BRPI0607762B1

BRPI0607762B1 - Análogos de glp-1, composição farmacêutica contendo os mesmos e uso de um composto

Info

Publication number: BRPI0607762B1
Application number: BRPI0607762-5A
Authority: BR
Inventors: Jesper Lau; Florencio Zaragoza Dörwald; Henrik Stephensen; Paw Bloch; Kjeld Madsen; Thomas Kruse Hansen
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 2005-03-18
Filing date: 2006-03-20
Publication date: 2019-05-07
Also published as: PL1863839T3; TW200700433A; JP2008533105A; CA2601784A1; IL184051A0; ZA200707261B; CN104017062A; BR122019002626A2; BRPI0607762B8; TWI362392B; RU2007134156A; DE602006015928D1; US8536122B2; EP2322546B1; MX2007011220A; US20120295847A1; JP2010116407A; ES2350051T3; JP5209463B2; JP4585037B2

Abstract

analogo de glp-1, método para aumentar o tempo de ação em um paciente de um analogo de glp-1, composição farmacêutica, e, uso de um composto. compostos glp-1 protraídos e usos terapêutieos destes.

Description

1/75 “ANÁLOGOS DE GLP-1, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO OS MESMOS E USO DE UM COMPOSTO”

CAMPO DA INVENÇÃO [0001] Esta invenção se refere ao campo de peptídeos terapêuticos, isto é, a novos compostos GLP-1 protraídos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [0002] Uma variedade de diferentes abordagens foi usada para modificar a estrutura de compostos de peptídeo tipo glucagon 1 (GLP-1) a fim de fornecer uma duração mais longa de ação in vivo. WO 96/29342 descreve derivados de hormônio de peptídeo caracterizados pelo fato de que o hormônio de peptídeo parental foi modificado pela introdução de um substituinte lipofílico no resíduo de aminoácido C terminal ou no resíduo de aminoácido N terminal.

[0003] WO 98/08871 descreve derivados de GLP-1 caracterizados pelo fato de que pelo menos um resíduo de aminoácido do peptídeo parental tem um substituinte lipofílico acoplado.

[0004] WO 99/43708 descreve derivados de GLP-1 (7-35) e GLP-1 (7-36) que têm um substituinte lipofílico acoplado ao resíduo de aminoácido C terminal.

[0005] WO 00/34331 descreve análogos de GLP-1 acilados.

[0006] WO 00/69911 descreve peptídeos insulinotrópicos ativados para serem injetados em pacientes onde eles são supostos para reagirem com componentes sanguíneos para formar conjugados e com isso supostamente fornecer duração mais longa de ação in vivo.

[0007] WO 02/46227 descreve análogos de GLP-1 e exendina-4 fusionados a albumina no soro humano a fim de estender meia vida in vivo.

[0008] Muitos pacientes de diabete particularmente no segmento de diabete tipo 2 são sujeitos a assim chamada fobia de agulha, isto é um medo substancial de se injetarem. No segmento de diabete tipo 2 a maioria dos pacientes são tratados com agentes hipoglicêmicos orais, e uma vez que compostos GLP-1 são esperados serem o primeiro produto injetável administrado a estes pacientes, o medo de injeções pode se tornar um obstáculo sério para o uso difundido dos compostos

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GLP-1 muito promissores clinicamente. Assim, existe uma necessidade de desenvolver novos compostos GLP-1 que possam ser administrados menos do que uma vez por dia, por exemplo uma vez a cada dois ou três dias preferivelmente uma vez por semana, embora retendo um perfil clínico aceitável.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0009] A invenção fornece um análogo de GLP-1 tendo uma modificação de pelo menos um resíduo de aminoácido proteogênico nas posições 7 e/ou 8 em relação à seqüência GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1), que é acilada com uma porção ao resíduo de lisina na posição 26, e onde dita porção compreende pelo menos dois grupos ácidos, em que um grupo ácido é acoplado terminalmente.

[0010] A presente invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo um composto de acordo com a presente invenção e o uso de compostos de acordo com a presente invenção para preparar medicamentos para tratar doença.

[0011] A invenção fornece um método para aumentar o tempo de ação em um paciente de um análogo de GLP-1, caracterizado por acilar dito análogo de GLP-1 com uma porção B-U' como descrito em qualquer das reivindicações precedentes, no resíduo de lisina na posição 26 de dito análogo de GLP-1.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [0012] No presente relatório, os termos seguintes têm o significado indicado: [0013] O termo polipeptídeo e peptídeo como usado neste lugar significa um composto constituído de pelo menos cinco aminoácidos constituintes conectados por pontes peptídicas. Os aminoácidos constituintes podem ser do grupo dos aminoácidos codificados pelo código genético e eles podem ser aminoácidos naturais que não são codificados pelo código genético, assim como aminoácidos sintéticos. Aminoácidos naturais que não são codificados pelo código genético são por exemplo, Y-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina, D-alanina e D-glutamina. Aminoácidos sintéticos compreendem aminoácidos fabricados por síntese química, isto é D-isômeros dos aminoácidos codificados pelo código genético tal como Dalanina e D-leucina, Aib (α-ácido aminoisobutírico), Abu (α-ácido aminobutírico), Tle

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3/75 (terc-butilglicina), β-alanina, 3-aminometil ácido benzóico, ácido antranílico.

[0014] Os 22 aminoácidos proteogênicos são:

[0015] Alanina, Arginina, Asparagina, Ácido aspártico, Cisteína, Cistina, Glutamina, Ácido glutâmico, Glicina, Histidina, Hidroxiprolina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenilalanina, Prolina, Serina, Treonina, Triptofano, Tirosina, Valina.

[0016] Assim um aminoácido não proteogênico é uma porção que pode ser incorporada a um peptídeo através de ligações peptídicas mas não é um aminoácido proteogênico. Exemplos são y-carboxiglutamato, ornitina, fosfoserina, os Daminoácidos tal como D-alanina e D-glutamina. Aminoácidos não proteogênicos sintéticos compreendem aminoácidos fabricados por síntese química, isto é Disômeros dos aminoácidos codificados pelo código genético tal como D-alanina e Dleucina, Aib (α-ácido aminoisobutírico), Abu (α-ácido aminobutírico), Tle (tercbutilglicina), 3- aminometil ácido benzóico, ácido antranílico, desamino-Histidina, os análogos beta de aminoácidos tal como β-alanina etc. D-histidina, desaminohistidina, 2-amino-histidina, β-hidroxihistidina, homohistidina, Na-acetil-histidina, afluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3 piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4piridilalanina, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1- aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico, ou ácido (1-aminociclooctil) carboxílico;

[0017] O termo análogo como usado neste lugar se referindo a um polipeptídeo significa um peptídeo modificado em que um ou mais resíduos de aminoácidos do peptídeo foram substituídos por outros resíduos de aminoácidos e/ou em que um ou mais resíduos de aminoácidos foram deletados do peptídeo e/ou em que um ou mais resíduos de aminoácidos foram deletados do peptídeo e ou em que um ou mais resíduos de aminoácidos foram adicionados ao peptídeo. Tal adição ou deleção de resíduos de aminoácidos pode ocorrer no N terminal do peptídeo e/ou no C terminal do peptídeo. Um sistema simples é freqüentemente usado para descrever análogos: Por exemplo [Arg1GLP-1(7-37) Lys indica um análogo de GLP-1(7-37) em que a

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4/75 lisina naturalmente ocorrente na posição 34 foi substituída com arginina e em que a lisina foi adicionada ao resíduo de aminoácido terminal, isto é ao Gly37. Todos os aminoácidos para os quais o isômero ótico não é determinado são para serem entendidos para significar o L-isômero. Em formas de realização da invenção um máximo de 17 aminoácidos foram modificados. Em formas de realização da invenção um máximo de 15 aminoácidos foram modificados. Em formas de realização da invenção um máximo de 10 aminoácidos foram modificados. Em formas de realização da invenção um máximo de 8 aminoácidos foram modificados. Em formas de realização da invenção um máximo de 7 aminoácidos foram modificados. Em formas de realização da invenção um máximo de 6 aminoácidos foram modificados. Em formas de realização da invenção um máximo de 5 aminoácidos foram modificados. Em formas de realização da invenção um máximo de 4 aminoácidos foram modificados. Em formas de realização da invenção um máximo de 3 aminoácidos foram modificados. Em formas de realização da invenção um máximo de 2 aminoácidos foram modificados. Em formas de realização da invenção 1 aminoácido foi modificado.

[0018] O termo derivado como usado neste lugar em relação a um peptídeo significa um peptídeo modificado quimicamente ou um análogo deste, em que pelo menos um substituinte não está presente no peptídeo não modificado ou um análogo deste, isto é um peptídeo que foi modificado covalentemente. Modificações típicas são amidas, carboidratos, grupos alquila, grupos acila, ésteres e os semelhantes. Um exemplo de um derivado de GLP-1(7-37) é Νε26-((4δ)-4(hexadecanoilamino)- carboxi-butanoil)[Arg³⁴, Lys26]GLP-1 -(7-37).

[0019] O termo peptídeo GLP-1 como usado neste lugar significa GLP-1(7-37) (SEQ ID No 1), um análogo de GLP-1 (7-37), um derivado de GLP-1 (7-37) ou um derivado de um análogo de GLP-1 (7-37). Em uma forma de realização o peptídeo GLP-1 é um agente insulinotrópicos.

[0020] O termo agente insulinotrópico como usado neste lugar significa um composto que é um agonista do receptor de GLP-1 humano, isto é um composto que estimula a formação de cAMP em um meio adequado contendo o receptor de GLP-1

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5/75 humano (um meio tal descrito abaixo). A potência de um agente insulinotrópico é determinada calculando o valor de EC50 a partir da curva de dose-resposta como descrito abaixo.

[0021] Células de rim de filhote de hamster (BHK) expressando o receptor de GLP-1 humano clonado (BHK- 467-12A) foram crescidas em meios DMEM com a adição de 100 lU/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 5% de soro fetal de bezerro e 0,5 mg/mL de Geneticina G-418 (Life Technologies). As células foram lavadas duas vezes em salina tamponada com fosfato e colhidas com Versene. Membranas de plasma foram preparadas a partir das células por homogeneização com um Ultraturrax em tampão 1 (20 mM de HEPES-Na, 10 mM de EDTA, pH 7,4). O homogenado foi centrifugado a 48,000 x g por 15 min a 4°C. O pélete foi suspenso por homogeneização em tampão 2 (20 mM de HEPES-Na, 0,1 mM de EDTA, pH 7,4), então centrifugado a 48,000 x g por 15 min a 4°C. O procedimento de lavagem foi repetido mais uma vez. O pélete final foi suspenso em tampão 2 e usado imediatamente para ensaios ou armazenado a -80°C.

[0022] O ensaio de receptor funcional foi realizado medindo AMP cíclico (cAMP) como uma resposta à estimulação pelo agente insulinotrópico. cAMP formado foi quantificado pelo Kit AlphaScreenTM cAMP (Perkin Elmer Life Sciences). Incubações foram realizadas em placas de microtítulo de 96 poços de metade da área em um volume total de 50 pL de tampão 3 (50 mM de Tris-HCI, 5 mM de HEPES, 10 mM de MgC12, pH 7,4) e com as seguintes adições: 1 mM de ATP, 1 pM de GTP, 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 0,01 % de Tween-20, 0,1% de BSA, 6 pg de preparação de membrana, 15 pg/mL de microsferas de aceptor, 20pg/mL de microsferas de doador pré-incubados com 6 nM de biotinil-cAMP. Compostos a serem testados para atividade de agonista foram dissolvidos e diluídos em tampão 3. GTP foi preparado recentemente para cada experimento. A placa foi incubada no escuro com agitação lenta por três horas em temperatura ambiente seguido por contagem no instrumento FusionTM (Perkin Elmer Life Sciences). Curvas de concentração-resposta foram plotados para os compostos individuais e valores de EC50 estimados usando um modelo logístico de quatro parâmetros com

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Prism v. 4.0 (GraphPad, Carlsbad, CA).

[0023] O termo protegido por DPP-IV como usado neste lugar se referindo a um polipeptídeo significa um polipeptídeo que foi modificado quimicamente a fim de tornar dito composto resistente à peptidase dipeptidil aminopeptidase-4 (DPP-IV) de plasma. A enzima DPP-IV em plasma é conhecida por ser envolvida na degradação de diversos hormônios de peptídeo, por exemplo GLP-1, GLP-2, Exendina-4 etc. Assim, um esforço considerável está sendo feito para desenvolver análogos e derivados dos polipeptídeos suscetíveis à hidrólise mediada por DPP-IV a fim de reduzir a taxa de degradação por DPP-IV. Em uma forma de realização um peptídeo protegido por DPP-IV é mais resistente a DPP-IV do que GLP-1 (7-37) ou Exendina4(1-39).

[0024] Resistência de um peptídeo a degradação por dipeptidil aminopeptidase IV é determinada pelo seguinte ensaio de degradação:

[0025] Alíquotas do peptídeo (5 nmol) são incubadas a 37 9C com 1 pL de dipeptidil aminopeptidase IV purificada correspondendo a uma atividade enzimática de 5 mil por 10-180 minutos em 100 pL de 0,1 M de tampão trietilamina-HCI, pH 7,4. Reações enzimáticas são finalizadas pela adição de 5 pL de 10% de ácido trifluoracético, e os produtos de degradação de peptídeo são separados e quantificados usando análise HPLC. Um método para realizar esta análise é: As misturas são aplicadas em uma coluna Vydac C18 widepore (poros de 30 nm, partículas de 5 pm) de 250 x 4,6 mm e eluídas em uma vazão de 1 ml/min com gradientes em etapas lineares de acetonitrila em 0,1% de ácido trifluoracético (0% de acetonitrila por 3 min, 0-24% de acetonitrila por 17 min, 24-48% de acetonitrila por 1 min) de acordo com Siegel et ai., Regul. Pept. 1999;79:93-102 e Mentlein et ai. Eur. J. Biochem. 1993;214:829-35. Peptídeos e seus produtos de degradação podem ser monitorados por sua absorbância a 220 nm (ligações peptídicas) ou 280 nm (aminoácidos aromáticos), e são quantificados por integração de suas áreas de pico em relação àquelas de padrões. A taxa de hidrólise de um peptídeo por dipeptidil aminopeptidase IV é estimada em tempos de incubação que resultam em menos do que 10% do peptídeo sendo hidrolisado.

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7/75 [0026] O termo alquil C1-6 como usado neste lugar significa um grupo de hidrocarbono saturado, ramificado, linear ou cíclico tendo de 1 a 6 átomos de carbono. Exemplos representativos incluem, mas não são limitados a, metil, etil, npropil, isopropil, butil, isobutil, sec-butil, terc-butil, n-pentil, isopentil, neopentil, tercpentil, n-hexil, isohexil, ciclohexano e os semelhantes. O termo farmaceuticamente aceitável como usado neste lugar significa adequado para aplicações farmacêuticas normais, isto é não gerando nenhum evento adverso em pacientes etc.

[0027] O termo excipiente como usado neste lugar significa os compostos químicos que são normalmente adicionados a composições farmacêuticas, por exemplo tampões, agentes de tonicidade, conservantes e os semelhantes.

[0028] O termo quantidade eficaz como usado neste lugar significa uma dosagem que é suficiente para ser eficaz para o tratamento do paciente comparado com nenhum tratamento.

[0029] O termo composição farmacêutica como usado neste lugar significa um produto compreendendo um composto ativo ou um sal deste junto com excipientes farmacêuticos tal como tampão, conservante, e opcionalmente um modificador de tonicidade e/ou um estabilizante. Assim a composição farmacêutica também é conhecida na técnica como uma formulação farmacêutica.

[0030] O termo tratamento de uma doença como usado neste lugar significa a supervisão e cuidado de um paciente tendo desenvolvido a doença, condição ou distúrbio. O propósito de tratamento é combater a doença, condição ou distúrbio. Tratamento inclui a administração dos compostos ativos para eliminar ou controlar a doença, condição ou distúrbio assim como para aliviar os sintomas ou complicações associadas com a doença, condição ou distúrbio.

[0031] Em outro aspecto a presente invenção se refere a um análogo de GLP-1 acilado que pode se ligar à albumina e ao receptor de GLP-1 simultaneamente.

[0032] Em outro aspecto a presente invenção se refere a um análogo de GLP-1 acilado que se liga ao receptor de GLP-1 com uma afinidade abaixo de 100nM, preferível abaixo de 30 nM na presença de 2% de albumina.

[0033] Em outro aspecto a presente invenção se refere a um análogo de GLP-1

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8/75 acilado cuja afinidade para o receptor de GLP-1 é apenas parcialmente diminuída quando comparando a afinidade na presença de concentração muito baixa (por exemplo 0,005% a 0,2%) de albumina humana com a afinidade na presença de 2% de albumina humana. A mudança em afinidade de ligação sob estas condições é menos do que 50 vezes, preferível abaixo de 30 vezes e mais preferível abaixo de vezes.

[0034] O termo porção de ligação de albumina como usado neste lugar significa um resíduo que se liga não covalentemente a albumina no soro humano. O resíduo de ligação de albumina acoplado ao polipeptídeo terapêutico tipicamente tem uma afinidade abaixo de 10 pM para albumina no soro humano e preferivelmente abaixo de 1 pM. Uma variedade de resíduos de ligação de albumina são conhecidos entre porções lipofílicas lineares e ramificadas contendo 4-40 átomos de carbono tendo um grupo ácido distai.

[0035] O termo ligante hidrofílico como usado neste lugar significa um espaçador que separa um peptídeo e um resíduo de ligação de albumina com uma porção química que compreende pelo menos 5 átomos de não hidrogênio onde 3050% destes são ou N ou 0.

[0036] O termo grupos ácidos como usado neste lugar significa grupos químicos orgânicos que são completamente ou parcialmente carregados negativamente em pH fisiológico. O valor de pKa de tais grupos é abaixo de 7, preferível abaixo de 5. Isto inclui mas não é limitado a ácidos carboxílicos, ácidos sulfônicos, ácidos fosfóricos ou sistemas de anel heterocíclico que são completamente ou parcialmente carregados negativamente em pH fisiológico.

[0037] Na formula estrutural abaixo II a porção U é um di-radical que pode ser acoplado aos grupos B terminais e ao aminogrupo do aminoácido lisina no peptídeo de duas diferentes maneiras. Em formas de realização da invenção o U em fórmula é acoplado com o grupo B acoplado na extremidade da cadeia alquila e o peptídeo na outra extremidade.

[0038] Nas fórmulas abaixo as ligações terminais dos grupos acoplados são para serem consideradas como ligações de acoplamento e não terminando em grupos de

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9/75 metileno a menos que determinado.

[0039] Nas fórmulas abaixo ^H í?

^nh2—H—— significa o H2N-His-Aib- N terminal do análogo de GLP-1.

[0040] Em uma forma de realização a invenção fornece um análogo de GLP-1 acilado com uma porção lipofílica de ligação de albumina contendo pelo menos dois grupos químicos ácidos livres acoplados através de um ligante de aminoácido não natural ao resíduo de lisina na posição 26.

[0041] Em uma forma de realização, o termo grupos químicos ácidos livres é para ser entendido como tendo o mesmo significado que grupos ácidos como usado neste lugar.

[0042] Em uma forma de realização a invenção fornece um análogo de GLP-1 acilado onde dito análogo de GLP-1 é estabilizado contra DPP-IV por modificação de pelo menos um resíduo de aminoácido nas posições 7 e 8 em relação à seqüência GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1), e onde dita acilação é um diácido acoplado ao resíduo de lisina na posição 26 opcionalmente através de um ligante hidrofílico de aminoácido não natural.

[0043] Em uma forma de realização da invenção um análogo de GLP-1 tendo uma modificação de pelo menos um resíduo de aminoácido não proteogênico nas posições 7 e/ou 8 em relação à seqüência GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1), que é acilado com uma porção ao resíduo de lisina na posição 26, e onde dita porção compreende pelo menos dois grupos ácidos, em que um grupo ácido é acoplado terminalmente.

[0044] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com a forma de realização acima, em que a porção acoplada na posição 26 compreende um ligante hidrofílico.

[0045] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com as formas de realização acima, em que o ligante hidrofílico compreende pelo menos 5 átomos de não hidrogênio onde 30-50% destes são ou N ou O.

[0046] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com

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10/75 qualquer das formas de realização acima, em que a porção acoplada na posição 26 compreende uma porção de ligação de albumina separada do peptídeo pelo ligante hidrofílico.

[0047] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com a forma de realização acima, em que a porção de ligação de albumina é uma porção lipofílica linear ou ramificada contendo 4-40 átomos de carbono tendo um grupo ácido distai.

[0048] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com qualquer das formas de realização acima, em que a porção acilada é B-U', onde U' é

o

COOH OH O

J J

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m é Ο, 1,2, 3, 4, 5, ou 6, n é 1,2 ou 3 s é 0, 1,2, ou 3, t é 0, 1,2, 3, ou 4 p é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21,22, ou 23;

e onde B é um grupo ácido selecionado a partir de

e onde I é 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20.

[0049] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com qualquer das formas de realização acima, que é um composto de fórmula I (SEQ ID No. 2):

Xaa₇-Xaa₈-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa₁₆-Ser-Xaa₁₈-Xaa_ig-Xaa₂₀-Glu-Xaa₂₂o

Xaa₂₃-Ala-Xaa₂₅——Xaa₂₇-Phe-lle-Xaa_8[l-Trp-Leu-Xaa₈₈-Xaa₈₄-Xaa₈₅-Xaa₈₆-Xaa₈₇

B-----U'----NH

Fórmula I em que

Xaa7, é L-histidina, imidazopropionil, α-hidroxi-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2 amino-histidina, β-hidroxi-histidina, homohistidina, Na-acetilhistidina, Na-formil-histidina, a-fluorometil-histidina, α-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4- piridilalanina

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Xaae é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Thr, Ser, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1- aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico, ou ácido (1-aminociclooctil) carboxílico;

Xaaw é Vai ou Leu;

Xaaw é Ser, Lys ou Arg;

Xaaw é Tyr ou Gin;

Xaa2o é Leu ou Met;

Xaa22 é Gly, Glu ou Aib;

Xaa23 é Gin, Glu, Lys ou Arg;

Xaa25 é Ala ou Vai;

Xaa27 é Glu ou Leu;

Xaa3o é Ala, Glu ou Arg;

Xaa33 é Vai ou Lys;

Xaa34 é Lys, Glu, Asn ou Arg;

Xaa35 é Gly ou Aib;

Xaa36 é Arg, Gly ou Lys, ou é ausente;

Xaa37 é Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, ou é ausente;

e B e U' juntos é a porção acilada, onde U' é selecionado a partir de

O

HO

O

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n é 1,2 ou 3 s é 0, 1,2, ou 3, t é 0, 1,2, 3, ou 4 p é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21,22, ou 23;

e onde B é um grupo ácido selecionado a partir de

onde I é 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20.

[0050] Em uma forma de realização a invenção fornece um composto que é um composto de fórmula II (SEQ ID No. 3):

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Xaa₂₃-Ala-Xaa₂₅--N_xJJ—-Xaa₂₇-Phe-lle-Xaa_8CI-Trp-Leu-Xaa₈₈-Xaa₈₄-Xaa₈₅-Xaa₈₆-Xaa₈₇-Xaa₈₈ [0051] Fórmula II [0052] A fórmula II é idêntica à fórmula I como determinado em uma forma de realização acima, onde a porção B-U é substituída por B-U'. diferença sendo apenas a incorporação do grupo carboxi no U' em relação a U, que está sem o grupo carboxi de acoplamento.

[0053] Em fórmula II cada um dos Xaa's tem o seguinte significado:

[0054] Xaa7, é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, βhidroxi-histidina, homohistidina, Na-acetil-histidina, α-fluorometil-histidina, a-metilhistidina, 3 piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina;

[0055] Xaae é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1- aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico, ou ácido (1-aminociclooctil) carboxílico;

Xaaw é Vai ou Leu;

Xaaw é Ser, Lys ou Arg;

Xaaw é Tyr ou Gin;

Xaa2o é Leu ou Met;

Xaa22 é Gly, Glu ou Aib;

Xaa23 é Gin, Glu, Lys ou Arg;

Xaa25 é Ala ou Vai;

Xaa27 é Glu ou Leu;

Xaa3o é Ala, Glu ou Arg;

Xaa33 é Vai ou Lys;

Xaa34 é Lys, Glu, Asn ou Arg;

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15/75

Xaa35 é Gly ou Aib;

Xaa36 é Arg, Gly ou Lys, ou é ausente;

Xaa37 é Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, ou é ausente;

Xaa38 é Lys, Ser, amida ou é ausente;

e onde U é um espaçador selecionado a partir de

o onde né 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18

I é 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18, m é 0, 1,2, 3, 4, 5, ou 6, s é 0, 1,2, ou 3, p é 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, ou

23;

e onde B é um grupo ácido selecionado a partir de

H

[0056] Nas formas de realização abaixo quando se referindo a U' em fórmula I é para ser entendido como também se referindo a fórmula II e U, com a única diferença sendo o grupo carboxi.

[0057] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com as formas de realização acima, em que U' é selecionado a partir de

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16/75

J ο COOH Η

COOH

J m é 2, 3, 4 ou 5,

COOH

J n é 1 ou 2 s é 0, 1, ou 2, t é 0, 1,2, ou 3 pé 1,2, 3, 4, 7, 11 ou 23.

[0058] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com as formas de realização acima, em que BU'- é

Petição 870190013350, de 08/02/2019, pág. 22/88

17/75

onde lé 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20; pé 1,2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.

s é 0, 1 ou 2 t é 0 ou 1.

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18/75 [0059] Uma forma de realização de acordo com a acima em que onde I é 14, 15, 16, 17 ou 18 p é 1,2, 3, 4 ou 11;

s é 0, 1 ou 2;

t é 0 ou 1.

[0060] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com a forma de realização acima, em que B-U' é

onde lé 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20;

p é 1,2, 3, ou 4.

s é 0, 1 ou 2

Petição 870190013350, de 08/02/2019, pág. 24/88

19/75 n é 0, 1 ou 2.

[0061] Uma forma de realização de realização acima em que B é acordo com qualquer das formas de

HO

e I é 14,16, 18 ou 20.

[0062] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 qualquer das formas de realização acima, em que B é de acordo com

HO

de de de

GLP-1

GLP-1 de de de acordo acordo acordo com com com onde I é 14, 15, ou 16.

[0063] Uma forma de realização fornece um análogo qualquer das formas de realização acima, em que s é 1.

[0064] Uma forma de realização fornece um análogo qualquer das formas de realização acima, em que n é 1.

[0065] Uma forma de realização fornece um análogo qualquer das formas de realização acima, em que I é 14, 15 ou 16; Em formas de realização I é 17, 18, 19 ou 20. Em formas de realização I é 15, 16 ou 17. Em formas de realização I é 18, 19 ou 20. Em formas de realização I é 14. Em formas de realização I é 16. Em formas de realização I é 18. Em formas de realização I é 20. [0066] Uma forma de realização fornece um análogo qualquer das formas de realização acima, em que p é 1.

[0067] Uma forma de realização fornece um análogo qualquer das formas de realização acima, em que p é 2.

[0068] Uma forma de realização fornece um análogo qualquer das formas de realização acima, em que p é 3.

[0069] Uma forma de realização fornece um análogo de de de de

GLP-1

GLP-1 de de de de acordo acordo acordo acordo com com com com

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20/75 qualquer das formas de realização acima, em que p é 4.

[0070] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com qualquer das formas de realização acima, em que B-U' é

[0071] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com qualquer das formas de realização acima, em que B-U' é

O°Y^OH h ⁰

Η o

N H

[0072] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com qualquer das formas de realização acima, em que B-U' é

[0073] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com fórmula I acima, em que

Xaa7, é His ou desamino-histidina;

Xaae é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Lys ou Aib;

Xaaw é Vai;

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21/75

Xaaw é Ser;

Xaaw é Tyr;

Xaa2o é Leu;

Xaa22 é Gly, Glu ou Aib;

Xaa23 é Gin ou Glu;

Xaa25 é Ala; Xaa27 é Glu;

Xaa3o é Ala ou Glu;

Xaa33 é Vai;

Xaa34 é Lys ou Arg;

Xaa35 é Gly ou Aib;

Xaa36 é Arg ou Lys

Xaa37 é Gly, amida ou é ausente.

[0074] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com fórmula I acima, em que

Xaa7, é His

Xaae é Gly, ou Aib;

Xaaw é Vai;

Xaaw é Ser;

Xaaw é Tyr;

Xaa2o é Leu;

Xaa22 é Glu ou Aib;

Xaa23 é Gin;

Xaa25 é Ala; Xaa27 é Glu;

Xaa3o é Ala;

Xaa33 é Vai;

Xaa34 é Lys ou Arg;

Xaa35 é Gly ou Aib;

Xaa36 é Arg

Xaa37 é Gly.

[0075] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com

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22/75 qualquer uma das formas de realização acima, em que dito análogo de GLP-1 compreende uma modificação da L-histidina N terminal na posição 7 da seqüência de GLP-1 (7-37).

[0076] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com a forma de realização acima, em que dito análogo de GLP-1 compreende imidazopropionil⁷, α-hidroxi-histidina⁷ ou N-metil-histidina⁷, Dhistidina⁷, desaminohistidina⁷, 2-amino-histidina⁷, β-hidroxi-histidina⁷, homohistidina⁷, N-acetil-histidina⁷, a-fluorometil-histidina⁷, α-metil-histidina⁷, 3-piridilalanina⁷, 2- piridilalanina⁷ ou 4piridilalanina⁷.

[0077] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que dito análogo de GLP-1 compreende uma substituição da L-alanina na posição 8 da seqüência de GLP-1 (737) por outro resíduo de aminoácido.

[0078] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com a forma de realização acima, em que dito análogo de GLP-1 compreende Aib⁸, Gly⁸, Vai⁸, lie⁸, Leu⁸, Ser⁸, Thr⁸, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico, ou ácido (1aminociclooctil) carboxílico.

[0079] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com qualquer forma de realização acima, em que dito análogo de GLP-1 compreende Aib⁸.

[0080] Em uma forma de realização da invenção dito análogo de GLP-1 é Aib⁸,Arg³⁴-GLP-1 (7-37) ou Aib⁸'22,Arg³⁴-G LP-1 (7-37).

[0081] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com qualquer das formas de realização acima, em que dito análogo de GLP-1 compreende não mais do que quinze resíduos de aminoácidos que foram trocados, adicionados ou deletados se comparado com GLP-1 (7-37) (SEQ ID No. 1).

[0082] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com a forma de realização acima, em que não mais do que dez resíduos de aminoácidos

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23/75 que foram trocados, adicionados ou deletados se comparado com GLP-1 (7-37) (SEQ ID No. 1).

[0083] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com a forma de realização acima, em que dito análogo de GLP-1 compreende não mais do que seis resíduos de aminoácidos que foram trocados, adicionados ou deletados se comparado com GLP-1 (7-37) (SEQ ID No. 1).

[0084] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com qualquer das formas de realização acima, em que dito análogo de GLP-1 compreende não mais do que 3 resíduos de aminoácidos que não são codificados pelo código genético.

[0085] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com qualquer das formas de realização acima, em que dito análogo de GLP-1 compreende apenas um resíduo de lisina.

[0086] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com qualquer das formas de realização acima, que é

Aib⁸, Arg³⁴-GLP-1(7-37)

Aib⁸·²², Arg³⁴-GLP-1(7-37)

Arg³⁴-GLP-1(7-37) [3-(4-lmidazolil)Propionil7,Arg³⁴]G LP-1 -(7-37)peptídeo Gly⁸,Arg³⁴-G LP-1 (7-37)

Aib⁸,Arg³⁴, Pro³⁷-GLP-1 (7-37) _Aib8,22,27,30,35_Arg34₅ p_ro37_ GLP-1 (7-37)amida, todos os quais são substituídos por B-U' na posição 26.

[0087] Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 de acordo com qualquer uma das formas de realização precedentes, que é selecionado a partir de

O

W L V R G R G—·:ooh

N-e²⁶-(17-carboxiheptadecanoil)-[Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1 -(7-37)-peptídeo,

Petição 870190013350, de 08/02/2019, pág. 29/88

24/75

Ο

N-e²⁶-(19-carboxinonadecanoil)-[Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1 -(7-37)-peptídeo,

Η O nh₂-HAEGTFTSDVSSYLEG3AA--N —EF IAALVRG R GH O __ hÍOT----⁰ o^aoh ^OH

O

N-ε²⁶- (4-{[N-(2-carboxietil)-N-(15-carboxipentadecanoil) amino]metil} benzoil)[Arg³⁴p LP-1 -(7-37),

G-----COOH

N-e²⁶42-(242-(242-(244-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil] [Aib⁸,Arg³⁴] GLP-1 -(7

37)peptídeo,

Η Ο Η θ

I-Η-Ν^Λε GTFTSDVSSY LEGQA Α-Ν^ΛΕ FIAWLVRGR G--COOH

H ⁰

- H G EGTFTSDVSSY L EGQ A Α-Ν/._{Ε F},_{AWL VRG} R G--

Η Ο η O

Y-HN^ÃE GTFTSDVSSY LEGQA A-N^E FIAWLVRGR G--

Η O

L—H G EGTFTSDVSSY LEGQA AN^Ãe FIAWLVRGR G--

H ?

H G EGTFTSDVSSY LEGQA A-N^E FIAWLVRGR G--

Petição 870190013350, de 08/02/2019, pág. 30/88

25/75

Ο ηο^λ ο

hcA ο

ηο^λ

Ο ηο^λ

Η Ο

Ν^Α-Ε FIAWLVRG R

Q-----COOH

Η

Ο ό ’Ο

Η ν^Ν· ο

Η

Υ^Ν ο

Q-----COOH

EF I AWLVRG

G--COOH ^HOr ο

^ΗΟν ο

Petição 870190013350, de 08/02/2019, pág. 31/88

26/75

^H0V ο

[0088] Uma forma de realização fornece um método para aumentar o tempo de ação em um paciente de um análogo de GLP-1, caracterizado por acilar dito análogo de GLP-1 com uma porção B-U como descrito em qualquer das formas de realização precedentes, no resíduo de lisina na posição 26 de dito análogo de GLP-1.

[0089] Uma forma de realização fornece um método para aumentar o tempo de ação em um paciente de um análogo de GLP-1 para mais do que cerca de 40 horas, caracterizado por modificar pelo menos um dos resíduos de aminoácidos nas posições 7 e 8 de um peptídeo GLP-1 (7-37) ou um análogo deste, e acilar dito análogo de GLP-1 com uma porção B-U'- como descrito em qualquer das formas de realização precedentes no resíduo de lisina na posição 26 de dito análogo de GLP-1. [0090] Uma forma de realização fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer das formas de realização acima, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0091] Uma forma de realização fornece uma composição farmacêutica de acordo com a forma de realização acima, que é adequada para administração parenteral.

[0092] Uma forma de realização fornece o uso de um composto de acordo com qualquer uma das formas de realização acima para a preparação de um medicamento.

[0093] Uma forma de realização fornece o uso de um composto de acordo com qualquer uma das formas de realização acima para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de hiperglicemia, diabete tipo 2,

Petição 870190013350, de 08/02/2019, pág. 32/88

27/75 tolerância à glicose prejudicada, diabete tipo 1, obesidade, hipertensão, síndrome X, dislipidemia, distúrbios cognitivos, arteriosclerose, infarto do miocárdio, doença coronária cardíaca e outros distúrbios cardiovasculares, derrame, síndrome de intestino inflamatório, dispepsia e úlceras gástricas.

[0094] Uma forma de realização fornece o uso de um composto de acordo com qualquer uma das formas de realização acima para a preparação de um medicamento para atrasar ou prevenir progressão de doença em diabete tipo 2.

[0095] Uma forma de realização fornece o uso de um composto de acordo com qualquer uma das formas de realização acima para a preparação de um medicamento para diminuir consumo de comida, diminuir apoptose de célula β, aumentar função de célula β e massa de célula β, e/ou para restaurar sensibilidade para glicose para células β.

[0096] Em uma forma de realização a invenção fornece um composto de acordo com as formas de realização acima, em que dito análogo de GLP-1 é Aib⁸,Arg³⁴GLP-1(7-37) ou Aib⁸'22,Arg³⁴-GLP-1(7-37) acoplado a um ligante B-U';

[0097] Em uma forma de realização de fórmula II, B-U representa

onde I é 14, 15 ou 16; 20 né 15, 16, 17 ou 18;

p é 3, 7, 11 ou 24.

[0098] Em formas de realização a invenção fornece um composto de acordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que dito diácido compreende um ácido dicarboxílico.

Petição 870190013350, de 08/02/2019, pág. 33/88

28/75 [0099] Em formas de realização a invenção fornece um composto de acordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que o grupo de acilação compreende um α,ω-ácido dicarboxílico de alcano de cadeia linear ou ramificado.

[00100] Em formas de realização a invenção fornece composto de acordo com a forma de realização acima, em que o grupo de acilação compreende a estrutura HOOC-(CH2),CO-, em que n é 12 a 20.

[00101] Em formas de realização a invenção fornece um composto de acordo com a forma de realização acima, em que o grupo de acilação compreende uma estrutura selecionada a partir de HOOC-(CH2)14CO-, HOOC(CH2)1500-, HOOC-(CH2)1600-, HOOC-(CH2)1700-, e HOOC-(CH2)18CO-, [00102] Em formas de realização a invenção fornece um composto de acordo com a forma de realização acima, em que o grupo de acilação compreende a estrutura HOOC-(CH2)16CO[00103] Outro objeto da presente invenção é fornecer uma formulação farmacêutica compreendendo um composto de acordo com a presente invenção que está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 25 mg/ml, e em que dita formulação tem um pH de 3,0 a 9,0. A formulação pode compreender adicionalmente um sistema tampão, conservante(s), agente(s) de tonicidade, agente(s) quelante(s), estabilizantes e tensoativos. Em uma forma de realização da invenção a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa, isto é formulação compreendendo água. Tal formulação é tipicamente uma solução ou uma suspensão. Em uma forma de realização adicional da invenção a formulação farmacêutica é uma solução aquosa. O termo formulação aquosa é definido como uma formulação compreendendo pelo menos 50 %w/w de água. Da mesma maneira, o termo solução aquosa é definido como uma solução compreendendo pelo menos 50 %w/w de água, e o termo suspensão aquosa é definido como uma suspensão compreendendo pelo menos 50 %w/w de água.

[00104] Em outra forma de realização a formulação farmacêutica é uma formulação liofilizada, a qual o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes de uso.

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29/75 [00105] Em outra forma de realização a formulação farmacêutica é uma formulação seca (por exemplo liofilizada ou pulverizada em atmosfera aquecida) pronta para uso sem qualquer dissolução anterior.

[00106] Em um aspecto adicional a invenção se refere a uma formulação farmacêutica compreendendo uma solução aquosa de um composto de acordo com a presente invenção, e um tampão, em que dito composto está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml ou acima, e em que dita formulação tem um pH de cerca de 3,0 a cerca de 9,0.

[00107] Em outra forma de realização da invenção o pH da formulação é de cerca de 7,0 a cerca de 9,5. Em outra forma de realização da invenção o pH da formulação é de cerca de 3,0 a cerca de 7,0. Em outra forma de realização da invenção o pH da formulação é de cerca de 5,0 a cerca de 7,5. Em outra forma de realização da invenção o pH da formulação é de cerca de 7,5 a cerca de 9,0. Em outra forma de realização da invenção o pH da formulação é de cerca de 7,5 a cerca de 8,5. Em outra forma de realização da invenção o pH da formulação é de cerca de 6,0 a cerca de 7,5. Em outra forma de realização da invenção o pH da formulação é de cerca de 6,0 a cerca de 7,0. Em outra forma de realização a formulação farmacêutica é de 8,0 a 8,5.

[00108] Em uma forma de realização adicional da invenção o tampão é selecionado a partir do grupo consistindo de acetato de sódio, carbonato de sódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, fosfato dihidrogênio de sódio, fosfato dihidrogênio dissódico, fosfato de sódio, e tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou misturas destes. Cada um destes tampões específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção.

[00109] Em uma forma de realização adicional da invenção a formulação compreende adicionalmente um conservante farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização adicional da invenção o conservante é selecionado a partir do grupo consistindo de fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, metil p-hidroxibenzoato, propil p-hidroxibenzoato, 2-fenoxietanol, butil p-hidroxibenzoato, 2-feniletanol, benzil

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30/75 álcool, clorobutanol, e tiomerosal, bronopol, ácido benzóico, imiduréia, clorohexidina, dehidroacetato de sódio, clorocresol, etil p-hidroxibenzoato, cloreto de benzetônio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-1,2-diol) ou misturas destes. Em uma forma de realização o conservante é fenol ou m-cresol. Em uma forma de realização adicional da invenção o conservante está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. Em uma forma de realização adicional da invenção o conservante está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. Em uma forma de realização adicional da invenção o conservante está presente em uma concentração de 5 mg/ml a 10 mg/ml. Em uma forma de realização adicional da invenção o conservante está presente em uma concentração de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada um destes conservantes específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção. O uso de um conservante em composições farmacêuticas é bem conhecido para a pessoa versada. Para conveniência é feita referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

[00110] Em uma forma de realização adicional da invenção a formulação compreende adicionalmente um agente isotônico. Em uma forma de realização adicional da invenção o agente isotônico é selecionado a partir do grupo consistindo de um sal (por exemplo cloreto de sódio), um açúcar ou álcool de açúcar, um aminoácido (por exemplo L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina), um alditol (por exemplo glicerol (glicerina), 1,2propanodiol (propilenoglicol), 1,3-propanodiol, 1,3- butanodiol) polietilenoglicol (por exemplo PEG400), ou misturas destes. Em uma forma de realização o agente de isotonicidade é propilenoglicol. Qualquer açúcar tal como mono-, di-, ou polissacarídeos, ou glucanas solúveis em água, incluindo por exemplo frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sucrose, trealose, dextrana, pululana, dextrina, ciclodextrina, amido solúvel, amido de hidroxietil e carboximetilcelulose-Na pode ser usado. Em uma forma de realização o aditivo de açúcar é sucrose. Álcool de açúcar é definido como um hidrocarboneto de C4-C8 tendo pelo menos um grupo -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol, e arabitol. Em uma forma de realização o aditivo de álcool

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31/75 de açúcar é manitol. Os açúcares ou álcoois de açúcar mencionados acima podem ser usados individualmente ou em combinação. Não existe limite para a quantidade usada, contanto que o açúcar ou álcool de açúcar seja solúvel na preparação líquida e não afete adversamente os efeitos estabilizantes atingidos usando os métodos da invenção. Em uma forma de realização, a concentração de açúcar ou álcool de açúcar é entre cerca de 1 mg/ml e cerca de 150 mg/ml. Em uma forma de realização adicional da invenção o agente isotônico está presente em uma concentração de 1 mg/ml a 50 mg/ml. Em uma forma de realização adicional da invenção o agente isotônico está presente em uma concentração de 1 mg/ml a 7 mg/ml. Em uma forma de realização da invenção o agente isotônico está presente em uma concentração de 5 mg/ml a 7 mg/ml. Em uma forma de realização adicional da invenção o agente isotônico está presente em uma concentração de 8 mg/ml a 24 mg/ml. Em uma forma de realização adicional da invenção o agente isotônico está presente em uma concentração de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada um destes agentes isotônicos específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção. O uso de um agente isotônico em composições farmacêuticas é bem conhecido para a pessoa versada. Para conveniência é feita referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

[00111] Em uma forma de realização adicional da invenção a formulação compreende adicionalmente um agente quelante. Em uma forma de realização adicional da invenção o agente quelante é selecionado a partir de sais de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido cítrico, e ácido aspártico, e misturas destes. Em uma forma de realização adicional da invenção o agente quelante está presente em uma concentração de 0,1mg/m1 a 5mg/ml. Em uma forma de realização adicional da invenção o agente quelante está presente em uma concentração de 0,1mg/m1 a 2mg/ml. Em uma forma de realização adicional da invenção o agente quelante está presente em uma concentração de 2mg/ml a 5mg/ml. Cada um destes agentes quelantes específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção. O uso de um agente quelante em composições farmacêuticas é bem conhecido para a pessoa versada. Para conveniência é feita referência a Remington:

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32/75

The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

[00112] Em uma forma de realização adicional da invenção a formulação compreende adicionalmente um estabilizante. O uso de um estabilizante em composições farmacêuticas é bem conhecido para a pessoa versada. Para conveniência é feita referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

[00113] Mais particularmente, composições da invenção são composições farmacêuticas líquidas estabilizadas cujos componentes terapeuticamente ativos incluem um polipeptídeo que possivelmente exibe formação agregada durante armazenamento em formulações farmacêuticas líquidas. Por formação agregada é pretendida uma interação física entre as moléculas de polipeptídeos que resulta em formação de oligômeros, que podem permanecer solúveis, ou agregados visíveis grandes que precipitam da solução. Por durante armazenamento é pretendida uma composição farmacêutica líquida ou formulação que uma vez preparada, não é imediatamente administrada ao sujeito. Preferivelmente, seguindo preparação, ela é embalada para armazenamento, ou em uma forma líquida, em um estado congelado, ou em uma forma seca para reconstituição posterior em uma forma líquida ou outra forma adequada para administração a um sujeito. Por forma seca é pretendida a composição ou formulação farmacêutica líquida é seca ou por liofilização (isto é, liofilização; veja, por exemplo, Williams and Polli (1984) J. Parenteral Sei. Technol. 38:48-59), peletização em atmosfera aquecida (veja Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491676; Broadhead et al. (1992) Drug Devei. Ind. Pharm. 18:1169-1206; e Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20), ou arde secagem (Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; e Roser (1991) Biopharm. 4:47-53). Formação agregada por um polipeptídeo durante armazenamento de uma composição farmacêutica líquida pode afetar adversamente atividade biológica daquele polipeptídeo, resultando em perda de eficácia terapêutica da composição farmacêutica. Além disso, formação agregada pode causar outros problemas tal como bloqueio de sondas, membranas, ou bombas

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33/75 quando a composição farmacêutica contendo polipeptídeo é administrada usando um sistema de infusão.

[00114] As composições farmacêuticas da invenção podem compreender adicionalmente uma quantidade de uma base de aminoácido suficiente para diminuir formação agregada pelo polipeptídeo durante armazenamento da composição. Por base de aminoácido é pretendido um aminoácido ou uma combinação de aminoácidos, onde qualquer aminoácido dado está presente ou em sua forma de base livre ou em sua forma de sal. Onde uma combinação de aminoácidos é usada, todos os aminoácidos podem estar presentes em suas formas de base livre, todos podem estar presentes em suas formas de sal, ou alguns podem estar presentes em suas formas de base livre enquanto outros estão presentes em suas formas de sal. Em uma forma de realização, aminoácidos para usar na preparação das composições da invenção são aqueles portando uma cadeia lateral carregada, tal como arginina, lisina, ácido aspártico, e ácido glutâmico. Qualquer estereoisômero (isto é, L, D, ou uma mistura destes) de um aminoácido particular (por exemplo metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina e misturas destes) ou combinações destes estereoisômeros, podem estar presentes nas composições farmacêuticas da invenção contanto que o aminoácido particular esteja presente ou em sua forma de base livre ou sua forma de sal. Em uma forma de realização o L-estereoisômero é usado. Composições da invenção também podem ser formuladas com análogos destes aminoácidos. Por análogo de aminoácido é pretendido um derivado do aminoácido naturalmente ocorrente que causa o efeito desejado de diminuir formação agregada pelo polipeptídeo durante armazenamento das composições farmacêuticas líquidas da invenção. Análogos de arginina adequados incluem, por exemplo, aminoguanidinas, ornitina e N-monoetil Larginina, análogos de metionina adequados incluem etionina e butionina e análogos de cisteína adequados incluem Smetil-L cisteína. Como com os outros aminoácidos, os análogos de aminoácidos são incorporados nas composições ou em sua forma de base livre ou sua forma de sal. Em uma forma de realização adicional da invenção os aminoácidos ou análogos de aminoácidos são usados em uma concentração, que

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34/75 é suficiente para prevenir ou atrasar agregação da proteína.

[00115] Em uma forma de realização adicional da invenção metionina (ou outros aminoácidos sulfúricos ou análogos de aminoácidos) podem ser adicionados para inibir oxidação de resíduos de metionina para sulfóxido de metionina quando o polipeptídeo atuando como o agente terapêutico é um polipeptídeo compreendendo pelo menos um resíduo de metionina suscetível a tal oxidação. Por inibir é pretendida acumulação mínima de espécie oxidada de metionina com o tempo. Inibir oxidação de metionina resulta em maior retenção do polipeptídeo em sua forma molecular própria. Qualquer estereoisômero de metionina (L ou D) ou combinações destes podem ser usados. A quantidade a ser adicionada deve ser uma quantidade suficiente para inibir oxidação dos resíduos de metionina de forma que a quantidade de sulfóxido de metionina seja aceitável para agências reguladoras. Tipicamente, isto significa que a composição contém não mais do que cerca de 10% a cerca de 30% de sulfóxido de metionina. Geralmente, isto pode ser atingido adicionando metionina de forma que a proporção de metionina adicionada a resíduos de metionina varie de cerca de 1:1 a cerca de 1000:1, tal como 10:1a cerca de 100:1.

[00116] Em uma forma de realização adicional da invenção a formulação compreende adicionalmente um estabilizante selecionado a partir do grupo de polímeros de alto peso molecular ou compostos de baixo peso molecular. Em uma forma de realização adicional da invenção o estabilizante é selecionado a partir de polietilenoglicol (por exemplo PEG 3350), polivinil álcool (PVA), polivinilpirrolidona, carboxi-/hidroxicelulose ou derivados destes (por exemplo HPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, substâncias contendo enxofre como monotioglicerol, ácido tioglicólico e 2-metiltioetanol, e sais diferentes (por exemplo cloreto de sódio). Cada um destes estabilizantes específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção.

[00117] As composições farmacêuticas também podem compreender agentes estabilizantes adicionais, que adicionalmente realçam estabilidade de um polipeptídeo terapeuticamente ativo nessas. Agentes estabilizantes de interesse particular para a presente invenção incluem, mas não são limitados a, metionina e

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EDTA, que protegem o polipeptídeo contra oxidação de metionina, e um tensoativo não iônico, que protege o polipeptídeo contra agregação associada com congelamento-descongelamento ou fragmentação mecânica.

[00118] Em uma forma de realização adicional da invenção a formulação compreende adicionalmente um tensoativo. Em outra forma de realização da invenção a composição farmacêutica compreende dois tensoativos diferentes. O termo Tensoativo como usado neste lugar se refere a quaisquer moléculas ou íons que são compreendidos de uma parte solúvel em água (hidrofílica), a cabeça, e um segmento solúvel em gordura (lipofílico). Tensoativos acumulam preferivelmente em interfaces, cuja parte hidrofílica é orientada para a água (fase hidrofílica) e a parte lipofílica para a fase oleosa ou hidrofóbica (isto é vidro, ar, óleo etc.). A concentração na qual tensoativos começam a formar micelas é conhecida como a concentração de micela crítica ou CMC. Além disso, tensoativos diminuem a tensão superficial de um líquido. Tensoativos também são conhecidos como compostos anfipáticos. O termo Detergente é um sinônimo usado para tensoativos em geral.

[00119] Tensoativos aniônicos podem ser selecionados a partir do grupo de: Ácido quenodesoxicólico, Sal de sódio de ácido quenodesoxicólico, Ácido cólico, Ácido dehidrocólico, Ácido desoxicólico, Metil éster de ácido deoxicólico, Digitonina, Digitoxigenina, Ν,Ν-Dimetildodecilamina N-óxido, Docusato de sódio, sódio de ácido glicoquenodeoxicólico, Hidrato de ácido glicocólico, Monohidrato de ácido glicodesoxicólico, Sal de sódio de ácido glicodesoxicólico, Sal de sódio de ácido glicodesoxicólico, Sal de 3-sulfato dissódico de ácido glicolitocólico, etil éster de ácido glicolitocólico, sal de sódio de N-Lauroilsarcosina, sal de sódio de NLauroilsarcosina, N-Lauroilsarcosina, N-Lauroilsarcosina, Dodecil sulfato de lítio, Lugol, 1-Sal de sódio de ácido octanosulfônico, 1 Sal de sódio de ácido octanosulfônico, 1-butanosulfonato de sódio, 1-decanosulfonato de sódio, 1dodecanosulfonato de sódio, 1-heptanosulfonato de sódio, 1-heptanosulfonato de sódio, 1-nonanosulfonato de sódio, monohidrato de 1-propanosulfonato de sódio, 2bromoetanosulfonato de sódio, Hidrato de colato de sódio, bile de boi ou ovelha, Hidrato de colato de sódio, Coleato de sódio, Deoxicolato de sódio, Dodecil sulfato

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36/75 de sódio, Dodecil sulfato de sódio, Hexanosulfonato de sódio, Octil sulfato de sódio, Pentanosulfonato de sódio, Taurocolato de sódio, sal de sódio de ácido tauroquenodesoxicólico, monohidrato de sal de sódio de ácido taurodesoxicólico, sal de 3-sulfato dissódico de ácido taurolitocólico, sal de sódio de ácido tauroursodesoxicólico, Trizma® dodecil sulfato, DSS (docusato de sódio, CAS registro no [577-11-7]), docusato de cálcio, (CAS registro no [128-49-4]), docusato de potássio, (CAS registro no [7491 09-0]), SDS (dodecil sulfato de sódio ou lauril sulfato de sódio), Dodecilfosfocolina (FOS-Colina-12), Decilfosfocolina (FOS-Colina10), Nonilfosfocolina (FOS-Colina9), dipalmitoil ácido fosfatídico, caprilato de sódio, e/ou ácido ursodesoxicólico.

[00120] Tensoativos catiônicos podem ser selecionados a partir do grupo de: Brometo de alquiltrimetilamônio, Cloreto de benzalcônio, Cloreto de benzalcônio, Cloreto de benzildimetilhexadecilamônio, Cloreto de benzildimetiltetradecilamônio, Tetracloroiodato de benziltrimetilamônio, Brometo de dimetildioctadecilamônio, Brometo de dodeciletildimetilamônio, Brometo de dodeciltrimetilamônio, Brometo de dodeciltrimetilamônio, Brometo de etilhexadecildimetilamônio, Brometo de hexadeciltrimetilamônio, Brometo de hexadeciltrimetilamônio, Polioxietileno(10)-Nsebo-1,3-diaminopropano, Brometo de tonzônio, e/ou Brometo de trimetil(tetradecil)amônio.

[00121] Tensoativos não iônicos podem ser selecionados a partir do grupo de: BigCHAP, Bis(polietilenoglicol bis[imidazoil carbonil]), copolímeros de bloqueio como copolímeros de bloqueio polietilenóxido/polipropilenóxido tal como poloxâmeros, poloxâmero 188 e poloxâmero 407, Brij®35, Brij® 56, Brij® 72, Brij® 76, Brij® 92V, Brij® 97, Brij® 58P, Cremophor® EL, Decaetileno glicol monododecil éter, NDecanoil-N-metilglucamina, n-Dodecanoil-N-metilglucamida, poliglicosídeos de alquila, óleo de ricínio etoxilado, Heptaetileno glicol monodecil éter, Heptaetileno glicol monododecil éter, Heptaetileno glicol monotetradecil éter, Hexaetileno glicol monododecil éter, Hexaetileno glicol monohexadecil éter, Hexaetileno glicol monooctadecil éter, Hexaetileno glicol monotetradecil éter, Igepal CA-630, Igepal CA-630, Metil-6-O-(Nheptilcarbamoil)-beta-D-glicopiranosídeo, Nonaetileno glicol

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37/75 monododecil éter, N-Nonanoil-N-metilglucamina, N-Nonanoil-N-metilglucamina, Octaetileno glicol monodecil éter, Octaetileno glicol monododecil éter, Octaetileno glicol monohexadecil éter, Octaetileno glicol monooctadecil éter, Octaetileno glicol monotetradecil éter, Octil-3-D-glicopiranosídeo, Pentaetileno glicol monodecil éter, Pentaetileno glicol monododecil éter, Pentaetileno glicol monohexadecil éter, Pentaetileno glicol monohexil éter, Pentaetileno glicol monooctadecil éter, Pentaetileno glicol monooctil éter, Polietilenoglicol diglicidil éter, Polietileno glicol éter W-1, Polioxietileno 10 tridecil éter, Polioxietileno 100 estearato, Polioxietileno 20 isohexadecil éter, Polioxietileno 20 oleil éter, Polioxietileno 40 estearato, Polioxietileno 50 estearato, Polioxietileno 8 estearato, Polioxietileno bis(imidazolil carbonil), Polioxietileno 25 propilenoglicol estearato, Saponina de cortiça de Quillaja, Span® 20, Span® 40, Span® 60, Span® 65, Span® 80, Span® 85, Tergitol, Tipo 15S-12, Tergitol, Tipo 15-S-30, Tergitol, Tipo 15-S-5, Tergitol, Tipo 15-S-7, Tergitol, Tipo 15-S-9, Tergitol, Tipo NP-10, Tergitol, Tipo NP-4, Tergitol, Tipo NP-40, Tergitol, Tipo NP-7, Tergitol, Tipo NP-9, Tetradecil-13-D-maltosídeo, Tetraetileno glicol monodecil éter, Tetraetileno glicol monododecil éter, Tetraetileno glicol monotetradecil éter, Trietileno glicol monodecil éter, Trietileno glicol monododecil éter, Trietileno glicol monohexadecil éter, Trietileno glicol monooctil éter, Trietileno glicol monotetradecil éter, Triton CF-21, Triton CF-32, Triton DF-12, Triton DF-16, Triton GR-5M, Triton QS-15, Triton QS-44, Triton X-100, Triton X-102, Triton X-15, Triton X-151, Triton X-200, Triton X207, Triton® X-100, Triton® X-114, solução de Triton® X-165, solução de Triton® X-305, Triton® X405, Triton® X-45, Triton® X705-70, TWEEN® 20, TWEEN® 40, TWEEN® 60, TWEEN® 6, TWEEN® 65, TWEEN® 80, TWEEN® 81, TWEEN® 85, Tiloxapol, esfingofosfolipídios (esfingomielina), e esfingoglicolipídios (ceramidas, gangliosídeos), fosfolipídios, e/ou nllndecil β-D-glicopiranosídeo.

[00122] Tensoativos zwitteriônicos podem ser selecionados a partir do grupo de: CHAPS, CHAPSO, sal interno de 3- (Decildimetilamônio)propanosulfonato, sal interno de 3-(Dodecildimetilamônio)- propanosulfonato, sal interno de 3(Dodecildimetilamônio)propanosulfonato, 3 (N,NPetição 870190013350, de 08/02/2019, pág. 43/88

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Dimetilmiristilamônio)propanosulfonato, 3-(N,N-Dimetiloctadecilamônio)propanosulfonato, sal interno de 3-(N,N-Dimetiloctilamônio)propanosulfonato, 3(N,NDimetilpalmitilamônio)propanosulfonato, N-alquil-N,N-dimetilamônio-1propanosulfonatos, 3-colamido-1 -propildimetilamônio-1 -propanosulfonato,

Dodecilfosfocolina, miristoil lisofosfatidilcolina, Zwittergent 3-12 (N-dodecil N,Ndimetil-3-amônio-1-propanosulfonato), Zwittergent 3-10 (sal interno de dimetilamônio 3-(Decildimetilamônio)- propanosulfonato), Zwittergent 3-08 (3(Octildimetilamônio)pro-panesulfonato), glicerofosfolipídios (lecitinas, cefalinas, fosfatidil serina), gliceroglicolipídios (galactopiranosídeo), alquil, alcóxi (alquil éster), alcóxi (alquil éter)- derivados de lisofosfatidil e fosfatidilcolinas, por exemplo lauroil e miristoil derivados de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, e modificações do grupo da cabeça polar, isto é colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol, inositol, lisofosfatidilserina e lisofosfatidiltreonina, acilcarnitinas e derivados, derivados de lisina, arginina ou histidina Nbeta- acilados, ou derivados de lisina ou arginina de cadeia lateral acilada, derivados Nbeta- acilados de dipeptídeos compreendendo qualquer combinação de lisina, arginina ou histidina e um aminoácido neutro ou ácido, derivado Nbeta-acilado de um tripeptídeo compreendendo qualquer combinação de um aminoácido neutro e dois aminoácidos carregados, ou o tensoativo pode ser selecionado a partir do grupo de derivados de imidazolina, ácidos graxos de cadeia longa e sais destes C6-C12 (eg. ácido oléico e ácido caprílico), N-Hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-1 -propanosulfonato, tensoativos monovalentes aniônicos (alquil-aril-sulfonatos), palmitoil lisofosfatidil-L-serina, lisofosfolipídios (por exemplo 1-acilsn-glicero-3-fosfato ésteres de etanolamina, colina, serina ou treonina), ou misturas destes.

[00123] O termo poliglicosídeos de alquila como usado neste lugar referindo-se a uma cadeia linear ou ramificada de Cs-2o-alquil, -alquenil ou -alquinil que é substituída por uma ou mais porções de glicosídeo tal como maltosídeo, sacarídeo etc. Formas de realização destes poliglicosídeos de alquila incluem C6-18poliglicosídeos de alquila. Formas de realização específicas destes poliglicosídeos de alquila incluem the cadeias de carbono numeradas igual tal como cadeia de

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39/75 alquila de C6, Cs, C10, C12, C14, C16, Cie e C20. Formas de realização específicas das porções de glicosídeo incluem piranosídeo, glicopiranosídeo, maltosídeo, maltotriosídeo e sucrose. Em formas de realização da invenção menos do que 6 porções de glicosídeo são acopladas ao grupo alquila. Em formas de realização da invenção menos do que 5 porções de glicosídeo são acopladas ao grupo alquila. Em formas de realização da invenção menos do que 4 porções de glicosídeo são acopladas ao grupo alquila. Em formas de realização da invenção menos do que 3 porções de glicosídeo são acopladas ao grupo alquila. Em formas de realização da invenção menos do que 2 porções de glicosídeo são acopladas ao grupo alquila. Formas de realização específicas de alquilpoliglicosídeos são alquil glicosídeos tal ndecil β-D-glicopiranosídeo, decil β-D maltopiranosídeo, dodecil β-D-glicopiranosídeo, n-dodecil β-D-maltosídeo, n-dodecil β-D-maltosídeo, n-dodecil β-D-maltosídeo, tetradecil β-D-glicopiranosídeo, decil β-D-maltosídeo, hexadecil β-D-maltosídeo, decil β-D-maltotriosídeo, dodecil β-D-maltotriosídeo, tetradecil β-D-maltotriosídeo, hexadecil β-D-maltotriosídeo, n-dodecil-sucrose, n-decil-sucrose, sucrose monocaprato, sucrose monolaurato, sucrose monomiristato, e sucrose monopalmitato.

[00124] O uso de um tensoativo em composições farmacêuticas é conhecido para a pessoa versada. Para conveniência é feita referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.

[00125] Em uma forma de realização adicional da invenção a formulação compreende adicionalmente inibidores de protease tal como EDTA (ácido etilenodiamina tetracético) e benzamidinaHCI, mas outros inibidores de protease disponíveis comercialmente também podem ser usados. O uso de um inibidor de protease é particularmente útil em composições farmacêuticas compreendendo zimogênios de proteases a fim de inibir autocatálise.

[00126] É possível que outros ingredientes possam estar presentes na formulação farmacêutica de peptídeo da presente invenção. Tais ingredientes adicionais podem incluir agentes umectantes, emulsificantes, antioxidantes, agentes de diluição, modificadores de tonicidade, agentes quelantes, íons metálicos, veículos

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40/75 oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina no soro humano, gelatina ou proteínas) e um zwitteríon (por exemplo, um aminoácido tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Tais ingredientes adicionais, claro, não devem afetar adversamente a estabilidade geral da formulação farmacêutica da presente invenção.

[00127] Composições farmacêuticas contendo um composto de acordo com a presente invenção podem ser administradas a um paciente com necessidade de tal tratamento em diversos sítios, por exemplo, em sítios tópicos, por exemplo, pele e sítios de mucosa, em sítios que evitam absorção, por exemplo, administração em uma artéria, em uma veia, no coração, e em sítios que envolvem absorção, por exemplo, administração na pele, sob a pele, em um músculo ou no abdômen.

[00128] Administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ser através de diversas vias de administração, por exemplo, lingual, sublingual, bucal, na boca, oral, no estômago e intestino, nasal, pulmonar, por exemplo, através dos bronquíolos e alvéolos ou uma combinação destas, epidermal, dermal, transdermal, vaginal, retal, ocular, por exemplo através da conjuntiva, uretral, e parenteral para pacientes com necessidade de um tal tratamento.

[00129] Composições da presente invenção podem ser administradas em diversas formas de dosagem, por exemplo, como soluções, suspensões, emulsões, microemulsões, emulsão múltipla, espumas, ungüentos, pastas, emplastros, pomadas, comprimidos, comprimidos revestidos, enxágües, cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina duras e cápsulas de gelatina macias, supositórios, cápsulas retais, gotas, géis, líquidos pulverizáveis, pó, aerossóis, inalantes, gotas oculares, pomadas oftálmicas, enxágües oftálmicos, pessários vaginais, anéis vaginais, pomadas vaginais, solução de injeção, soluções de transformação in situ, por exemplo gelificação in situ, deposição in situ, precipitação in situ, cristalização in situ, solução de infusão, e implantes.

[00130] Composições da invenção podem adicionalmente ser compostas em, ou acopladas a, por exemplo através de interações covalentes, hidrofóbicas e eletrostáticas, um portador de droga, sistema de entrega de droga e sistema de

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41/75 entrega de droga avançado a fim de realçar adicionalmente estabilidade do composto da presente invenção, aumentar biodisponibilidade, aumentar solubilidade, diminuir efeitos adversos, atingir cronoterapia bem conhecida para aqueles versados na técnica, e aumentar adaptação ao paciente ou qualquer combinação destes. Exemplos de portadores, sistema de entrega de drogas e sistema de entrega de droga avançados incluem, mas não são limitados a, polímeros, por exemplo celulose e derivados, polissacarídeos, por exemplo dextran e derivados, amido e derivados, poli(vinil álcool), polímeros de acrilato e metacrilato, ácido poliláctico e poliglicólico e co-polímeros de bloqueio destes, polietilenoglicóis, proteínas carreadoras, por exemplo albumina, géis, por exemplo, sistemas de termogelificação, por exemplo sistemas co-poliméricos de bloqueio bem conhecidos para aqueles versados na técnica, micelas, lipossomos, microesferas, nanoparticulatos, cristais líquidos e dispersões destes, fase L2 e dispersões destes, bem conhecidos para aqueles versados na técnica de comportamento de fase em sistemas de lipídio-água, micelas poliméricas, emulsões múltiplas, autoemulsificante, auto-microemulsificante, ciclodextrinas e derivados destes, e dendrímeros.

[00131] Composições da presente invenção são úteis na formulação de sólidos, semisólidos, pó e soluções para administração pulmonar de compostos da presente invenção, usando, por exemplo um inalador de dose medida, inalador de pó seco e um nebulizador, todos sendo dispositivos bem conhecidos para aqueles versados na técnica.

[00132] Composições da presente invenção são especificamente úteis na formulação de sistema de entrega de drogas controlado, sustentado, prolongado, retardado, e de liberação lenta. Mais especificamente, mas não limitado a, composições são úteis em formulação de sistemas parenterais de liberação controlada e liberação sustentada (ambos sistemas levando a uma redução primordial em número de administrações), bem conhecidos para aqueles versados na técnica. Ainda mais preferivelmente, são sistemas de liberação controlada e liberação sustentada administrados subcutaneamente. Sem limitar o escopo da

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42/75 invenção, exemplos de sistema de liberação controlada útil e composições são hidrogéis, géis oleaginosos, cristais líquidos, micelas poliméricas, microesferas, nanopartículas, Métodos para produzir sistemas de liberação controlada úteis para composições da presente invenção incluem, mas não são limitados a, cristalização, condensação, co-cristalização, precipitação, co-precipitação, emulsificação, dispersão, homogeneização em alta pressão, encapsulação, liofilização, microencapsulação, coacervação, separação de fase, evaporação de solvente para produzir microsferas, extrusão e processos de fluidos supercríticos. Referência geral é feita a Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcei Dekker, New York, 2000) e Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcei Dekker, New York, 2000).

[00133] Administração parenteral pode ser realizada por injeção subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa por meio de uma seringa, opcionalmente uma seringa tipo caneta. Alternativamente, administração parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba de infusão. Uma opção adicional é uma composição que pode ser uma solução ou suspensão ou um pó para a administração do composto da presente invenção na forma de um líquido pulverizável de pó ou líquido nasal ou pulmonar. Como uma opção ainda adicional, as composições farmacêuticas contendo o composto da invenção também podem ser adaptadas para administração transdermal, por exemplo por injeção livre de agulha ou a partir de um esparadrapo, opcionalmente um esparadrapo iontoforético, ou administração transmucosal, por exemplo bucal.

[00134] Os compostos da presente invenção podem ser administrados através da via pulmonar em um veículo, como uma solução, suspensão ou pó seco usando qualquer de tipos conhecidos de dispositivos adequados para entrega pulmonar de droga. Exemplos destes compreendem, mas não são limitados a, os três tipos gerais de geração de aerossol para entrega pulmonar de droga, e podem incluir nebulizadores a jato ou ultra-sônicos, inaladores de dose medida, ou inaladores de pó seco (Cf. Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453).

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43/75 [00135] Baseado em metodologia de teste padronizada, o diâmetro aerodinâmico (da) de uma partícula é definido como o diâmetro geométrico equivalente de uma partícula esférica padrão de referência de densidade unitária (1 g/cm3). No caso mais simples, para partículas esféricas, da é relacionado a um diâmetro de referência (d) como uma função da raiz quadrada da proporção de densidade como descrito por: Modifications to this relationship occur for non-spherical particles (cf. Edwards DA, BenJebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). Os termos MMAD e MMEAD são bem descritos e conhecidos para a técnica (cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R e representam uma medida do valor médio de uma distribuição de tamanho de partícula aerodinâmica. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). Diâmetro aerodinâmico médio de massa (MMAD) e diâmetro aerodinâmico efetivo médio de massa (MMEAD) são usados permutavelmente, são parâmetros estatísticos, e descrevem empiricamente o tamanho de partículas de aerossol em relação ao seu potencial de depositar nos pulmões, independente de forma atual, tamanho, ou densidade (cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). MMAD é normalmente calculado a partir da medida feita com impactadores, um instrumento que mede o comportamento inercial da partícula no ar. Em uma forma de realização adicional, a formulação pode ser aerossolizada por qualquer tecnologia de aerossolização conhecida, tal como nebulização, para atingir um MMAD de partículas de aerossol menores do que 10 pm, mais preferivelmente entre 1-5 pm, e o mais preferivelmente entre 1-3 pm. O tamanho de partícula preferido é baseado no tamanho mais efetivo para entrega de droga para o interior do pulmão, onde proteína é otimamente absorvida (cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385).

[00136] Deposição no interior do pulmão das formulações pulmonares compreendendo o composto da presente invenção pode opcionalmente ser

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44/75 adicionalmente otimizada usando modificações das técnicas de inalação, por exemplo, mas não limitado a: fluxo lento de inalação (eg. 30 L/min), bloqueio da respiração e momento de ativação.

[00137] O termo formulação estabilizada se refere a uma formulação com estabilidade física aumentada, estabilidade química aumentada ou estabilidade física e química aumentada.

[00138] O termo estabilidade física da formulação protéica como usado neste lugar se refere à tendência da proteína para formar agregados biologicamente inativos e/ou insolúveis da proteína como um resultado de exposição da proteína a estresses termo-mecânicos e/ou interação com interfaces e superfícies que são desestabilizantes, tal como superfícies e interfaces hidrofóbicas. Estabilidade física das formulações protéicas aquosas é avaliada por meio de inspeção visual e/ou medidas de turbidez depois de exposição da formulação carregada em recipientes adequados (por exemplo cartuchos ou frascos) a estresse mecânico/físico (por exemplo agitação) em diferentes temperaturas por vários períodos de tempo. Inspeção visual das formulações é realizada em uma luz de foco definido com um fundo escuro. A turbidez da formulação é caracterizada por um escore visual ranqueando o grau de turbidez por exemplo em uma escala de 0 a 3 (uma formulação mostrando nenhuma turbidez corresponde a um escore visual 0, e uma formulação mostrando turbidez visual na luz do dia corresponde a escore visual 3). Uma formulação é classificada instável fisicamente com respeito à agregação de proteína, quando ela mostra turbidez visual na luz do dia. Alternativamente, a turbidez da formulação pode ser avaliada por medidas de turbidez simples bem conhecidas para a pessoa versada. Estabilidade física das formulações protéicas aquosas também pode ser avaliada usando um agente espectroscópico ou sonda do estado conformacional da proteína. A sonda é preferivelmente uma molécula pequena que se liga preferencialmente a um confôrmero não nativo da proteína. Um exemplo de uma sonda espectroscópica molecular pequena de estrutura protéica é Tioflavina T. Tioflavina T é um corante fluorescente que foi amplamente usado para a detecção de fibrilas amilóides. Na presença de fibrilas, e talvez outras

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45/75 conformações protéicas também, Tioflavina T leva a ocorrer um novo máximo de excitação em cerca de 450 nm e emissão realçada em cerca de 482 nm quando ligada a uma forma protéica fibrilar. Tioflavina T não ligada é essencialmente não fluorescente nos comprimentos de onda.

[00139] Outras moléculas pequenas podem ser usadas como sondas das mudanças em estrutura protéica de estados nativos para não nativos. Por exemplo as sondas de trecho hidrofóbico que se ligam preferencialmente a trechos hidrofóbicos expostos de uma proteína. Os trechos hidrofóbicos são geralmente encobertos dentro da estrutura terciária de uma proteína em seu estado nativo, mas se tornam expostos à medida que a proteína começa a desenovelar ou desnaturar. Exemplos destas sondas espectroscópicas moleculares pequenas são corantes hidrofóbicos aromáticos, tal como antraceno, acridina, fenantrolina ou os semelhantes. Outras sondas espectroscópicas são complexos de metal-aminoácido, tal como complexos metálicos de cobalto de aminoácidos hidrofóbicos, tal como fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, e valina, ou os semelhantes.

[00140] O termo estabilidade química da formulação protéica como usado neste lugar se refere a mudanças covalentes químicas na estrutura protéica levando a formação de produtos de degradação química com menor potência biológica potencial e/ou propriedades imunogênicas aumentadas potenciais comparado à estrutura protéica nativa. Vários produtos de degradação química podem ser formados dependendo do tipo e natureza da proteína nativa e do ambiente ao qual a proteína é exposta. Eliminação de degradação química mais provavelmente não pode ser completamente evitada e quantidades crescentes de produtos de degradação química é freqüentemente visto durante armazenamento e uso da formulação protéica como bem conhecido pela pessoa versada na técnica. A maioria das proteínas é propensa a desamidação, um processo no qual o grupo amida de cadeia lateral em resíduos de glutaminil ou asparaginil é hidrolisado para formar um ácido carboxílico livre. Outras vias de degradações envolvem formação de produtos de transformação de alto peso molecular onde duas ou mais moléculas de proteína são covalentemente ligadas uma a outra através de transamidação e/ou interações

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46/75 dissulfeto levando a formação de produtos de degradação de dímero, oligômero e polímero covalentemente ligado (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). Oxidação (de por exemplo resíduos de metionina) pode ser mencionada como outra variante de degradação química. A estabilidade química da formulação protéica pode ser avaliada medindo a quantidade dos produtos de degradação química em vários momentos depois de exposição a diferentes condições ambientais (a formação de produtos de degradação pode freqüentemente ser acelerada por exemplo aumentando temperatura). A quantidade de cada produto de degradação individual é freqüentemente determinada por separação dos produtos de degradação dependendo de tamanho e/ou carga de molécula usando várias técnicas de cromatografia (por exemplo SEC-HPLC e/ou RP-HPLC).

[00141] Por isso, como esboçado acima, uma formulação estabilizada se refere a uma formulação com estabilidade física aumentada, estabilidade química aumentada ou estabilidade física e estabilidade química. Em geral, uma formulação deve ser estável durante uso e armazenamento (em conformidade com condições recomendadas de uso e armazenamento) até a data de validade ser atingida.

[00142] Em uma forma de realização da invenção a formulação farmacêutica compreendendo o composto da presente invenção é estável por mais do que 6 semanas de utilização e por mais do que 3 anos de armazenamento.

[00143] Em outra forma de realização da invenção a formulação farmacêutica compreendendo o composto da presente invenção é estável por mais do que 4 semanas de utilização e por mais do que 3 anos de armazenamento.

[00144] Em uma forma de realização adicional da invenção a formulação farmacêutica compreendendo o composto da presente invenção é estável por mais do que 4 semanas de utilização e por mais do que dois anos de armazenamento.

[00145] Em uma forma de realização ainda adicional da invenção a formulação farmacêutica compreendendo o composto da presente invenção é estável por mais do que 2 semanas de utilização e por mais do que dois anos de armazenamento.

[00146] Em outro aspecto a presente invenção se refere ao uso de um composto

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47/75 de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento.

[00147] Em uma forma de realização um composto de acordo com a invenção é usado para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de hiperglicemia, diabete tipo 2, tolerância à glicose prejudicada, diabete tipo 1, obesidade, hipertensão, síndrome X, dislipidemia, distúrbios cognitivos, arteriosclerose, infarto do miocárdio, derrame, doença coronária cardíaca e outros distúrbios cardiovasculares, síndrome de intestino inflamatório, dispepsia e úlceras gástricas.

[00148] Em outra forma de realização um composto de acordo com a invenção é usado para a preparação de um medicamento para atrasar ou prevenir progressão de doença em diabete tipo 2.

[00149] Em outra forma de realização um composto de acordo com a invenção é usado para a preparação de um medicamento para diminuir consumo alimentar, diminuir apoptose de célula β, aumentar função de célula β e massa de célula β, e/ou para restaurar sensibilidade a glicose para células β.

[00150] O tratamento com um composto de acordo com a presente invenção também pode ser combinado com um segundo ou mais substâncias farmacologicamente ativas, por exemplo selecionado a partir de agentes antidiabéticos, agentes antiobesidade, agentes reguladores de apetite, agentes antihipertensivos, agentes para o tratamento e/ou prevenção de complicações resultando de ou associadas com diabete e agentes para o tratamento e/ou prevenção de complicações e distúrbios resultando de ou associadas com obesidade. Exemplos destas substâncias farmacologicamente ativas são: Insulina, sulfoniluréias, biguanidas, meglitinidas, inibidores de glucosidase, antagonistas de glucagon, inibidores de DPP-IV (dipeptidil peptidase-IV), inibidores de enzimas hepáticas envolvidas em estimulação de gliconeogênese e/ou glicogenólise, moduladores de absorção de glicose, compostos modificando o metabolismo lipídico tal como agentes antihiperlipidêmicos como inibidores de HMG CoA (estatinas), Polipeptídeos Inibidores Gástricos (análogos de GIP), compostos diminuindo consumo alimentar, agonistas de RXR e agentes atuando no canal de potássio

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48/75 dependente de ATP das células β; Colestiramina, colestipol, clofibrato, gemfibrozil, lovastatina, pravastatina, simvastatina, probucol, dextrotiroxina, neteglinida, repaglinida; bloqueadores β tal como alprenolol, atenolol, timolol, pindolol, propranolol e metoprolol, inibidores de ACE (enzima conversora de angiotensina) tal como benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, alatriopril, quinapril e ramipril, bloqueadores de canal de cálcio tal como nifedipina, felodipina, nicardipina, isradipina, nimodipina, diltiazem e verapamil, e bloqueadores α tal como doxazosina, urapidil, prazosina e terazosina; agonistas de CART (transcrito regulado por anfetamina cocaína), antagonistas de NPY (neuropeptídeo Y), agonista de PYY, agonistas de PYY2, agonistas de PYY4, agonistas de PPY2/PYY4 misturados, agonistas de MC4 (melanocortina 4), antagonistas de orexina, agonistas de TNF (fator de necrose tumoral), agonistas de CRF (fator de liberação de corticotropina), antagonistas de CRF BP (proteína de ligação de fator de liberação de corticotropina), agonistas de urocortina, agonistas de In, agonistas de MSH (hormônio estimulador de melanócito), antagonistas de MCH (hormônio concentrador de melanócito), agonistas de CCK (colecistocinina), inibidores de re-consumo de serotonina, inibidores de re-consumo de serotonina e noradrenalina, compostos de serotonina e noradrenérgicos misturados, agonistas de 5HT (serotonina), agonistas de bombesina, antagonistas de galanina, hormônio de crescimento, compostos de liberação de hormônio de crescimento, agonistas de TRH (hormônio de liberação de tireotropina), moduladores de UCP 2 ou 3 (proteína de desacoplamento 2 ou 3), agonistas de leptina, agonistas de DA (bromocriptina, doprexina), inibidores de lipase/amilase, moduladores de RXR (receptor X retinóide), agonistas de TR β; antagonistas de histamina H3, agonistas ou antagonistas de Polipeptídeo Inibidor Gástrico (análogos de GIP), gastrina e análogos de gastrina.

[00151] O tratamento com um composto de acordo com esta invenção também pode ser combinado com cirurgia- uma cirurgia que influencie os níveis de glicose e/ou homeostase de lipídio tal como bandeamento gástrico ou derivação gástrica. [00152] Deve ser entendido que qualquer combinação adequada dos compostos de acordo com a invenção com um ou mais dos compostos mencionados acima e

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49/75 opcionalmente uma ou mais substâncias farmacologicamente ativas adicionais é considerada estar dentro do escopo da presente invenção.

[00153] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos seguintes que, entretanto, não são para serem construídos para limitar o escopo de proteção. As características descritas na descrição precedente e nos exemplos seguintes podem, tanto separadamente como em qualquer combinação desta, ser material para realizar a invenção em diversas formas desta.

[00154] EXEMPLOS

Abreviações usadas:

r.t: Temperatura ambiente

DIPEA: diisopropiletilamina

H20: água CH3CN: acetonitrila

DMF: NN dimetilformamida

HBTU: 2-(1 H-Benzotriazol-1-il-)-1,1,3,3 hexafluorofosfato de tetrametilurônio

Fmoc: 9 H-fluoren-9-ilmetoxicarbonil

Boc: terc-butiloxicarbonil

OtBu: terc-butil éster tBu: terc-butil

Trt: trifenilmetil

Pmc: 2,2,5,7,8-Pentametil-croman-6-sulfonil

Dde: 1 -(4,4-Dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)etil ivDde: 1 -(4,4-Dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-3-metilbutil

Mtt: 4-metiltritil

Mmt: 4-metoxitritil

DCM: diclorometano

TIS: triisopropilsilano)

TFA: ácido trifluoracético

Et20: dietiléter

NMP: 1 -Metil-pirrolidin-2-ona

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DIPEA: Diisopropiletilamina

HOAt: 1 -Hidroxi-7-azabenzotriazol

HOBt: 1-Hidroxibenzotriazol

DIC: Diisopropilcarbodiimida

A: Síntese de peptídeo ligado em resina.

[00155] A resina de peptidil protegida foi sintetizada de acordo com a estratégia de Fmoc em um sintetizador de peptídeo Applied Biosystems 433 em escala de 0,25 mmol ou 1,0 mmol usando os protocolos FastMoc UV fornecidos pelo fabricante que empregam acoplamentos mediados por HBTU ( 2-(1 H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3 hexafluorofosfato de tetrametilurônio) ou HATU (0-(7-azabenzotriazol-1-i1 )-1,1,3,3hexafluorofosfato de tetrametilurônio) em NMP (N-metil pirrolidona), e monitoramento de UV da desproteção do grupo de proteção de Fmoc. A resina inicial usada para a síntese das amidas de peptídeo GLP-1 foi resina Rink-Amida e ou resina de Wang ou clorotritil foi usada para peptídeos GLP-1 com um carboxi C terminal. Os derivados de aminoácidos protegidos usados foram aminoácidos de Fmoc padrão (fornecidos a partir de por exemplo Anaspec, ou Novabiochem) fornecidos em cartuchos pré-pesados adequados para o sintetizador AB1433A com a exceção de aminoácidos não naturais tal como Fmoc-Aib-OH (ácido aminoisobutírico de Fmoc). O aminoácido N terminal foi protegido com Boc no grupo amino alfa (por exemplo Boc-His(Boc)OH foi usado para peptídeos com His no N terminal). O grupo amino epsilon de lisina na posição 26 foi protegido ou com Mtt, Mmt, Dde, ivDde, ou Boc, dependendo da via para acoplamento da porção de ligação de albumina e espaçador. A síntese dos peptídeos pode em alguns casos ser melhorada pelo uso de dipeptídeos protegidos na ligação de amida de dipeptídeo com um grupo que pode ser clivado sob condições ácidas tal mas não limitado a 2-Fmoc-oxi-4-metoxibenzil ou 2,4,6-trimetoxibenzil. Em casos onde uma serina ou uma treonina está presente no peptídeo, o uso de dipeptídeos de pseudoprolina pode ser usado (veja por exemplo catálogo de Novobiochem 2002/2003 ou versão mais recente, ou W.R. Sampson (1999), J. Pep. Sei. 5, 403).

[00156] Procedimento para remoção de proteção por ivDde ou Dde.

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51/75 [00157] A resina (0,25 mmol) foi colocada em um equipamento manual de agitação/filtração e tratada com 2% de hidrazina em N-metil pirrolidona (20 ml, 2x12 min) para remover o grupo Dde ou ivDde e lavar com N-metil pirrolidona (4x20 ml).

[00158] Procedimento para remoção de proteção por Mtt ou Mmt.

[00159] A resina (0,25 mmol) foi colocada em um equipamento manual de agitação/filtração e tratada com 2% de TFA e 2-3% de TIS em DCM (20 ml, 5-10 min repetido 6-12 vezes) para remover o grupo Mtt ou Mmt e lavar com DCM (2x20 ml), 10%de MeOH e 5% de DIPEA em DCM (2x20m1) e N-metil pirrolidona (4x20 ml).

[00160] Procedimento para acoplamento de cadeias laterais a resíduo de Lisina.

[00161] O resíduo de ligação de albumina (B-U- cadeia lateral de fórmula I) pode ser acoplado ao peptídeo GLP-1 ou por acilação para peptídeo ligado em resina ou acilação em solução para o peptídeo não protegido usando reagente acilante padrão tal como mas não limitado a DIC, HOBt/DIC, HOAt/DIC, ou HBTU.

[00162] Acoplamento a peptídeo ligado em resina:

[00163] Via I [00164] Resíduo de ligação de albumina ativado (éster ativo ou anidrido simétrico) (B-U- cadeia lateral de fórmula I) tal como ácido octadecanodióico mono-(2,5-dioxopirrolidin-1 -il) éster (Ebashi et al. EP511600, 4 equivalentes molares em relação a peptídeo ligado em resina) foi dissolvido em NMP (25 mL), adicionado à resina e agitado durante a noite em temperatura ambiente. A mistura de reação foi filtrada e a resina foi lavada extensivamente com NMP, diclorometano, 2-propanol, metanol e dietil éter.

[00165] Via II [00166] O resíduo de ligação de albumina (B-U- cadeia lateral de fórmula I) foi dissolvido em N-metil pirrolidona/metileno cloreto (1:1, 10 ml). O reagente de ativação tal como hidroxibenzotriazol (HOBt) (4 equivalentes molares em relação à resina) e diisopropilcarbodiimida (4 equivalentes molares em relação à resina) foi adicionado e a solução foi agitada por 15 min. A solução foi adicionada à resina e diisopropietilamina (4 equivalentes molares em relação à resina) foi adicionada. A resina foi agitada 2 a 24 horas em temperatura ambiente. A resina foi lavada com N

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52/75 metil pirrolidona (2x20 ml), N-metil pirrolidona/Metileno cloreto (1:1) (2x20m1) e metileno cloreto (2x20 ml).

[00167] Via III [00168] Resíduo de ligação de albumina ativado (éster ativo ou anidrido simétrico) (B-U- cadeia lateral de fórmula I) tal como ácido octadecanodióico mono-(2,5-dioxopirrolidin-1 -il) éster (Ebashi et al. EP511600), 1-1,5 equivalentes molares em relação ao peptídeo GLP-1 foi dissolvido em um solvente orgânico tal como acetonitrila, THF, DMF, DMSO ou em uma mistura de água/solvente orgânico (1-2 ml) e adicionado a uma solução do peptídeo em água (10-20m1) junto com 10 equivalentes molares de DIPEA. Em caso de grupos de proteção no resíduo de ligação de albumina tal como tert.-butil, a mistura de reação foi liofilizada 0/N e o peptídeo bruto isolado desprotegido depois disso - em caso de um grupo terc-butil o peptídeo foi dissolvido em uma mistura de ácido trifluoracético, água e triisopropilsilano (90:5:5). Depois por 30min a mistura foi evaporada a vácuo e o peptídeo final purificado por HPLC preparativo.

[00169] Procedimento para remoção de proteção por Fmoc:

[00170] A resina (0,25 mmol) foi colocada em um frasco de filtro em um equipamento de agitação manual e tratada com N-metil pirrolidona/metileno cloreto (1:1) (2x20 ml) e com N-metil pirrolidona (1x20 ml), uma solução de 20% de piperidina em N-metil pirrolidona (3x20 ml, 10 min cada). A resina foi lavada com Nmetil pirrolidona (2x20 ml), N-metil pirrolidona/Metileno cloreto (1:1) (2x20m1) e metileno cloreto (2x20 ml).

[00171] Procedimento para clivar o peptídeo da resina:

[00172] O peptídeo foi clivado da resina agitando por 180 min em temperatura ambiente com uma mistura de ácido trifluoracético, água e triisopropilsilano (95:2,5:2,5 para 92:4:4). A mistura de divagem foi filtrada e o filtrado foi concentrado para um óleo por uma corrente de nitrogênio. O peptídeo bruto foi precipitado deste óleo com 45 ml de dietil éter e lavado 1 a 3 vezes com 45 ml de dietil éter.

[00173] Purificação: O peptídeo bruto foi purificado por HPLC semipreparativo em uma coluna de 20 mm x 250 mm embalada ou com 5μ ou 7μ ou de sílica C-18.

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Dependendo do peptídeo um ou dois sistemas de purificação foram usados.

[00174] TFA: Depois de secagem o peptídeo bruto foi dissolvido em 5 ml de H20 com 50% de ácido acético e diluído para 20 ml com H20 e injetado na coluna que então foi eluída com um gradiente de 40-60 % de CH3CN em 0,1% de TFA 10 ml/min durante 50 min a 40 °C. As frações contendo peptídeo foram coletadas. O peptídeo purificado foi liofilizado depois de diluição do eluato com água. Sulfato de amônio: A coluna foi equilibrada com 40% de CH3CN em 0,05M de (NH4)2SO4, que foi ajustado para pH 2,5 com H2SO4 concentrado. Depois de secagem o peptídeo bruto foi dissolvido em 5 ml de H20 com 50% de ácido acético e diluído para 20 ml com H20 e injetado na coluna que então foi eluída com um gradiente de 40% - 60% de CH3CN em 0,05M de (NH4)2SO4, pH 2,5 a 10 ml/min durante 50 min a 40 °C. As frações contendo peptídeo foram coletadas e diluídas com 3 volumes de H20 e passadas através de um cartucho Sep-Pak® C18 (Waters part. #:51910) que havia sido equilibrado com 0,1% de TFA. Ele foi então eluído com 70% de CH3CN contendo 0,1% de TFA e o peptídeo purificado foi isolado por liofilização depois de diluição do eluato com água.

[00175] O produto final obtido foi caracterizado por RP-HPLC analítico (tempo de retenção) e por LCMS [00176] A análise RP-HPLC foi realizada usando detecção de UV em 214 nm e uma coluna de sílica C-18 de 5μ de 4,6mm x 250mm Vydac 218TP54 (The Separations Group, Hesperia, USA) que foi eluída a 1 ml/min a 42 °C. Duas condições de eluição diferentes foram usadas:

A1: Equilíbrio da coluna dentro de um tampão consistindo de 0,1 M de (NH4)2504, que foi ajustada para pH 2,5 com H2504 concentrado e eluição por um gradiente de 0% a 60% de CH3CN no mesmo tampão durante 50 min.

BI: Equilíbrio da coluna com 0,1% de TFA / H20 e eluição por um gradiente de 0% de CH3CN / 0,1% de TFA / H20 a 60% de CH3CN / 0,1% de TFA / H20 durante 50 min.

B6: Equilíbrio da coluna com 0,1% de TFA / H20 e eluição por um gradiente de 0% de CH3CN / 0,1% de TFA / H20 a 90% de CH3CN / 0,1% de TFA /

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Η20 durante 50 min.

[00177] Alternativamente a análise RP-HPLC foi realizada usando detecção de UV em 214 nm e uma coluna de sílica C-18 de 3,5g de 3,6mm x 150mm Symmetry300 (Waters) que foi eluída a 1 ml/min a 42 °C.

B4: Equilíbrio da coluna com 0,05% de TFA / H20 e eluição por um gradiente de 5% de CH3CN / 0,05% de TFA / H20 a 95% de CH3CN / 0,05% de TFA / H20 durante 15 min.

[00178] A instrumentação seguinte foi usada:

[00179] LCMS foi realizado em uma estrutura consistindo de espectrômetro de massa quadrupolar Sciex API 100 Single, bomba Perkin Elmer Series 200 Quard, amostrador automático Perkin Elmer Series 200, detector de UV Applied Biosystems 785A, detector do espalhamento da luz por um evaporado Sedex 75 [00180] O controle de instrumento e aquisição de dados foram feitos pelo aplicativo computacional de controle Sciex Sample rodando em um computador com Windows 2000.

[00181] A bomba de HPLC é conectada a dois reservatórios de eluentes contendo:

A: 0,05% de Ácido trifluoracético em água

B: 0,05% de Ácido trifluoracético em acetonitrila [00182] A análise é realizada em temperatura ambiente injetando um volume apropriado da amostra (preferivelmente 20 pl) na coluna que é eluída com um gradiente de acetonitrila.

[00183] As condições de HPLC, ajustes de detector e ajustes de espectrômetro de massa usados são dados na tabela seguinte:

Coluna: Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 pm;

Gradiente: 5% - 90 % de acetonitrila linear durante 7,5 min a 1,5m1/min; Detecção : 210 nm (emissão de análogo a partir de DAD);

ELS (emissão de análogo a partir de ELS), 40 °C;

MS ionização modo API-ES.

[00184] Alternativamente LCMS foi realizado em um ajuste consistindo de Bomba

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Hewlett Packard series 1100 G1312A Bin, compartimento de Coluna Hewlett Packard series 1100, detector por conjunto de diodos Hewlett Packard series 1100 G1315A DAD, Hewlett Packard series 1100 MSD e detector do espalhamento da luz por um evaporado Sedere 75 controlado por aplicativo computacional HP Chemstation. A bomba de HPLC é conectada a dois reservatórios de eluentes contendo:

A: 10mM de NH4OH em água;

B: 10mM de NH4OH em 90% de acetonitrila.

[00185] A análise foi realizada a 23° C injetando um volume apropriado da amostra (preferivelmente 20 p1) na coluna que é eluída com um gradiente de A e B.

[00186] As condições de HPLC, ajustes de detector e ajustes de espectrômetro de massa usados são dados na tabela seguinte.

Coluna Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 m;

Gradiente 5% -100% de acetonitrila linear durante 6,5 min a 1,5m1/min; Detecção 210 nm (emissão de análogo a partir de DAD);

ELS (emissão de análogo a partir de ELS);

MS ionização modo API-ES. Scan 100-1000 amu step 0,1 amu;

Ligação radioligante a membranas de plasma expressando o receptor de GLP-1 humano.

[00187] O ensaio de ligação foi realizado com membranas de plasma purificadas contendo o receptor de GLP-1 humano. As membranas de plasma contendo os receptores foram purificadas a partir de 13 células expressando estavelmente BHK tk-ts. As membranas foram diluídas em Tampão de Ensaio (50 mM de HEPES, 5 mM de EGTA, 5 mM de MgC12, 0,005% de Tween 20, pH=7,4) para uma concentração final de 0,2 mg/ml de proteína e distribuídas para placas de microtítulo de 96 poços pré-revestidas com 0,3 % de PEI.

[00188] Membranas na presença de 0,05 nM [1251]GLP-1, ligantes não marcados em concentrações crescentes e diferentes concentrações de HSA (0,005%, 0,05%, e 2%) foram incubadas 2 hr a 30°C. Depois de incubação, ligantes não ligados foram separados de ligantes ligados por filtração através de um coletor de vácuo seguido

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56/75 por lavar 2X100 pl com tampão de ensaio congelado. Os filtros foram secos durante a noite a RT, registrados e quantificados em um contador y.

[00189] Exemplo 1

H 9 H 9

NH-H-N^-E GTFTSDVSSYLEGQA A-N^-E F I AWLVRGR G—

O

N-e²⁶ (17-carboxiheptadecanoil)-[Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1 -(7-37)-peptídeo [00190] Uma resina (Fmoc-Gly-NovaSyn TGT, 0,22 mmol/g Novabiochem 0,25 mmole) foi usada para produzir a seqüência primária em uma máquina AB1433A de acordo com orientações de fabricante. Todos os grupos de proteção foram ácidolábeis com a exceção do resíduo usado na posição 26 (FmocLys(ivDde)-OH, Novabiochem) permitindo desproteção específica desta lisina preferivelmente do que qualquer outra lisina.

[00191] Procedimento [00192] A resina (0,09 mmole) foi colocada em um equipamento manual de agitação/filtração e tratada com 4% de hidrazina em N-metil pirrolidona em (4x10 min. 4x4 ml) para remover o grupo ivDde. A resina foi lavada com N-metil pirrolidona (3x4 ml). Ácido octadecanodióico mono-(2,5-dioxopirrolidona-1-il)éster) (4 equivalentes molares em relação a resina) foi dissolvido em DMF (4m1).

[00193] A solução foi adicionada à resina e diisopropiletilamina (8 equivalentes molares em relação à resina) foi adicionada. A resina foi agitada 24 horas em temperatura ambiente. A resina foi lavada com N-metil pirrolidona (4x4 ml) e DCM (4x4m1). O peptídeo foi clivado da resina agitando por 180 min em temperatura ambiente com uma mistura de ácido trifluoracético, água e triisopropilsilano (92,5:5,0:2,5 4 ml).A mistura de divagem foi filtrada e o peptídeo bruto foi precipitado de 40 ml de dietil éter e lavado 3 vezes com 45 ml de dietil éter. O peptídeo bruto foi purificado por HPLC preparativo em uma coluna de 20 mm x 250 mm embalada com sílica C-18 de 7 μ. O peptídeo bruto foi dissolvido em 5 ml de 50% ácido acético em água e diluído para 20 ml com H20 e injetado na coluna que então foi eluída com um gradiente de 25-65 % (CH3CN em água com 0,1% de TFA) 20 ml/min durante 40

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57/75 min a RT. As frações contendo peptídeo foram coletadas. O peptídeo purificado foi liofilizado depois de diluição do eluato com água.

HPLC (método B4): RT= 9,94 min (91%);

LCMS: m/z = 1232 (MH33+) Calculado para (MH33+) = 1232.

[00194] Exemplo 2 o o ^H II ^H II ^NH2~H—E GTFTSDVSSYLEGQA --E F I AWLVRGR G

ΗΟ .ΝΗ

N-e²⁶-(19-carboxinonadecanoil)-[Aib⁸,Arg³⁴PLP-1-(7-37)-peptídeo

Preparado como em Exemplo 1 e em conformidade com métodos sintéticos. HPLC (método B4): RT= 10,42 min (91%)

LCMS: m/z = 1242 (MH33+) Calculado para (MH33+) = 1242

Exemplo 3 [00195]

GTFTSDVSSYLEG

ΟΗ

N-e²⁶-(4-{[N-(2-carboxietil)-N-(15carboxipentadecanoil)amino]metil}benzoil[Arg³⁴]G LP-1 -(7-37)-peptídeo Para uma solução de 4-(N-(2-(terc-butoxicarbonipentil)-N-(15-(terc[00196] butoxicarbonil)pentadecanoil)aminometil)ácido benzóico (36 mg, 60 iimol) em THF (1 ml) foram adicionados DIPEA (7 pl) e 0-(1-succinimidil)-N,N,N',N'-hexafluorofosfato de tetrametilurônio (TSTU, 17 mg, 56 pl). Depois de agitar por 1 h em temperatura ambiente, a mistura foi diluída com THF (1 ml), e 1 ml da solução resultante foi adicionado a uma solução de [Arg³⁴]GLP-1-(7-37) peptídeo (aprox 100 mg) e DIPEA (103 μΙ) em água (5 ml). Depois de 0,5 h foi adicionado mais da solução THF de agente acilante (0,4 ml). Depois de agitar em temperatura ambiente por um total de 1,5 h a mistura de reação foi filtrada e aplicada a um HPLC preparativo (eluição de gradiente com 35-55% de MeCN/55-35% de água/10% de água com 1% de TFA).

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Frações contendo o produto desejado foram combinadas e liofilizadas. O produto foi então tratado com 25 ml de uma mistura de TFA e água (95/5 vol) por 15 min em temperatura ambiente, concentrado, e purificado mais uma vez por HPLC. 15,4 mg do composto título foram obtidos.

HPLC (método B4): RT = 9,41 min (99%);

LCMS: m/z = 1287 (MH33+) Calculado para (MH33+): 1287.

[00197] Exemplo 4

N-e²⁶-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1-(7

37)peptídeo.

[00198] [Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1-(7-37)-peptídeo foi preparado por síntese de peptídeo de fase sólida de Fmoc padrão e purificado por HPLC preparativo. [Aib⁸,Arg³⁴]GLP1-(7-37)-peptídeo foi dissolvido em água (15m1) e DIPEA (50u1) foi adicionado. 17((S)-1 -terc-Butoxicarbonil-3-{2- [2-({242-(2,5-dioxopirrolid in-1 -iloxicarbonilmetoxi) etoxi]etilcarbamoil}metoxi)etoxi]etilcarbamoil}propilcarbamoil)ácido heptadecanóico terc-butil éster (21 mg) foi dissolvido em acetonitrila/água 2:1 (1.5 ml) e adicionado em pequenas porções. A reação foi monitorada por HPLC. Quando não foi mais encontrado [Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1-(7-37)- peptídeo a mistura de reação foi liofilizada 0/N. Ao composto isolado foi adicionado 10 ml de 90% de TFA / 5% de TIS/ 5% de água e a mistura de reação foi constante por 2 horas, evaporada a vácuo, e co-evaporada com heptano. O óleo residual foi dissolvido em 15m1 de água contendo 1 % de NH3-aq e purificado por HPLC preparativo para gerar o composto título.

HPLC (método B4): RT = 9,60 min (100%);

LCMS: m/z = 1372 (MH33+) Calculado para (MH33+): 1372.

[00199] Exemplo 5

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N-e²⁶-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(19-Carboxinonadecanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1-(737)peptídeo.

[00200] O peptídeo foi preparado de acordo com: A. Síntese de peptídeo ligado em resina em escala de 0,25 mMol em uma resina Fmoc-Gly-Wang (0,66 mmol/g Novabiochem) foi usada para produzir a seqüência primária em uma máquina AB1433A de acordo com orientações de fabricante. Todos os grupos de proteção foram ácido-lábeis com a exceção do resíduo usado na posição 26 (FmocLys(Mtt)OH, Novabiochem) que é super ácido-lábil, permitindo desproteção específica desta lisina preferivelmente do que qualquer outra lisina.

[00201] Procedimento para remoção de proteção por Mtt. A resina (0,25 mmol) foi colocada em um equipamento manual de agitação/filtração e tratada com 2% de TFA, 3% de TIS em DCM (20 ml, 5-10 min repetido 6-12 vezes) para remover o grupo Mtt e lavar com DMF. Síntese foi continuada com Procedimento para acoplamento de cadeias laterais para resíduo de Lisina, seguindo Via II, com o Procedimento para remoção de proteção por Fmoc apropriado. Desproteção final, purificação por HPLC e análise por HPLC e LC-MS de acordo com os procedimentos.

HPLC (método B6): RT = 34,56 min (100%);

LCMS: m/z = 1381,8 (MH33+) Calculado para (M+H+): 4142,7.

[00202] Exemplo 6

N-e²⁶-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)

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60/75 carboxibutirilam ino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][3-(4lmidazolil)Propionil⁷,Arg³⁴]GLP-1-(7-37)peptídeo.

[00203] Preparado como em Exemplo 5 e em conformidade com métodos sintéticos. HPLC (método B6): RT = 32,89 min (100%).

[00204] LCMS: m/z = 1362,3 (MH33+) Calculado para (M+H+): 4085,6.

[00205] Exemplo 7

N-e²⁶-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)(Carboximetilamino)acetilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Arg³⁴]G LP-1-(7- 37)peptídeo.

[00206] Preparado como em Exemplo 5 e em conformidade com métodos sintéticos.

HPLC (método B6): RT = 32,67 min (100%);

LCMS: m/z = 1367,3 (MH33+) Calculado para (M+H+): 4100,6.

[00207] Exemplo 8

N-e²⁶-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-3(S)Sulfopropionilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1-(737)peptídeo [00208] Preparado como em Exemplo 5 e em conformidade com métodos sintéticos.

HPLC (método B6): RT = 32,04 min (100%);

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LCMS: m/z = 1379,8 (MH33+) Calculado para (M+H+): 4136,7.

[00209] Exemplo 9

NHjHO.

o ^0;

ΌΗ 'Ν'

H

-N.

0'

-O.

N-e²⁶-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)carboxibutinlamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Gly⁸,Arg³⁴]GLP-1-(737)peptídeo.

[00210] [Gly⁸,Arg³⁴]GLP-1(7-37) peptídeo começando de 150 mg de resina de 2clorotritiI cloreto (1,4 mmol/g) foi preparado por síntese de peptídeo de fase sólida de Fmoc usando Apex396 de Advanced Chemtech. O resíduo de Lys na posição 26 foi protegido como Lys(ivDde) enquanto as cadeias laterais funcionais para os outros aminoácidos foram protegidas com grupos de proteção ácido-lábeis padrão. O resíduo de Lys foi desprotegido com 3% de hidrazina/3% de piperidina em NMP por 1 hr. Então, as duas unidades de 8-amino-3,6-ácido dioxaoctanóico, y-ácido glutâmico e ácido octadecanodióico foram acopladas ao peptídeo acoplado à resina usando DIC/HOAt. O peptídeo foi finalmente desprotegido e clivado da resina com TFA/TIS/H20/tioanisol (90/5/3/2). O peptídeo foi isolado por LC-MS.

HPLC: Elui a 46% de acetonitrila;

MALDI: 4087 (MH+).

[00211] Exemplo 10

N-e²⁶-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1-(7- 37)amida.

[00212] [Aib⁸,34]GLP-1 (7-37) amida começando de 200 mg de resina Tentagel RAM S (0,26 mmol/g) foi preparada por síntese de peptídeo de fase sólida de Fmoc usando Apex396 de Advanced Chemtech. O resíduo de Lys na posição 26 foi

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62/75 protegido como Lys(ivDde) enquanto as cadeias laterais funcionais para os outros aminoácidos foram protegidas com grupos de proteção ácido-lábeis padrão. O resíduo de Lys foi desprotegido com 3% de hidrazina/3% de piperidina em NMP por 1 hr. Então, as duas unidades de,8-amino-3,6-ácido dioxaoctanóico, y-ácido glutâmico ácido octadecanodióico foram acopladas ao peptídeo acoplado à resina usando DIC/HOAt. O peptídeo foi finalmente desprotegido e clivado da resina com TFA/TIS/H20/tioanisol (90/5/3/2). O peptídeo foi isolado por LC-MS.

HPLC: Elui a 49% de acetonitrila;

MALDI: 4114 (MH+).

N-e²⁶-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Arg³⁴,Pro³⁷]GL P-1(7-37)amida [00214] O peptídeo foi preparado em uma resina de amida Rink (0,70 mmol/g Novabiochem) e também como em Exemplo 5 e em conformidade com métodos sintéticos.

HPLC (método B6): RT = 32,13 min (100%). (método Al): RT = 44,33 min (98,4%) LCMS: m/z = 1385,3 (MH33+) Calculado para (M+H+): 4153,8.

[00215] Exemplo 12

G· [00216] Aib⁸,Lys28(N-E28-{2-(2-(2-(242-(2-(4-(pentadecanoilamino)-4carboxibutirilamino)etoxi)etoxi]acetipetoxi)etoxi)acetil))),Arg³⁴)GLP-1 H(7-37)-OH

HPLC (método B6): RT= 30,41 min;

LCMS: m/z = 1362,9 (MH33+) Calculado para (M+) = 4085,61.

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63/75 [00217] Exemplo 13

N-e²⁶'[2-(2[2-(2[2-(2[4-{[N-(2-carboxietil)-N-(17carboxiheptadecanoil)amino]metil}benzoil)amino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)a cetil][Aib⁸, Arg³⁴]GLP-1 (7-37) [00218] [Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1(7-37) peptídeo começando de 150 mg de resina de 2clorotritiI cloreto (1,4 mmol/g) foi preparado por síntese de peptídeo de fase sólida de Fmoc usando Apex396 de Advanced Chemtech. O resíduo de Lys na posição 26 foi protegido como Lys(ivDde) enquanto as cadeias laterais funcionais para os outros aminoácidos foram protegidas com grupos de proteção ácido-lábeis padrão. O resíduo de Lys foi desprotegido com 3% de hidrazina/3% de piperidina em NMP por 1 hr. As duas unidades de 8-amino-3,6-ácido dioxaoctanóico e 4{[(2-tercbutoxicarboniletil)-(17-terc-butoxicarbonil-heptadecanoil)-amino]-metil}-ácido benzóico foram acoplados ao peptídeo acoplado à resina usando DIC/HOAt. O peptídeo foi finalmente desprotegido e clivado da resina com TFA/TIS/H20/tioanisol (90/5/3/2). O peptídeo foi isolado por LC-MS preparativo.

HPLC: Elui a 52% de acetonitrila;

MALDI: 4191 (MH+).

[00219] Exemplo 14

N-a⁷-formil, N-e²⁶-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Arg³⁴]GLP-1-(7-37)peptídeo

HPLC (método B6): RT= 32,6 min;

LCMS: m/z = 1377,3 (MH33+) Calculado para (M+) = 4128,0.

[00220] Exemplo 15

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64/75

N-e²⁶26-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Glu²²,Arg³⁴]GL P-1(7-37)peptídeo.

[00221] [Aib⁸,Glu²²,Arg³⁴]GLP-1(7-37) peptídeo começando de 150 mg de resina

Fmoc-Gly-Wang (0,66mmol/g) foi preparado por síntese de peptídeo de fase sólida de Fmoc usando Apex396 de Advanced Chemtech. O resíduo de Lys na posição 26 foi protegido como Lys(Mtt) enquanto as cadeias laterais funcionais para os outros aminoácidos foram protegidas com grupos de proteção ácido-lábeis padrão. O resíduo de Lys foi desprotegido com 2% de TFA/270 de TIS em DCM por 4 x 5 min. As duas unidades de 8-amino-3,6-ácido dioxaoctanóico, y-glutâmico e ácido octadecanóico tertbutil éster foram acoplados ao peptídeo acoplado à resina usando DIC/HOAt. O peptídeo foi finalmente desprotegido e clivado da resina com TFA/TIS/H20/tioanisol (90/5/3/2). O peptídeo foi isolado por LC-MS.

HPLC: Elui a 50% de acetonitrila;

MALDI: 4187 (MH+).

[00222] Exemplo 16

N-e²⁶{3[2-(2-{2[2-(2-{2[2-(2[4-(15-(N-((S)-1,3-dicarboxipropil)carbamoil) pentadecanoilamino)-(S)-4- carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]etoxi}etoxi) etoxi]etoxi}etoxi)etoxi]propionil}[Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1-(7-37)-peptídeo [00223] Método e análise [00224] Preparado como em Exemplo 3 e em conformidade com métodos sintéticos.

HPLC (método B4): RT = 10,29 min (92%);

LCMS: m/z = 1450 (MH33+) Calculado para (MH33+): 1450.

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65/75 [00225] Exemplo 17

N-£²⁶-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-{[N-(2-carboxietil)-N-(17- carboxiheptadecanoil) amino]metil}benzoil)amino]4(S)- carboxibutirilamino)etoxi)etoxi] acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1 (7- 37) [00226] [Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1(7-37) peptídeo começando de 150 mg de resina FmocGly Wang (0,66mmol/g) foi preparado por síntese de peptídeo de fase sólida de Fmoc usando Apex396 de Advanced Chemtech. O resíduo de Lys na posição 26 foi protegido como Lys(Mtt) enquanto as cadeias laterais funcionais para os outros aminoácidos foram protegidas com grupos de proteção ácido-lábeis padrão. O resíduo de Lys foi desprotegido com 2% de TFA/2% de TIS em DCM por 4 x 5 min. As duas unidades de 8-amino-3,6-ácido dioxaoctanóico, y-ácido glutâmico e 4{[(2terc-butoxicarbonil etil)-(17-terc-butoxicarbonil-heptadecanoil)-amino]-metil}-ácido benzóico foram acopladas ao peptídeo acoplado à resina usando DIC/HOAt. O peptídeo foi finalmente desprotegido e clivado da resina com TFA/TIS/H20/tioanisol (90/5/3/2). O peptídeo foi isolado por HPLC preparativo.

HPLC: Elui a 51% de acetonitrila;

MALDI: 4320 (MH+).

[00227] Exemplo 18

N-s²⁶-{(S)-4-carboxi-4-((S)-4-carboxi-4-((S)-4-carboxi-4-((S)-4-carboxi-4(19- carboxinonadecanoilamino)butirilamino)butirilamino) butiriIam ino)butiriIam inollAib⁸,Arg 34]GLP-1 -(7-37) [00228] O peptídeo foi sintetizado usando química Fmoc em um Sintetizador de Peptídeo Liberty Microwave (CEM Corporation). A síntese foi realizada em uma

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66/75 resina Gly-Wang (Novabiochem) com uma carga de 0,66 mmol/g usando excesso de 4 vezes de aminoácidos e DIC/HOAt para acoplamento. A histidina N terminal foi protegida com Boc e a lisina a ser modificada foi protegida com Mtt. Depois de síntese do esqueleto de peptídeo, o grupo Mtt foi removido com 3% de TFA em DCM e a cadeia lateral foi construída no Liberty usando protocolos de síntese de peptídeo padrão. Na última etapa o diácido graxo foi adicionado como um mono-t-butiléster. [00229] Depois de divagem com TFA/TIS/água (95:2,5:2,5), o peptídeo foi dissolvido em 50% de acetonitrila por adição de DIPEA e purificado em um sistema Waters LC-MS usando uma coluna de 7,8 x 300 mm X-Terra Prep MS C18 10 pm correndo em temperatura ambiente. Depois de 5 minutos a 30% de CH3CN, 0,08% de TFA, 4 ml/min, a coluna foi eluída com um gradiente linear de 30 a 70% de CH3CN por 40 minutos. As frações contendo o composto desejado foram coletadas e a concentração do peptídeo no eluato foi determinada por mensuração da absorção de UV em 280 nm assumindo coeficientes de extinção molar de 1280 e 3690 para tirosina e triptofano respectivamente. A identidade e pureza foram confirmadas por MALDI. Depois da determinação da concentração o eluato foi aliquotado em frascos contendo a quantidade desejada e seco por centrifugação a vácuo.

HPLC: Elui a 52% de acetonitrila MALDI: 4239 (MH+)

N-s²⁶-4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutiril4Aib⁸,Arg³⁴p

LP-1 -(7-37)- peptídeo [00231] Método e análise [00232] Preparado como em Exemplo 4 e em conformidade com métodos sintéticos.

HPLC (método B4): Rt = 9,64 min (97 %);

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LCMS: m/z: = 1276 (MH33+) Calculado para (MH33+) 1276.

[00233] Exemplo 20

A W L V R G R G---^co°

N-e²⁶-{3[2-(2-{2[2-(2-{2[2-(2[4-(17-carboxiheptadecanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]etoxi}etoxi)etoxi]etoxi}etoxi)etoxi]propionil}[Aib⁸,Arg³⁴p LP-1-(7- 37)-peptídeo.

LCMS*: m/z: = 1417 (MH33+), Calculado para (MH33+) 1417;

*HPLC (Eluiu a 0,5 mL/min a 42°C por um gradiente linear de 5 —>80% de acetonitrila, 85—>10% de água e 10% de uma solução de 1,0% de ácido trifluoracético por 50min. Detecção de UV em 214 em uma coluna Symmetry300, 5um, 3,9 mm x 150 mm C-18 sílica)método B4): Rt = 32,09 min (95 %).

[00234] Exemplo 21

O 0 0 H₃C CH₃ h—H-N^J—_E GTFTSDVSSYL E-N^J-q _{a A}nJ--N ''|pI

H₃C ch₃ H₃C CH₃ I

O^. .OH oo _N ^N Q ⁰ _N ⁰ QN H

H II HII oo

N-s²⁶-{2-(2-(2-(2[2-(2-(4-(17-carboxiheptadecanoilamino)-4carboxibutirilamino)etoxi)etoxi]acetipetoxi)etoxi)acetil)}4Aib⁸'22'27'35,Arg³⁴,Pro³⁷, Lys26] GLP-1 (7-37)amida.

HPLC (método B6): RT= 35,0 min;

LCMS: mlz = 1394,0 (MH33+) Calculado para (M+) = 4180,0.

Exemplo 22

Oo >₂—H-N^Le GTFTSDVSSY LEGQA Α-Ν^^Λε FiAWLVRG R Gc°° h₃c ch₃L

HO.

O [00235]

o.

OH

N-e²⁶[2-(2[2[4-(21 -Carboxiuneicosanoilamino)-4(S)- carboxibutirilamino] etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1 -(7-37) Preparado usando o mesmo método que em Exemplo 19.

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HPLC: Elui a 53,4% de acetonitrila MALDI: 4025 (MH+).

[00236] Outros compostos desta invenção incluem:

H ⁰ H ⁰ —H——E GTFTSDVSSY LEGQA A—FiaWLVRG R G---cooh

N-e²⁶[2-(2[2-(2[2-(2[4-(21 -Carboxiuneicosanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1 -(737)peptídeo.

N-a1-formil-N-e²⁶[2-(2[2-(2[2-(2[4-(19-Carboxinonadecanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi] acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Arg³⁴]G LP-1 -(737)peptídeo.

Η ⁰ Η O ^-H-N^E GTFTSDVSSY LEGQA Α-Ν^ΛΕ FIAWLVRGR G--cooh

H G EGTFTSDVSSY L EGQ A A-NJ-e _F,_{AWL VRG} R G--=o„„

Η Ο η O

1,-H-N^ÃE GTFTSDVSSY LEGQA A-N^Ae FIAWLVRGR G--

Η O

L—H G EGTFTSDVSSY LEGQA AN^Ãe FIAWLVRGR G--

H ?

H G EGTFTSDVSSY LEGQA A—N^^E FIAWLVRGR G--cooh

h₃c ch₃

G-----cooh

H ^NYS—V

0 o

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R

O

H

Η O

S Y L E G Q A A-N,>E F I A W L V R G

O

O Ó Ό

R G—cooh

O

H

Q----COOH

G----COOH

H ^N^O

HOOC

H o_a_n^^o^o^y^nh

Η O ~γΝΗ o

2—H G EGTFTSDVS

COOH

E GTFTSDVSSYLEGQA AN^E FIAWLVRGR G--=°°

H₃CCH, HOOC [00237] Estudo farmacodinâmico usando camundongos db/db

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70/75 [00238] Em um aspecto desta invenção os agonistas de GLP-1 têm uma duração de ação de pelo menos 24hrs depois de dosagem de 30nmol/kg para camundongos db/db [00239] A eficácia e duração de ação são medidas em camundongos db/db.

[00240] Camundongos db/db machos são enviados de Taconic, Dinamarca na idade de 8-10 semanas. A partir da hora de chegada, os camundongos são alojados sob condições padrão mas a 24 °C. Os camundongos são mantidos em 10 por gaiola até experimento com acesso livre a comida padrão (Altromin, Brogaarden APS., Denmark) e água de torneira em um dia normal: ciclo de luz (luz às 6 am). Os camundongos são usados para 1 experimento por semana por 3 semanas. Depois disso, os camundongos são eutanizados.

[00241] Depois de um período de aclimatação de 1 semana, a glicose sanguínea é medida por amostragem do capilar da ponta da cauda. Em resumo, 5 μΙ de sangue é amostrado em tubos capilares de vidro heparinizado e imediatamente suspenso em 250 μΙ de solução tampão EBIO (Eppendorf, Germany) em um tubo Eppendorf de 1,5 ml. A concentração de glicose no sangue é medida pelo método de glicose oxidase no analisador EBIO Plus Auto (Eppendorf, Germany).

[00242] O corte de valor para glicose sanguínea é 10 mM. Ao avaliar os camundongos, é essencial, que todos os 42 camundongos que entram no experimento tenham valores de glicose sanguínea acima de 10 mM, mas também que a variância entre camundongos seja pequena. Portanto, se muitos camundongos não são severamente diabéticos, ao passo que alguns são, o começo dos experimentos deve ser postergado uma semana e novas medidas basais de glicose sanguínea serem feitas.

[00243] Baseado nos valores basais de glicose sanguínea, os camundongos são alocados em 7 grupos de n=6 com valores de glicose sanguínea médios de grupo compatível.

[00244] No dia de teste os valores matinais basais de glicose sanguínea são verificados como descrito acima e o peso corporal basal de cada camundongo é verificado. Em tempo 0, o composto é dosado subcutaneamente na nuca do

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71/75 pescoço (volume de dosagem ap. 300 μΙ/50 g de camundongo).

[00245] Os valores de glicose sanguínea são acompanhados até 48 horas (tempo

1,3, 6, 24 e 48 h) e o peso corporal terminal é verificado.

[00246] Todos os dados são colocados em Graphpad Prism onde glicose sanguínea média e pesos corporais delta médios são calculados.

[00247] Um aspecto desta invenção é preparar análogos/derivados de GLP-1 com meias-vidas no plasma estendidas que são adequados para administração uma vez por semana. As propriedades farmacocinéticas podem ser avaliadas em minisuínos ou suínos domésticos como descrito abaixo

Triagem farmacocinética de análogos de GLP-1 uma vez por semana [00248] Triagem farmacocinética de análogos de GLP-1 para identificação de candidatos uma vez por semana adequados foi realizada em candidatos que de acordo com os planos de seleções de projeto mostraram ser suficientemente potentes com respeito a potencial de redução de glicose em um modelo de camundongo diabético (camundongos db/db) e subseqüentemente tiveram um tempo de duração de 48 horas ou mais no modelo de camundongo db/db.

Triagem primária [00249] A primeira parte da triagem farmacocinética consistiu de administração subcutânea de uma única dose de 2 nmol/kg para três minisuínos pesando 8-12 kg. Amostras de sangue foram extraídas de cada animal em pré-dose, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas após injeção. Todas as amostras de sangue foram estabilizadas com um tampão de estabilização especial consistindo de:

[00250] EDTA (di-sódio) 0,18 M, Aprotenina 15000 KIE/ml, Val-Pyr 0,30 mM, pH ajustado para 7,4 a fim de prevenir degradação enzimática dos análogos de GLP-1. Plasma foi coletado de cada uma das amostras de sangue estabilizadas por centrifugação (4°C, 10 min., 1270 G (4000 rpm)), e analisado para o teor de análogo de GLP-1 por ensaios ELISA. Três ensaios ELISA diferentes foram usados para a análise de plasma: O Ensaio total usando a combinação de anticorpo F1/Ra2135 detectando tanto a molécula 7-37GLP-1 intacta N-terminalmente como a molécula 937GLP-1 N-terminal enzimaticamente degradada com um limite de detecção (LOD)

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72/75 de 35 pM e uma extensão analítica dinâmica de 35-30000 pM. O Ensaio intacto usando a combinação de anticorpo F1/Mab26.1. Este ensaio foi detectar molécula 737GLP-1 intacta N-terminalmente apenas. O LOD foi 35 pM e uma extensão analítica dinâmica de 35-30000 pM. O Ensaio de Aib-intacto usando a combinação de anticorpo F1/GLP162-3F15. Este ensaio foi detectar o N-terminal estabilizado de Aib da molécula de GLP-1 possibilitando detecção de análogos de GLP-1 estabilizados. O LOD foi 45 pM e a extensão analítica dinâmica 45-30000 pM.

[00251] Todos os perfis de concentração-tempo no plasma foram analisados farmacocineticamente por uma análise não compartimental. Os seguintes parâmetros farmacocinéticos foram calculados se dados permitiram: tmax, Cmax, AUC, AUC/Dose, AUCO/OExtrapoi, Az, t1/2, CUF, VziF e MRT.

Triagem secundária [00252] Uma segunda parte da triagem farmacocinética foi conduzida naqueles compostos com uma meia vida terminal inicial de 60-70 horas ou mais. Esta triagem consistiu de administração intravenosa e subcutânea de uma única dose de 2 nmol/kg para seis minisuínos por cada via de administração. O cronograma de amostragem sanguínea foi prolongado de 0-120 horas para 0-432 e 0504 horas depois de administração intravenosa e subcutânea respectivamente. Isto foi feito a fim de aumentar a precisão e acurácia das estimativas de parâmetro farmacocinético, especialmente a meia vida terminal, AUC e os parâmetros derivados depuração e volume de distribuição, e para estimar a biodisponibilidade depois de administração subcutânea.

ENSAIO DE GLP-1 (Aib⁸- INTACTO) [00253] O ensaio foi um ensaio de dois sítios com incubação simultânea do analito com anticorpo receptor e detector. Um substrato quimioluminescentes pronto para usar foi usado para maximizar sinal. O ensaio não reconhece GLP-1 (7-37) endógeno nem o GLP-1 (9-37) clivado com DPPIV.

Plasma de referência para ensaios de GLP-1 [00254] 0-plasma foi preparado a partir de plasma EDTA combinado sem Valina Pirrolidida e Aprotinina de animais em jejum. O plasma EDTA combinado foi

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73/75 incubado a 37°C por 4 horas para remover traços de GLP-1 e depois de incubação Valina Pirrolidida e Aprotinina foram adicionadas.

Tampões [00255] Tampão de revestimento [00256] PBS foi usado como tampão de revestimento: 10mM de fosfato de sódio e 145mM de cloreto de sódio ajustado para pH 7,4.

[00257] Tampão de lavagem [00258] PBS com 0,05% (v/v) de Tween 20 [00259] Tampão de ensaio [00260] PBS com 0,05% (v/v) de Tween 20, 10g/L de BSA e 10mg/L de anti-TNP.

[00261] Tampão de estreptavidina [00262] Tampão de lavagem com um 0,5M de NaCl adicional.

[00263] Substrato [00264] Substrato SuperSignal ELISA Femto (Pierce, cat.no. 37075) pronto para usar.

Padrões [00265] Padrões foram preparados a partir de uma solução estoque de 25 μΜ de 0113-0000-0217. O peptídeo foi diluído serialmente em plasma de referência para fazer padrões com concentrações finais de 30000 10000-3333-1111-370-123-41 e 0 pM. Padrões foram armazenados em tubos Micronic em alíquotas de 100pL a -20°C.

Procedimento de ensaio [00266] Microplacas Crystal 2000 (pretas) foram revestidas com anticorpo monoclonal GLPb1-7F1, 100pL de 5 pg/mL em PBS durante a noite a 4°C.

[00267] Placas foram lavadas 5 vezes com tampão de lavagem em um lavador de placas automático (SkanWasher, Skatron) e permitidas para permanecer por pelo menos 30min. com tampão de lavagem para bloquear sítios remanescentes.

[00268] 20pL de amostra ou padrão foram adicionados a cada poço em duplicata imediatamente seguido por 100pL de GLP162-3F15 biotinilado, 1 pg/mL em tampão de ensaio. Placas foram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente em um agitador de placa seguido por 5 ciclos de lavagem como previamente descrito.

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100μΙ_ de solução de estreptavidina-peroxidase (KPL, código 14-30-00, 1:20000 em tampão de estreptavidina) foram adicionados a cada poço e incubados por 1 hora em temperatura ambiente em um agitador de placa. Placas foram lavadas como previamente descrito e depois de esvaziar 100μΙ_ de SuperSignal femto foram adicionados. Placas foram postas em um agitador por 1 minuto e medidas em Luminômetro Orion (Berthold). Dados foram transferidos para MultiCalc e curvas padrão calculadas usando o método de 4PL pesado. Concentrações de amostras foram calculadas a partir da curva padrão.

[00269] ENSAIO DE GLP-1 (TOTAL) [00270] O ensaio foi um ensaio de dois sítios com incubação simultânea do analito com anticorpo receptor e detector. O ensaio não reconhece GLP-1 clivado Nterminalmente até GLP-1 (12-37). Tampões [00271] Tampão de revestimento [00272] PBS foi usado como tampão de revestimento: 10mM de fosfato de sódio e 145mM de cloreto de sódio ajustado para pH 7,4.

[00273] Tampão de lavagem [00274] PBS com 0,05% (v/v) de Tween 20 [00275] Tampão de ensaio [00276] PBS com 0,05% (v/v) de Tween 20, 10g/L de BSA e 10mg/L de anti-TNP. [00277] Tampão de estreptavidina [00278] Tampão de lavagem com um 0,5M de NaCI adicional.

[00279] Substrato [00280] Substrato TMB (KemEnTec código 4380A) pronto para usar [00281] Tampão de parada [00282] 4 Μ H3PO4 [00283] Padrões [00284] Padrões foram preparados a partir de uma solução estoque de 25 μΜ de 0113-0000-0217. O peptídeo foi diluído serialmente em plasma de referência para fazer padrões com concentrações finais de 30000 10000-3333-1111-370-123-41 e 0 pM. Padrões foram armazenados em tubos Micronic em alíquotas de 100pL a -20°C.

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75/75 [00285] Procedimento de ensaio [00286] Placas de microtítulo Maxisorp (NUNC) foram revestidas com anticorpo monoclonal GLPb1-7F1, 10OpL de 5 pg/mL em PBS durante a noite at 4°C.

[00287] Placas foram lavadas 5 vezes com tampão de lavagem em um lavador de placas automático (SkanWasher, Skatron) e permitidas para permanecer por pelo menos 30min. com tampão de lavagem para bloquear sítios remanescentes.

[00288] 20pL de amostra ou padrão foram adicionados a cada poço imediatamente seguido por 100pL de Ra2135- biotinilado, 1 pg/mL em tampão de ensaio. Placas foram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente em um agitador de placa seguido por 5 ciclos de lavagem como previamente descrito.

[00289] 100pL de solução de estreptavidina-peroxidase (Amersham Bioscinces código RPN4401 V, 1:8000 em tampão de ensaio) foram adicionados a cada poço e incubados por 1 hora em temperatura ambiente em um agitador de placa. Placas foram lavadas como previamente descrito e depois de esvaziar 100gL de TMB foram adicionados e depois de 5 minutos paradas com 10OpL de H3PO4.

[00290] Placas foram medidas em Victor Multilabel Reader (Wallac). Dados foram transferidos para MultiCalc e curvas padrão calculadas usando o método de 4PL pesado. Concentrações de amostras foram calculadas a partir da curva padrão.

[00291] Os procedimentos experimentais em vida, análise de plasma e análise farmacocinética foram idênticas àqueles descritos sob a triagem primária.

[00292] Formulação farmacêutica:

[00293] Um composto da invenção pode ser formulado como:

[00294] Composto de exemplo 4 6,25 mg/ml [00295] Propilenoglicol 14,0 mg/ml [00296] Fenol 5,5 mg/ml [00297] Tampão Fosfato pH 8,15 [00298] Opcionalmente o composto é tratado com calor e/ou base antes de formulação como descrito em PCT/ EP2005/055946.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Análogo de GLP-1, caracterizado pelo fato de que é:

G •COOH

HO

N-e²⁶-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1-(737)peptídeo;

ou ^ΗΟχ

O

O'

Ό'

N-e²⁶-{3[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-[4-(17-carboxiheptadecanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]etoxi}etoxi)etoxi]etoxi}etoxi)etoxi]propionil}[Aib⁸,Arg³⁴p LP-1-(7- 37)-peptídeo;

N-e²⁶-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(19-Carboxinonadecanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1-(737)peptídeo;

ou

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2/4

N-e²⁶-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][3-(4lmidazolil)Propionil⁷,Arg³⁴]GLP-1-(7-37)peptídeo;

ou

N-e²⁶-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)(Carboximetilamino)acetilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Arg³⁴]G LP-1-(7- 37)peptídeo;

ou

N-e²⁶-[(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-3(S)Sulfopropionilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1-(737)peptídeo;

ou

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3/4

N-e²⁶-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1-(7- 37)amida;

ou

N-a⁷-formil, N-e²⁶-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)4(S)- carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Arg³⁴]GLP-1-(7-

N-e²⁶26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Glu²²,Arg³⁴]GLP-1(7-37)peptídeo;

ou

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4/4

N-e²⁶[2-(2-[2-[4-(21 -Carboxiuneicosanoilamino)-4(S)- carboxibutirilamino] etoxi]etoxi)acetil][Aib⁸,Arg³⁴]GLP-1 -(7-37).

2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um composto como definido na reivindicação 1, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de ser adequada para administração parenteral.

4. Uso de um composto como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento.
5. Uso de um composto como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de hiperglicemia, diabete tipo 2, tolerância à glicose prejudicada, diabete tipo 1, obesidade, hipertensão, síndrome X, dislipidemia, distúrbios cognitivos, arteriosclerose, infarto do miocárdio, doença coronária cardíaca e outros distúrbios cardiovasculares, derrame, síndrome de intestino inflamatório, dispepsia e úlceras gástricas.
6. Uso de um composto como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para atrasar ou prevenir progressão de doença em diabete tipo 2.
7. Uso de um composto como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para diminuir consumo alimentar, diminuir apoptose de célula β, aumentar função de célula β e massa de célula β, e/ou para restaurar sensibilidade de glicose para células β.