KR20230171471A - 글루카곤 유사 펩티드 화합물 - Google Patents

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조비타 마르킨케비치엔
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마틴 마로
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Abstract

GLP-1 화합물 및 지방산 또는 지방산 유도체를 포함하는 신규 화합물, 상기 신규 화합물의 제조 및 이의 용도가 본원에 제공된다.

Description

글루카곤 유사 펩티드 화합물
GLP-1 화합물 및 지방산 또는 지방산 유도체를 포함하는 신규 화합물, 상기 신규 화합물의 제조 및 이의 용도가 본원에 제공된다. 이러한 신규 화합물은 바람직한 약리학적 효능을 나타낸다.
글루카곤 유사 펩티드(GLP) 1(GLP1) 작용제는 중요한 부류의 치료적으로 효과적인 화합물에 속한다. GLP1 작용제는 일반적으로 제2형 당뇨병 치료에 사용된다. 빠른 생분해를 방지하여 생체 내 양호한 작용 지속 시간을 제공하고 내약성을 향상시키기 위해, 이러한 글루카곤 유사 펩티드 1(GLP1) 화합물의 구조를 변형하는 다양한 접근법이 사용되어 왔다.
예를 들어, WO 2006/097537(Novo Nordisk)에는 위치 26의 리신 잔기에 대한 모이어티(상기 모이어티는 2개 이상의 산성 기를 포함함)로 아실화된 서열 GLP-1(7-37)(서열번호 1)에 비해 위치 7 및/또는 8에 하나 이상의 비천연 아미노산 잔기의 변형이 있는 GLP1 화합물이 기재되어 있다.
WO 2015/200078(Novartis)에는 링커를 통해 지방산에 연결된 GDF15와 같은 생체분자를 포함하는 접합체가 개시되어 있다. 해당 접합체는 대사 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다.
임의로 링커를 통해 화학식 i의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 공유 결합된 GLP-1 또는 GLP-1 유사체를 포함하는 화합물이 본원에 제공된다:
[화학식 i]
[식에서,
R1 및 R2는 독립적으로 CH3, OH, CO2H, CH=CH2, 및 C≡CH로부터 선택되고;
n 및 m은 각각 5 내지 30에서 독립적으로 선택되는 정수이고;
화학식 i의 화합물은 이의 CO2H 기 중 하나를 통해 공유 결합됨].
본원에 기술된 화합물은 일반적으로 글루카곤 유사 펩티드 1 수용체(GLP1R)의 작용제로서 작용할 수 있다. 따라서, 이러한 화합물은 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는 질환 또는 장애의 치료에 유용할 수 있다: 비만, 제2형 진성 당뇨병, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 하나 이상의 당뇨병 합병증(만성 신장 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않음), 당뇨병성 신장병, 이상지질혈증, 심혈관 질환, 및 신경병증과 같은 대사성 질환, 장애, 및 병태. 화합물은 또한 진행성 간 질환 및 신경병증의 치료에 잠재적으로 유용할 수 있다.
정의
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 5개의 아미노산으로 구성된 화합물을 나타낸다. 아미노산은 자연발생적 아미노산일 수도 있고 비자연발생적 아미노산일 수도 있다. 일부 펩티드는 자연발생적 아미노산으로 모두 구성될 수 있다. 일부 펩티드는 비자연발생적 아미노산으로 모두 구성될 수 있다. 일부 펩티드는 자연발생적 아미노산 및 비자연발생적 아미노산의 혼합물로 구성될 수 있다.
용어 "자연발생적"은 자연에서 발견되며 인간이 조작하지 않는 물질을 나타낸다. 마찬가지로, 본원에서 사용되는 바와 같이, "비자연발생적", "비자연적" 등은 자연에서 발견되지 않거나 인간에 의해 구조적으로 변형 또는 합성된 물질을 나타낸다.
아미노산과 관련하여 사용될 때 용어 "자연발생적"은 일반적으로 다음과 같은 22개의 통상적인 아미노산을 나타낸다: 알라닌(A 또는 Ala), 시스테인(C 또는 Cys), 시스틴(CySS), 아스파르트산(D 또는 Asp), 글루탐산(E 또는 Glu), 페닐알라닌(F 또는 Phe), 글리신(G 또는 Gly), 히스티딘 (H 또는 His), 이소류신(I 또는 Ile), 리신(K 또는 Lys), 류신(L 또는 Leu), 메티오닌(M 또는 Met), 아스파라긴(N 또는 Asn), 프롤린(P 또는 Pro), 4-하이드록시프롤린(O 또는 Hyp), 글루타민(Q 또는 Gln), 아르기닌(R 또는 Arg), 세린(S 또는 Ser), 트레오닌(T 또는 Thr), 발린(V 또는 Val), 트립토판(W 또는 Trp), 및 티로신(Y 또는 Tyr).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비자연발생적 아미노산", "비천연 아미노산" 및 "비자연적 아미노산"은 동일하거나 상이한 임의의 유기체로부터 변형되지 않거나 변형된 유전자를 사용하여 임의의 유기체에서 생합성적으로 생성될 수 없는 아미노산 구조를 상호교환적으로 나타내기 위한 것이다. 여기에는 상기의 22개 자연발생적 아미노산 중 하나가 아닌 변형된 아미노산 및/또는 아미노산 유사체가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
비천연 아미노산의 예로는 γ-카복시글루타메이트, 오르니틴, 포스포세린, D-알라닌 및 D-글루타민과 같은 D-아미노산이 있다. 합성 비천연 아미노산은 화학적 합성에 의해 제조된 아미노산, 즉 D-알라닌 및 D-류신과 같은 아미노산의 D-이성질체, Aib(α-아미노이소부티르산), Abu(α-아미노부티르산), Tle (tert-부틸글리신), 3-아미노메틸 벤조산, 안트라닐산, 데스-아미노-히스티딘, β-알라닌 등과 같은 아미노산의 베타 유사체, 예를 들어, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, 베타-하이드록시-히스티딘, 호모히스티딘, Na-아세틸-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌, 또는 4-피리딜알라닌, (1-아미노시클로프로필) 카복실산, (1-아미노시클로부틸) 카복실산, (1-아미노시클로펜틸) 카복실산, (1-아미노시클로헥실) 카복실산, (1-아미노시클로헵틸) 카복실산, 또는 (1-아미노시클로옥틸) 카복실산을 포함한다.
광학 이성질체가 명시되지 않은 모든 아미노산은 L-이성질체를 나타내는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 펩티드의 "유사체(analogue 또는 analog)"라는 용어는 변형된 펩티드를 나타내며, 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기는 다른 아미노산 잔기로 1회 이상 치환되고/되거나 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩티드로부터 결실되고/되거나 하나 이상의 아미노산 잔기가 펩티드에 첨가된 것이다. 이러한 아미노산 잔기의 첨가 또는 결실은 펩티드 내 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 이러한 첨가 또는 결실은 펩티드의 N-말단 부분 및/또는 펩티드의 C-말단 부분에서 발생할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "GLP-1"은 GLP-1(7-37)(서열번호 1)을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "GLP-1 유사체"는 상기 정의한 바와 같은 GLP-1(7-37)의 유사체를 나타내며, 용어 "유사체"는 상기 정의한 바와 같다. 예를 들어, [Arg34]GLP-1(7-37)Lys는 GLP-1(7-37) 유사체를 나타내며, GLP-1(7-37)의 위치 34에 있는 자연발생적 리신은 아르기닌으로 치환되고, 리신은 말단 아미노산 잔기, 즉 GIy37에 첨가된 것이다.
추가 구현예
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 화학식 I의 화합물인 화학식 i의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 I]
[식에서,
R1 및 R2는 독립적으로 CH3, OH, CO2H, CH=CH2, 및 C≡CH로부터 선택되고;
n 및 m은 각각 5 내지 30에서 독립적으로 선택되는 정수이고;
L은 임의적 링커이고, P는 GLP-1 또는 GLP-1 유사체임].
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, GLP-1 또는 GLP-1 유사체(P)는 NH 기를 통해 임의의 링커(L)에 결합되는, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 다음으로부터 링커(L)가 선택되는, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
, 및
[식에서,
y는 1 내지 36에서 선택되는 정수이고;
l는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고;
k는 1, 2, 또는 3이고;
s는 0, 1, 2, 또는 3이고;
t는 0, 1, 2, 3, 또는 4이고;
p는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23이고;
**로 표시된 물결선은 화학식 I의 CO 기에 대한 부착을 나타내고,
***로 표시된 물결선은 P 기에 대한 부착을 나타냄].
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서,
y는 1 내지 36에서 선택되는 정수이고;
l는 2, 3, 4, 또는 5이고;
k는 1 또는 2이고;
s는 0, 1, 또는 2이고;
t는 0, 1, 2, 또는 3이고;
p는 1, 2, 3, 4, 7, 11, 또는 23인, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서,
y는 1 내지 36에서 선택되는 정수이고;
l는 2, 3, 4, 또는 5이고;
k는 1 또는 2이고;
s는 0, 1, 또는 2이고;
t는 0 또는 1이고;
p는 1, 2, 3, 4, 또는 11인, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 다음으로부터 링커(L)가 선택되는, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
,
, 및
[식에서,
y는 1 내지 36에서 선택되는 정수이고;
s는 1이고, k는 1이고;
**로 표시된 물결선은 화학식 I의 CO 기에 대한 부착을 나타내고,
***로 표시된 물결선은 P 기에 대한 부착을 나타냄].
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 다음으로부터 L이 선택되는, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
,
, 및
[식에서,
y는 1 내지 36에서 선택되는 정수이고,
s는 0, 1, 또는 2이고, k는 1, 2, 또는 3이고,
**로 표시된 물결선은 화학식 I의 CO 기에 대한 부착을 나타내고,
***로 표시된 물결선은 P 기에 대한 부착을 나타냄].
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 다음으로부터 링커(L)가 선택되는, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[식에서, y는 1 내지 36에서 선택되는 정수임].
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 상기 링커의 C(O) 기의 탄소 원자는 GLP-1 또는 GLP-1 유사체의 리신 잔기의 NH 기의 질소 원자에 부착되는, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, R1 및 R2는 CH3, OH, 및 CO2H로부터 독립적으로 선택되는, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 화학식 II의 화합물인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 II]
[식에서,
NH-P'는 NH-모이어티를 통해 링커 L에 부착된 P 기(즉, GLP-1 또는 GLP-1 유사체)를 나타내고;
R1 및 R2는 CH3, OH, 및 CO2H로부터 독립적으로 선택되고;
n 및 m은 각각 5 내지 30에서 독립적으로 선택되는 정수이고,
y는 1 내지 36에서 선택되는 정수임].
일 구현예에서, P 기(즉, GLP-1 또는 GLP-1 유사체)는 P’-NH2, 즉 아미노산 측쇄의 일부인 유리 -NH2 기를 갖는 P 기에 해당하고, P는 상기 -NH 기를 통해 링커 L에 부착된다.
다른 구현예는 상기 본원에 정의된 화학식 II의 화합물에 있어서, R1 및 R2는 CO2H 및 CH3으로부터 독립적으로 선택되는, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 상기 본원에 정의된 화학식 II의 화합물에 있어서, n 및 m은 각각 5 내지 20에서 독립적으로 선택되는 정수인, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 상기 본원에 정의된 화학식 II의 화합물에 있어서, n 및 m은 각각 10, 11, 13, 및 14에서 독립적으로 선택되는 정수인, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 상기 본원에 정의된 화학식 II의 화합물에 있어서,
R1은 CO2H이고 R2는 CH3이고; n은 10이고 m은 10이거나;
R1은 CO2H이고 R2는 CO2H이고; n은 10이고 m은 10이거나;
R1은 CO2H이고 R2는 CO2H이고; n은 10이고 m은 11이거나;
R1은 CO2H이고 R2는 CO2H이고; n은 10이고 m은 13이거나;
R1은 CO2H이고 R2는 CO2H이고; n은 10이고 m은 14인, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 II의 화합물에 있어서, 화학식 III의 화합물인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 III]
[식에서, R1은 CO2H이고 R2는 CH3임].
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 III의 화합물에 있어서, 화학식 IIIa의 화합물 또는 화학식 IIIb의 화합물인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 IIIa]
, 또는
[화학식 IIIb]
[식에서, R1은 CO2H이고 R2는 CH3임].
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 II의 화합물에 있어서, 화학식 IV의 화합물인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 IV]
(상기 화합물은 라세미체로 존재하거나 입체화학적으로 풍부한 혼합물로 존재하거나, *로 표시된 탄소 원자에 대해 입체화학적으로 순수함).
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 IV의 화합물에 있어서, 화학식 IVa의 화합물 또는 화학식 IVb의 화합물인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 IVa]
[화학식 IVb]
[식에서, y는 1 내지 36에서 선택되는 정수임].
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 IVa의 화합물 또는 화학식 IVb의 화합물에 있어서, y는 2 내지 24에서 선택되는 정수인, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 IVa의 화합물 또는 화학식 IVb의 화합물에 있어서, y는 2, 8, 및 24에서 선택되는 정수인, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 IVa의 화합물 또는 화학식 IVb의 화합물에 있어서, y는 2인, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 IVa의 화합물 또는 화학식 IVb의 화합물에 있어서, y는 8인, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 IVa의 화합물 또는 화학식 IVb의 화합물에 있어서, y는 24인, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 임의의 상기 정의된 구현예에 있어서, P는
GLP-1(7-37): His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly(서열번호 1), 및
서열 GLP-1(7-37)에 비해, 위치 7, 위치 8, 또는 위치 7 및 8에 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 GLP-1 유사체로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 임의의 상기 정의된 구현예에 있어서, P는
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Arg-Xaa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37(서열번호 2)(이하 P*)인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다
[식에서,
Xaa7은 His, 이미다조프로피오닐, α-하이드록시-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-하이드록시-히스티딘, 호모히스티딘, Nα-아세틸-히스티딘, Nα-포르밀-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌, 또는 4-피리딜알라닌이고;
Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Thr, Ser, Lys, Aib, (1-아미노시클로프로필) 카복실산, (1-아미노시클로부틸) 카복실산, (1-아미노시클로펜틸) 카복실산, (1-아미노시클로헥실) 카복실산, (1-아미노시클로헵틸) 카복실산, 또는 (1-아미노시클로옥틸) 카복실산이고;
Xaa16은 VaI 또는 Leu이고;
Xaa18은 Ser, Lys, 또는 Arg이고;
Xaa19는 Tyr 또는 GIn이고;
Xaa20은 Leu 또는 Met이고;
Xaa22는 GIy, Glu, 또는 Aib이고;
Xaa23은 GIn, Glu, Lys, 또는 Arg이고;
Xaa25는 Ala 또는 VaI이고;
Xaa27은 Glu 또는 Leu이고;
Xaa30은 Ala, Glu, 또는 Arg이고;
Xaa33은 VaI 또는 Lys이고;
Xaa34는 Lys, Glu, Asn, 또는 Arg이고;
Xaa35는 GIy 또는 Aib이고;
Xaa36은 Arg, GIy, 또는 Lys, 또는 부재이고;
Xaa37은 GIy, Ala, Glu, Pro, Lys, 또는 부재임].
다른 구현예는 전술한 구현예에 있어서,
P*에서:
Xaa7은 His 또는 데스아미노-히스티딘이고;
Xaa8은 Ala, GIy, VaI, Leu, Lys, 또는 Aib이고;
Xaa16은 VaI이고;
Xaa18은 Ser이고;
Xaa19는 Tyr이고;
Xaa20은 Leu이고;
Xaa22는 GIy, Glu, 또는 Aib이고;
Xaa23은 Gln 또는 Glu이고;
Xaa25는 Ala이고;
Xaa27은 Glu이고;
Xaa30은 Ala 또는 Glu이고;
Xaa33은 VaI이고;
Xaa34는 Lys 또는 Arg이고;
Xaa35는 GIy 또는 Aib이고;
Xaa36은 Arg 또는 Lys, 또는 부재이고;
Xaa37은 GIy 또는 부재인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 전술한 구현예에 있어서,
P*에서:
Xaa7은 His이고;
Xaa8은 GIy 또는 Aib이고;
Xaa16은 VaI이고;
Xaa18은 Ser이고;
Xaa19는 Tyr이고;
Xaa20은 Leu이고;
Xaa22는 Glu 또는 Aib이고;
Xaa23은 Gln 또는 Glu이고;
Xaa25는 Ala이고;
Xaa27은 Glu이고;
Xaa30은 Ala이고;
Xaa33은 VaI이고;
Xaa34는 Lys 또는 Arg이고;
Xaa35는 GIy 또는 Aib이고;
Xaa36은 Arg이고;
Xaa37은 GIy인, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 I의 화합물에 있어서, P는
[Aib8, Arg34]GLP-1(7-37): His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly(서열번호 3); 및
[Arg34]GLP-1(7-37): His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly(서열번호 4)로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 I의 화합물에 있어서, P는 [Aib8, Arg34]GLP-1(7-37)(서열번호 3) 또는 대안적으로
로 나타낸 바와 같고, 식에서 아미노산 구성원 Lys 상의 물결선은 링커에 대한 부착점을 나타내는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 I의 화합물에 있어서,
인(식에서, y는 1 내지 36에서 선택되는 정수이고, 상기 화합물은 입체화학적으로 풍부한 혼합물인 부분입체이성질체 혼합물로 존재하거나, *로 표시된 탄소 원자에 대해 입체화학적으로 순수함), 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 I의 화합물에 있어서, 화학식 X 또는 화학식 XI의 화합물인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 X]
[화학식 XI]
[식에서, y는 1 내지 36에서 선택되는 정수임].
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 X 또는 화학식 XI의 화합물에 있어서, y는 2 내지 24에서 선택되는 정수인, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 X 또는 화학식 XI의 화합물에 있어서, y는 2, 8, 및 24에서 선택되는 정수인, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 X 또는 화학식 XI의 화합물에 있어서, y는 2인, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 X 또는 화학식 XI의 화합물에 있어서, y는 8인, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 X 또는 화학식 XI의 화합물에 있어서, y는 24인, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 I의 화합물에 있어서,
[화합물 1]
,
[화합물 2]
,
[화합물 3]
,
[화합물 4]
,
[화합물 5]
,
[화합물 6]
,
[화합물 7]
,
[화합물 8]
, 및
[화합물 9]
로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 I의 화합물에 있어서,
[화합물 1]
인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 I의 화합물에 있어서,
[화합물 2]
인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화학식 I의 화합물에 있어서,
[화합물 3]
인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 본원에 정의된 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 화합물이 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9로부터 선택되는, 약학적 조성물을 제공한다,
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 화합물이 화합물 1, 2, 및 3으로부터 선택되는, 약학적 조성물을 제공한다,
다른 구현예는 본원에 정의된 치료 유효량의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 하나 이상의 치료활성제를 포함하는 조합을 제공한다.
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 화합물이 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9로부터 선택되는, 조합을 제공한다.
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 화합물이 화합물 1, 2, 및 3으로부터 선택되는, 조합을 제공한다.
다른 구현예는 의약으로서 사용하기 위한 본원에 정의된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 화합물이 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9로부터 선택되는, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 화합물이 화합물 1, 2, 및 3으로부터 선택되는, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 비만, 제2형 진성 당뇨병, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 만성 신장 질환 및 당뇨병성 신장병으로부터 선택되는 하나 이상의 당뇨병 합병증, 이상지질혈증, 대사 증후군, NAFLD 및 NASH로부터 선택되는 진행성 간 질환, 심혈관 질환, 및 당뇨병과 관련된 말초 신경병증으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 본원에 정의된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 비제한적 예로서, 신경병증은 말초 신경병증(예를 들어 당뇨병과 관련될 수 있음)이다.
다른 구현예는 고혈압, 죽상경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심근병증, 심방세동, 심부전(예를 들어, 박출률 감소 심부전(HFrEF), 중간 범위 박출률 심부전(HFmrEF), 및 박출률 보존 심부전(HFpEF), 관상동맥 심장 질환, 및 부정맥(예를 들어, 심방 부정맥 및 심실 부정맥)으로부터 선택되는 심혈관 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 본원에 정의된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 이전 2개의 구현예에 있어서, 화합물이 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9로부터 선택되는, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 화합물이 화합물 1, 2, 및 3으로부터 선택되는, 화합물을 제공한다.
다른 구현예는 글루카곤 유사 펩티드 1 수용체(GLP1R)의 작용제에 민감한 치료법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법으로서, 본원에 정의된 바와 같은 치료 유효량의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 화합물이 화합물 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9로부터 선택되는, 치료 방법을 제공한다.
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 화합물이 화합물 1, 2, 및 3으로부터 선택되는, 치료 방법을 제공한다.
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 환자에게 비만, 제2형 진성 당뇨병, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 하나 이상의 당뇨병 합병증(만성 신장 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않음), 당뇨병성 신장병, 이상지질혈증, 대사 증후군, 진행성 간 질환, 심혈관 질환, 및 신경병증으로부터 선택되는 질환 또는 장애가 있는, 치료 방법을 제공한다. 비제한적 예로서, 신경병증은 말초 신경병증(예를 들어 당뇨병과 관련될 수 있음)이다.
다른 구현예는 이전 구현예에 있어서, 환자에게 고혈압, 죽상경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심근병증, 심방세동, 심부전(예를 들어, 박출률 감소 심부전(HFrEF), 중간 범위 박출률 심부전(HFmrEF), 및 박출률 보존 심부전(HFpEF), 관상동맥 심장 질환, 및 부정맥(예를 들어, 심방 부정맥 및 심실 부정맥)으로부터 선택되는 심혈관 질환 또는 장애가 있는, 치료 방법을 제공한다.
추가 양태
출발 물질 및 절차의 선택에 따라, 화합물은 비대칭 탄소 원자의 개수에 따라 가능한 입체이성질체 중 하나의 형태로 또는 이의 혼합물로서, 예를 들어 순수한 광학 이성질체로서, 또는 라세미체 및 부분입체이성질체 혼합물과 같은 입체이성질체 혼합물로서 존재할 수 있다. 본원에 기술된 화합물은 한정되지 않으며, 화합물은 라세미 혼합물, 부분입체이성질체 혼합물, 및 광학적으로 순수한 형태를 포함하여 이러한 가능한 입체이성질체 모두를 포함한다. 광학 활성 (R)- 및 (S)- 입체이성질체는 키랄 신톤 또는 키랄 시약을 사용하여 제조되거나, 통상적인 기술을 사용하여 분해될 수 있다. 화합물이 이중결합을 포함하는 경우, 치환기는 E 또는 Z 배열일 수 있다. 화합물이 이치환 시클로알킬을 포함하는 경우, 시클로알킬 치환기는 시스- 또는 트랜스-배열을 가질 수 있다. 모든 호변이성질체 형태도 포함되는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 "염"은 본 개시내용의 화합물의 산 부가염 또는 염기 부가염을 지칭한다. "염"은 특히 "약학적으로 허용가능한 염"을 포함한다. 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 본 개시내용의 화합물의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고 일반적으로는 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 염을 지칭한다. 다수의 경우에, 본 개시내용의 화합물은 예를 들어 아미노 및 피리딘 기 또는 이와 유사한 다른 기에서 발견되는 바와 같은 염기성 질소 원자 및/또는 예를 들어 카복실산 또는 5-옥소-4,5-디하이드로-1,2,4-옥사디아졸 기, 또는 이와 유사한 다른 기에서 발견되는 바와 같은 산성 양성자의 존재로 인해 산 및/또는 염기 염을 형성할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 산 부가염은 무기산 및 유기산으로 형성될 수 있다. 염이 유도될 수 있는 무기산은 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등을 포함한다. 염이 유도될 수 있는 유기산은 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 옥살산, 말레산, 말론산, 석신산, 푸마르산, 타타르산, 시트르산, 벤조산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 톨루엔설폰산, 설포살리실산 등을 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 염기 부가염은 무기 염기 및 유기 염기로 형성될 수 있다. 염이 유도될 수 있는 무기 염기는 예를 들어 암모늄염 및 주기율표의 I 내지 XII열의 금속을 포함한다. 특정 구현예에서, 염은 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 은, 아연, 및 구리로부터 유도되고; 특히 적합한 염은 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘, 및 마그네슘 염을 포함한다. 염이 유도될 수 있는 유기 염기는 예를 들어 1차, 2차, 및 3차 아민, 천연 발생 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 환형 아민, 염기성 이온 교환 수지 등을 포함한다. 특정 유기 아민은 이소프로필아민, 벤자틴, 콜리네이트, 디에탄올아민, 디에틸아민, 리신, 메글루민, 피페라진, 및 트로메타민을 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용의 화합물은 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 은, 아연, 구리, 이소프로필아민, 벤자틴, 콜리네이트, 디에탄올아민, 디에틸아민, 리신, 메글루민, 피페라진, 또는 트로메타민 염 형태로 제공된다.
다른 양태에서, 본 개시내용의 화합물은 아세테이트, 아스코르베이트, 아디페이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 베실레이트, 브로마이드/하이드로브로마이드, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 캄포설포네이트, 카프레이트, 클로라이드/하이드로클로라이드, 클로르테오필로네이트, 시트레이트, 에탄디설포네이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 글루타메이트, 글루타레이트, 글리콜레이트, 히푸레이트, 하이드로요오다이드/요오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 락토바이오네이트, 라우릴설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 만델레이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 뮤케이트, 나프토에이트, 나프실레이트, 니코티네이트, 니트레이트, 옥타데카노에이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/하이드로젠 포스페이트/디하이드로젠 포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 프로피오네이트, 세바케이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설포살리실레이트, 설페이트, 타르트레이트, 토실레이트 트리페나테이트, 트리플루오로아세테이트, 또는 시나포에이트 염 형태로 제공된다.
본원에 제공된 모든 화학식은 또한 화합물의 비표지 형태뿐만 아니라 동위원소 표지된 형태를 나타내는 것이다. 동위원소 표지 화합물은 하나 이상의 원자가 선택된 원자 질량 또는 질량수를 갖는 원자로 대체된 것을 제외하고, 본원에 제공된 화학식으로 표시된 구조를 갖는다. 본원에 기재된 화합물에 혼입될 수 있는 동위원소는 예를 들어 수소의 동위원소를 포함한다.
또한, 특정 동위원소, 특히 중수소(즉, 2H 또는 D)의 혼입은 더 큰 대사 안정성으로 인한 특정 치료적 이점, 예를 들어 생체내 반감기의 증가, 또는 투약 요건의 감소, 또는 치료지수 또는 내약성의 개선을 제공할 수 있다. 이러한 맥락에서 중수소는 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 치환기로서 간주되는 것으로 이해된다. 중수소의 농도는 동위원소 농축 계수에 의해 정의될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "동위원소 농축 계수"는 특정 동위원소의 동위원소 존재비와 자연 존재비의 비를 의미한다. 본원에 기재된 화합물에서의 치환기가 중수소인 것으로 표시되는 경우, 이러한 화합물은 각각의 지정된 중수소 원자에 대해 적어도 3500(각각의 지정된 중수소 원자에서 52.5%의 중수소 혼입), 적어도 4000(60%의 중수소 혼입), 적어도 4500(67.5%의 중수소 혼입), 적어도 5000(75%의 중수소 혼입), 적어도 5500(82.5%의 중수소 혼입), 적어도 6000(90%의 중수소 혼입), 적어도 6333.3(95%의 중수소 혼입), 적어도 6466.7(97%의 중수소 혼입), 적어도 6600(99%의 중수소 혼입), 또는 적어도 6633.3(99.5%의 중수소 혼입)의 동위원소 농축 계수를 갖는다. 용어 "동위원소 농축 계수"는 중수소에 대해 설명된 것과 동일한 방식으로 임의의 동위원소에 적용될 수 있음을 이해해야 한다.
본원에 기재된 화합물에 혼입될 수 있는 동위원소의 다른 예는 수소, 탄소, 질소, 산소, 불소, 및 황의 동위원소, 예컨대 각각 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 35S를 포함한다. 따라서, 예를 들어 3H 및 14C와 같은 방사성 동위원소를 포함하여 상기 임의의 동위원소 중 하나 이상을 포함하는 본원에 기재된 임의의 화합물, 또는 2H 및 13C와 같은 비방사성 동위원소가 존재하는 것들을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 이러한 동위원소 표지 화합물은 대사 연구(14C 사용), 반응 동역학 연구(예를 들어, 2H 또는 3H 사용), 약물 또는 기질 조직 분포 분석을 포함하여 양전자 방출 단층촬영(PET) 또는 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT)과 같은 검출 또는 이미징 기법, 또는 환자의 방사선 치료에 유용하다. 특히, 18F 또는 표지된 화합물은 PET 또는 SPECT 연구에 특히 바람직할 수 있다. 본원에 개시된 동위원소 표지 화합물은 일반적으로, 당업자에게 알려진 통상적인 기술에 의해, 또는 이전에 사용된 비표지 시약 대신 적절한 동위원소 표지 시약을 사용하여 첨부 실시예 및 제조예에 기재된 것과 유사한 공정에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적 조성물"은 경구 또는 비경구 투여에 적합한 형태인, 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께, 본원에 기재된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 약학적 조성물의 제조 또는 사용에 유용한 물질을 지칭하며, 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 예를 들어 적합한 희석제, 용매, 분산 매질, 계면활성제, 항산화제, 보존제, 등장화제, 완충제, 유화제, 흡수 지연제, 염, 약물 안정제, 결합제, 부형제, 붕해제, 활택제, 습윤제, 감미제, 착향제, 염료, 및 이들의 조합을 포함한다(예를 들어, 문헌[Remington The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed. Pharmaceutical Press, 2013, pp. 1049-1070] 참조).
본원에 기재된 화합물의 "치료 유효량"이라는 용어는 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도할 화합물의 양을 나타낸다. 비제한적 예로서, 본원에 기재된 이러한 치료 유효량의 화합물은 예를 들어 GLP1R 활성을 작용시키거나, 하나 이상의 증상을 개선하거나, 하나 이상의 병태를 완화하거나, 질환, 장애, 또는 병태의 진행을 늦추거나 지연시키거나, 질환, 장애, 또는 병태를 예방한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료 유효량"은 대상체에게 투여될 때 GLP1R의 활성을 증가시키거나 작용시키는 데 반응하는 병태, 장애, 또는 질환을 적어도 부분적으로 완화, 예방, 및/또는 개선시키는, 본원에 기술된 화합물의 양을 나타낸다. 다른 구현예에서, 용어 "치료 유효량"은 대상체에게 세포, 또는 조직, 또는 생물학적 비세포 물질, 또는 배지에 투여될 때, GLP1R의 활성을 적어도 부분적으로 증가시키거나 작용시키거나; 또는 GLP1R의 발현을 적어도 부분적으로 증가시키거나 작용시키는, 본원에 기재된 화합물의 양을 지칭한다. 다른 구현예에서, 용어 "치료 유효량"은 대상체에게 투여될 때 관찰가능한 수준의 하나 이상의 목적하는 생물학적 또는 의학적 반응(예를 들어, 혈당 수치 저하(예컨대 혈당 수치 저하), 인슐린 감수성 증가, 포도당 항상성 개선, 중성지방 또는 콜레스테롤 수치 저하, 체중 감소, 음식 섭취 감소 및 체지방량(예컨대 말초 지방 및/또는 내장 지방) 감소로부터 선택됨)을 일으키는, 본원에 기재된 화합물의 양을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 상호교환가능하며, 영장류(예를 들어, 인간, 남성 또는 여성; 또는 비인간 영장류), 개, 토끼, 기니피그, 돼지, 래트, 및 마우스를 지칭한다. 특정 구현예에서, 대상체는 영장류이다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 용어 "작용시키다", "효능작용" 및 "작용시키는"은 예를 들어 세포내 환형 아데노신 모노포스페이트(cAMP)의 증가에 의해 측정되는 GLP1R 신호전달의 증가를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 질환, 장애, 또는 병태를 "치료하다", "치료하는", 또는 "치료"라는 용어는 질환, 장애, 또는 병태의 완화 또는 개선(즉, 질환, 장애, 또는 병태, 또는 이의 임상 증상 중 적어도 하나의 발생이나 진행을 지연 또는 저지); 또는 질환, 장애, 또는 병태와 관련된 적어도 하나의 신체적 파라미터 또는 바이오마커(환자가 인식할 수 없는 것들을 포함함)의 완화 또는 개선을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 질환, 장애, 또는 병태를 "예방하다", "예방하는", 또는 "예방"이라는 용어는 질환, 장애, 또는 병태의 예방적 처치; 또는 질환, 장애, 또는 병태의 발생 또는 진행의 지연을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체가 생물학적으로, 의학적으로 또는 삶의 질에 있어서 이러한 치료에서 이익을 얻는 경우 이러한 대상체는 치료를 "필요로 한다".
본원에서 사용되는 바와 같이, (특히 청구범위의 맥락에서) 사용되는 단수형 용어("a", "an", "the") 및 유사한 용어는 본원에서 달리 지시되거나 맥락에서 명백히 부정하지 않는 한 단수 및 복수 둘 다를 포함하도록 해석될 것이다.
본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 모든 예, 또는 예시적인 용어(예를 들어, "~와 같은")의 사용은 단지 본원에 제공된 조성물 및 방법 또는 용도를 더 잘 설명하고자 하는 것으로, 청구된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
본원에 기재된 화합물(들)의 임의의 비대칭 원자(예를 들어, 탄소 등)는 라세미 또는 거울상 이성질체 풍부 상태로, 예를 들어 (R)-, (S)-, 또는 (R,S)-배열로 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 비대칭 원자는 (R)- 또는 (S)-배열에서 적어도 50%의 거울상이성질체 과잉률, 적어도 60%의 거울상이성질체 과잉률, 적어도 70%의 거울상이성질체 과잉률, 적어도 80%의 거울상이성질체 과잉률, 적어도 90%의 거울상이성질체 과잉률, 적어도 95%의 거울상이성질체 과잉률, 또는 적어도 99%의 거울상이성질체 과잉률을 갖는다.
따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에 기재된 화합물은 가능한 입체이성질체, 회전이성질체, 회전장애이성질체, 호변이성질체, 또는 이의 혼합물 중 하나의 형태로, 예를 들어, 실질적으로 순수한 부분입체이성질체, 광학이성질체(거울상체), 라세미체 또는 이의 혼합물로서 존재할 수 있다.
입체이성질체의 임의의 생성된 혼합물은 구성성분의 물리화학적 차이를 기반으로, 예를 들어 크로마토그래피 및/또는 분별 결정화에 의해, 순수하거나 실질적으로 순수한 기하 또는 광학 이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체로 분리될 수 있다.
본원에 기재된 화합물 또는 중간체의 임의의 생성된 라세미체는 공지된 방법에 의해, 예를 들어 광학 활성 산 또는 염기로 얻은 부분입체이성질체 염을 분리하고, 광학적 활성의 산성 또는 염기성 화합물을 유리시킴으로써 광학적 거울상체로 분해될 수 있다. 따라서, 특히 염기성 모이어티가, 예를 들어 광학 활성 산, 예를 들어 타타르산, 디벤조일 타타르산, 디아세틸 타타르산, 디-O,O'-p-톨루오일 타타르산, 만델산, 말산, 또는 캠퍼-10-설폰산으로 형성된 염의 분별 결정화에 의해 본원에 기재된 화합물을 광학적 거울상체로 분해하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 라세미 화합물 또는 라세미 중간체는 또한 키랄 크로마토그래피, 예를 들어 키랄 흡착제를 사용하는 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분해될 수 있다.
본 출원의 화합물은, 본원의 교시에 비추어 숙련된 화학자에게 명백하거나, 또는 당업자에게 공지된 표준 합성 방법 및 절차를 사용하여, 용이하게 제조된 중간체로부터, 또는 문헌에 공지된 화합물, 구매가능한 출발 물질을 사용하여 유기 합성 분야의 당업자에 의해 제조될 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 하기 합성 반응식에 의해 부분적으로 기재된 바와 같이 유기 합성 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 하기 반응식에서, 화학의 일반 원리에 따라 필요한 경우 민감성 또는 반응성 기에 대한 보호기가 사용된다는 것은 잘 이해된다. 보호기는 예를 들어 문헌[Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999 or Protecting Groups, 3rd edition, Thieme, Stuttgart, 2004]에 기술된 바와 같이 유기 합성의 표준 방법에 따라 처리된다 보호기는 당업자가 쉽게 알 수 있는 방법을 사용하여 화합물 합성 중 편리한 단계에서 제거된다.
당업자는 본원에 기재된 화합물에 입체 중심이 존재하는지를 인식할 것이다. 최종 생성물, 중간체, 또는 출발 물질의 분해는 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 문헌[Stereochemistry of Organic Compounds" by E. L. Eliel, S. H. Wilen, and L. N. Mander (Wiley-lnterscience, 1994)] 참조.
본원에 기재된 화합물은 상업적으로 입수 가능한 출발 물질로 제조되거나, 공지된 유기, 무기, 및/또는 효소 공정을 사용하여 합성될 수 있다.
화합물의 제조
본원에 기재된 화합물은 유기 합성 분야의 당업자에게 잘 알려진 다수의 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 합성 유기 화학 분야에 공지된 합성 방법, 또는 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 이에 대한 변형된 방법과 함께, 하기 방법을 사용하여 합성될 수 있다.
일반 합성 절차
본원에 기재된 화합물은 실험 부분(화학 부분)에 상세히 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어:
일반 반응식 I: 지방산 모이어티인 화학식 i의 화합물의 합성:
화학식 i의 화합물을 제조하는 일반적인 방법은 일반 반응식 I에 요약되어 있다.
[반응식 I]
말론산 유도체 60은 염기(예를 들어 수소화나트륨, 탄산칼륨 또는 탄산세슘, 수산화나트륨, 리튬 디이소프로필 아미드, 나트륨 비스(트리메틸실릴)아미드 등)의 존재 하 및 DMF, THF, 또는 디메틸 아세트아미드와 같은 용매의 존재 또는 부재 하에, 실온에 가까운 또는 그 이상 또는 이하에서, R1-(CH2)m-X와 반응하여, 알킬화된 중간체 61을 생성하고, 이어서 이를 염기의 존재 하에 R2-(CH2)n-X와 반응시켜 디-알킬화 중간체 62를 제공할 수 있다. 변수 R1, R2, n 및 m은 본원에 정의된 바와 같은 의미를 갖고, X는 할로겐(예를 들어, Br, Cl, I), 트리플루오로메탄설포닐옥시 등으로부터 선택되는 이탈기이고, P1 및 P2는 예를 들어 메틸, 에틸, tert-부틸, 메톡시벤질, 벤질, 트리메틸실릴, t-부틸디메틸실릴, 또는 2-알킬 1,3 옥사졸린과 같은 카복실산 보호기이다.
보호기 P1 및 P2에 따라, 중간체 62는 이어서 염기(예를 들어, NaOH, KOH, 또는 LiOH) 또는 TFA, HCl, 또는 BCl3 중에서 선택되지만 이에 한정되지 않는 산과 함께 반응하거나, 보호기 P1 및 P2가 벤질 또는 메톡시벤질인 경우 중간체 62는 일반적으로 탄소상 팔라듐과 같으나 이에 한정되지 않는 촉매의 존재 하에 수소와 반응하여 화학식 i의 화합물에 해당하는 화합물 65를 제공한다(즉, P1이 수소인 경우).
대안적으로, 중간체 61은 NaH, 탄산칼륨 또는 탄산세슘, 수산화나트륨, 리튬 디이소프로필 아미드 등과 같은 염기의 존재 하 및 DMF, THF, 또는 디메틸 아세트아미드와 같은 용매의 존재 또는 부재 하에, CH2=CH-(CH2)j-X(j는 1~10이고 X는 본원에 정의된 바와 같음), 예를 들어 알릴 브로마이드와 반응하여, 크로마토그래피에 의해 R 또는 S 거울상이성질체로 분리될 수 있는 불포화 디-알킬화 중간체 63을 생성할 수 있다. 이어서 중간체 63은 과량, 예를 들어 2 당량의 알킬화제 R2-(CH2)n’-CH=CH2(n'은 5~27임) 존재 하 및 DCM 또는 THF와 같은 용매의 존재 하에 올레핀 복분해 촉매, 예를 들어, Grubbs II와 반응하여, 촉매(예를 들어 Pd/C)의 존재 하 및 용매(예를 들어 THF, 메탄올 등)의 존재 하에 수소와 반응할 수 있는 중간체 64를 생성하고, 이어서 임의로, 예를 들어 P2가 벤질 기가 아닌 경우, 예를 들어 NaOH, KOH, 또는 LiOH, 메탄올, 에탄올, 또는 디옥산, 또는 TFA, HCl, 또는 BCl3 중에서 선택되지만 이에 한정되지 않는 산과 함께, 중간체 62의 중간체 65로의 반응에 일반적으로 개시된 바와 같은 탈보호 반응이 뒤따른다. 반응식 II에 나타낸 바와 같이 링커가 지방산에 부착된 후 측쇄의 이중 결합도 수소화될 수 있다. CH=CH 기와 함께 매개변수 j 및 n'은 중간체 65에서 n에 의해 결정되는 사슬 길이, 즉 (CH2)n을 제공하기 위해 선택된다.
일반 반응식 II: 링커(L)를 포함하는 지방산 모이어티의 합성:
중간체 65를 사용하여 중간체 66을 제조하는 일반적인 방법은 일반 반응식 II에 요약되어 있다. 지방산 유도체 65는 커플링 시약(예를 들어 카보닐디이미다졸(DCC)의 존재 하, 염기(예를 들어 N,N-디이소프로필 에틸아민 또는 K2CO3)의 존재 하, 및 용매(예를 들어 DMF)의 존재 또는 부재 하에, 일반적으로 화학식 H2N-L-COOP3(P3은 수소 또는 카복실산 보호기(예를 들어 메틸, 에틸, tert-부틸, 메톡시벤질, 벤질, 트리메틸실릴, t-부틸디메틸실릴, 또는 2-알킬 1,3 옥사졸린)이고, L은 본원에 기재된 바와 같은 링커이다(단, 화학식 H2N-L-COOP3의 아미노산 유도체의 링커 L은 말단 기, 즉 NH2 및 COOP3과 함께 표시됨)의 아미노산 유도체와 반응하여 유도체화된 지방산 유도체 66을 수득할 수 있다.
표준 펩티드 커플링 반응은 예를 들어 카복실산 기를 이의 활성화된 형태, 예를 들어, 상응하는 피롤리딘-2,5-디온 기(예를 들어 표준 N-하이드로석신이미드 화학을 사용하거나 탄산 기를 트리포스겐, 카보닐디이미다졸, 4-니트로페닐 클로로포르메이트, 또는 디석신이미딜 카보네이트와 같은 시약과 반응시킴), 상응하는 할로겐화 탄산(염화티오닐 또는 염화옥살릴과 같은 시약을 사용하거나, ClC(O)O-이소부틸, 2,4,6-트리클로로벤조일 클로라이드, 또는 프로필 포스폰산 무수물 환형 삼량체(T3P)와 같은 시약을 사용하여 탄산 기를 상응하는 혼합 무수물로 전환함)으로 전환하고 이어서 3차 아민(예를 들어 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필 에틸아민) 또는 무기 염기(예를 들어 K2CO3)와 같은 염기의 존재 또는 부재 하에 옥사졸리딘-2,5-디온, 산 할로겐화물, 또는 혼합 무수물의 반응이 이어지는 것을 포함한다. 대안적으로, 펩티드 커플링 반응 시약은 1-하이드록시벤조트리아졸, 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸, 또는 디메틸아미노피리딘과 같은 시약의 존재 또는 부재 하에 디시클로헥실카보디이미드(DCC), 디이소프로필카보디이미드(DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC HCl), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP), 또는 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP)를 포함한다.
일반 반응식 III: 화학식 I의 화합물의 합성:
중간체 66를 사용하여 화학식 I의 화합물을 제조하는 일반적인 방법은 일반 반응식 III에 요약되어 있다. P3가 보호기(예를 들어 수소가 아님)인 경우, 화학식 66의 지방산 유도체는 예를 들어 용매, 예를 들어 메탄올의 존재 또는 부재 하에 산, 예를 들어 HCl 또는 p-톨루엔설폰산을 사용하여 카복실산으로 전환되고, 이어서 용매(예를 들어 DCM 또는 THF)의 존재 또는 부재 하에, 예를 들어 DCC 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)를 사용하여, 활성화된 탄산 에스테르, 예를 들어 NHS-에스테르로 전환되고, 이 후 이는 예를 들어 피페리딘 및 용매(예를 들어 DMF 또는 DMA)의 존재 하에, 유리 NH2 기를 갖는 GLP-1 또는 GLP-1 유사체 P*(변수 P* 및 P는 본원에 정의된 바와 같은 의미를 갖음(일반 반응식 III에 도시된 바와 같음))와 반응한다.
상기 절차로부터 생성된 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 및 시스/트랜스 이성질체의 혼합물은 분리의 속성에 따라, 키랄염 기술, 순상, 역상, 또는 키랄 컬럼을 이용한 크로마토그래피에 의해 단일 성분들로 분리될 수 있다.
본 발명 화합물 또는 중간체의 임의의 생성된 라세미체는 공지된 방법에 의해, 예를 들어 광학 활성 산 또는 염기로 얻은 부분입체이성질체 염을 분리하고, 광학적 활성의 산성 또는 염기성 화합물을 유리시킴으로써 광학적 거울상체로 분해될 수 있다. 따라서, 특히 염기성 모이어티가, 예를 들어 광학 활성 산, 예를 들어 타타르산, 디벤조일 타타르산, 디아세틸 타타르산, 디-O,O'-p-톨루오일 타타르산, 만델산, 말산, 또는 캠퍼-10-설폰산으로 형성된 염의 분별 결정화에 의해 본 발명의 화합물을 광학적 거울상체로 분해하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 라세미 화합물 또는 라세미 중간체는 또한 키랄 크로마토그래피, 예를 들어 키랄 흡착제를 사용하는 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분해될 수 있다.
약학적 조성물
본원에 기재된 약학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 추가 구현예에서, 본 조성물은 본원에 기술된 것과 같은 적어도 2가지의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 약학적 조성물은 경구 투여, 비경구 투여(예를 들어, 주사, 주입, 경피, 또는 국소 투여), 및 직장 투여와 같은 특정 투여 경로용으로 제형화될 수 있다. 국소 투여는 또한 흡입 또는 비강내 적용과 관련될 수 있다. 본원에 기재된 약학적 조성물은 고체 형태(캡슐, 정제, 환제, 과립제, 산제, 또는 좌제를 제한 없이 포함함), 또는 액체 형태(용액, 현탁액, 또는 에멀젼을 제한 없이 포함함)로 제조될 수 있다. 정제는 당업계에 알려진 방법에 따라 필름 코팅되거나 장용 코팅될 수 있다. 일반적으로, 약학적 조성물은 다음 중 하나 이상과 함께 활성 성분을 포함하는 정제 또는 젤라틴 캡슐이다:
a) 희석제, 예를 들어 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스, 및/또는 글리신;
b) 활택제, 예를 들어 실리카, 활석, 스테아르산, 이의 마그네슘 또는 칼슘 염, 및/또는 폴리에틸렌글리콜; 정제의 경우도 마찬가지
c) 결합제, 예를 들어 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트래거캔스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈; 요망되는 경우
d) 붕해제, 예를 들어 전분, 한천, 알긴산 또는 이의 나트륨 염, 또는 발포성 혼합물; 및
e) 흡수제, 착색제, 착향제, 및 감미제.
주사용으로 적합한 약학적 조성물은 일반적으로 멸균 수용액(수용성) 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다.
정맥내 투여를 위해, 적합한 담체에는 생리 식염수, 정균수, Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고, 주사가 용이할 정도로 유동적이어야 한다. 바람직한 약학적 제형은 제조 및 보관의 조건에서 안정적이어야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다. 일반적으로, 적절한 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 아미노산, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 장기간의 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함함으로써 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 알부민과 같은 다기능 부형제는 분해 또는 응집으로부터 본 화합물의 안정화를 촉진하고, 용해도를 개선하고, 활성 성분의 투여 및 방출을 돕기 위해 제형화 공정에 포함될 수 있다. 문헌[(BioPharm International, 2012, Vol 23, Issue 3, pp 40-44)].
특정한 주사용 조성물은 수성 등장성 용액 또는 현탁액이고, 좌제는 유리하게는 지방 유화액 또는 현탁액으로부터 제조된다. 상기 조성물은 멸균될 수 있고/있거나 보조제, 예를 들어 보존제, 안정제, 습윤제 또는 유화제, 용해 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 또한, 이들은 다른 치료적으로 중요한 물질을 함유할 수도 있다. 상기 조성물은 각각 통상적인 혼합, 과립화, 또는 코팅 방법에 따라 제조되며, 0.1 내지 75%의 유효 성분을 함유하거나 1 내지 50%의 활성 성분을 함유한다.
필요에 따라 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 조합과 함께, 요구되는 양의 활성 화합물을 적절한 용매 중에 혼입한 후, 여과 살균함으로써 살균 주사용 용액이 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 위에 열거된 것들 중 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼합하여 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 필요한 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
유리 형태 또는 약학적으로 허용가능한 염 형태의 본원에 기재된 화합물은, 예를 들어 본원에 제공되는 시험관내 및 생체내 시험에서 나타내는 바와 같이, 예를 들어 GLP1R의 작용제로서 가치 있는 약리학적 특성을 나타내고, 따라서, 치료용 또는 연구 화학물질로서, 예를 들어, 도구 화합물로서의 용도를 보여준다.
유틸리티 목록
본원에 기재된 화합물은 예를 들어 다음으로부터 선택되는 대사 및 관련 질환, 장애, 및 병태의 치료에 유용할 수 있다:
비만, 제2형 진성 당뇨병, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 하나 이상의 당뇨병 합병증(만성 신장 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않음), 당뇨병성 신장병, 이상지질혈증, 대사 증후군, 진행성 간질환, 심혈관 질환, 및 신경병증 비제한적 예로서, 신경병증은 말초 신경병증(예를 들어 당뇨병과 관련될 수 있음)이다.
진행성 간 질환은 예를 들어 비알코올성 지방간 질환(FLD 또는 NAFLD), 예를 들어 비알코올성 지방간염(NASH)일 수 있다.
심혈관 질환은 다음 중에서 선택될 수 있다: 고혈압, 죽상경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심근병증, 심방세동, 심부전(예를 들어 박출률 감소 심부전(HFrEF), 중간 범위 박출률 심부전(HFmrEF), 및 박출률 보존 심부전(HFpEF)), 관상동맥 심장 질환, 및 부정맥(심방 부정맥 및 심실 부정맥).
본 발명의 화합물은 대상체에서 동시에 발생하는 여러 질환, 장애, 또는 병태('동반질환'으로 지칭됨)의 치료에 유용할 수 있다. 예를 들어, 동반질환은 제2형 당뇨병이 있고 추가로 비만 및/또는 추가로 심부전 및/또는 NASH를 보이는 대상체의 질환일 수 있다. 예를 들어 비만 대상체는 제2형 당뇨병을 나타낼 수도 있고/있거나 심혈관 질환(예를 들어 심부전)을 나타낼 수도 있다. 이러한 대상체는 또한 진행성 간 질환(예를 들어 NASH)을 나타낼 수도 있다. 예를 들어, 비만 대상체는 또한 제2형 당뇨병을 나타낼 수 있고/있거나 심혈관 질환(예를 들어 심부전)을 나타낼 수 있고/있거나 진행성 간 질환(예를 들어 NASH)을 나타낼 수 있다. 대상체는 고혈압 및/또는 높은 혈중콜레스테롤 수치를 보일 수 있다. 대상체는 또한 말초 신경병증이 있을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 상기 유틸리티 부문에 개시된 표시는 이하에서 "앞서 언급된 목록"으로 지칭될 수 있다.
일 구현예에서, 질환, 장애, 또는 병태는 비만, 제2형 당뇨병, 죽상경화증, 심부전(특히 박출률 보존 심부전) 및 NASH로부터 선택된다.
일 구현예에서, 질환, 장애, 또는 병태는 비만, 제2형 당뇨병, 죽상경화증, 및 심부전(특히 박출률 보존 심부전)으로부터 선택된다.
본 개시내용의 다른 양태는 GLP1R의 조절과 관련된 환자의 질환 또는 장애를 치료, 예방, 억제, 또는 제거하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 본원에 기술된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 GLP1R의 조절과 관련된 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
따라서, 추가 양태로서, 본원에 기재된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 치료상 용도가 본원에 제공된다. 추가 구현예에서, 치료법은 GLP1R의 효능작용에 의해 치료될 수 있는 질환, 장애, 또는 병태의 치료이다. 다른 구현예에서, 치료법은 임의의 앞서 언급된 목록으로부터 선택된 질환, 장애, 또는 병태의 치료이다.
따라서, 추가 양태로서, 치료적 용도를 위한, 본원에 기재된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 본원에 제공된다. 추가 구현예에서, 치료법은 GLP1R의 효능작용에 의해 치료될 수 있는 질환, 장애, 또는 병태의 치료이다. 다른 구현예에서, 치료법은 임의의 앞서 언급된 목록으로부터 선택된 질환, 장애, 또는 병태의 치료이다.
다른 양태에서, 치료 유효량의 본원에 기재된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는, GLP1R의 효능작용에 의해 치료될 수 있는 환자의 질환, 장애, 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
다른 구현예에서, 질환, 장애, 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법이 제공되고, 이 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 화합물을 투여하는 단계를 포함하며, 이 경우 질환, 장애, 또는 병태는 임의의 앞서 언급된 목록에서 선택된다.
추가 양태에서, 의약의 제조를 위한, 본원에 기재된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도가 본원에 제공된다. 추가 구현예에서, 의약은 CFTR의 효능작용에 의해 치료될 수 있는 질환의 치료를 위한 것이다. 다른 구현예에서, 질환은 앞서 언급된 목록으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 임의의 앞서 언급된 목록으로부터 선택된 질환, 장애, 또는 병태를 치료하기 위한, 본원에 기재된 임의의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
"대사 장애" 또는 "대사 질환"이라는 용어는 비만, 포도당 불내성, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 과도한 내장 지방증, 고혈압, 높은 중성지방을 특징으로 하는 이상지질혈증, 낮은 고밀도 지질단백질(HDL)-콜레스테롤, 및 높은 저밀도 지질단백질(LDL) 콜레스테롤을 포함하지만 이에 한정되지 않는 관련 특성의 집합을 나타낸다. 대사 질환 또는 장애가 있는 대상체는 제2형 진성 당뇨병 및 예를 들어 죽상동맥경화증의 발병 위험이 있다.
인간 성인에서 "비만"이라는 용어는 체질량 지수(BMI)가 30 이상인 것을 나타낸다(질병 통제 예방 센터). 이러한 대상체는 비만이라고도 지칭될 수 있다. 이를 1급 비만이라고 한다. 2급 비만은 BMI가 35~39.9인 개체를 의미하며, 3급 비만은 BMI가 40을 초과하는 개체를 지칭한다. 체질량지수(BMI)는 키 및 체중을 기준으로 체지방을 측정한 것이다. 계산 공식은 BMI = 체중(킬로그램)/키(㎡)이다. 일 구현예에서, 비만인 인간 대상체의 BMI는 30이상 또는 35이상이거나 35이상 내지 40미만 또는 30이상 내지 40미만 범위에 있다. 예를 들어 40 미만의 수치는 39.9일 수 있다. 일부 구현예에서, 비만은 중증 비만 또는 병적 비만이고, 이 경우 인간 대상체의 BMI는 40이상이다.
"제2형 진성 당뇨병"이라는 용어는 공복 상태와 섭식 상태 모두에서 포도당 사용 장애와 과도한 포도당 생성이 결합되어 발생하는 지속적으로 높은 포도당 수치를 특징으로 하는 병태이다. 이는 췌장에서 인슐린 생성이 부족하거나 말초 인슐린 저항성으로 인해 발생할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인슐린 저항성"은 정상량의 인슐린이 예상되는 생리학적 반응을 유도할 수 없고 하류 경로를 활성화할 수 없는 병태를 나타낸다. 다수의 예에서, 내인성으로 생성되거나 외인성으로 투여되는 생리학적 범위를 넘어서는 인슐린은 예상되는 생리학적 반응을 유도하기 위해 완전하거나 부분적인 생물학적 반응을 유도하기에 충분하다.
"고인슐린혈증"이라는 용어는 혈액 중 과도한 인슐린이 검출될 수 있는 병태를 나타낸다.
용어 "포도당 불내증"은 건강한 개체에 비해, 대상체에서 기저 또는 식후 포도당 수치의 상승 및/또는 인슐린 수치의 상승 또는 비정상적인 포도당 자극 인슐린 방출 또는 HOMA-IR(인슐린 저항성의 항상성 모델 평가)와 관련된 임상 증상 또는 임상 증상의 조합을 특징으로 하는 임의의 장애를 포괄한다. 포도당 및/또는 인슐린의 수치 상승은 다음과 같은 질환, 장애, 및 병태에서 나타날 수 있다: 비만, 대사 증후군, 내당능 장애, 제2형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 제1형 당뇨병, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 지방이상증, 지방위축증, 및 다양한 청소년기 성인발병 당뇨병(MODY) 돌연변이. 본 개시내용의 GLP1R 작용제 및 이의 조성물은 예를 들어 글루코스 항상성을 달성하고/하거나 유지하기 위해(예를 들어 혈류의 포도당 수치를 낮추고/낮추거나 인슐린 수치를 건강한 대상체에서 발견되는 범위로 낮추기 위해) 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 ＂고혈당증＂은 건강한 개체에 비해, 대상체의 혈액 혈장내 순환하는 포도당의 양이 상승된 병태를 나타낸다. 본원에 기재된 바와 같이, 고혈당증은 공복 혈당 수치의 측정을 비롯해 당업계에 알려진 방법을 사용하여 진단될 수 있다.
"당뇨병 합병증"이라는 용어는 신장, 말초 사지, 및 눈을 포함한 여러 기관을 손상시키거나(예를 들어: 망막병증) 혈관 질환 및 신경병증을 유발하는, 지속적으로 높은 혈당 수치로 인해 발생하는 문제이다. 혈관 기능의 손상은 발기 부전을 유발하고 피부 감염의 위험을 증가시킬 수 있다. 당뇨병은 또한 심장병과 뼈 및 관절 장애의 위험을 증가시킨다. 당뇨병의 다른 장기적 합병증은 간세포암종, 자궁내막암, 유방암, 및 췌장암을 비롯한 과도한 암의 위험을 포함한다.
"당뇨병성 신장병"이라는 용어는 당뇨병으로 인해 발생하고 신장 기능을 저하시키는 신장 내 혈관 및 기타 세포의 손상으로 인해 발생되는 병태이다.
"이상지질혈증"이라는 용어는 지질단백질 과잉생성 또는 비정상적 대사를 비롯한 지질단백질 대사의 복합 장애이다. 이상지질혈증은 혈중 총 콜레스테롤, 저밀도 지질단백질(LDL) 콜레스테롤, 및 트리글리세리드 농도의 상승, 및 고밀도 지질단백질(HDL) 콜레스테롤 농도의 감소로 나타날 수 있다.
"대사 증후군"이라는 용어는 관상동맥질환, 박출률 감소 심부전, 박출률 보존 심부전, 뇌혈관질환, 말초혈관질환을 비롯한 심혈관질환의 위험을 높이는 위험인자의 집합체를 나타낸다. 이러한 위험인자는 다음과 같다: 복부 지방, 단식 후 고혈당(최소 데시리터당 110 밀리그램(mg/dl)); 혈류 내 높은 중성지방(최소 150 mg/dL); 낮은 HDL(40mg/dl 미만); 및 혈압 130/85 mmHg 이상(세계보건기구).
"진행성 간 질환"이라는 용어는 간세포 암종의 원인이 되는 섬유증 및 간경변으로 입증되는 간 지방증의 양성 상태로부터의 진행을 나타낸다. 비만 관련 비알코올성 지방간(NAFL)이 NASH, 섬유증, 및 간경변으로 진행되는 것은 문헌에 충분히 제시되어 있다.
NAFLD로도 알려진 "비알코올성 지방간 질환(FLD)"이라는 용어는 과도한 지질이 간세포에 축적되는 병태로, 이는 간에서의 과도한 지방 생성 또는 지방산의 비정상적인 제거 및 산화로 인해 발생할 수 있다. NAFLD는 알코올성 간질환, 바이러스성 간질환을 비롯한 간질환의 다른 원인에서 제외된다. NAFLD는 질환의 진행을 반영하는 다음과 같은 세 가지 조직학적 존재를 포함한다: 지방간, 간지방증 및 섬유증, 또는 간경변. NAFLD의 가장 일반적인 원인은 비만이지만 NAFLD는 마른 사람에서도 볼 수 있다. 지방의 축적은 대식세포의 침윤, 및 팽창을 포함한 간세포 조직학의 변화를 동반하는 염증으로 진행될 수 있고, 이를 지방간염이라고 하며 비알코올성 지방간염(NASH)이라고 지칭한다. NASH는 소엽간 연결 섬유증을 동반한 섬유증 또는 간경변으로 진행될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, NASH라는 용어는 지방증, 간세포 팽창, 및 소엽 염증을 포함할 수 있다.
용어 "심혈관 질환"은 심장 또는 혈관과 관련된 질환이다.
용어 "죽상동맥경화증"은 중대형 동맥의 내막에서의 불규칙적으로 분포된 지질 침착을 특징으로 하는 혈관 질환을 나타내며, 이로 인해 때때로 동맥 내강이 좁아지고 결국 섬유증 및 석회화로 진행된다. 병변은 대개 국소적이며, 천천히 그리고 간헐적으로 진행된다. 혈류의 제한은 병변의 분포 및 중증도에 따라 달라지는 대부분의 임상 증상의 원인이 된다.
"말초 동맥 질환"이라는 용어는 동맥에 지방이 축적되어 다리 근육으로의 혈액 공급이 제한되는 경우를 나타낸다.
'뇌졸중'이라는 용어는 뇌의 일부에 혈액 공급이 차단되는 경우를 나타낸다.
"심근병증"이라는 용어는 심장 기능, 생리학, 및 전도에 영향을 미칠 수 있는 심방 또는 심실 심근의 후천적 또는 선천적 구조적 이상으로 정의된다.
"심부전"이라는 용어는 심장의 혈액 펌프 능력이 저하된 경우를 나타내며, 박출률 보존 심부전(HFpEF), 박출률 감소 심부전(HFrEF), 및 중중간 범위 박출률 심부전(HFmrEF)을 포함할 수 있다.
관상동맥 질환으로도 불리는 용어 "관상동맥 심질환"은 심장에 혈액을 공급하는 동맥의 협착이다.
"부정맥"이라는 용어는 비정상적 심장 박동을 나타내며 심방 부정맥, 심방세동, 및 심실 부정맥을 포함할 수 있다.
용어 "신경병증"은 신경이 손상되는 경우를 나타낸다. 이 용어는 손, 발, 팔과 같은 사지의 신경이 손상될 때 발생하는 말초 신경병증을 포함한다. 당뇨병은 말초 신경병증의 일반적인 원인이다.
다른 구현예는 비만, 제2형 진성 당뇨병, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 당뇨병 합병증(만성 신장 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않음), 당뇨병성 신장병, 이상지질혈증, 대사 증후군, 진행성 간질환, 심혈관 질환, 및 신경병증(특히 예를 들어 당뇨병과 관련된 말초 신경병증)으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한,
[화합물 1]
인, 본원에 정의된 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 비만, 제2형 진성 당뇨병, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 당뇨병 합병증(만성 신장 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않음), 당뇨병성 신장병, 이상지질혈증, 대사 증후군, 진행성 간질환, 심혈관 질환, 및 신경병증(특히 예를 들어 당뇨병과 관련된 말초 신경병증)으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한,
[화합물 2]
인, 본원에 정의된 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 비만, 제2형 진성 당뇨병, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 당뇨병 합병증(만성 신장 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않음), 당뇨병성 신장병, 이상지질혈증, 대사 증후군, 진행성 간질환, 심혈관 질환, 및 신경병증(특히 예를 들어 당뇨병과 관련된 말초 신경병증)으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한,
[화합물 3]
인, 본원에 정의된 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 고혈압, 죽상경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심근병증, 심방세동, 심부전(예를 들어, 박출률 감소 심부전(HFrEF), 중간 범위 박출률 심부전(HFmrEF), 및 박출률 보존 심부전(HFpEF), 관상동맥 심장 질환, 및 부정맥(예를 들어, 심방 부정맥 및 심실 부정맥)으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한,
[화합물 1]
인, 본원에 정의된 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 고혈압, 죽상경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심근병증, 심방세동, 심부전(예를 들어, 박출률 감소 심부전(HFrEF), 중간 범위 박출률 심부전(HFmrEF), 및 박출률 보존 심부전(HFpEF), 관상동맥 심장 질환, 및 부정맥(예를 들어, 심방 부정맥 및 심실 부정맥)으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한,
[화합물 2]
인, 본원에 정의된 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 구현예는 고혈압, 죽상경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심근병증, 심방세동, 심부전(예를 들어, 박출률 감소 심부전(HFrEF), 중간 범위 박출률 심부전(HFmrEF), 및 박출률 보존 심부전(HFpEF), 관상동맥 심장 질환, 및 부정맥(예를 들어, 심방 부정맥 및 심실 부정맥)으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한,
[화합물 3]
인, 본원에 정의된 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
투약 형태
본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물 또는 조합은 약 50 내지 70 kg의 대상체에 대해 약 1 내지 100 mg의 활성 성분(들)의 단위 투약량으로 나타낼 수 있다. 화합물, 약학적 조성물, 또는 이들의 조합의 치료적으로 유효한 투여량은 대상체의 종, 체중, 연령 및 개별 상태, 치료되는 장애 또는 질환 또는 이의 중증도에 따라 다르다.
조합 양태
본원에 기재된 임의의 화합물은 하나 이상의 다른 치료제와 동시에, 또는 그 전에, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 본원에 기재된 화합물은 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 개별적으로 투여되거나, 다른 제제와 동일한 약학적 조성물로 함께 투여될 수 있다. 치료제는 예를 들어 치료적으로 활성이거나 본원에 기재된 화합물과 조합하여 대상체에게 투여될 때 치료 활성을 증진시키는 화학적 화합물, 펩티드, 펩티드 접합체 및 융합체, 항체, 항체 단편, 또는 핵산이다.
따라서, 다른 양태에서, 화합물, 특히 본원에 기재된 (예를 들어 치료 유효량의) 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 하나 이상의 다른 치료활성제를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 화합물 및 적어도 하나의 다른 치료제를 치료에서 동시에, 개별적으로, 또는 순차적으로 사용하기 위한 조합제로서 포함하는 조합이 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 치료법은 앞서 언급된 목록으로부터 선택된 질환, 장애, 또는 병태의 치료이다.
조합제로서 제공되는 제품은 본원에 기재된 화합물 및 하나 이상의 추가 치료제(들)를 동일한 약학적 조성물에 함께 포함하는 조성물을 포함하거나, 또는 본원에 기재된 화합물 및 다른 치료제(들)를 별도의 형태, 예를 들어 키트의 형태로 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 화합물 및 하나 이상의 추가 치료제(들)를 포함하는 약학적 조합이 본원에 제공된다. 임의로, 약학적 조합은 전술한 바와 같은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 2가지 이상의 별개의 약학적 조성물(이중 적어도 하나는 본원에 기재된 화합물을 함유함)을 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일 구현예에서, 키트는 상기 조성물을 개별적으로 유지하는 수단, 예컨대 용기, 분할된 병, 또는 분할된 포일 패킷을 포함한다. 이러한 키트의 예는 정제, 캡슐 등의 패키징에 일반적으로 사용되는 블리스터 팩이다.
키트는 상이한 투약 형태, 예를 들어 경구 및 비경구 투약 형태를 투여하기 위해, 개별 조성물을 상이한 투약 간격으로 투여하기 위해, 또는 개별 조성물을 서로에 대해 적정하기 위해 사용될 수 있다. 준수 보조를 위해 키트는 일반적으로 투여 지침을 포함한다.
본원에 기재된 조합 요법에서, 본원에 기재된 임의의 화합물 및 다른 치료제는 동일하거나 상이한 제조업체에 의해 제조 및/또는 제형화될 수 있다.
또한, 본원에 기술된 임의의 화합물 및 다른 치료제는 (i) 의사에게 조합 제품을 제공하기 전에(예를 들어, 본원에 기재된 화합물 및 다른 치료제를 포함하는 키트의 경우); (ii) 투여 직전에 의사에 의해 직접(또는 의사의 지도하에); (iii) 예를 들어 본원에 기재된 화합물 및 다른 치료제의 순차 투여 중에, 환자에 의해 직접, 병용요법으로 합쳐질 수 있다.
또한, 임의의 앞서 언급된 목록으로부터 선택된 질환, 장애, 또는 병태를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본원에 기재된 화합물 및 하나 이상의 추가 치료제를 포함하는 조합물이 본원에 제공된다.
또한, 임의의 앞서 언급된 목록으로부터 선택된 질환, 장애, 또는 병태를 치료하기 위한, 본원에 기재된 화합물 및 하나 이상의 추가 치료제를 포함하는 조합물의 용도가 본원에 제공된다.
일 구현예에서, 다른 치료제는 다음으로부터 선택될 수 있다:
1. 인슐린, 인슐린 유도체, 및 유사체 등의 항당뇨병제; 설포닐우레아(예를 들어 클로르프로파미드)와 같은 인슐린 분비촉진제; 또는 빌다글립틴과 같은 DPPIV(디펩티딜 펩티다제 IV) 억제제;
2. 3-하이드록시-3-메틸-글루타릴 조효소 A(HMG-CoA) 환원효소 억제제와 같은 고지혈증제, 예를 들어 로바스타틴; 스쿠알렌 신타제 억제제; FXR(파네소이드 X 수용체) 및 LXR(간 X 수용체) 리간드; 콜레스티라민 및 콜레세벨람과 같은 담즙산 격리제; 피브레이트; 니코틴산 또는 아스피린;
3. 오를리스타트와 같은 항비만제;
4. 항고혈압제, 예를 들어 에타크린산과 같은 루프 이뇨제; 베나제프릴과 같은 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제; 디곡신과 같은 Na-K-ATPase 막 펌프 억제제; 중성엔도펩티다제(NEP) 억제제; 오마파트릴라트와 같은 ACE/NEP 억제제; 발사르탄과 같은 안지오텐신 II 길항제; 사쿠비트릴/발사르탄(LCZ696)과 같은 안지오텐신 수용체-네프릴리신 억제제(ARNi); 디테키렌과 같은 레닌 억제제; 티몰롤과 같은 β-아드레날린 수용체 차단제; 디곡신과 같은 수축제; 암로디핀과 같은 칼슘 채널 차단제; 알도스테론 수용체 길항제; 또는 알도스테론 신타제 억제제;
5. 페노피브레이트와 같은 퍼옥시좀 증식자-활성자 수용체의 작용제;
6. Urocortin 2와 같은, 코르티코트로핀 방출 호르몬 수용체를 결합하는 화합물.
실시예
본 발명은 다음의 실시예 및 합성 반응식에 의해 추가로 설명되며, 이들은 본 발명을 범위 또는 사상 면에서 본원에 기술된 특정 절차로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 실시예는 특정 구현예를 예시하기 위해 제공되며 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아님을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 사상 및 첨부된 청구범위의 범위를 벗어남이 없이 당업자에게 제안될 수 있는 다양한 다른 구현예, 이의 변형예, 및 균등예가 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 화합물은 유기 합성 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 모든 방법에서, 화학의 일반 원리에 따라 필요한 경우 민감성 또는 반응성 기에 대한 보호기가 사용될 수 있음이 이해된다. 보호기는 유기 합성의 표준 방법에 따라 처리된다(T.W. Green and P.G.M. Wuts (1999) Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons). 이들 기는 당업자가 쉽게 알 수 있는 방법을 사용하여 화합물 합성 중 편리한 단계에서 제거된다.
실험 부문
분석 방법, 재료, 및 기기
달리 명시되지 않는 한, 시약 및 용매는 상업적 공급업체로부터 받은 그대로 사용되었다. 달리 명시되지 않는 한, 양성자 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼은 Bruker Avance 분광계 또는 Varian Oxford 400 MHz 분광계에서 획득되었다. 스펙트럼은 ppm(δ)으로 제공되고, 커플링 상수 J는 헤르츠로 보고된다. 내부 표준물질로 테트라메틸실란(TMS)을 사용하였다. 화학적 이동은 설폭사이드(δ 2.50), 메탄올(δ 3.31), 클로로포름(δ 7.26), 또는 NMR 스펙트럼 데이터에 표시된 기타 용매에 대해 ppm 단위로 보고된다. 소량의 건조 샘플(2~5 mg)을 적절한 중수소화 용매(1 mL)에 용해시킨다. 화학명은 CambridgeSoft의 ChemBioDraw Ultra v17from를 사용하여 생성되었다.
약어:
AC50 절반 최대 화합물 효과의 농도
ACN 아세토니트릴
Ainf 고농도에서의 힐 곡선 정체기 값
A0 저농도에서의 힐 곡선 정체기 값
Aib α-아미노이소부티르산
ALS 오토샘플러
AUCinf 시간 0에서 무한대까지의 혈장 농도-시간 곡선하 면적
br 광폭
BSA 소 혈청 알부민
BW 체중
cAMP 환형 아데노신 모노포스페이트
cat # 카탈로그 번호
CHO 중국 햄스터 난소 세포
Cmax 최대 혈장 농도
CO2 이산화탄소
cynoGLP1R 시노몰구스 글루카곤 유사 펩티드 1 수용체
d 이중선
dd 이중선의 이중선
DCC N,N’-디시클로헥실카보디이미드
DCM 디클로로메탄
DCU N,N’-디시클로헥실우레아
DEA N,N-디에틸아닐린
DERET 해리 강화된 공명 에너지 전달
DIEA/DIPEA 디에틸이소프로필아민
DIO 식이 유발 비만
DMEM Dulbecco의 변형된 eagle 배지
DMF N,N-디메틸포름아미드
DMSO 디메틸설폭사이드
DSC N,N'-디석신이미딜 카보네이트
DMA 디메틸아세트아미드
DMAP 4-(N,N-디메틸아미노)피리딘
EA 효소 수용체
EC 유효 농도
EC0 무반응 화합물의 유효 농도
EC50 절반 최대 반응 화합물의 유효 농도
EC100 최대(100%) 반응 화합물의 유효 농도
Emax 효능: 투여제로부터 달성가능한 최대 반응
EDC 또는 EDCI N-에틸-N’-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
Ex9-39 엑센딘 9-39
ELSD 증발 광 산란 검출기
equiv 당량
ESI 전기분무 이온화
EtOAc 에틸 아세테이트
FBS 소태아 혈청
FI 음식 섭취
Fmoc 9-플루오레닐메톡시카보닐
FRET 형광 공명 에너지 전달
g 그램
GLP1 글루카곤 유사 펩티드 1
GLP1R 글루카곤 유사 펩티드 1 수용체
GPCR G-단백질 결합 수용체
G418 제네티신(선택 항생제)
Grubbs II 디클로로[1,3-비스(2,4,6-트리메틸페닐)-2-이미다졸리디닐리덴](벤질리덴)(트리시클로헥실포스핀) 루테늄(II)
h 시간
HATU (1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트
HDF 고지방식이
HESI 가열 전기분무 이온화
hGLP1R 인간 글루카곤 유사 펩티드 1 수용체
HPLC 고압 액체 크로마토그래피
HTRF 균일 시분해 형광
IBMX 3-이소부틸-1-메틸잔틴
kg 킬로그램
L 리터
LCMS 액체 크로마토그래피 및 질량분석법
MeOH 메탄올
MS 질량분석법
MTBE 메틸 tert-부틸 에테르
m 다중선
mg 밀리그램
min 분
mL 밀리리터
mmol 밀리몰
mM 밀리몰
m/z 질량 대 전하 비
nM 나노몰
nmol 나노몰
NMP N-메틸-2-피롤리디논
NMR 핵자기 공명
NPLC 순상 액체 크로마토그래피
p 오중선
Pbf 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조푸란-5-설포닐-
PBS 인산염 완충 식염수
Pd/C 탄소상의 팔라듐
PEG 폴리에틸렌 글리콜
PK 약동학
PD 약력학
ppm 백만분율
QC 품질 관리
QD 1일 1회
Q3D 3일에 1회
Q1W 주 1회
RCF 상대원심력
RPM 분당 회전수
Rt 유지 시간
RT 실온
rotovap 회전식 증발기
s 단일선
s.c. 또는 SC 피하
sec 초
SEM 평균의 표준 오차
SFC 초임계 유체 크로마토그래피
SM 출발 물질
t 삼중선
TEA 트리에틸아민
TFA 트리플루오로아세트산
THF 테트라하이드로푸란
Tmax 최대 혈장 농도에 도달하는 시간
T1/2 반감기
v/v 부피/부피
[μg] 마이크로그램
μL 마이크로리터
μM 마이크로몰
생물학적 분석 및 데이터
본원에 기재된 화합물을 세포내 cAMP 농도를 측정하는 하기의 세포 분석에서 테스트하였다. cAMP는 GLP1R의 활성화에 의해 생성된다. 수득한 데이터를 표 1~3에 나타내었다. EC50은 (기준선 수정 후) 최대 반응의 절반을 유도하는 화합물의 농도로 정의된다. Emax는 테스트 화합물에 대해 관찰된 최대 반응으로 정의되며, GLP1R에 대한 내인성 리간드(GLP1(7-36))에 대해 관찰된 최대 반응으로 정규화된다.
인간 GLP1R cAMP 작용제 분석
GPCR의 리간드 활성화 후 cAMP의 세포내 농도 변화를 측정하는 GloSensor™ cAMP Assay(Promega Corp.)를 사용하여 화합물의 작용제 활성을 측정하였다. 이 분석은 Photinus pyralis 루시퍼라제의 돌연변이 형태에 융합된 cAMP 결합 도메인을 갖는 pGloSensor™-22F cAMP 플라스미드(Promega, cat # E2301)에 의해 암호화된 바이오센서를 사용한다. cAMP에 결합하면 발광 검출기로 측정할 수 있는 광 출력의 큰 증가를 촉진하는 형태 변화가 발생한다. 인간 GLP1 수용체(hGLP1R) 및 pGloSensor™-22F를 안정적으로 과발현하는 HEK293-SNAP-hGLP1R-GloSensor 세포를 CO2 비의존 배지(1.0% FBS, 2 mM L-글루타민, 페니실린, 및 스트렙토마이신을 함유한 Gibco cat # 18045-088) 내 백색 384-웰 폴리-D-리신 코팅 플레이트(Greiner Bio One, cat # 781945)에 시딩하고, 습도가 있는 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. GloSensor 기질(Promega, cat # E1291)의 4% v/v 희석을 함유한 동일한 부피의 CO2 비의존 배지를 모든 웰에 첨가하여 다음날 아침 분석을 개시하였다. 세포 플레이트를 실온에서 2시간 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 액체 취급 단계에 Biomek i7(Beckman Coulter) 장비를 사용하였다. 중복 용량 반응 곡선을 생성하기 위해, 3배 연속 희석된 화합물을 0.1% BSA, 0.5 mM IBMX, 및 0.4% DMSO을 함유한 CO2 비의존 배지에서 100 nM~0.03 pM 범위의 최종 농도의 최종 부피 60 μL로 세포 분석 플레이트에 추가하였다. 2 nM의 최종 농도로 GLP1(7-36) 펩티드(Bachem, cat # H-6795)를 함유하는 EC100 대조군 웰 및 펩티드를 함유하지 않은 EC0 대조군 웰을 동일한 플레이트에서 동시에 테스트 하였고, 테스트된 화합물과 동일한 분석 완충액을 사용하였다. 이 플레이트를 세포에 화합물을 첨가한 후 실온에서 12분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 이어서 384웰 발광 조리개가 있는 Ultra-Sensitive 프로토콜 설정 "384웰 US 발광 검출기"를 사용하여 "TRF Light Unit, 337 nm"(PerkinElmer)가 있는 Envision 2104 다중 라벨 판독기로 발광을 웰당 0.1초로 측정하였다. cAMP 활성은 GLP1(7-36) EC100 대조군 웰의 백분율로 계산하였다: [(샘플 신호 - 평균 EC0 신호)/(GLP1(7-36) 신호의 평균 EC100 - 평균 EC0 신호)}*100. EC50 측정을 위한 곡선 피팅은 소프트웨어 패키지 DAVID의 Helios 모듈에서 수행하였다. 4-매개변수 로지스틱 모델인 Hill Slope를 사용하였다: y = Ainf + (A0 - Ainf) / (1 + (x / AC50)Hill Slope)(식에서, y는 기능적 반응이고; x는 화합물 농도이고; A0는 최소값(0용량)이고; Ainf는 최대값(무한 용량에서)이고; AC50은 변곡점(즉, A0와 Ainf 사이의 중간에 있는 S자형 곡선의 지점)에 해당함). EC50 값은 Helios로부터 계산된 AC50 값(μM)으로 나타내었다. Emax는 피팅된 곡선에서 파생된, 농도 범위 내에서 검출된 최대 활성이다.
HEK293-SNAP-hGLP1R 세포주의 생성
327 μL의 Opti-MEM 배지(Gibco, cat # 31985-062)를 12 μL의 FuGENE® HD(Promega, cat # E2311)와 혼합하고 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 이어서 SNAP 태그와 융합된 인간 GLP1R(NCBI 기준 서열: NM_002062.3)을 암호화하는 pSNAP-hGLP1R 플라스미드(Cisbio, cat # PSNAP-GLP1) 8.2 μL(4 μg, 0.485 μg/μL 용액)를 Fugene HD/Opti-MEM 혼합물에 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. HEK293 세포(ATCC® CRL-1573™)의 현탁액을 800,000개 세포/mL로 제조하였다. 이어서, 플라스미드/FuGene HD 혼합물을 8 mL의 세포에 첨가하고 부드럽게 혼합하였다. 2 mL의 새로운 혼합물을 6웰 플레이트의 4개 웰에 첨가하고, 2 mL의 형질감염되지 않은 세포를 대조군으로서 2개의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 100% 합류될 때까지 37℃에서 인큐베이션하였다. 항생제 선택[800 μg/mL G418(Geneticin, Gibco, cat # 10131-035)]은 2500개 세포/mL로 희석하여 세포 트립신화 후에 수행하였다. 1 mL 세포 현탁액을 10 cm 배양 접시의 20 mL 선택 배지(총 2500개 세포)에 첨가하고 동시에 희석된 세포 현탁액 4 mL를 10 cm 배양 접시의 20 mL 선택 배지(총 10000개 세포)에 첨가하였다. 나머지 세포는 T150 플라스크에서 배양하였다. 또한, HEK293 세포를 음성 대조군으로서 선택 배지 내 T75 플라스크에서 배양하였다. 마지막으로, 단일 클론을 10 cm 배양 접시에서 골라 유전자 발현 분석 및 HTRF cAMP 분석을 위한 충분한 세포가 있을 때까지 배양하였다. 클론 2는 가장 높은 GLP1R 의존적 cAMP 반응을 나타내었고, GloSensor 안정 세포주의 생성을 위해 확장하였다.
HEK293-SNAP-hGLP1R-GloSensor 안정 세포주 생성
SNAP-hGLP1R(상기 설명됨)을 안정적으로 과발현하는 HEK293 세포를 17 mL의 DMEM 완전 성장 배지(Gibco, cat # 11965-092) + 10% 소 태아 혈청(FBS, Gibco, cat # 16140-071)이 함유된 10 cm 접시에 300만 개의 세포 밀도로 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 다음과 같이 형질감염시켰다. DNA 복합체는 1758 μL Opti-MEM 용액에 37 μg의 플라스미드 DNA를 첨가하여 0.020 μg/μL pGloSensor™-22F cAMP 플라스미드(Promega, cat # E2301; GenBank® 수탁번호 GU174434)로 제조하였다. 이어서 FuGENE® HD 시약 112 μL를 조심스럽게 혼합하여 첨가하였다. 실온에서 5~10분간 인큐베이션한 후, 웰당 복합체 850 μL를 세포에 첨가하고 완전히 혼합하였다. 습도가 있는 37℃, 5% CO2에서 24시간 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 헹구었다. 이어서, 선택 배지[600 μg/mL G418 및 600 μg/mL 히그로마이신 B(Gibco, cat # 10687010)]를 첨가하였다. 더 이상 사멸 세포가 관찰되지 않을 때까지 배지를 주 2회 교체하였다. 세포 클론이 보이면, 0.05% 트립신-EDTA 용액 10 μL를 첨가한 후 위아래로 피펫팅하여 단일 세포를 단리하였다. 이어서 이러한 단일 세포 유래 클론을, 본원에 기재된 GloSensor 발광 분석에서 cAMP 작용제 반응에 대해 테스트하기에 충분한 세포를 사용할 수 있을 때까지 선택 배지(600 μg/mL G418 + 600 μg/mL 히그로마이신 B)가 포함된 6개의 웰 플레이트에서 배양하였다. 목적하는 반응을 산출한 HEK293-SNAP-hGLP1R 안정 세포 클론을 인간 GLP1R cAMP 작용제 분석에 사용하였다. 이러한 데이터는 테스트된 화합물의 상대적 효능을 나타낸다.
시노몰구스 GLP1R cAMP 작용제 분석
기재된 화합물의 작용제 활성은 GPCR의 리간드 활성화 후 cAMP의 세포내 농도 변화를 측정하는 HTRF cAMP 분석(CisBio, cat # 62AM4PEC)을 사용하여 추가로 테스트하였다. 이 분석은 Eu3+ 크립테이트(공여체 형광단) 및 d2(수용체 형광단)에 결합된 cAMP로 표지된 특정 항-cAMP 단일클론 항체를 포함하는 경쟁 포맷을 기반으로 한다. 이를 통해 세포의 G 단백질 결합 수용체에 작용하는 화합물의 직접적인 특성화가 가능하다. 세포에 의해 생성된 천연 cAMP는 항-cAMP 항체-Eu3+ 크립테이트에 결합하기 위해 d2-표지된 cAMP와 경쟁한다. 시노몰구스 GLP1 수용체(cynoGLP1R)를 안정적으로 과발현하는 HEK293-cynoGLP1R F6 세포를 DMEP 완전 배지(Gibco, cat # 11965-092, 10% 열 불활성화 FBS, 0.5 mg/ml 제네티신, Gibco Life Technologies, cat # 10131027) 내 5000개 세포/웰로 백색 384-웰 폴리-D-리신 코팅 플레이트에 시딩하고, 습도가 있는 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 분석을 수행하였다. 펩티드를 자극 완충액[1X HBSS(Life Technologies, cat # 14065-056), 20 mM HEPES(Life Technologies, cat # 15630), 0.1% BSA(Sigma, cat # A0281), 및 0.5 mM IBMX]에 희석하였다. 3중 용량 반응 곡선을 생성하기 위해, 3배 연속 희석된 화합물(2배 농도)을 DMSO에 희석하였다. 세포를 ELx405 Select, BioTek 플레이트 세척기로 세척하여 10 μL/웰 분석 완충액[1X HBSS(Life Technologies, cat # 14065-056), 20 mM HEPES(Life Technologies, cat # 15630)]를 남겼다. 플레이트를 간단히 원심분리하고 2배 희석된 펩티드 10 μL를 웰당 첨가하였다. 플레이트를 다시 간단히 원심분리하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 20x d2 및 Eu3+크립테이트를, 키트와 함께 제공된 용해 완충액에 희석하였다. 펩티드와 함께 30분간 인큐베이션한 후, 10 μL의 희석된 d2를 웰당 첨가한 후 10 μL의 희석된 Eu3+크립테이트를 첨가하였다. 플레이트를 검정색 뚜껑으로 덮고 간단한 원심분리 후 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 HTRF 신호를 두 개의 상이한 파장(665 nm 및 620 nm)으로 설정된 형광 방출을 사용하여 Envision 2104 Multilabel 판독기(Perkin Elmer)를 사용하여 측정하였다. EC50 측정을 위한 곡선 피팅은 소프트웨어 패키지 DAVID의 Helios 모듈에서 수행하였다. 4-매개변수 로지스틱 곡선 피팅을 표준 곡선 화합물이 배치된 플레이트 단면에서 수행하여 4개의 표준 매개변수를 수득하였다: std_crv_ac50(표준 곡선 AC50), std_crv_a0(표준 곡선 A0), std_crv_ainf(표준 곡선 Ainf), std_crv_hill(표준 곡선 Hill slope). 이어서 이 4개의 매개변수 값을 사용하여 다음의 공식으로 각 웰에 표준 곡선 변환을 적용하였다: y = std_crv_ac50 * [ (X - std_crv_a0) / (std_crv_ainf - X)] ^ ( 1 / std_crv_hill)(y는 기능적 반응이고; x는 화합물 농도임). 4-매개변수 로지스틱 곡선 피팅을 변환된 데이터에 대해 수행하여 모든 테스트 화합물에 대한 AC50(μM)을 수득하였고 이는 이 분석의 EC50 값을 나타낸다. 는 GLP1(7-36) EC100의 백분율로 표시하였다: [(샘플 Amax - 샘플 A0)/ (GLP1(7-36) Amax - GLP1(7-36) A0)]*100.
HEK293-cynoGLP1R 안정 세포주의 생성
HEK293 세포를 형질감염 전날 T25 플라스크 내 8 mL의 DMEM 완전 성장 배지 + 10% FBS에 1 X 106개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 다음과 같이 형질감염시켰다. 414 μL의 OptiMEM 용액 중 cyno GLP1R cDNA를 암호화하는 pcDNA3.1(+) Neo 플라스미드[코돈 최적화, GeneArt(Thermo Fisher Scientific); NCBI 기준 서열: NP_001274592] 8.8 μg을 첨가하여 DNA 복합체를 0.020 μg/μl로 제조하였다. 이어서 FuGENE® HD 시약 26 μL를 조심스럽게 혼합하여 첨가하였다. 실온에서 5~10분간 인큐베이션한 후, 웰당 복합체 400 μL를 세포에 첨가하고 완전히 혼합하였다. 습도가 있는 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 0.5 mg/mL 제네티신의 존재 하에 15 cm 접시에 옮겼다. 기능적 cAMP 분석에서 가장 높은 활성을 나타낸 HEK293T-cynoGLP1R 안정 세포 클론(클론 F6)을 cyno GLP1R cAMP 세포 작용제 분석에서 추가 분석을 위해 선택하였다.
이러한 데이터는 테스트된 화합물의 상대적 효능을 나타낸다.
마우스 GLP1R cAMP 작용제 분석
마우스 GLP1 수용체(mGLP1R)를 안정적으로 과발현하는 HEK293-mGLP1R CRE-Luc(Clone C3) 세포가 사용되었다는 사실을 제외하고, 시노몰구스 GLP1R cAMP 분석(상기 참조)과 유사한 절차를 사용하여 화합물의 cAMP 작용제 활성을 테스트하였다(하기에 기재된 생성).
HEK293-mGLP1R CRE-Luc 안정 세포주의 생성
HEK293T CRE-Luc 세포를 10 cm 접시의 17 mL DMEM 완전 성장 배지 + 10% FBS에 3 X 1106개 세포 밀도로 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 다음과 같이 형질감염시켰다. 1758 μL Opti-MEM 용액 중 마우스 GLP1R cDNA를 암호화하는 플라스미드 DNA(GeneCopoeia, cat # EX-Mm23901-M67; NCBI 기준 서열: NM_021332.2) 37 μg을 첨가하여 DNA 복합체를 0.020 μg/μL로 제조하였다. 이어서 FuGENE® HD 시약 112 μL를 조심스럽게 혼합하여 첨가하였다. 실온에서 5~10분간 인큐베이션한 후, 웰당 DNA 복합체 850 μL를 세포에 첨가하고 완전히 혼합하였다. 습도가 있는 37℃, 5% CO2에서 24시간 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 헹구고 분할하였다. 이어서, 선택 배지[2 μg/mL 퓨로마이신(Corning, cat # 61-385-RA) 및 100 μg/mL 하이그로마이신(Gibco, cat # 10687010)]을 첨가하였다. 더 이상 사멸 세포가 관찰되지 않을 때까지 배지를 주 2회 교체하였다. 세포 클론이 보이면 단일 세포를 단리하였다. 최대 유전자 발현을 나타낸 HEK293T-mGLP1R-CRE-Luc 안정 세포 클론(Clone C3)을 마우스 GLP1R cAMP 세포 작용제 분석에 사용하였다.
이러한 데이터는 테스트된 화합물의 상대적 효능을 나타낸다.
인간 GLP1R β-아레스틴 모집 분석
작용제가 β-아레스틴을 모집하는 정도는 PathHunter® β-아레스틴 분석(DiscoverX)을 사용하여 측정하였다. 이 분석은 효소 보완 접근법을 사용하여 수용체에 대한 β-아레스틴의 결합을 측정한다. β-갈락토시다제 효소(Prolink 및 Enzyme Acceptor 또는 'EA'라고 함)의 두 비활성 부분을, 인간 GLP1R(hGLP1R)이 Prolink 부분을 함유하고 β-아레스틴이 EA 부분을 함유하도록, 태깅한다. β-아레스틴이 수용체에 모집되면 효소는 활성화되어 화학발광 기질(PathHunter® 검출 키트, DiscoverX cat # 93-0001) 존재 하에 발광을 생성한다. 발광은 관련 검출기로 측정할 수 있다. Prolink 태그가 있는 hGLP1R 및 EA 태그가 있는 β-아레스틴을 안정적으로 과발현하는 CHO-hGLP1R-β-아레스틴 세포를 플레이팅 시약 2(DiscoverX, cat # 93-0563R2A) 중 백색 384-웰 폴리-D-리신 코팅 플레이트(Greiner Bio One, cat # 781945)에 웰당 20 μL로 시딩하고, 습도가 있는 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 최종 요구 농도의 5배로 작용제를 제조하였다. 3중 용량 반응 곡선을 생성하기 위해, 화합물을 분석 완충액(HBSS, 10 mM Hepes 및 0.1% BSA)에서 연속적으로 3배 희석한 후, 화합물에 따라 최종 부피 25 μL, 최종 최고 농도는 3 μM 이하에서 시작하여 세포 분석 플레이트에 첨가하였다. 1 nM의 최종 농도로 GLP1(7-36) 펩티드(Bachem, cat # H-6795)를 함유하는 EC100 대조군 웰 및 화합물을 함유하지 않은 EC0 대조군 웰을 동일한 플레이트에서 동시에 테스트 하였고, 테스트된 화합물과 동일한 분석 완충액을 사용하였다. 세포에 화합물을 첨가한 후 플레이트를 습도가 있는 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 검출 시약(제조업체 권장 사항, DiscoverX cat # 93-0001에 따라 세포 분석 완충액 19부, 기질 시약 1 5부, 기질 시약 2 1부)을 준비하고 웰당 12 μL를 세포 분석 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온의 암실에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 384웰 발광 조리개가 있는 Ultra-Sensitive 프로토콜 설정 "384웰 US 발광 검출기"를 사용하여 "TRF Light Unit, 337 nm"(Perkin Elmer)가 있는 Envision 2104 다중 라벨 판독기로 발광을 웰당 0.1초로 측정하였다. β-아레스틴 모집을 계산하고 GLP1(7-36) EC100 대조군 웰의 백분율로 표시하였다: [(샘플 신호 - 평균 EC0 신호)/(GLP1(7-36) 신호의 평균 EC100 - 평균 EC0 신호)]*100(Microsoft Excel 사용). GraphPad Prism을 사용하여 EC50 측정을 위한 곡선 피팅을 수행하였다. 4-매개변수 로지스틱 모델인 Hill Slope를 사용하였다: Y=하단 + (상단-하단)/(1+10^((Log EC50-X)*Hill Slope))(식에서, Y는 기능적 반응이고; X는 화합물 농도이고; 하단은 A0 또는 최소값(0 용량)이고; 상단은 Ainf 또는 최대값(무한 용량)이고; EC50은 변곡점(즉, A0와 Ainf 사이의 중간에 있는 S자형 곡선의 지점)임). EC50 값은 μM 단위로 계산하였다. Emax는 GLP1(7-36)에 대한 피팅된 곡선에서 파생된, 농도 범위 내에서 검출된 최대 활성이다.
CHO-hGLP1R-β-아레스틴 세포주의 생성
PathHunter® CHO-K1-EA 모 세포(DiscoverX, cat # 93-0164)를 22 mL의 완전 배지(AssayComplete Cell Culture 키트 107, DiscoverX, cat # 92-3107G)에 T75 cm2 플라스크당 2 X 106개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 다음날, 항생제가 첨가되지 않은 새로운 배지 22 mL로 배지를 교체하고 다음과 같이 세포를 형질감염시켰다.Plasmid/Fugene® HD Transfection 혼합물은 Opti-MEM 배지(시약:DNA 비율 3:1)에서 제조하였다. 25 μg(34 μL)의 pCMV-PK1-GLP1R 플라스미드[(DiscoverX pCMV PK 벡터 번들, 전장 인간 GLP1R을 암호화하는 서열이 삽입된 cat # 93-0491 - NCBI 기준 서열: NM_002062, GeneArt(Thermo Fisher Scientific)에서 합성]를 총 부피 1163 μL가 되도록 1129 μL Opti-MEM에 첨가하였다. 이어서 FuGENE® HD Reagent 74 μL를 조심스럽게 혼합하여 첨가하였다. 실온에서 5~10분간 인큐베이션한 후, 1125 μL의 복합체 용액을 세포에 첨가하고 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 배지를 제거하고 300 μg/mL 히그로마이신(Gibco, cat # 10687010) 및 500 μg/mL 제네티신(Gibco, cat # 10131035)을 함유하는 선택 배지를 첨가하였다. 더 이상 사멸 세포가 관찰되지 않을 때까지 배지를 2~3일마다 교체하였다. 세포를 분리하고 300000개 세포/mL로 재현탁한 후 40 μm 스트레이너로 걸러냈다. 이어서 세포를 Aria G 기기를 사용하여 100 μL 배지 내 검정색의 투명 바닥 폴리-D-리신 코팅 96-웰 플레이트의 단일 세포로 FACS 분류하였다. 배지는 최대 80 μL까지 제거하고 선택 항생제가 함유된 새로운 배지를 추가하여 2~3일마다 교체하였다. 생존 단일 클론을 확장하고 테스트하였다. 최적의 신호 및 곡선 프로파일을 기반으로 β-아레스틴 분석을 위해 단일 클론 1을 선택하였다.
β-아레스틴 분석에서 평가된 데이터는 역으로, 본원에 기재된 화합물의 위장 내약성(메스꺼움/구토의 감소)과 상관관계가 있을 수 있다(즉 β-아레스틴 분석에서 화합물의 활성이 낮을수록 내약성이 더 높을 수 있음). 예를 들어, 문헌[Jones et. al. Nat. Commun. 2018, 9, 1602.] 참조.
인간 GLP1R DERET 내재화 및 리사이클링 분석
작용제가 인간 GLP1R을 내재화하거나 리사이클링할 수 있는 정도는 RealTime FRET 기반 'DERET'(Dissociation Enhanced Resonance Energy Transfer) 분석의 최적 버전을 기반으로 측정하였다. 이 기술은 SNAP-Lumi-Terbium(공여체 형광단, Cisbio, cat # SSNPTBD)을 사용한 SNAP-태그 GPCR의 표지화에 의존한다. 화합물을 과량의 플루오레세인(수용체 형광단)의 존재 하에 관심 GPCR을 과발현하는 세포와 함께 인큐베이션한다. GPCR이 세포 표면에 있을 때 공여체 신호는 수용체에 의해 ??칭되고 공여체/수용체 비율은 낮다. GPCR이 내재화됨에 따라 공여체 신호는 더 이상 ??칭되지 않으며 수용체는 더 이상 여기되지 않으므로 공여체/수용자 비율이 증가한다. 과량의 길항제를 추가하면 수용체 내재화가 더 차단되어 수용체가 막으로 다시 리사이클링되어 공여체/수용체 비율이 결과적으로 감소하게 된다.
HEK293-SNAP-hGLP1R-GloSensor 세포(SNAP-태그 hGLP1R을 안정적으로 과발현함)를 일반 DMEM 성장 배지(Gibco, cat # 11965-092, 10% 열 불활성화 FBS, 10 mM HEPES, 1x 페니실린/스트렙토마이신, 0.5 mg/mL 제네티신(Gibco, cat # 10131-035), 및 0.25 mg/mL 히그로마이신 B(Invitrogen, cat # 10687010) 내 백색 384웰 폴리-D-리신 코팅 플레이트(Greiner Bio One, cat # 781945)에서 밤새 시딩하였다. 분석 당일 세포 배지를 제거하고 Opti-MEM 용액에 100 nM SNAP-Lumi-Tb 시약을 첨가하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 분석 완충액[1X HBSS(10X Gibco, cat # 14065-056), 20 mM Hepes(Gibco, cat # 15630-080), 1 mM CaCl2(Fluka, cat # 21114-1L), 1 mM MgCl2(Ambion, cat # AM9530G) pH7.4]에서 플레이트 세척기를 사용하여 세척하고, 0.1% BSA가 포함된 20 μL 완충액을 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 약 15분 동안 세포가 평형화 되도록 하고, 이어서 10 μl의 플루오레세인(나트륨 염, Sigma, cat # F6377, 완충액에 희석)을 25 μM 최종 농도로 첨가하였다. 3중 용량 반응 곡선을 생성하기 위해, 화합물을 분석 완충액에서 연속적으로 3배 희석한 후, 화합물에 따라 최종 부피 40 μL, 최종 최고 농도는 3 μM 이하에서 시작하여 세포 분석 플레이트에 첨가하였다(경우에 따라 다름). 테스트된 화합물과 동일한 플레이트 및 분석 완충액에, EC100을 확립하기 위해 GLP1(7-36) 펩티드(Bachem, cat # H-6795) 대조 곡선을 최종 최고 농도 1 μM로 포함하였다. 완충액만 있는 EC0 웰도 포함하였다. 플레이트 FRET 형광은 LANCE/DELFIA D400 단일 미러, 여기 필터 X320, 및 방출 필터 M615_203(공여체 방출) 및 M515(수용체 방출)가 포함된 Perkin Elmer Envision을 사용하여 즉시 측정한 후 30분마다 측정하였다. 피크 내재화는 120분에 도달했으며, 이 시점에서 작용제 결합을 추가로 차단하기 위해 10 μM(최종) Exendin 9-39(Bachem, cat # H8740, GLP1R 길항제)를 모든 웰에 첨가하였다. 수용체가 막으로 얼마나 잘 리사이클링되는지 확인하기 위해 추가 180분 동안 측정을 계속하였다. 판독 중 플레이트를 37℃로 유지하였다. 데이터는 Microsoft Excel을 사용하여 공여체/수용체 배출 비율로 표시하였고, GraphPad Prism에 플로팅하였다. 내재화에 대한 EC50 및 Emax를 측정하기 위해 데이터를 계산하고 GLP1(7-36) EC100 대조군 웰의 백분율로 표시하였다. [(샘플 신호 - 평균 EC0 신호)/(GLP1(7-36) 신호의 평균 EC100 - 평균 EC0 신호)]*100(Microsoft Excel 사용). GraphPad Prism을 사용하여 EC50 측정을 위한 곡선 피팅을 수행하였다. 4-매개변수 로지스틱 모델인 Hill Slope를 사용하였다:
Y=하단 + (상단-하단)/(1+10^((Log EC50-X)*Hill Slope)),
(식에서, Y는 기능적 반응이고; X는 화합물 농도이고; 하단은 A0 또는 최소값(0 용량)이고; 상단은 Ainf 또는 최대값(무한 용량)이고; EC50은 변곡점(즉, A0와 Ainf 사이의 중간에 있는 S자형 곡선의 지점)임). EC50 값은 μM 단위로 계산하였다. Emax는 GLP1(7-36)에 대한 피팅된 곡선에서 파생된, 농도 범위 내에서 측정된 최대 활성이다. 수용체 리사이클링 매개변수를 측정하기 위해, Ex9-39 첨가 후 각 시점에서 상대 Emax를 계산하고 4-매개변수 S자형 피팅을 사용하여 시간 경과에 따른 곡선을 피팅하였다. 이 모델을 사용하여 수용체가 막으로 다시 리사이클링되는 T1/2률을 측정하였다. 또한 초기에 내재화된 양의 비율로 리사이클링된 수용체의 최대 백분율을 측정하였다.
내재화율이 낮고 수용체 리사이클링율이 빠를수록 수용체가 막에 더 많이 유지된다. 표 5는 수용체 내재화 데이터를 나타낸 것이고 표 6은 수용체 리사이클링 데이터를 나타낸 것이다. 후자의 경우, 더 낮은 T1/2 값은 수용체가 세포 표면으로 더 빠르게 복귀하고 화합물과 상호작용할 수 있는 수용체의 수가 증가했음을 나타낸다(예를 들어 문헌[Jones et. al. Nat. Commun. 2018, 9, 1602.] 참조). 이는 역으로, 기재된 화합물의 내약성과 상관관계가 있을 수 있다(즉, 효능이 낮을수록 내약성은 더 높음).
약동학 실험
마우스 PK:
모든 생체내 실험에 대해, 본원에 개시된 화합물은 화합물의 농도가 1 mg/mL인 PBS 중 스톡 용액으로 제조되었다. 이어서 이 스톡 용액을 식염수로 희석하여 실험에 개시된 농도를 달성하였다.
모든 생체내 실험에 대해, 세마글루티드는 1.34 mg/mL 세마글루티드 스톡 용액인 OZEMPIC이라는 임상 제형으로 구입하였다. 스톡 용액은 비활성 인산이나트륨 이수화물(1.42 mg), 프로필렌 글리콜(14.0 mg), 페놀(5.50 mg), 및 주입용 물을 포함한다. OZEMPIC의 pH는 약 7.4이다. 이어서, 이 스톡 용액을 식염수로 희석하여 본원에 개시된 농도를 달성하였다.
모든 화합물의 경우: 약동학적 매개변수를 얻기 위해, 6주령부터 고지방식(지방으로부터 60% 칼로리)을 공급한 3마리의 C57BL/6 마우스(20~30주령)에게 5 mL/kg의 투여량으로 식염수 중 화합물 0.24 mg/kg을 피하(s.c.) 투여하고 이 때 화합물의 농도는 48 μg/mL였다. 화합물 투여 후, 혈액 샘플을 0일차 투여 후 0.5, 1, 3, 및 6시간에, 이어서 투여 후(즉, 1일차, 2일차, 3일차, 4일차, 7일차, 10일차, 14일차, 및 17일차) 24, 48, 72, 96, 168, 240, 336, 및 408시간에, 꼬리 틈(nick)을 통해 EDTA 코팅 튜브에 수집하였다. 원심분리(13,000 rpm, 4℃, 5분)로 혈장 부분을 수득하고, 생체분석을 위해 마우스 혈장의 30 μL 분취량을 96웰 플레이트로 옮겼다. 보정 표준 및 QC 샘플을 블랭크 마우스 혈장(처치되지 않은 마우스의 혈장)에서 준비하였다. PK 샘플을 블랭크 마우스 혈장(10 μL 샘플 + 10 μL 블랭크 마우스 혈장)으로 2회 희석하고, 내부 표준물질을 함유하는 150 μL 메탄올의 첨가를 수반하는 단백질 침전 절차를 사용하여 추출하였다. 샘플을 볼텍싱하고 4℃에서 15분 동안 4000 rpm으로 원심분리하였다. 125 μL의 상청액 분취량을 96웰 플레이트로 옮기고 100 μL의 물을 각 웰에 첨가하고 볼텍싱하였다. 샘플을 하기에 요약된 조건을 사용하여 LC-MS/MS로 분석 및 정량화하였다.
LC/MS/MS 방법
질량 분석계: Thermo QExactive HFX
액체 크로마토그래피: Thermo Vanquish
오토샘플러(ALS): Thermo Vanquish
HPLC 조건
LC 컬럼: Waters Acquity UPLC Protein BEH C4, 50x2.1 mm, 1.7 um
용매 A: 100:0.1(v : v) 물: 포름산
용매 B: 100:0.1(v : v) 아세토니트릴: 포름산
주입 부피: 10 μL
컬럼 오븐 온도: 40℃
ALS 온도: 4℃
MS 조건
이온 소스: HESI
극성: 양성
보조 가스 히터 온도: 380℃
차단 가스 유량: 60
보조 가스 유량: 14
스위프 가스 유량: 3
이온 스프레이 전압: 3500 V
모세관 온도: 320℃
시노몰구스 원숭이 PK:
약동학적 매개변수를 수득하기 위해 비만 수컷 시노몰구스 원숭이에게 0.5 mL/kg의 투여량을 사용하여, 식염수 중 제형 농도가 30, 60, 또는 90 μg/mL인 단일 s.c. 화합물의 용량을 투여하였다. 원숭이에게 먹이를 주기 전 아침에 투여하였지만 금식시키지는 않았다. 원숭이를 정의된 간격(투여 전, 투약 후 0.25, 0.5, 1, 3, 7, 24, 48, 96, 168, 240, 336, 및 504시간)으로 복재 정맥을 통해 채혈하였다. 혈액을 K2EDTA가 들어 있는 진공관에 넣고 원심분리할 때까지 얼음 위에 보관하였다. 혈장 부분은 4℃에서 10분간 1000~2000 RCF(일반적으로 1300 RCF)에서 원심분리하여 수득하였다. 원숭이 혈장의 50 μL 분취량을 생체분석을 위해 96웰 플레이트로 옮겼다. 보정 표준 및 QC 샘플을 블랭크 시노몰구스 비만 원숭이 혈장(처치되지 않은 비만 원숭이의 혈장)에서 준비하였다. PK 샘플을 블랭크 비만 원숭이 혈장(10 μL 샘플 + 10 μL 블랭크 비만 원숭이 혈장)으로 2회 희석하고, 내부 표준물질을 함유하는 150 μL 메탄올의 첨가를 수반하는 단백질 침전 절차를 사용하여 추출하였다. 샘플을 볼텍싱하고 4℃에서 15분 동안 4000 rpm으로 원심분리하였다. 125 μL의 상청액 분취량을 96웰 플레이트로 옮기고 100 μL의 물을 각 웰에 첨가하고 볼텍싱하였다. 샘플을 요약된 조건을 사용하여 LC-MS/MS로 분석 및 정량화하였다.
표 8 및 9에서 평가된 데이터는 세마글루티드와 비교하여, 본 화합물의 대사 분해에 대한 우수한 생체내 안정성에 대한 증거를 제공한다.
효능 연구: 급성 음식 섭취 연구:
식염수 중 제형 농도가 24, 38, 또는 48 μg/ml인 각 테스트 화합물(투여량 5 mL/kg)(예를 들어, 화합물 1)의 단일 SC 피하(s.c.) 투여 후 음식 섭취량(FI)을 식이 유발 비만(DIO) 수컷 마우스(6주령부터 고지방식이(지방으로부터 60% 칼로리)를 공급한 C57BL/6 마우스)에서 평가하였다. 연구에는 24~30주령의 수컷을 사용하였다. 마우스를 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 정상적인 조명 주기실(오전 6시~오후 6시 조명 켜기, 그 외 조명 끄기)에 케이지당 한 마리씩 수용하였다. 평균 음식 섭취량(FI)(연구 시작 전 3일 동안 측정된 24시간 음식 섭취량)을 기준선으로 사용하였다. 연구가 시작될 때, 음식의 무게를 기록하고 마우스에게 테스트 화합물을 피하 투여하였다. 음식 섭취량 무게는 테스트 화합물 투여 24시간 후에 측정하였다. 비만 쥐의 24시간 후 음식 섭취량(FI)은 지시된 용량의 화합물을 단일 용량으로 피하 투여한 후 평가하였다; 결과 데이터는 표 10에 제공되어 있다. 비교하기 위해, 세마글루티드의 효과를 평가하였다.
효능 연구
화합물(예를 들어, 화합물 1) 처치 후 효능(음식 섭취 및 체중 감소)을 식이 유발 비만(DIO) 수컷 마우스(6주령부터 고지방식이(지방으로부터 60% 칼로리)를 공급한 C57BL/6 마우스)에서 평가하였다. 연구에는 24~30주령의 수컷을 사용하였다(그룹당 n= 7). 마우스를 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 정상적인 조명 주기실에 케이지당 한 마리씩 수용하였다. 체중(BW) 및 음식 섭취량(FI)(24시간 음식 섭취량, 연구 시작 전 3일 동안 측정)의 평균을 기준으로 마우스를 비히클(식염수) 또는 처치 그룹에 할당하였다. 연구 시작 시, 체중과 음식 무게를 기록하고, 마우스에게 비히클 또는 화합물(5 ml/kg의 용량을 사용하여 식염수 중 12, 24, 29.6, 38, 또는 48 ug/ml)을 피하 투여하였다. 화합물 또는 비히클은 QD로 제공되거나 지시된 경우 Q3D(3일마다)로 제공하였다. 세마글루티드를 QD로 투여하였다. 체중과 음식 섭취량을 매일 측정하였다. 화합물 1 및 세마글루티드의 용량은 (i) 별도의 연구에서 및 공개된 데이터(세마글루티드)와 인라인으로 평가된 최대 효능 및 (ii) 등몰 농도를 기준으로 선택하였다. 입체이성질체(화합물 2 및 3)의 용량은 별도의 연구에서 평가된 화합물 1의 최대 효능을 기준으로 선택하였다.
화합물의 피하 투여 18일, 24일, 및 30일 후 비만 마우스의 체중 감소가 표 11에 제공되어 있다. 테스트 화합물 및 비히클은 투여량에 따라 QD 또는 Q3D로 투여하였고; 세마글루티드는 QD로 투여하였고; 모든 화합물은 식염수에 용해하였다.
Cyno 효능 연구:
신규한 지속형 GLP1R 작용제(화합물 1)의 약동학(PK)/약력학(PD) 관계를 BW 및 FI에 대한 효과를 평가함으로써 비만 시노몰구스 원숭이에서 평가하였다. 효능을 FI 및 BW의 감소로 정의하였다. 내약성은 구토의 감소 및/또는 부재, 및 간식으로 선별된 과일, 채소, 및 땅콩에 대한 관심의 유지로 평가하였다.
원숭이를 적어도 1주 동안 연구 식이(5TUR 식이, 1 g 펠렛(TestDiet Cat # 1815639-310))에 적응시켰다. 적응 기간 이후, 기준 음식 섭취량(FI)을 설정하기 위해 투여 첫 날 1주일 전의 음식 섭취량을 기록하였다. 기준 체중은 투여 첫날 전, 7일 기간 내에 수득한 2개의 독립적인 측정값의 평균으로 계산하였다.
10마리의 비만 시노몰구스 원숭이 수컷에게 비히클(n=4) 또는 화합물(n=6)(0.5 mL/kg의 투여량을 사용하여 0.03 mg/kg, 따라서 0.06 mg/mL 농도)을 피하(s.c.) 주사하였다. 테스트 화합물을 지시된 농도의 식염수에 용해시켰다. 원숭이에게 먹이를 주기 전 아침에 투여하였지만 금식시키지는 않았다. 연구 기간 동안 음식 섭취량을 매일 측정하였다. 원숭이에게는 미리 무게를 측정한 양의 음식(1일 200 g)을 제공하였다; 할당량의 절반은 아침에 제공하고 나머지는 오후에 제공하였다. 매일 FC를 측정하기 위해 다음날 아침 남은 음식의 무게를 측정하였다. 체중(BW)은 일주일에 두 번 측정하였다.
화합물 1은 비만 원숭이의 음식 섭취를 억제하고 체중을 감소시킨다(표 12 및 13 참조). 모든 데이터는 평균 ± SEM(그룹당 n= 7)으로 표시된다.
내약성 평가:
뜻밖에도, 본원에 기재된 화합물은 비만 원숭이에게 투여되었을 때 내약성이 훨씬 우수하다는 것이 밝혀졌다(비교체로서 세마글루티드에 대해 평가함). 화합물 1, 2, 5, 또는 9를 투여한 후 어떤 원숭이도 구토 징후를 보이지 않았고, 1/6의 원숭이가 화합물 3을 투여한 후 구토를 보인 반면, 세마글루티드를 투여 받은 원숭이는 모두 구토하였다(표 14 참조).
화학 부문
A: 분석 부문
LCMS 방법:
방법 A
방법 B
방법 C
방법 D
방법 E
방법 F
방법 G
방법 H
방법 I
방법 J
방법 K
B: 합성 부문
중간체 1 : 벤질 11-브로모운데카노에이트
DCM(26.5 kg) 중 11-브로모운데칸산(4.60 kg, 17.3 mol, 1.1 당량)의 혼합물에 EDCI(3.8 kg, 20.2 mol, 1.28 당량)를 DMAP(98 g, 0.8 mol, 0.05 당량)와 함께 0℃에서 조금씩 첨가하였다 이어서, 벤질 알코올(1.70 kg, 15.7 mol, 1.00 당량)을 적가하였다. 20℃에서 4시간 동안 교반한 후, 물(70.0 kg)을 적가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 진공 하에 농축하였다. 헵탄(23.2 kg) 및 19% NaCl 용액(17 kg)을 첨가하고 상을 분리하였다. 유기상을 5% Na2CO3(25.0 kg); 19% NaCl 용액(25.0 kg(x2)), 5.2% HCl 수용액(25.0 kg), 19% NaCl 용액(25.0 kg), 물(5.0 kg), 및 염수(5.0 kg)로 세척하였다. 이어서, 유기상을 진공 하에 50℃에서 농축하여 중간체 1을 제공하고 이를 그대로 다음 단계에 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 1.18 - 1.36 (m, 10 H) 1.37 - 1.47 (m, 2 H) 1.64 (quin, J = 7.33 Hz, 2 H) 1.85 (dt, J = 14.56, 7.06 Hz, 2 H) 2.35 (t, J = 7.58 Hz, 2 H) 3.40 (t, J = 6.88 Hz, 2 H) 5.11 (s, 2 H) 7.28 - 7.45 (m, 5 H).
중간체 2 : 1,11-디벤질 11-(tert-부틸) 도코산-1,11,11-트리카복실레이트
NMP(30 L) 중의 벤질 tert-부틸 말로네이트(3.0 kg, 12.0 mol, 1.0 당량)의 용액에 1-요오도운데칸(3.55 kg, 12.58 mol, 1.05 당량), 및 Cs2CO3(11.76 kg, 36.09 mol, 3.0 당량)을 20℃에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20℃에서 6시간 동안 교반한 후 중간체 1(5.53 kg, 15.6 mol, 1.3 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 85℃까지 가열하고 12시간 동안 교반하였다. 이어서 혼합물을 20℃까지 냉각시키고 물(30 kg)과 헵탄(10 kg)의 혼합물을 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, 유기상을 분리하고 염수(5 kg)와 MeOH(4 kg)의 혼합물로 3회 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피(헵탄/EtOAc = 1/0 내지 100/1로 용리)로 추가 정제를 수행하여 중간체 2를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.84 - 0.94 (m, 3 H) 1.12 (m, J = 6.60 Hz, 4 H) 1.19 - 1.33 (m, 28 H) 1.35 (s, 9 H) 1.66 (quin, J = 7.40 Hz, 2 H) 1.85 (t, J = 8.44 Hz, 4 H) 2.37 (t, J = 7.52 Hz, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 5.16 (s, 2 H) 7.30 - 7.42 (m, 10 H).
중간체 3 : 13-(벤질옥시)-2-((벤질옥시)카보닐)-13-옥소-2-운데실트리데칸산
헵탄(21 L) 중의 중간체 2(6.0 kg, 8.8 mol, 1.0 당량)의 용액에 TFA(10.0 kg, 88.4 mol, 10.0 당량)를 20 ± 5℃에서 적가하였다. 20 ± 5℃에서 적가하였다. 8시간 동안 20 ± 5℃에서 교반한 후, 대부분의 TFA를 감압 하에 제거하고 생성된 잔류물을 헵탄(42 L, 7 V)에 재용해하고 염수(42 L x 3)로 세척하였다. 상 분리 후, 유기상을 농축하여 미정제 생성물을 황색 오일로서 제공하였다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피(헵탄:EtOAc = 10/1로 용리)로 정제하여 중간체 3을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.87 - 0.94 (m, 3 H) 0.94 - 1.05 (m, 2 H) 1.19 (br. s., 14 H) 1.23 - 1.37 (m, 16 H) 1.65 (quin, J = 7.40 Hz, 2 H) 1.78 - 1.91 (m, 2 H) 1.93 - 2.05 (m, 2 H) 2.37 (t, J = 7.52 Hz, 2 H) 5.14 (s, 2 H) 5.27 (s, 2 H) 7.31 - 7.44 (m, 10 H).
라세미체 중간체 3의 순수한 거울상이성질체를 키랄 SFC를 통해 분리하여 순수거울상 중간체 3A 및 3B를 제공하고 이를 각각 화합물 2 및 3을 제조하는 데 사용하였다. 순수거울상 중간체 3A 및 3B를 수득하기 위한 매개변수는 다음과 같다:
기기: Thar 350 분취용 SFC(SFC-18)
컬럼: ChiralPak AD, 300×50 mm I.D., 10 μm
이동상: CO2에 대한 A 및 에탄올에 대한 B
구배: B 40%
유량: 200 mL/분
배압: 100 bar
컬럼 온도: 38℃
파장: 210 nm
사이클 타임: 약 3.7 분
피크 1: R 거울상이성질체(3A)
피크 2: S 거울상이성질체(3B)
거울상이성질체 3A의 절대 배열은 이의 유도체(하기에 표시됨)에 의해 측정되었다; 즉, 거울상이성질체 3A를 첫 번째 단계에서 DMF 중 옥살릴클로라이드와 반응시킨 후, 생성된 산 염화물을 (S)-1-(4-니트로페닐)-에탄-1-아민과 반응시키고, 이어서 Pd/C 존재 하에 수소로 처리하여 하기에 나타낸 구조가 생성되었고, 이로부터 단일 X선 결정을 수득하였다. 따라서 키랄 SFC에 의해 분리된 거울상이성질체 혼합물의 피크 2는 S-배열과 연관되었으며 거울상이성질체 3A의 절대 배열이 R이라는 측정에 따라 거울상이성질체 3B에 할당되었다.
중간체 4 : 14-((벤질옥시)카보닐)-3,15-디옥소-1-페닐-14-운데실-2,19,22,25,28, 31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85,88-펜타코사옥사-16-아자헤노나콘탄-91-오익산
플라스크에 중간체 3(640 g, 1.03 mol), DCM(8.3 kg), 및 DMF(3 g)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 25℃에서 교반한 후 옥살릴 클로라이드(170 g, 1.34 mol)를 적가하였다. 추가로 2~3시간 동안 교반을 계속하였다. 반응 혼합물을 농축하고 헵탄으로 용매를 교환하여 미정제 혼합물을 수득하였고, 여기에 8.5 kg DCM을 첨가하여 용액을 형성하고 다음 단계에서 직접 사용하였다.
플라스크에 1-아미노-3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72-테트라코사옥사펜타헵타콘탄-75-오익산(아민-PEG24-산, 900 g, 0.79 mol), DCM(6.0 kg), 및 DIPEA(203 g)를 첨가하고 생성된 혼합물을 25℃에서 교반하였다. 이어서, 1 단계로부터의 아실 클로라이드 미정제 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 추가로 1~2시간 동안 교반하였다. 산성 수지(1.3 kg)를 첨가하고 30분 동안 계속 교반하였다. 이어서, 혼합물을 여과하였다. MgSO4(1.3 kg)를 첨가하고 30분 동안 계속 교반하였다. 혼합물을 여과하고 농축하여 미정제 잔류물을 제공하였다. 미정제 잔류물을 MTBE, DCM, MeOH를 포함하는 이동상을 사용하여 Al2O3로 정제하였다. 이어서 목적하는 분획을 모두 수집하고 농축하여 중간체 4를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.86 - 0.93 (m, 3 H) 0.93 - 1.04 (m, 2 H) 1.19 (br. s., 15 H) 1.23 - 1.37 (m, 15 H) 1.61 - 1.68 (m, 2 H) 1.78 (td, J = 12.44, 4.34 Hz, 2 H) 1.92 - 2.05 (m, 2 H) 2.37 (t, J = 7.58 Hz, 2 H) 2.62 (t, J = 6.05 Hz, 2 H) 3.49 (dd, J = 6.72, 2.32 Hz, 2 H) 3.52 - 3.59 (m, 2 H) 3.59 - 3.73 (m, 92 H) 3.80 (t, J = 6.05 Hz, 2 H) 5.13 (s, 2 H) 5.18 (s, 2 H) 7.31 - 7.42 (m, 10 H) 8.09 (t, J = 5.26 Hz, 1 H).
중간체 5 : 77,87-디벤질 1-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 76-옥소-77-운데실-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33 ,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사-75-아자헵타옥타콘탄-1,77,87-트리카복실레이트
DCM(6.1 kg) 중의 중간체 4(920 g, 0.53 mol)의 용액에 TEA(11 g)를 첨가하고 생성된 혼합물을 교반하여 투명한 용액을 제공하였다. 이어서, DSC(161 g, 0.63 mol)를 첨가하고 25℃에서 2시간 동안 계속 교반하였다. 산성 수지(180 g)를 첨가하고 이 혼합물을 30분 동안 교반하였다. MgSO4(180 g)를 첨가하고 30분 동안 계속 교반하였다. 이어서, 혼합물을 여과하여 투명한 담황색 용액을 제공하였다. 진공 하에 농축하여 미정제 중간체 5를 수득하고, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다. LCMS 방법 A: Rt = 1.5분, [M+H3O+H]+2 = 933.9.
중간체 6 : 2-((75-((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시)-75-옥소-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사펜타헵타콘틸)카바모일)-2-운데실트리데칸디오익산
수소화 반응기에 중간체 5(986 g, 0.48 mol, 순도 90%), THF(7.6 kg), 및 10% Pd/C(110 g)를 첨가한 다음 MgSO4(110 g)를 첨가하고 생성된 혼합물을 N2에 이어 H2로 퍼징하고 25℃에서 3~24시간 동안 교반하였다. 출발 물질이 완전히 소비된 후, MgSO4(220 g)를 더 첨가하고 추가로 30분 동안 계속 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하였다. 케이크를 THF 100 mL로 세척하고, 여과액을 합하고 농축하여 중간체 6을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.84 - 0.94 (m, 3 H) 1.17 (br. s., 2 H) 1.21 - 1.39 (m, 30 H) 1.57 - 1.68 (m, 2 H) 1.69 - 1.80 (m, 2 H) 1.97 - 2.10 (m, 2 H) 2.34 (t, J = 7.21 Hz, 2 H) 2.86 (s, 4 H) 2.92 (t, J = 6.48 Hz, 2 H) 3.51 - 3.73 (m, 96 H) 3.87 (t, J = 6.48 Hz, 2 H) 7.45 (t, J = 4.46 Hz, 1 H).
중간체 7 : 1-벤질 3-(tert-부틸) 2-운데실말로네이트
벤질 tert-부틸 말로네이트(110 g, 439 mmol, 1 당량)를 DMF(800 mL)에 용해시켰다. 생성된 혼합물에 1-요오도운데칸(130 g, 461 mmol, 1.05 당량) 및 K2CO3(151 g, 1.10 mol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 50℃에서 12시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(500 mL)로 희석한 후, 얼음물에 부었다. 합한 유기상을 염수(150 mL)로 2회 세척하고, 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축하여 미정제 잔류물을 제공하였다. 미정제 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1로 용리)로 정제하여 중간체 7을 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 7.46 - 7.26 (m, 5H), 5.27 - 4.98 (m, 2H), 3.44 - 3.26 (m, 1H), 1.72 (br d, J = 6.8 Hz, 2H), 1.33 (s, 9H), 1.28 - 1.10 (m, 18H), 0.93 - 0.75 (m, 3H).
중간체 8 : 1-벤질 3-(tert-부틸) 2-알릴-2-운데실말로네이트
NaH(14.5 g, 364 mmol, 60%, 1.2 당량)를 0℃에서 DMF(1230 mL)에 적가한 후, DMF(123 mL) 중 중간체 7(123 g, 304 mmol, 1 당량)을 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 0.5시간 동안 교반한 후, 알릴 브로마이드(40.4 g, 334 mmol, 29 mL, 1.1 당량)를 적가하였다. 반응 혼합물을 20℃에서 9.5시간 동안 교반한 후, 에틸 아세테이트(2500 mL)로 희석하였다. 혼합물을 빙냉 포화 NH4Cl4(1200 mL)에 부었다. 유기상을 수성상으로부터 분리하고, 수성상을 에틸 아세테이트로 2회 세척하였다. 이어서, 유기상을 합하고, 염수(500 mL)로 3회 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축하여 잔류물을 제공하였다. 이 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 98/2로 용리)로 정제하여 중간체 8을 황색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 7.50 - 7.26 (m, 5H), 5.70 - 5.50 (m, 1H), 5.24 - 5.01 (m, 4H), 4.99 - 4.74 (m, 1H), 1.70 (br s, 2H), 1.45 - 1.34 (m, 3H), 1.27 (s, 9H), 1.25 - 1.15 (m, 18H), 0.85 (br t, J = 6.8 Hz, 3H).
중간체 8A 및 8B : 1-벤질 3-(tert-부틸) 2-알릴-2-운데실말로네이트
중간체 8(159 g)을 SFC 분리(컬럼: Chiralpak IG-3 100 * 4.6 mm I.D., 3 um; 이동상: A: CO2 B: 이소프로판올(0.05% DEA); 구배: 5분 내 5% 내지 40% 및 2.5분 동안 40% 유지, 이어서 2.5분 동안 5% B 유지, 유량: 2.5 mL/분; 컬럼 온도: 35℃ ABPR: 1500 psi)를 통해 정제하고 중간체 8A(피크 1) 및 중간체 8B(피크 2)를 제공하였다. LCMS 방법 B: Rt = 1.334분, MS (ESI) m/z [M+Na]+ = 467.3. SFC: 중간체 8A(피크 1), 순수 거울상이성질체(R); SFC: 중간체 8B(피크 2), 순수 거울상이성질체(S).
중간체 9 : 벤질 데크-9-에노에이트
DCM(1400 mL) 중의 데크-9-엔산(70.0 g, 411 mmol, 76.0 mL, 1 당량)의 용액에 BnOH(66.6 g, 616 mmol, 64.1 mL, 1.5 당량), DMAP(5.02 g, 41.12 mmol, 0.1 당량), EDCI(94.5 g, 493.3 mmol, 1.2 당량), 및 DIEA(63.7 g, 493 mmol, 85.9 mL, 1.2 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 DCM(500 mL)으로 희석하였다. 생성된 용액을 염수(500 mL)로 2회 세척하고, Na2SO4로 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축하여 미정제 잔류물을 제공하였다. 미정제 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1로 용리)로 정제하여 중간체 9를 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 7.46 - 7.29 (m, 5H), 5.78 (dd, J = 10.4, 16.8 Hz, 1H), 5.13 - 5.05 (m, 2H), 5.03 - 4.77 (m, 2H), 2.38 - 2.26 (m, 2H), 2.13 - 1.92 (m, 2H), 1.62 - 1.48 (m, 2H), 1.38 - 1.28 (m, 2H), 1.28 - 1.15 (m, 6H).
중간체 10A: 1,11-디벤질 11-(tert-부틸)( R ) 도코스-8-엔-1,11,11-트리카복실레이트
중간체 8A(26.0 g, 58.4 mmol, 1 당량) 및 중간체 9(30.4 g, 116 mmol, 2 당량)를 CH2Cl2(520 mL)에 용해시켰다. 이어서 Grubbs II(2.38 g, 3.80 mmol, 0.065 당량)를 첨가하고 생성된 혼합물을 40℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축하여 미정제 잔류물을 제공하였다. 이 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1로 용리)로 정제하여 중간체 10A를 무색 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 B: Rt = 1.456분, [M+Na]+ = 699.6.
중간체 11A: S)-13-(벤질옥시)-2-((벤질옥시)카보닐)-13-옥소-2-운데실트리데크-4-엔산
중간체 10A(50.0 g, 73.8 mmol, 1 당량)를 TFA(500 mL)에 용해시키고, 생성된 혼합물을 25℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축하여 미정제 잔류물을 수득하고, 이를 에틸 아세테이트(500 mL)에 용해시킨 다음 포화 NaHCO3(500 mL)로 2회 및 염수(100 mL)로 세척하고 Na2SO4로 건조하고 여과하고 농축하여 미정제 잔류물을 제공하였다. 이 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1로 용리)로 정제하여 중간체 11A를 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 7.44 - 7.14 (m, 10H), 5.41 (br s, 1H), 5.22 - 4.86 (m, 5H), 2.49 - 2.41 (m, 2H), 2.37 - 2.28 (m, 2H), 1.95 - 1.83 (m, 2H), 1.76 - 1.65 (m, 2H), 1.58 - 1.46 (m, 2H), 1.34 - 0.98 (m, 25H), 0.90 - 0.76 (m, 3H). LCMS 방법 B: Rt = 1.323분, [M+H]+ = 622.3 .
중간체 12A: 1,11-디벤질 11-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)(R)-도코스-8-엔-1,11,11-트리카복실레이트
CH2Cl2(260 mL) 및 THF(29 mL) 중의 중간체 11A(29.0 g, 46.7 mmol, 1 당량)의 용액에 NHS(5.64 g,49.0 mmol, 1.05 당량) 및 DCC(11.5 g, 56.0 mmol, 11.3 mL, 1.2 당량)을 25℃에서 첨가하고, 생성된 혼합물을 25℃에서 5시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 여과하고 CH2Cl2(30 mL)로 3회 세척하였다. 유기상을 농축하여 미정제 잔류물을 제공하였다. 미정제 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 85/15로 용리)로 정제하여 중간체 12A를 담황색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 7.37 - 7.20 (m, 10H), 5.53 - 5.34 (m, 1H), 5.24 - 5.16 (m, 1H), 5.15 - 5.12 (m, 2H), 5.16 - 5.12 (m, 2H), 5.07 - 5.00 (m, 2H), 2.73 (br s, 4H), 2.66 - 2.53 (m, 2H), 2.34 - 2.16 (m, 2H), 1.97 - 1.77 (m, 4H), 1.70 - 1.47 (m, 3H), 1.37 - 0.99 (m, 26H), 0.88 - 0.65 (m, 3H). LCMS 방법 B: Rt = 1.348분, [M+H]+ = 718.6.
중간체 13A: ( S )-14-((벤질옥시)카보닐)-3,15-디옥소-1-페닐-14-운데실-2, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49 , 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88-펜타코사옥사-16-아자헤노나콘트-11-엔-91-오익산
DMF(3 mL) 중 중간체 12A(545 mg, 0.759 mmol)에 1-아미노-3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72-테트라코사옥사펜타콘탄-75-오익산(아민-PEG24-산, 1131 mg, 0.987 mmol) 및 DIPEA(0.199 mL, 1.139 mmol)를 첨가하였다. 16시간 후, 반응이 완료되었다.휘발성 물질을 제거하고 생성된 잔류물을 RPLC(ISCO C18 Gold 150 g 컬럼, 0.1% TFA를 포함하는 10~100% ACN:물 구배로 용리) 상에서 직접 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결하고, 동결건조하여 중간체 13A를 걸쭉한 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 H: Rt = 2.93분, [M+H]+ = 1750.5.
중간체 14A: 77,87-디벤질 1-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)-( S )-76-옥소-77-운데실-3, 6, 9, 12, 15, 18, 21,24, 27, 30 , 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72-테트라코사옥사-75-아자헵타옥타콘트-79-엔-1,77,87-트리카복실레이트
5 mL 무수 DCM에 용해된 중간체 13A(183 mg, 0.105 mmol)에 DSC(32.2 mg, 0.126 mmol) 및 DIPEA(0.027 mL, 0.157 mmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 16시간 동안 교반한 후, 반응을 종결시켰다. 미정제 혼합물을 DCM 평형 ISCO Gold 40 g 컬럼에 직접 주입하고 NPLC(DCM 중 0~30% MeOH로 용리, 실리카)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 14A를 걸쭉하고 투명한 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 H: Rt = 2.79분, [M+H]+ = 1847.5.
중간체 15A : ( S )-2-((75-((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시)-75-옥소-3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 , 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69,72-테트라코사옥사펜타헵타콘틸)카바모일)-2-운데실트리데칸디오익산
중간체 14A(165 mg, 0.089 mmol)를 2 mL의 무수 THF에 용해시키고 대기를 배기시키고 질소로 3회 교체하였다. 이 혼합물에 10% 탄소상 팔라듐(9.51 mg, 8.94 μmol)을 첨가하고 대기를 진공화하고 자석 교반을 통해 벌룬으로부터의 수소로 교체하였다. 16시간 후, 반응이 완료되었다. 반응 혼합물을 5 mL 무수 DCM으로 희석한 후 Celite®를 통해 여과하였다. 탄소상 팔라듐 및 패드를 5 mL DCM으로 2회 세척하고 모든 유기상을 합하고 농축하여 중간체 15A를 제공하였다. LCMS 방법 F: Rt = 3.29분, [M+H]+ = 1669.5.
중간체 10B: 1,11-디벤질 11-(tert-부틸)( S) -도코스-8-ene-1,11,11-트리카복실레이트
중간체 8B(36.0 g, 80.9 mmol, 1 당량) 및 중간체 3(42.1 g, 161 mmol, 2 당량)을 CH2Cl2(720 mL)에 용해시킨 후 Grubbs II(3.30 g, 5.26 mmol, 0.065 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 40℃에서 1시간 동안 교반한 후 진공에서 농축하여 미정제 잔류물을 제공하였다. 미정제 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1로 용리)로 정제하여 중간체 10B를 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 7.45 - 7.25 (m, 10H), 5.50 - 5.30 (m, 1H), 5.20 - 5.02 (m, 5H), 2.48 - 2.40 (m, 1H), 2.39 - 2.23 (m, 3H), 1.96 - 1.83 (m, 3H), 1.79 - 1.64 (m, 1H), 1.61 - 1.45 (m, 3H), 1.40 - 1.14 (m, 22H), 1.13 - 0.94 (m, 3H), 1.14 - 0.93 (m, 3H), 0.87 - 0.80 (m, 1H). LCMS 방법 B: RT = 1.448분, [M-56+H]+ = 622.3.
중간체 11B: ( R )-13-(벤질옥시)-2-((벤질옥시)카보닐)-13-옥소-2-운데실트리데크-4-엔산
중간체 10B(62 g, 91.59 mmol, 1 당량)를 TFA(620 mL)에 용해시키고 생성된 혼합물을 25℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 미정제 잔류물을 제공하였다. 미정제 잔류물을 에틸 아세테이트(800 mL)에 용해시킨 다음 포화 NaHCO3(200 mL)로 2회 및 염수(100 mL)로 세척하고 Na2SO4를 사용하여 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제 잔류물을 제공하였다. 미정제 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 0/1로 용리)로 정제하여 중간체 11B를 황색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 13.15 - 12.55 (m, 1H), 7.54 - 6.92 (m, 10H), 5.54 - 5.33 (m, 1H), 5.25 - 4.94 (m, 5H), 2.47 (br d, J = 7.2 Hz, 1H), 2.33 (br t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.97 - 1.83 (m, 2H), 1.79 - 1.63 (m, 2H), 1.60 - 1.45 (m, 2H), 1.38 - 0.96 (m, 26H), 0.92 - 0.76 (m, 3H).LCMS 방법 B: RT = 1.323분, MS (ESI) m/z [M+H]+ = 621.6.
중간체 12B: 1,11-디벤질 11-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)( S )-도코스-8-엔-1,11,11-트리카복실레이트
CH2Cl2(243 mL) 및 THF(27 mL) 중의 중간체 11B(27 g, 43.4 mmol, 1 당량)의 용액에 NHS(5.26 g, 45.6 mmol, 1.05 당량) 및 DCC(10.7 g, 52.1 mmol, 10.5 mL, 1.2 당량)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 25℃에서 6시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 여과하고 CH2Cl2(30 mL)로 3회 세척하여 여과액을 제공한 후 농축하여 미정제 잔류물을 제공하였다. 미정제 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 1/0 내지 85/15로 용리)로 정제하여 중간체 12B를 담황색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 13.15 - 12.55 (m, 1H), 7.54 - 6.92 (m, 10H), 5.54 - 5.33 (m, 1H), 5.25 - 4.94 (m, 5H), 2.47 (br d, J = 7.2 Hz, 1H), 2.33 (br t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.97 - 1.83 (m, 2H), 1.79 - 1.63 (m, 2H), 1.60 - 1.45 (m, 2H), 1.38 - 0.96 (m, 26H), 0.92 - 0.76 (m, 3H). LCMS 방법 B: Rt = 1.348분, [M+H]+ = 718.5.
중간체 13B: ( R )-14-((벤질옥시)카보닐)-3,15-디옥소-1-페닐-14-운데실-2,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49 ,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85,88-펜타코사옥사-16-아자헤노나콘트-11-엔-91-오익산
중간체 12B(1.07 g, 1.49 mmol)를 1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사펜타콘탄-75-오익산(Biopharm, 1.88 g, 1.64 mmol), DIPEA(390 μL, 2.236 mmol), 및 DMAP(18 mg, 0.05 mmol)로 처리하였다. 16시간 후, 반응이 완료되었다. 휘발성 물질을 제거하고 생성된 잔류물을 RPLC(ISCO C18 Gold 150 g 컬럼, 0.1% TFA를 포함하는 10~100% ACN:물 구배로 용리)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 동결하고, 동결건조하여 중간체 13B를 걸쭉한 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 C: Rt = 4.04분, [M+2H]2+ = 875.8.
중간체 14B: 77,87-디벤질 1-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)-( R )-76-옥소-77-운데실-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30 ,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사-75-아자헵타옥타콘트-79-엔-1,77,87-트리카복실레이트
중간체 13B(312 mg, 0.178 mmol)를 1-하이드록시피롤리딘-2,5-디온(24.63 mg, 0.214 mmol)과 함께 1.8 mL 무수 DCM에 용해시킨 후 DCM(Aldrich, 196 μL) 중 1 M DCC로 처리하여 디시클로헥실 우레아 부산물의 즉각적 침전을 생성하였다. 16시간 후, 반응이 완료되었고 반응 혼합물을 DCM 평형 ISCO Gold 40그램 컬럼에 직접 주입하고 NPLC(DCM 중 0~30% MeOH 용리, 실리카)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 14B를 걸쭉하고 투명한 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 F: Rt = 4.21분, [M+H+H2O]+ = 1864.4.
중간체 15B: ( R )-2-((75-((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시)-75-옥소-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33 ,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사펜타헵타콘틸)카바모일)-2-운데실트리데칸디오익산
중간체 14B(172 mg, 0.093 mmol)를 1.8 mL의 무수 THF에 용해시키고 대기를 배기시키고 질소로 3회 교체하였다. 이 혼합물에 10% 탄소상 팔라듐(10 mg, 9.4 umol)을 첨가하고 대기를 진공화하고 자석 교반을 통해 벌룬으로부터의 수소로 교체하였다. 16시간 후, 반응이 완료되었다. 반응 혼합물을 5 mL 무수 DCM으로 희석한 후 Celite®를 통해 여과하였다. 탄소상 팔라듐 및 셀라이트-케이크를 5 mL DCM으로 2회 세척하고 여과하였다. 모든 유기물을 합하고 농축하여 중간체 15B를 제공하였다. LCMS 방법 F: Rt = 3.31분, [M+H]+ = 1669.0.
중간체 16: 1,11-디벤질 11-(2,5-디옥소시클로펜틸) 도코산-1,11,11-트리카복실레이트
1000 mL 3구 둥근 바닥 플라스크(기계적 교반기 및 질소 주입구가 장착됨)에 중간체 3(37.7 g, 60.5 mmol), DCM(360 mL, 비율: 9.0), 및 THF(40 mL, 비율: 1.0)을 첨가하고, 이어서 N-하이드록시석신이미드(7.31 g, 63.6 mmol) 및 DCC(14.99 g, 72.6 mmol)를 첨가하였다. 첨가 5분 후, 생성된 혼합물은 백색 현탁액이 되었다. 반응 혼합물을 실온에서 총 6시간 동안 교반한 후 Celite® 패드로 여과하였다. 패드를 DCM(2 베드 부피)으로 철저히 세척하였다. 합한 유기상을 진공에서 농축하고, 미정제 잔류물을 진공 하에 건조하였다. 미정제 생성물을 백색 오일로서 단리하였다. 미정제 생성물에 DCM(약 400 mL) 및 실리카겔(75 g)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 진공에서 농축하고 잔류물을 고진공 하에 3시간 동안 건조하였다. 배치를 컬럼 크로마토그래피(750 g SiO2겔, 2% 에틸 아세테이트/헵탄에서 35% 에틸 아세테이트/헵탄으로 용리)를 통해 정제하였다. 분획을 함유하는 생성물을 합하고, 진공에서 농축하고, 고진공 하에 밤새 건조하여 중간체 16을 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ ppm 0.86 - 0.93 (m, 3 H) 1.12 - 1.21 (m, 2 H) 1.21 - 1.37 (m, 30 H) 1.66 (quin, J = 7.40 Hz, 2 H) 1.89 - 2.07 (m, 4 H) 2.37 (t, J = 7.58 Hz, 2 H) 2.84 (br. s., 4 H) 5.13 (s, 2 H) 5.25 (s, 2 H) 7.30 - 7.47 (m, 10 H).
중간체 17 : 14-((벤질옥시)카보닐)-3,15-디옥소-1-페닐-14-운데실-2,19,22,25,28,31,34,37,40-노나옥사-16-아자트리테트라콘탄-43-오익산
250 mL 둥근 바닥 플라스크(자석 교반기 및 질소 주입구가 장착됨)에 중간체 16(7.0 g, 9.72 mmol) 및 DCM(70 mL)을 첨가한 후 1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코산-27-오익산(아미노-PEG8-산)(4.51 g, 10.21 mmol), DIPEA(4.25 mL, 24.31 mmol), 및 DMAP(0.119 g, 0.972 mmol)를 첨가하였다. 생성된 담황색 균질 용액을 밤새 주위 온도에서 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 진공에서 농축하여 담황색 오일성 잔류물을 제공하였다. 이어서, 이 잔류물을 에틸 아세테이트(150 mL)로 희석하고, 용액을 500 mL 분리 깔때기로 옮겼다. 이어서, 용액을 염수(500 mL)로 세척하였다. 생성된 수성상을 에틸 아세테이트(150 mL, 이어서 100mL)로 역추출하였다. 합한 유기상을 건조하고(황산나트륨 사용), Celite®로 여과하고 진공에서 농축하였다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피(330 g SiO2겔, DCM 내지 10% 메탄올/DCM으로 용리)를 통해 정제하였다. 주요 생성물을 함유하는 분획을 합하고 진공에서 농축하였다. 잔류물을 밤새 고진공 하에 건조하여 중간체 17을 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.43분, [M+H]+ = 1047.0
중간체 18 : 29,39-디벤질 1-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 28-옥소-29-운데실-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사-27-아자노나트라이아콘탄-1,29,39-트리카복실레이트
중간체 17(5.51 g, 5.27 mmol)을 함유한 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 DCM(27.5 mL, 비율: 1.0) 및 THF(27.5 mL, 비율: 1.0)를 첨가한 다음 DCC(1.412 g, 6.85 mmol) 및 N-하이드록시석신이미드(0.697 g, 6.06 mmol)를 첨가하였다. 약 10분 동안 교반한 후, 생성된 혼합물은 걸쭉한 백색 현탁액이 되었다. 이어서, 반응 혼합물을 주위 온도에서 3시간 45분 동안 교반하고 진공에서 농축하여 백색 페이스트를 제공하였다. 혼합물에 DCM(35 mL)을 첨가하고, 생성된 백색 현탁액을 10분 동안 교반하였다. 이어서 혼합물을 Celite® 패드로 여과하고 패드를 차가운 DCM(1 베드 부피)으로 세척하였다. 합한 여과액을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 밤새 고진공 하에 건조하여 중간체 18을 무색 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.45분, [M+H]+ = 1044.0.
중간체 19 : 2-((27-((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시)-27-옥소-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코실)카바모일)-2-운데실트리칸디오익산
250 mL 둥근 바닥 플라스크(자석 교반기가 장착됨)에 중간체 18(6.0 g, 5.25 mmol) 및 THF(70 ml)를 첨가하였다. 이 용액에 10% Pd/C(0.603 g, 0.567 mmol)를 첨가하고, 반응 용기를 질소에 이어 수소로 퍼징하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 3시간 동안 수소(벌룬 압력)에 노출시켰다. 반응 용기를 질소로 퍼징하고 현탁액을 Celite® 패드로 여과하였다. 패드를 THF로 철저히 세척하고 합한 여과물을 진공에서 농축하였다. 이어서, 생성된 잔류물을 고진공 하에 밤새 건조하여 중간체 19를 무색 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 0.91분, [M+H]+ = 963.8.
중간체 20 : 14-((벤질옥시)카보닐)-3,15-디옥소-1-페닐-14-운데실-2,19,22-트리옥사-16-아자펜타코산-25-오익산
250 mL 둥근 바닥 플라스크(자석 교반 막대 장착됨)에 중간체 16(5.0 g, 6.94 mmol) 및 DCM(부피: 100 mL)을 첨가한 다음, 3-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)프로판산(아미노-PEG2-산, 1.231 g, 6.94 mmol), DIPEA(3.03 mL, 17.36 mmol), 및 DMAP(0.085 g, 0.694 mmol)를 첨가하였다. 생성된 백색 현탁액을 주위 온도에서 22시간 동안 교반하였다. LCMS는 상당한 NHS 에스테르 출발 물질이 남아 있음을 나타내었다. 이어서, 반응 혼합물을 40℃까지 가온하고 5.5시간 동안 계속 교반하였다. 혼합물을 주위 온도로 냉각시킨 후 진공에서 농축하여 백색 페이스트를 제공하였다. 혼합물에 에틸 아세테이트(150 mL)를 첨가하였다. 용액을 염수(150 mL)와 함께 500 mL 분리 깔대기로 옮겼다. 상을 분리하고 수성상을 에틸 아세테이트(150 mL)로 2회 추출하였다. 합한 유기상을 건조하고(황산나트륨 사용), Celite®로 여과하고 진공에서 농축하였다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피(120 g 실리카겔, 0.5% 메탄올/DCM 내지 60% 메탄올/DCM으로 용리)를 통해 정제하였다. TLC에 의한 주요 생성물(5% 메탄올/DCM)을 함유하는 분획을 합하고, 진공에서 농축하고, 생성된 잔류물을 밤새 고진공 하에 건조하여 중간체 20을 무색 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.45분, [M+H]+ = 782.8.
중간체 21 : 디벤질 2-((2-(2-(3-((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시)-3-옥소프로폭시)에톡시)에틸)카바모일)-2-운데실트리데칸디오에이트
500 mL 둥근 바닥 플라스크(자석 교반기 및 질소 주입구가 장착됨)에 중간체 20(3.7 g, 4.73 mmol), DCM(19 mL, 비율: 1.0), 및 THF(19 mL, 비율: 1.0)를 첨가한 후, N-하이드록시석신이미드(0.626 g, 5.44 mmol) 및 DCC(1.269 g, 6.15 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 3시간 동안 교반하였고, 이때 이 혼합물은 백색 현탁액이 되었다. 이어서, 현탁액을 Celite®로 여과하고 패드를 DCM으로 세척하였다. 합한 여과액을 진공에서 농축하였다. 이어서 생성된 잔류물을 DCM(20 mL)에 현탁시키고 혼합물을 주위 온도에서 10분 동안 교반한 다음 Celite® 패드로 여과하였다. 패드를 차가운 DCM으로 세척하였다. 합한 여과액을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 밤새 진공 하에 건조하여 중간체 21을 담황색 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.47분, [M+H]+ = 879.7.
중간체 22 : 2-((2-(2-(3-((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시)-3-옥소프로폭시)에톡시)에틸)카바모일)-2-운데실트리데칸디오익산
중간체 21(4.16 g, 4.73 mmol)을 함유한 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 THF(40 mL)를 첨가하였다. 이 용액에 10% Pd/C(0.42 g, 3.93 mmol)를 첨가하고, 용기를 질소로 퍼징하였다. 이어서 반응 용기를 수소로 퍼징하고 수소 압력(벌룬)에 노출시켰다. 생성된 흑색 현탁액을 4시간 동안 교반한 후 Celite® 패드로 여과하였다. 패드를 THF로 세척하였다. 합한 여과물을 진공에서 농축한 다음, 진공 하에 건조하여 중간체 22를 무색 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 G: Rt = 1.72분, [M+H]+ = 699.4.
중간체 23 : 벤질 11-브로모운데카노에이트
2 L 3구 둥근 바닥 플라스크(기계적 교반기, 온도 프로브, 및 질소 주입구가 장착됨)에 11-브로문데칸산(50 g, 189 mmol) 및 500 mL 디클로로메탄을 첨가하였다. 생성된 오렌지색 균질 용액에 벤질 알코올(23.53 mL, 226 mmol), EDCI HCl(54.2 g, 283 mmol), 및 DMAP(1.152 g, 9.43 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. TLC 분석(헵탄 중 30% 에틸 아세테이트)은 11-브로문데칸산의 소비를 나타냈다. 반응 혼합물을 2 L 둥근 바닥 플라스크로 옮기고 진공에서 농축하였다. 생성된 잔류물을 물 1 L 및 MTBE 800 mL로 희석하였다. 상을 분리하고, 수성상을 MTBE 600 mL로 2회 추출하였다. 합한 유기상을 염수 750 mL로 세척하고, 황산나트륨으로 건조하고, Celite®로 여과하고, 진공에서 농축하였다. 이 물질을 고진공 하에 2시간 동안 건조하여 담황색 오일을 제공하였다. 미정제 생성물을 500 mL DCM에 용해시키고 100 g 실리카겔을 첨가하였다. 혼합물을 진공에서 농축한 다음, 고진공 하에 밤새 건조하였다. 잔류물을 크로마토그래피(750 g 실리카 컬럼, 1% EtOAc/헵탄 내지 20% EtOAc/헵탄 구배로 용리)를 통해 정제하였다. 벤질 11-브로마운데카노에이트 함유 분획을 합하고 진공에서 농축하였다. 잔류물을 고진공 하에 5시간 동안 건조하여 중간체 23을 무색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.58 - 7.31 (m, 5H), 5.14 (s, 2H), 3.43 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.38 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.87 (p, J = 7.0 Hz, 2H), 1.73 - 1.61 (m, 2H), 1.49 - 1.40 (m, 2H), 1.37 - 1.26 (m, 10H).
중간체 24 : 1,11,21-트리벤질 11-tert-부틸 헤니코산-1,11,11,21-테트라카복실레이트
기계적 교반기, 온도 프로브, 및 질소 주입구가 장착된 250 mL 3구 둥근 바닥 플라스크에 벤질 tert-부틸 말로네이트(6 g, 23.97 mmol) 및 30 mL DMF를 첨가한 다음 중간체 23(18.74 g, 52.7 mmol)과 60 mL DMF의 혼합물을 첨가하였다. 이 무색 용액에 탄산세슘(31.2 g, 96 mmol)을 첨가하고 생성된 현탁액을 주위 온도에서 교반하였다. 주위 온도에서 5.5시간 동안 교반한 후, LCMS는 벤질 tert-부틸 말로네이트가 존재하지 않음을 나타내었다. 반응 혼합물은 모노- 및 디-알킬화된 생성물의 혼합물이었다. 따라서 혼합물을 22시간 동안 교반하였지만, LCMS는 모노알킬화 중간체가 여전히 남아 있음을 나타냈다. 이어서, 반응 혼합물을 40℃까지 가열하고 3시간 동안 교반하였다. LCMS는 여전히 최소한의 진전을 나타냈다. 혼합물을 0~5℃까지 냉각시키고 200 mL의 탈이온(DI)수를 엷은 스트림으로 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 주위 온도까지 가온하고 500 mL 분리 깔때기로 옮겼다. 수성상을 MTBE 200 mL로 2회 추출하였다. 합한 유기상을 염수 200 mL로 세척하고, 황산나트륨으로 건조하고, Celite®로 여과하고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 고진공 하에 2시간 동안 건조하여 미정제 무색 생성물을 수득하고, 이를 NPLC(330 g ISCO 실리카 컬럼, 0.5% 에틸 아세테이트/헵탄 내지 30% 에틸 아세테이트/헵탄 구배로 용리)를 통해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 합하고 진공에서 농축하였다. 잔류물을 밤새 진공하에 건조하여 중간체 24를 무색 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.75분, [M+H+H2O]+ = 821.3.
중간체 25 : 13-(벤질옥시)-2-(11-(벤질옥시)-11-옥소운데실)-2-((벤질옥시)카보닐)-13-옥소트리데칸산
자석 교반 막대 및 질소 주입구가 장착된 1 L 둥근 바닥 플라스크에 중간체 24(17.78 g, 22.25 mmol) 및 180 mL TFA를 첨가하고 생성된 혼합물을 45분 동안 교반하였다. LCMS 분석에서 남은 출발 물질이 없음을 나타내면, 혼합물을 진공에서 농축하여 담황색 오일을 제공하였다. 생성된 오일을 250 mL 톨루엔으로 희석한 다음 진공에서 농축하여 남은 TFA를 제거하였다. 이 최종 단계는 한 번 반복되었다. 잔류물을 주말 동안 고진공 하에 건조하여 중간체 25를 담황색 오일로서 제공하고, 이를 다음 단계에서 그대로 사용하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.55분, [M+H+H2O]+ = 760.4.
중간체 26 : 1,11,21-트리벤질 11-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)헤니코산-1,11,11,21-테트라카복실레이트
중간체 25(16.53 g, 22.25 mmol)를 함유하는 500 mL 둥근 바닥 플라스크에 180 mL DCM 및 20 mL THF를 첨가한 다음, N-하이드록시석신이미드(2.69 g, 23.36 mmol) 및 DCC(5.51 g, 26.7 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 밤새 교반한 후 LCMS는 목적하는 생성물로의 완전한 전환을 나타내었다. 생성된 백색 현탁액을 Celite® 패드로 여과하고 패드를 2 베드 부피의 DCM으로 세척하였다. 합한 여과물을 진공에서 농축하여 무색 오일을 제공하고, 생성된 오일을 고진공 하에 1시간 동안 건조하여 21.3 g의 미정제 생성물을 제공하였다. 미정제 생성물을 250 mL DCM에 용해시키고 32 g 실리카겔을 첨가하였다. 혼합물을 진공에서 농축한 다음, 고진공 하에 2시간 동안 건조하였다. 잔류물을 카트리지 건식 로딩 NPLC(330 g 실리카겔 컬럼, 5% 에틸 아세테이트/헵탄 내지 40% 에틸 아세테이트/헵탄 구배로 용리)를 통해 정제하였다. 분획을 함유하는 생성물을 합하고, 진공에서 농축하고, 고진공 하에 밤새 건조하여 중간체 26을 무색 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.58분, [M+H+H2O]+ = 857.4.
중간체 27 : 14-(11-(벤질옥시)-11-옥사운데실)-14-((벤질옥시)카보닐)-3,15-디옥소-1-페닐-2,19,22,25,28,31,34, 37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85,88-펜타코사옥사-16-아자헤노나콘탄-91-오익산
중간체 26(479 mg, 0.503 mmol)을 5.7 mL 무수 DCM에 용해시켰다. 이어서 이 용액을 1-아미노 3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사펜타헵타콘탄-75-오익산(686 mg, 0.599 mmol), DIPEA(149 μL,0.855 mmol), 및 DMAP(7 mg, 0.057 mmol)로 처리하고 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 16시간 후, LC/MS 분석을 통해 반응을 완료하고 휘발성 물질을 회전증발기로 제거하였다. 미정제 생성물을 NPLC(24 g ISCO Gold 실리카 컬럼, DCM 중 0~20% MeOH로 용리)로 정제하여 중간체 27을 걸쭉한 오일로서 생성하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.35분, [M+H]+ = 1871.9.
중간체 28 : 77,87-디벤질 1-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 77-(11-(벤질옥시)-11-옥사운데실)-76-옥소-3,6,9,12,15,18 ,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사-75-아자헵타옥타콘탄-1,77,87-트리카복실레이트
중간체 27(764 mg, 0.408 mmol)을 4 mL DCM 중 1-하이드록시피롤리딘-2,5-디온(56.4 mg, 0.490 mmol)으로 처리하였다. 이 혼합물에 DCM(Aldrich, 0.499 mL, 0.499 mmol) 중 1 M DCC 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 질소 하에 교반되도록 하였다. 16시간 후, 반응이 완료되었다. 휘발성 물질을 제거하고 잔류물을 NPLC(24 gram ISCO Gold 컬럼, DCM 중 0~15% MeOH로 용리)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 28을 생성하였다. LCMS 방법 F: Rt = 4.03분, [M+2H]2+ = 985.1.
중간체 29 : 11-((75-((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시)-75-옥소-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사펜타헵타콘틸)카바모일)헤니코산-1,11,21-트리카복실산
중간체 28(500 mg, 0.254 mmol)을 교반 막대를 사용하여 2.5 mL 무수 THF에 용해시켰다. 대기를 배기시키고 질소로 3회 교체하였다 이어서, 10% 탄소상 팔라듐(Aldrich, 27 mg, 0.025 mmol)을 조심스럽게 첨가하고 플라스크를 배기시켰다. 대기는 벌룬 저장소의 수소로 교체하였다. 반응 혼합물을 밤새 16시간 동안 교반하였고, 이때 LC/MS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 5 mL 무수 DCM으로 희석하고 Celite®를 통해 여과하였다. 여과물을 농축하여 중간체 29를 걸쭉하고 투명한 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 F: Rt = 2.60분, [M+2H]2+ = 849.9.
중간체 30 : 벤질 12-브로모운데카노에이트
12-브로모도데칸산(2 g, 7.16 mmol), 벤질 알코올(1.16 g, 10.74 mmol), 및 EDC HCl(2.06 g,10.74 mmol)을 24 mL DCM에 합하였다. 이 용액에 DMAP(44 mg, 0.358 mmol)를 한 번에 첨가하고, 생성된 혼합물을 밤새 교반되도록 하였다. LCMS 분석은 반응이 약 90% 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 NPLC(헵탄 중 0~15% EtOAc로 용리, 실리카)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 목적하는 생성물인 중간체 30을 제공하였다. 1H NMR: (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.47 - 7.31 (m, 5H), 5.14 (s, 2H), 3.43 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.38 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.88 (p, 2H), 1.67 (p, 2H), 1.50 - 1.39 (m, 2H), 1.35 - 1.26 (m, 12H).
중간체 31 : 1,12,23-트리벤질 12-(tert-부틸)트리코산-1,12,12,23-테트라카복실레이트, 1,12-디벤질 1-(tert-부틸)도데칸-1,1,12-트리카복실레이트
중간체 30(1 g, 2.71 mmol), 벤질 tert-부틸 말로네이트(276.4 mg, 1.104 mmol) 및 오일 중 수소화나트륨 60%(97 mg, 2.43 mmol)를 12 mL 무수 DMF에 합하고 생성된 혼합물을 오븐 건조된 둥근 바닥 플라스크에서 질소 분위기 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 16시간 후, LCMS 분석은 목적하는 생성물로의 완전한 전환을 나타냈다. 반응 혼합물을 물과 EtOAc 사이에 분배하고 EtOAc(2 x 20 mL)로 세척하였다. 유기상을 합하고, 염수로 세척하고, 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 회전증발기로 농축하였다. 미정제 생성물을 NPLC(헵탄 중 0~60% EtOAc로 용리, 실리카, ELSD 검출)로 정제하였다. 과량의 SM 브로마이드가 먼저 용리되고 신속하게 모노 알킬화된 생성물이 두 번째로 용리되고 이어서 목적하는 생성물이 용리되었다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 31을 투명한 점성 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.73분, [M+H+H2O]+ = 845.0.
중간체 32 : 14-(벤질옥시)-2-(12-(벤질옥시)-12-옥소도데실)-2-((벤질옥시)카보닐)-14-옥소테트라데칸산
중간체 31(650 mg, 0.786 mmol)을 DCM(7.2 mL)에 용해시키고 TFA(0.605 mL, 7.86 mmol)로 처리하였다 16시간 후, LC/MS ELSD 신호에 의해 나타난 바와 같이 반응이 완료되었다. 휘발성 물질을 제거하고 생성된 잔류물을 NPLC(DCM 중 0~5% MeOH로 용리, 실리카)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 32를 투명한 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.57분, [M+H]+ + 771.9.
중간체 33 : 1,12,23-트리벤질 12-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일)트리코산-1,12,12,23-테트라카복실레이트
중간체 32(310 mg, 0.402 mmol)를 1-하이드록시피롤리딘-2,5-디온(50.9 mg, 0.442 mmol) 및 DCM(Aldrich, 422 μl, 0.422 mmol) 중 1 M DCC와 함께 3.6 mL DCM에 용해시켰다. 15분 후 DCU 부산물의 침전이 관찰되었다. 반응 혼합물을 밤새 교반한 후 LC/MS가 생성물로의 완전한 전환을 나타내었다. 휘발성 물질을 부분적으로 제거하고 유성 생성물을 NPLC(헵탄 중 0~30% EtOAc로 용리, 실리카)로 정제하여 중간체 33을 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.49분, [M+H+H2O]+ = 886.5.
중간체 34 : 15-(12-(벤질옥시)-12-옥소도데실)-15-((벤질옥시)카보닐)-3,16-디옥소-1-페닐-2,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86, 89-펜타코사옥사-17-아자도노나콘탄-92-오익산
중간체 33(127.6 mg, 0.147 mmol)를 1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사펜타콘탄-75-오익산(Biopharm, 168 mg, 0.147 mmol), DIPEA(38.5 μL,0.220 mmol), 및 DMAP(1.8 mg, 0.0015 mmol)로 처리하였다. 16시간 후, 반응이 본질적으로 완료되었다. 휘발성 물질을 제거하고 잔류물을 NPLC(DCM 중 0~15% MeOH로 용리, 실리카)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 34를 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.41분, [M+2H]2+ = 951.6.
중간체 35 : 77,88-디벤질 1-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 77-(12-(벤질옥시)-12-옥소도데실)-76-옥소-3,6,9,12,15,18 ,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사-75-아자옥타옥타콘탄-1,77,88-트리카복실레이트
중간체 34(194 mg, 0.102 mmol)를 1 mL DCM에 용해시키고 1-하이드록시피롤리딘-2,5-디온(11.75 mg,0.102 mmol) 및 DCM(Aldrich, 0.107 mL, 0.107 mmol) 중 1 M DCC로 처리하였다. 15분 후 DCU의 침전이 관찰되었다. 16시간 후, LC/MS에 의해 나타난 바와 같이 반응이 완료되었다. 휘발성 물질을 제거하여 유성 잔류물을 생성하였다. 이 물질을 NPLC(DCM 중 0~15% MeOH로 용리, 실리카, ELSD 검출)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 목적하는 생성물인 중간체 35를 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.40분, [M+2H+H2O]2+ = 1008.2.
중간체 36 : 12-((75-((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시)-75-옥소-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사펜타헵타콘틸)카바모일)트리코산-1,12,23-트리카복실산
중간체 35(130 mg, 0.065 mmol)를 THF(2 mL)에 용해시키고 생성된 혼합물을 질소로 3회 퍼징하였다. 10% 탄소상 팔라듐(36.4 mg, 0.033 mmol)을 조심스럽게 첨가하고 대기를 배기시킨 후 벌룬 저장소의 수소로 교체하였다. LC/MS 분석(ELSD 검출)에 의해 나타난 바와 같이 반응은 16시간 후에 완료되었다. NPLC(DCM 중 MeOH로 용리, 실리카, 0~20%)에 의해 정제를 달성하고 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 36을 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 0.64분, [M+2H]2+ = 864.0.
중간체 37 : 벤질 14-브로모테트라데카노에이트
14-브로모테트라데칸산(1.00 gm, 3.25 mmol), 벤질 알코올(677 μL, 6.51 mmol), 및 EDC HCl(936 mg, 4.89 mmol)을 DCM(11 mL)에 합하였다. 이 용액에 DMAP(19.9 mg, 0.163 mmol)를 한 번에 첨가하고, 생성된 혼합물을 밤새 교반되도록 하였다. 이 후, LC/MS 분석에 의해 나타난 바와 같이 반응이 완료되었다. 휘발성 물질을 제거하고 생성된 잔류물을 NPLC(헵탄 중 0~15% EtOAc로 용리, 실리카)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 목적하는 중간체 37을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.33 - 7.22 (m, 5H), 5.04 (s, 2H), 3.34 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.28 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.78 (p, 2H), 1.58 (p, J = 7.3 Hz, 2H), 1.39 - 1.31 (m, 2H), 1.25 - 1.16 (m, 16H).
중간체 38 : 1,14,27-트리벤질 14-(tert-부틸) 헵타코산-1,14,14,27-테트라카복실레이트, 1,14-디벤질 1-(tert-부틸) 테트라데칸-1,1,14-트리카복실레이트
중간체 37(713 mg, 1.793 mmol), 벤질 tert-부틸 말로네이트(187 mg, 0.747 mmol), 및 오일 중 60% 수소화나트륨(65.7 mg, 1.644 mmol)를 무수 DMF(8 mL)에 합하고, 오븐 건조된 둥근 바닥 플라스크에서 질소 분위기 하에 60℃에서 밤새 교반하였다. 24시간 후, LC/MS 분석 결과 모노 및 비스 알킬화된 말로네이트 생성물이 존재하는 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 추가의 벤질 14-브로모테트라데카노에이트(229.2 mg, 0.57 mmol) 및 오일 중 60% 수소화나트륨(45 mg, 1.13 mmol)으로 처리하였다. 16시간 후, LC/MS에 의해 나타난 바와 같이 반응이 본질적으로 완료되었다. 반응 혼합물을 물 10 mL와 EtOAc 10 mL 사이에 조심스럽게 분배하였다. 수성상을 EtOAc 10 ml로 세척하였다. 유기상을 합하고, 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 회전증발기로 농축하였다. 미정제 생성물을 NPLC(헵탄 중 0~35% EtOAc로 용리, 실리카, ELSD 검출)로 정제하였다. 과량의 출발 물질인 브로마이드가 먼저 빠르게 용리되었고, 모노 알킬화된 생성물이 두 번째로 용리된 후 목적하는 생성물이 용리되었다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 38을 투명한 점성 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.87분, [M+Na]+ = 905.7.
중간체 39 : 16-(벤질옥시)-2-(14-(벤질옥시)-14-옥소테트라데실)-2-((벤질옥시)카보닐)-16-옥소헥사데칸산
중간체 38(290.4 mg, 0.329 mmol)을 DCM(3 mL)에 용해시킨 후 TFA(0.25 mL, 3.29 mmol)로 처리하였다. 16시간 후, LC/MS ELSD 신호에 의해 나타난 바와 같이 반응이 완료되었다. 휘발성 물질을 제거하고 생성된 잔류물을 NPLC(DCM 중 0~5% MeOH로 용리, 실리카)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 39를 투명한 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.65분, [M+H]+= 828.1.
중간체 40 : 1,14,27-트리벤질 14-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 헵타코산-1,14,14,27-테트라카복실레이트
중간체 39(170.4 mg, 0.206 mmol)를 1-하이드록시피롤리딘-2,5-디온(35.6 mg, 0.309 mmol) 및 DCM 중 1 M DCC(Aldrich, 212 μL, 0.212 mmol)와 함께 DCM(2 mL)에 용해시켰다. 10분 후 DCU의 침전이 관찰되었다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였고, 이때 LC/MS는 생성물로의 완전한 전환을 나타냈다. 휘발성 물질을 부분적으로 제거하고 유성 생성물을 NPLC(헵탄 중 0~40% EtOH로 용리, 실리카)로 정제하여 중간체 40을 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.69분, [M+H]+ = 924.4.
중간체 41 : 17-(14-(벤질옥시)-14-옥소테트라데실)-17-((벤질옥시)카보닐)-3,18-디옥소-1-페닐-2,22,25,28,31,34,37, 40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73,76,79,82,85,88,91-펜타코사옥사-19-아자테트라노나콘탄-94-오익산
중간체 40(119.8 mg, 0.130 mmol)을 1.3 mL DCM 용액 중 1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사펜타헵타콘탄-75-오익산(149 mg, 0.130 mmol), DIPEA(34.0 μL,0.194 mmol), 및 DMAP(1.584 mg, 0.0013 mmol)로 처리하였다. 16시간 후, 반응이 본질적으로 완료되었다. 휘발성 물질을 제거하고 잔류물을 NPLC(DCM 중 0~65% MeOH로 용리, 실리카)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 41을 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.56분, [M+2H]2+ = 978.9.
중간체 42 : 77,90-디벤질 1-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 77-(14-(벤질옥시)-14-옥소테트라데실)-76-옥소-3,6,9,12,15,18 ,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사-75-아자노나콘탄-1,77,90-트리카복실레이트
중간체 41(144.2 mg, 0.074 mmol)을 700 μL DCM에 용해시키고 1-하이드록시피롤리딘-2,5-디온(12.73 mg, 0.111 mmol) 및 DCM 중 1 M DCC(디시클로헥실메탄디이민)(Aldrich, 0.077 mL, 0.077 mmol)로 처리하였다. 15분 후 DCU의 침전이 관찰되었다. 16시간 후, LC/MS에 의해 나타난 바와 같이 반응이 완료되었다. 휘발성 물질을 제거하여 유성 잔류물을 생성하였다. 이 물질을 ELSD 검출(DCM 중 0~25% MeOH로 용리, 실리카)을 사용하는 NPLC로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 목적하는 생성물인 중간체 42를 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 1.55분, [M+2H+H2O]2+ = 1036.2/
중간체 43 : 14-((75-((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시)-75-옥소-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사펜타헵타콘틸)카바모일)헵타코산-1,14,27-트리카복실산
중간체 42(118.8 mg, 0.058 mmol)를 교반 막대로 둥근 바닥 플라스크에서 THF 3.75 mL에 용해시켰다. 생성된 혼합물을 질소로 3회 퍼징한 다음, 30.8 mg(0.029 mmol)의 10% Pd/C를 첨가하였다. 대기를 배기시키고 벌룬의 수소로 교체하였다. 16시간 후 반응이 완료되었다. 반응 혼합물을 10 mL DCM으로 희석하고, Celite®를 통해 여과하고, 여과액을 농축 건조하였다. NPLC에 의한 정제(DCM 중 MeOH로 용리, 실리카, 0~20%) 및 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 43을 제공하였다. LCMS 방법 E: Rt = 0.86분, [M+2H]2+ = 892.0.
중간체 44 : 벤질 15-브로모펜타데카노에이트
15-브로모펜타데칸산(1949 mg, 6.07 mmol), 벤질 알코올(984 mg, 9.10 mmol), 및 EDCI HCl(1744 mg, 9.10 mmol)을 24 mL DCM에 합하였다. 이 용액에 DMAP(37.1 mg, 0.303 mmol)를 한 번에 첨가하고, 생성된 혼합물을 32시간 동안 교반하였다. 32시간 후, 반응은 본질적으로 완료되었다. 반응 혼합물을 물과 DCM 사이에 분배하였다. 유기상을 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과하였다. 휘발성 물질을 제거하고 생성된 잔류물을 NPLC(헵탄 중 0~15% EtOAc로 용리, 실리카, ELSD 검출)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 44를 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) δ 7.29 - 7.22 (m, 5H), 5.02 (s, 2H), 3.31 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.26 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.76 (p, 2H), 1.54 (p, J = 7.3 Hz, 2H), 1.36 - 1.30 (m, 2H), 1.22 - 1.16 (m, 18H).
중간체 45 : 1,15,29-트리벤질 15-(tert-부틸) 노나코산-1,15,15,29-테트라카복실레이트, 1,15-디벤질 1-(tert-부틸)펜타데칸-1,1,15-트리카복실레이트
중간체 44(1013 mg, 2.461 mmol), 벤질 tert-부틸 말로네이트(280 mg, 1.119 mmol), 및 오일 중 60% 수소화나트륨(98 mg, 2.461 mmol)를 무수 DMF(5.6 mL)에 합하고, 오븐 건조된 둥근 바닥 플라스크에서 질소 분위기 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 물 10 mL에 조심스럽게 붓고 EtOAc 10 mL로 3회 추출하였다. 유기상을 합하고, 염수 및 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 생성물을 NPLC(헵탄 중 0~60% EtOAc로 용리, 실리카, ELSD 검출)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 45를 투명한 점성 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 H: Rt = 4.23분, [M+H+H2O]+ = 928.9.
중간체 46 : 17-(벤질옥시)-2-(15-(벤질옥시)-15-옥소펜타데실)-2-((벤질옥시)카보닐)-17-옥소헵타데칸산
중간체 45(750 mg, 0.823 mmol)를 DCM(8.23 mL)에 용해시키고 TFA(634 μL, 8.23 mmol)로 처리하였다. 16시간 후. 반응이 부분적으로 완료되었다. 반응 혼합물을 일주일 동안 교반한 채로 방치하였고, 이 후 본질적으로 완료되었다. 생성된 유성 잔류물을 ELSD 검출과 함께 NPLC(헵탄 중 0~25% EtOAc로 용리, 실리카)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 농축하여 중간체 46을 수득하였다. LCMS 방법 H: Rt = 3.70분, [M+H+H2O]+ = 873.2.
중간체 47 : 1,15,29-트리벤질 15-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 노나코산-1,15,15,29-테트라카복실레이트
중간체 46(435 mg, 0.509 mmol) 및 1-하이드록시피롤리딘-2,5-디온(64.4 mg, 0.560 mmol)을 5 mL 무수 DCM(5 mL)에 현탁시키고 DCM 중 1 M DCC(Aldrich, 534 μL, 0.534 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 교반하였다. 15분 후 미세 침전물(ppt)이 형성되어 DCU가 형성되었음을 시사하였다. 16시간 후, LC/MS에 의해 나타난 바와 같이 반응이 완료되었다. 증발에 의해 휘발성 물질을 제거하였다. 유성 잔류물을 NPLC(DCM 중 0~10% MeOH로 용리, 실리카, ELSD 검출)로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 47을 제공하였다. LCMS 방법 I: Rt = 3.62분, [M+H2O+H]+ = 970.1.
중간체 48 : 18-(15-(벤질옥시)-15-옥소펜타데실)-18-((벤질옥시)카보닐)-3,19-디옥소-1-페닐-2,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71,74,77,80,83,86, 89,92-펜타코사옥사-20-아자펜타노나콘탄-95-오익산
중간체 47(143 mg, 150 mmol)을 1-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사펜타콘탄-75-오익산(198 mg, 0.173 mmol), DIPEA(48.5 μL, 0.375 mmol), 및 DMAP(2 mg, 0.109 mmol)과 함께 2dram 스크류 캡 바이알 내 1.5 mL DCM에 용해시켰다. 생성된 혼합물을 밤새 교반되도록 하였다. 이어서, 휘발성 물질을 제거하고 생성된 잔류물을 NPLC(DCM 중 0~10% MeOH로 용리, 실리카)를 통해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 48을 투명한 반고체로서 제공하였다. LCMS 방법 I: Rt = 2.53분, [M+2H+2H2O]2+ = 1010.1.
중간체 49 : 77,91-디벤질 1-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 77-(15-(벤질옥시)-15-옥소펜타데실)-76-옥소-3,6,9,12,15,18 ,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사-75-아자헤노나콘탄-1,77,91-트리카복실레이트
중간체 48(210 mg, 0.106 mmol) 및 1-하이드록시피롤리딘-2,5-디온(13.4 mg, 0.116 mmol)을 오븐 건조된 10 mL 둥근 바닥 플라스크(RBF)에서 교반하면서 1 mL 무수 DCM에 현탁시켰다. 이 혼합물에 DCM 중 1 M DCC(Aldrich, 116 μL, 0.116 mmol)를 첨가하였다. 16시간 후, LC/MS에 의해 나타난 바와 같이 반응이 완료되었다. 휘발성 물질을 제거하고 생성된 잔류물을 NPLC(DCM 중 0~15% MeOH로 용리, 실리카, ELSD 검출)로 정제하였다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 합하고 농축하여 중간체 49를 왁스성 고체로서 생성하였다. LCMS 방법 H: Rt = 3.48분, [M+H2O+2H]2+ = 1049.9.
중간체 50 : 15-((75-((2,5-디옥소피롤리딘-1-일)옥시)-75-옥소-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72-테트라코사옥사펜타헵타콘틸)카바모일)노나코산-1,15,29-트리카복실산
교반 막대가 장착된 둥근 바닥 플라스크에서 중간체 49(140 mg, 0.067 mmol)를 무수 THF(1 mL)에 용해시키고 생성된 혼합물을 N2로 3회 퍼징하였다. 이어서, 탄소상 건조 10% Pd(7 mg, 6.73 umol) 및 탄소상 20% Pd 수산화물(Aldrich)(5 mg, 6.73 umol)을 첨가하고 대기를 배기시키고 벌룬으로부터의 수소로 교체하였다. 반응 혼합물을 16시간 동안 교반되도록 하였다. 이어서 대기를 배기시키고 N2로 교체하였다. 반응 혼합물을 5 mL 무수 DCM으로 희석하였다. Celite®를 통해 여과한 후, 휘발성 물질을 제거하여 중간체 50을 점성 오일로서 제공하였다. LCMS 방법 D: Rt = 1.36분, [M+2H]2+ = 906.2.
펩티드 합성:
GLP1 펩티드는 표준 합성 기술, 예를 들어 문헌[Jose Palomo RSC Adv., 2014, 4, 32658-32672]에 언급된 바와 같은 고체상 펩티드 합성 기술, 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor (1989)] 및 유사 참조문헌에 기술된 바와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 합성될 수 있다.
GLP-1 유사체 합성: [Fmoc-His7, Aib8, Arg34]GLP-1(7-37)
펩티드는 표준 Fmoc 화학을 사용하여 합성하였다.
1) 수지 제조: 1-클로로-2-[클로로(디페닐)메틸]벤젠(100 mmol, 1.00 당량)에 DCM(4.00 mL) 중 Fmoc-Gly-OH(50 mol, 0.50 당량) 및 DIEA(400 mmol, 4.00 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 질소 분위기 하에 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, MeOH(100 mL)를 첨가하고, 혼합물을 질소 분위기 하에 추가로 30분 동안 교반하였다. 수지를 DMF(500 mL)로 3회 세척하였다. 이어서 DMF(500 mL) 중 20% 피페리딘을 첨가하고 혼합물을 질소 분위기 하에 25℃에서 20분 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 여과하여 수지를 제공하였다. 수지를 DMF(500 mL)로 5회 세척한 후 여과하여 수지를 제공하였다.
2) 커플링: DMF(300 mL) 중의 DIEA(200 mmol, 4.00 당량), Fmoc-Arg(Pbf)-OH(100 mmol, 2.00 당량), 및 HBTU(95 mmol, 1.90 당량)의 용액을 수지에 첨가하고, 질소 분위기 하에 25℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 수지를 DMF(500 mL)로 3회 세척하였다.
3) 탈보호: DMF(500 mL) 중 20% 피페리딘을 수지에 첨가하고 생성된 혼합물을 질소 분위기 하에 25℃에서 20분 동안 교반하였다. 수지를 DMF(500 mL)로 5회 세척하고 여과하여 수지를 제공하였다.
이어서, 추가 아미노산 단위 #3 내지 #31을 사용하여 상기 커플링 2단계 및 탈보호 3단계를 반복하여 GLP-1 또는 GLP-1 유사체를 생성하였다.
커플링 반응을 닌히드린 테스트로 모니터링하고, 레진을 DMF로 5회 세척하였다.
펩티드 절단 및 정제:
1) 측쇄 보호된 펩티드가 들어 있는 플라스크에 절단 완충액(92.5%TFA/2.5%3-머캅토프로피온산/2.5%TIS/2.5%H2O)을 실온에서 첨가한 후 2시간 동안 교반하였다.
2) 침전된 펩티드를 차가운 이소프로필 에테르로 세척하였다.
3) 침전된 펩티드를 여과하고 필터 케이크를 수집하였다.
4) 침전된 펩티드를 이소프로필 에테르로 2회 더 세척하였다.
5) 이어서, 미정제 펩티드를 진공 하에 2시간 동안 건조하였다.
미정제 펩티드를 prep-HPLC(TFA 조건; 30℃, A: H2O 중 0.075% TFA, B:CH3CN으로 용리)로 정제하고 prep-HPLC(HOAc 조건, A: H2O 중 0.5% HAc, B: ACN로 용리)로 정제하여 [Fmoc-His7, Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)을 백색 고체로서 제공하였다.
지방산 유도체(링커 포함)와 펩티드의 접합:
펩티드 접합을 위한 일반적 절차:
방법 A: [Fmoc-His7, Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)을 DMA에 넣고 목적하는 '지방산-링커 접합체' NHS-에스테르를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 16~40시간 동안 교반되도록 하였다. LCMS 분석에 따라 완전한 전환이 관찰되면, 10 당량의 피페리딘을 첨가하고 2시간 동안 계속 교반하여 Fmoc 기를 제거하였다.
미정제 생성물을 0.1% TFA 개질제(30 mL/분)와 함께 물 중 0~100% ACN으로 용리하는 HPLC(컬럼: Waters XSelect C18 CSH 19 x 150 mm; 5 미크론)로 정제하여 목적하는 화합물의 TFA 염을 백색의 솜털형 고체로 제공하였다. BT AG 1-XB 수지(cat # 143-2446; BIO-RAD)와 함께 물에 화합물을 넣고 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반하여 잔류 TFA를 제거하였다. 이어서, 혼합물을 여과하고 수지를 아세토니트릴 및 물로 세척하였다. 용액을 동결건조하여 목적하는 화합물을 제공하였다.
방법 B: [Fmoc-His7, Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)을 DMF에 넣고 목적하는 '지방산-링커 접합체' NHS 지방산을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 16~40시간 동안 교반되도록 하였다. LCMS 분석에 따라 완전한 전환이 관찰되면, 10 당량의 피페리딘을 첨가하고 추가로 2시간 동안 계속 교반하여 Fmoc 기를 제거하였다. 미정제 생성물을 0.1 N 수성 탄산암모늄으로 희석하고 RPLC(ISCO Gold C18 150그램 컬럼, 물 중 10~100% ACN로 용리, 0.1% 포름산 개질제)로 정제하였다. 목적하는 생성물을 함유하는 순수한 분획을 합하고 동결건조하여 목적하는 화합물을 제공하였다.
화합물 1(부분입체이성질체 혼합물)
무수 DMF(9.8 mL) 중의 [Fmoc-His7, Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)(356.6 mg, 0.099 mmol)의 용액에 1.5 mL 무수 DMF 중의 중간체 6(197 mg, 0.118 mmol)의 용액을 첨가하였다. 16시간 후, 반응은 약 85% 전환에 도달하여 추가로 0.2 당량의 중간체 6을 첨가하였다(0.5 mL 무수 DMF 중 32.9 mg). 48시간 후, 반응이 완료되었다. 이어서 피페리딘(98 μL, 0.985 mmol, 10 당량)을 첨가하여 Fmoc 제거를 개시하였다. 16시간 후, Fmoc 제거가 완료되었고, 용매를 감압 하에서 제거하였다. 상기 미정제 생성물을 25 mL 0.1 N 수성 탄산암모늄에 넣고, 0.1% TFA 개질제와 함께 용리액으로서 물 중 0~100% ACN으로 용리하는 ISCO RediSep Gold C18Aq 100 Gram 컬럼(cat # 69-2203-562)에 주입(2회)하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조하여 백색의 솜털형 분말을 제공하였다. 잔류 TFA를 제거하기 위해 수산화물 수지(BioRad AG 1-X8) 700 mg을 칭량하여 Eppendorf 튜브에 넣고, 5 X 2 mL 1:1 ACN:H2O, 0.1% 포름산으로 헹구고 상청액을 제거하고 각 헹굼 중간에 버렸다(원심분리기로 수지 침전).위에서 제조한 생성물 용액에 헹군 수지를 첨가하고 1시간 동안 흔들었다. 상청액을 여과한 후 0.1% 포름산이 포함된 1:1 ACN:H2O 10 mL로 헹구었다. 이 용액을 동결건조하여 화합물 1을 백색 분말로서 제공하였다. LCMS 방법 J: 관찰된 m/z = 2474.8447 (MH2 2+), Rt: 1.16분; 계산된 질량: 4947.6750. LCMS 방법 K: 관찰된 m/z = 4948.7002 (MH)+, Rt: 2.31분; 계산된 질량: 4947.6750.
화합물 2: 부분입체이성질체 1
화합물 2는 일반적인 접합 절차인 방법 B를 사용하고 중간체 15A(S-거울상이성질체)를 출발 물질로 사용하여 합성하였다.
LCMS 방법 F: 관찰된 m/z = 1238.5 (MH4 4+), Rt: 2.25분; 계산된 질량: 4947.6750.
LCMS 방법 K: 관찰된 4948.7002 (MH+), Rt: 2.31분; 계산된 질량: 4947.6750.
화합물 2의 대안적 합성 방법:
중간체 3에서 중간체 4로, 이어서 중간체 5로, 최종적으로 중간체 6으로 전환하기 위해 기술된 반응과 유사하게, 화합물 2를 합성하는 대안적 방법은 중간체 3B(S-거울상이성질체)로 시작하여 4B(= 중간체 4의 S-거울상이성질체)로 전환되고, 이어서 5B(= 중간체 5의 S-거울상이성질체)로, 최종적으로 중간체 6B(= 중간체 6의 S-거울상이성질체)로 전환된다. 이어서, 중간체 6B 및 [Fmoc-His7, Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)을 일반적인 접합 절차에 따라 반응시켜 화합물 2를 수득한다.
화합물 2의 합성을 위한 출발 물질로 사용된 거울상이성질체적으로 순수한 중간체 3B의 유도체의 단일 X-선 결정학을 사용하여 화합물 2에 대한 지방산 부분의 절대 배열이 S인 것으로 확인되었다.
화합물 3: 부분입체이성질체 2
화합물 3은 일반적인 접합 절차인 방법 B를 사용하고 중간체 15B(R-거울상이성질체)를 출발 물질로 사용하여 합성하였다.
LCMS 방법 F: 관찰된 m/z = 1238.6 (MH4 4+), Rt: 2.29분; 계산된 질량: 4947.6750.
LCMS 방법 K: 관찰된 4948.7002 (MH+), Rt: 2.31분; 계산된 질량: 4947.6750
화합물 3의 대안적 합성 방법:
중간체 3에서 중간체 4로, 이어서 중간체 5로, 최종적으로 중간체 6으로 전환하기 위해 기술된 반응과 유사하게, 화합물 3에 대한 대안적 방법은 중간체 3A(R-거울상이성질체)로 시작하여 4A(= 중간체 4의 R-거울상이성질체)로 전환되고, 이어서 5A(= 중간체 5의 R-거울상이성질체)로, 최종적으로 중간체 6A(= 중간체 6의 R-거울상이성질체)로 전환된다. 이어서, 중간체 6A 및 [Fmoc-His7, Aib8, Arg34]GLP-1-(7-37)을 일반적인 접합 절차에 따라 반응시켜 화합물 3을 수득한다.
화합물 3에 대한 지방산 부분의 절대 배열은 R인 것으로 확인되었다. 이는 거울상이성질체적으로 순수한 중간체 3A의 유도체의 단일 X선 결정학에 의해 확인된 것이다.
화합물 4:
중간체 19를 사용하여 일반적인 접합 절차, 방법 A를 사용하여 화합물 4를 합성하였다.
LCMS 방법 F: 관찰된 m/z = 1061.7 (MH4 4+), Rt: 2.26분; 계산된 질량: 4243.2556.
화합물 5:
중간체 22를 사용하여 일반적인 접합 절차, 방법 B를 사용하여 화합물 5를 합성하였다.
LCMS 방법 F: 관찰된 m/z = 996.6 (MH4 4+), Rt: 2.34분; 계산된 질량: 3979.0983.
화합물 6:
중간체 29를 사용하여 일반적인 접합 절차, 방법 B를 사용하여 화합물 6을 합성하였다.
LCMS 방법 F: 관찰된 m/z = 2490.9 (MH2 2+), Rt: 2.09분; 계산된 질량: 4977.6495.
LCMS 방법 K: 관찰된 4978.6602 (MH+), Rt: 2.09분; 계산된 질량: 4977.6495.
화합물 7:
중간체 36을 사용하여 일반적인 접합 절차, 방법 B를 사용하여 화합물 7을 합성하였다.
LCMS 방법 F: 관찰된 m/z = 1253.1 (MH4 4+), Rt: 2.13분; 계산된 질량: 5005.6805
LCMS 방법 K: 관찰된 5006.7100 (MH+), Rt: 2.15분; 계산된 질량: 5005.6805
화합물 8:
중간체 43을 사용하여 일반적인 접합 절차, 방법 B를 사용하여 화합물 8을 합성하였다.
LCMS 방법 K: 관찰된 5062.7700 (MH+), Rt: 2.30분; 계산된 질량: 5061.7431
화합물 9:
중간체 50을 사용하여 일반적인 접합 절차, 방법 A를 사용하여 화합물 9를 합성하였다.
LCMS 방법 J: 관찰된 m/z = 1274.0 (MH4 4+), Rt: 1.18분; 계산된 질량: 5089.7744.
당업자는 본원에 구체적으로 기재된 특정 구현예에 대한 다수의 균등물을 통상적인 실험을 사용하는 것만으로도 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 다음의 청구범위의 범위에 포함된다.
부록 1(서열 목록)
GLP-1 (7-37):
서열번호 1: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly
서열번호 2: Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Arg-Xaa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37
Xaa16은 VaI 또는 Leu이고;
Xaa18은 Ser, Lys, 또는 Arg이고;
Xaa19는 Tyr 또는 GIn이고;
Xaa20은 Leu 또는 Met이고;
Xaa22는 GIy, Glu, 또는 Aib이고;
Xaa23은 GIn, Glu, Lys, 또는 Arg이고;
Xaa25는 Ala 또는 VaI이고;
Xaa27은 Glu 또는 Leu이고;
Xaa30은 Ala, Glu, 또는 Arg이고;
Xaa33은 VaI 또는 Lys이고;
Xaa34는 Lys, Glu, Asn, 또는 Arg이고;
Xaa35는 GIy 또는 Aib이고;
Xaa36은 Arg, GIy, 또는 Lys이거나 부재이고;
Xaa37은 GIy, Ala, Glu, Pro, Lys이거나 부재이다.
[Aib8, Arg34]GLP-1 (7-37):
서열번호 3: His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly
[Arg34]GLP-1 (7-37):
서열번호 4: His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly
서열 목록
<110> NOVARTIS AG
<120> 글루카곤 유사 펩티드 화합물
<130> PAT059040-EP-EPA
<160> 4
<170> PatentIn 버전 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성 폴리펩티드
<400> 1
<210> 2
<211> 31
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성 폴리펩티드
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Xaa는 임의의 자연발생적 아미노산일수 있음
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> VaI 또는 Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Ser, Lys 또는 Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Tyr 또는 GIn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Leu 또는 Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> GIy, Glu 또는 Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> GIn, Glu, Lys 또는 Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> Ala 또는 VaI
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> Glu 또는 Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> Ala, Glu 또는 Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27)..(27)
<223> VaI 또는 Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> Lys, Glu, Asn 또는 Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> GIy 또는 Aib
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Arg, GIy, 또는 Lys, 또는 부재
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> GIy, Ala, Glu, Pro, Lys, 또는 부재
<400> 2
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성 폴리펩티드
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Aib
<400> 3
<210> 4
<211> 31
<212> PRT
<213> 인공 서열
<220>
<223> 합성 폴리펩티드
<400> 4
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> GLUCAGON LIKE PEPTIDE COMPOUNDS <130> PAT059040-EP-EPA <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> VaI or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Ser, Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Tyr or GIn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Leu or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> GIy, Glu or Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> GIn, Glu, Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Ala or VaI <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> Glu or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> Ala, Glu or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27) <223> VaI or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> Lys, Glu, Asn or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> GIy or Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Arg, GIy or Lys, or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> GIy, Ala, Glu, Pro, Lys, or is absent <400> 2 Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 1 5 10 15 Xaa Ala Xaa Arg Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <400> 3 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 4 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30

Claims (30)

  1. 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 I]

    [식에서,
    R1 및 R2는 독립적으로 CH3, OH, CO2H, CH=CH2, 및 C≡CH로부터 선택되고;
    n 및 m은 각각 5 내지 30에서 독립적으로 선택되는 정수이고;
    L은 임의적 링커이고;
    P는 GLP-1 또는 GLP-1 유사체임].
  2. 제1항에 있어서, P는 NH 기를 통해 L에 결합되는, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, L은
    ,
    , 및

    부터 선택되는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염
    [식에서,
    y는 1 내지 36에서 선택되는 정수이고,
    s는 0, 1, 또는 2이고, k는 1, 2, 또는 3이고,
    **로 표시된 물결선은 화학식 I의 CO 기에 대한 부착을 나타내고,
    ***로 표시된 물결선은 P 기에 대한 부착을 나타냄].
  4. 제3항에 있어서, L은

    인(식에서, y는 1 내지 36에서 선택되는 정수임), 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 화학식 II의 화합물인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 II]

    [식에서,
    NH-P'는 NH 모이어티를 통해 링커 L의 CO 기에 부착된 P 기를 나타내고;
    R1 및 R2는 독립적으로 CH3, OH, 및 CO2H로부터 선택되고;
    n 및 m은 각각 5 내지 30에서 독립적으로 선택되는 정수이고;
    y는 1 내지 36에서 선택되는 정수임].
  6. 제5항에 있어서,
    R1은 CO2H이고 R2는 CH3이고; n은 10이고 m은 10이거나;
    R1은 CO2H이고 R2는 CO2H이고; n은 10이고 m은 10이거나;
    R1은 CO2H이고 R2는 CO2H이고; n은 10이고 m은 11이거나;
    R1은 CO2H이고 R2는 CO2H이고; n은 10이고 m은 13이거나;
    R1은 CO2H이고 R2는 CO2H이고; n은 10이고 m은 14인, 화학식 II의 화합물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 화학식 III의 화합물인 화학식 II의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 III]

    [식에서, R1은 CO2H이고 R2는 CH3임].
  8. 제7항에 있어서, 화학식 IV의 화합물인 화학식 III의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 IV]

    (상기 화합물은 라세미체로 존재하거나 입체화학적으로 풍부한 혼합물로 존재하거나, *로 표시된 탄소 원자에 대해 입체화학적으로 순수함).
  9. 제8항에 있어서, 화학식 IVa의 화합물 또는 화학식 IVb의 화합물인 화학식 IV의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 IVa]

    [화학식 IVb]

    [식에서, y는 1 내지 36에서 선택되는 정수임].
  10. 제9항에 있어서, y는 2 내지 24에서 선택되는 정수인, 화학식 IVa의 화합물 또는 화학식 IVb의 화합물.
  11. 제10항에 있어서, y는 24인, 화학식 IVa의 화합물 또는 화학식 IVb의 화합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, P는
    GLP-1(7-37): His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly(서열번호 1), 및
    서열 GLP-1(7-37)에 비해, 위치 7, 또는 위치 8, 또는 위치 7 및 8에 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 GLP-1 유사체로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, P는
    [Aib8, Arg34]GLP-1(7-37): His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly(서열번호 3); 및
    [Arg34]GLP-1(7-37): His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly(서열번호 4)로부터 선택되는, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, P는

    로 나타낸 바와 같은 [Aib8, Arg34]GLP-1(7-37)이고, 식에서 아미노산 구성원 Lys 상의 물결선은 L에 대한 부착점을 나타내는, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  15. 제1항 내지 제11항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서,

    인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염(식에서, y는 1 내지 36에서 선택되는 정수이고,
    상기 화합물은 입체화학적으로 풍부한 혼합물인 부분입체이성질체 혼합물로 존재하거나, *로 표시된 탄소 원자에 대해 입체화학적으로 순수함).
  16. 제1항 내지 제11항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    [화합물 1]
    ,
    [화합물 2]
    ,
    [화합물 3]
    ,
    [화합물 4]
    ,
    [화합물 5]
    ,
    [화합물 6]
    ,
    [화합물 7]
    ,
    [화합물 8]
    , 및
    [화합물 9]

    로부터 선택되는 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  17. 제16항에 있어서,

    인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  18. 제16항에 있어서,

    인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  19. 제16항에 있어서,

    인 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  21. 치료 유효량의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 하나 이상의 치료활성제를 포함하는 조합.
  22. 제21항에 있어서, 화합물은 화합물 1, 2, 및 3으로부터 선택되는, 조합.
  23. 의약으로서 사용하기 위한 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  24. 비만, 제2형 진성 당뇨병, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 만성 신장 질환 및 당뇨병성 신장병으로부터 선택되는 하나 이상의 당뇨병 합병증, 이상지질혈증, 대사 증후군, NAFLD 및 NASH로부터 선택되는 진행성 간 질환, 심혈관 질환, 및 당뇨병과 관련된 말초 신경병증으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  25. 제24항에 있어서, 심혈관 질환은 고혈압, 죽상경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심근병증, 심방세동, 박출률 감소 심부전(HFrEF), 중간 범위 박출률 심부전(HFmrEF), 및 박출률 보존 심부전(HFpEF)으로부터 선택되는 심부전, 관상동맥 심장 질환, 및 심방 부정맥 및 심실 부정맥으로부터 선택되는 부정맥으로부터 선택되는, 화합물.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 화합물 1, 2, 및 3으로부터 선택되는, 화합물.
  27. 글루카곤 유사 펩티드 1 수용체(GLP1R)의 작용제에 민감한 치료법을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  28. 비만, 제2형 진성 당뇨병, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 포도당 불내성, 고혈당증, 만성 신장 질환 및 당뇨병성 신장병으로부터 선택되는 하나 이상의 당뇨병 합병증, 이상지질혈증, 대사 증후군, NAFLD 및 NASH로부터 선택되는 진행성 간 질환, 심혈관 질환, 및 당뇨병과 관련된 말초 신경병증으로부터 선택되는 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 이를 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 심혈관 질환은 고혈압, 죽상경화증, 말초 동맥 질환, 뇌졸중, 심근병증, 심방세동, 박출률 감소 심부전(HFrEF), 중간 범위 박출률 심부전(HFmrEF), 및 박출률 보존 심부전(HFpEF)으로부터 선택되는 심부전, 관상동맥 심장 질환, 및 심방 부정맥 및 심실 부정맥으로부터 선택되는 부정맥으로부터 선택되는, 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 화합물은 화합물 1, 2, 및 3으로부터 선택되는, 방법.
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