CN106029088A - 稳定的胰高血糖素类似物以及用于治疗低血糖的用途 - Google Patents

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CN106029088A CN201580008796.8A CN201580008796A CN106029088A CN 106029088 A CN106029088 A CN 106029088A CN 201580008796 A CN201580008796 A CN 201580008796A CN 106029088 A CN106029088 A CN 106029088A
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Abstract

本发明涉及包含置换Imp1和His3、与赖氨酸的侧链共价连接的具有三至十个带负电荷部分的取代基的胰高血糖素类似物的衍生物及其中间体和组合物，以及它们在医学中的用途。

Description

稳定的胰高血糖素类似物以及用于治疗低血糖的用途
本发明涉及胰高血糖素类似物的新型衍生物以及它们在医学中，例如在低血糖治疗中的用途。
背景技术
人们早已了解到胰高血糖素对于治疗由胰岛素作用引起的低血糖是有效的。胰高血糖素的升血糖效应是刺激肝糖原分解成葡萄糖(糖原分解)和增加来源于氨基酸前体的葡萄糖产生(糖异生)从而导致从肝输出的葡萄糖增加的结果。
用于治疗严重低血糖的可商购的胰高血糖素作为药盒提供，该药盒包含具有冻干的胰高血糖素的小瓶和预先装有水的一次性注射器(Eli Lilly和Novo Nordisk)。使用前，必须通过将注射器中的水添加至具有胰高血糖素的小瓶中来重建胰高血糖素。随后必须轻轻摇动小瓶直至所有胰高血糖素溶解，并且应将所得到的溶液吸回注射器中，并注射至有需要的人中。在严重的低血糖事件中，患者是无意识的或半无意识的，因此要依赖提供帮助的人来施用胰高血糖素。
糖尿病患者的亲属认为所述重建步骤是麻烦的，并且该步骤会延迟或甚至可能妨碍对严重低血糖事件的治疗。
预装填的即用型装置的主要障碍是胰高血糖素的固有不稳定性。在溶解之后的数小时内胰高血糖素的溶液形成凝胶或原纤维。另外，胰高血糖素在pH 3-9的范围内具有固有的低溶解度。胰高血糖素含有若干种不稳定的氨基酸，并且胰高血糖素组合物的化学稳定性非常差，这主要是由于脱酰胺化、异构化、氧化和水解裂解。
为了能够开发预装填的即用型装置，需要开发新的不形成原纤维的胰高血糖素类似物。另外，要求胰高血糖素具有改善的化学稳定性以使溶液能够在室温下保持延长的一段时间。此外，这样的胰高血糖素类似物应当在皮下(SC)或肌肉内(IM)施用之后迅速起效(诸如升血糖效应)。
发明内容
在一个实施方案中，本发明涉及一种胰高血糖素类似物的衍生物，或所述衍生物的药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述衍生物包含式I：
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30[I]
其中
X2为Ser或Aib；
X10为Tyr、Leu、Ile或Val；
X12为Lys或Arg；
X15为Asp或Glu；
X16为Ser、Ala、Leu、Thr、Aib、Ile、Val或Lys；
X20为Gln、Glu、Aib或Lys；
X21为Asp、Glu或Lys；
X24为Gln、Ala、Glu、Aib或Lys；
X27为Met、Leu或Val；
X28为Asn、Ser、Thr、Gln、Ala、Gly、Glu或Lys；
X29为Thr、Gly、Ser、Gln、Ala、Glu或Lys；且
X30不存在或为Lys；
并且其中所述衍生物包含与在式1的位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29或X30处的赖氨酸的侧链的氮原子共价连接的取代基，其中所述取代基具有式II：
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-[II]
其中Y1为氢或表示C2-6酰基基团或琥珀酰基部分，并且
其中Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11或Y12单独地不存在或单独地表示选自Ser残基、Ala残基、Gly残基、式i、式ii、式iii、式iv和式v的氨基酸残基：
其中式i、ii、iii和iv单独地具有立体化学L或D，
并且条件是所述取代基具有三至十个带负电荷的部分。
在一个实施方案中，本发明涉及一种胰高血糖素类似物形式的中间产物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，该中间产物与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比包含以下修饰：
(i)[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(ii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(iii)[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(iv)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-胰高血糖素；
(v)[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(vi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(vii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(viii)[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(ix)[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(x)[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xi)[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xii)[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xiii)[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xiv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-胰高血糖素；
(xv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-胰高血糖素；
(xvi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys30]-胰高血糖素。
在一个实施方案中，本发明涉及一种包含本发明的衍生物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及如本发明所定义的衍生物，其用于在医学中使用。
具体实施方式
在一个实施方案中，本发明涉及胰高血糖素类似物的新型快速作用衍生物，即可在例如低血糖的治疗中使用的胰高血糖素类似物的衍生物，其中需要在施用后生物作用快速起效。
本发明人惊讶地发现，本发明的衍生物在溶液中具有改善的化学和物理稳定性，同时保持对人胰高血糖素受体的良好效力和升血糖效应的迅速起效。因此，本发明的衍生物能够获得一种液体组合物，其具有包含所述衍生物的所述液体组合物的长期储存稳定性。
所述衍生物包含在位置1的氨基酸置换咪唑并丙酰基(Imp)和在位置3的氨基酸置换组氨酸。所述衍生物进一步包含具有3-10个带负电荷的部分的取代基，其中所述取代基与氨基酸的侧链如赖氨酸侧链的氮原子共价连接。
在一个实施方案中，本发明涉及一种胰高血糖素类似物的衍生物，或所述衍生物的药学上可接受的盐、酰胺或酯，所述衍生物包含式I：
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30[I]
其中
X2为Ser或Aib；
X10为Tyr、Leu、Ile或Val；
X12为Lys或Arg；
X15为Asp或Glu；
X16为Ser、Ala、Leu、Thr、Aib、Ile、Val或Lys；
X20为Gln、Glu、Aib或Lys；
X21为Asp、Glu或Lys；
X24为Gln、Ala、Glu、Aib或Lys；
X27为Met、Leu或Val；
X28为Asn、Ser、Thr、Gln、Ala、Gly、Glu或Lys；
X29为Thr、Gly、Ser、Gln、Ala、Glu或Lys；且
X30不存在或为Lys；
并且其中所述衍生物包含与在式1的位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29或X30处的赖氨酸的侧链的氮原子共价连接的取代基，
其中所述取代基具有式II：
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-[II]
其中Y1为氢或表示C2-6酰基基团或琥珀酰基部分，并且
其中Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11或Y12单独地不存在或单独地表示选自Ser残基、Ala残基、Gly残基、式i、式ii、式iii、式iv和式v的氨基酸残基：
其中式i、ii、iii和iv单独地具有立体化学L或D，
并且条件是所述取代基具有三至十个带负电荷的部分。
在一个实施方案中，当本文在化学结构的图中使用符号“*”(或者可替代的波浪线)时，其表示与该衍生物中相邻位置的连接点。
胰高血糖素肽和类似物
如本文使用的术语“胰高血糖素肽”是指人胰高血糖素(其序列作为SEQ ID NO:1包括在序列表中)，或其类似物(例如式I的胰高血糖素类似物)。具有SEQ ID NO:1的序列的肽在本文中还可被称为“胰高血糖素”。在一个实施方案中，如本文使用的术语“胰高血糖素”是指His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQ ID NO:1)。
本发明的衍生物包括胰高血糖素类似物。如本文使用的术语“胰高血糖素类似物”是指作为胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的变体的肽或化合物。在一个实施方案中，该胰高血糖素类似物包含式I：
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30[I]
其中
X2为Ser或Aib；
X10为Tyr、Leu、Ile或Val；
X12为Lys或Arg；
X15为Asp或Glu；
X16为Ser、Ala、Leu、Thr、Aib、Ile、Val或Lys；
X20为Gln、Glu、Aib或Lys；
X21为Asp、Glu或Lys；
X24为Gln、Ala、Glu、Aib或Lys；
X27为Met、Leu或Val；
X28为Asn、Ser、Thr、Gln、Ala、Gly、Glu或Lys；
X29为Thr、Gly、Ser、Gln、Ala、Glu或Lys；且
X30不存在或为Lys。
可参考以下各项来描述本发明的衍生物的胰高血糖素类似物：i)人胰高血糖素(SEQ ID NO:1)中对应于被修饰的氨基酸残基(即在胰高血糖素(SEQ ID NO:1)中的相应位置)的氨基酸残基的数目，以及ii)实际的修饰。以下是合适的类似物命名的非限制性实例。
换言之，所述胰高血糖素类似物是与人胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比具有多个氨基酸残基修饰的胰高血糖素肽。这些修饰可以独立地代表一个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失。例如，“[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素”表示这样的胰高血糖素(SEQ ID NO:1)，其中在位置1的氨基酸已被置换为Imp，在位置3的氨基酸已被置换为His，在位置15的氨基酸已被置换为Glu，在位置24的氨基酸已被置换为Lys，在位置27的氨基酸已被置换为Leu，并且在位置28的氨基酸已被置换为Ser。
与SEQ ID NO:1相比，“包含”某些指定变化的类似物可以包含进一步的变化。在特定的实施方案中，该类似物“具有”指定的变化。
从以上的实例中可以明显看出，氨基酸残基可用其全名、其单字母密码和/或其三字母密码来表示。这三种方式是完全等同的。在一个实施方案中，根据IUPAC-IUB命名法使用标准的单字母或三字母密码来描绘肽类似物及其衍生物。
可使用表述“位置”或“相应位置”来表征胰高血糖素类似物序列相对于胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的变化的位点。例如，通过简单的书写和目测容易推断出变化的位置以及变化的数目。
例如在本发明衍生物的胰高血糖素类似物的上下文中使用的术语“肽”是指包含通过酰胺(或肽)键互相连接的一系列氨基酸的化合物。本发明的肽包含至少五个通过肽键连接的组成氨基酸。在特定的实施方案中，所述肽a)包含i)29个或ii)30个氨基酸，或者b)由i)29个或ii)30个氨基酸组成。在进一步的特定实施方案中，所述肽由通过肽键互相连接的氨基酸组成。
氨基酸是含有氨基基团和羧酸基团以及任选的一个或多个通常被称为侧链的附加基团的分子。如本文使用的术语“氨基酸”包括编码的氨基酸(其中有20种标准氨基酸)以及非编码的氨基酸。编码的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸(IUPAC表1 3AA-1部分，http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/AA1n2.html#AA1)。非编码的氨基酸是在天然的肽和/或蛋白质中未发现的，或者不是由标准的细胞机器产生的(例如，它们可能已经经历翻译后修饰)。非编码的氨基酸的非限制性实例是Aib(α-氨基异丁酸)、脱氨基组氨酸(别名为咪唑并丙酸，缩写为Imp)以及编码的氨基酸的D-异构体。在此，Imp被称为氨基酸，虽然它不含有氨基基团。
在下文中，没有规定光学异构体的胰高血糖素肽的所有氨基酸应理解为意指L-异构体(除非另有说明)。
该胰高血糖素肽可以是这样的胰高血糖素类似物(SEQ ID NO:1)：与胰高血糖素相比，其具有总计最多15个氨基酸差异(在本文中也被称为修饰)，例如一个或多个添加、一个或多个缺失和/或一个或多个置换。
在一个实施方案中，该胰高血糖素类似物由式I组成。在一个实施方案中，X2为Ser。在一个实施方案中，X10为Tyr。在一个实施方案中，X12为Lys。在一个实施方案中，X15为Asp。在一个实施方案中，X16为Ser。在一个实施方案中，X20为Gln。在一个实施方案中，X21为Asp。在一个实施方案中，X24为Gln。在一个实施方案中，X27为Met。在一个实施方案中，X28为Asn。在一个实施方案中，X29为Thr。在一个实施方案中，X30不存在。在一个实施方案中，X2为Aib。在一个实施方案中，X10为Leu。在一个实施方案中，X15为Glu。在一个实施方案中，X16为Leu。在一个实施方案中，X16为Val。在一个实施方案中，X20为Lys。在一个实施方案中，X21为Glu。在一个实施方案中，X24为Lys。在一个实施方案中，X24为Ala。在一个实施方案中，X27为Leu。在一个实施方案中，X28为Ser。在一个实施方案中，X28为Lys。在一个实施方案中，X29为Lys。在一个实施方案中，该胰高血糖素类似物不包含C-末端酰胺。在一个实施方案中，该胰高血糖素类似物或衍生物不包含添加至X30的C-末端的氨基酸残基。
在一个实施方案中，该胰高血糖素类似物与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比在所述胰高血糖素类似物中包含3-15个氨基酸残基修饰，如置换或添加。在一个实施方案中，该胰高血糖素类似物与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比包含3-15个氨基酸残基修饰，如置换或添加。在一个实施方案中，该衍生物与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比在所述胰高血糖素类似物中包含最多14个如最多13个或最多12个氨基酸残基修饰，如置换或添加。在一个实施方案中，该胰高血糖素类似物与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比在所述胰高血糖素类似物中包含最多11个如最多10个或最多9个氨基酸残基修饰，如置换或添加。在一个实施方案中，该胰高血糖素类似物与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比在所述胰高血糖素类似物中包含最多8个如最多7个或最多6个氨基酸残基修饰，如置换或添加。
胰高血糖素衍生物
本发明涉及胰高血糖素类似物的衍生物。如本文在胰高血糖素肽的上下文如胰高血糖素类似物中使用的术语“衍生物”，意指化学修饰的胰高血糖素肽，其中一个或多个取代基已与该胰高血糖素肽共价连接。如本文使用的术语“取代基”意指替代氢原子的化学部分或基团。该衍生物可包含一个或多个选自酰胺、碳水化合物、烷基基团、酰基基团、酯等的修饰。
在一个实施方案中，所述衍生物包含与在式1的位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29或X30处的赖氨酸的侧链的氮原子共价连接的取代基。在一个实施方案中，该取代基具有式II：
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-[II]
其中Y1为氢或表示C2-6酰基基团或琥珀酰基部分，并且其中Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11或Y12单独地不存在或单独地表示选自Ser残基、Ala残基、Gly残基、式i、式ii、式iii、式iv和式v的氨基酸残基：
其中式i、ii、iii和iv单独地具有立体化学L或D。
在一个实施方案中，Y12与在所述衍生物的位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29或X30处的赖氨酸的侧链的氮原子连接。在一个实施方案中，所述取代基与赖氨酸的侧链的ε-氮原子共价连接。在一个实施方案中，所述取代基与在位置X12、X16或X20处的赖氨酸连接。在一个实施方案中，所述取代基与在位置X21、X24或X28处的赖氨酸连接。在一个实施方案中，所述取代基与在位置X29或X30处的赖氨酸连接。在一个实施方案中，所述取代基与在位置X24处的赖氨酸连接。所述取代基可经由Y12与赖氨酸的侧链的ε-氮原子共价连接。所述取代基可经由Y12与在位置X12、X16或X20处的赖氨酸连接。所述取代基可经由Y12与在位置X21、X24或X28处的赖氨酸连接。所述取代基可经由Y12与在位置X29或X30处的赖氨酸连接。所述取代基可经由Y12与在位置X24处的赖氨酸连接。
在一个实施方案中，Y1为氢或表示C2-6酰基基团或琥珀酰基部分。如本文使用的术语“C2-6酰基基团”是指具有二至六个碳原子的支链或无支链的酰基基团，诸如：
在一个实施方案中，Y1为乙酰基基团。如本文使用的术语“琥珀酰基”是指以下部分：
在一个实施方案中，Y1为琥珀酰基部分。在一个实施方案中，Y1为氢。
在一个实施方案中，Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11和Y12(如果存在)经由酰胺键连接。在一个实施方案中，Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11或Y12不存在。在一个实施方案中，Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11或Y12为Ser残基。在一个实施方案中，Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11或Y12为Ala残基。在一个实施方案中，Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11或Y12为Gly残基。在一个实施方案中，Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11或Y12为式i。在一个实施方案中，Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11或Y12为式ii。在一个实施方案中，Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11或Y12为式iii。在一个实施方案中，Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11或Y12为式iv。在一个实施方案中，Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11或Y12为式v。在一个实施方案中，所述取代基包含3-10个如3-5个或4个式i的残基。
在一个实施方案中，所述取代基具有三至十个带负电荷的部分。在一个实施方案中，所述取代基具有3、4、5、6、7、8、9或10个带负电荷的部分。在一个实施方案中，所述取代基具有三至十个带负电荷的部分。在一个实施方案中，所述取代基具有3-10个如3-7或3-5个带负电荷的部分。如本文使用的术语“带负电荷的部分”意指可带负电荷的化学部分，诸如但不限于氨基酸部分(例如Glu、γ-Glu、Asp或β-Asp、羧酸、磺酸或四唑部分)。在一个实施方案中，在生理pH(pH 7.4)下测定“带负电荷的部分”的数目。在一个实施方案中，“带负电荷的部分”为羧酸基团。
在一个实施方案中，所述取代基为以下部分：
在一个实施方案中，所述取代基为以下部分：
在一个实施方案中，所述取代基为以下部分：
在一个实施方案中，所述取代基为以下部分：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式1：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式2：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式3：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-胰高血糖素
化学式4：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式5：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式6：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式7：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式8：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式9：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式10：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε16-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式11：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε20-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式12：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε21-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式13：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-胰高血糖素
化学式14：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε29-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-胰高血糖素
化学式15：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nα([Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素基)-Nε[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]Lys
化学式16：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε24-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]乙酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式17：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式18：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式19：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式20：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式21：
在一个实施方案中，所述衍生物为Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-胰高血糖素
化学式22：
药学上可接受的盐、酰胺、酯或羧酸
本发明的衍生物、类似物和中间产物可以是药学上可接受的盐、酰胺、羧酸或酯的形式。例如通过碱与酸之间的化学反应形成盐，例如：2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4。该盐可以是碱式盐、酸式盐，或者它可以两者都不是(即为中性盐)。碱式盐在水中产生氢氧根离子，而酸式盐在水中产生水合氢离子。在一个实施方案中，所述衍生物为所述衍生物的药学上可接受的盐、酰胺或酯。
本发明衍生物的盐可通过分别在阴离子或阳离子基团之间添加阳离子或阴离子来形成。这些基团可位于胰高血糖素类似物部分，和/或位于本发明衍生物的取代基中。
本发明衍生物的阴离子基团的非限制性实例包括在取代基(如果有的话)中以及在胰高血糖素类似物部分中的游离羧酸基团。胰高血糖素类似物部分通常在C-末端处包含游离羧酸基团，并且它还可以在内部酸性氨基酸残基如Asp和Glu处包含游离羧酸基团。
胰高血糖素类似物部分中的阳离子基团的非限制性实例包括内部碱性氨基酸残基如His、Arg和Lys的任何游离氨基基团。
本发明衍生物的酯例如可通过游离羧酸基团与醇或苯酚的反应来形成，该反应导致至少一个羟基基团被烷氧基或芳氧基基团所替代。
所述酯的形成可涉及在胰高血糖素类似物的C-末端处的游离羧酸基团，和/或在取代基中的任何游离羧酸基团。
本发明衍生物的酰胺例如可通过游离羧酸基团与胺或取代的胺的反应或通过游离或取代的氨基基团与羧酸的反应来形成。
所述酰胺的形成可涉及在胰高血糖素类似物的C-末端处的游离羧酸基团，在取代基中的任何游离羧酸基团，在胰高血糖素类似物的N-末端处的游离氨基基团，和/或胰高血糖素类似物和/或取代基的任何游离或取代的氨基基团。在一个实施方案中，所述衍生物不包含胰高血糖素类似物的C-末端酰胺。
在一个实施方案中，除非另有说明，本发明的衍生物包含C-末端羧酸基团。在一个实施方案中，本发明涉及该衍生物的药学上可接受的盐、酰胺或酯。术语“药学上可接受的盐”意在表示对患者无害的盐。在一个实施方案中，该衍生物为药学上可接受的盐的形式。在一个实施方案中，该衍生物的羧酸是在胰高血糖素类似物的C-末端处包含酰胺基团的衍生物，即胰高血糖素类似物。在另一个特定的实施方案中，该衍生物为药学上可接受的酰胺的形式，优选在胰高血糖素类似物的C-末端处具有酰胺基团。在进一步特定的实施方案中，该胰高血糖素类似物或衍生物为药学上可接受的酯的形式。
胰高血糖素肽的衍生物的制备
本发明的衍生物可通过以下描述的方法制备。
SPPS通用方法
将要使用的Fmoc保护的氨基酸衍生物可以是以下推荐的标准品：由例如Anaspec、Bachem、Iris Biotech或NovabioChem提供的Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH和Fmoc-Lys(Mtt)-OH。使用3-(N-1-三苯甲基-咪唑-4-基)-丙酸来引入Imp。
可使用基于Fmoc的化学法在来自Protein Technologies(Tucson,AZ85714U.S.A.)的Prelude固相肽合成仪(Phase Peptide Synthesizer)上进行SPPS。用于制备C-末端羧酸的合适的树脂是预加载有氨基酸的Wang树脂，诸如Fmoc-Thr(tBu)-Wang树脂(低负载，0.35mmol/g)。在取代基与C-末端赖氨酸连接的情况下，合适的树脂为预加载的fmoc-Lys(Mtt)-Wang。用于制备C-末端肽酰胺的合适的树脂为H-Rink Amide-ChemMatrix树脂(加载例如0.52nmol/g)或Rink Amide AM聚苯乙烯树脂(Novabiochem，加载例如0.62mmol/g)等。采用在NMP中的20％哌啶来实现Fmoc脱保护。在没有预激活的情况下通过使用DIC/HOAt/三甲基吡啶(collidine)或DIC/Oxyma Pure/三甲基吡啶进行肽偶联。将氨基酸/HOAt或氨基酸/Oxyma Pure溶液(在3-10倍摩尔过量下在NMP中0.3M/0.3M)添加至树脂中，然后添加相同摩尔当量的DIC(在NMP中3M)，接着添加三甲基吡啶(在NMP中3M)。例如，对于以下规模的反应，每一偶联可以使用以下量的0.3M氨基酸/HOAt溶液：规模/mL，0.05mmol/1.5mL、0.10mmol/3.0mL、0.25mmol/7.5mL。可通过用HFIP/DCM(75:25)洗涤树脂(2x 2min)，用DCM洗涤并将树脂悬浮于HFIP/DCM(75:25)中(2x 20min)，并随后用哌啶/NMP(20:80)、DCM(1x)、NMP(1x)、DCM(1x)、NMP(1x)依次洗涤来去除Mtt基团。
取代基的连接
可通过如上所述的Prelude肽合成仪，使用适当保护的结构单元在逐步程序中引入取代基，其中伴随氨基酸和羧酸衍生物的修饰，包括Fmoc-Ado-OH、Fmoc-Glu-OtBu和乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、己酸或4-甲基戊酸。在每个偶联步骤之后，可使用过量的乙酸酐和三甲基吡啶(>10个当量)对未反应的肽中间体加帽。
使用受Mtt保护的赖氨酸(Fmoc-Lys(Mtt)-OH)实现在赖氨酸的ε-氮上引入取代基。或者，可用ivDde基团保护赖氨酸的ε-氮(Fmoc-Lys(ivDde)-OH)。可通过与氨基酸Fmoc-Glu-OtBu偶联实现在取代基中并入γ-Glu部分。
可使用延长的偶联时间(1x 6小时)接着用乙酸酐或可替代的乙酸/DIC/HOAt/三甲基吡啶加帽来实现每个部分在取代基中的引入。在NMP中使用乙酸酐(10个当量)和三甲基吡啶(20个当量)实现取代基上末端氮的乙酰化。
从树脂上切割
在合成之后用DCM洗涤树脂，并且通过用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)处理2-3小时接着用二乙醚沉淀，将肽从树脂上切割下来。用二乙醚洗涤沉淀物。
纯化和定量
将粗肽溶解于水和MeCN的适当混合物如水/MeCN(4:1)中，并在含有C18-硅胶的柱上通过反相制备型HPLC(Waters Deltaprep 4000或Gilson)进行纯化。采用逐渐增加的MeCN在含有0.1％TFA的水中的梯度进行洗脱。通过分析型HPLC或UPLC检查相关级分。将含有纯的靶肽的级分混合并减压浓缩。分析(HPLC，LCMS)所得溶液，并使用化学发光氮特异性HPLC检测器(Antek 8060HPLC-CLND)或通过测量280nm处的UV吸收对产物(即衍生物)进行定量。将产物分配至玻璃小瓶中。给小瓶盖上Millipore玻璃纤维预滤器。冷冻干燥得到呈白色固体的肽三氟乙酸盐。
中间产物
在一个实施方案中，本发明涉及一种胰高血糖素类似物形式的中间产物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，该中间产物与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比包含以下修饰：
(i)[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(ii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(iii)[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(iv)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-胰高血糖素；
(v)[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(vi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(vii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(viii)[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(ix)[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(x)[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xi)[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xii)[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xiii)[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xiv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-胰高血糖素；
(xv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-胰高血糖素；
(xvi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys30]-胰高血糖素。在一个实施方案中，本发明涉及一种胰高血糖素类似物形式的中间产物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，该中间产物与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比包含以下修饰：
(xvii)[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xviii)[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xix)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-胰高血糖素。
在一个实施方案中，本发明涉及一种中间产物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，其中胰高血糖素类似物选自以下的胰高血糖素(SEQ ID NO:1)类似物：
(i-a)[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(ii-a)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(iii-a)[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(iv-a)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-胰高血糖素；
(v-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(vi-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(vii-a)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(viii-a)[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(ix-a)[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(x-a)[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xi-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xii-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xiii-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xiv-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-胰高血糖素；
(xv-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-胰高血糖素；
(xvi-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素。在一个实施方案中，本发明涉及一种中间产物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，其中胰高血糖素类似物选自以下的胰高血糖素(SEQ ID NO:1)类似物：
(xvii-a)[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xviii-a)[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xix-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-胰高血糖素。
可通过以下的逐步合成法来制备本发明的胰高血糖素衍生物，该方法包括(i)中间胰高血糖素类似物的制备，以及随后的(ii)取代基的连接。可使用受保护的氨基酸，使用如实验部分中描述的标准固相合成来实现本方法的步骤(i)；从树脂上切割后，可如本文实验部分中所述使用制备型HPLC使胰高血糖素类似物经历纯化，以得到中间产物。或者，可使用如WO2009/083549中所述的半重组合成来进行本方法的步骤(i)，即中间产物的制备。可使用WO2009/083549中描述的方法来实现本方法的步骤(ii)，即，取代基与中间产物连接而产生最终产物，以及取代基本身的制备。
功能性质
在第一功能性实施方案中，本发明的衍生物是化学稳定的。而且，或者备选地，在第二功能性实施方案中，该衍生物是物理稳定的。而且，或者备选地，在第三功能性实施方案中，该衍生物对胰高血糖素受体具有良好的受体结合和效力。而且，或者备选地，在第四功能性实施方案中，该衍生物是快速作用的衍生物。而且，或者备选地，在第五功能性实施方案中，该衍生物具有高溶解度。而且，或者备选地，在第六功能性实施方案中，该衍生物具有其对GLP-1受体的EC50与其对胰高血糖素受体的EC50之间的高比值(或等于人胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的比值)。在一个实施方案中，在功能性实施方案中的作用是相对于人胰高血糖素(SEQ ID NO:1)而确定的。
化学稳定性
如本文使用的术语肽组合物的“化学稳定性”是指肽结构中的化学共价变化，其导致与天然肽(例如人胰高血糖素)结构相比具有潜在较低的生物效力和/或潜在增强的免疫原性性质的化学降解产物的形成。可根据天然肽的类型和性质以及该肽所暴露的环境而形成各种化学降解产物。化学降解很可能不能完全避免，并且在延长的储存过程中经常看到化学降解产物的量增加。大多数的肽倾向于脱酰胺，即谷氨酰胺酰基或天冬酰胺酰基残基中的侧链酰胺基团水解以形成游离羧酸的过程。其他降解途径包括高分子量转化产物的形成，其中两个或更多个肽分子通过转酰胺基作用和/或二硫键相互作用彼此共价结合，从而导致共价结合的二聚体、寡聚体和聚合物降解产物的形成(Stability of ProteinPharmaceuticals,Ahern.T.J.&Manning M.C.,Plenum Press,New York1992)。(例如甲硫氨酸残基的)氧化可作为化学降解的另一变型而提及。含有天冬酰胺或天冬氨酸的肽可能倾向于经由中间体天冬氨酰亚胺的形成而异构化，从而产生相应的异天冬氨酸异构体，其中可形成D-和L-异构体两者。天冬氨酰亚胺中间体还可以导致D-天冬氨酸异构体的形成。(Formulation Consideration for Proteins Susceptible to Asparagine Deamidationand Aspartate Isomerization,Wakankar和Borchardt,Journal ofPharmaceuticalSciences,2006,Vol.95,no.11,p 2321)。最后，肽还可以经历水解裂解，其中肽片段或单个氨基酸通过肽键的水解而裂解。
可通过在暴露于不同的环境条件(通常可通过例如提高温度来加速降解产物的形成)之后的各个时间点测量化学降解产物的量来评估组合物的化学稳定性。通常通过使用各种色谱技术(例如SE-HPLC和/或RP-UPLC)根据分子大小和/或电荷分离降解产物，来确定每个单独的降解产物的量。
因此，如上所概述的，“稳定的组合物”是指具有增强的物理稳定性、增强的化学稳定性或增强的物理和化学稳定性的组合物。通常，组合物在使用和储存过程中(按照推荐的使用和储存条件)必须是稳定的，直到达到失效期。
可通过本文描述的试验(IV)中的化学降解的测定来测量所述衍生物的化学稳定性。在一个实施方案中，化学稳定的衍生物具有小于5％如小于4％、小于3％或小于2％的化学降解，其中所述化学降解可通过本文描述的试验(IV)来测定。在一个实施方案中，所述衍生物具有小于5％如小于4％、小于3％或小于2％的化学降解，其中所述化学降解可通过本文描述的试验(IV)来测定。
物理稳定性
肽可能经历物理状态的各种变化。肽可能由于在某一组条件下缺乏溶解性而沉淀，例如由于因pH的变化而引起的氨基酸侧链上排斥电荷的中和而沉淀。另一个物理变化是淀粉样原纤维的形成，其包括构象变化成富含β-折叠的大分子纤维结构。可通过因聚集引起的较少的系统结构重复而形成其他的大分子结构。在后两种情况下，最终可观察到作为沉淀物的肽物质。实际上，这些物理变化可能在一定程度上是相关的，例如溶解度相对于pH与原纤维形成是相关的[Schmittschmitt和Scholtz,Protein Science,12,10,2374–2378,2003]。此外，仅通过目测很难区分这些现象，因此通常通过通用术语“沉淀物”来描述这些变化的结果。
物理状态的其他变化包括作为溶液中肽含量损失而观察到的向表面上的吸附，和液体溶液到凝胶的变化。然而，不论沉淀物的性质或凝胶的形成如何，当沉淀物为药物可注射的形式时在其储存和使用期间，对该沉淀物的观察是一个问题。
胰高血糖素在中性pH下具有非常低的水溶解度，这使药物组合物在中性pH下失效。即使在酸性pH下溶解时，胰高血糖素也可根据浓度和温度而经历不同的相变，并且因此是非常物理不稳定的。在胰高血糖素样品溶解在盐酸中之后，可能出现滞后期，此时样品的粘度低并且溶液完全透明。若干小时之后粘度开始增加——指示凝胶形成(Beaven等人,European J.Biochem.11(1969)37-42)。在达到稳定期之后，粘度可能开始再次下降，并且同时原纤维可能出现并从溶液中沉淀出来。该过程是有可播性的(seedable)，添加少量预形成的凝胶减少了滞后期。凝胶的形成和原纤维形成高度依赖于物理应力，诸如加热和摇动，它们均增加该过程的速率。
如本文使用的术语组合物的“物理稳定性”是指由于肽和/或蛋白质暴露于热-机械应力和/或与不稳定的界面和表面如疏水性表面和界面相互作用，使肽和/或蛋白质形成肽和/或蛋白质的生物失活的和/或不可溶的聚集体的倾向。在装在合适容器(例如筒匣或小瓶)中的组合物在不同温度下暴露于机械/物理应力(例如搅拌)不同的时间段之后，借助于目测和/或浊度测量来评估水性肽和/或蛋白质组合物的物理稳定性。在暗背景下采用锐聚焦光进行组合物的目测。通过对浊度的程度进行排序的例如在0至3范围上的目测得分来表征组合物的浊度(显示没有浊度的组合物对应于目测得分0，而在日光下显示可见浊度的组合物对应于目测得分3)。当组合物在日光下显示可见浊度时，将该组合物归类为就蛋白质聚集而言物理不稳定的。或者，可通过技术人员公知的简单浊度测量来评估组合物的浊度。水性肽和/或蛋白质组合物的物理稳定性还可以通过使用该肽和/或蛋白质的构象状态的光谱剂或探针来评估。该探针优选为优先与该肽和/或蛋白质的非天然构象异构体结合的小分子。肽和/或蛋白质结构的小分子光谱探针的一个实例是硫代黄素T。硫代黄素T是已经广泛用于检测淀粉样原纤维的荧光染料。在原纤维以及可能的其他肽和/或蛋白质构型的存在下，硫代黄素T当与原纤维肽和/或蛋白质形式结合时产生了在约450nm处的新的最大激发和在约482nm处的增强的发射。未结合的硫代黄素T在这些波长处基本上是非荧光的。
其他小分子可以用作肽和/或蛋白质结构从天然到非天然状态的变化的探针。例如，优先与肽和/或蛋白质的暴露的疏水小片(hydrophobic patch)结合的“疏水小片”探针。疏水小片通常掩埋在天然状态的肽和/或蛋白质的三级结构内，但随着肽和/或蛋白质开始展开或变性而变得暴露。这些小分子、光谱探针的实例是芳香族疏水性染料，诸如蒽、吖啶、菲咯啉等。
可通过本文描述的试验(III)即ThT原纤维形成试验中的回收率和/或滞后时间来确定所述衍生物的物理稳定性。在一个实施方案中，在本文描述的试验(III)中，物理稳定的衍生物具有大于70％的回收率和/或大于7小时的滞后时间。
在一个实施方案中，在ThT原纤维形成试验如本文描述的试验(III)中，所述衍生物具有大于70％的回收率。在一个实施方案中，在ThT原纤维形成试验如本文描述的试验(III)中，所述衍生物具有大于90％如大于95％或大于98％的回收率。在一个实施方案中，在ThT原纤维形成试验如本文描述的试验(III)中，所述衍生物具有约100％的回收率。
在一个实施方案中，在ThT原纤维形成试验如本文描述的试验(III)中，所述衍生物具有大于7小时如大于20小时或大于45小时的滞后时间。
受体结合和效力
本发明的衍生物是胰高血糖素受体激动剂。可将受体激动剂定义为与受体结合并引起天然配体典型的响应的衍生物。在一个实施方案中，如本文使用的术语“胰高血糖素受体”意指人胰高血糖素受体。
在一个实施方案中，本发明的衍生物是胰高血糖素受体激动剂和/或具有胰高血糖素受体活性。在一个实施方案中，本发明的胰高血糖素类似物是胰高血糖素受体激动剂和/或具有胰高血糖素受体活性。在一个实施方案中，所述胰高血糖素肽是胰高血糖素受体激动剂和/或具有胰高血糖素受体活性。术语“胰高血糖素受体活性”是指与胰高血糖素受体结合并激活细胞内信号转导途径的能力，诸如激活腺苷酸环化酶和增加细胞内cAMP水平，从而介导如本领域已知的生理效应。例如，可使用本文描述的试验(I)(b)或试验(II)(b)测试本发明的衍生物或类似物的胰高血糖素受体活性。
在一个实施方案中，所述衍生物是胰高血糖素受体的激动剂，其EC50不大于200pM。在一个实施方案中，所述衍生物是胰高血糖素受体的激动剂，如通过例如本文描述的试验(I)(b)所测定的，其具有低于200pM如低于100pM或低于20pM的EC50。在另一个实施方案中，所述衍生物是胰高血糖素受体的激动剂，如通过例如本文描述的试验(I)(b)所测定的，其具有低于10pM如低于5pm的EC50。
在一个实施方案中，所述衍生物对GLP-1受体的EC50与其对胰高血糖素受体的EC50的比值为至少50，诸如至少100、1000或5000，其中可使用本文描述的试验(I)(a)和试验(I)(b)测定所述效力(即EC50)。
在一个实施方案中，如通过本文描述的试验(II)(b)所测定的，本发明的衍生物具有低于100nM如低于50nM、低于10nM或低于2nM的IC50。
快速作用的衍生物
在一个实施方案中，所述衍生物是快速作用的衍生物。在一个实施方案中，如本文所用的“快速作用的衍生物”具有迅速起效的升血糖效应。在一个实施方案中，“快速作用的衍生物”在皮下或肌肉内施用之后具有与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)等同的升血糖效应的起效。
在一个实施方案中，快速作用的衍生物在皮下或肌肉内施用之后具有与人胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比改善的生物利用度。
溶解度
本发明的衍生物可以是可溶的胰高血糖素受体激动剂。在一个实施方案中，所述衍生物的溶解度为至少0.1mmol/l、至少0.2mmol/l或至少0.5mmol/l，诸如至少2mmol/l、至少4mmol/l或至少8mmol/l，或诸如至少10mmol/l或至少15mmol/l。在一个实施方案中，当与本发明的衍生物结合使用时，术语“可溶的”、“溶解度”和“水溶解度”是指所述衍生物1)在水中，或2)在水性盐或水性缓冲溶液例如10mM磷酸盐溶液中，或3)在含有其他化合物的水溶液中的溶解度，并且其中可在6.5至8.5如7.0至8.5或7.4至8.2范围内的pH下测定所述溶解度。
在一个实施方案中，可溶的衍生物在pH在7.0-8.5如7.4-8.2范围内的10mM磷酸盐溶液中具有至少0.1mmol/l的溶解度。
在一个实施方案中，所述衍生物具有至少0.1mmol/l的溶解度。在一个实施方案中，可在pH在7.4-8.2范围内的10mM磷酸盐缓冲液中，在包含所述衍生物的组合物中测定所述衍生物的溶解度。
药物组合物
在一个实施方案中，本发明涉及一种包含本发明的衍生物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个实施方案中，该组合物适合于肠胃外施用，诸如SC、IM或IV施用。术语“药物组合物”和“组合物”在本文中可互换使用。
可通过常规技术，例如如Remington's Pharmaceutical Sciences,1985或Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第19版,1995中所述，来制备含有本发明的衍生物的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及一种包含本发明的衍生物的药物组合物，其中所述衍生物以约0.01mg/mL至约25mg/mL，诸如约0.05mg/mL至约5mg/mL和约0.1mg/mL至约2mg/mL的浓度存在，并且其中所述组合物具有2.0至10.0的pH。该药物组合物可包含本发明的衍生物，其中所述衍生物以约0.01mg/mL至约50mg/mL的浓度存在，并且其中所述组合物具有2.0至10.0的pH。
在一个实施方案中，所述药物组合物包含本发明的衍生物的水溶液和缓冲液，其中所述衍生物以0.01mg/mL或以上的浓度存在，并且其中所述组合物具有约2.0至约10.0的pH。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含本发明的衍生物的水溶液和缓冲液，其中所述衍生物以0.01mg/mL或以上的浓度存在，并且其中所述组合物具有约6.5至约8.5的pH。
在一个实施方案中，本发明的组合物具有约2.0至约10.0的pH。在另一个实施方案中，该组合物具有约6.5至约8.5的pH。在进一步的实施方案中，该组合物具有约7.0至约8.5如约7.2至约8.2的pH。
所述组合物可进一步包含缓冲系统、防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在一个实施方案中，所述药物组合物是水性组合物，即包含水的组合物。这样的组合物通常是溶液或悬浮液。在本发明的进一步的实施方案中，所述药物组合物是水溶液。将术语“水性组合物”定义为包含至少50％w/w水的组合物。同样地，将术语“水溶液”定义为包含至少50％w/w水的溶液。在一个实施方案中，所述组合物包含非水性有机溶剂。
在另一个实施方案中，所述药物组合物是冷冻干燥的组合物，在使用之前例如由医师或患者向其中添加溶剂和/或稀释剂。
在另一个实施方案中，所述药物组合物是经干燥(例如冷冻干燥或喷雾干燥)的组合物，以供在没有任何预先溶解的情况下使用。
在一个实施方案中，本发明涉及一种包含本发明的衍生物以及一种或多种其他活性成分如GLP-1、胰岛素或其类似物和/或衍生物的组合物。在一个实施方案中，本发明涉及一种包含本发明的衍生物以及GLP-1或其类似物和/或衍生物的组合物。在一个实施方案中，本发明涉及一种包含本发明的衍生物以及胰岛素或其类似物和/或衍生物的组合物。包含本发明的衍生物以及一种或多种其他活性成分的组合物可被称为“联合制剂(co-formulation)”。在一个实施方案中，这样的联合制剂是物理稳定和/或化学稳定的组合物。
本发明的衍生物在中性pH下可以溶解这一事实可以允许获得具有胰岛素的联合制剂，并允许更稳定的血糖水平和次数减少的低血糖发作，以及降低的糖尿病相关并发症的风险。
药物施用
本发明的衍生物可以肠胃外施用于患者。该衍生物的施用途径可以是肌肉内(IM)、皮下(SC)或静脉内(IV)。推荐由医师选择将向患者施用的包含本发明衍生物的组合物的剂量。
可通过借助于注射器(任选地，笔状注射器)进行的皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射进行肠胃外施用。在一个实施方案中，可以使用包含本发明衍生物的组合物以备使用笔装置进行胰高血糖素施用。或者，可借助于输注泵进行肠胃外施用。在一个实施方案中，可以在用于胰高血糖素施用的泵中使用包含本发明衍生物的组合物。肠胃外施用可以是经鼻施用。作为其他选择，含有本发明衍生物的胰高血糖素制剂还可以适于经皮施用，例如通过无针注射或经由贴剂(任选地，离子电渗贴剂)，或跨粘膜例如经颊施用。
本发明的衍生物或组合物在根据本发明的方法中使用时的典型剂量在每日约0.0001至约1mg/kg体重，优选约0.001至约1mg/kg体重，更优选约0.005至约0.02mg/kg体重的范围内。如上所述，本发明的衍生物可与一种或多种附加的治疗活性化合物或物质联合施用或使用，并且合适的附加化合物或物质可以选自，例如，抗糖尿病药、抗高血脂药、减肥药、抗高血压药以及用于治疗由糖尿病引起或与糖尿病有关的并发症的药剂。
合适的抗糖尿病药包括胰岛素、胰岛素衍生物或类似物、GLP-1(胰高血糖素样肽-1)衍生物或类似物[诸如在WO 98/08871(Novo Nordisk A/S)中公开的那些，或其他GLP-1类似物如艾塞那肽(Byetta,Eli Lilly/Amylin；AVE0010,Sanofi-Aventis)、他泊鲁肽(Taspoglutide)(Roche)、阿必鲁泰(Albiglutide)(Syncria,GlaxoSmithKline)]、胰淀素(amylin)、胰淀素类似物(例如Symlin/Pramlintide)以及口服活性降血糖药。
药物适应证
本发明还涉及本发明的衍生物，其用于在医学中使用。在一个实施方案中，所述衍生物用于治疗和/或预防低血糖。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗和/或预防低血糖的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的衍生物。
在一个实施方案中，本发明的衍生物用于治疗或预防低血糖、胰岛素诱发的低血糖、反应性低血糖、糖尿病性低血糖、非糖尿病性低血糖、空腹低血糖、药物诱发的低血糖、胃旁路术诱发的低血糖、妊娠期低血糖、酒精诱发的低血糖、胰岛瘤和/或Von Girkes病。
在一个实施方案中，本发明的衍生物用于抑制胃肠道的运动性，这对于使用诸如x-射线、CT-和NMR-扫描等技术进行胃肠道的检查而言是有用的。
在一个实施方案中，所述衍生物用于治疗β-阻滞剂中毒。在一个实施方案中，所述衍生物用于治疗或预防肝脂肪变性。在一个实施方案中，所述衍生物用于治疗或预防低血糖。在一个实施方案中，所述衍生物用于治疗或预防胰岛素诱发的低血糖。在一个实施方案中，所述衍生物用于治疗或预防反应性低血糖。在一个实施方案中，所述衍生物用于治疗或预防糖尿病性低血糖。在一个实施方案中，所述衍生物用于治疗或预防非糖尿病性低血糖。在一个实施方案中，所述衍生物用于治疗或预防空腹低血糖。在一个实施方案中，所述衍生物用于治疗或预防药物诱发的低血糖。在一个实施方案中，所述衍生物用于治疗或预防胃旁路术诱发的低血糖。在一个实施方案中，所述衍生物用于治疗或预防妊娠期低血糖。在一个实施方案中，所述衍生物用于治疗或预防酒精诱发的低血糖。在一个实施方案中，所述衍生物用于治疗或预防胰岛瘤。在一个实施方案中，所述衍生物用于治疗或预防Von Girkes病。
在一个实施方案中，所述衍生物以提供治疗有效量的所述衍生物的剂量方案来施用。如本文所用的，术语本发明衍生物的“治疗有效量”是指足以治愈、减轻或部分抑制给定疾病和/或其并发症的临床表现的量。将足以实现该目标的量定义为“治疗有效量”。用于各个目的的有效量将取决于疾病或损伤的严重性以及患者的体重和整体状况。将会理解，可通过构建值的矩阵并测试该矩阵中的不同的点，使用常规实验来确定合适的剂量，所有这些均在受过训练的医师或兽医的普通技术水平之内。
如本文使用的术语“治疗”、“处理”及其其他变型是指为了对抗状况如疾病或病症的目的而对患者的管理和照护。该术语意在包括对患者正在罹患的给定状况的全范围的治疗，诸如施用所讨论的活性化合物以减轻其症状或并发症，以延缓疾病、病症或状况的进展，以治愈或消除疾病、病症或状况，和/或以预防状况，其中预防应理解为为了对抗疾病、状况或病症的目的而对患者的管理和照护，并且包括施用所讨论的活性化合物以预防症状或并发症的发作。待治疗的患者优选为哺乳动物，尤其是人，但诸如狗、猫、牛、马、绵羊、山羊或猪等其他动物的治疗也在本发明的范围内。
在标题为“特定实施方案”的部分中描述了本发明衍生物的另外的特定实施方案。
特定实施方案
以下是本发明的非限制性特定实施方案：
1.一种包含式I的胰高血糖素类似物的衍生物，或所述衍生物的药学上可接受的盐、酰胺或酯：
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30[I]
其中
X2为Ser或Aib；
X10为Tyr、Leu、Ile或Val；
X12为Lys或Arg；
X15为Asp或Glu；
X16为Ser、Ala、Leu、Thr、Aib、Ile、Val或Lys；
X20为Gln、Glu、Aib或Lys；
X21为Asp、Glu或Lys；
X24为Gln、Ala、Glu、Aib或Lys；
X27为Met、Leu或Val；
X28为Asn、Ser、Thr、Gln、Ala、Gly、Glu或Lys；
X29为Thr、Gly、Ser、Gln、Ala、Glu或Lys；并且
X30不存在或为Lys；
并且其中所述衍生物包含与在式1的位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29或X30处的赖氨酸的侧链的氮原子共价连接的取代基，
其中所述取代基具有式II：
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-[II]
其中Y1为氢或表示C2-6酰基基团或琥珀酰基部分，并且
其中Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11或Y12单独地不存在或单独地表示选自Ser残基、Ala残基、Gly残基、式i、式ii、式iii、式iv和式v的氨基酸残基：
其中式i、ii、iii和iv单独地具有立体化学L或D，
并且条件是所述取代基具有三至十个带负电荷的部分。
2.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述胰高血糖素类似物由式I组成。
3.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述胰高血糖素类似物或衍生物不包含添加至X30的C-末端上的氨基酸残基。
4.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述衍生物为所述衍生物的药学上可接受的盐、酰胺或酯。
5.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述胰高血糖素类似物与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比在所述胰高血糖素类似物中包含3-15个氨基酸残基修饰，如置换或添加。
6.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述衍生物与胰高血糖素(SEQID NO:1)相比在所述胰高血糖素类似物中包含最多14个如最多13个或最多12个氨基酸残基修饰，如置换或添加。
7.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述胰高血糖素类似物与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比在所述胰高血糖素类似物中包含最多11个如最多10个或最多9个氨基酸残基修饰，如置换或添加。
8.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述胰高血糖素类似物与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比在所述胰高血糖素类似物中包含最多8个如最多7个或最多6个氨基酸残基修饰，如置换或添加。
9.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X2为Ser。
10.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X10为Tyr。
11.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X12为Lys。
12.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X15为Asp。
13.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X16为Ser。
14.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X20为Gln。
15.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X21为Asp。
16.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X24为Gln。
17.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X27为Met。
18.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X28为Asn。
19.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X29为Thr。
20.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X30不存在。
21.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X2为Aib。
22.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X10为Leu。
23.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X15为Glu。
24.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X16为Leu。
25.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X16为Val。
26.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X20为Lys。
27.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X21为Glu。
28.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X24为Lys。
29.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X24为Ala。
30.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X27为Leu。
31.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X28为Ser。
32.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X28为Lys。
33.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中X29为Lys。
34.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中Y12与在所述衍生物的位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29或X30处的赖氨酸的侧链的所述氮原子连接。
35.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述取代基与赖氨酸的侧链的ε-氮原子共价连接。
36.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述取代基与在位置X12、X16或X20处的赖氨酸连接。
37.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述取代基与在位置X21、X24或X28处的赖氨酸连接。
38.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述取代基与在位置X29或X30处的赖氨酸连接。
39.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述取代基与在位置X24处的赖氨酸连接。
40.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述取代基具有3、4、5、6、7、8、9或10个带负电荷的部分。
41.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述取代基包含3-10个如3-5个或4个式i的残基。
42.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述取代基的Y1为乙酰基基团。
43.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述取代基选自以下部分：
44.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述取代基为以下部分：
45.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述衍生物选自：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式1：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式2：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式3：
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-胰高血糖素
化学式4：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式5：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式6：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式7：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式8：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式9：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式10：
Nε16-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式11：
Nε20-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式12：
Nε21-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式13：
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-胰高血糖素
化学式14：
Nε29-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-胰高血糖素
化学式15：
Nα([Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素基)-Nε[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]Lys
化学式16：
46.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述衍生物选自
Nε24-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]乙酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式17：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式18：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式19：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式20：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式21：
以及
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-胰高血糖素
化学式22：
47.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述胰高血糖素类似物不包含C-末端酰胺。
48.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述衍生物是胰高血糖素受体的激动剂，其EC50不大于200pM。
49.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述衍生物在ThT原纤维形成试验如本文描述的试验(III)中具有大于70％的回收率。
50.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述衍生物在ThT原纤维形成试验如本文描述的试验(III)中具有大于7小时的滞后时间。
51.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述衍生物具有如通过本文所述的试验(IV)测定的小于5％的化学降解。
52.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述衍生物具有至少0.1mmol/l的溶解度。
53.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述溶解度可在pH在7.4-8.2范围内的10mM磷酸盐缓冲液中在包含所述衍生物的组合物中测定。
54.根据前述实施方案中任一个所述的衍生物，其中所述衍生物对GLP-1受体的EC50效力与其对胰高血糖素受体的EC50效力的比值至少为50，其中所述效力可使用本文描述的试验(I)(a)和试验(I)(b)来测定。
55.一种胰高血糖素类似物形式的中间产物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，该中间产物与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比包含以下修饰：
(i)[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(ii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(iii)[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(iv)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-胰高血糖素；
(v)[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(vi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(vii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(viii)[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(ix)[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(x)[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xi)[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xii)[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xiii)[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xiv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-胰高血糖素；
(xv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-胰高血糖素；
(xvi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys30]-胰高血糖素。
56.一种胰高血糖素类似物形式的中间产物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，该中间产物与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比包含以下修饰：
(xvii)[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xviii)[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xix)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-胰高血糖素。
57.根据前述实施方案中任一个所述的中间产物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，其中所述胰高血糖素类似物选自以下胰高血糖素(SEQ ID NO:1)类似物：
(i-a)[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(ii-a)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(iii-a)[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(iv-a)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-胰高血糖素；
(v-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(vi-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(vii-a)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(viii-a)[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(ix-a)[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(x-a)[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xi-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xii-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xiii-a)[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xiv-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-胰高血糖素；
(xv-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-胰高血糖素；
(xvi-a)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys30]-胰高血糖素。
58.根据前述实施方案中任一个所述的中间产物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，其中所述胰高血糖素类似物选自以下胰高血糖素(SEQ ID NO:1)类似物：
(xvii)[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xviii)[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xix)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-胰高血糖素。
59.一种组合物，其包含如前述实施方案中任一个所述的衍生物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
60.如前述实施方案中任一个所述的衍生物，其用于在医学中使用。
61.根据实施方案60所述的衍生物，其用于治疗和/或预防低血糖。
62.一种治疗和/或预防低血糖的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的如前述实施方案中任一个所述的衍生物。
实施例
参考以下实施例进一步说明本发明，这些实施例并非旨在以任何方式限制所请求保护的本发明的范围。
缩写列表
BOC：叔丁氧羰基
DCM：二氯甲烷
DIC：二异丙基碳二亚胺
Fmoc：9-芴基甲氧羰基
HOAt：1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HPLC：高效液相色谱法
LCMS：液相色谱质谱法
MeCN：乙腈
Min：分钟
Mtt：4-甲基三苯甲基
NMP：N-甲基吡咯烷酮
Oxyma Pure：氰基-羟基亚氨基-乙酸乙酯
RP：反相
RP-HPLC：反相高效液相色谱法
RT：室温
Rt：保留时间
SPPS：固相肽合成
TFA：三氟乙酸
TIPS：三异丙基硅烷
UPLC：超高效液相色谱法
10EE：10的幂(例如“10EE(X)”指数字10的幂(X)或简化为数字10(X)，即5x10EE3为5x103)
通用方法
该章节涉及用于合成树脂结合的肽的方法(SPPS法，其包括氨基酸脱保护方法、用于从树脂上切割肽的方法和肽纯化方法)以及用于检测和表征所得肽的方法(LCMS和UPLC法)。
SPPS通用方法
该章节涉及固相肽合成方法(SPPS法，其包括氨基酸脱保护方法、用于从树脂上切割肽的方法和肽纯化方法)以及用于检测和表征所得肽的方法(LCMS和UPLC法)。所使用的Fmoc保护的氨基酸衍生物为以下推荐的标准品：由例如Anaspec、Bachem、Iris Biotech或Novabiochem提供的Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH或Fmoc-Val-OH等。当没有其他指定时，使用氨基酸的天然L-形式。使用3-(N-1-三苯甲基-咪唑-4-基)-丙酸来引入N-末端Imp。
该章节“SPPS通用方法”中以下所述的所有操作在100-μmol合成规模下进行。
用于制备C-末端羧酸的合适的树脂是预加载有氨基酸的Wang树脂，如Fmoc-Thr(tBu)-Wang树脂(低负载，0.35mmol/g)。在取代基与C-末端赖氨酸连接的情况下，合适的树脂是预加载的fmoc-Lys(Mtt)-Wang。
在100-μmol规模下，使用相对于树脂负载例如低负载Fmoc-Gly-Wang(0.35mmol/g)六倍过量的Fmoc-氨基酸(在含有300mM HOAt或Oxyma的NMP中300mM)，在来自Protein Technologies(Tucson,AZ 85714U.S.A.)的Prelude固相肽合成仪上进行SPPS。采用在NMP中的20％哌啶进行Fmoc脱保护。使用在NMP中的3:3:3:4氨基酸/OxymaDIC/三甲基吡啶进行偶联。在脱保护与偶联步骤之间进行NMP和DCM顶部洗涤(各2x 2)。偶联时间通常为60或120分钟。将一些氨基酸“双偶联”，意味着在第一次偶联之后，排空树脂并添加更多试剂(氨基酸、(HOAt或Oxyma)、DIC和三甲基吡啶)，并使混合物再次反应。
取代基与树脂结合的受保护的肽骨架的连接
用Mtt保护待酰化的赖氨酸的ε氨基基团。通过用六氟异丙醇/DCM(75:25，5x20ml，各10min)处理然后如以上在“SPPS通用方法”章节中所述洗涤来进行Mtt脱保护。
如上所述使用Fmoc-Glu-OtBu或结构单元通过一个或多个自动化步骤在Prelude肽合成仪上进行赖氨酸的化学修饰。以每次偶联120分钟的反应时间进行双偶联。使用乙酸酐实现乙酰化。
从树脂上切割
在合成后用DCM洗涤树脂，并且通过用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5)处理2-3小时将肽从树脂上切割下来，随后用二乙醚沉淀。用二乙醚洗涤沉淀物。
纯化和定量
将粗肽溶解于水和MeCN的适当混合物如水/MeCN(9:1)中，并在含有C18-硅胶的柱上通过反相制备型HPLC(Waters Deltaprep 4000或Gilson)进行纯化。采用逐渐增加的MeCN在含有0.1％TFA的水中的梯度进行洗脱。通过分析型HPLC或UPLC检查相关级分。将含有纯靶肽的级分混合并减压浓缩。分析(HPLC，LCMS)所得溶液，并使用化学发光氮特异性HPLC检测器(Antek 8060HPLC-CLND)或通过测量280nm处的UV吸收对产物进行定量。将产物分配至玻璃小瓶中。给该小瓶盖上Millipore玻璃纤维预滤器。冷冻干燥得到呈白色固体的肽三氟乙酸盐。
检测和表征方法
方法：LCMS01
方法：UPLC01
方法：UPLC02
实施例1
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式1：
UPLC01：Rt＝10.2min
LCMS01：Rt＝1.99min；计算m/z＝4014.3；实测m/3＝1339；实测m/4＝1004；实测m/5＝803
实施例2
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式2：
UPLC02：Rt＝6.3min
LCMS01：Rt＝1.75min；计算m/z＝4002.3；实测m/3＝1335；实测m/4＝1001；实测m/5＝801
实施例3
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式3：
UPLC02：Rt＝6.7min
LCMS01：Rt＝1.8min；实测m/1＝3952.3；实测m/3＝1318；实测m/4＝989；实测m/5＝791
实施例4
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-胰高血糖素
化学式4：
UPLC02：Rt＝6.2min
LCMS01：Rt＝1.7min；计算m/z＝3986.3；实测m/3＝1329；实测m/4＝997；实测m/5＝798
实施例5
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式5：
UPLC01：Rt＝9.2min
LCMS01：Rt＝1.8min；计算m/z＝4004.2；实测m/3＝1336；实测m/4＝1002；实测m/5＝801
实施例6
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式6：
UPLC01：Rt＝9.4min
LCMS01：Rt＝1.82min；计算m/z＝4018.3；实测m/3＝1340；实测m/4＝1005；实测m/5＝804
实施例7
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式7：
UPLC02：Rt＝6.4min
LCMS01：Rt＝1.7min；计算m/z＝4016.3；实测m/3＝1339；实测m/4＝1005；实测m/5＝804
实施例8
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式8：
UPLC01：Rt＝10.8min
LCMS01：Rt＝1.9min；计算m/z＝4030.3；实测m/3＝1344；实测m/4＝1008；实测m/5＝807
实施例9
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式9：
UPLC01：Rt＝10.5min
LCMS01：Rt＝1.9min；计算m/z＝4016.3；实测m/3＝1340；实测m/4＝1005；实测m/5＝804
实施例10
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式10：
UPLC01：Rt＝10.3min
LCMS01：Rt＝1.9min；计算m/z＝4000.3；实测m/3＝1334；实测m/4＝1001；实测m/5＝801
实施例11
Nε16-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式11：
UPLC02：Rt＝6.4min
LCMS01：Rt＝3.1min；计算m/z＝4059.3；实测m/3＝1354；实测m/4＝1015；实测m/5＝812
实施例12
Nε20-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式12：
UPLC02：Rt＝6.4min
LCMS01：Rt＝3.2min；计算m/z＝4018.3；实测m/3＝1340；实测m/4＝1005；实测m/5＝804
实施例13
Nε21-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式13：
UPLC01：Rt＝9.5min
LCMS01：Rt＝3.1min；计算m/z＝4017.3；实测m/3＝1340；实测m/4＝1005；实测m/5＝804
实施例14
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-胰高血糖素
化学式14：
UPLC02：Rt＝6.2min
LCMS01：Rt＝3.2min；计算m/z＝4059.3；实测m/3＝1354；实测m/4＝1015；实测m/5＝812
实施例15
Nε29-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-胰高血糖素
化学式15：
UPLC01：Rt＝9.4min
LCMS01：Rt＝4.1min；计算m/z＝4045.3；实测m/3＝1349；实测m/4＝1012；实测m/5＝810
实施例16
Nα([Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素基)-N{Epsilon}[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]Lys
化学式16：
UPLC01：Rt＝9.2min
LCMS01：Rt＝4.1min；计算m/z＝4146.4；实测m/3＝1383；实测m/4＝1037；实测m/5＝830
实施例17
Nε24-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]乙酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式17：
UPLC01：Rt＝9.6min
LCMS01：Rt＝1.8min；计算m/z＝4075.3；实测m/3＝1359.7；实测m/4＝1020.0；实测m/5＝816.2
实施例18
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式18：
UPLC01：Rt＝9.8min
LCMS01：Rt＝1.8min；计算m/z＝3889.2；实测m/3＝1297.3；实测m/4＝973.2；实测m/5＝1178.8
实施例19
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式19：
UPLC01：Rt＝9.8min
LCMS01：Rt＝1.8min；计算m/z＝4147.4；实测m/3＝1383.4；实测m/4＝1037.7；实测m/5＝830.4
实施例20
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式20：
UPLC01：Rt＝10.2min
LCMS01：Rt＝1.9min；计算m/z＝3974.2；实测m/3＝1325.6；实测m/4＝994.5；实测m/5＝795.8
实施例21
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式21：
UPLC01：Rt＝10.6min
LCMS01：Rt＝2.0min；计算m/z＝3988.2；实测m/3＝1330.0；实测m/4＝998.0；实测m/5＝798.6
实施例22
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-胰高血糖素
化学式22：
UPLC01：Rt＝10.0min
LCMS01：Rt＝1.8min；计算m/z＝4060.3；实测m/3＝1354.3；实测m/4＝1016.0；实测m/5＝813.0
试验(I)：GLP-1和胰高血糖素受体效力
本试验的目的在于测试本发明的衍生物的体外活性或效力。在全细胞试验中，体外效力分别是人GLP-1受体和/或胰高血糖素受体激活的量度。
原理
通过在报道基因试验中分别测量人GLP-1或胰高血糖素受体的响应来测定体外效力。在稳定转染的BHK细胞系中进行该试验，该细胞系表达人GLP-1受体或人胰高血糖素受体，并且包含与启动子偶联的cAMP响应元件(CRE)的DNA以及萤火虫萤光素酶(CRE萤光素酶)的基因。当分别激活人GLP-1或胰高血糖素受体时，导致cAMP的产生，这转而导致萤光素酶蛋白质被表达。当完成测定温育时，添加萤光素酶底物(萤光素)，并且该酶将萤光素转化为氧化萤光素并产生生物发光。测量发光作为该试验的读出。
(a)GLP-1受体激活
细胞培养和准备
本试验中使用的细胞(克隆FCW467-12A/KZ10-1)为BHK细胞，以BHKTS13作为亲本细胞系。该细胞来源于表达人GLP-1受体的克隆(FCW467-12A)，并且通过用CRE萤光素酶进一步转染以获得当前的克隆而建立。
将细胞在5％CO2下在含有10％FBS、1xGlutaMAX、1mg/mL G418、240nM MTX(甲氨蝶呤)和1％pen/strep(青霉素/链霉素)的DMEM培养基中培养。对细胞进行等分并储存在液氮中。在每次测定之前，取出等份并将其在PBS中洗涤三次，然后以所需浓度悬浮于测定缓冲液中。对于96孔板，制备悬浮液以得到5x10EE3个细胞/孔的最终浓度。材料
在该试验中使用以下化学品：Pluronic F-68(10％)(Gibco 2404)、卵清蛋白(Sigma A5503)、不含酚红的DMEM(Gibco 11880-028)、1M Hepes(Gibco 15630)、Glutamax100x(Gibco 35050)和steadylite plus(PerkinElmer 6016757)。
测定培养基由不含酚红的DMEM、10mM Hepes、1x GlutaMAX、2％卵清蛋白和0.2％Pluronic F-68组成。
程序
将细胞储备物在37℃水浴中解冻。将细胞在PBS中洗涤三次。对细胞进行计数并调整到在测定培养基中5x10EE3个细胞/50μl(1x10EE5个细胞/mL)。将细胞的50μl等份转移至测定板的每个孔中。
将测试化合物和参考化合物的储备物在测定培养基中稀释至0.2μM的浓度。将化合物稀释10倍以得到以下浓度：2x10EE-6M、2x10EE-7M、2x10EE-8M；2x10EE-9M、2x10EE-10M、2x10EE-11M、2x10EE-12M和2x10EE-13M。对于每种化合物，还包括空白测定缓冲液对照。
将化合物或空白的50μl等份从稀释板转移至测定板中。在以下最终浓度下测试化合物：1x10EE-6M、1x10EE-7M、1x10EE-8M；1x10EE-9M、1x10EE-10M、1x10EE-11M和1x10EE-12M和1x10EE-13M。
在37℃下将测定板在5％CO2培养箱中温育3h。从培养箱中取出测定板并使其在室温下静置15min。将steadylite plus试剂的100μl等份添加至该测定板的每个孔中(试剂是光敏性的)。用铝箔覆盖每个测定板以使其避光，并在室温下摇动30min。在PackardTopCountNXT仪器中读取每个测定板。
计算
将来自TopCount仪器的数据转移至GraphPad Prism软件。该软件进行非线性回归(log(激动剂)相对于响应-可变斜率(四参数))。通过该软件计算EC50值并以pM为单位记录。
(b)胰高血糖素受体激活
细胞培养和准备
本试验中使用的细胞(克隆pLJ6’-4-25)为BHK细胞，以BHK570作为表达CRE萤光素酶基因的亲本细胞系(克隆BHK/KZ10-20-48)，并通过用人胰高血糖素受体进一步转染而建立(在pHZ-1载体中的克隆pLJ6’)。
将细胞在5％CO2下在含有10％FBS、1xGlutaMAX、1mg/mL G418、240nM MTX(甲氨蝶呤)和1％pen/strep(青霉素/链霉素)的DMEM培养基中培养。对细胞进行等分并储存在液氮中。在每次测定之前，取出等份并将其在PBS中洗涤三次，然后以所需浓度悬浮于测定缓冲液中。对于96孔板，制备悬浮液以得到5x10EE3个细胞/孔的最终浓度。材料
在该试验中使用以下化学品：Pluronic F-68(10％)(Gibco 2404)、卵清蛋白(Sigma A5503)、不含酚红的DMEM(Gibco 11880-028)、1M Hepes(Gibco 15630)、Glutamax100x(Gibco 35050)和steadyliteplus(PerkinElmer 6016757)。
测定培养基由不含酚红的DMEM、10mM Hepes、1x GlutaMAX、2％卵清蛋白和0.2％Pluronic F-68组成。
程序
将细胞储备物在37℃水浴中解冻。将细胞在PBS中洗涤三次。对细胞进行计数并调整到在测定培养基中5x10EE3个细胞/50μl(1x10EE5个细胞/mL)。将细胞的50μl等份转移至测定板的每个孔中。
将测试化合物和参考化合物的储备物在测定培养基中稀释至0.2μM的浓度。将化合物稀释10倍以得到以下浓度：2x10EE-6M、2x10EE-7M、2x10EE-8M；2x10EE-9M、2x10EE-10M、2x10EE-11M、2x10EE-12M和2x10EE-13M。对于每种化合物，还包括空白测定缓冲液对照。
将化合物或空白的50μl等份从稀释板转移至测定板中。在以下最终浓度下测试化合物：1x10EE-6M、1x10EE-7M、1x10EE-8M；1x10EE-9M、1x10EE-10M、1x10EE-11M和1x10EE-12M和1x10EE-13M。
在37℃下将测定板在5％CO2培养箱中温育3h。从培养箱中取出测定板并使其在室温下静置15min。将steadylite plus试剂的100μl等份添加至测定板的每个孔中(试剂是光敏性的)。用铝箔覆盖每个测定板以使其避光，并在室温下摇动30min。在PackardTopCountNXT仪器中读取每个测定板。
计算
将来自TopCount仪器的数据转移至GraphPad Prism软件。该软件进行非线性回归(log(激动剂)相对于响应-可变斜率(四参数))。通过该软件计算EC50值并以pM为单位报告。
试验(II)：GLP-1和胰高血糖素受体结合
(a)GLP-1受体结合
本试验的目的在于测试本发明的胰高血糖素衍生物的体外受体结合活性。该受体结合是化合物对人GLP-1受体的亲和力的量度。
原理
在置换结合试验中测量每种化合物与人GLP-1受体的受体结合。在这一类型的试验中，使标记的配体(在这种情况下为125I-GLP-1)与受体结合。以一系列的浓度将每种衍生物添加至含有人GLP-1受体的分离的膜中，并监测标记的配体的置换。将受体结合报告为一半的标记的配体从受体上置换时的浓度，即IC50值。
材料
在该试验中使用以下化学品：不含酚红的DMEM(Gibco 11880-028)、Pen/strep(Invitrogen 15140-122)、G418(Invitrogen 10131-027)、1M Hepes(Gibco 15630)、EDTA(Invitrogen 15575-038)、PBS(Invitrogen 14190-094)、胎牛血清(Invitrogen 16140-071)、EGTA、MgCl2(Merck 1.05832.1000)、吐温20(Amresco 0850C335)、SPA颗粒(麦胚凝集素(WGA)SPA珠，Perkin Elmer RPNQ0001)、[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2(内部生产的)、OptiPlateTM-96(Packard 6005290)。
缓冲液1由20mM Na-HEPES加10mM EDTA组成，并且将pH调节至7.4。缓冲液2由20mMNa-HEPES加0.1mM EDTA组成，并且将pH调节至7.4。测定缓冲液由50mM补充有5mM EGTA、5mMMgCl2、0.005％吐温20的HEPES组成，并且将pH调节至7.4。
细胞培养和膜制备
本试验中使用的细胞(克隆FCW467-12A)为BHK细胞，以BHKTS13作为亲代细胞系。该细胞表达人GLP-1受体。
使细胞在5％CO2下在DMEM、10％胎牛血清、1％Pen/Strep(青霉素/链霉素)和1.0mg/mL选择标记G418中生长。为了进行膜制备，使细胞生长至约80％汇合。将细胞在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次并收获。使用短暂离心使细胞沉淀，并将细胞沉淀物保持在冰上。在适量的缓冲液1(例如，10mL)中，将细胞沉淀物用ULTRA-THURRAX分散仪器匀浆化20-30秒。将匀浆离心15分钟。将沉淀物在10mL缓冲液2中重悬(匀浆化)并离心。再一次重复该步骤。将所得沉淀物重悬于缓冲液2中并测定蛋白质浓度。对膜进行等分并储存在-80℃下。
程序
1.对于受体结合试验，将50μl的测定缓冲液添加至测定板的每个孔中。
2.连续稀释测试化合物以得到以下浓度：8x10EE-7M、8x10EE-8M、8x10EE-9M、8x10EE-10M、8x10EE-11M、8x10EE-12M和8x10EE-13M。将25μl添加至测定板的适当的孔中。
3.将细胞膜等份解冻并稀释至其工作浓度。将50μl添加至测定板的每个孔中。
4.将WGA SPA珠以20mg/mL悬浮于测定缓冲液中。在临添加至测定板之前将悬浮液在测定缓冲液中稀释至10mg/mL。将50μl添加至测定板的每个孔中。
5.通过将25μl的480pM[125I]-GLP-1]-(7-36)NH2溶液添加至测定板的每个孔中开始温育。留下25μl等份以用于测量总计数/孔。
6.测定板在30℃下温育2h。
7.将测定板离心10min。
8.在Packard TopCountNXT仪器中读取测定板。
计算
将来自TopCount仪器的数据转移至GraphPad Prism软件。该软件对重复测量的值取平均，并进行非线性回归。通过该软件计算IC50值并以nM为单位报告。
(b)胰高血糖素受体结合
本试验的目的在于测试本发明的胰高血糖素衍生物的体外受体结合活性。该受体结合活性是衍生物对人胰高血糖素受体的亲和力的量度。
原理
在置换结合试验中测量每种化合物与人胰高血糖素受体的受体结合。在这一类型的试验中，使标记的配体(在这种情况下为125I-胰高血糖素)与受体结合。以一系列的浓度将每种衍生物添加至含有人胰高血糖素受体的分离的膜中，并监测标记的配体的置换。将受体结合报告为一半的标记的配体从受体上置换时的浓度，即IC50值。
材料
在该试验中使用以下化学品：含有Glutamax的DMEM(Gibco 61965-026)、Pen/strep(Invitrogen 15140-122)、G418(Invitrogen 10131-027)、Versene(Gibco 15040)、1M Hepes(Gibco 15630)、PBS(Invitrogen 14190-094)、胎牛血清(Invitrogen 16140-071)、MgCl2(Merck 1.05832.1000)、EDTA(Invitrogen 15575-038)、CaCl2(Sigma，C5080)、吐温20(Amresco 0850C335)、卵清蛋白(Sigma A5503)、SPA颗粒(麦胚凝集素(WGA)SPA珠，Perkin Elmer RPNQ0001)、[125I]-胰高血糖素(内部生产的)、OptiPlateTM-96(Packard6005290)。
HME缓冲液由25mM HEPES、2mM MgCl2和1mM EDTA组成，并且将pH调节至7.4。结合缓冲液由50mM补充有5mM MgCl2、1mM CaCl2、0.02％吐温20和0.1％卵清蛋白的HEPES组成，并且将pH调节至7.4。
细胞培养和膜制备。
本试验中使用的细胞(克隆BHK hGCGR A3*25)为用含有编码人胰高血糖素受体的cDNA的表达质粒稳定转染的BHK细胞。
使细胞在5％CO2下在DMEM、10％胎牛血清、1％Pen/Strep(青霉素/链霉素)和1.0mg/mL选择标记G418中生长。为了进行膜制备，使细胞生长至约80％汇合。将细胞在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次并收获。使用短暂离心使细胞沉淀，并将细胞沉淀物保持在冰上。通过添加约5mL HME缓冲液裂解细胞，通过吸液混合，并在液氮中骤冻。使细胞裂解物快速解冻，并添加HME缓冲液至10mL。将细胞沉淀物用ULTRA-THURRAX分散仪器匀浆化20-30秒。在4℃下以20,000xG离心匀浆10分钟。将沉淀物在1-2mL HME缓冲液中重悬(匀浆化)。测定蛋白质浓度。对膜进行等分并在液氮中骤冻，并储存在-80℃下。
程序
1.对于受体结合试验，将50μl测定缓冲液添加至测定板的每个孔中。
2.连续稀释测试化合物以得到以下浓度：8x10EE-7M、8x10EE-8M、8x10EE-9M、8x10EE-10M、8x10EE-11M、8x10EE-12M和8x10EE-13M。将25μl添加至测定板的适当的孔中。
3.将细胞膜等份解冻并稀释至其工作浓度。将50μl添加至测定板的每个孔中。
4.将WGA SPA珠以20mg/mL悬浮于测定缓冲液中。在临添加至测定板之前将悬浮液在测定缓冲液中稀释至10mg/mL。将50μl添加至测定板的每个孔中。
5.通过将25μl的480pM[125I]-胰高血糖素溶液添加至测定板的每个孔中开始温育。留下25μl等份以用于测量总计数/孔。
6.测定板在25℃下温育2h。
7.将测定板在1500rpm下离心10min。
8.在Packard TopCountNXT仪器中读取测定板。
计算
将来自TopCount仪器的数据转移至GraphPad Prism软件。该软件对重复测量的值取平均，并进行非线性回归。
试验(III)：用于评估肽组合物的物理稳定性的ThT原纤维形成试验
本试验的目的在于评估本发明的胰高血糖素衍生物在水溶液中的物理稳定性。
肽的低物理稳定性可导致淀粉样原纤维的形成，观察到其在样品中呈有序的丝状大分子结构，这最终可导致凝胶形成。这在传统上通过对样品的目测来测量。然而，这种测量非常不方便，并且取决于观察者。因此，小分子指示探针的应用更为有利。硫代黄素T(ThT)是这样一种探针，并且当与原纤维结合时具有不同的荧光特征[Naiki等人(1989)Anal.Biochem.177,244-249；LeVine(1999)Methods.Enzymol.309,274-284]。
可采用以下表达式利用S形曲线描述原纤维形成的时程[Nielsen等人(2001)Biochemistry 40,6036-6046]：
这里，F为在时间t时的ThT荧光。常数t0为达到最大荧光的50％所需的时间。描述原纤维形成的两个重要参数是通过t0–2τ计算出的滞后时间和表观速率常数kapp 1/τ。
提出肽的部分折叠中间体的形成是原纤维形成的一般启动机制。这些中间体中很少成核形成模板(进一步的中间体可以装配到该模板上)并且原纤维形成继续进行。滞后时间对应于建立核的临界质量的时间间隔，而表观速率常数是形成原纤维本身的速率。
在每次测定之前新鲜制备样品。每种样品的组成在图例中描述。使用适量的浓NaOH和HCl将样品的pH调节至所需值。将硫代黄素T从在H2O中的储备溶液添加至样品中，至1μM的最终浓度。
将200μl的样品等份(在10mM pH 7.5的HEPES缓冲液中的250μM胰高血糖素衍生物/类似物)放置在96孔微量滴定板(Packard OptiPlateTM-96，白色聚苯乙烯)中。通常，将每种样品(对应于一个测试条件)的四个或八个重复物放置在一列孔中。该板用Scotch Pad(Qiagen)密封。
在Fluoroskan Ascent FL荧光读板器(Thermo Labsystems)中完成在给定温度下的温育、摇动和ThT荧光发射的测量。采用调节至960rpm、振幅为1mm的定轨摇动(orbitalshaking)，将板在37℃下温育。使用通过444nm滤光器的激发，以及通过485nm滤光器的发射的测量，来完成荧光测量。
通过将板在测定温度下温育10min来启动每个运行。在期望的时间段内每20分钟对板进行测量。在各次测量之间，如描述的那样将板摇动并加热。
完成ThT试验之后，合并每种样品的四个或八个重复物，并在18℃下以20000rpm离心30分钟。通过0.22μm过滤器过滤上清液，并将等份转移至HPLC小瓶中。
使用合适的标准作为参考，通过反相HPLC测定在初始样品中和在过滤的上清液中的肽的浓度。将过滤样品的浓度占初始样品浓度的百分比分数报告为回收率。
将测量点以Microsoft Excel格式保存以供进一步处理，并使用GraphPad Prism进行曲线绘制和拟合。在不存在原纤维时来自ThT的背景发射可忽略不计。数据点通常是四个或八个样品的平均值，并示出标准差误差条。仅将在同一实验(即在同一板上的样品)中获得的数据呈现在同一曲线图中，以确保实验之间原纤维形成的相对量度。
可将数据集拟合至方程(1)。然而，通过目测曲线来确定本文报告的原纤维形成之前的滞后时间，以确定ThT荧光增加至显著高于背景水平的时间点。
试验(IV)：化学稳定性评估
本试验的目的在于评估本发明的胰高血糖素衍生物在水溶液中的化学稳定性。
通过RP-UPLC测定胰高血糖素类似物的化学稳定性。将冻干样品溶解在8mM pH8.6的磷酸盐缓冲液中，接着用HCl调节至pH 7.3，至最终浓度为333μM。将样品在5℃和37℃下温育14天，然后进行RP-UPLC分析。将纯度定义为每个色谱图中的主峰相对于所有完整峰的总面积的面积百分比。化学稳定性被确定为在37℃下14天之后的纯度损失(本文中也称为化学降解)，其如下确定：在5℃下温育的样品或起始样品(没有温育)与37℃之间的纯度差除以起始样品或在5℃下温育14天之后的纯度。
使用Waters Acquity CSH Fluoro-phenyl 150x 2.1mm,1.7μm柱进行RP-UPLC分析，该柱使用由A：0.09M磷酸盐缓冲液pH 3.6(磷酸氢二铵(di-ammoniumhydrogenphosphat))、10％MeCN(v/v％)，和B：60％MeCN(v/v％)、20％异丙醇(v/v％)组成的流动相系统在50℃和0.3mL/min的流速下操作。
在215nm下进行UV检测。以下示出了用于大多数样品的典型梯度图形。为了使类似物在与大多数类似物相比基本不同的保留时间下洗脱，对梯度图形作了一些调整，以便更好地实现样品间的纯度评估比较。数据证实了本发明的胰高血糖素衍生物的改善的化学稳定性。
通过大小排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)测定高分子量蛋白质(HMWP)含量。使用Waters Insulin HMWP 7.8x 300mm柱进行分析，该柱使用由500mM NaCl、10mM NaH2PO4、5mMH3PO4和50％(v/v)2-丙醇组成的解离流动相在50℃和0.5mL/min的流速下操作。在215nm下进行UV检测。
用于RP-UPLC分析的典型梯度图形：
时间(min) ％B
注射 24.8
1 24.8
52.5 35.8
54 90
55 90
55.2 24.8
60 24.8
实施例23：本发明的衍生物的性质
分别使用如本文所述的试验(I)(b)、试验(II)(b)、试验(III)和试验(IV)测试本发明的衍生物对人胰高血糖素受体的效力(EC50hGlucagonR)、对人胰高血糖素受体的亲和力(IC50hGlucagonR)、物理稳定性和化学稳定性。结果示于表1中。
表1
结果显示本发明的衍生物具有良好的对胰高血糖素受体的效力、良好的对胰高血糖素受体的亲和力以及良好或适度的物理稳定性和良好的化学稳定性。
虽然本文已说明并描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员现将想到许多修改、替换、变化和等同项。因此，应当理解，所附权利要求旨在涵盖落入本发明的真正范围之内的所有这样的修改和变化。

Claims (15)

1.一种包含式I的胰高血糖素类似物的衍生物，或所述衍生物的药学上可接受的盐、酰胺或酯：
Imp-X2-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-Tyr-Leu-X15-X16-Arg-Arg-Ala-X20-X21-Phe-Val-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30 [I]
其中
X2为Ser或Aib；
X10为Tyr、Leu、Ile或Val；
X12为Lys或Arg；
X15为Asp或Glu；
X16为Ser、Ala、Leu、Thr、Aib、Ile、Val或Lys；
X20为Gln、Glu、Aib或Lys；
X21为Asp、Glu或Lys；
X24为Gln、Ala、Glu、Aib或Lys；
X27为Met、Leu或Val；
X28为Asn、Ser、Thr、Gln、Ala、Gly、Glu或Lys；
X29为Thr、Gly、Ser、Gln、Ala、Glu或Lys；并且
X30不存在或为Lys；
并且其中所述衍生物包含与在式1的位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29或X30处的赖氨酸的侧链的氮原子共价连接的取代基，
其中所述取代基具有式II：
Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12- [II]
其中Y1为氢或表示C2-6酰基基团或琥珀酰基部分，并且
其中Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11或Y12单独地不存在或单独地表示选自Ser残基、Ala残基、Gly残基、式i、式ii、式iii、式iv和式v的氨基酸残基：
其中式i、ii、iii和iv单独地具有立体化学L或D，
并且条件是所述取代基具有三至十个带负电荷的部分。
2.根据前述权利要求中任一项所述的衍生物，其中所述胰高血糖素类似物与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比在所述胰高血糖素类似物中包含3-15个氨基酸残基修饰，如置换或添加。
3.根据前述权利要求中任一项所述的衍生物，其中Y12与在所述衍生物的位置X12、X16、X20、X21、X24、X28、X29或X30处的赖氨酸的侧链的所述氮原子连接。
4.根据前述权利要求中任一项所述的衍生物，其中所述取代基与赖氨酸的侧链的ε-氮原子共价连接。
5.根据前述权利要求中任一项所述的衍生物，其中所述取代基与在位置X24处的赖氨酸连接。
6.根据前述权利要求中任一项所述的衍生物，其中所述取代基具有3、4、5、6、7、8、9或10个带负电荷的部分。
7.根据前述权利要求中任一项所述的衍生物，其中所述取代基包含3-10个如3-5个或4个式i的残基。
8.根据前述权利要求中任一项所述的衍生物，其中所述取代基的Y1为乙酰基基团。
9.根据前述权利要求中任一项所述的衍生物，其中所述取代基选自以下部分：
以及
10.根据前述权利要求中任一项所述的衍生物，其中所述衍生物选自
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式1：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式2：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式3：
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-胰高血糖素
化学式4：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式5：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式6：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式7：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式8：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式9：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式10：
Nε16-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式11：
Nε20-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式12：
Nε21-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式13：
Nε28-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-胰高血糖素
化学式14：
Nε29-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-胰高血糖素
化学式15：
Nα([Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素基)-Nε[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]Lys
化学式16：
Nε24-[2-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]乙酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式17：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式18：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式19：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式20：
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素
化学式21：
以及
Nε24-[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-[[(4S)-4-乙酰氨基-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]氨基]-4-羧基丁酰基]-[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-胰高血糖素
化学式22：
11.根据前述权利要求中任一项所述的衍生物，其中所述衍生物具有如通过本文所述的试验(IV)所测定的小于5％的化学降解。
12.一种胰高血糖素类似物形式的中间产物，或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，该中间产物与胰高血糖素(SEQ ID NO:1)相比包含以下修饰：
(i)[Imp1,Aib2,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(ii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(iii)[Imp1,Aib2,His3,Leu10,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(iv)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Ala24,Leu27,Lys28]-胰高血糖素；
(v)[Imp1,His3,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(vi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(vii)[Imp1,Aib2,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(viii)[Imp1,His3,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(ix)[Imp1,His3,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(x)[Imp1,Aib2,His3,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xi)[Imp1,His3,Glu15,Lys16,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xii)[Imp1,His3,Glu15,Lys20,Glu21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xiii)[Imp1,His3,Glu15,Lys21,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xiv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Lys28]-胰高血糖素；
(xv)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys29]-胰高血糖素；
(xvi)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Leu27,Ser28,Lys30]-胰高血糖素；
(xvii)[Imp1,His3,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xviii)[Imp1,His3,Aib16,Lys24,Leu27,Ser28]-胰高血糖素；
(xix)[Imp1,His3,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Glu28]-胰高血糖素。
13.一种组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的衍生物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
14.如前述权利要求中任一项所述的衍生物，其用于在医学中使用。
15.根据权利要求14所述的衍生物，其用于治疗和/或预防低血糖。
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