷은 10mM이다. 마우스를 평가할 때는 실험에 들어가는 42마리의 마우스가 전부 10mM 이상의 혈액 글루코스 값을 가져야 하며, 또한 마우스들 간 변동이 적어야 한다. 따라서, 대부분의 마우스에서는 당뇨병이 그다지 심하지 않고 일부만 심할 경우, 실험의 시작을 1주일 연기하여야 하며, 기초적 혈액 글루코오스 측정을 새로 해야 한다.
기초적 혈액 글루코오스 값에 기초하여 마우스를 n=6의 7개 그룹으로 배분하고, 각 그룹의 혈액 글루코오스 값을 평균한다.
시험일 아침에 기초적 혈액 글루코오스 값을 상기 설명한 대로 평가하고, 각 마우스의 기초 체중을 평가한다. 화합물을 목덜미에 피하 투약하고, 이때를 0 시간으로 한다(투약량 부피 약 300㎕/50g 마우스). 혈액 글루코오스 값을 48시간까지 추적하고(1, 3, 6, 24 및 48 시간), 마지막 체중을 평가한다.
모든 데이터를 Graphpad Prism에 입력하여, 평균 혈액 글루코오스와 평균 Δ 체중을 계산한다.
본 발명의 한 양태는 주 1회 투여에 적합한 연장된 혈장 반감기를 갖는 GLP-1 유사체/유도체를 제조하는 것이다. 약물역학적 특성이 하기 설명된 대로 미니돼지 또는 가축용 돼지에서 평가될 수 있다.
주 1회 GLP-1 유사체의 약물역학적 스크리닝
적합한 주 1회 후보들의 확인을 위한 GLP-1 유사체들의 약물역학적 스크리닝을, 프로젝트 스크리닝 플랜에 따라 당뇨병 마우스 모델(db/db 마우스)에서 글루코오스 저하 잠재력과 관련하여 충분한 효능을 나타내었고, 그 다음 db/db 마우스 모델에서 48시간 이상의 지속기간을 가졌던 후보들에 대해 수행했다.
1차 스크리닝
8-12kg 중량의 3마리 미니돼지에게 2nmol/kg의 단일 용량을 피하 투여하는 것으로 약물역학적 스크리닝의 첫 부분을 구성하였다. 투약 전, 주사 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96 및 120시간 후에 각 동물로부터 혈액 샘플을 채취했다. EDTA(2-나트륨) 0.18M, Aprotenin 15000 KIE/mL, Val-Pyr 0.30mM로 구성된 pH 7.4로 조정한 특수 안정화 버퍼로 모든 혈액 샘플을 안정화하여 GLP-1 유사체의 효소 분해를 방지했다. 원심분리(4℃, 10분, 1270G(4000rpm))하여 각 안정화된 혈액 샘플로부터 혈장을 수집하고, ELISA 분석에 의해 GLP-1 유사체의 함량을 분석했다. 혈장 분석에는 3가지 상이한 ELISA 분석을 사용했다:
"총 분석" - F1/Ra2135 항체 조합 사용. N-말단 무손상 7-37GLP-1 분자와 N-말단 효소 분해된 9-37GLP-1 분자를 모두 검출. 검출 한계(LOD)는 35pM. 기능적 분 석 범위는 35-30000pM.
"무손상 분석" - F1/Mab26.1 항체 조합 사용. 이 분석은 N-말단 무손상 7-37GLP-1 분자만을 검출한다. LOD는 35pM였고, 기능적 분석 범위는 35-30000pM였다.
"Aib-무손상 분석" - F1/GLP162-3F15 항체 조합 사용. 이 분석은 GLP-1 분자의 Aib 안정화된 N-말단을 검출하며, 이로써 안정화된 GLP-1 유사체의 검출이 가능했다. LOD는 45pM였고, 기능적 분석 범위는 45-30000pM였다.
모든 혈장 농도-시간 프로파일을 비-격벽 분석에 의해 약물역학적으로 분석했다. 데이터가 허용하는 한에서 다음의 약물역학적 매개변수들을 계산했다: tmax, Cmax, AUC, AUC/용량, AUC% 외삽, λZ, t1 /2, CL/F, Vz/F 및 MRT.
2차 스크리닝
약물역학적 스크리닝의 두 번째 부분은 60-70시간 이상의 초기 종점 반감기를 갖는 화합물에 대해 수행했다. 이 스크리닝은 각 투여 경로에 대해 6마리 미니돼지에게 2nmol/kg의 단일 용량을 정맥내 및 피하 투여하는 것으로 구성했다. 각 정맥내 및 피하 투여 후의 혈액 샘플링 일정을 0-120시간에서 0-432시간 그리고 0-504시간까지 확장하였다. 이것은 약물역학적 매개변수 어림값, 특히 종점 반감기, AUC 및 유도된 매개변수 클리어런스 및 분포 부피의 정밀성 및 정확성을 증가시키고, 피하 투여 후의 생체이용률을 추정하기 위한 것이다.
GLP-1 ( AIB8 - 무손상 ) 분석
이 분석은 포착자 및 검출자 항체와 함께 분석물질을 동시에 인큐베이션하는 2-부위 분석이었다. 신호를 최대화할 목적으로 바로 사용할 수 있는 화학발광 기질을 제조했다. 이 분석은 엔도겐 GLP-1(7-37)과 DPPIV 절단 GLP-1(9-37)을 모두 인식하지 않는다.
GLP-1 분석을 위한 기준 혈장
금식시킨 동물로부터의 발린 피롤리디드와 아프로티닌이 없는 EDTA 혈장 풀로부터 O-혈장을 제조했다. EDTA 혈장 풀을 37℃에서 4시간 인큐베이션하여 미량의 GLP-1을 제거하고, 인큐베이션 후에 발린 피롤리디드와 아프로티닌을 첨가했다.
버퍼
코팅 버퍼: 코팅 버퍼로서 PBS를 사용했다: 10mM 인산나트륨 및 145mM 염화나트륨, pH 7.4로 조정.
세척 버퍼: PBS, 0.05%(v/v) Tween 20 함유
분석 버퍼: PBS, 0.05%(v/v) Tween 20, 10g/L BSA 및 10mg/L 항-TNP 함유
스트렙토아비딘 버퍼: 세척 버퍼에 0.5M NaCl을 첨가
기질: 바로 사용할 수 있는 SuperSignal ELISA Femto(Pierce, cat.no.37075) 기질
표준물질
0113-0000-0217의 25μM 스톡 용액으로 표준물질을 제조했다. 펩티드를 기준 혈장 중에 연속적으로 희석하여 30000-10000-3333-1111-370-123-41 및 0pM의 최종 농도로 표준물질을 제조했다. 표준물질을 100㎕ 알리쿼트씩 마이크로닉 튜브에 넣어 -20℃에 보관했다.
분석 과정
Crystal 2000 Microplates(검은색)를 4℃, PBS 중에서 하룻밤 동안 5㎍/mL의 단클론성 항체 GLPb1-7F1를 100㎕를 사용하여 코팅했다. 플레이트를 자동 플레이트 세척장치(SkanWasher, Skatron)에서 세척 버퍼로 5회 세척하고, 30분 이상 방치하여 세척 버퍼로 남은 부위들을 차단했다. 샘플 또는 표준물질을 20㎕씩 각 웰에 중복하여 가하고, 바로 이어서 분석 버퍼 중의 1㎍/mL의 바이오틴화된 GLP162-3F15를 100㎕씩 가했다. 플레이트를 플레이트 쉐이커에서 실온에서 2시간 인큐베이션한 후에 앞서 설명한 대로 5회의 세척 사이클을 수행했다. 스트렙토아비딘-퍼옥시다제 용액(KPL, code 14-30-00, 스트렙토아비딘 버퍼 중에 1:20000)을 100㎕씩 각 웰에 가하고 플레이트 쉐이커에서 실온에서 1시간 인큐베이션했다. 플레이트를 앞서 설명한 대로 세척하고 비운 다음 SuperSignal femto를 100㎕씩 가했다. 플레이트를 1분간 쉐이커에 놓아두고, 이어서 Orion 발광분석기(Berthold)에서 측정했다. 데이터를 MultiCalc로 옮겨서 가중 4PL법을 이용하여 표준 곡선을 계산했다. 표준 곡선으로부터 샘플 농도를 계산했다.
GLP-1 (총) 분석
이 분석은 포착자 및 검출자 항체와 함께 분석물질을 동시에 인큐베이션하는 2-부위 분석이었다. 이 분석은 N-말단 절단 GLP-1을 GLP-1(12-37)까지 인식한다.
버퍼
코팅 버퍼: 코팅 버퍼로서 PBS를 사용했다: 10mM 인산나트륨 및 145mM 염화나트륨, pH 7.4로 조정.
세척 버퍼: PBS, 0.05%(v/v) Tween 20 함유
분석 버퍼: PBS, 0.05%(v/v) Tween 20, 10g/L BSA 및 10mg/L 항-TNP 함유
스트렙토아비딘 버퍼: 세척 버퍼에 0.5M NaCl을 첨가
기질: 바로 사용할 수 있는 TMB(KemEnTec code 4380A) 기질
중단 버퍼: 4M H3PO4
표준물질
0113-0000-0217의 25μM 스톡 용액으로 표준물질을 제조했다. 펩티드를 기준 혈장 중에 연속적으로 희석하여 30000-10000-3333-1111-370-123-41 및 0pM의 최종 농도로 표준물질을 제조했다. 표준물질을 100㎕ 알리쿼트씩 마이크로닉 튜브에 넣어 -20℃에 보관했다.
분석 과정
Maxisorb 마이크로타이터 플레이트(NUNC)를 4℃, PBS 중에서 하룻밤 동안 5㎍/mL의 단클론성 항체 GLPb1-7F1를 100㎕씩 사용하여 코팅했다. 플레이트를 자동 플레이트 세척장치(SkanWasher, Skatron)에서 세척 버퍼로 5회 세척하고, 30분 이상 방치하여 세척 버퍼로 남은 부위들을 차단했다. 샘플 또는 표준물질을 20㎕씩 각 웰에 가하고, 바로 이어서 분석 버퍼 중의 1㎍/mL의 바이오틴화된 Ra2135를 100㎕씩 가했다. 플레이트를 플레이트 쉐이커에서 실온에서 2시간 인큐베이션한 후에 앞서 설명한 대로 5회의 세척 사이클을 수행했다. 스트렙토아비딘-퍼옥시다제 용액(Amersham Bioscinces code RPN4401V, 분석 버퍼 중에 1:8000)을 100㎕씩 각 웰에 가하고 플레이트 쉐이커에서 실온에서 1시간 인큐베이션했다. 플레이트를 앞서 설명한 대로 세척하고 비운 다음 TMB를 100㎕씩 가하고, 5분 후에 100㎕ H3PO4를 사용하여 중단시켰다. Victor Multilabel Reader(Wallac)에서 플레이트를 측정했다. 데이터를 MultiCalc로 옮겨서 가중 4PL법을 이용하여 표준 곡선을 계산했다. 표준 곡선으로부터 샘플 농도를 계산했다.
생존 실험 과정, 혈장 분석 및 약물역학적 분석은 1차 스크리닝에서 설명한 것과 동일했다.
제약 제제:
본 발명의 화합물은 다음과 같이 조제될 수 있다:
실시예 4의 화합물 6.25mg/mL
프로필렌글리콜 14.0mg/mL
페놀 5.5mg/mL
포스페이트 버퍼 pH 8.15
선택적으로 화합물은 조제 전에 PCT/EP2005/055946에 설명된 대로 열 및/또는 염기로 처리된다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> Acylated GLP-1 compounds <130> 7140-204-WO <140> PCT/EP2006/060855 <141> 2006-03-20 <150> EP05102171.5 <151> 2006-03-18 <160> 43 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa in position 1 is L-histidine, imidazopropionyl, alpha-hydroxy-histidine, D-histidine, desamino-histidine, 2-amino-histidine, ?hydroxy-histidine, homohistidine, Nalpha-acetyl-histidine, Nalpha-formyl-histidine, alpha- fluoromethyl-histidine, alpha-methyl-histidine, 3-pyridylalanine, 2-pyridylalanine or 4-pyridylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa in position 2 is Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Thr, Ser, Lys, Aib, (1-aminocyclopropyl) carboxylic acid, (1-aminocyclobutyl) carboxylic acid, (1-aminocyclopentyl) carboxylic acid, (1-aminocyclohexyl) carboxylic acid, (1-aminocycloheptyl)carboxylic acid or (1-aminocyclooctyl)carboxylic acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa in position 10 is Val or Leu; <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa in position 12 is Ser, Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa in position 13 is Tyr or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa in position 14 is Leu or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa in position 16 is Gly, Glu or Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa in position 17 is Gln, Glu, Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa in position 19 is Ala or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa in position 21 is Glu or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa in position 24 is Ala, Glu or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa in position 27 is Val or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa in position 28 is Lys, Glu, Asn or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa in position 29 is Gly or Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa in position 30 is Arg, Gly or Lys, or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa in position 31 is Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, or is absent <400> 2 Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 1 5 10 15 Xaa Ala Xaa Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa in position 1 is L-histidine, D-histidine, desamino-histidine, 2-aminohistidine, ?hydroxy-histidine, homohistidine, Nalpha-acetyl-histidine, alpha-fluoromethyl-histidine, alpha-methyl-histidine, 3-pyridylalanine, 2-pyridylalanine or 4-pyridylalanine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa in position 2 is Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, (1-aminocyclopropyl) carboxylic acid, (1-aminocyclobutyl) carboxylic acid, (1-aminocyclopentyl) carboxylic acid, (1-aminocyclohexyl) carboxylic acid, (1-aminocycloheptyl) carboxylic acid or (1-aminocyclooctyl)carboxylic acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa in position 10 is Val or Leu; <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa in position 12 is Ser, Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa in position 13 is Tyr or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa in position 14 is Leu or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa in position 16 is Gly, Glu or Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa in position 17 is Gln, Glu, Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa in position 19 is Ala or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa in position 21 is Glu or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa in position 24 is Ala, Glu or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa in position 27 is Val or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa in position 28 is Lys, Glu, Asn or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa in position 29 is Gly or Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa in position 30 is Arg, Gly or Lys, or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa in position 31 is Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa in position 32 is is Lys, Ser, amide or is absent <400> 3 Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 1 5 10 15 Xaa Ala Xaa Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <400> 4 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 5 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 5 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 6 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 7 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 8 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 9 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 10 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 10 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 11 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 12 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 13 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 14 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 14 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 15 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 15 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 16 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 16 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 17 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 17 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 18 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 18 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 19 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 19 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 20 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 20 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 21 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 21 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 22 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 22 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 23 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 23 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 24 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <400> 24 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 25 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa in position 1 is 3-(4-imidazolyl)propionyl <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 25 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 26 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <400> 26 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 27 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <400> 27 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 28 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <400> 28 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 29 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <400> 29 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Pro 20 25 30 <210> 30 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <400> 30 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 31 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa in position 1 is N-alpha-formyl-histidine <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 31 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 32 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <400> 32 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 33 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <400> 33 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 34 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <400> 34 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 35 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <400> 35 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 36 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <400> 36 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 37 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <400> 37 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 38 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <220> <221> VARIANT <222> (21)..(21) <223> Xaa is aib <220> <221> VARIANT <222> (24)..(24) <223> Xaa is aib <220> <221> VARIANT <222> (29)..(29) <223> Xaa is aib <400> 38 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Val Arg Xaa Arg Pro 20 25 30 <210> 39 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <400> 39 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 40 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in postion 20 is substituted <400> 40 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 41 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa in position 1 is N-alpha-formyl-histidine <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <400> 41 Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 42 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa in position 1 is HIS or desamino-histidine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa in position 2 is Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa in position 10 is Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa in position 12 is Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa in position 13 is Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa in position 14 is Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa in position 16 is Gly, Glu or Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa in position 17 is Gln or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa in position 19 is Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa in position 21 is Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa in position 24 is Ala or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa in position 27 is Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa in position 28 is Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa in position 29 is Gly or Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa in position 30 is Arg or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa in position 31 is Gly, amide or absent <400> 42 Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 1 5 10 15 Xaa Ala Xaa Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 43 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa in position 1 is HIS <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa in position 2 is Gly or Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa in position 10 is Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa in position 12 is Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa in position 13 is Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa in position 14 is Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa in position 16 is Glu or Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa in position 17 is Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa in position 19 is Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Lys in position 20 is substituted <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Xaa in position 21 is Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa in position 24 is Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> Xaa in position 27 is Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Xaa in position 28 is Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> Xaa in position 29 is Gly or Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa in position 30 is Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa in position 31 is Gly <400> 43 Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 1 5 10 15 Xaa Ala Xaa Lys Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30

Claims (36)

  1. 하기 구조의 화합물.
    Figure 112012006948813-pct00096
    기식에서 아미노산 서열은 SEQ ID No. 6의 아미노산 서열이다.
  2. 하기 구조의 화합물
    Figure 112012070393133-pct00097
    (상기식에서 아미노산 서열은 SEQ ID No. 6의 아미노산 서열이다.)과 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 2형 당뇨병 치료용 제약 조성물.
  3. 하기 구조의 화합물
    Figure 112012070393133-pct00098
    (상기식에서 아미노산 서열은 SEQ ID No. 6의 아미노산 서열이다.)과 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 치료를 필요로 하는 사람을 제외한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 사람을 제외한 대상에서 2형 당뇨병을 치료하는 방법.
  4. 하기 이름
    N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)펩티드의 화합물.
  5. 하기 이름
    N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)펩티드의 화합물과 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 2형 당뇨병 치료용 제약 조성물.
  6. 하기 이름
    N-ε26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-카르복시헵타데카노일아미노)-4(S)-카르복시부티릴아미노]에톡시)에톡시]아세틸아미노)에톡시]에톡시)아세틸][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)펩티드의 화합물과 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 치료를 필요로 하는 사람을 제외한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 사람을 제외한 대상에서 2형 당뇨병을 치료하는 방법.
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