TW202304500A - 升糖素樣肽化合物 - Google Patents

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金海 高
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喬維塔 馬辛克維奇安
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Abstract

本文提供了包含GLP-1化合物和脂肪酸或脂肪酸衍生物的新穎化合物、所述新穎化合物的製備及其用途。

Description

升糖素樣肽化合物
本文提供了包含GLP-1化合物和脂肪酸或脂肪酸衍生物的新穎化合物、所述新穎化合物的製備及其用途。該等新穎化合物表現出良好的藥理功效。
升糖素樣肽（GLP）1（GLP1）促效劑屬於一類重要的治療有效的化合物。GLP1促效劑通常用於治療2型糖尿病。已使用各種方法來修飾此類升糖素樣肽1（GLP1）化合物的結構，以防止快速生物降解，從而提供令人滿意的體內作用持續時間以及提高耐受性。
例如，WO 2006/097537（諾和諾德公司（Novo Nordisk））描述了GLP1化合物，相對於用一個部分（其中所述部分包含至少兩個酸性基團）對位置26的離胺酸殘基進行了醯化的序列GLP-1 (7-37)（SEQ ID NO: 1），該等GLP1化合物在位置7和/或位置8具有至少一個非天然胺基酸殘基的修飾。
WO 2015/200078（諾華股份有限公司（Novartis））揭露了軛合物，該軛合物包含經由連接子與脂肪酸連接的生物分子，例如GDF15。相應的軛合物可用於治療或預防代謝疾病或障礙。
本文提供了包含視需要經由連接子共價結合至式 (i) 之化合物的GLP-1或GLP-1類似物的化合物，或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image001
(i) 其中， R 1和R 2獨立地選自CH 3、OH、CO 2H、CH=CH 2和C≡CH； n和m各自是獨立地選自5至30的整數； 並且其中式 (i) 之化合物通過CO 2H基團之一共價結合。
本文所述之化合物通常可充當升糖素樣肽1受體（GLP1R）的促效劑。因此，該等化合物可用於治療疾病或障礙，包括但不限於：代謝疾病、障礙和病症，例如肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖、一或多種糖尿病併發症（包括但不限於慢性腎病）、糖尿病腎病、血脂異常、心血管疾病和神經病變。該等化合物也可能潛在地用於治療進行性肝病和神經病變。
定義
如本文所用，術語「肽」係指由藉由肽鍵連接的至少五個胺基酸構成的化合物。胺基酸可為天然存在的胺基酸以及非天然存在的胺基酸。一些肽可以全部由天然存在的胺基酸構成。一些肽可以全部由非天然存在的胺基酸構成。一些肽可以由天然存在的胺基酸和非天然存在的胺基酸的混合物構成。
術語「天然存在的」係指在自然界中發現且未受人為操縱的材料。類似地，如本文所用，「非天然存在的」、「非天然的」等係指在自然界中未發現或已被人在結構上修飾或合成的材料。
當與胺基酸一起使用時，術語「天然存在的」通常係指22種常規胺基酸，例如：丙胺酸（A或Ala）、半胱胺酸（C或Cys）、胱胺酸（CySS）、天冬胺酸（D或Asp）、麩胺酸（E或Glu）、苯丙胺酸（F或Phe）、甘胺酸（G或Gly）、組胺酸（H或His），異白胺酸（I或Ile），離胺酸（K或Lys），白胺酸（L或Leu），蛋胺酸（M或Met），天冬醯胺（N或Asn），脯胺酸（P或Pro），4-羥脯胺酸（O或Hyp）、麩醯胺酸（Q或Gln）、精胺酸（R或Arg）、絲胺酸（S或Ser）、蘇胺酸（T或Thr）、纈胺酸（V或Val）、色胺酸（W或Trp）和酪胺酸（Y或Tyr））。
如本文所用，術語「非天然存在的胺基酸」、「非天然胺基酸」和「非自然胺基酸」可互換地表示使用來自任何生物體的未修飾或經修飾的基因（無論相同或不同）無法在任何生物體中生物合成產生的胺基酸結構。該等包括但不限於不是上述22種天然存在的胺基酸之一的經修飾的胺基酸和/或胺基酸類似物。
非天然胺基酸的示例係γ-羧基麩胺酸、鳥胺酸、磷酸絲胺酸、D-胺基酸例如D-丙胺酸和D-麩醯胺酸。合成的非天然胺基酸包括藉由化學合成製造的胺基酸，即，胺基酸的D-異構物，例如D-丙胺酸和D-白胺酸、Aib（α-胺基異丁酸）、Abu（α-胺基丁酸）、Tle（三級丁基甘胺酸）、3-胺基甲基苯甲酸、鄰胺基苯甲酸、脫胺基組胺酸，胺基酸例如β-丙胺酸等的β類似物，例如D-組胺酸、脫胺基組胺酸、2-胺基-組胺酸、β-羥基-組胺酸、高組胺酸、Na-乙醯基-組胺酸、α-氟甲基-組胺酸、α-甲基-組胺酸、3-吡啶基丙胺酸、2-吡啶基丙胺酸或4-吡啶基丙胺酸、(1-胺基環丙基)甲酸、(1-胺基環丁基)甲酸、(1-胺基環戊基)甲酸、(1-胺基環己基)甲酸、(1-胺基環庚基)甲酸或(1-胺基環辛基)甲酸。
未說明旋光異構物的所有胺基酸應理解為係指L-異構物。
如本文所用，術語肽的「類似物」或「類同物」係指經修飾的肽，其中該肽的一或多個胺基酸殘基已被另一胺基酸殘基取代一次或多次和/或其中一或多個胺基酸殘基已從該肽中缺失和/或其中一或多個胺基酸殘基已添加至該肽。這種胺基酸殘基的添加或缺失可以發生在肽內的任何位置。例如，這種胺基酸殘基的添加或缺失可以發生在肽的N末端部分和/或肽的C末端部分。
如本文所用，術語「GLP-1」係指GLP-1 (7-37)（SEQ ID NO: 1）。
如本文所用，術語「GLP-1類似物」係指如上定義的GLP-1 (7-37)的類似物，其中術語「類似物」如上定義。例如[Arg 34]GLP-1 (7-37)Lys表示GLP-1 (7-37)類似物，其中GLP-1 (7-37)的位置34處的天然存在的離胺酸已經被精胺酸取代並且其中離胺酸已經被添加到末端胺基酸殘基，即GIy 37上。 進一步的實施方式
另一個實施方式提供了根據前述實施方式的式 (i) 之化合物，其為式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽：
Figure 02_image003
(I)， 其中， R 1和R 2獨立地選自CH 3、OH、CO 2H、CH=CH 2和C≡CH； n和m各自是獨立地選自5至30的整數； L係視需要的連接子，P係GLP-1或GLP-1類似物。
另一個實施方式提供了根據前述實施方式的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中GLP-1或GLP-1類似物（P）經由NH基團與視需要的連接子（L）結合。
另一個實施方式提供了根據前述實施方式的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽， 其中連接子（L）選自：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
、
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
、
Figure 02_image027
、
Figure 02_image029
、
Figure 02_image031
、和
Figure 02_image033
其中， y係選自1至36的整數； l係0、1、2、3、4、5或6； k係1、2或3； s係0、1、2或3； t係0、1、2、3或4； p係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23； 其中標記為**的波浪線表示與式 (I) 之CO-基團的附接，並且其中標記為***的波浪線表示與基團P的附接。
另一個實施方式提供了根據前述實施方式的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中 y係選自1至36的整數； l係2、3、4或5； k係1或2； s係0、1或2； t係0、1、2或3；以及 p係1、2、3、4、7、11或23。
另一個實施方式提供了根據前述實施方式的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中 y係選自1至36的整數； l係2、3、4或5； k係1或2； s係0、1或2； t係0或1；以及 p係1、2、3、4或11。
另一個實施方式提供了根據前述實施方式的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中連接子（L）選自：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image009
、和
Figure 02_image019
， 其中 y係選自1至36的整數， s係1，k係1，並且 其中標記為**的波浪線表示與式 (I) 之CO-基團的附接，並且其中標記為***的波浪線表示與基團P的附接。
另一個實施方式提供了根據前述實施方式的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中L選自：
Figure 02_image005
、
Figure 02_image009
、和
Figure 02_image019
， 其中： y係選自1至36的整數， s係0、1或2，且k係1、2或3，並且 標記為**的波浪線表示與式 (I) 之CO-基團的附接，並且 標記為***的波浪線表示與基團P的附接。
另一個實施方式提供了根據前述實施方式的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中連接子（L）選自：
Figure 02_image009
其中y係選自1至36的整數。
另一個實施方式提供根據前述實施方式的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中所述連接子的C(O)基團的碳原子附接至GLP-1或GLP-1類似物的離胺酸殘基的NH基團的氮原子。
另一個實施方式提供了根據前述實施方式的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中R 1和R 2獨立地選自CH 3、OH和CO 2H。
另一個實施方式提供了根據前述實施方式的式 (I) 之化合物，其為式 (II) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，
Figure 02_image040
(II) 其中 NH-P’表示經由NH-部分附接至連接子L的基團P（即GLP-1或GLP-1類似物）； R 1和R 2獨立地選自CH 3、OH和CO 2H； n和m各自是獨立地選自5至30的整數； 以及 y係選自1至36的整數。
在一個實施方式中，基團P（即，GLP-1或GLP-1類似物）對應於P’-NH 2，即具有游離-NH 2基團（其係胺基酸側鏈的一部分）的P基團，並且P經由所述-NH基團附接至連接子L。
另一個實施方式提供如上文所定義的式 (II) 之化合物，其中R 1和R 2獨立地選自CO 2H和CH 3。
另一個實施方式提供如上文所定義的式 (II) 之化合物，其中n和m各自是獨立地選自5至20的整數。
另一個實施方式提供如上文所定義的式 (II) 之化合物，其中n和m各自是獨立地選自10、11、13和14的整數。
另一個實施方式提供如上文定義的式 (II) 之化合物，其中 R 1係CO 2H並且R 2係CH 3；n係10並且m係10； R 1係CO 2H並且R 2係CO 2H；n係10並且m係10； R 1係CO 2H並且R 2係CO 2H；n係10並且m係11； R 1係CO 2H並且R 2係CO 2H；n係10並且m係13；或者 R 1係CO 2H並且R 2係CO 2H；n係10並且m係14。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (II) 之化合物，其為式 (III) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，
Figure 02_image042
(III)， 其中R 1係CO 2H並且R 2係CH 3。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (III) 之化合物，其為式 (IIIa) 之化合物或式 (IIIb) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，
Figure 02_image044
(IIIa)，或
Figure 02_image046
(IIIb)， 其中R 1係CO 2H並且R 2係CH 3。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (II) 之化合物，其為式 (IV) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，
Figure 02_image048
(IV) 其中該化合物作為外消旋物存在，或作為立體化學富集的混合物存在，或者就標記為*的碳原子而言是立體化學純的。
另一個實施方式提供如前文所定義的式 (IV) 之化合物，其為式 (IVa) 之化合物或式 (IVb) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，
Figure 02_image050
(IVa)
Figure 02_image052
(IVb) 其中y係選自1至36的整數。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (IVa) 之化合物或式 (IVb) 之化合物，其中y係選自2至24的整數。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (IVa) 之化合物或式 (IVb) 之化合物，其中y係選自2、8和24的整數。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (IVa) 之化合物或式 (IVb) 之化合物，其中y係2。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (IVa) 之化合物或式 (IVb) 之化合物，其中y係8。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (IVa) 之化合物或式 (IVb) 之化合物，其中y係24。
另一個實施方式提供根據任何上述定義的實施方式的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中P選自 GLP-1 (7-37) ：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly（ SEQ ID NO: 1），和 GLP-1類似物，其相對於序列GLP-1 (7-37)（SEQ ID NO: 1）在位置7、或在位置8、或在位置7和位置8包含非天然胺基酸殘基。
另一個實施方式提供根據任何上述定義的實施方式的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中P係 Xaa 7-Xaa 8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa 16-Ser-Xaa 18-Xaa 19-Xaa 20-Glu-Xaa 22-Xaa 23-Ala-Xaa 25-Arg-Xaa 27-Phe-lle-Xaa 30-Trp-Leu-Xaa 33-Xaa 34-Xaa 35-Xaa 36-Xaa 37,（ SEQ ID NO: 2）,（以下稱為P*）， 其中 Xaa 7係His 、咪唑丙醯基、α-羥基-組胺酸、D-組胺酸、脫胺基-組胺酸、2-胺基-組胺酸、β-羥基-組胺酸、高組胺酸、N α-乙醯基-組胺酸、N α-甲醯基-組胺酸、α-氟甲基-組胺酸、α-甲基-組胺酸、3-吡啶基丙胺酸、2-吡啶基丙胺酸或4-吡啶基丙胺酸； Xaa 8係Ala 、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-胺基環丙基)甲酸、(1-胺基環丁基)甲酸、(1-胺基環戊基)甲酸、(1-胺基環己基)甲酸、(1-胺基環庚基)甲酸或(1-胺基環辛基)甲酸； Xaa 16係VaI或Leu； Xaa 18係Ser、Lys或Arg； Xaa 19係Tyr或GIn； Xaa 20係Leu或Met； Xaa 22係GIy、Glu或Aib； Xaa 23係GIn、Glu、Lys或Arg； Xaa 25係Ala或VaI； Xaa 27係Glu或Leu； Xaa 30係Ala、Glu或Arg； Xaa 33係VaI或Lys； Xaa 34係Lys、Glu、Asn或Arg； Xaa 35係GIy或Aib； Xaa 36係Arg、GIy或Lys、或不存在；以及 Xaa 37係GIy、Ala、Glu、Pro、Lys、或不存在。
另一個實施方式提供根據前述實施方式的化合物，其中在P*中： Xaa 7係His或脫胺基組胺酸； Xaa 8係Ala 、GIy、VaI、Leu、Lys或Aib； Xaa 16係VaI； Xaa 18係Ser； Xaa 19係Tyr； Xaa 20係Leu； Xaa 22係GIy、Glu或Aib； Xaa 23係Gln或Glu； Xaa 25係Ala； Xaa 27係Glu； Xaa 30係Ala或Glu； Xaa 33係VaI； Xaa 34係Lys或Arg； Xaa 35係GIy或Aib； Xaa 36係Arg或Lys、或不存在；以及 Xaa 37係GIy或不存在。
另一個實施方式提供根據前述實施方式的化合物，其中在P*中： Xaa 7係His； Xaa 8係GIy或Aib； Xaa 16係VaI； Xaa 18係Ser； Xaa 19係Tyr； Xaa 20係Leu； Xaa 22係Glu或Aib； Xaa 23係Gln或Glu； Xaa 25係Ala； Xaa 27係Glu； Xaa 30係Ala； Xaa 33係VaI； Xaa 34係Lys或Arg； Xaa 35係GIy或Aib； Xaa 36係Arg；以及 Xaa 37係GIy。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中P選自： [Aib8, Arg34]GLP-1 (7-37) ：His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly（ SEQ ID NO: 3）；以及 [Arg34]GLP-1 (7-37) ：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly（ SEQ ID NO: 4）。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中P係 [Aib8, Arg34]GLP-1 (7-37)（ SEQ ID NO: 3）；或者可替代地如下所示：
Figure 02_image054
並且其中胺基酸成員Lys上的波浪線表示與連接子的附接點。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其係
Figure 02_image056
其中y係選自1至36的整數，並且 其中該化合物作為非鏡像異構物混合物、立體化學富集的混合物存在或者就標記為*的碳原子而言是立體化學純的。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其具有式 (X) 或式 (XI)：
Figure 02_image058
(X)，
Figure 02_image060
(XI)， 其中y係選自1至36的整數。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (X) 或式 (XI) 之化合物，其中y係選自2至24的整數。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (X) 或式 (XI) 之化合物，其中y係選自2、8和24的整數。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (X) 或式 (XI) 之化合物，其中y係2。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (X) 或式 (XI) 之化合物，其中y係8。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (X) 或式 (XI) 之化合物，其中y係24。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其選自：
Figure 02_image062
（化合物1）、
Figure 02_image064
（化合物2）、
Figure 02_image066
（化合物3）、
Figure 02_image068
（化合物4）、
Figure 02_image070
（化合物5）、
Figure 02_image072
（化合物6）、
Figure 02_image074
（化合物7）、
Figure 02_image076
（化合物8）和
Figure 02_image078
（化合物9）。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其係：
Figure 02_image062
（化合物1）。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其係：
Figure 02_image064
（化合物2）。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其係：
Figure 02_image066
（化合物3）。
另一個實施方式提供藥物組成物，該藥物組成物包含本文所述之化合物或其藥學上可接受的鹽以及一或多種藥學上可接受的載劑。
另一個實施方式提供根據前述實施方式的藥物組成物，其中該化合物選自化合物1、2、3、4、5、6、7、8和9。
另一個實施方式提供根據前述實施方式的藥物組成物，其中該化合物選自化合物1、2和3。
另一個實施方式提供組合，該組合包含治療有效量的本文所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，以及一或多種治療活性劑。
另一個實施方式提供根據前述實施方式的組合，其中該化合物選自化合物1、2、3、4、5、6、7、8和9。
另一個實施方式提供根據前述實施方式的組合，其中該化合物選自化合物1、2和3。
另一個實施方式提供本文所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，用作藥物。
另一個實施方式提供根據前述實施方式使用的化合物，其中該化合物選自化合物1、2、3、4、5、6、7、8和9。
另一個實施方式提供根據前述實施方式使用的化合物，其中該化合物選自化合物1、2和3。
另一個實施方式提供本文所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，用於在選自以下的疾病和障礙的治療中使用：肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖、一或多種糖尿病併發症（包括但不限於慢性腎病）、糖尿病腎病、血脂異常、代謝綜合症、進行性肝病、心血管疾病和神經病變。作為非限制性示例，神經病變係周圍神經病變（其可以例如與糖尿病相關）。
另一個實施方式提供如本文所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，用於在選自以下的心血管疾病或障礙的治療中使用：高血壓、動脈粥樣硬化、周邊動脈疾病、中風、心肌病、心房顫動、心臟衰竭（例如射出分率降低的心臟衰竭（HFrEF）、射出分率中間值的心臟衰竭（HFmrEF））和射出分率保留的心臟衰竭（HFpEF）、冠心病和心律不整（例如房性心律不整和室性心律不整）。
另一個實施方式提供了根據前述兩個實施方式使用的化合物，其中該化合物選自化合物1、2、3、4、5、6、7、8和9。
另一個實施方式提供了根據前述實施方式使用的化合物，其中該化合物選自化合物1、2和3。
另一個實施方式提供了用於治療需要對升糖素樣肽1受體（GLP1R）的促效劑敏感的療法的患者之方法，該方法包括向該患者投與治療有效量的本文所述之化合物或其藥學上可接受的鹽。
另一個實施方式提供根據前述實施方式的治療方法，其中該化合物選自化合物1、2、3、4、5、6、7、8和9。
另一個實施方式提供根據前述實施方式的治療方法，其中該化合物選自化合物1、2和3。
另一個實施方式提供根據前述實施方式的治療方法，其中患者患有選自以下的疾病或障礙：肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖、一或多種糖尿病併發症（包括但不限於慢性腎病）、糖尿病腎病、血脂異常、代謝綜合症、進行性肝病、心血管疾病和神經病變。作為非限制性示例，神經病變係周圍神經病變（其可以例如與糖尿病相關）。
另一個實施方式提供根據前述實施方式的治療方法，其中患者患有選自以下的心血管疾病或障礙：高血壓、動脈粥樣硬化、周邊動脈疾病、中風、心肌病、心房顫動、心臟衰竭（例如射出分率降低的心臟衰竭（HFrEF）、射出分率中間值的心臟衰竭（HFmrEF））和射出分率保留的心臟衰竭（HFpEF）、冠心病和心律不整（例如房性心律不整和室性心律不整）。 進一步的方面
根據起始材料和程序的選擇，該等化合物可以呈可能的立體異構物形式或作為其混合物（例如作為純的光學異構物或作為立體異構物混合物，如外消旋物和非鏡像異構物混合物）存在，這取決於不對稱碳原子的數目。如本文所述之化合物不受限制並且該等化合物包括所有此類可能的立體異構物，包括外消旋混合物、非鏡像異構物混合物和光學純形式。光學活性( R)-和( S)-立體異構物可以使用手性合成子或手性試劑製備，或使用常規技術拆分。如果化合物含有雙鍵，則取代基可為E或Z組態。如果化合物含有二取代的環烷基，則環烷基取代基可以具有順式或反式組態。所有互變異構形式也包括在內。
如本文所用，術語「鹽（salt或salts）」係指本揭露之化合物的酸加成鹽或鹼加成鹽。「鹽」特別包括「藥學上可接受的鹽」。術語「藥學上可接受的鹽」係指保留本揭露內容的化合物的生物有效性和特性，並且典型地不是生物學上或其他方面不希望的鹽。在許多情況下，本揭露之化合物能夠藉由鹼性氮原子（例如在胺基和吡啶基團或與其相似的其他基團和/或酸質子中發現的，例如在羧酸或5-側氧基-4,5-二氫-1,2,4-㗁二唑基團或與其類似的其他基團中發現的）的存在形成酸鹽和/或鹼鹽。
可以用無機酸和有機酸形成藥學上可接受的酸加成鹽。可以衍生出鹽的無機酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可以衍生出鹽的有機酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水楊酸等。
可以用無機鹼和有機鹼形成藥學上可接受的鹼加成鹽。可以衍生出鹽的無機鹼包括例如銨鹽和來自元素週期表第I至XII列的金屬。在某些實施方式中，該等鹽衍生自鈉、鉀、銨、鈣、鎂、鐵、銀、鋅和銅；特別適合的鹽包括銨鹽、鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽和鎂鹽。可以衍生出鹽的有機鹼包括例如一級胺、二級胺和三級胺；經取代的胺（包括天然存在的經取代的胺）；環胺；鹼性離子交換樹脂等。某些有機胺包括異丙胺、苄星（benzathine）、膽鹼鹽、二乙醇胺、二乙胺、離胺酸、葡甲胺、哌𠯤、和胺丁三醇。
在另一方面，本揭露之化合物以鈉、鉀、銨、鈣、鎂、鐵、銀、鋅、銅、異丙胺、苄星、膽鹼、二乙醇胺、二乙胺、離胺酸、葡甲胺、哌𠯤或胺丁三醇鹽形式提供。
在另一方面，本揭露之化合物以如下形式提供：乙酸鹽、抗壞血酸鹽、己二酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、溴化物/氫溴酸鹽、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、樟腦磺酸鹽、癸酸鹽、氯化物/鹽酸鹽、氯脲鎓酸鹽（chlortheophyllonate）、檸檬酸鹽、乙二磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、麩胺酸鹽、戊二酸鹽、乙醇酸、馬尿酸鹽、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙基磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖醛酸鹽、十二烷基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、苦杏仁酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硫酸鹽、黏酸鹽、萘甲酸鹽、萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、十八烷酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、癸二酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、磺基水楊酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽三氟甲磺酸鹽、三氟乙酸鹽或昔萘酸鹽形式。
本文中給出的任何式還旨在代表化合物的非標記形式以及同位素標記形式。除了一或多個原子被具有選定原子量或質量數的原子替代以外，同位素標記的化合物具有本文中給出的式所描述的結構。可以摻入本文所述之化合物中的同位素包括例如氫的同位素。
此外，摻入某些同位素，特別是氘（即 2H或D）可提供更高代謝穩定性導致的某些治療優勢，例如增加的體內半衰期或減少的劑量要求或治療指數或耐受性的改善。應理解，在此上下文中的氘被認為是本文所述之化合物的取代基。氘的濃度可以由同位素富集因子定義。如本文所用的術語「同位素富集因子」意指指定同位素的同位素豐度與天然豐度之間的比率。如果本文所述之化合物中的取代基指示為氘，則這種化合物具有針對每個指定的氘原子的同位素富集因子為至少3500（在每個指定的氘原子上52.5%氘摻入）、至少4000（60%氘摻入）、至少4500（67.5%氘摻入）、至少5000（75%氘摻入）、至少5500（82.5%氘摻入）、至少6000（90%氘摻入）、至少6333.3（95%氘摻入）、至少6466.7（97%氘摻入）、至少6600（99%氘摻入）或至少6633.3（99.5%氘摻入）。應當理解，術語「同位素富集因子」可以與針對氘所描述的相同方式應用於任何同位素。
可摻入本文所述之化合物中的同位素的其他示例包括氫、碳、氮、氧、氟和硫的同位素，分別例如 3H、 11C、 13C、 14C、 15N、 18F、 35S。因此，應理解包括還摻入一或多種上述任何同位素（包括例如放射性同位素，例如 3H和 14C）的本文所述之任何化合物或其中存在非放射性同位素（如 2H和 13C）的那些。此類同位素標記的化合物可用於代謝研究（用 14C）、反應動力學研究（用例如 2H或 3H）、檢測或成像技術（例如正電子發射斷層掃描（PET）或單光子發射電腦斷層掃描（SPECT），包括藥物或底物組織分佈測定），或用於患者的放射性治療。特別地， 18F或標記的化合物可能對於PET或SPECT研究是特別希望的。本文所述之經同位素標記的式 (I) 之化合物通常可以藉由熟悉該項技術者已知的常規技術或藉由與所附實例和製備中描述的那些類似的方法使用適當的同位素標記的試劑代替先前使用的未標記的試劑來製備。
如本文所用，術語「藥物組成物」係指呈適用於口服或腸胃外投與的形式的本文所述之化合物或其藥學上可接受的鹽以及至少一種藥學上可接受的載劑。
如本文所用，術語「藥學上可接受的載劑」係指可用於製備或使用藥物組成物的物質，並且包括例如合適的稀釋劑、溶劑、分散介質、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑、等滲劑、緩衝劑、乳化劑、吸收延遲劑、鹽、藥物穩定劑、黏合劑、賦形劑、崩散劑、潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、調味劑、染料以及它們的組合，如熟悉該項技術者已知的（參見例如，Remington The Science and Practice of Pharmacy [雷明頓：藥物科學與實踐], 第22版, Pharmaceutical Press [藥物出版社], 2013, 第1049至1070頁）。
本文所述化合物的術語「治療有效量」係指將引發受試者的生物學或醫學響應的該化合物的量。作為一組非限制性示例，本文所述之化合物的這種治療有效量可以例如激動GLP1R活性，改善一或多種症狀，減輕一或多種病症，減緩或延緩疾病、障礙或病症的進展，或預防疾病、障礙或病症。
如本文所用，術語「治療有效量」係指本文所述之化合物的量，當投與給受試者時，該量至少部分地減輕、預防和/或改善對增加或激動GLP1R活性有應答的病症、障礙或疾病。在另一個實施方式中，術語「治療有效量」係指本文所述之化合物的量，當投與給受試者、細胞或組織；或非細胞生物材料；或培養基時，該量至少部分地增加或激動GLP1R活性；或至少部分地增加或激動GLP1R表現。在另一個實施方式中，術語「治療有效量」係指本文所述之化合物的量，當投與給受試者時，該量引起可觀察水平的一或多種期望的生物學或醫學響應，例如選自：降低葡萄糖水平（例如降低血糖水平）、增加胰島素敏感性、改善葡萄糖穩態、降低甘油三酯或膽固醇水平、減輕體重、減少食物攝入和減少身體脂肪量（例如周邊脂肪和/或內臟脂肪）。
如本文所用，術語「患者」或「受試者」係可互換的並且係指靈長類動物（例如人類，男性或女性；或非人類靈長類動物）、狗、兔、豚鼠、豬、大鼠和小鼠。在某些實施方式中，受試者係靈長類動物。在又其他實施方式中，受試者係人。
如本文所用，術語「激動（agonize）」、「激動（agonism）」和「激動（agonizing）」係指GLP1R傳訊的增加，例如藉由細胞內環磷酸腺苷（cAMP）的增加來測量。
如本文所用，任何疾病、障礙或病症的術語「治療（treat）」、「治療（treating）」或「治療（treatment）」係指減輕或改善疾病、障礙或病症（即，減緩或阻止疾病、障礙或病症或其至少一種臨床症狀的發展或進展）；或者減輕或改善與疾病、障礙或病症相關聯的至少一種物理參數或生物標誌物，包括針對患者可能無法辨別的那些物理參數或生物標誌物。
如本文所用，任何疾病、障礙或病症的術語「預防（prevent）」、「預防（preventing）」或「預防（prevention）」係指疾病、障礙或病症的預防性治療；或延緩疾病、障礙或病症的發作或進展。
如本文所用，如果受試者將在生物學上、在醫學上或在生活品質上從治療中獲益，則這樣的受試者係「需要」這種治療的。
如本文所用，「一個/種（a，an）」、「該/該等（the）」以及使用的類似術語（特別是在請求項的上下文中）應被解釋為涵蓋單數和複數二者，本文中除非另外指示或與上下文明顯相矛盾。
本文描述的所有方法能夠以任何合適的順序進行，除非本文中另外指示或另外與上下文明顯矛盾。本文提供的任何和所有示例或示例性語言（例如，「例如」）的使用僅旨在更好地闡明本文提供的組成物和方法或用途，並且不對另外聲明的範圍構成限制。
本文所述之一或多種化合物的任何非對稱原子（例如，碳等）可以以外消旋或鏡像異構物富集的形式存在，例如，( R)-、( S)-或( R,S)-組態。在某些實施方式中，每個非對稱原子具有至少50%鏡像異構物過量、至少60%鏡像異構物過量、至少70%鏡像異構物過量、至少80%鏡像異構物過量、至少90%鏡像異構物過量、至少95%鏡像異構物過量、或至少99%鏡像異構物過量的 ( R)-或 ( S)-組態。
因此，如本文所用，如本文所述之化合物可以呈以下之一的形式：可能的立體異構物、旋轉異構物、阻轉異構物、互變異構物或其混合物，例如，作為基本上純的非鏡像異構物、光學異構物（對映體）、外消旋物或其混合物。
任何所得立體異構物混合物可以基於組分的物理化學差異例如藉由層析法和/或分級結晶被分離成純的或基本上純的幾何或光學異構物、非鏡像異構物、外消旋物。
可以藉由已知方法將任何所得的本文所述之化合物或中間體的外消旋物拆分成旋光對映體，例如藉由將用光學活性酸或鹼得到的其非鏡像異構物鹽進行分離，並釋放出光學活性的酸性或鹼性化合物。特別地，因此可以採用鹼性部分將本文所述之化合物拆分成它們的光學對映體，例如藉由分級結晶用光學活性酸，例如酒石酸、二苯甲醯基酒石酸、二乙醯基酒石酸、二- O,O'-對甲苯醯基酒石酸、苦杏仁酸、蘋果酸或樟腦-10-磺酸形成的鹽來拆分。本文所述之外消旋化合物或外消旋中間體還可以藉由手性層析法（例如，使用手性吸附劑的高壓液相層析法（HPLC））拆分。
本申請的化合物可以由有機合成領域技術者使用可商購獲得的起始材料、文獻中已知的化合物，或由容易製備的中間體，藉由採用熟悉該項技術者已知的、或根據本文的傳授內容對熟練化學家將顯而易見的標準合成方法和程序製備。
本文所述之化合物可以藉由有機合成領域中已知的方法製備，如部分藉由以下合成方案闡述的。在下文所描述的方案中，很好理解的是，根據通用化學原理，在必要時採用敏感基團或反應性基團的保護基團。根據有機合成的標準方法（如例如在Protective Groups in Organic Synthesis [有機合成中的保護基團], 第3版, John Wiley & Sons [約翰威立父子出版公司]: 紐約, 1999或Protecting Groups [保護基團], 第3版, Thieme [蒂梅出版社], Stuttgart [斯圖加特], 2004中所描述的）操作保護基團。使用熟悉該項技術者顯而易見的方法，在化合物合成的方便階段去除保護基團。
熟悉該項技術者將認識到本文揭露的化合物中是否存在立體中心。最終產物、中間體或起始材料的拆分可受到本領域已知的任何合適方法的影響。參見例如「Stereochemistry of Organic Compounds [有機化合物的立體化學]」 作者E. L. Eliel, S. H. Wilen, 和L. N. Mander（Wiley-lnterscience [威利科學出版社], 1994）。
本文描述的化合物可以由可商購的起始材料製備或使用已知的有機、無機和/或酶促方法合成。 化合物的製備
本文所述之化合物可以以有機合成領域技術者熟知的多種方式製備。舉例來說，本揭露內容的化合物可以使用下文描述的方法、以及合成有機化學領域中已知的合成方法或熟悉該項技術者所理解的其變體來合成。 通用合成程序
本文所述之化合物可以如實驗部分（化學部分）中詳細顯示的那樣製造，例如： 通用方案 (I) ：合成脂肪酸部分，式 (i) 之化合物：
製備式 (i) 之化合物的通用方法概述於通用方案 (I) 中。 方案 (I)
Figure 02_image083
丙二酸衍生物（60）可在鹼（例如氫化鈉、碳酸鉀或碳酸銫、氫氧化鈉、二異丙基胺基鋰、雙(三甲基矽基)胺基鈉）存在下、在溶劑（例如DMF、THF或二甲基乙醯胺）存在或不存在下、在RT左右或以上或以下與R 1-(CH 2) m-X反應產生烷基化中間體（61），其然後在鹼存在下與R 2-(CH 2) n-X反應以提供二烷基化中間體（62）。變數R 1、R 2、n和m具有如本文定義的含義，X係選自鹵素（例如Br、Cl、I）、三氟甲磺醯氧基等的離去基團，P 1和P 2係羧酸保護基團，例如甲基、乙基、三級丁基、甲氧基苄基、苄基、三甲基矽基、三級丁基二甲基矽基或2-烷基1,3㗁唑啉。
根據保護基團P 1和P 2，中間體（62）然後與鹼（例如NaOH、KOH或LiOH）反應，或與酸（選自但不限於TFA、HCl或BCl 3）反應，或在保護基團P 1和P 2係苄基或甲氧基苄基時，中間體（62）通常在催化劑（例如但不限於鈀碳）的存在下與氫反應以提供化合物（65），其對應於式 (i) 之化合物，即當P 1係氫時。
可替代地，中間體（61）可以在鹼（例如NaH、碳酸鉀或碳酸銫、氫氧化鈉、二異丙基胺基鋰等）存在下，以及在溶劑（例如DMF、THF或二甲基乙醯胺）存在或不存在下與CH 2=CH-(CH 2) j-X反應（其中j係1-10並且X係如本文所定義，例如烯丙基溴）產生不飽和二-烷基化中間體63，可藉由層析法將其分離為其R或S鏡像異構物。然後中間體63在過量的例如2當量的烷基化試劑R 2-(CH 2) n’-CH=CH 2（其中n’係5-27）和烯烴複分解催化劑（例如Grubbs II）存在下在溶劑（例如DCM或THF）存在下反應產生中間體64，其可在催化劑（例如Pd/C）存在下在溶劑（例如THF、甲醇等）存在下與氫氣反應並視需要隨後進行去保護反應（例如條件係P 2不是苄基，通常如在中間體62到中間體65的反應中所揭露的）；例如與NaOH、KOH或LiOH在甲醇、乙醇或二㗁𠮿中反應或與選自但不限於TFA、HCl或BCl 3的酸反應。側鏈中的雙鍵也可以在連接子附接到脂肪酸後被氫化，如方案 (II) 中所示。選擇參數j和n’以及CH=CH基團以提供由中間體65中的n確定的鏈長，即(CH 2) n。 通用方案 (II) ：包含連接子（ L ）的脂肪酸部分的合成：
Figure 02_image085
使用中間體65製備中間體66的通用方法概述於通用方案 (II) 中。脂肪酸衍生物65通常可以與式H 2N-L-COOP 3的胺基酸衍生物（其中P 3係氫或羧酸保護基團（例如甲基、乙基、三級-丁基、甲氧基苄基、苄基、三甲基矽基、三級丁基二甲基矽基或2-烷基1,3㗁唑啉）並且L係如在本文中所述之連接子，條件係式H 2N-L-COOP 3的胺基酸衍生物中的連接子L與其末端基團（即NH 2和COOP 3）一起顯示）在偶合劑（例如羰基二咪唑（DCC））存在下，在鹼（例如 N,N-二異丙基乙胺或K 2CO 3）存在或不存在下，在溶劑（例如DMF）存在或不存在下反應，得到衍生的脂肪酸衍生物（66）。
標準肽偶合反應包括例如將羧酸基團轉化為其活化形式，例如轉化為相應的吡咯啶-2,5-二酮基團，例如藉由使用標準的N-氫琥珀醯亞胺化學，或藉由使碳酸基團與試劑例如三光氣、羰基二咪唑、4-硝基苯基氯甲酸酯或二琥珀醯亞胺碳酸酯反應生成相應的碳醯鹵，藉由使用試劑例如亞硫醯氯或草醯氯，或藉由使用試劑（例如ClC(O)O-異丁基、2,4,6-三氯苯甲醯氯或丙基膦酸酐環狀三聚體（T3P））將碳酸基團轉化為相應的混合酸酐，然後在鹼例如三級胺（例如三乙胺或 N,N-二異丙基乙胺）或無機鹼（例如K 2CO 3）存在或不存在下使㗁唑烷-2,5-二酮、醯鹵或混合酸酐反應。可替代地，在存在或不存在試劑（例如1-羥基苯并三唑、1-羥基-7-氮雜苯并三唑或二甲基胺基吡啶）的情況下，肽偶合反應試劑包括二環己基碳二亞胺（DCC）、二異丙基碳二亞胺（DIC）、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC HCl）、苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯啶基-鏻六氟磷酸鹽（PyBOP）、或苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基胺基)-鏻六氟磷酸鹽（BOP）。 通用方案 (III) ：式 (I) 之化合物的合成：
Figure 02_image087
使用中間體66製備式 (I) 之化合物的通用方法概述於通用方案 (III) 中。如果P 3係保護基團（例如不是氫），則例如在溶劑（例如甲醇）存在或不存在下使用酸（例如HCl或對甲苯磺酸）將式（66）的脂肪酸衍生物轉化為其羧酸，然後例如在溶劑（例如DCM或THF）存在或不存在下使用DCC和N-羥基琥珀醯亞胺（NHS）轉化為活性碳酸酯（例如NHS酯），然後例如在哌啶和溶劑（例如DMF或DMA）存在下將其與具有游離-NH 2基團的GLP-1或GLP-1類似物P*反應；其中變數P*和P具有如本文定義的含義（如通用方案 (III) 中所示）。
由上文所述之方法得到的鏡像異構物、非鏡像異構物和順式/反式異構物的混合物可以藉由手性鹽技術，使用正常相、逆相或手性柱的層析法分離成它們的單一組分，這取決於分離的性質。
可以藉由已知方法將任何所得的本揭露之化合物或中間體的外消旋物拆分成旋光對映體，例如藉由將用光學活性酸或鹼得到的其非鏡像異構物鹽進行分離，並釋放出光學活性的酸性或鹼性化合物。特別地，因此可以採用鹼性部分將本揭露之化合物拆分成它們的旋光對映體，例如藉由用光學活性酸（例如酒石酸、聯苯甲醯酒石酸、二乙醯酒石酸、二-O,O'-對甲苯甲醯酒石酸、苦杏仁酸、蘋果酸或樟腦-10-磺酸）形成的鹽進行分步結晶。本揭露之外消旋化合物或外消旋中間體還可以藉由手性層析法（例如，使用手性吸附劑的高壓液相層析法（HPLC））拆分。 藥物組成物
本文所述之藥物組成物包含本文所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載劑。在一個另外的實施方式中，該組成物包含至少兩種藥學上可接受的載劑，例如本文所描述的那些。藥物組成物可以配製用於特定的投與途徑，如口服投與、腸胃外投與（例如藉由注射、輸注、經皮或局部投與）和直腸投與。局部投與也可以涉及吸入或鼻內應用。本文所述之藥物組成物可以固體形式（包括但不限於膠囊、片劑、丸劑、顆粒劑、粉末或栓劑）或以液體形式（包括但不限於溶液、懸浮液或乳液）製成。片劑可以根據本領域已知的方法進行薄膜包衣或腸溶包衣。典型地，藥物組成物係包含活性成分以及以下中的一或多種的片劑或明膠膠囊： a)      稀釋劑，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素和/或甘胺酸； b)      潤滑劑，例如二氧化矽、滑石、硬脂酸、其鎂或鈣鹽和/或聚乙二醇； 對於片劑，還包含 c)      黏合劑，例如矽酸鋁鎂、澱粉糊、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯啶酮；如果希望的話， d)      崩散劑，例如澱粉、瓊脂、海藻酸或其鈉鹽、或泡騰混合物；以及 e)      吸附劑、著色劑、調味劑和甜味劑。
適合於可注射使用的藥物組成物通常包括無菌水溶液（在水溶性的情況下）或分散體、以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。
對於靜脈內的投與，適當的載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM（巴斯夫公司（BASF），帕西波尼（Parsippany），新澤西州（N.J.））或磷酸酯緩衝鹽水（PBS）。在所有情況下，該組成物應當是無菌的並且應當具有達到容易注射的程度的流動性。較佳的藥物配製物在製造和儲存條件下係穩定的並且必須抗微生物（例如細菌和真菌）污染作用而保存。通常，相關載劑可為溶劑或分散介質，其包含例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等）及其合適的混合物。例如，可以藉由使用塗層（如卵磷脂）、藉由在分散體的情況下維持所需粒度以及藉由使用界面活性劑來維持適當的流動性。防止微生物的作用可以藉由不同的抗細菌以及抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯、三氯三級丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等來實現。在許多情況下，將較佳的是在組成物中包含等滲劑例如糖、多元醇（如甘露醇、胺基酸或山梨糖醇）和氯化鈉。可以藉由在組成物中包含延遲吸收的藥劑（例如單硬脂酸鋁和明膠）來實現可注射組成物的長時間吸收。在一些實施方式中，可將多官能賦形劑如重組白蛋白摻入配製過程中以促進本發明化合物的穩定化以防止降解或聚集，從而提高溶解度並有助於活性成分的投與和釋放。（BioPharm International [國際生物製藥], 2012, 第23卷, 第3期, 第40-44頁）。
某些可注射組成物係水性等滲溶液或懸浮液，並且栓劑有利地由脂肪乳液或懸浮液製備。所述組成物可為滅菌的和/或含有輔助劑，例如防腐劑、穩定劑、潤濕劑或乳化劑、溶液促進劑、用於調節滲透壓的鹽和/或緩衝液。另外，該等組成物還可以含有其他有治療價值的物質。所述組成物分別根據常規的混合、製粒或包衣方法來製備，並且含有0.1%-75%、或含有1%-50%的活性成分。
可以藉由以下來製備無菌可注射溶液：將活性化合物以所需的量，根據需要，與一種以上列舉的成分或該等成分的組合摻入適當的溶劑中，然後進行過濾滅菌。總體上，藉由將活性化合物摻入無菌媒劑來製備分散體，該無菌媒劑含有基礎分散介質以及來自以上列舉的所需其他成分。就用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末而言，較佳的製備方法係真空乾燥和冷凍乾燥，該等方法產生活性成分的粉末以及來自其以前的無菌過濾溶液的任何另外的所希望的成分。
本文所述之化合物無論是游離形式還是藥學上可接受的鹽形式都表現出有價值的藥理學性質，例如，作為GLP1R的促效劑，例如，如在此提供的體外和體內試驗所示，因此指示用於療法或用作研究化學品，例如用作工具化合物。 實用性列表
本文所述之化合物可用於治療代謝和相關疾病、障礙和病症，例如選自：
肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖、一或多種糖尿病併發症（包括但不限於慢性腎病）、糖尿病腎病、血脂異常、代謝綜合症、進行性肝病、心血管疾病和神經病變。作為非限制性示例，神經病變係周圍神經病變（其可以例如與糖尿病相關）。
進行性肝病可為例如非酒精性脂肪性肝病（FLD或NAFLD），例如非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。
心血管疾病可以選自：高血壓、動脈粥樣硬化、周邊動脈疾病、中風、心肌病、心房顫動、心臟衰竭（例如射出分率降低的心臟衰竭（HFrEF）、射出分率中間值的心臟衰竭（HFmrEF））和射出分率保留的心臟衰竭（HFpEF）、冠心病和心律不整（例如房性心律不整和室性心律不整）。
本發明之化合物可用於治療在受試者中同時發生的幾種疾病、障礙或病症（稱為「共病」）。例如，共病可為患有2型糖尿病並且另外肥胖和/或另外表現出心臟衰竭和/或NASH的受試者中的那些。例如，肥胖的受試者也可表現出2型糖尿病和/或表現出心血管疾病（例如心臟衰竭）。此類受試者也可表現出進行性肝病（例如NASH）。例如，肥胖的受試者也可表現出2型糖尿病和/或表現出心血管疾病（例如心臟衰竭）和/或表現出進行性肝病（例如NASH）。受試者還可能患有高血壓和/或高血膽固醇水平。受試者還可能患有周圍神經病變。
如本文所用，在上述實用性部分中揭露的適應症在下文中可稱為「 上述列表」。
在實施方式中，疾病、障礙或病症選自肥胖症、2型糖尿病、動脈粥樣硬化、心臟衰竭（特別是射出分率保留的心臟衰竭）和NASH。
在實施方式中，疾病、障礙或病症選自肥胖症、2型糖尿病、動脈粥樣硬化和心臟衰竭（特別是射出分率保留的心臟衰竭）。
本揭露之另一方面關於治療、預防、抑制、或消除與GLP1R的調節相關的患者中的疾病或障礙之方法。該方法包括向需要治療與GLP1R的調節相關的疾病或障礙的患者投與有效量的本文所述之化合物或其藥學上可接受的鹽或包含本文所述之化合物或其藥學上可接受的鹽以及一或多種藥學上可接受的載劑的藥物組成物。
因此，作為另一方面，本文提供的是本文所述之化合物或其藥學上可接受的鹽在療法中之用途。在進一步的實施方式中，該療法係治療可以藉由GLP1R的激動治療的疾病、障礙或病症。在另一個實施方式中，該療法係治療選自任何上述列表的疾病、障礙或病症。
因此，作為另一方面，本文提供了用於在療法中使用的本文所述之化合物或其藥學上可接受的鹽。在進一步的實施方式中，該療法係治療可以藉由GLP1R的激動治療的疾病、障礙或病症。在另一個實施方式中，該療法係治療選自任何上述列表的疾病、障礙或病症。
在另一個方面，本文提供了一種治療患者的可藉由GLP1R的激動治療的疾病、障礙或病症之方法，該方法包括投與治療有效量的本文所述之化合物或其藥學上可接受的鹽。
在另一個實施方式中，本文提供了一種在有需要的受試者中治療疾病、障礙或病症之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的本文所述之化合物，其中該疾病、障礙或病症選自任何上述清單。
在另一方面，本文提供了本文所述之化合物或其藥學上可接受的鹽在製備藥物中之用途。在另一個實施方式中，該藥物用於治療可以藉由GLP1R的激動治療的疾病。在另一個實施方式中，該疾病選自任何上述列表。
此外，本發明提供本文所述之任何化合物或其藥學上可接受的鹽用於治療選自任何上述列表的疾病、障礙或病症之用途。
術語「代謝障礙」或「代謝疾病」係指相關的一組特徵，包括但不限於肥胖症、葡萄糖耐受不良、胰島素抵抗、高胰島素血症、過度內臟肥胖、高血壓、以高甘油三酯、低高密度脂蛋白（HDL）-膽固醇和高低密度脂蛋白（LDL）膽固醇為特徵的血脂異常。患有代謝疾病或障礙的受試者有患上2型糖尿病和例如動脈粥樣硬化的風險。
術語「肥胖」在人類成年人中係指體重指數（BMI）為30或更高（疾病控制和預防中心（Centers for Disease Control and Prevention））。這樣的受試者也可以被稱為肥胖。這被稱為I類肥胖。II類肥胖包括BMI為35-39.9的個體，III類肥胖係指BMI大於40的個體。體重指數（BMI）係基於身高和體重的體脂肪量度。計算公式為BMI = 公斤體重/米 2身高。在實施方式中，患有肥胖症的人類受試者具有 ≥ 30或 ≥ 35的BMI或在 ≥ 35至 ＜ 40或 ≥ 30至 ＜ 40範圍內的BMI。例如，＜ 40的量可為39.9。在一些實施方式中，肥胖係嚴重肥胖或病態肥胖，其中人類受試者具有 ≥ 40的BMI。
術語「2型糖尿病」係一種以空腹和進食狀態下持續高葡萄糖水平為特徵的疾病，這係由於葡萄糖利用受損和葡萄糖產生過多共同導致的。這可能是由於胰臟產生的胰島素不足或周邊胰島素抵抗所致。
如本文所用，術語「胰島素抵抗」係指正常量的胰島素不能誘導預期的生理響應並且不能激活下游途徑的情況。在許多示例中，內源性產生或外源性投與的超出生理範圍的胰島素足以誘導完全或部分生物響應以誘導預期的生理響應。
術語「高胰島素血症」係指可以在血液中檢測到過量胰島素的情況。
術語「葡萄糖耐受不良」包括以受試者中相對於健康個體與基礎或餐後葡萄糖水平升高和/或胰島素水平升高或葡萄糖刺激的胰島素釋放異常或HOMA-IR（胰島素抵抗的穩態模型評估）相關的臨床症狀或臨床症狀組合為特徵的任何障礙。葡萄糖和/或胰島素水平升高可能表現在以下疾病、障礙和病症中：肥胖症、代謝綜合症、糖耐量受損、II型糖尿病、妊娠糖尿病、I型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、脂肪營養不良、脂肪萎縮和各種MODY（年輕人的成熟期糖尿病）突變。本揭露之GLP1R促效劑及其組成物可用於例如實現和/或維持葡萄糖穩態，例如降低血液中的葡萄糖水平和/或降低胰島素水平至健康受試者之範圍。
如本文所用，術語「高血糖」係指相對於健康個體而言升高量的葡萄糖在受試者的血漿中循環的病症。可以使用本領域已知的方法診斷高血糖，包括如本文所述測量空腹血糖水平。
術語「糖尿病併發症」係由持續高血糖水平引起的問題，該等問題會損害其他器官，包括腎臟、周邊肢體和眼睛（例如視網膜病變）或誘發血管疾病和神經病變。血管功能受損會導致勃起功能障礙，並可能導致皮膚感染風險增加。糖尿病還會增加心臟病以及骨骼和關節障礙的風險。糖尿病的其他長期併發症包括癌症風險過高，包括肝細胞癌、子宮內膜癌、乳癌和胰臟癌。
術語「糖尿病腎病」係由糖尿病引起的疾病並且係由腎臟中的血管和其他細胞受損導致腎功能降低而引起的。
術語「血脂異常」係指脂蛋白代謝的複雜障礙，包括脂蛋白過度產生或代謝異常。血脂異常可能表現為總膽固醇升高、低密度脂蛋白（LDL）膽固醇和甘油三酯濃度升高，以及血液中高密度脂蛋白（HDL）膽固醇濃度降低。
術語「代謝綜合症」係指一組增加心血管疾病（包括冠狀動脈疾病、射出分率降低的心臟衰竭、射出分率保留的心臟衰竭、腦血管疾病和周邊血管疾病）風險的危險因素。該等風險因素包括：腹部脂肪、禁食後高血糖（至少110毫克/分升（mg/dl））；血液中的高甘油三酯（至少150 mg/dL）；低HDL（低於40 mg/dl）；並且，血壓為130/85 mmHg或更高（世界衛生組織）。
術語「進行性肝病」係指從肝脂肪變性的良性狀態進展，顯示纖維化和肝硬化，這使得易患肝細胞癌。肥胖相關的非酒精性脂肪肝（NAFL）向NASH、纖維化和肝硬化的進展已得到充分證明。
術語「非酒精性脂肪性肝病（FLD）」，也稱為NAFLD，係過量脂質在肝細胞中積聚的病症，這可能是由於肝臟中過多的從頭脂肪生成或脂肪酸的異常清除和氧化引起的。NAFLD被排除在其他肝病原因之外，包括酒精性肝病和病毒性肝病。NAFLD包括三個反映疾病進展的組織學實體：脂肪肝、肝脂肪變性和纖維化或肝硬化。NAFLD最常見的原因係肥胖，儘管NAFLD也可見於瘦人。脂肪的積累可能會導致炎症，伴隨巨噬細胞的浸潤和肝細胞組織學的變化，包括氣球樣變性，稱為脂肪性肝炎，也稱為非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。NASH可能進展為伴有小葉間橋接纖維化或肝硬化的纖維化。如本文所用，術語NASH可涵蓋脂肪性肝炎、肝細胞氣球樣變性和小葉炎症。
術語「心血管疾病」係與心臟或血管有關的疾病。
術語「動脈粥樣硬化」係指血管疾病，其特徵在於大動脈和中動脈的內膜中不規則分佈的脂質沈積，有時導致動脈腔變窄並最終進展成纖維化和鈣化。病變通常是局灶性的，並且進展緩慢且間歇地。血流的限制係大多數臨床表現的原因，其隨病變的分佈和嚴重度而變化。
術語「周邊動脈疾病」係指動脈中脂肪沈積物的堆積限制了腿部肌肉的血液供應的情況。
術語「中風」係指部分腦的血液供應被切斷的情況。
術語「心肌病」被定義為心房或心室心肌的獲得性或先天性結構異常，這可能影響心臟功能或生理學和傳導。
術語「心臟衰竭」係指心臟泵血能力下降並且可以包括射出分率保留的心臟衰竭（HFpEF）、射出分率降低的心臟衰竭（HFrEF）和射出分率中間值的心臟衰竭（HFmrEF）。
術語「冠心病」，也稱為冠狀動脈疾病，係向心臟供血的動脈狹窄。
術語「心律不整」係指異常的心律，並且可以包括房性心律不整、心房顫動和室性心律不整。
術語「神經病變」係指神經受損的情況。該術語包括當手、腳和手臂等四肢中的神經受損時發生的周圍神經病變。糖尿病係周圍神經病變的常見原因。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其係：
Figure 02_image062
（化合物1），用於治療選自以下的疾病或障礙：肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖、糖尿病併發症（包括但不限於慢性腎病）、糖尿病腎病、血脂異常、代謝綜合症、進行性肝病、心血管疾病、和例如與糖尿病相關的神經病變（特別是周圍神經病變）。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其係：
Figure 02_image064
（化合物2），用於治療選自以下的疾病或障礙：肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖、糖尿病併發症（包括但不限於慢性腎病）、糖尿病腎病、血脂異常、代謝綜合症、進行性肝病、心血管疾病和例如與糖尿病相關的神經病變（特別是周圍神經病變）。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其係：
Figure 02_image066
（化合物3），用於治療選自以下的疾病或障礙：肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖、糖尿病併發症（包括但不限於慢性腎病）、糖尿病腎病、血脂異常、代謝綜合症、進行性肝病、心血管疾病和例如與糖尿病相關的神經病變（特別是周圍神經病變）。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其係：
Figure 02_image062
（化合物1），用於治療選自以下的疾病或障礙：高血壓、動脈粥樣硬化、周邊動脈疾病、中風、心肌病、心房顫動、心臟衰竭（例如射出分率降低的心臟衰竭（HFrEF）、射出分率中間值的心臟衰竭（HFmrEF））和射出分率保留的心臟衰竭（HFpEF）、冠心病和心律不整（例如房性心律不整和室性心律不整）。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其係：
Figure 02_image064
（化合物2），用於治療選自以下的疾病或障礙：高血壓、動脈粥樣硬化、周邊動脈疾病、中風、心肌病、心房顫動、心臟衰竭（例如射出分率降低的心臟衰竭（HFrEF）、射出分率中間值的心臟衰竭（HFmrEF））和射出分率保留的心臟衰竭（HFpEF）、冠心病和心律不整（例如房性心律不整和室性心律不整）。
另一個實施方式提供如本文定義的式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其係：
Figure 02_image066
（化合物3），用於治療選自以下的疾病或障礙：高血壓、動脈粥樣硬化、周邊動脈疾病、中風、心肌病、心房顫動、心臟衰竭（例如射出分率降低的心臟衰竭（HFrEF）、射出分率中間值的心臟衰竭（HFmrEF））和射出分率保留的心臟衰竭（HFpEF）、冠心病和心律不整（例如房性心律不整和室性心律不整）。 劑型
對於約50-70 kg的受試者，如本文所述之藥物組成物或組合可為約1-100 mg的一或多種活性成分的單位劑量。化合物、藥物組成物、或其組合的治療有效劑量取決於受試者的物種、體重、年齡和個體狀況，所治療的障礙或疾病或其嚴重性。 組合方面
本文所述之任何化合物可以與一或多種其他的治療劑同時投與或在治療劑之前或之後投與。本文所述之任何化合物可以藉由相同或不同的投與途徑單獨投與，或與其他藥劑處於同一藥物組成物中一起投與。治療劑係例如化學化合物、肽、肽軛合物和融合物、抗體、抗體片段或核酸，該治療劑當與本文所述之化合物組合投與於受試者時具有治療活性或增強治療活性。
因此，在另一方面，本文提供的是組合，特別是藥物組合，其包含（例如，治療有效量的）本文所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，以及一或多種其他治療活性劑。
在一個實施方式中，本文提供的是組合，其包含本文所述之化合物和至少一種其他治療劑，作為組合製劑用於在療法中同時的、分開的或順序的使用。在一個實施方式中，該療法係治療選自上述列表的疾病、障礙或病症。
作為組合製劑提供的產品包括組成物，該組成物包含在同一藥物組成物中的本文所述之化合物和一或多種另外的治療劑，或以單獨形式（例如，套組（kit）形式）的本文所述之化合物和一或多種其他治療劑。
在一個實施方式中，本文提供的是藥物組合，其包含本文所述之化合物和一或多種另外的治療劑。視需要，該藥物組合可以包含如上描述的藥學上可接受的載劑。
在一個實施方式中，本文提供的是套組，其包含兩種或更多種單獨的藥物組成物，其中的至少一種含有本文所述之化合物。在一個實施方式中，該套組包含用於單獨地保留所述組成物的裝置，例如容器、分開的瓶、或分開的箔袋。此類套組的實例係泡罩包裝，如典型地用於包裝片劑、膠囊等。
該藥盒可以用於投與不同的劑型（例如，口服劑型和腸胃外劑型），用於以不同劑量間隔投與單獨的組成物，或用於相對彼此滴定單獨的組成物。為了有助於依從性，該藥盒典型地包括投與說明書。
在本文所述之組合療法中，本文所述之任何化合物和另一種治療劑可以由相同或不同的製造商製造和/或配製。
另外，本文所述之任何化合物和另一種治療劑可以一起形成組合療法：(i) 在向醫師發佈組合產品（例如，在包含本文所述之化合物和另一種治療劑的藥盒的情況下）之前進行；(ii) 在投與前不久，由醫師自己（或在醫師的指導下）進行；(iii) 在患者本身中，例如在相繼投與本文所述之化合物和另一種治療劑期間進行。
本文還提供的是組合，其包含本文所述之化合物和一或多種另外的治療劑，用於在治療選自任何上述列表的疾病、障礙或病症的方法中使用。
本文還提供的是包含如本文所述之化合物和一或多種另外的治療劑的組合用於治療選自任何上述列表的疾病、障礙或病症之用途。
在一個實施方式中，另一種治療劑可以選自： 1.      抗糖尿病劑，例如胰島素、胰島素衍生物和模擬物；胰島素促分泌物，例如磺醯脲類（例如氯磺丙脲）；或DPPIV（二肽基肽酶IV）抑制劑，例如維達列汀； 2.      降血脂劑，例如3-羥基-3-甲基-戊二醯輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，例如洛伐他汀；角鯊烯合酶抑制劑；FXR（菌綠烯醇X受體）和LXR（肝X受體）配體；膽汁酸螯合劑，例如銷膽胺和考來維侖；貝特類；菸鹼酸或阿司匹林； 3.      抗肥胖劑，例如奧利司他； 4.      抗高血壓劑，例如亨氏環利尿劑，例如埃酒克林酸；血管張力素轉化酶（ACE）抑制劑，例如貝那普利；Na-K-ATP酶膜泵抑制劑，例如長葉毛地黃苷；中性內肽酶（NEP）抑制劑；ACE/NEP抑制劑，例如奧帕曲拉；血管張力素II拮抗劑，例如纈沙坦；血管張力素受體-腦啡肽酶抑制劑（ARNi），例如沙庫必曲/纈沙坦（LCZ696）；腎素抑制劑，如地替吉侖；β-腎上腺素受體阻滯劑，例如噻嗎洛爾；強心劑，如長葉毛地黃苷；鈣通道阻滯劑，如胺氯地平；醛固酮受體拮抗劑；或醛固酮合酶抑制劑； 5.      過氧化物酶體增殖物激活劑受體的促效劑，例如非諾貝特； 6.      結合促腎上腺皮質激素釋放激素受體的化合物，例如尿促皮素2。 實例
藉由以下實例和合成方案進一步說明本揭露，該等實例和合成方案不應解釋為將本揭露的範圍或精神限制於本文描述的具體程序。應理解，該等實例被提供用來說明某些實施方式，並且本揭露之範圍不旨被其限制。應進一步理解，在不脫離本揭露之精神和/或所附請求項的範圍的情況下，可以採取可為熟悉該項技術者提出的各種其他實施方式、修改和其等效物。
本揭露之化合物可藉由有機合成領域中已知的方法製備。在所有方法中，應理解，可以在必要時根據化學的通用原理使用針對敏感或反應性基團的保護基團。根據有機合成的標準方法操作保護基團（T.W. Green和P.G.M. Wuts (1999) Protective Groups in Organic Synthesis [有機合成中的保護基團], 第3版, John Wiley & Sons [約翰威立父子出版公司]）。使用對熟悉該項技術者顯而易見的方法，在化合物合成的方便階段除去該等基團。 實驗部分 分析方法、材料和儀器
除非另有說明，否則使用如從商業供應商處收到的試劑和溶劑。除非另有說明，否則在Bruker Avance光譜儀或Varian Oxford 400 MHz光譜儀上獲得質子核磁共振（NMR）光譜。光譜以ppm（δ）給出，並且以赫茲報告耦合常數J。將四甲基矽烷（TMS）用作內標。相對於二甲基亞碸（δ 2.50）、甲醇（δ 3.31）、氯仿（δ 7.26）或NMR光譜數據中所示的其他溶劑，以ppm報告化學位移。將少量乾燥樣本（2-5 mg）溶於適當的氘代溶劑（1 mL）中。化學名稱使用來自劍橋軟體（CambridgeSoft）的ChemBioDraw Ultra v17產生。 縮寫：AC 50半最大化合物效應時的濃度 ACN                     乙腈 A inf高濃度時希爾曲線的平臺值 A 0低濃度時希爾曲線的平臺值 Aib                       α-胺基異丁酸 ALS                      自動進樣器 AUC inf從零到無窮大的血漿濃度-時間曲線下面積 br                          寬峰 BSA                     牛血清白蛋白 BW                       體重 cAMP                   環腺苷單磷酸 cat #                     目錄號 CHO                     中國倉鼠卵巢細胞 C max最大血漿濃度 CO 2二氧化碳 cynoGLP1R         食蟹猴升糖素樣肽1受體 d                           雙重峰 dd                         雙重雙重峰 DCC N,N’-二環己基碳二亞胺 DCM                    二氯甲烷 DCU N,N’-二環己基脲 DEA N,N-二乙基苯胺 DERET                 解離增強共振能量轉移 DIEA/DIPEA       二乙基異丙胺 DIO                      飲食引起的肥胖 DMEM                 杜爾貝科改良伊格爾培養基 DMF N,N-二甲基甲醯胺 DMSO                  二甲基亞碸 DSC N,N’-二琥珀醯亞胺基碳酸酯 DMA                    二甲基乙醯胺 DMAP                  4-( N,N-二甲基胺基)吡啶 EA                        酶受體 EC                        有效濃度 EC 0沒有響應的化合物的有效濃度 EC 50產生半最大響應的化合物的有效濃度 EC 100產生最大（100%）響應的化合物的有效濃度 E max功效：給藥的藥劑可達到的最大響應 EDC或EDCI N-乙基- N’-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺 EDTA                   乙二胺四乙酸 Ex9-39                 exendin 9-39 ELSD                   蒸發光散射檢測器 equiv                    當量 ESI                       電噴霧離子化 EtOAc                  乙酸乙酯 FBS                      胎牛血清 FI                         食物攝入 Fmoc                    9-茀基甲氧基羰基 FRET                    螢光共振能量轉移 g                           克 GLP1                    升糖素樣肽1 GLP1R                 升糖素樣肽1受體 GPCR                   G蛋白偶合受體 G418                    遺傳黴素，一種選擇抗生素 Grubbs II              二氯[1,3-雙(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑啶亞基](亞苄基)(三環己基膦)釕 (II) h                           小時 HATU                  (1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽 HDF                     高脂肪飲食 HESI                    加熱電噴霧電離 hGLP1R               人升糖素樣肽1受體 HPLC                   高壓液相層析 HTRF                   均質時間分辨螢光 IBMX                   3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 kg                         公斤 L                           升 LCMS                   液相層析法和質譜法 MeOH                  甲醇 MS                       質譜法 MTBE                  甲基三級丁基醚 m                          多重峰 mg                        毫克 min                       分鐘 mL                        毫升 mmol                    毫莫耳 mM                       毫莫耳 m/z                       質荷比 nM                        奈莫耳 nmol                     奈莫耳 NMP N-甲基-2-吡咯啶酮 NMR                    核磁共振 NPLC                   正相液相層析 p                           五重峰 Pbf                       2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯基- PBS                      磷酸鹽緩衝的溶液； Pd/C                     鈀碳 PEG                      聚乙二醇 PK                        藥物動力學 PD                        藥效動力學 ppm                      百萬分率 QC                        品質控制 QD                       每日一次 Q3D                     每3天一次 Q1W                    每週一次 RCF                      相對離心力 RPM                     每分鐘轉數 R t滯留時間 RT                        室溫 rotovap                 旋轉蒸發儀 s                           單峰 s.c.或SC               皮下 sec                        秒 SEM                     平均值標準誤差 SFC                      超臨界液相層析法 SM                       起始材料 t                            三重峰 TEA                     三乙胺 TFA                      三氟乙酸 THF                      四氫呋喃 T max達到最大血漿濃度所需的時間 T 1/2半衰期 v/v                        體積/體積 µg                         微克 µL                        微升 µM                       微莫耳 生物學測定和數據
在以下測量細胞內cAMP濃度的細胞測定中測試了本文所述之化合物。cAMP係由GLP1R的激活產生的。所得數據見表1-3。EC 50定義為導致最大響應一半的化合物濃度（基線校正後）。E max定義為觀察到的測試化合物的最大響應，歸一化為觀察到的內源性配體（GLP1（7-36））對GLP1R的最大響應。 人 GLP1R cAMP 促效劑測定
化合物的促效劑活性係使用GloSensor™ cAMP測定（普洛麥格公司（Promega Corp.））測定的，它測量GPCR經配體激活後細胞內cAMP濃度的變化。該測定使用由pGloSensor™-22F cAMP質體（普洛麥格公司（Promega），目錄號E2301）編碼的生物感測器，其中cAMP結合結構域與螢火蟲螢光素酶的突變形式融合。與cAMP結合會導致構象變化，從而促進光輸出的大幅增加，這可以藉由發光檢測器進行測量。將穩定過表現人GLP1受體（hGLP1R）和pGloSensor™-22F的HEK293-SNAP-hGLP1R-GloSensor細胞接種於白色384孔多聚-D-離胺酸包被板（格雷納生物一號公司（Greiner Bio One），目錄號781945）中的CO 2非依賴性培養基（吉布科公司（Gibco）目錄號18045-088，含1.0% FBS、2 mM L-麩醯胺酸、青黴素和鏈黴素）中並在37°C、5% CO 2和濕度下孵育過夜。第二天早上，藉由向所有孔中加入等體積的含有4% v/v稀釋的GloSensor底物（普洛麥格公司，目錄號E1291）的CO 2非依賴性培養基開始測定。將細胞板在黑暗中在室溫孵育2 h。Biomek i7（貝克曼庫爾特（Beckman Coulter））儀器用於液體處理步驟。為了生成一式兩份劑量響應曲線，將3倍系列稀釋的化合物添加到細胞測定板中，最終體積為60 µL，在含有0.1% BSA、0.5 mM IBMX和0.4% DMSO的CO 2非依賴性培養基中的最終濃度範圍為100 nM至0.03 pM。EC 100對照孔（其含有最終濃度為2 nM的GLP1（7-36）肽（巴亨公司（Bachem），目錄號H-6795）和EC 0對照孔（其不含肽）在同一板中並使用與測試化合物相同的測定緩衝液同時測試。在向細胞中添加化合物後，將該板在黑暗中在室溫孵育12 min。然後使用具有「TRF光單元，337 nm」的Envision 2104 Multilabel閱讀器（珀金埃爾默公司（Perkin Elmer））測量發光，其中使用具有384孔發光孔徑的超靈敏方案設置「384孔US發光檢測器」，每孔0.1秒。cAMP活性計算為GLP1（7-36）EC 100對照孔的百分比：[(樣本信號-平均EC 0信號)/(平均GLP1（7-36）EC 100信號-平均EC 0信號)}*100。EC 50測定的曲線擬合在套裝軟體DAVID的Helios模組中進行。使用了4參數邏輯模型希爾坡度：y = A inf+ (A 0-A inf)/(1 + (x/AC 50) 希爾斜率)，其中y係功能響應；x係化合物濃度；A 0係最小值（在0劑量時）；A inf係最大值（在無限劑量時）；AC 50對應於拐點（即S形曲線上在A 0和A inf之間中間的點）。EC 50值由從Helios計算的AC 50值表示，單位為µM。E max係在濃度範圍內檢測到的最大活性，衍生自擬合曲線。 HEK293-SNAP-hGLP1R 細胞系的產生
將327 µL Opti-MEM培養基（吉布科公司，目錄號31985-062）與12 µL FuGENE® HD（普洛麥格公司，目錄號E2311）混合並在室溫孵育5 min。然後將8.2 µL（4 µg，0.485 µg/µL溶液）的編碼與SNAP標籤融合的人GLP1R（NCBI參考序列: NM_002062.3）的pSNAP-hGLP1R質體（浠思生物公司（Cisbio），目錄號PSNAP-GLP1）添加到Fugene HD/Opti-MEM混合物中，並在室溫孵育20 min。以800,000個細胞/mL製備HEK293細胞（ATCC® CRL-1573™）懸浮液。然後，將質體/FuGene HD混合物加入8 mL細胞中並輕輕混合。將2 mL新混合物添加到6孔板的4個孔中，並將2 mL未轉染的細胞添加到兩個孔中作為對照。將板在37°C孵育直至100%匯合。抗生素選擇[800 µg/mL G418（遺傳黴素，吉布科公司，目錄號10131-035）]在細胞胰蛋白酶化後以2500個細胞/mL的稀釋度進行。將1 mL細胞懸浮液加入10 cm培養皿中的20 mL選擇培養基中（共2500個細胞），並且平行地將4 mL稀釋的細胞懸浮液加入10 cm培養皿中的20 mL選擇培養基中（共10000個細胞）。其餘細胞在T150燒瓶中培養。此外，將HEK293細胞在T75燒瓶中的選擇培養基中培養作為陰性對照。最後，從10 cm培養皿中挑選出單個殖株並進行培養，直到有足夠的細胞用於基因表現分析和HTRF cAMP測定。殖株2顯示出最高的GLP1R依賴性cAMP響應，並被擴增以生成GloSensor穩定細胞系。 HEK293-SNAP-hGLP1R-GloSensor 穩定細胞系的產生
將穩定過表現SNAP-hGLP1R（如上所述）的HEK293細胞以300萬個細胞的密度鋪板在含有17 mL DMEM完全生長培養基（吉布科公司，目錄號11965-092）+ 10%胎牛血清（FBS，吉布科公司，目錄號16140-071）的10 cm培養皿中。第二天，如下轉染細胞。藉由在1758 µL Opti-MEM溶液中加入37 µg質體DNA，將DNA複合物製備為0.020 µg/µL pGloSensor™-22F cAMP質體（普洛麥格公司，目錄號E2301；GenBank®登錄號係GU174434）。然後，小心混合，添加112 µL FuGENE® HD試劑。在室溫孵育5-10 min後，將每孔850 µL複合物添加至細胞，並徹底混合。在37°C、5% CO 2和濕度下孵育24 h後，除去培養基並用PBS沖洗細胞。然後，添加選擇培養基[600 µg/mL G418和600 µg/mL潮黴素B（吉布科公司，目錄號10687010）]。每週更換培養基兩次，直到不再觀察到死細胞。一旦細胞殖株可見，在添加10 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液後，藉由上下吸移分離單細胞。然後將該等源自單細胞的殖株在具有選擇培養基（600 µg/mL G418 + 600 µg/mL潮黴素B）的六孔板中培養，直到有足夠的細胞可用於在本文所述之GloSensor發光測定中測試cAMP促效劑響應。產生所需響應的HEK293-SNAP-hGLP1R穩定細胞殖株用於人GLP1R cAMP促效劑測定。該等數據表明了測試的化合物的相對效力。 [ 表 1] ： hGLP1R cAMP 測定總結
化合物 EC 50 平均值（ μM ） EC 50SEM （ μM ） E max 平均值（ % ） E maxSEM （ % ） n 溶劑
化合物1 1.72E-05 1.32E-06 105 4 6 DMSO
化合物2 1.99E-05 2.06E-06 115 2 5 DMSO
化合物3 1.51E-05 9.80E-07 108 1 6 DMSO
化合物4 2.94E-05 1.30E-05 119 2 3 DMSO
化合物5 8.83E-05 3.53E-06 111 2 3 DMSO
化合物6 5.73E-06 2.31E-06 111 7 3 DMSO
化合物7 2.45E-05 2.15E-06 112 5 3 DMSO
化合物8 1.05E-04 1.06E-05 106 0 2 DMSO
化合物9 2.02E-04 6.72E-06 107 2 3 DMSO
索馬魯肽** 1.44E-05 7.50E-07 109 3 6 DMF
GLP1（7-36） 3.71E-06 2.60E-07 109 1 6 PBS + 0.1% BSA
**索馬魯肽醋酸鹽（表1-6）購自巴赫姆公司（Bachem）（目錄號H-7894），並溶解在如「 溶劑」行中的說明的DMF中。 食蟹猴 GLP1R cAMP 促效劑測定
使用HTRF cAMP測定（浠思生物公司，目錄號62AM4PEC）進一步測試所述之化合物的促效劑活性，該測定測量GPCR經配體激活後細胞內cAMP濃度的變化。這種測定基於競爭形式，該競爭形式涉及特異性抗cAMP單株抗體，該抗體標記有Eu 3+穴狀化合物（供體螢光團）和與d2偶合的cAMP（受體螢光團）。這使得能夠直接表徵作用於細胞中G蛋白偶合受體的化合物。細胞產生的天然cAMP與經d2標記的cAMP競爭結合抗cAMP抗體-Eu 3+穴狀化合物。將穩定過表現食蟹猴GLP1受體（cynoGLP1R）的HEK293-cynoGLP1R F6細胞以5000個細胞/孔接種於白色384孔聚-D-離胺酸包被板（格雷納生物一號公司，目錄號 781945）中的DMEP完全培養基（吉布科公司，目錄號11965-092，10%熱滅活FBS，0.5 mg/ml遺傳黴素；吉布科生命技術公司（Gibco Life Technologies），目錄號10131027）中，並在37°C、5% CO 2和濕度下孵育過夜。第二天進行測定。肽在刺激緩衝液[1X HBSS（生命技術公司（Life Technologies），目錄號14065-056）、20 mM HEPES（生命技術公司，目錄號15630）、0.1% BSA（西格瑪公司（Sigma），目錄號A0281）和0.5 mM IBMX]中稀釋。為了生成一式三份劑量響應曲線，將3倍系列稀釋的化合物（以2倍濃度）稀釋在DMSO中。用ELx405 Select、BioTek 洗板機清洗細胞，留下10 μL/孔測定緩衝液[1X HBSS（生命技術公司，目錄號14065-056）、20 mM HEPES（生命技術公司，目錄號15630）]。將板短暫離心，每孔添加10 μL 2倍稀釋的肽。將板再次短暫離心並在室溫孵育30 min。將20x d2和Eu 3+穴狀化合物在套組提供的裂解緩衝液中稀釋。與肽一起孵育30 min後，每孔添加10 μL的稀釋的d2，然後添加10 μL的稀釋的Eu 3+穴狀化合物。用黑色蓋子覆蓋板並在短暫離心後在RT孵育1 h。然後用Envision 2104 Multilabel閱讀器（珀金埃爾默公司）測量HTRF信號，螢光發射設置在兩個不同的波長（665 nm和620 nm）。EC 50測定的曲線擬合在套裝軟體DAVID的Helios模組中進行。對板的部分進行4參數邏輯曲線擬合，放置標準曲線化合物以獲得4個標準參數：std_crv_ac50（標準曲線AC 50）、std_crv_a0（標準曲線A 0）、std_crv_ainf（標準曲線A inf）、std_crv_hill（標準曲線希爾斜率）。然後，這4個參數值用於將標準曲線變換應用到每個孔，使用公式：y = std_crv_ac50 * [ (X - std_crv_a0)/(std_crv_ainf - X)] ^ (1/std_crv_希爾)。y係功能響應；x係化合物濃度。對變換後的數據進行4參數邏輯曲線擬合，以獲得所有測試的化合物的AC 50（以μM），其表示該測定的EC 50值。E max表示為GLP1（7-36）EC 100的百分比：[(樣本A max-樣本A 0)/(GLP1（7-36）A max-GLP1（7-36）A 0)]*100。 HEK293-cynoGLP1R 穩定細胞系的產生
HEK293細胞在轉染前一天以1 X 10 6個細胞的密度接種在T25燒瓶中的8 mL DMEM完全生長培養基 + 10% FBS中。第二天，如下轉染細胞。藉由在414 µL OptiMEM溶液中添加編碼cyno GLP1R cDNA[密碼子優化的，GeneArt（賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific））；NCBI參考序列：NP_001274592]的8.8 µg pcDNA3.1 (+) Neo質體，以0.020 µg/µl製備DNA複合物。然後，小心混合，添加26 µL FuGENE® HD試劑。在室溫孵育5-10 min後，將每孔400 µL複合物添加至細胞，並徹底混合。在37°C、5% CO2和濕度下孵育48 h後，將細胞轉移到0.5 mg/mL遺傳黴素存在的15 cm培養皿中。選擇在功能性cAMP測定中顯示最高活性的HEK293T-cynoGLP1R穩定細胞殖株（殖株F6）用於在cyno GLP1R cAMP細胞促效劑測定中進行進一步分析。
該等數據表明了測試的化合物的相對效力。 [ 表 2] ： cynoGLP1R cAMP 測定總結
化合物 EC 50 平均值（ μM ） EC 50SEM （ μM ） E max 平均值（ % ） E maxSEM （ % ） n 溶劑
化合物1 1.59E-04 2.08E-05 111 4.5 6 DMSO
化合物2 2.18E-04 2.41E-05 119 7.3 7 DMSO
化合物3 2.94E-04 3.63E-05 108 4.2 3 DMSO
化合物4 4.68E-04 8.05E-05 112 4.2 5 DMSO
化合物5 5.77E-04 1.09E-04 103 4.0 3 DMSO
化合物6 6.61E-05 1.51E-05 108 6.1 3 DMSO
化合物7 3.18E-04 2.05E-05 108 8.4 4 DMSO
化合物9 2.24E-03 3.81E-04 111 4.6 3 DMSO
索馬魯肽** 4.91E-05 3.4E-06 110 3.3 6 DMF
GLP1（7-36） 2.17E-05 2.48E-06 100 0 6 PBS + 0.1% BSA
小鼠 GLP1R cAMP 促效劑測定
除了 使用穩定過表現小鼠GLP1受體（mGLP1R）的HEK293-mGLP1R CRE-Luc（殖株C3）細胞（生成如下所述）之外，化合物的cAMP促效劑活性使用與食蟹猴GLP1R cAMP測定類似的程序進行測試（見上文）。 HEK293-mGLP1R CRE-Luc 穩定細胞系的產生
將HEK293T CRE-Luc細胞以3 X 10 6個細胞的密度接種在10 cm培養皿中的17 mL DMEM完全生長培養基 + 10% FBS中。第二天，如下轉染細胞。藉由以下以0.020 µg/µL製備DNA複合物：添加37 µg編碼小鼠GLP1R cDNA（GeneCopoeia，目錄號EX-Mm23901-M67；NCBI參考序列：NM_021332.2）的質體DNA至1758 µL Opti-MEM溶液中。然後，小心混合，添加112 µL FuGENE® HD試劑。在室溫孵育5-10 min後，將每孔850 µL DNA複合物添加至細胞，並徹底混合。在37°C、5% CO 2和濕度下孵育24 h後，除去培養基；用PBS沖洗細胞並拆分。然後，添加選擇培養基[2 µg/mL嘌呤黴素（康寧公司（Corning），目錄號61-385-RA）和100 µg/mL潮黴素（吉布科公司，目錄號10687010）]。每週更換培養基兩次，直到不再觀察到死細胞。一旦細胞殖株可見，就分離單細胞。顯示最大基因表現的HEK293T-mGLP1R-CRE-Luc穩定細胞殖株（殖株C3）用於小鼠GLP1R cAMP細胞促效劑測定。
該等數據表明了測試的化合物的相對效力。 [ 表 3] . mGLP1R cAMP 測定總結
化合物 EC 50 平均值（ μM ） EC 50SEM （ μM ） E max 平均值（ % ） E maxSEM （ % ） n 溶劑
化合物1 1.26E-04 1.52E-05 111 3.1 12 DMSO
化合物3 1.69E-04 2.09E-05 110 3.6 8 DMSO
化合物2 1.55E-04 1.42E-05 117 1.9 13 DMSO
化合物5 5.44E-04 8.68E-05 107 3.5 4 DMSO
化合物4 4.28E-04 1.27E-04 118 4.7 6 DMSO
化合物9 6.86E-04 1.80E-04 109 3.5 4 DMSO
化合物6 3.40E-05 2.76E-05 104 3.1 6 DMSO
化合物7 1.55E-04 2.65E-05 96 3.9 6 DMSO
索馬魯肽** 3.37E-05 3.08E-05 106 2.8 5 DMF
GLP1（7-36） 7.78E-06 1.04E-06 100 0 8 PBS + 0.1% BSA
人 GLP1R β- 抑制蛋白募集測定
使用PathHunter® β-抑制蛋白測定（DiscoverX公司）測量促效劑募集β-抑制蛋白的程度。該測定使用酶互補方法測量β-抑制蛋白與受體的結合。對β-半乳糖苷酶的兩個無活性部分（稱為Prolink和酶受體，或「EA」）加標籤，以便人GLP1R（hGLP1R）包含Prolink部分，並且β-抑制蛋白包含EA部分。當β-抑制蛋白被募集到受體上時，酶變得由活性並在化學發光底物（PathHunter®檢測套組，DiscoverX目錄號93-0001）存在下產生發光。可以在相關檢測器上測量發光。將穩定過表現帶有Prolink標籤的hGLP1R和帶有EA標籤的β-抑制蛋白的CHO-hGLP1R-β-抑制蛋白血球以每孔20 μL接種於白色384孔聚-D-離胺酸包被板（格雷納生物一號公司，目錄號781945）的鋪板試劑2（DiscoverX，目錄號93-0563R2A）中，並在37°C、5% CO 2和濕度下孵育過夜。第二天，以最終所需濃度的5倍製備促效劑。為了生成一式三份劑量響應曲線，將化合物在測定緩衝液（HBSS、10 mM Hepes和0.1% BSA）中系列稀釋3倍，然後添加到細胞測定板中，最終體積為25 μL，最終最高濃度起始於3 μM或更小，這取決於化合物。EC 100對照孔（其含有最終濃度為1 μM的GLP1（7-36）肽（巴亨公司（Bachem），目錄號H-6795）和EC 0對照孔（其不含化合物）在同一板中並使用與測試化合物相同的測定緩衝液同時測試。將化合物添加至細胞後，將板在37°C、5% CO 2和濕度下孵育2 h。然後製備檢測試劑（19份細胞測定緩衝液、5份底物試劑1和1份底物試劑2，根據製造商的建議，DiscoverX目錄號93-0001），向細胞測定板中每孔添加12 μL。將板在室溫在黑暗中再孵育一個小時。然後使用具有「TRF光單元，337 nm」的Envision 2104 Multilabel閱讀器（珀金埃爾默公司）測量發光，其中使用具有384孔發光孔徑的超靈敏方案設置「384孔US發光檢測器」，每孔0.1秒。計算β-抑制蛋白募集並使用Microsoft Excel表示為GLP1（7-36）EC 100對照孔的百分比：[(樣本信號-平均EC 0信號)/(平均GLP1（7-36）EC 100信號-平均EC 0信號)]*100。使用GraphPad Prism進行EC 50測定的曲線擬合。使用了4參數邏輯模型希爾坡度：Y = 底 + (頂-底)/(1 + 10^((Log EC 50-X)*希爾斜率))，其中Y係功能響應；X係化合物濃度；底係A 0或最小值（在0劑量時）；頂係A inf或最大值（在無限劑量時）；EC 50係拐點（即在S形曲線上A 0和A inf之間中間的點）。EC 50值以μM計算。E max係在濃度範圍內檢測到的最大活性，衍生自相對於GLP1（7-36）的擬合曲線。 CHO-hGLP1R-β- 抑制蛋白血球系的產生
將PathHunter ®CHO-K1-EA親代細胞（DiscoverX公司，目錄號93-0164）以2 X 10 6個細胞/T75 cm 2燒瓶的密度鋪板在22 mL完全培養基中（測定完全細胞培養套組107，DiscoverX公司，目錄號92-3107G）。第二天，將培養基更換為22 mL不含抗生素的新鮮培養基，並如下轉染細胞。在Opti-MEM培養基（3 : 1比例的試劑 : DNA）中製備質體/Fugene® HD轉染混合物。將25 µg（34 µL）pCMV-PK1-GLP1R質體[（DiscoverX pCMV PK載體束，目錄號93-0491，插入的序列編碼全長人類GLP1R-NCBI參考序列：NM_002062，由GeneArt（賽默飛世爾科技公司）合成]添加到1129 μL Opti-MEM中，總體積為1163 μL。然後，藉由小心混合來添加74 μL FuGENE® HD試劑。在室溫孵育5-10 min後，向細胞添加1125 μL複合溶液並在37°C孵育48 h。隨後，除去培養基並添加含有300 µg/mL潮黴素（吉布科公司，目錄號10687010）和500 µg/mL遺傳黴素（吉布科公司，目錄號10131035）的選擇培養基。每2-3天更換培養基，直到不再觀察到死細胞。將細胞分離，以300000個細胞/mL重新懸浮，並用40 µm過濾器過濾。然後使用Aria G儀器將細胞進行FACS分選為黑色、透明底聚-D-離胺酸包被的96孔板中100 μL培養基中的單細胞。每2-3天藉由以下更換培養基：去除多達80 μL並添加含有選擇抗生素的新鮮培養基。對存活的單個殖株進行擴增和測試。基於最佳信號和曲線譜選擇單個殖株1用於β-抑制蛋白測定。 [ 表 4] ： β- 抑制蛋白總結
化合物 EC 50 平均值（ μM ） EC 50SEM （ μM ） E max 平均值（ % ） E maxSEM （ % ） n 溶劑
化合物1 0.192 0.034 92 1.8 7 DMSO
化合物2 0.133 0.021 94 5.1 4 DMSO
化合物3 0.149 0.030 91 4.5 4 DMSO
化合物4 0.235 0.004 84 10.1 4 DMSO
化合物5 0.254 0.058 77 6.1 3 DMSO
化合物6 0.070 0.006 75 2.6 3 DMSO
化合物7 0.178 0.015 82 12.2 3 DMSO
化合物9 ＞ 2 0.000 37 3.5 3 DMSO
索馬魯肽** 0.036 0.004 67 3.5 3 DMF
GLP1（7-36） 0.007 0.001 100 0.0 7 PBS + 0.1% BSA
β-抑制蛋白測定中評估的數據可能與本文所述化合物的胃腸道耐受性（噁心/嘔吐的減少）以相反的方式相關，即化合物在β-抑制蛋白測定中的活性越低，它的耐受性就越高。[參見例如Jones等人 Nat. Commun.[自然通訊] 2018, 9, 1602.] 人 GLP1R DERET 內化和再循環測定
促效劑內化或允許人類GLP1R再循環的程度係根據基於即時FRET的「DERET」（解離增強共振能量轉移）測定的優化版本確定的。該技術依賴於用SNAP-Lumi-Terbium（供體螢光團，浠思生物公司，目錄號SSNPTBD）標記經SNAP標記的GPCR。在存在過量螢光素（受體螢光團）的情況下，將化合物與過表現目的GPCR的細胞一起孵育。當GPCR在細胞表面時，供體信號被受體猝滅，供體/受體比率較低。隨著GPCR內化，供體信號不再被猝滅，受體不再被激發，因此供體/受體比率增加。添加過量的拮抗劑會阻止受體進一步內化，使受體再循環回膜，導致隨後供體/受體比率降低。
將HEK293-SNAP-hGLP1R-GloSensor細胞（穩定過表現經SNAP標記的hGLP1R）接種在白色384孔聚-D-離胺酸包被板（格雷納生物一號公司，目錄號781945）中的常規DMEM生長培養基（吉布科公司，目錄號11965-092、10%熱滅活FBS、10 mM HEPES、1x青黴素/鏈黴素、0.5 mg/mL遺傳黴素（吉布科公司，目錄號10131-035）和0.25 mg/mL潮黴素B（英傑公司，目錄號10687010）中過夜。在測定當天，去除細胞培養基並在Opti-MEM溶液中加入100 nM SNAP-Lumi-Tb試劑。將細胞在37°C孵育1 h。將細胞用板洗滌器在測定緩衝液[1X HBSS（10X吉布科公司，目錄號14065-056）、20 mM Hepes（吉布科公司，目錄號15630-080）、1 mM CaCl 2（弗盧卡公司（Fluka），目錄號21114-1L）、1 mM MgCl 2（安比恩公司（Ambion），目錄號AM9530G）pH 7.4]中洗滌並且將20 μL含0.1% BSA的緩衝液添加到每個孔中。讓細胞在37°C平衡約15 min後，添加10 μl螢光素（鈉鹽，西格瑪公司，目錄號F6377，在緩衝液中稀釋），最終濃度為25 μM。為了生成一式三份劑量響應曲線，將化合物在測定緩衝液中系列稀釋3倍，然後添加到細胞測定板中，最終體積為40 μL，最終最高濃度起始於3 μM或更小，這取決於具體情況。在與測試的化合物相同的板和測定緩衝液中，包括GLP1（7-36）肽（巴亨公司，目錄號H-6795）對照曲線，最終最高濃度為1 μM，以建立EC 100。還包括僅含緩衝液的EC 0孔。使用帶有LANCE/DELFIA D400單鏡、激發濾光片X320和發射濾光片M615_203（供體發射）和M515（受體發射）的Perkin Elmer Envision立即測量板FRET螢光，然後每30 min測量一次。在120 min達到峰值內化，此時將10 μM（最終）Exendin 9-39（巴亨公司，目錄號H8740，GLP1R拮抗劑）添加到所有孔中以進一步阻斷促效劑結合。測量再持續180 min，以確定受體再循環回膜的情況。在讀取之間將板保持在37°C。使用Microsoft Excel將數據表示為供體/受體發射的比率，並在GraphPad Prism中繪製。為了確定針對內化的EC 50和E max，計算數據並使用Microsoft Excel表示為GLP1（7-36）EC 100對照孔的百分比：[(樣本信號-平均EC 0信號)/(平均GLP1（7-36）EC 100信號-平均EC 0信號)]*100。使用GraphPad Prism進行EC 50測定的曲線擬合。使用了4參數邏輯模型希爾坡度： Y = 底 + (頂-底)/(1 + 10^((Log EC 50-X)*希爾斜率))， 其中Y係功能響應；X係化合物濃度；底係A 0或最小值（在0劑量時）；頂係A inf或最大值（在無限劑量時）；EC 50係拐點（即在S形曲線上A 0和A inf之間中間的點）。EC 50值以μM計算。E max係在濃度範圍內測量到的最大活性，衍生自相對於GLP1（7-36）的擬合曲線。為了確定受體再循環參數，在添加Ex9-39後的每個時間點計算相對E max，並使用4參數S形擬合隨時間擬合曲線。使用該模型，我們確定了受體再循環回膜的T 1/2速率。我們還確定了再循環的受體的最大百分比，其作為最初內化的量的比例。 [ 表 5] ：內化測定總結
化合物 EC 50 平均值（ μM ） EC 50SEM （ μM ） E max 平均值（ % ） E maxSEM （ % ） n 溶劑
化合物1 0.535 0.05 88 5.4 3 DMSO
化合物2 0.331 0.07 96 3.0 3 DMSO
化合物3 0.372 0.08 93 6.7 3 DMSO
化合物4 0.056 0.01 100 3.2 3 DMSO
化合物5 0.079 0.03 105 4.4 3 DMSO
化合物6 0.153 0.06 92 8.4 3 DMSO
化合物7 0.367 0.08 77 4.8 3 DMSO
化合物9 ＞ 1 0.00 22 0.0 3 DMSO
索馬魯肽** 0.070 0.01 91 5.9 4 DMF
GLP1（7-36） 0.027 0.00 100 0.0 8 PBS + 0.1% BSA
[ 表 6] ：再循環測定總結
化合物 T 1/2 平均值（ min ） T 1/2SEM （ min ） 再循環的受體的平均值（ % ） 再循環的受體的 SEM （ % ） n 溶劑
化合物1 62.3 3.7 65 6.5 3 DMSO
化合物2 71.3 5.2 68 4.6 3 DMSO
化合物3 74.2 0.5 69 5.8 3 DMSO
化合物4 105.5 6.4 65 2.6 3 DMSO
化合物5 135.2 9.7 62 5.5 3 DMSO
化合物6 69.1 0.2 70 4.8 3 DMSO
化合物7 76.4 5.6 71 4.0 3 DMSO
化合物9 NC NC NC NC 3 DMSO
索馬魯肽** 100.6 5.1 64 3.9 3 DMF
GLP1（7-36） 61.1 1.9 41 1.7 6 PBS + 0.1% BSA
NC：未計算
內化速率越低，受體再循環速率越快，受體在膜上保留的越多。表5顯示受體內化數據，表6顯示受體再循環數據。在後者中，較低的T 1/2值表明受體更快地返回細胞表面，並且可用於與化合物相互作用的受體數量增加[參見例如Jones等人 Nat. Commun.[自然通訊] 2018, 9, 1602.]。這可能與所述之化合物的耐受性以相反的方式相關，即，效力越低，耐受性越強。 藥物動力學實驗 小鼠 PK ：
對於所有體內實驗，本文揭露的化合物以在PBS中的儲備溶液製備，其中化合物的濃度為1 mg/mL。然後用鹽水稀釋該等儲備溶液以獲得實驗中揭露的濃度。
對於所有體內實驗，索馬魯肽係作為稱為OZEMPIC（它係1.34 mg/mL索馬魯肽的儲備溶液）的臨床配製物購買的。該儲備溶液包含無活性的磷酸二鈉二水合物，1.42 mg；丙二醇，14.0 mg；苯酚，5.50 mg；和注射用水。OZEMPIC的pH值為約7.4。然後用鹽水稀釋該儲備溶液以獲得本文揭露的濃度。
對於所有化合物：為獲得藥物動力學參數，對從6週齡開始餵食高脂肪飲食（60%熱量來自脂肪）的三隻C57BL/6小鼠（20-30週齡）使用5 mL/kg的劑量體積以0.24 mg/kg皮下（sc）給藥在鹽水中的化合物，其中化合物的濃度為48 μg/mL。在化合物投與後，在給藥後第0天0.5、1、3和6 h，然後在給藥後24、48、72、96、168、240、336、和408 h（即第1、2、3、4、7、10、14和17天）經由尾部切口將血液樣本收集在包被EDTA的試管中。藉由離心（13,000 rpm，4°C，5 min）獲得血漿部分；並且將小鼠血漿的30 µL等分試樣轉移到96孔板中進行生物分析。在空白小鼠血漿（未處理的小鼠的血漿）中製備校準標準品和QC樣本。將PK樣本用空白小鼠血漿（10 μL樣本加10 μL空白小鼠血漿）稀釋2倍，並使用蛋白質沈澱程序提取，該程序包括添加150 μL含內標的甲醇。將樣本在4°C以4000 rpm的轉速渦旋和離心15 min。將上清液的125 μL等分試樣轉移到96孔板中，並且向每個孔中添加100 μL水並渦旋。使用下面概述的條件，藉由LC-MS/MS對樣本進行分析和量化。 LC/MS/MS 方法質譜儀：Thermo QExactive HFX 液相層析儀：Thermo Vanquish 自動進樣器（ALS）：Thermo Vanquish HPLC 條件LC柱：Waters Acquity UPLC蛋白質BEH C4，50 x 2.1 mm，1.7 um 溶劑A：100 : 0.1（v : v）水 : 甲酸 溶劑B：100 : 0.1（v : v）乙腈 : 甲酸 注射體積：10 μL 柱溫箱溫度：40°C ALS溫度：4°C [ 表 7] ：梯度
時間（ min ） %A %B 流量 [μL/min]
0.00 70 30 500
0.50 70 30 500
3.50 5 95 500
4.00 5 95 500
4.01 70 30 500
4.50 70 30 500
MS 條件離子源：HESI 極性：陽性 輔助氣體加熱器溫度：380°C 鞘流氣流速：60 輔助氣體流速：14 吹掃氣體流速：3 離子噴霧電壓：3500 V 毛細管溫度：320°C [ 表 8] ： DIO 小鼠 PK 數據：（穩定性評估）
化合物 劑量（ mg/kg ） T max （天） C max （ nmol/L ） AUC inf （天 *nmol/L ） T 1/2 （天）
化合物1 0.24 1.0 ± 0.0 308 ± 58.1 854 ± 59.2 1.4 ± 0.05
化合物2 0.24 1.0 ± 0.0 338 ± 54.6 1150 ± 115 1.5 ± 0.04
化合物3 0.24 1.0 ± 0.0 261 ± 41.9 683 ± 72.5 1.0 ± 0.05
化合物4 0.24 1.3 ± 0.6 241 ± 37.6 892 ± 37.4 1.7 ± 0.2
化合物5 0.24 1.0 ± 0.0 548 ± 106 1650 ± 150 2.1 ± 0.2
化合物6 0.24 0.25 ± 0 284 ± 48.2 371 ± 70 0.5 ± 0.01
化合物7 0.24 1.0 ± 0.0 354 ± 47.1 1050 ± 216 1.37 ± 0.14
索馬魯肽 0.12 0.21 ± 0.07 219 ± 25.5 194 ± 26.3 0.35 ± 0.09
食蟹猴 PK ：
為了獲得藥物動力學參數，使用0.5 mL/kg的劑量體積向肥胖的雄性食蟹猴給予單次皮下劑量的化合物，其在鹽水中的配製濃度為30、60或90 μg/mL。猴在早上餵食前給藥，但不禁食。以規定的時間間隔（給藥前、給藥後0.25、0.5、1、3、7、24、48、96、168、240、336和504 h）對動物經由大隱靜脈采血。將血液抽入含有K 2EDTA的真空采血管中並儲存在冰上直至離心。血漿部分藉由在4°C以1000-2000 RCF（通常為1300 RCF）離心10 min獲得。將猴血漿的50 µL等分試樣轉移到96孔板中進行生物分析。在空白食蟹猴肥胖猴血漿（未經處理的肥胖猴血漿）中製備校準標準品和QC樣本。將PK樣本用空白肥胖猴血漿（10 μL樣本加10 μL空白肥胖猴血漿）稀釋2倍，並使用蛋白質沈澱程序提取，該程序包括添加150 μL含內標的甲醇。將樣本在4°C以4000 rpm的轉速渦旋和離心15 min。將上清液的125 μL等分試樣轉移到96孔板中，並且向每個孔中添加100 μL水並渦旋。使用概述的條件，藉由LC-MS/MS對樣本進行分析和量化。 [ 表 9] ：肥胖猴 PK 數據：（穩定性評估）
化合物 劑量（ mg/kg ） T max （天） C max （ nmol/L ） AUC inf （天 *nmol/L ） T 1/2 （天）
化合物1 0.045 1.0 ± 0.0 119 ± 29.0 1020 ± 202 4.8 ± 0.4
化合物2 0.015 2.3 ± 1.2 28.2 ± 1.7 294 ± 26.7 6.0 ± 1.1
化合物3 0.015 2.3 ± 1.2 24.4 ± 8.3 196 ± 9.8 3.8 ± 0.4
化合物5 0.030 1.3 ± 0.6 31.4 ± 10.4 264 ± 101 4.4 ± 0.4
索馬魯肽 0.004 1.0 ± 0.0 7.11 ± 2.2 35.5 ± 7.1 2.8 ± 0.2
表8和表9中評估的數據提供了與索馬魯肽相比本發明化合物具有優異的體內抗代謝降解穩定性的證據。 功效研究：急性食物攝入研究：
在飲食誘導的肥胖（DIO）雄性小鼠（從6週齡開始餵食高脂肪飲食（60%卡路里來自脂肪）的C57BL/6小鼠）中對單次SC皮下（s.c.）劑量的每種測試化合物（在鹽水中24、38或48 µg/ml的配製濃度（劑量體積5 mL/kg））（例如化合物1）後的食物攝入（FI）進行了評估。研究中使用了24-30週齡的雄性。根據經批准的IACUC方案，將動物圈養在正常光照週期（上午6:00-下午6:00燈亮，其他時間熄燈）房間內每籠一隻。平均食物攝入（FI）（在研究開始前3天內測量的24 h食物攝入）用作基線。在研究開始時，記錄食物重量並且給動物皮下給藥測試化合物。在測試化合物給藥後24 h測量食物攝入重量。在以指定劑量皮下投與單劑量的化合物後評估肥胖小鼠24小時後的食物攝入（FI）；所得數據如表10所示。作為比較，評估了索馬魯肽的作用。 [ 表 10] ：單次皮下投與後 DIO 模型小鼠的食物攝入
化合物 FI @ 24 h （基線 % ） 劑量
化合物1 -88 ± 2 240 μg/kg
化合物2 -91 ± 5 240 μg/kg
化合物3 -97 ± 3 240 μg/kg
化合物4 -54 ± 9 240 μg/kg
化合物5 -72 ± 3 120 μg/kg
-81 ± 5 190 μg/kg
-89 ± 2 240 μg/kg
化合物6 -67 ± 8 240 μg/kg
化合物7 -49 ± 12 240 μg/kg
化合物9 -44 ± 12 240 μg/kg
索馬魯肽 -86 ± 1 120 μg/kg
功效研究
在飲食誘導的肥胖（DIO）雄性小鼠（從6週齡開始餵食高脂肪飲食（60%卡路里來自脂肪）的C57BL/6小鼠）評估化合物（例如化合物1）治療後的功效（食物攝入和體重減輕）。研究中使用了24-30週齡的雄性（n = 7/組）。根據經批准的IACUC方案，將動物圈養在正常光照週期房間內每籠一隻。根據體重（BW）和食物攝入（FI）的平均值（24 h食物攝入，在研究開始前的3天內測量）將小鼠分配到媒劑（鹽水）或一或多個治療組。在研究開始時，記錄體重和食物重量，並向動物皮下給藥媒劑或化合物（在鹽水中12、24、29.6、38或48 ug/ml，使用5 ml/kg的劑量體積）。QD或當指示時Q3D（每3天）給予一或多種化合物或媒劑。QD給藥索馬魯肽。每天測量體重和食物攝入。化合物1和索馬魯肽的劑量係根據 (i) 在單獨研究中評估並與已發表的數據（索馬魯肽）一致的最大功效和 (ii) 等莫耳濃度來選擇。根據在單獨研究中評估的化合物1的最大功效選擇立體異構物（化合物2和3）的劑量。
在皮下投與化合物後在18、24和30天後肥胖小鼠的體重減輕顯示在表11中。取決於劑量，QD或Q3D給藥測試化合物和媒劑；QD給藥索馬魯肽；所有化合物都溶解在鹽水中。 [ 表 11] ：皮下投與後 DIO 模型小鼠中的體重減輕
化合物 平均初始 BW （ g ） 劑量 體重減輕 （基線 % ） 天數
化合物5 53.4 ± 0.4 60 μg/kg QD -7.4 ± 1.4 24
120 μg/kg Q3D -10.7 ± 1.1
240 μg/kg Q3D -19.0 ± 1.2
化合物1 58.2 ± 0.5 148 μg/kg Q3D 240 μg/kg QD -17.1 ± 2.2 -33.4 ± 3.8 30
索馬魯肽 120 μg/kg QD -17.8 ± 1.2
化合物1 49.3 ± 0.3 190 μg/kg Q3D -19.5 ± 3.0 18
化合物2 -14.1 ± 1.1
化合物3 -25.6 ± 2.9
化合物1 49.3 ± 0.3 240 μg/kg Q3D -20.5 ± 2.8 18
化合物2 240 μg/kg QD -20.5 ± 3.0
化合物3 240 μg/kg Q3D -24.2 ± 2.7
Cyno 功效研究：
藉由評估其對BW和FI的影響，在肥胖食蟹猴中評估了新穎長效GLP1R促效劑（化合物1）的藥物動力學（PK）/藥效學（PD）關係。功效定義為FI和BW的降低。耐受性，評估為嘔吐減少和/或沒有嘔吐，並且對選擇的水果、蔬菜和花生作為零食保持興趣。
猴在至少一週的過程中適應研究飲食（5TUR飲食，1 g丸粒（測試飲食公司（TestDiet）目錄號1815639-310））。在適應期之後，在給藥的第一天前一週記錄食物攝入，以確定基線食物攝入（FI）。基線體重計算為在給藥第一天之前的七天內獲得的兩次獨立測量值的平均值。
給十隻雄性肥胖食蟹猴皮下（s.c.）注射媒劑（n = 4）或化合物（n = 6）（0.03 mg/kg，使用的劑量體積為0.5 mL/kg，因此0.06 mg/mL濃度；）。將測試化合物以指定濃度溶解在鹽水中。猴在早上餵食前給藥，但不禁食。在整個研究過程中每天測量食物攝入。給猴預先稱重的食物，200 g/天；食物分配的一半在上午給予，其餘在下午給予。第二天早上對剩餘的食物進行稱重以確定每日的FC。每週測量體重（BW）兩次。 [ 表 12] ：肥胖猴的體重變化
體重隨時間的變化
按天計的時間 化合物 1 30 µg/kg s.c.Q1W 媒劑（鹽水） s.c.Q1W
0 0.0% ± 0.0% 0.0% ± 0.0%
4 -1.6% ± 1.1% -0.2% ± 0.3%
7 -1.2% ± 0.7% 0.5% ± 0.2%
11 -1.8% ± 1.2% 0.6% ± 0.2%
14 -2.2% ± 1.0% 0.6% ± 0.5%
18 -2.7% ± 1.5% 0.9% ± 0.6%
21 -2.6% ± 1.4% 1.0% ± 0.4%
25 -3.1% ± 1.7% 1.6% ± 0.8%
28 -3.1% ± 1.6% 1.2% ± 0.9%
32 -3.5% ± 2.1% 1.7% ± 1.0%
35 -4.2% ± 1.9% 1.4% ± 1.0%
39 -4.2% ± 2.2% 1.2% ± 0.8%
42 -3.7% ± 2.2% 1.8% ± 1.2%
[ 表 13] ：肥胖猴食物攝入的變化
食物攝入（ FI ）隨時間的相對變化
按天計的時間 化合物 1 30 µg/kg s.c.Q1W +/- SEM 媒劑（鹽水） s.c.Q1W +/- SEM
0 0.0% 0.0% 0.0% 0.0%
1 -35.0% 16.0% -2.5% 4.1%
2 -52.8% 18.6% -5.4% 6.0%
3 -50.2% 17.9% -12.6% 7.3%
4 -38.2% 15.1% -0.7% 8.2%
5 -27.6% 12.1% -4.0% 2.3%
6 -20.4% 10.4% 1.3% 2.1%
7 -10.2% 4.8% 8.8% 8.7%
8 -31.3% 14.1% -1.9% 6.7%
9 -40.2% 17.3% -3.0% 8.5%
10 -39.2% 15.9% 0.7% 0.6%
11 -29.6% 13.3% 5.5% 5.9%
12 -26.0% 13.0% -6.8% 7.6%
13 -23.0% 10.3% -2.8% 2.4%
14 -23.3% 11.2% -5.3% 2.8%
15 -29.0% 14.3% 8.1% 7.4%
16 -42.7% 18.4% 3.7% 5.8%
17 -39.2% 16.1% -15.2% 21.8%
18 -35.7% 15.4% 6.2% 5.3%
19 -25.0% 14.8% -0.4% 4.2%
20 -24.4% 12.7% 2.5% 14.1%
21 -25.0% 14.8% 7.7% 6.9%
22 -35.7% 16.8% -0.5% 0.4%
23 -49.4% 16.2% -0.7% 5.6%
24 -37.5% 16.4% -8.2% 11.1%
25 -32.0% 15.9% 12.3% 11.8%
26 -28.3% 14.7% 1.9% 2.8%
27 -19.7% 16.1% 3.8% 14.0%
28 -25.0% 14.6% -4.0% 6.8%
29 -28.8% 15.2% 9.9% 9.1%
30 -42.2% 18.4% 3.1% 4.8%
31 -42.1% 18.7% -19.9% 10.6%
32 -32.7% 15.7% 9.9% 9.7%
化合物1抑制肥胖猴的食物攝入並降低體重（見表12和13）。所有數據均表示為平均值 ± SEM，n = 7/組。 耐受性評估：
出人意料的是，發現本文所述之化合物在投與於肥胖猴時具有更好的耐受性（針對索馬魯肽作為比較物進行評估）。雖然在投與化合物1、2、5或9後沒有猴表現出任何嘔吐跡象，並且1/6的猴表現出用化合物時3嘔吐，所有接受索馬魯肽的猴都嘔吐（見表14）。 [ 表 14] ：根據化合物的單劑量 s.c. 投與的嘔吐和 FI 評估
化合物 觀察到 FI 減少 單劑量 S.C. 嘔吐（研究中嘔吐的猴數量 / 動物總數）
索馬魯肽 是 30 μg/kg 是（3/3）
化合物1 是 30 μg/kg 否（0/2）
化合物2 是 30 μg/kg 否（0/6）
化合物3 是 30 μg/kg 是（1/6）
化合物5 是 15 μg/kg 否（0/3）
是 30 μg/kg 否（0/3）
化合物9 是 30 μg/kg 否（0/3）
化學部分 A ：分析部分LCMS方法： 方法 A
流動式細胞測量術 1 mL/min
洗脫液 A：水（0.1%甲酸）；B：ACN（0.1%甲酸）
梯度 時間 %A %B
   0.00 95 40
   1.40 5 98
   2.05 5 98
   2.10 95 40
柱 Acquity BEH 1.7 µm 2.1 x 50 mm
柱溫 50°C
質譜儀 單四極桿ESI掃描範圍120-1600
UPLC Waters Acquity；
方法 B
流動式細胞測量術 1.5 mL/min
洗脫液 A：水（0.037% TFA）；B：ACN（0.018% TFA）
梯度 時間 %A %B
   0.00 95 5
   0.80 5 95
   1.20 5 95
   1.21 95 5
   1.55 95 5
柱 Kinetex® 5 um 30 x 2.1 mm S/N：H17-247175
柱溫 50°C
電離源 ESI
儀器 SHIMADZU LCMS-2020
檢測器 PDA（220 nm & 254 nm）
掃描範圍 100-1000
方法 C
流動式細胞測量術 1.0 mL/min
停止時間 5.20 min
洗脫液 A：水（0.1% TFA）；B：ACN（0.1% TFA）
梯度 時間 %A %B
   0.00 98 2
   4.40 2 98
   5.15 2 98
   5.19 98 2
柱 AcQuity UPLC BEH C18 1.7 µm 2.1 × 50 mm
柱溫 50°C
UV 210-400 nm
方法 D
流動式細胞測量術 1.0 mL/min
停止時間 2.00 min
洗脫液 A：水（0.1%甲酸）；B：ACN（0.1%甲酸）
梯度 時間 %A %B
   0.00 98 2
   0.10 98 2
   1.50 2 98
   1.80 2 98
   1.90 98 2
   2.00 98 2
柱 AcQuity UPLC BEH C18 1.7 µm 2.1 × 30 mm
柱溫 50°C
UV 210-400 nm
方法 E
流動式細胞測量術 1.0 mL/min
停止時間 2.20 min
洗脫液 A：水（0.1%甲酸）；B：ACN（0.1%甲酸）
梯度 時間 %A %B
   0.00 60 40
   1.40 2 98
   2.05 2 98
   2.09 60 40
柱 AcQuity UPLC BEH C18 1.7 µm 2.1 x 30 mm
柱溫 50°C
UV 210-400 nm
方法 F
流動式細胞測量術 1.0 mL/min
停止時間 5.20 min
洗脫液 A：水（0.1%甲酸）；B：ACN（0.1%甲酸）
梯度 時間 %A %B
   0.00 98 2
   4.40 2 98
   5.15 2 98
   5.19 98 2
柱 AcQuity UPLC BEH C18 1.7 µm 2.1 × 50 mm
柱溫 50°C
UV 210-400 nm
方法 G
流動式細胞測量術 1.0 mL/min
停止時間 5.20 min
洗脫液 A：水（0.1%甲酸）；B：ACN（0.1%甲酸）
梯度 時間 %A %B
   0.00 60 40
   3.40 2 98
   5.15 2 98
   5.19 60 40
柱 AcQuity UPLC BEH C18 1.7 µm 2.1 × 50 mm
柱溫溫度 50°C
UV 210-400 nm
質量範圍 100-2050 Da
方法 H
流動式細胞測量術 1.0 mL/min
停止時間 5.20 min
洗脫液 A：水（0.1%甲酸）；B：ACN（0.1%甲酸）
梯度 時間 %A %B
   0.00 60 40
   3.40 2 98
   5.15 2 98
   5.19 60 40
柱 AcQuity UPLC BEH C18 1.7 µm 2.1 × 50 mm
柱溫 50°C
UV 210-400 nm
方法 I
流動式細胞測量術 1.0 mL/min
停止時間 5.20 min
pH 10.2
洗脫液 A：水（5 mM NH 4OH）；B：ACN（5 mM NH 4OH）
梯度 時間 %A %B
   0.00 60 40
   3.40 2 98
   5.15 2 98
   5.19 60 40
     
柱 AcQuity UPLC BEH C18 1.7 µm 2.1 × 50 mm
柱溫 50°C
UV 210-400 nm
方法 J
流動式細胞測量術 1.0 mL/min
停止時間 2.20 min
洗脫液 A：水（0.1%甲酸）；B：ACN（0.1%甲酸）
梯度 時間 %A %B
   0.00 98 2
   0.06 98 2
   1.76 2 98
   2.00 2 98
   2.16 98 2
柱 AcQuity UPLC CSH C18 1.7 µm 2.1 × 50 mm
柱溫 50°C
UV 210-400 nm
質量範圍 100-2050 Da
方法 K
流動式細胞測量術 1.0 mL/min
停止時間 5.20 min
洗脫液 A：水（0.1% TFA）；B：ACN（0.1% TFA）
梯度 時間 %A %B
   0.00 98 2
   0.06 98 2
   1.76 2 98
   2.00 2 98
   2.16 98 2
柱 AcQuity UPLC CSH C18 1.7 µm 2.1 × 50 mm
柱溫 80°C
UV 210-400 nm
B ：合成部分 中間體 1 ：苄基 11- 溴十一烷酸酯
Figure 02_image093
在0°C向11-溴十一烷酸（4.60 kg，17.3 mol，1.1當量）在DCM（26.5 kg）中之混合物中分批添加EDCI（3.8 kg，20.2 mol，1.28當量）連同DMAP（98 g，0.8 mol，0.05當量）。然後滴加苄醇（1.70 kg，15.7 mol，1.00當量）。在20°C攪拌4 h後，滴加水（70.0 kg）。然後將反應混合物真空濃縮。添加庚烷（23.2 kg）和19% NaCl溶液（17 kg）並分離各相。將有機相用以下洗滌：5% Na 2CO 325.0 kg；19% NaCl溶液，25.0 kg（x2），5.2% HCl水溶液，25.0 kg；19% NaCl溶液、25.0 kg、水（5.0 kg）和鹽水（5.0 kg）。然後將有機相在50°C真空濃縮以提供 中間體 1，其原樣用於下一步。 1H NMR (400 MHz, 氯仿- d) δ ppm 1.18 - 1.36 (m, 10 H) 1.37 - 1.47 (m, 2 H) 1.64 (quin, J= 7.33 Hz, 2 H) 1.85 (dt, J= 14.56, 7.06 Hz, 2 H) 2.35 (t, J= 7.58 Hz, 2 H) 3.40 (t, J= 6.88 Hz, 2 H) 5.11 (s, 2 H) 7.28 - 7.45 (m, 5 H)。 中間體 2 ： 1,11- 二苄基 11-( 三級丁基 ) 二十二烷 -1,11,11- 三甲酸酯
Figure 02_image095
在20°C向丙二酸三級丁酯（3.0 kg，12.0 mol，1.0當量）在NMP（30 L）中之溶液中添加1-碘十一烷（3.55 kg，12.58 mol，1.05當量）和Cs 2CO 3（11.76 kg，36.09 mol，3.0當量）。將所得混合物在20°C攪拌6 h，然後添加 中間體 1（5.53 kg，15.6 mol，1.3當量）。將反應混合物加熱至85°C並攪拌12 h。然後將混合物冷卻至20°C並添加水（30 kg）和庚烷（10 kg）的混合物。攪拌30 min後，將有機相分離並用鹽水（5 kg）和MeOH（4 kg）的混合物洗滌3次。將有機層經Na 2SO 4乾燥，過濾，並在真空中濃縮。藉由柱層析法進一步純化：用庚烷/EtOAc = 1/0至100/1洗脫，以提供 中間體 2。 1H NMR (400 MHz, 氯仿- d) δ ppm 0.84 - 0.94 (m, 3 H) 1.12 (m, J= 6.60 Hz, 4 H) 1.19 - 1.33 (m, 28 H) 1.35 (s, 9 H) 1.66 (quin, J= 7.40 Hz, 2 H) 1.85 (t, J= 8.44 Hz, 4 H) 2.37 (t, J= 7.52 Hz, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 5.16 (s, 2 H) 7.30 - 7.42 (m, 10 H)。 中間體 3 ： 13-( 苄基氧基 )-2-(( 苄基氧基 ) 羰基 )-13- 側氧基 -2- 十一烷基十三烷酸
Figure 02_image097
在20°C ± 5°C，向 中間體 2（6.0 kg，8.8 mol，1.0當量）在庚烷（21 L）中之溶液中滴加TFA（10.0 kg，88.4 mol，10.0當量）。在20°C ± 5°C攪拌8 h後，減壓除去大部分TFA，並且將所得殘餘物重新溶解在庚烷（42 L，7V）中並用鹽水（42 L x 3）洗滌。相分離後，濃縮有機相，以提供呈黃色油狀物的粗製產物。將粗製產物經柱層析法純化：用庚烷至庚烷 : EtOAc = 10/1洗脫以提供 中間體 3。 1H NMR (400 MHz, 氯仿- d) δ ppm 0.87 - 0.94 (m, 3 H) 0.94 - 1.05 (m, 2 H) 1.19 (br. s., 14 H) 1.23 - 1.37 (m, 16 H) 1.65 (quin, J= 7.40 Hz, 2 H) 1.78 - 1.91 (m, 2 H) 1.93 - 2.05 (m, 2 H) 2.37 (t, J= 7.52 Hz, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 5.27 (s, 2 H) 7.31 - 7.44 (m, 10 H)。
外消旋 中間體 3的純鏡像異構物經由手性SFC分離，以提供對映純 中間體 3A和 3B，其用於分別製備 化合物 2和 3。獲得對映純 中間體 3A和 3B的參數為： 儀器：Thar 350製備型SFC（SFC-18） 柱：ChiralPak AD，300 × 50 mm I.D.，10 µm 流動相：A代表CO2，B代表乙醇 梯度：B 40% 流速：200 mL/min 背壓：100巴 柱溫：38°C 波長：210 nm 循環時間：約3.7 min 峰1：R鏡像異構物（3A） 峰2：S鏡像異構物（3B）
Figure 02_image099
Figure 02_image101
鏡像異構物3A                                             鏡像異構物3B
鏡像異構物3A的絕對組態由其衍生物確定（如下所示）；即鏡像異構物3A在第1步驟中與草醯氯在DMF中反應，然後將所得醯氯與(S)-1-(4-硝基苯基)-乙-1-胺反應，然後在Pd/C的存在下用氫處理得到如下所示的結構，從中獲得單X射線晶體。
因此，藉由手性SFC分離的鏡像異構物混合物的峰2與S組態相關，並根據鏡像異構物3A的絕對組態為 R的測定歸屬於鏡像異構物3B。
Figure 02_image103
中間體 4 ： 14-(( 苄基氧基 ) 羰基 )-3,15- 二側氧基 -1- 苯基 -14- 十一烷基 -2,19,22,25,28, 31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85,88- 二十五氧雜 -16- 氮雜九十一烷 -91- 酸
Figure 02_image105
向燒瓶中添加 中間體 3（640 g，1.03 mol）、DCM（8.3 kg）和DMF（3 g）。將所得混合物在25°C攪拌，然後滴加草醯氯（170 g，1.34 mol）。繼續攪拌另外2-3 h。濃縮反應混合物並用庚烷交換溶劑得到粗製混合物，向其中添加8.5 kg DCM以形成溶液並且其直接用於下一步驟。
向燒瓶中添加1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四基七十五烷-75-酸（胺-PEG24-酸，900 g，0.79 mol）、DCM（6.0 kg）和DIPEA（203 g）並將所得混合物在25°C攪拌。然後滴加來自步驟1的醯氯粗製溶液。將反應混合物再攪拌1-2 h。添加酸性樹脂（1.3 kg）並繼續攪拌30 min。然後過濾混合物。添加MgSO 4（1.3 kg）並繼續攪拌30 min。將混合物過濾並濃縮以提供粗製殘餘物。將粗製殘餘物用Al 2O 3用包括MTBE、DCM、MeOH的流動相純化。然後收集所有所需級分並濃縮以提供 中間體 4。 1H NMR (400 MHz, 氯仿- d) δ ppm 0.86 - 0.93 (m, 3 H) 0.93 - 1.04 (m, 2 H) 1.19 (br. s., 15 H) 1.23 - 1.37 (m, 15 H) 1.61 - 1.68 (m, 2 H) 1.78 (td, J= 12.44, 4.34 Hz, 2 H) 1.92 - 2.05 (m, 2 H) 2.37 (t, J= 7.58 Hz, 2 H) 2.62 (t, J= 6.05 Hz, 2 H) 3.49 (dd, J= 6.72, 2.32 Hz, 2 H) 3.52 - 3.59 (m, 2 H) 3.59 - 3.73 (m, 92 H) 3.80 (t, J= 6.05 Hz, 2 H) 5.13 (s, 2 H) 5.18 (s, 2 H) 7.31 - 7.42 (m, 10 H) 8.09 (t, J= 5.26 Hz, 1 H)。 中間體 5 ： 77,87- 二苄基 1-(2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 76- 側氧基 -77- 十一烷基 -3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72- 二十四氧雜 -75- 氮雜八十七烷 -1,77,87- 三甲酸酯
Figure 02_image107
向 中間體 4（920 g，0.53 mol）在DCM（6.1 kg）中之溶液中添加TEA（11 g）並攪拌所得混合物以提供澄清溶液。然後添加DSC（161 g，0.63 mol）並在25°C繼續攪拌2 h。添加酸性樹脂（180 g）並將該混合物攪拌30 min。添加MgSO 4（180 g）並繼續攪拌30 min。然後過濾混合物以提供澄清的淡黃色溶液。真空濃縮得到粗製 中間體 5，直接用於下一步。LCMS方法A：Rt = 1.5 min，[M+H 3O+H] +2= 933.9。 中間體 6 ： 2-((75-((2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 氧基 )-75- 側氧基 -3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33, 36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72- 二十四氧雜七十五烷基 ) 胺基甲醯基 )-2- 十一烷基十三烷二酸
Figure 02_image109
向氫化反應器中添加 中間體 5（986 g，0.48 mol，90%純度）、THF（7.6 kg）和10% Pd/C（110 g），然後添加MgSO 4（110 g），所得混合物用N 2和H 2吹掃，並在25°C攪拌3-24 h。在起始材料完全消耗後，添加更多的MgSO 4（220 g）並繼續攪拌另外30 min。將反應混合物過濾。用100 mL THF洗滌濾餅，合併濾液並濃縮以提供 中間體 6。 1H NMR (400 MHz, 氯仿- d) δ ppm 0.84 - 0.94 (m, 3 H) 1.17 (br. s., 2 H) 1.21 - 1.39 (m, 30 H) 1.57 - 1.68 (m, 2 H) 1.69 - 1.80 (m, 2 H) 1.97 - 2.10 (m, 2 H) 2.34 (t, J= 7.21 Hz, 2 H) 2.86 (s, 4 H) 2.92 (t, J= 6.48 Hz, 2 H) 3.51 - 3.73 (m, 96 H) 3.87 (t, J= 6.48 Hz, 2 H) 7.45 (t, J= 4.46 Hz, 1 H)。 中間體 7 ： 1- 苄基 3-( 三級丁基 ) 2- 十一烷基丙二酸酯
Figure 02_image111
將苄基三級丁基丙二酸酯（110 g，439 mmol，1當量）溶於DMF（800 mL）中。向所得混合物中添加1-碘十一烷（130 g，461 mmol，1.05當量）和K 2CO 3（151 g，1.10 mol，2.5當量）。將所得懸浮液在50°C攪拌12 h。然後將反應混合物用乙酸乙酯（500 mL）稀釋，然後倒入冰水中。將合併的有機相用鹽水（150 mL）洗滌兩次，經硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮，以提供粗製殘餘物。將粗製殘餘物藉由柱層析法（SiO 2，用石油醚/乙酸乙酯 ＝ 1/0至0/1洗脫）純化，以提供呈無色油狀物的 中間體 7。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ ppm 7.46 - 7.26 (m, 5H), 5.27 - 4.98 (m, 2H), 3.44 - 3.26 (m, 1H), 1.72 (br d, J= 6.8 Hz, 2H), 1.33 (s, 9H), 1.28 - 1.10 (m, 18H), 0.93 - 0.75 (m, 3H)。 中間體 8 ： 1- 苄基 3-( 三級丁基 ) 2- 烯丙基 -2- 十一烷基丙二酸酯
Figure 02_image113
在0°C將NaH（14.5 g，364 mmol，60%，1.2當量）滴加到DMF（1230 mL）中，然後緩慢添加在DMF（123 mL）中之 中間體 7（123 g，304 mmol，1當量）。將所得混合物在0°C攪拌0.5 h，然後滴加烯丙基溴（40.4 g，334 mmol，29 mL，1.1當量）。將反應混合物在20°C攪拌9.5 h，然後用乙酸乙酯（2500 mL）稀釋。將混合物倒入冰冷的飽和NH 4Cl 4（1200 mL）中。將有機相與水相分離，並將水相用乙酸乙酯洗滌兩次。然後將有機相合併，用鹽水（500 mL）洗滌三次，經硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮，以提供殘餘物。將該殘餘物藉由柱層析法（SiO 2，用石油醚/乙酸乙酯 = 1/0至98/2洗脫）純化以提供呈黃色油狀物的 中間體 8。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ ppm 7.50 - 7.26 (m, 5H), 5.70 - 5.50 (m, 1H), 5.24 - 5.01 (m, 4H), 4.99 - 4.74 (m, 1H), 1.70 (br s, 2H), 1.45 - 1.34 (m, 3H), 1.27 (s, 9H), 1.25 - 1.15 (m, 18H), 0.85 (br t, J= 6.8 Hz, 3H)。 中間 8A 和 8B ： 1- 苄基 3-( 三級丁基 ) 2- 烯丙基 -2- 十一烷基丙二酸酯
Figure 02_image115
將 中間體 8（159 g）藉由SFC分離純化（柱：Chiralpak IG-3 100 * 4.6 mm I.D.，3um；流動相：A：CO2 B：異丙醇（0.05% DEA）；梯度：在5 min內，從5%至40% B並保持40%持續2.5 min，然後5% B持續2.5 min；流速：2.5 mL/min；柱溫：35°C ABPR：1500 psi）以提供 中間體 8A（峰1）和 中間體 8B（峰2）。LCMS方法B：Rt = 1.334 min，MS (ESI) m/z[M+Na] += 467.3。 SFC ：中間體 8A（峰1），純鏡像異構物（ R）； SFC ：中間體 8B（峰2），純鏡像異構物（ S）。 中間體 9 ： 苄基癸 -9- 烯酸酯
Figure 02_image117
向癸-9-烯酸（70.0 g，411 mmol，76.0 mL，1當量）在DCM（1400 mL）中之溶液中添加BnOH（66.6 g，616 mmol，64.1 mL，1.5當量）、DMAP（5.02 g，41.12 mmol，0.1當量）、EDCI（94.5 g，493.3 mmol，1.2當量）和DIEA（63.7 g，493 mmol，85.9 mL，1.2當量）。將所得混合物在25°C攪拌12 h。然後將反應混合物用DCM（500 mL）稀釋。將所得溶液用鹽水（500 mL）洗滌兩次，經Na 2SO 4乾燥，過濾並減壓濃縮，以提供粗製殘餘物。將該粗製殘餘物藉由柱層析法（SiO 2，用石油醚/乙酸乙酯 ＝ 1/0至0/1洗脫）純化，以提供呈無色油狀物的 中間體 9。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ ppm 7.46 - 7.29 (m, 5H), 5.78 (dd, J= 10.4, 16.8 Hz, 1H), 5.13 - 5.05 (m, 2H), 5.03 - 4.77 (m, 2H), 2.38 - 2.26 (m, 2H), 2.13 - 1.92 (m, 2H), 1.62 - 1.48 (m, 2H), 1.38 - 1.28 (m, 2H), 1.28 - 1.15 (m, 6H)。 中間體 10A ： 1,11- 二苄基 11-( 三級丁基 ) ( R) 二十二 -8- 烯 -1,11,11- 三甲酸酯
Figure 02_image119
將 中間體 8A（26.0 g，58.4 mmol，1當量）和 中間體 9（30.4 g，116 mmol，2當量）溶解在CH 2Cl 2（520 mL）中。然後添加Grubbs II（2.38 g，3.80 mmol，0.065當量）並將所得混合物在40°C攪拌1.5 h。然後濃縮反應混合物以提供粗製殘餘物。將該殘餘物藉由柱層析法（SiO 2，用石油醚/乙酸乙酯 ＝ 1/0至0/1洗脫）純化，以提供呈無色油狀物的 中間體 10A。LCMS方法B：Rt = 1.456 min，[M+Na] + =699.6。 中間體 11A ： ( S)-13-( 苄基氧基 )-2-(( 苄基氧基 ) 羰基 )-13- 側氧基 -2- 十一烷基十三 -4- 烯酸
Figure 02_image121
將 中間體 10A（50.0 g，73.8 mmol，1當量）溶解在TFA（500 mL）中，並將所得混合物在25°C攪拌30 min。然後將反應混合物濃縮以提供粗製殘餘物，將其溶解在乙酸乙酯（500 mL）中，然後用飽和NaHCO 3（500 mL）洗滌兩次並且用鹽水（100 mL）洗滌，經Na 2SO 4乾燥，過濾並濃縮以提供粗製殘餘物。將殘餘物藉由柱層析法（SiO 2，用石油醚/乙酸乙酯 ＝ 1/0至0/1洗脫）純化，以提供呈無色油狀物的 中間體 11A。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ ppm 7.44 - 7.14 (m, 10H), 5.41 (br s, 1H), 5.22 - 4.86 (m, 5H), 2.49 - 2.41 (m, 2H), 2.37 - 2.28 (m, 2H), 1.95 - 1.83 (m, 2H), 1.76 - 1.65 (m, 2H), 1.58 - 1.46 (m, 2H), 1.34 - 0.98 (m, 25H), 0.90 - 0.76 (m, 3H)。LCMS方法B：Rt = 1.323 min，[M+H] += 622.3。 中間體 12A ： 1,11- 二苄基 11-(2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) ( R)- 二十二 -8- 烯 -1,11,11- 三甲酸酯
Figure 02_image123
在25°C向 中間體 11A（29.0 g，46.7 mmol，1當量）在CH 2Cl 2（260 mL）和THF（29 mL）中之溶液中添加NHS（5.64 g，49.0 mmol，1.05當量）和DCC（11.5 g，56.0 mmol，11.3 mL，1.2當量），並將所得混合物在25°C攪拌5 h。然後將反應混合物過濾並用CH 2Cl 2（30 mL）洗滌三次。濃縮有機相以提供粗製殘餘物。將粗製殘餘物藉由柱層析法（SiO 2，用石油醚/乙酸乙酯 = 1/0至85/15洗脫）純化，以提供呈淡黃色油狀物的 中間體 12A。 1H NMR (400 MHz, 氯仿- d) δ ppm 7.37 - 7.20 (m, 10H), 5.53 - 5.34 (m, 1H), 5.24 - 5.16 (m, 1H), 5.15 - 5.12 (m, 2H), 5.16 - 5.12 (m, 2H), 5.07 - 5.00 (m, 2H), 2.73 (br s, 4H), 2.66 - 2.53 (m, 2H), 2.34 - 2.16 (m, 2H), 1.97 - 1.77 (m, 4H), 1.70 - 1.47 (m, 3H), 1.37 - 0.99 (m, 26H), 0.88 - 0.65 (m, 3H)。LCMS方法B：Rt = 1.348 min，[M+H] += 718.6。 中間體 13A ： ( S)- 14-(( 苄基氧基 ) 羰基 )-3,15- 二側氧基 -1- 苯基 -14- 十一烷基 -2,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85,88- 二十五氧雜 -16- 氮雜九十一 -11- 烯 -91- 酸
Figure 02_image125
向DMF（3 mL）中之 中間體 12A（545 mg，0.759 mmol）添加1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四基七十五烷-75-酸（胺-PEG24-酸，1131 mg，0.987 mmol）和DIPEA（0.199 mL，1.139 mmol）。16 h後，反應完成。除去揮發物，並且將所得殘餘物直接在RPLC（ISCO C18 Gold 150 g柱，用10%-100% ACN : 水（具有0.1% TFA）梯度洗脫）上純化。將含有產物的級分合併、冷凍並凍乾以提供呈濃稠油狀物的 中間體 13A。LCMS方法H：Rt = 2.93 min，[M+H] += 1750.5。 中間體 14A ： 77,87- 二苄基 1-(2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 )-( S)-76- 側氧基 -77- 十一烷基 -3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72- 二十四氧雜 -75- 氮雜八十七 -79- 烯 -1,77,87- 三甲酸酯
Figure 02_image127
向溶解在5 mL無水DCM中之 中間體 13A（183 mg，0.105 mmol）添加DSC（32.2 mg，0.126 mmol）和DIPEA（0.027 mL，0.157 mmol），並將所得混合物攪拌16 h，之後反應完成。將粗製混合物直接注射到DCM平衡的ISCO Gold 40克柱上並藉由NPLC（用DCM中的0-30% MeOH洗脫，二氧化矽）純化。將含有產物的級分合併並濃縮以提供呈濃稠透明油狀物的 中間體 14A。LCMS方法H：Rt = 2.79 min，[M+H] += 1847.5。 中間 15A： ( S)-2-((75-((2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 氧基 )-75- 側氧基 -3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72- 二十四氧雜七十五烷基 ) 胺基甲醯基 )-2- 十一烷基十三烷二酸
Figure 02_image129
將 中間體 14A（165 mg，0.089 mmol）溶解在2 mL無水THF中，抽真空並用氮氣置換三次。向該混合物中添加10%鈀碳（9.51 mg，8.94 µmol），將大氣抽真空並在磁力攪拌下用來自氣球的氫氣置換。16 h後，反應完成。在用5 mL無水DCM稀釋後，將反應混合物通過Celite ®過濾。將鈀碳和墊用5 mL DCM洗滌兩次，將所有有機相合併並濃縮以提供 中間體 15A。LCMS方法F：Rt = 3.29 min，[M+H] += 1669.5。 中間體 10B ： 1,11- 二苄基 11-( 三級丁基 ) ( S)- 二十二 -8- 烯 -1,11,11- 三甲酸酯
Figure 02_image131
將 中間體 8B（36.0 g，80.9 mmol，1當量）和 中間體 3（42.1 g，161 mmol，2當量）溶解在CH 2Cl 2（720 mL）中並且然後添加Grubbs II（3.30 g，5.26 mmol，0.065當量）。將所得混合物在40°C攪拌1 h，然後真空濃縮，以提供粗製殘餘物。將粗製殘餘物藉由柱層析法（SiO 2，用石油醚/乙酸乙酯 ＝ 1/0至0/1洗脫）純化，以提供呈無色油狀物的 中間體 10B。 1H NMR (400 MHz, 氯仿- d) δ ppm 7.45 - 7.25 (m, 10H), 5.50 - 5.30 (m, 1H), 5.20 - 5.02 (m, 5H), 2.48 - 2.40 (m, 1H), 2.39 - 2.23 (m, 3H), 1.96 - 1.83 (m, 3H), 1.79 - 1.64 (m, 1H), 1.61 - 1.45 (m, 3H), 1.40 - 1.14 (m, 22H), 1.13 - 0.94 (m, 3H), 1.14 - 0.93 (m, 3H), 0.87 - 0.80 (m, 1H)。LCMS方法B：RT = 1.448 min，[M-56+H] += 622.3。 中間 11B ： ( R)-13-( 苄基氧基 )-2-(( 苄基氧基 ) 羰基 )-13- 側氧基 -2- 十一烷基十三 -4- 烯酸
Figure 02_image133
將 中間體 10B（62 g, 91.59 mmol, 1當量）溶解在TFA（620 mL）中，並將所得混合物在25°C攪拌30 min。然後將反應混合物真空濃縮以提供粗製殘餘物。將粗製殘餘物溶解在乙酸乙酯（800 mL）中，然後用飽和NaHCO 3（200 mL）洗滌兩次並且用鹽水（100 mL）洗滌，用Na 2SO 4乾燥，過濾並濃縮以提供粗製殘餘物。將粗製殘餘物藉由柱層析法（SiO 2，用石油醚/乙酸乙酯 ＝ 1/0至0/1洗脫）純化，以提供呈黃色油狀物的 中間體 11B。 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 13.15 - 12.55 (m, 1H), 7.54 - 6.92 (m, 10H), 5.54 - 5.33 (m, 1H), 5.25 - 4.94 (m, 5H), 2.47 (br d, J= 7.2 Hz, 1H), 2.33 (br t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.97 - 1.83 (m, 2H), 1.79 - 1.63 (m, 2H), 1.60 - 1.45 (m, 2H), 1.38 - 0.96 (m, 26H), 0.92 - 0.76 (m, 3H).LCMS 方法 B: RT = 1.323 min，MS (ESI) m/z[M+H] += 621.6。 中間 12B ： 1,11- 二苄基 11-(2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) ( S)- 二十二 -8- 烯 -1,11,11- 三甲酸酯
Figure 02_image135
向 中間體 11B（27 g，43.4 mmol，1當量）在CH 2Cl 2（243 mL）和THF（27 mL）中之溶液中添加NHS（5.26 g，45.6 mmol，1.05當量）和DCC（10.7 g，52.1 mmol，10.5 mL，1.2當量），並將所得混合物在25°C攪拌6 h。然後將反應混合物過濾並用CH 2Cl 2（30 mL）洗滌三次以提供濾液，然後將其濃縮以提供粗製殘餘物。將粗製殘餘物藉由柱層析法（SiO 2，用石油醚/乙酸乙酯 = 1/0至85/15洗脫）純化，以提供呈淡黃色油狀物的 中間體 12B。 1H NMR (400 MHz, 氯仿- d) δ 13.15 - 12.55 (m, 1H), 7.54 - 6.92 (m, 10H), 5.54 - 5.33 (m, 1H), 5.25 - 4.94 (m, 5H), 2.47 (br d, J= 7.2 Hz, 1H), 2.33 (br t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.97 - 1.83 (m, 2H), 1.79 - 1.63 (m, 2H), 1.60 - 1.45 (m, 2H), 1.38 - 0.96 (m, 26H), 0.92 - 0.76 (m, 3H)。LCMS方法B：Rt = 1.348 min，[M+H] += 718.5。 中間 13B ： ( R)-14-(( 苄基氧基 ) 羰基 )-3,15- 二側氧基 -1- 苯基 -14- 十一烷基 -2,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85,88- 二十五氧雜 -16- 氮雜九十一 -11- 烯 -91- 酸
Figure 02_image137
將 中間體 12B（1.07 g，1.49 mmol）用1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四基七十五烷-75-酸（Biopharm，1.88 g，1.64 mmol）、DIPEA（390 μL，2.236 mmol）和DMAP（18 mg，0.05 mmol）處理。16 h後，反應完成。除去揮發物，並且將所得殘餘物藉由RPLC（ISCO C18 Gold 150 g柱，用10%-100% ACN : 水（具有0.1% TFA）梯度洗脫）上純化。將含有產物的級分合併、冷凍並凍乾以提供呈濃稠油狀物的 中間體 13B。LCMS方法C：Rt = 4.04 min，[M+2H] 2+= 875.8。 中間 14B ： 77,87- 二苄基 1-(2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 )-( R)-76- 側氧基 -77- 十一烷基 -3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72- 二十四氧雜 -75- 氮雜八十七 -79- 烯 -1,77,87- 三甲酸酯
Figure 02_image139
將中間體 13B（312 mg，0.178 mmol）與1-羥基吡咯啶-2,5-二酮（24.63 mg，0.214 mmol）一起溶解在1.8 mL無水DCM中，然後用DCM（奧德里奇公司（Aldrich），196 μL）中之1M DCC處理產生二環己基脲副產物的立即沈澱。16 h後，反應完成，然後將反應混合物直接注射到DCM平衡的ISCO Gold 40克柱上並藉由NPLC（用DCM中之0-30% MeOH洗脫，二氧化矽）純化。將含有產物的級分合併並濃縮以提供呈濃稠透明油狀物的 中間體 14B。LCMS方法F：Rt = 4.21 min，[M+H+H 2O] += 1864.4。 中間體 15B ： ( R)-2-((75-((2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 氧基 )-75- 側氧基 -3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72- 二十四氧雜七十五烷基 ) 胺基甲醯基 )-2- 十一烷基十三烷二酸
Figure 02_image141
將 中間體 14B（172 mg，0.093 mmol）溶解在1.8 mL無水THF中，抽真空並用氮氣置換三次。向該混合物中添加10%鈀碳（10 mg，9.4 umol），抽真空並在磁力攪拌下用來自氣球的氫氣置換。16 h後，反應完成。在用5 mL無水DCM稀釋後，將反應混合物通過Celite ®過濾。將鈀碳和矽藻土餅用5 mL DCM洗滌兩次並過濾。將所有有機物合併並濃縮以提供 中間體 15B。LCMS方法F：Rt = 3.31 min，[M+H] + =1669.0。 中間體 16 ： 1,11- 二苄基 11-(2,5- 二側氧基環戊基 ) 二十二烷 -1,11,11- 三甲酸酯
Figure 02_image143
向1000 mL 3頸圓底燒瓶（配備機械攪拌器和氮氣入口）中添加 中間體 3（37.7 g，60.5 mmol）、DCM（360 mL，比率：9.0）和THF（40 mL，比率：1.0），然後是N-羥基琥珀醯亞胺（7.31 g，63.6 mmol）和DCC（14.99 g，72.6 mmol）。添加後5 min，所得混合物變成白色懸浮液。將反應混合物在室溫攪拌總共6 h，然後在矽藻土 ®墊上過濾。用DCM（2床體積）徹底清洗墊。將合併的有機相真空濃縮，並將粗製殘餘物在高真空下乾燥。粗製產物分離為白色油狀物。向粗製產物中添加DCM（約400 mL）和矽膠（75 g）。將所得懸浮液真空濃縮並將殘餘物在高真空下乾燥3 h。該批次經由柱層析法（750 g SiO 2凝膠，用2%乙酸乙酯/庚烷至35%乙酸乙酯/庚烷洗脫）純化。將含有產物的級分合併，真空濃縮並在高真空下乾燥過夜以提供呈無色油狀物的 中間體 16。 1H NMR (400 MHz, 氯仿- d) δ ppm 0.86 - 0.93 (m, 3 H) 1.12 - 1.21 (m, 2 H) 1.21 - 1.37 (m, 30 H) 1.66 (quin, J= 7.40 Hz, 2 H) 1.89 - 2.07 (m, 4 H) 2.37 (t, J= 7.58 Hz, 2 H) 2.84 (br. s., 4 H) 5.13 (s, 2 H) 5.25 (s, 2 H) 7.30 - 7.47 (m, 10 H)。 中間體 17 ： 14-(( 苄基氧基 ) 羰基 )-3,15- 二側氧基 -1- 苯基 -14- 十一烷基 -2,19,22,25,28,31,34,37,40- 九氧雜 -16- 氮雜四十三烷 -43- 酸
Figure 02_image145
向250 mL圓底燒瓶（配備磁力攪拌器和氮氣入口）中添加 中間體 16（7.0 g，9.72 mmol）和DCM（70 mL），然後添加1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-酸（胺基-PEG8-酸）（4.51 g，10.21 mmol）、DIPEA（4.25 mL，24.31 mmol）和DMAP（0.119 g，0.972 mmol））。將所得淺黃色均勻溶液在環境溫度下攪拌過夜。然後將反應混合物真空濃縮以提供淺黃色油狀殘餘物。然後將該殘餘物用乙酸乙酯（150 mL）稀釋，並將溶液轉移到500 mL分液漏斗中。然後用鹽水（500 mL）洗滌溶液。將所得水相用乙酸乙酯（150 mL；然後100 mL）反萃取。將合併的有機相乾燥（用硫酸鈉），經矽藻土 ®過濾，並真空濃縮。將粗製產物經由柱層析法（330 g SiO 2凝膠，用DCM至10%甲醇/DCM洗脫）純化。將含有主要產物的級分合併並真空濃縮。將殘餘物在高真空下乾燥過夜以提供 中間體 17。LCMS方法E：Rt = 1.43 min, [M+H] += 1047.0 中間體 18 ： 29,39- 二苄基 1-(2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 28- 側氧基 -29- 十一烷基 -3,6,9,12,15,18,21,24- 八氧雜 -27- 氮雜三十九烷 -1,29,39- 三甲酸酯
Figure 02_image147
向含有 中間體 17（5.51 g，5.27 mmol）的50 mL圓底燒瓶中添加DCM（27.5 mL，比例：1.0）和THF（27.5 mL，比例：1.0），然後添加DCC（1.412 g，6.85 mmol）和N-羥基琥珀醯亞胺（0.697 g，6.06 mmol）。攪拌約10 min後，所得混合物變成濃稠的白色懸浮液。然後將反應混合物在環境溫度攪拌3 h 45 min並真空濃縮以提供白色糊狀物。向混合物中添加DCM（35 mL），並將所得白色懸浮液攪拌10 min。然後將混合物在矽藻土 ®墊上過濾，並用冷DCM（一個床體積）洗滌墊。將合併的濾液真空濃縮。將殘餘物在高真空下乾燥過夜以提供呈無色油狀物的 中間體 18。LCMS方法E：Rt = 1.45 min，[M+H] += 1044.0。 中間體 19 ： 2-((27-((2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 氧基 )-27- 側氧基 -3,6,9,12,15,18,21,24- 八氧雜二十七烷基 ) 胺基甲醯基 )-2- 十一烷基十三烷二酸
Figure 02_image149
向250 mL圓底燒瓶（配備磁力攪拌器）中添加 中間體 18（6.0 g，5.25 mmol）和THF（70 ml）。向該溶液中添加10% Pd/C（0.603 g，0.567 mmol），並且將反應容器用氮氣吹掃，然後用氫氣吹掃。然後將所得混合物暴露於氫氣（氣球壓力）3 h。將反應容器用氮氣吹掃，並且將懸浮液在矽藻土 ®墊上過濾。將墊用THF徹底洗滌並將合併的濾液真空濃縮。然後將所得殘餘物在高真空下乾燥過夜以提供呈無色油狀物的 中間體 19。LCMS方法E：Rt = 0.91 min，[M+H] += 963.8。 中間體 20 ： 14-(( 苄基氧基 ) 羰基 )-3,15- 二側氧基 -1- 苯基 -14- 十一烷基 -2,19,22- 三氧雜 -16- 氮雜二十五烷 -25- 酸
Figure 02_image151
向250 mL圓底燒瓶（帶有磁力攪拌棒）中添加 中間體 16（5.0 g，6.94 mmol）和DCM（體積：100 mL），然後添加3-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)丙酸（胺基-PEG2-酸，1.231 g，6.94 mmol）、DIPEA（3.03 mL，17.36 mmol）和DMAP（0.085 g，0.694 mmol）。將所得白色懸浮液在環境溫度攪拌22 h。LCMS表明剩餘大量NHS酯起始材料。然後將反應混合物升溫至40°C並繼續攪拌5.5 h。將混合物冷卻至環境溫度，然後真空濃縮以提供白色糊狀物。向混合物中添加乙酸乙酯（150 mL）。將該溶液與鹽水（150 mL）一起轉移到500 mL分液漏斗中。分離各相並將水相用乙酸乙酯（150 mL）萃取兩次。將合併的有機相乾燥（用硫酸鈉），經矽藻土 ®過濾，並真空濃縮。將粗製產物經由柱層析法（120 g矽膠，用0.5%甲醇/DCM至60%甲醇/DCM洗脫）純化。藉由TLC（5%甲醇/DCM）合併含有主要產物的級分，真空濃縮，並將所得殘餘物在高真空下乾燥過夜，以提供呈無色油狀物的 中間體 20。LCMS方法E：Rt = 1.45 min，[M+H] += 782.8。 中間體 21 ：二苄基 2-((2-(2-(3-((2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 氧基 )-3- 側氧基丙氧基 ) 乙氧基 ) 乙基 ) 胺基甲醯基 )-2- 十一烷基十三烷二酸酯
Figure 02_image153
向500 mL圓底燒瓶（配備磁力攪拌器和氮氣入口）中添加 中間體 20（3.7 g，4.73 mmol）、DCM（19 mL，比率：1.0）和THF（19 mL，比率：1.0），然後是N-羥基琥珀醯亞胺（0.626 g，5.44 mmol）和DCC（1.269 g，6.15 mmol）。將所得混合物在環境溫度攪拌3 h，此時它已變成白色懸浮液。然後將懸浮液經矽藻土 ®過濾，並用DCM洗滌墊。將合併的濾液真空濃縮。然後將所得殘餘物懸浮在DCM（20 mL）中並將混合物在環境溫度攪拌10 min，然後經矽藻土 ®墊過濾。將墊用冷的DCM洗滌。將合併的濾液真空濃縮。將殘餘物在高真空下乾燥過夜以提供呈淡黃色油狀物的 中間體 21。LCMS方法E：Rt = 1.47 min，[M+H] += 879.7。 中間體 22 ： 2-((2-(2-(3-((2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 氧基 )-3- 側氧基丙氧基 ) 乙氧基 ) 乙基 ) 胺基甲醯基 )-2- 十一烷基十三烷二酸
Figure 02_image155
向含有 中間體 21（4.16 g，4.73 mmol）的100 mL圓底燒瓶中添加THF（40 mL）。向該溶液中添加10% Pd/C（0.42 g，3.93 mmol），並用氮氣吹掃容器。然後用氫氣吹掃反應容器並暴露於氫氣壓力（氣球）。將得到的黑色懸浮液攪拌4 h，然後經矽藻土 ®墊過濾。將墊用THF洗滌。將合併的濾液真空濃縮，然後在高真空下乾燥，以提供呈無色油狀物的 中間體 22。LCMS方法G：Rt = 1.72 min，[M+H] += 699.4。 中間體 23 ：苄基 11- 溴十一烷酸酯
Figure 02_image157
向2 L圓形3頸圓底燒瓶（配備機械攪拌器、溫度探頭和氮氣入口）中添加11-溴十一烷酸（50 g，189 mmol）和500 mL二氯甲烷。然後向所得橙色均勻溶液中添加苯甲醇（23.53 mL，226 mmol）、EDCI HCl（54.2 g，283 mmol）和DMAP（1.152 g，9.43 mmol）。將反應混合物攪拌過夜。TLC分析（庚烷中的30%乙酸乙酯）表明消耗了11-溴十一烷酸。將反應混合物轉移到2 L圓底燒瓶中並真空濃縮。所得殘餘物用1 L水和800 mL MTBE稀釋。分離各相，並且將水相用600 mL MTBE萃取兩次。將合併的有機相用750 mL鹽水洗滌，用硫酸鈉乾燥，經矽藻土 ®過濾，並真空濃縮。將該材料在高真空下乾燥2 h以提供淡黃色油狀物。將粗製產物溶解在500 mL DCM中並添加100 g矽膠。將混合物真空濃縮，然後在高真空下乾燥過夜。將殘餘物經由層析法（750 g矽膠柱，用1% EtOAc/庚烷至20% EtOAc/庚烷梯度洗脫）純化。將含有苄基11-溴十一烷酸酯的級分合併並真空濃縮。將殘餘物在高真空下乾燥5 h以提供呈無色油狀物的 中間體 23。 1H NMR (400 MHz, 氯仿- d) δ 7.58 - 7.31 (m, 5H), 5.14 (s, 2H), 3.43 (t, J= 6.9 Hz, 2H), 2.38 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 1.87 (p, J= 7.0 Hz, 2H), 1.73 - 1.61 (m, 2H), 1.49 - 1.40 (m, 2H), 1.37 - 1.26 (m, 10H)。 中間體 24 ： 1,11,21- 三苄基 11- 三級丁基二十一烷 -1,11,11,21- 四甲酸酯
Figure 02_image159
向裝有機械攪拌器、溫度探頭和氮氣入口的250 mL 3頸圓底燒瓶中添加苄基三級丁基丙二酸酯（6 g，23.97 mmol）和30 mL DMF，然後添加 中間體 23（18.74 g，52.7 mmol）和60 mL DMF的混合物。向該無色溶液中添加碳酸銫（31.2 g，96 mmol）並將所得懸浮液在環境溫度攪拌。在環境溫度攪拌5.5 h後，LCMS表明不存在苄基三級丁基丙二酸酯。反應混合物係單烷基化產物和二烷基化產物的混合物。因此使混合物攪拌22 h，但LCMS表明單烷基化中間體仍然存在。然後將反應混合物加熱至40°C並攪拌3 h。LCMS仍表明進展甚微。將混合物冷卻至0-5°C並以細流的形式添加200 mL去離子（DI）水。然後將混合物升溫至環境溫度並轉移至500 mL分液漏斗。將水相用200 mL MTBE萃取兩次。將合併的有機相用200 mL鹽水洗滌，用硫酸鈉乾燥，經矽藻土 ®過濾，並真空濃縮。將殘餘物在高真空下乾燥2 h以提供粗製無色產物，將其經由NPLC（330 g ISCO二氧化矽柱，0.5%乙酸乙酯/庚烷至30%乙酸乙酯/庚烷梯度洗脫）純化。將含有產物的級分合併並真空濃縮。將殘餘物在高真空下乾燥過夜以提供呈無色油狀物的 中間體 24。LCMS方法E：Rt = 1.75 min，[M+H+H 2O] += 821.3。 中間體 25 ： 13-( 苄基氧基 )-2-(11-( 苄基氧基 )-11- 側氧基十一烷基 )-2-(( 苄基氧基 ) 羰基 )-13- 側氧基十三烷酸
Figure 02_image161
向裝有磁力攪拌棒和氮氣入口的1 L圓底燒瓶中添加 中間體 24（17.78 g，22.25 mmol）和180 mL TFA，並將所得混合物攪拌45 min。一旦LCMS分析表明沒有剩餘起始材料，將混合物真空濃縮以提供淡黃色油狀物。所得油狀物用250 mL甲苯稀釋，然後真空濃縮以除去任何剩餘的TFA。將最後一步重複一次。將殘餘物在高真空下乾燥週末以提供呈淡黃色油狀物的 中間體 25，其原樣用於下一步。LCMS方法E：Rt = 1.55 min，[M+H+H 2O] += 760.4。 中間體 26 ： 1,11,21- 三苄基 11-(2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 二十一烷 -1,11,11,21- 四甲酸酯
Figure 02_image163
向含有 中間體 25（16.53 g，22.25 mmol）的500 mL圓底燒瓶中添加180 mL DCM和20 mL THF，然後添加N-羥基琥珀醯亞胺（2.69 g，23.36 mmol）和DCC（5.51 g，26.7 mmol）。將所得混合物攪拌過夜，之後LCMS指示完全轉化為所需產物。將得到的白色懸浮液經矽藻土 ®墊過濾，並用兩個床體積的DCM洗滌墊。將合併的濾液真空濃縮，以提供無色油狀物，並且將得到的油狀物在高真空下乾燥1 h，以提供21.3 g粗製產物。將粗製產物溶解在250 mL DCM中並添加32 g矽膠。將混合物真空濃縮，然後在高真空下乾燥2 h。將殘餘物經由柱乾載入型NPLC（330 g矽膠柱，用5%乙酸乙酯/庚烷至40%乙酸乙酯/庚烷梯度洗脫）純化。將含有產物的級分合併，真空濃縮並在高真空下乾燥過夜以提供呈無色油狀物的 中間體 26。LCMS方法E：Rt = 1.58 min，[M+H+H 2O] += 857.4。 中間體 27 ： 14-(11-( 苄基氧基 )-11- 側氧基十一烷基 )-14-(( 苄基氧基 ) 羰基 )-3,15- 二側氧基 -1- 苯基 -2,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85,88- 二十五氧雜 -16- 氮雜九十一烷 -91- 酸
Figure 02_image165
將 中間體 26（479 mg，0.503 mmol）溶解在5.7 mL無水DCM中。然後用1-胺基3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51, 54,57,60,63,66,69,72-二十四氧雜七十五烷-75-酸（686 mg，0.599 mmol）、DIPEA（149 μL, 0.855 mmol）和DMAP（7 mg，0.057 mmol）處理該溶液並在室溫攪拌16 h。16 h後，根據LC/MS分析反應完成，並藉由旋轉蒸發儀去除揮發物。將粗製產物藉由NPLC（24克ISCO Gold矽膠柱，用在DCM中之0-20% MeOH洗脫）純化，得到呈濃稠油狀物的 中間體 27。LCMS方法E：Rt = 1.35 min，[M+H] += 1871.9。 中間體 28 ： 77,87- 二苄基 1-(2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 77-(11-( 苄基氧基 )-11- 側氧基十一烷基 )-76- 側氧基 -3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72- 二十四氧雜 -75- 氮雜八十七烷 -1,77,87- 三甲酸酯
Figure 02_image167
將 中間體 27（764 mg，0.408 mmol）用在4 mL DCM中之1-羥基吡咯啶-2,5-二酮（56.4 mg，0.490 mmol）處理。向該混合物中添加1M DCC在DCM中之溶液（奧德里奇公司，0.499 mL，0.499 mmol），並將反應混合物在氮氣下攪拌。16 h後，反應完成。除去揮發物並將殘餘物藉由NPLC（24克ISCO Gold柱，用在DCM中之0-15% MeOH洗脫）純化。將含有產物的級分合併並濃縮，以提供 中間體 28。LCMS方法F：Rt = 4.03 min，[M+2H] 2+= 985.1。 中間體 29 ： 11-((75-((2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 氧基 )-75- 側氧基 -3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72- 二十四氧雜七十五烷基 ) 胺基甲醯基 ) 二十一烷 -1,11,21- 三甲酸
Figure 02_image169
用攪拌棒將 中間體 28（500 mg，0.254 mmol）溶解在2.5 mL無水THF中。將大氣抽真空並用氮氣置換三次。然後小心地添加10%鈀碳（奧德里奇公司，27 mg，0.025 mmol）並將燒瓶抽真空。將大氣用來自氣球儲存器的氫氣置換。將反應混合物攪拌過夜16 h，其中LC/MS表明反應完成。將反應混合物用5 mL無水DCM稀釋並通過矽藻土 ®過濾。將濾液濃縮以提供呈濃稠透明油狀物 中間體 29。LCMS方法F：Rt = 2.60 min，[M+2H] 2+= 849.9。 中間體 30 ：苄基 12- 溴十二烷酸酯
Figure 02_image171
將12-溴十二烷酸（2 g，7.16 mmol）、苯甲醇（1.16 g，10.74 mmol）和EDC HCl（2.06 g，10.74 mmol）在24 mL DCM中合併。向該溶液中一次性添加DMAP（44 mg，0.358 mmol）並將所得混合物攪拌過夜。根據LCMS分析，反應完成約90%。將反應混合物藉由NPLC（用在庚烷中之0-15% EtOAc洗脫，二氧化矽）純化。將含有產物的級分合併並濃縮以提供所需產物， 中間體 30。 1H NMR：(400 MHz, 氯仿- d) δ 7.47 - 7.31 (m, 5H), 5.14 (s, 2H), 3.43 (t, J= 6.9 Hz, 2H), 2.38 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 1.88 (p, 2H), 1.67 (p, 2H), 1.50 - 1.39 (m, 2H), 1.35 - 1.26 (m, 12H)。 中間體 31 ： 1,12,23- 三苄基 12-( 三級丁基 ) 二十三烷 -1,12,12,23- 四甲酸酯 , 1,12- 二苄基 1-( 三級丁基 ) 十二烷 -1,1,12- 三甲酸酯
Figure 02_image173
將 中間體 30（1 g，2.71 mmol）、苄基三級丁基丙二酸酯（276.4 mg，1.104 mmol）和在油中60%的氫化鈉（97 mg，2.43 mmol）在12 mL無水DMF中合併以及將所得混合物在烘箱乾燥的圓底燒瓶中在氮氣氛下在室溫攪拌過夜。16 h後，LCMS分析表明完全轉化為所需產物。將反應混合物在水和EtOAc之間分配並用EtOAc（2 x 20 mL）洗滌。將有機相合併，用鹽水洗滌，用硫酸鈉乾燥，過濾並藉由旋轉蒸發儀濃縮。將粗製產物藉由NPLC（用在庚烷中之0-60% EtOAc洗脫，二氧化矽，ELSD檢測）純化。過量的SM溴化物首先快速洗脫，單烷基化產物隨後洗脫，然後是所需產物。將含有產物的級分合併並濃縮以提供呈透明黏性油狀物的 中間體 31。LCMS方法E：Rt = 1.73 min，[M+H+H 2O] += 845.0。 中間體 32 ： 14-( 苄基氧基 )-2-(12-( 苄基氧基 )-12- 側氧基十二烷基 )-2-(( 苄基氧基 ) 羰基 )-14- 側氧基十四烷酸
Figure 02_image175
將 中間體 31（650 mg，0.786 mmol）溶解在DCM（7.2 mL）中並用TFA（0.605 mL，7.86 mmol）處理。16 h後，如LC/MS ELSD信號所示，反應完成。除去揮發物，將所得殘餘物藉由NPLC（用在DCM中之0-5% MeOH洗脫，二氧化矽）純化。將含有產物的級分合併並濃縮以提供呈透明油狀物的 中間體 32。LCMS方法E：Rt = 1.57 min，[M+H] ++ 771.9。 中間體 33 ： 1,12,23- 三苄基 12-(2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 二十三烷 -1,12,12,23- 四甲酸酯
Figure 02_image177
將 中間體 32（310 mg，0.402 mmol）與1-羥基吡咯啶-2,5-二酮（50.9 mg，0.442 mmol）和在DCM中之1M DCC（奧德里奇公司，422 µl，0.422 mmol）溶解在3.6 mL DCM中。15 min後，觀察到DCU副產物的沈澱。將反應混合物攪拌過夜，之後LC/MS顯示完全轉化為產物。部分地除去揮發物，並且將油狀產物藉由NPLC（用在庚烷中之0-30% EtOAc洗脫，二氧化矽）純化，以提供 中間體 33。LCMS方法E：Rt = 1.49 min，[M+H+H 2O] += 886.5。 中間體 34 ： 15-(12-( 苄基氧基 )-12- 側氧基十二烷基 )-15-(( 苄基氧基 ) 羰基 )-3,16- 二側氧基 -1- 苯基 -2,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86,89- 二十五氧雜 -17- 氮雜九十二烷 -92- 酸
Figure 02_image179
將 中間體 33（127.6 mg，0.147 mmol）用1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四基七十五烷-75-酸（Biopharm, 168 mg，0.147 mmol）、DIPEA（38.5 μL, 0.220 mmol）和DMAP（1.8 mg，0.0015 mmol）處理。16 h後，反應基本完成。除去揮發物並將殘餘物藉由NPLC（用在DCM中之0-15% MeOH洗脫，二氧化矽）純化。將含有產物的級分合併並濃縮以提供 中間體 34。LCMS方法E：Rt = 1.41 min，[M+2H] 2+= 951.6。 中間體 35 ： 77,88- 二苄基 1-(2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 77-(12-( 苄基氧基 )-12- 側氧基十二烷基 )-76- 側氧基 -3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72- 二十四氧雜 -75- 氮雜八十八烷 -1,77,88- 三甲酸酯
Figure 02_image181
Figure 02_image183
將 中間體 34（194 mg，0.102 mmol）溶解在1 mL DCM中並用1-羥基吡咯啶-2,5-二酮（11.75 mg，0.102 mmol）和在DCM中之1M DCC（奧德里奇公司，0.107 mL，0.107 mmol）處理。15 min後，觀察到DCU的沈澱。16 h後，如LC/MS所示，反應完成。除去揮發物，得到油狀殘餘物。將該材料藉由NPLC（用在DCM中之0-15% MeOH洗脫，二氧化矽，ELSD檢測）純化。將含有產物的級分合併並濃縮以提供所需產物， 中間體 35。LCMS方法E：Rt = 1.40 min，[M+2H+H 2O] 2+= 1008.2。 中間體 36 ： 12-((75-((2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 氧基 )-75- 側氧基 -3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72- 二十四氧雜七十五烷基 ) 胺基甲醯基 ) 二十三烷 -1,12,23- 三甲酸
Figure 02_image185
將 中間體 35（130 mg，0.065 mmol）溶解在THF（2 mL）中，並將所得混合物用氮氣吹掃三次。小心地添加10%鈀碳（36.4 mg，0.033 mmol），將大氣抽真空，然後用來自氣球儲存器的氫氣置換。如LC/MS分析（ELSD檢測）所示，反應在16 h後完成。藉由NPLC（用在DCM中之MeOH洗脫，二氧化矽，0-20%）完成純化，將含有所需產物的級分合併並濃縮，以提供 中間體 36。LCMS方法E：Rt = 0.64 min，[M+2H] 2+= 864.0。 中間體 37 ：苄基 14- 溴十四烷酸酯
Figure 02_image187
將14-溴十四烷酸（1.00 gm，3.25 mmol）、苯甲醇（677 μL，6.51 mmol）和EDC HCl（936 mg，4.89 mmol）在DCM（11 mL）中合併。向該溶液中一次性添加DMAP（19.9 mg，0.163 mmol）並將所得混合物攪拌過夜。此後，如LC/MS分析所示，反應完成。除去揮發物，將所得殘餘物藉由NPLC（用在庚烷中之0-15% EtOAc洗脫，二氧化矽）純化。將含有產物的級分合併並濃縮以提供所需 中間體 37。 1H NMR (400 MHz, 氯仿- d) δ 7.33 - 7.22 (m, 5H), 5.04 (s, 2H), 3.34 (t, J= 6.9 Hz, 2H), 2.28 (t, J= 7.6 Hz, 2H), 1.78 (p, 2H), 1.58 (p, J= 7.3 Hz, 2H), 1.39 - 1.31 (m, 2H), 1.25 - 1.16 (m, 16H)。 中間體 38 ： 1,14,27- 三苄基 14-( 三級丁基 ) 二十七烷 -1,14,14,27- 四甲酸酯 , 1,14- 二苄基 1-( 三級丁基 ) 十四烷 -1,1,14- 三甲酸酯
Figure 02_image189
將 中間體 37（713 mg，1.793 mmol）、苄基三級丁基丙二酸酯（187 mg，0.747 mmol）和在油中60%的氫化鈉（65.7 mg，1.644 mmol）在無水DMF（8 mL）中合併並在烘箱乾燥的圓底燒瓶中在氮氣氣氛下於60°C攪拌過夜。24 h後，LC/MS分析表明存在單烷基化和雙烷基化丙二酸酯產物。將反應混合物用另外的苄基14-溴十四烷酸酯（229.2 mg，0.57 mmol）和在油中60%的氫化鈉（45 mg，1.13 mmol）處理。16 h後，如LC/MS所示，反應基本完成。將反應混合物小心地在10 mL水和10 mL EtOAc之間分配。將水相用10 ml EtOAc洗滌。將有機相合併，用鹽水洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，並藉由旋轉蒸發儀濃縮。將粗製產物藉由NPLC（用在庚烷中之0-35% EtOAc洗脫，二氧化矽，ELSD檢測）純化。過量的起始材料溴化物首先快速洗脫，單烷基化產物隨後洗脫，然後是所需產物。將含有產物的級分合併並濃縮以提供呈透明黏性油狀物的 中間體 38。LCMS方法E：Rt = 1.87 min，[M+Na] += 905.7。 中間體 39 ： 16-( 苄基氧基 )-2-(14-( 苄基氧基 )-14- 側氧基十四烷基 )-2-(( 苄基氧基 ) 羰基 )-16- 側氧基十六烷酸
Figure 02_image191
將 中間體 38（290.4 mg，0.329 mmol）溶解到DCM（3 mL）中，然後用TFA（0.25 mL，3.29 mmol）處理。16 h後，如LC/MS ELSD信號所示，反應完成。除去揮發物，將所得殘餘物藉由NPLC（用在DCM中之0-5% MeOH洗脫，二氧化矽）純化。將含有產物的級分合併並濃縮以提供呈透明油狀物的 中間體 39。LCMS方法E：Rt = 1.65 min，[M+H] += 828.1。 中間體 40 ： 1,14,27- 三苄基 14-(2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 二十七烷 -1,14,14,27- 四甲酸酯
Figure 02_image193
將 中間體 39（170.4 mg，0.206 mmol）與1-羥基吡咯啶-2,5-二酮（35.6 mg，0.309 mmol）和在DCM中之1M DCC（奧德里奇公司，212 μL，0.212 mmol）溶解在DCM（2 mL）中。10 min後，觀察到DCU的沈澱。將反應混合物攪拌過夜，此時LC/MS顯示完全轉化為產物。部分地除去揮發物，並且將油狀產物藉由NPLC（用在庚烷中之0-40% EtOH洗脫，二氧化矽）純化，以提供 中間體 40。LCMS方法E：Rt = 1.69 min，[M+H] += 924.4。 中間體 41 ： 17-(14-( 苄基氧基 )-14- 側氧基十四烷基 )-17-(( 苄基氧基 ) 羰基 )-3,18- 二側氧基 -1- 苯基 -2,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85,88,91- 二十五氧雜 -19- 氮雜九十四烷 -94- 酸
Figure 02_image195
將 中間體 40（119.8 mg，0.130 mmol）用在1.3 mL DCM溶液中之1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四基七十五烷-75-酸（149 mg，0.130 mmol）、DIPEA（34.0 μL, 0.194 mmol）和DMAP（1.584 mg，0.0013 mmol）處理。16 h後，反應基本完成。除去揮發物並將殘餘物藉由NPLC（用在DCM中之0-65% MeOH洗脫，二氧化矽）純化。將含有產物的級分合併並濃縮以提供 中間體 41。LCMS方法E：Rt = 1.56 min，[M+2H] 2+= 978.9。 中間體 42 ： 77,90- 二苄基 1-(2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 77-(14-( 苄基氧基 )-14- 側氧基十四烷基 )-76- 側氧基 -3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72- 二十四氧雜 -75- 氮雜九十烷 -1,77,90- 三甲酸酯
Figure 02_image197
Figure 02_image199
將 中間體 41（144.2 mg，0.074 mmol）溶解到700 μL DCM中，並用1-羥基吡咯啶-2,5-二酮（12.73 mg，0.111 mmol）和在DCM中之1M DCC（二環己基甲烷二亞胺）（奧德里奇公司，0.077 mL，0.077 mmol）處理。15 min後，觀察到DCU的沈澱。16 h後，如LC/MS所示，反應完成。除去揮發物，得到油狀殘餘物。將該材料藉由具有ELSD檢測的NPLC（用在DCM中之0-25% MeOH洗脫，二氧化矽）純化。將含有產物的級分合併並濃縮以提供所需產物， 中間體 42。LCMS方法E ：Rt = 1.55 min，[M+2H+H 2O] 2+= 1036.2/ 中間體 43 ： 14-((75-((2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 氧基 )-75- 側氧基 -3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72- 二十四氧雜七十五烷基 ) 胺基甲醯基 ) 二十七烷 -1,14,27- 三甲酸
Figure 02_image201
將 中間體 42（118.8 mg，0.058 mmol）溶解在帶有攪拌棒的圓底燒瓶中之3.75 mL THF中。將所得混合物用氮氣吹掃三次，然後添加30.8 mg（0.029 mmol）10% Pd/C。將大氣抽真空，並且用來自氣球的氫氣置換。反應在16 h內完成。將反應混合物用10 mL DCM稀釋，通過矽藻土 ®過濾並將濾液濃縮至乾。藉由NPLC（用在DCM中之MeOH洗脫，二氧化矽，0-20%）完成純化，將含有產物的級分合併並濃縮，以提供 中間體 43。LCMS方法E：Rt = 0.86 min，[M+2H] 2+= 892.0。 中間體 44 ：苄基 15- 溴十五烷酸酯
Figure 02_image203
將15-溴十五烷酸（1949 mg, 6.07 mmol）、苯甲醇（984 mg, 9.10 mmol）和EDCI HCl（1744 mg，9.10 mmol）在24 mL DCM中合併。向該溶液中一次性添加DMAP（37.1 mg，0.303 mmol）並將所得混合物攪拌32 h。32 h後，反應基本完成。將反應混合物在水和DCM之間分配。將有機相用鹽水洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，並且過濾。除去揮發物，將所得殘餘物藉由NPLC（用在庚烷中之0-15% EtOAc洗脫，二氧化矽，ELSD檢測）純化。將含有產物的級分合併並濃縮以提供 中間體 44。 1H NMR (400 MHz, 氯仿- d) δ 7.29 - 7.22 (m, 5H), 5.02 (s, 2H), 3.31 (t, J= 6.9 Hz, 2H), 2.26 (t, J= 7.6 Hz, 2H), 1.76 (p, 2H), 1.54 (p, J= 7.3 Hz, 2H), 1.36 - 1.30 (m, 2H), 1.22 - 1.16 (m, 18H)。 中間體 45 ： 1,15,29- 三苄基 15-( 三級丁基 ) 二十九烷 -1,15,15,29- 四甲酸酯 , 1,15- 二苄基 1-( 三級丁基 ) 十五烷 -1,1,15- 三甲酸酯
Figure 02_image205
將 中間體 44（1013 mg, 2.461 mmol）、苄基三級丁基丙二酸酯（280 mg, 1.119 mmol）和在油中60%的氫化鈉（98 mg, 2.461 mmol）在無水DMF（5.6 mL）中合併並在烘箱乾燥的圓底燒瓶中在氮氣氣氛下於RT攪拌過夜。然後將反應混合物小心倒入10 mL水中並用10 mL EtOAc萃取三次。將有機相合併，用鹽水和無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。將產物藉由NPLC（用在庚烷中之0-60% EtOAc洗脫，二氧化矽，ELSD檢測）純化。將含有產物的級分合併並濃縮以提供呈透明黏性油狀物的 中間體 45。LCMS方法H：Rt = 4.23 min，[M+H+H 2O] += 928.9。 中間體 46：17-(苄基氧基)-2-(15-(苄基氧基)-15-側氧基十五烷基)-2-((苄基氧基)羰基)-17-側氧基十七烷酸
Figure 02_image207
將 中間體 45（750 mg，0.823 mmol）溶解到DCM（8.23 mL）中並用TFA（634 μL, 8.23 mmol）處理。16 h後，反應部分地完成。將反應混合物攪拌一週並在此時間之後基本完成。將所得油狀殘餘物藉由NPLC（用0-25% EtOAc/庚烷洗脫，二氧化矽）用ELSD檢測純化。將含有產物的級分濃縮，得到 中間體 46。LCMS方法H：Rt = 3.70 min，[M+H+H 2O] += 873.2。 中間體 47 ： 1,15,29- 三苄基 15-(2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 二十九烷 -1,15,15,29- 四甲酸酯
Figure 02_image209
將 中間體 46（435 mg，0.509 mmol）和1-羥基吡咯啶-2,5-二酮（64.4 mg，0.560 mmol）懸浮於5 mL無水DCM（5 mL）中並且添加在DCM中之1M DCC（奧德里奇公司，534 μL, 0.534 mmol）。將所得混合物在室溫攪拌。15 min後，形成了細小沈澱物（ppt），表明形成了DCU。16 h後，如LC/MS所示，反應完成。藉由蒸發除去揮發物。將油狀殘餘物藉由NPLC（用在DCM中之0-10% MeOH洗脫，二氧化矽，ELSD檢測）純化。將含有產物的級分合併並濃縮以提供 中間體 47。LCMS方法I：Rt = 3.62 min，[M+H 2O+H] += 970.1。 中間體 48 ： 18-(15-( 苄基氧基 )-15- 側氧基十五烷基 )-18-(( 苄基氧基 ) 羰基 )-3,19- 二側氧基 -1- 苯基 -2,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86,89,92- 二十五氧雜 -20- 氮雜九十五烷 -95- 酸
Figure 02_image211
將 中間體 47（143 mg, 150 mmol）與1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-二十四基七十五烷-75-酸（198 mg，0.173 mmol）、DIPEA（48.5 μL，0.375 mmol）和DMAP（2 mg，0.109 mmol）溶解在2打蘭螺旋蓋小瓶中之1.5 mL DCM中。將所得混合物攪拌過夜。然後除去揮發物並將所得殘餘物經由NPLC（用在DCM中之0-10% MeOH洗脫，二氧化矽）純化。將含有產物的級分合併並濃縮以提供呈透明半固體的 中間體 48。LCMS方法I：Rt = 2.53 min，[M+2H+2H 2O] 2+= 1010.1。 中間體 49 ： 77,91- 二苄基 1-(2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 77-(15-( 苄基氧基 )-15- 側氧基十五烷基 )-76- 側氧基 -3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72- 二十四氧雜 -75- 氮雜九十一烷 -1,77,91- 三甲酸酯
Figure 02_image213
將 中間體 48（210 mg，0.106 mmol）和1-羥基吡咯啶-2,5-二酮（13.4 mg，0.116 mmol）伴隨攪拌在烘箱乾燥的10 mL圓底燒瓶中（RBF）中之1 mL無水DCM中懸浮。向該混合物中添加在DCM中之1M DCC（奧德里奇公司，116 μL，0.116 mmol）。16 h後，如LC/MS所示，反應完成。除去揮發物，將所得殘餘物藉由NPLC（用在DCM中之0-15% MeOH洗脫，二氧化矽，ELSD檢測）純化。將含有所需產物的級分合併並濃縮，得到呈蠟狀固體的 中間體 49。LCMS方法H：Rt = 3.48 min，[M+H 2O+2H] 2+= 1049.9。 中間體 50 ： 15-((75-((2,5- 二側氧基吡咯啶 -1- 基 ) 氧基 )-75- 側氧基 -3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72- 二十四氧雜七十五烷基 ) 胺基甲醯基 ) 二十九烷 -1,15,29- 三甲酸
Figure 02_image215
Figure 02_image217
將 中間體 49（140 mg，0.067 mmol）溶解在配備有攪拌棒的圓底燒瓶中之無水THF（1 mL）中，並將所得混合物用氮氣吹掃三次。然後添加乾10%鈀碳（7 mg，6.73 umol）和20%氫氧化鈀碳（奧德里奇公司）（5 mg，6.73 umol），並且將大氣抽真空並用來自氣球的氫氣置換。允許將反應混合物攪拌16 h。然後將大氣抽真空並用氮氣置換。將反應混合物用5 mL無水DCM稀釋。在通過矽藻土 ®過濾後，除去揮發物以提供呈黏性油狀物的 中間體 50。LCMS方法D：Rt = 1.36 min，[M+2H] 2+= 906.2。 肽合成：
GLP1肽可以使用標準合成技術合成，例如 Jose Palomo RSC Adv. [ RSC進展], 2014, 4, 32658-32672中提到的固相肽合成技術；Sambrook等人. Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖：實驗室手冊], 第2版, 冷泉港 (1989)和類似的參考資料中描述的重組DNA技術。 GLP-1 類似物合成：[Fmoc-His7, Aib8, Arg34]GLP-1 (7-37)
Figure 02_image219
Figure 02_image221
使用標準Fmoc化學合成肽。
1)     樹脂製備：向1-氯-2-[氯(二苯基)甲基]苯（100 mmol，1.00當量）添加Fmoc-Gly-OH（50 mol，0.50當量）和在DCM（4.00 mL）中之DIEA（400 mmol，4.00當量）。將所得混合物在氮氣氛下在25°C攪拌2 h。然後添加MeOH（100 mL）並將混合物在氮氣氛下再攪拌30 min。將樹脂用DMF（500 mL）洗滌三次。然後添加在DMF（500 mL）中之20%哌啶並將混合物在氮氣氣氛中在25°C攪拌20 min。將所得混合物過濾以提供樹脂。將樹脂用DMF（500 mL）洗滌五次，然後過濾以提供樹脂。
2)     偶合：將DIEA（200 mmol，4.00當量）、Fmoc-Arg(Pbf)-OH（100 mmol，2.00當量）和HBTU（95 mmol，1.90當量）在DMF（300 mL）中之溶液添加至樹脂並在25°C在氮氣氣氛下攪拌30 min。然後將樹脂用DMF（500 mL）洗滌三次。
3)     去保護：將在DMF（500 mL）中之20%哌啶添加至樹脂，並將所得混合物在25°C在氮氣氣氛下攪拌20 min。將樹脂用DMF（500 mL）洗滌五次並且過濾以提供樹脂。
然後用另外的胺基酸單元#3至31重複上述偶合步驟2和去保護步驟3以產生GLP-1或GLP-1類似物。
單位 編號 材料 偶合試劑
1 Fmoc-Gly-OH（2.00當量） HBTU（1.90當量）和DIEA（4.00當量）
2 Fmoc-Arg(Pbf)-OH（2.00當量） HBTU（1.90當量）和DIEA（4.00當量）
3 Fmoc-Gly-OH（2.00當量） HBTU（1.90當量）和DIEA（4.00當量）
4 Fmoc-Arg(Pbf)-OH（2.00當量） HBTU（1.90當量）和DIEA（4.00當量）
5 Fmoc-Val-OH（2.00當量） HBTU（1.90當量）和DIEA（4.00當量）
6 Fmoc-Leu-OH（2.00當量） HBTU（1.90當量）和DIEA（4.00當量）
7 Fmoc-Trp(Boc)-OH（2.00當量） HBTU（1.90當量）和DIEA（4.00當量）
8 Fmoc-Ala-OH（2.00當量） HBTU（1.90當量）和DIEA（4.00當量）
9 Fmoc-Ile-OH（2.00當量） HBTU（1.90當量）和DIEA（4.00當量）
10 Fmoc-Phe-OH（2.00當量） HBTU（1.90當量）和DIEA（4.00當量）
11 Fmoc-Glu(Otbu)-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
11 Fmoc-Glu(Otbu)-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
12 Fmoc-Lys(Boc)-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
13 Fmoc-Ala-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
14 Fmoc-Ala-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
15 Fmoc-Gln(Trt)-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
15 Fmoc-Gln(Trt)-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
16 Fmoc-Gly-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
17 Fmoc-Glu(Otbu)-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
18 Fmoc-Leu-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
19 Fmoc-Tyr(tBu)-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
20 Fmoc-Ser (tBu)-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
21 Fmoc-Ser (tBu)-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
22 Fmoc-Val-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
23 Fmoc-Asp(Otbu)-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
24 Fmoc-Ser (tBu)-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
25 Fmoc-Thr (tBu)-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
26 Fmoc-Phe-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
27 Fmoc-Thr (tBu)-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
28 Fmoc-Gly-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
29 Fmoc-Glu(Otbu)-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
30 Fmoc-Aib-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
31 Fmoc-His(Trt)-OH（3.00當量） HOAt（3.00當量）和DIC（3.00當量）
偶合反應藉由茚三酮試驗監測，並且將樹脂用DMF洗滌5次。 肽切割和純化：
1)     在室溫下將切割緩衝液（92.5%TFA/2.5%3-巰基丙酸/2.5%TIS/2.5%H 2O）添加到含有側鏈受保護的肽的燒瓶中，並且然後攪拌2 h。
2)     將沈澱的肽用冷的異丙醚洗滌。
3)     將沈澱的肽過濾並收集濾餅。
4)     將沈澱的肽用異丙醚再洗滌兩次。
5)     然後將粗肽在真空下乾燥2 h。
將粗肽藉由製備型HPLC（TFA條件；30°C，用A：在H 2O中之0.075% TFA，B：CH 3CN洗脫）純化並藉由製備型HPLC（HOAc條件，用A：在H 2O中之0.5%HAc，B：ACN洗脫）以提供呈白色固體的[Fmoc-His7, Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)。 脂肪酸衍生物（帶有連接子）與肽的軛合：
Figure 02_image223
肽軛合的通用程序：
方法 A ：將[Fmoc-His7, Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)放入DMA中並添加所需的「脂肪酸-連接子軛合物」NHS-酯。將該混合物在室溫攪拌16-40 h。一旦藉由LCMS分析觀察到完全轉化，添加10當量哌啶並繼續攪拌2 h以除去Fmoc基團。
將粗製產物藉由HPLC（柱：Waters XSelect C18 CSH 19 x 150 mm；5微米）用含0.1% TFA改性劑的0-100% ACN水溶液（30 mL/min）洗脫進行純化，以提供呈白色蓬鬆固體的所需化合物的TFA鹽。藉由將化合物連同BT AG 1-XB樹脂（目錄號143-2446；伯樂公司（BIO-RAD））一起放入水中並攪拌所得混合物1 h來除去殘留的TFA。然後過濾混合物並用乙腈和水洗滌樹脂。將該溶液凍乾以提供所需化合物。
方法 B ：將[Fmoc-His7, Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)放入DMF中並添加所需的「脂肪酸-連接子軛合物」NHS脂肪酸。將該混合物在室溫攪拌16-40 h。一旦藉由LCMS分析觀察到完全轉化，添加10當量哌啶並繼續攪拌另外2 h以除去Fmoc基團。將粗製產物用0.1N碳酸銨水溶液稀釋並藉由RPLC（ISCO Gold C18 150克柱，用在水中之10%-100% ACN、0.1%甲酸改性劑洗脫）純化。將含有所需產物的純級分合併並凍乾以提供所需化合物。 化合物 1 （非鏡像異構物混合物）
Figure 02_image225
向[Fmoc-His7, Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)（356.6 mg，0.099 mmol）在無水DMF（9.8 mL）中之溶液中添加 中間體 6（197 mg，0.118 mmol）在1.5 mL無水DMF中之溶液。16 h後，反應已達到約85%的轉化率，因此添加另外的0.2當量 中間體 6（32.9 mg，在0.5 mL無水DMF中）。48 h後，反應完成。然後通過添加哌啶（98 μL，0.985 mmol，10當量）開始去除Fmoc。16 h後，Fmoc完全去除，並且減壓去除溶劑。將上述粗製產物放入25 mL 0.1N碳酸銨水溶液中並注入（兩次）到ISCO RediSep Gold C18Aq 100克層析柱（目錄號69-2203-562）上，用含0.1% TFA改性劑的0-100% ACN水溶液作為洗脫劑洗脫。將含有產物的級分凍乾以提供白色蓬鬆粉末。為了清除殘留的TFA，將700 mg氫氧化物樹脂（伯樂公司AG 1-X8）稱重到Eppendorf管中並用5 X 2 mL 1 : 1 ACN : H 2O，0.1%甲酸沖洗，每次沖洗之間去除並丟棄上清液（離心以沈澱樹脂）。將沖洗過的樹脂添加到上述製備的產物溶液中並振盪1 h。將上清液過濾，然後用含0.1%甲酸的10 mL 1 : 1 ACN : H 2O沖洗。將該溶液凍乾以提供呈白色粉末的 化合物 1。LCMS方法J：觀察到的m/z = 2474.8447（MH 2 2+），Rt：1.16 min；計算的質量：4947.6750.LCMS方法K：觀察到的m/z = 4948.7002 (MH) +，Rt：2.31 min；計算的質量：4947.6750. 化合物 2 ：非鏡像異構物 1
Figure 02_image227
化合物 2使用軛合的通用程序方法B並使用 中間體 15A（S-鏡像異構物）作為起始材料合成。
LCMS方法F：觀察到的m/z = 1238.5（MH 4 4+），Rt：2.25 min；計算的質量：4947.6750.
LCMS方法K：觀察到的4948.7002（MH +），Rt：2.31 min；計算的質量：4947.6750. 用於合成 化合物 2的替代方法：
類似於將 中間體 3轉換為 4，然後轉換為 5並最終轉換為 中間體 6的反應，用於合成 化合物 2的替代方法起始於 中間體 3B（ S-鏡像異構物），其轉化為 4B（= 中間體 4的 S-鏡像異構物），然後到 5B（= 中間體 5的 S-鏡像異構物），最後到 中間體 6B（= 中間體 6的S-鏡像異構物）。然後使 中間體 6B和[Fmoc-His7, Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)根據軛合的通用程序反應以獲得 化合物 2。
化合物 2 的脂肪酸部分的絕對組態藉由使用鏡像異構物純的 中間體 3B（其用作合成 化合物 2的起始材料）之衍生物的單X射線晶體學確定為 S。 化合物 3 ：非鏡像異構物 2
Figure 02_image229
化合物 3使用軛合的通用程序方法B並使用 中間體 15B（ R-鏡像異構物）作為起始材料合成。
LCMS方法F：觀察到的m/z = 1238.6（MH 4 4+），Rt：2.29 min；計算的質量：4947.6750.
LCMS方法K：觀察到的4948.7002（MH +），Rt：2.31 min；計算的質量：4947.6750 用於合成 化合物 3的替代方法：
類似於將 中間體 3轉換為 4，然後轉換為 5並最終轉換為 中間體 6的反應，用於 化合物 3的替代方法起始於 中間體 3A（ R-鏡像異構物），其轉化為 4A（= 中間體 4的 R-鏡像異構物），然後到 5A（= 中間體 5的 R-鏡像異構物），最後到 中間體 6A（= 中間體 6的 R-鏡像異構物）。然後使 中間體 6A和[Fmoc-His7, Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)根據軛合的通用程序反應以獲得 化合物 3。
化合物 3的脂肪酸部分的絕對組態被確定為 R。這藉由鏡像異構物純的 中間體 3A的衍生物的單X射線晶體學測定。 化合物 4 ：
Figure 02_image231
化合物 4使用 中間體 19使用軛合的通用程序方法A合成。
LCMS方法F：觀察到的m/z = 1061.7（MH 4 4+），Rt：2.26 min；計算的質量：4243.2556. 化合物 5 ：
Figure 02_image233
化合物 5使用 中間體 22使用軛合的通用程序方法B合成。
LCMS方法F：觀察到的m/z = 996.6（MH 4 4+），Rt：2.34 min；計算的質量：3979.0983. 化合物 6 ：
Figure 02_image235
化合物 6使用 中間體 29使用軛合的通用程序方法B合成。
LCMS方法F：觀察到的m/z = 2490.9（MH 2 2+），Rt：2.09 min；計算的質量：4977.6495.
LCMS方法K：觀察到的4978.6602（MH +），Rt：2.09 min；計算的質量：4977.6495. 化合物 7 ：
Figure 02_image237
化合物 7使用 中間體 36使用軛合的通用程序方法B合成。
LCMS方法F：觀察到的m/z = 1253.1（MH 4 4+），Rt：2.13 min；計算的質量：5005.6805
LCMS方法K：觀察到的5006.7100（MH +），Rt：2.15 min；計算的質量：5005.6805 化合物 8 ：
Figure 02_image239
化合物 8使用 中間體 43使用軛合的通用程序方法B合成。
LCMS方法K：觀察到的5062.7700（MH +），Rt：2.30 min；計算的質量：5061.7431 化合物 9 ：
Figure 02_image241
化合物 9使用 中間體 50使用軛合的通用程序方法A合成。
LCMS方法J：觀察到的m/z = 1274.0（MH 4 4+），Rt：1.18 min；計算的質量：5089.7744.
熟悉該項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗就確定本文具體描述的具體實施方式的許多等效物。此類等效物旨在被涵蓋於以下請求項的範圍內。 附件 1 （序列表）GLP-1 (7-37)： SEQ ID NO: 1：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly SEQ ID NO: 2：Xaa 7-Xaa 8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa 16-Ser-Xaa 18-Xaa 19-Xaa 20-Glu-Xaa 22-Xaa 23-Ala-Xaa 25-Arg-Xaa 27-Phe-lle-Xaa 30-Trp-Leu-Xaa 33-Xaa 34-Xaa 35-Xaa 36-Xaa 37Xaa 16係VaI或Leu； Xaa 18係Ser、Lys或Arg； Xaa 19係Tyr或GIn； Xaa 20係Leu或Met； Xaa 22係GIy、Glu或Aib； Xaa 23係GIn、Glu、Lys或Arg； Xaa 25係Ala或VaI； Xaa 27係Glu或Leu； Xaa 30係Ala、Glu或Arg； Xaa 33係VaI或Lys； Xaa 34係Lys、Glu、Asn或Arg； Xaa 35係GIy或Aib； Xaa 36係Arg、GIy或Lys、或不存在；以及 Xaa 37係GIy、Ala、Glu、Pro、Lys、或不存在。 [Aib8, Arg34]GLP-1 (7-37)： SEQ ID NO: 3：His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly [Arg34]GLP-1 (7-37)： SEQ ID NO: 4：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly 序列表＜110＞ 諾華股份有限公司（NOVARTIS AG） ＜120＞ 升糖素樣肽化合物 ＜130＞ PAT059040-US-PSP ＜160＞ 4 ＜170＞ PatentIn 3.5版 ＜210＞ 1 ＜211＞ 31 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的多肽 ＜400＞ 1
Figure 02_image243
＜210＞ 2 ＜211＞ 31 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的多肽 ＜220＞ ＜221＞ 尚未歸類的特徵 ＜222＞ (1)..(2) ＜223＞ Xaa可為任何天然存在的胺基酸 ＜220＞ ＜221＞ 尚未歸類的特徵 ＜222＞ (10)..(10) ＜223＞ VaI或Leu ＜220＞ ＜221＞ 尚未歸類的特徵 ＜222＞ (12)..(12) ＜223＞ Ser、Lys或Arg ＜220＞ ＜221＞ 尚未歸類的特徵 ＜222＞ (13)..(13) ＜223＞ Tyr或GIn ＜220＞ ＜221＞ 尚未歸類的特徵 ＜222＞ (14)..(14) ＜223＞ Leu或Met ＜220＞ ＜221＞ 尚未歸類的特徵 ＜222＞ (16)..(16) ＜223＞ GIy、Glu或Aib ＜220＞ ＜221＞ 尚未歸類的特徵 ＜222＞ (17)..(17) ＜223＞ GIn、Glu、Lys或Arg ＜220＞ ＜221＞ 尚未歸類的特徵 ＜222＞ (19)..(19) ＜223＞ Ala或VaI ＜220＞ ＜221＞ 尚未歸類的特徵 ＜222＞ (21)..(21) ＜223＞ Glu或Leu ＜220＞ ＜221＞ 尚未歸類的特徵 ＜222＞ (24)..(24) ＜223＞ Ala、Glu或Arg ＜220＞ ＜221＞ 尚未歸類的特徵 ＜222＞ (27)..(27) ＜223＞ VaI或Lys ＜220＞ ＜221＞ 尚未歸類的特徵 ＜222＞ (28)..(28) ＜223＞ Lys、Glu、Asn或Arg ＜220＞ ＜221＞ 尚未歸類的特徵 ＜222＞ (29)..(29) ＜223＞ GIy或Aib ＜220＞ ＜221＞ 尚未歸類的特徵 ＜222＞ (30)..(30) ＜223＞ Arg、GIy或Lys或不存在 ＜220＞ ＜221＞ 尚未歸類的特徵 ＜222＞ (31)..(31) ＜223＞ GIy、Ala、Glu、Pro、Lys或不存在 ＜400＞ 2
Figure 02_image245
＜210＞ 3 ＜211＞ 31 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的多肽 ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ (2)..(2) ＜223＞ Aib ＜400＞ 3
Figure 02_image247
＜210＞ 4 ＜211＞ 31 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成的多肽 ＜400＞ 4
Figure 02_image249
無
無
無
 

          <![CDATA[<110>  瑞士商諾華公司（NOVARTIS AG）]]>
          <![CDATA[<120>  升糖素樣肽化合物]]>
          <![CDATA[<130>  PAT059040-EP-EPA]]>
          <![CDATA[<160>  4     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn 3.5版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  31]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的多肽]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 
                      20                  25                  30      
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  31]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa可為任何天然存在的胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (10)..(10)]]>
          <![CDATA[<223>  VaI或Leu]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (12)..(12)]]>
          <![CDATA[<223>  Ser, Lys或Arg]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (13)..(13)]]>
          <![CDATA[<223>  Tyr或GIn]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (14)..(14)]]>
          <![CDATA[<223>  Leu或Met]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (16)..(16)]]>
          <![CDATA[<223>  GIy, Glu或Aib]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (17)..(17)]]>
          <![CDATA[<223>  GIn, Glu, Lys或Arg]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (19)..(19)]]>
          <![CDATA[<223>  Ala或VaI]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (21)..(21)]]>
          <![CDATA[<223>  Glu或Leu]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (24)..(24)]]>
          <![CDATA[<223>  Ala, Glu或Arg]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (27)..(27)]]>
          <![CDATA[<223>  VaI或Lys]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (28)..(28)]]>
          <![CDATA[<223>  Lys, Glu, Asn或Arg]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (29)..(29)]]>
          <![CDATA[<223>  GIy或Aib]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (30)..(30)]]>
          <![CDATA[<223>  Arg, GIy或Lys或不存在]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (31)..(31)]]>
          <![CDATA[<223>  GIy, Ala, Glu, Pro, Lys或不存在]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 
          1               5                   10                  15      
          Xaa Ala Xaa Arg Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 
                      20                  25                  30      
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  31]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的多肽]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MOD_RES]]>
          <![CDATA[<222>  (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  Aib]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 
                      20                  25                  30      
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  31]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的多肽]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 
                      20                  25                  30
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004

Claims (30)

  1. 一種式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽：
    Figure 03_image251
    (I)， 其中： R 1和R 2獨立地選自CH 3、OH、CO 2H、CH=CH 2和C≡CH； n和m各自是獨立地選自5至30的整數； L係視需要的連接子； P係GLP-1或GLP-1類似物。
  2. 如請求項1所述之式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中P經由NH基團與L結合。
  3. 如請求項1或2所述之式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中L選自：
    Figure 03_image005
    、
    Figure 03_image009
    、和
    Figure 03_image019
    ， 其中： y係選自1至36的整數， s係0、1或2，且k係1、2或3，並且 標記為**的波浪線表示與式 (I) 之CO-基團的附接，並且 標記為***的波浪線表示與基團P的附接。
  4. 如請求項3所述之式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，其中L係：
    Figure 03_image009
    其中y係選自1至36的整數。
  5. 如請求項1或4所述之式 (I) 之化合物，其係式 (II) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，
    Figure 03_image257
    (II) 其中： NH-P’表示經由NH-部分與連接子L的CO-基團附接的基團P； R 1和R 2獨立地選自CH 3、OH和CO 2H； n和m各自是獨立地選自5至30的整數； 以及 y係選自1至36的整數。
  6. 如請求項5所述之式 (II) 之化合物，其中： R 1係CO 2H並且R 2係CH 3；n係10並且m係10； R 1係CO 2H並且R 2係CO 2H；n係10並且m係10； R 1係CO 2H並且R 2係CO 2H；n係10並且m係11； R 1係CO 2H並且R 2係CO 2H；n係10並且m係13；或者 R 1係CO 2H並且R 2係CO 2H；n係10並且m係14。
  7. 如請求項5或6所述之式 (II) 之化合物，其係式 (III) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，
    Figure 03_image259
    (III)， 其中R 1係CO 2H並且R 2係CH 3。
  8. 如請求項7所述之式 (III) 之化合物，其係式 (IV) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，
    Figure 03_image048
    (IV) 其中該化合物作為外消旋物存在，或作為立體化學富集的混合物存在，或者就標記為*的碳原子而言是立體化學純的。
  9. 如請求項8所述之式 (IV) 之化合物，其係式 (IVa) 之化合物或式 (IVb) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，
    Figure 03_image262
    (IVa)
    Figure 03_image264
    (IVb) 其中y係選自1至36的整數。
  10. 如請求項9所述之式 (IVa) 之化合物或式 (IVb) 之化合物，其中y係選自2至24的整數。
  11. 如請求項10所述之式 (IVa) 之化合物或式 (IVb) 之化合物，其中y係24。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之化合物、或其藥學上可接受的鹽，其中P選自 GLP-1 (7-37)：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly（ SEQ ID NO: 1），和 GLP-1類似物，其相對於序列GLP-1 (7-37) 在位置7、或在位置8、或在位置7和8包含非天然胺基酸殘基。
  13. 如請求項1至11中任一項所述之式 (I) 之化合物、或其藥學上可接受的鹽，其中P選自： [Aib8, Arg34]GLP-1 (7-37)：His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly（ SEQ ID NO: 3）；以及 [Arg34]GLP-1 (7-37)：His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly（ SEQ ID NO: 4）。
  14. 如請求項1至11中任一項所述之式 (I) 之化合物、或其藥學上可接受的鹽，其中P係[Aib8, Arg34]GLP-1 (7-37) 如下所示：
    Figure 03_image054
    並且其中胺基酸成員Lys上的波浪線表示與L的附接點。
  15. 如請求項1至11和14中任一項所述之式 (I) 之化合物、或其藥學上可接受的鹽，該化合物係
    Figure 03_image056
    其中y係選自1至36的整數，並且 其中該化合物作為非鏡像異構物混合物、立體化學富集的混合物存在或者就標記為*的碳原子而言是立體化學純的。
  16. 如請求項1至11和15中任一項所述之式 (I) 之化合物、或其藥學上可接受的鹽，該化合物選自：
    Figure 03_image062
    （化合物1）、
    Figure 03_image064
    （化合物2）、
    Figure 03_image066
    （化合物3）、
    Figure 03_image068
    （化合物4）、
    Figure 03_image070
    （化合物5）、
    Figure 03_image072
    （化合物6）、
    Figure 03_image074
    （化合物7）、
    Figure 03_image076
    （化合物8）和
    Figure 03_image078
    （化合物9）。
  17. 如請求項16所述之式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，該化合物係：
    Figure 03_image062
    （化合物1）。
  18. 如請求項16所述之式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，該化合物係：
    Figure 03_image064
    （化合物2）。
  19. 如請求項16所述之式 (I) 之化合物或其藥學上可接受的鹽，該化合物係：
    Figure 03_image066
    （化合物3）。
  20. 一種藥物組成物，該藥物組成物包含如請求項1至19中任一項所述之化合物或其藥學上可接受的鹽、以及一或多種藥學上可接受的載劑。
  21. 一種組合，該組合包含治療有效量的如請求項1至19中任一項所述之化合物或其藥學上可接受的鹽、以及一或多種治療活性劑。
  22. 如請求項21所述之組合，其中該化合物選自化合物1、2和3。
  23. 如請求項1至19中任一項所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，用於作為藥物使用。
  24. 如請求項1至19中任一項所述之化合物或其藥學上可接受的鹽，用於在治療選自以下的疾病和障礙中使用：肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖、一或多種選自慢性腎病和糖尿病腎病、血脂異常、代謝綜合症、選自NAFLD和NASH的進行性肝病、心血管疾病和與糖尿病相關的周圍神經病變的糖尿病併發症。
  25. 如請求項24所述使用的化合物，其中該心血管疾病選自高血壓，動脈粥樣硬化，周邊動脈疾病，中風，心肌病，心房顫動，選自射出分率降低的心臟衰竭（HFrEF）、射出分率中間值的心臟衰竭（HFmrEF）和射出分率保留的心臟衰竭（HFpEF）的心臟衰竭，冠心病和選自房性心律不整和室性心律不整的心律不整。
  26. 如請求項23至25中任一項所述使用的化合物，其中該化合物選自化合物1、2和3。
  27. 一種用於治療需要對升糖素樣肽1受體（GLP1R）的促效劑敏感的療法的患者之方法，該方法包括向該患者投與治療有效量的如請求項1至19中任一項所述之化合物或其藥學上可接受的鹽。
  28. 一種在有需要的患者中治療選自以下的疾病或障礙之方法：肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖、一或多種選自慢性腎病和糖尿病腎病、血脂異常、代謝綜合症、選自NAFLD和NASH的進行性肝病、心血管疾病和與糖尿病相關的周圍神經病變的糖尿病併發症，該方法包括向該患者投與治療有效量的如請求項1至19中任一項所述之化合物或其藥學上可接受的鹽。
  29. 如請求項28所述之方法，其中該心血管疾病選自高血壓，動脈粥樣硬化，周邊動脈疾病，中風，心肌病，心房顫動，選自射出分率降低的心臟衰竭（HFrEF）、射出分率中間值的心臟衰竭（HFmrEF）和射出分率保留的心臟衰竭（HFpEF）的心臟衰竭，冠心病和選自房性心律不整和室性心律不整的心律不整。
  30. 如請求項28或29所述之方法，其中該化合物選自化合物1、2和3。
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