DE69734607T2

DE69734607T2 - Langwirkende arzneistoffe und diese enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE69734607T2
Application number: DE69734607T
Authority: DE
Inventors: Matityahu Fridkin; Yoram Shechter; Eytan Gershonov
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1996-08-07
Filing date: 1997-08-05
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2017-08-06
Also published as: BR9711045A; HUP0000809A2; CN1227501A; IL128274A0; WO1998005361A3; JP2000515542A; EP1019089B1; DE69734607D1; CZ36999A3; CA2261835A1; AU725468B2; NZ333845A; IL128274A; DK1019089T3; WO1998005361A2; JP4416184B2; EP1019089A2; IL119029A0; CA2261835C; ES2252787T3

Description

–Die vorliegende Erfindung betrifft neue langwirkende Arzneistoffvorstufen, die im Körper einer chemischen Umwandlung aus einer unwirksamen in eine biologisch wirksame Form unterzogen werden können, wobei diese Arzneistoffvorstufen funktionelle Gruppen tragen, die empfindlich auf milde basische Bedingungen reagieren, spezieller Fluorenylmethoxycarbonyl-(Fmoc) und Fluorenylmethyl-substituierte (Fm) Arzneistoffvorstufen und Arzneimittel, die diese umfassen.
Therapeutische Arzneistoffe, die gegenwärtig sowohl in der Humantherapie als auch tierärztlich verwendet werden, können nach verschiedenen Kriterien klassifiziert werden. Zum Beispiel können Arzneistoffe als Moleküle mit einem proteinartig-peptidischen, d.h. aus Aminosäure-Baueinheiten bestehend, oder nicht-peptidischem Charakter oder durch ein Kriterium ohne Beziehung zur Struktur eingestuft werden, wie Arzneistoffe, die oral absorbiert oder auf andere Arten, d.h. Injektion, intranasal oder topisch, verabreicht werden, um den Blutkreislauf zu erreichen.
Oral absorbierte Verbindungen sind im Allgemeinen niedermolekulargewichtig, eher stabil, lipophil ("ölig") und von nicht-peptidischer Beschaffenheit. Nahezu alle peptidischen Arzneistoffe und Proteinarzneistoffe folgen aufgrund ihrer intrinsischen hydrophilen (nicht-lipophilen) und polaren Eigenschaften und metabolischen Instabilität diesen Kriterien nicht und müssen meistens durch Injektion verabreicht werden. Da diese Moleküle ferner im Körper durch verschiedene Mechanismen, in besonderem Maße Proteolyse, rasch abgebaut werden, sind sie üblicherweise kurzlebige Spezies.
Nicht-peptidische Arzneistoffe sind sehr oft ausreichend hydrophob und können den Blutkreislauf durch den Magen-Darm-Weg erreichen. Aufgrund ihrer relativen chemischen Stabilität sind die nicht-peptidischen Arzneistoffe üblicherweise langlebige Spezies.
Protein- und Peptid-Arzneistoffe haben bedeutende und zahlreiche klinische Anwendungen, z.B. Insulin bei der Behandlung von Diabetes, Analoga des Gonadotropin-releasing-Hormons (GnRH) bei der Therapie von Prostatakrebs, Calcitonin bei der Behandlung von Beschwerden, die die Knochen betreffen. Das Potential für diese wichtigste Molekülfamilie ist enorm, aber ist bisher nur teilweise, wenn nicht geringfügig, erforscht worden. Das liegt weitgehend an ihrer kurzen Lebensdauer im Körper und der Unbequemlichkeit der Verabreichungsart. Nicht-peptidische Arzneistoffe, wie Antibiotika, sind, obgleich relativ langlebig, mehrmals am Tag über einen Zeitraum von einer Woche oder länger zu verabreichen, um die gewünschten kontinuierlichen zirkulierenden Spiegel zu erhalten.
Die orale Absorption von Arzneistoffen ist ein höchst erstrebenswertes Ziel bei der Behandlung menschlicher Erkrankungen, insbesondere bei anhaltenden therapeutischen Behandlungen. Die strukturelle Veränderung von Arzneistoffen kann zur Zunahme der oralen und topischen Absorption, der biologischen Stabilität und schließlich der biologischen Verfügbarkeit führen. Hauptsächliche Bemühungen sind gegenwärtig auf diese Ziele gerichtet. Die meisten Ansätze schließen eine derartige Arzneistoffmodifikation ein, dass ihre natürliche Architektur, d.h. biologisch wirksame Struktur, erhalten bleibt. Diese natürliche Struktur ist diejenige, die speziell vom Ziel des Arzneistoffs erkannt wird, und ist ein erforderliches Merkmal der Wirksamkeit des Arzneistoffs. Bedauerlicherweise wird jedoch in vielen Fällen die natürliche Struktur auch durch das "Klärungs-Maschinerie-System" erkannt, das den Arzneistoff binden, abbauen oder ihn metabolisieren kann und so seine Beseitigung beschleunigt. So ist oft eine Stabilisierung der biologisch wirksamen Struktur begleitend mit dem Wunsch, die metabolische Stabilität zu verbessern, versucht worden. Verfahren wie Verkapselung, verminderte Löslichkeit und chemische Modifikation sind eingesetzt worden, um dieses Ziel zu erreichen.
Es wäre höchst erstrebenswert, die Halbwertszeit geradezu vieler, wenn nicht aller peptidischen sowie nicht-peptidischen Arzneistoffe, die auf dem Markt vorhanden sind oder in der Zukunft zu entwickeln sind, einschließlich Antibiotika, antiviraler, blutdrucksenkender, entzündungshemmender, schmerzstillender, Cholesterinspiegel-senkender, antikarzinogener, antidiabetischer, wachstumsfördernder und anderer Arzneistoffe zu verlängern. Arzneistoffvorstufen, die mit natürlichen Arzneistoffen verwandt sind, die oberhalb bestimmter Grenzkonzentrationen toxisch sind, dürften besonders vorteilhaft sein.
Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Arzneistoffvorstufen bereitzustellen, die durch ihre hohe Empfindlichkeit gegenüber milden basischen Bedingungen und ihre Fähigkeit, sich unter physiologischen Bedingungen im Körper einer Umwandlung aus einer unwirksamen in eine biologisch wirksame Form zu unterziehen, gekennzeichnet sind.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Arzneistoffvorstufen bereitzustellen, die von Arzneistoffen mit freien Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl- und/oder Mercaptogruppen abgeleitet sind, wobei diese Arzneistoffvorstufen im Wesentlichen biologisch nicht wirksam sind, aber im Anschluss an eine Verabreichung im Körper zu einer spontanen und langsamen Umwandlung zum ursprünglichen wirksamen Arzneistoffmolekül imstande sind.
Es ist noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Arzneistoffvorstufen bereitzustellen, die eine höhere metabolische Stabilität und vermehrte biologische Verfügbarkeit bieten.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Arzneistoffvorstufen bereitzustellen, die alternative Möglichkeiten zur Arzneistoffverabreichung, z.B. oral und transdermal, darstellen und ferner imstande sind, physiologische Barrieren, z.B. die Blut-Hirn-Schranke, zu durchdringen.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Arzneistoffvorstufen bereitzustellen, die ein spezielles Abzielen des Arzneistoffs auf befallene Stellen im Körper zulassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit Arzneistoffvorstufen, die von einem Arzneistoff derivatisiert sind, wobei eine oder mehrere Gruppen dieses Arzneistoffmoleküls, die aus freien Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl- und/oder Mercaptogruppen ausgewählt sind, durch funktionelle Gruppen substituiert sind, die empfindlich auf Basen reagieren und unter milden basischen, z.B. physiologischen, Bedingungen entfernbar sind.
Das neue Konzept der Erfindung für langsam freigebende Arzneistoffe schließt ihre Derivatisierung zu neuen, im Allgemeinen hydrophoberen, Arzneistoffderivaten ein. Bei diesem Ansatz ist es bevorzugt, die natürliche Konformation, die biologische Wirksamkeit und die Erkennungsidentität des Arzneistoffs durch die abbauenden Systeme lieber zu verlieren als zu erhalten. Ein Vorteil dieses Ansatzes liegt jedoch in der Tatsache, dass das so modifizierte Derivat unter den in vivo-Bedingungen langsam und spontan zurück zum natürlichen wirksamen Arzneistoff hydrolysieren kann.
Die Arzneistoffvorstufen der Erfindung haben die Formel: X-Y wobei
Y eine Arzneistoffeinheit ist, die mindestens eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus freiem Amino, Carboxyl, Hydroxyl und/oder Mercapto trägt, und
X ein aus den Resten der Formeln (i) bis (iv) ausgewählter Rest ist:
wobei R₁ und R₂, gleich oder verschieden, jeweils Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Aryl, Alkaryl, Aralkyl, Halogen, Nitro, Sulfo, Amino, Ammonium, Carboxyl, PO₃H₂ oder OPO₃H₂ sind; R₃ und R₄, gleich oder verschieden, jeweils Wasserstoff, Alkyl oder Aryl sind; und A eine kovalente Bindung ist, wenn der Rest an eine Carboxyl- oder Mercaptogruppe des Arzneistoffs Y gebunden ist, oder A OCO- ist, wenn der Rest an eine Amino- oder Hydroxylgruppe von Y gebunden ist, mit der Maßgabe, dass, wenn R₁ bis R₄ Wasserstoff sind und A OCO- ist, Y keine Arzneistoffeinheit ist, die eine O-Malonyltyrosylgruppe enthält.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist Y eine Einheit eines beliebigen Arzneistoffs zur menschlichen und tierärztlichen Verwendung, die mindestens eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus freiem Amino, Carboxyl, Hydroxyl und/oder Mercapto, trägt, wie antidiabetische Arzneistoffe, z.B. Insulin; Wachstumsförderer, z.B. menschliches Wachstumshormon, Rinder- Wachstumshormon; Antibiotika, wie Aminoglykoside, z.B. Gentamicin, Neomycin und Streptomycin, β-Lactame, wie Penicilline, z.B. Amoxicillin, Ampicillin, Piperacillin, und Cephalosporine, z.B. Cefaclor, Cefminox und Cefalexin, Macrolide, z.B. Carbomycin und Erythromycin, und Polypeptidantibiotika, z.B. Bacitracin, Gramicidine und Polymyxine; synthetische antibakterielle Mittel, z.B. Trimethoprim, Piromidinsäure und Sulfamethazin; schmerzstillende und entzündungshemmende Arzneistoffe, z.B. Acetaminophen, Aspirin, Ibufenac, Indometacin; antiallergische und antiasthmatische Arzneistoffe, z.B. Amlexanox und Cromolyn; antihypercholesterinämische Arzneistoffe, z.B. Clofibrinsäure, Oxiniacinsäure und Triparanol; β-adrenerge Blocker und blutdrucksenkende Arzneistoffe, z.B. Bupranolol, Captopril, Indenolol, Propranolol und 4-Aminobuttersäure; antineoplastische Arzneistoffe, z.B. Daunorubicin, Azacitidin, 6-Mercaptopurin, Interferone, Interleukin-2, Methotrexat, Taxol und Vinblastin; antivirale Arzneistoffe, z.B. Acyclovir, Ganciclovir, Amantadin, Interferone, AZT und Ribavirin, usw., aber ist nicht darauf beschränkt. Der Begriff Arzneistoff gemäß der Erfindung soll auch Pheromone umfassen.
Die Begriffe "Alkyl", "Alkoxy", "Alkoxyalkyl", "Aryl", "Alkaryl" und "Aralkyl" bei den Definitionen von R₁, R₂, R₃ und R₄ hier werden verwendet, um Alkylreste mit 1–8, vorzugsweise 1–4 Kohlenstoffatomen, z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl und Butyl, und Arylreste mit 6–10 Kohlenstoffatomen, z.B. Phenyl und Naphthyl, zu bezeichnen. Der Begriff "Halogen" schließt Brom, Fluor, Chlor und Iod ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die funktionelle Gruppe der Rest (i), wobei R₁, R₂, R₃ und R₄ Wasserstoff sind und A OCO- ist, d.h. der gut bekannte 9-Fluorenylmethoxycarbonylrest (Fmoc), der in der Peptidsynthese zum vorübergehenden reversiblen Schutz von Aminogruppen viel verwendet wird (zum Überblick siehe L. A. Carpino, Acc. Chem. Res. (1987) 20, 401–407). Die Fmoc-Gruppe ist zur Peptidsynthese besonders geeignet aufgrund der günstigen synthetischen Handhabung zu seiner Einführung und Entfernung und der bevorzugten Stabilität als Voraussetzung zur Peptidsynthese und der bequemen Reinigung. Außerdem ist die verwandte 9-Fluorenylmethylgruppe (Fm) auch zur reversiblen Maskierung von Carboxylfunktionen, z.B. von Aminosäuren, verwendbar. Die resultierenden 9-Fluorenylmethylester (Fm-Ester) erzeugen die freien Stammcarboxylfunktionen, wobei nach milder basischer Behandlung einem β-Eliminierungs-Reaktionsweg gefolgt wird, und können so in ähnlicher Weise zur reversiblen Maskierung von Carboxylfunktionen von Arzneistoffen eingesetzt werden. Die Fmoc-Gruppe wird weiter potentiell ähnlich beim reversiblen Schutz von Hydroxylgruppen des Tyrosins, Serins und Threonins verwendet.
Die halogenierten Fmoc-Reste (i), bei denen mindestens ein Rest von R₁ und R₂ Halogen in der 2- oder 7-Position, vorzugsweise Cl oder Br, ist, der 2-Chlor-1-indenylmethoxycarbonylrest (CLIMOC) (ii), der 1-Benzo[f]indenylmethoxycarbonylurethanrest (BIMOC) (iii), der Urethansulfonrest (iv) und die entsprechenden Reste (i) bis (iv), bei denen A eine kovalente Bindung ist, können in ähnlicher Weise wie Fmoc und Fm zur Substitution freier Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl- und Mercaptofunktionen von Arzneistoffen verwendet werden, wobei so eine große Auswahl von Empfindlichkeit gegen eine Entfernung solcher Gruppen unter basischen, z.B. physiologischen, Bedingungen bereitgestellt wird. Tatsächlich gehören die vorstehenden Reste (i) bis (iv) zu einer allgemeinen Familie seltener chemischer Einheiten, die bei neutralem oder leicht alkalischem pH-Wert und milden Bedingungen eine Hydrolyse erfahren, und können deshalb zum vorübergehenden reversiblen Schutz von α- und ε-Aminogruppen, zum Beispiel in der Peptidsynthese, verwendet werden und können von der Aminofunktion durch eine β-Eliminierungsreaktion unter milden basischen Bedingungen entfernt werden.
Gemäß der Erfindung wird der Rest (i) bis (iv), vorzugsweise kovalent an Amino- und/oder Hydroxyleinheiten gebundenes Fmoc oder kovalent an Carboxyl- und/oder Mercaptoeinheiten gebundenes Fm, einer Hydrolyse (über β-Eliminierung) zurück zur freien Amino-, Hydroxy-, Mercapto- oder Carboxylfunktionen unter physiologischen Bedingungen in der Körperflüssigkeit und zwar bei pH 7,4 und 37°C unterworfen.
Die Arzneistoffvorstufen der Erfindung können durch Umsetzung des Arzneistoffmoleküls mit einem geeigneten Reagens, das einen Rest (i) bis (iv) umfasst, hergestellt werden. Verschiedene Derivate von 9-Fluorenylmethyl (Fm) sind verfügbar, wie 9-Fluorenylmethyl-N-hydroxysuccinimid (Fmoc-OSu), ein sehr spezifisches Reagens für Aminofunktionen; 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid (Fmoc-Cl), das sich mit Amino- und Hydroxylresten umsetzt und kovalent damit verknüpft; 9-Chlormethylfluoren (Fm-Cl), das sich mit Mercaptoresten umsetzt, wobei S-Fm-Derivate erhalten werden (Bodanszky und Bednarek, 1982); und 9-Fluorenylmethanol (Fm-OH), das sich mit Carboxylfunktionen umsetzt und diese verestert.
Für basische Bedingungen empfindliche funktionelle Gruppen, die von Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl- oder Mercaptofunktionen entfernt werden können, wobei andere Wege als die β-Eliminierung verfolgt werden, sind auch verfügbar, aber sie erfordern üblicherweise umfangreiche Manipulationen, die für einen Arzneistoffschutz nicht angemessen sind. Eine bekannte Ausnahme ist die Trifluoracetylgruppe (TFA), die in ihrer leichten Entfernung von Aminogruppen eher Fmoc ähnlich ist, aber sie ist möglicherweise toxisch, und so werden TFA- derivatisierte Arzneistoffe für therapeutische Zwecke nicht empfohlen. Andererseits wurde gezeigt, dass Fmoc-Aminosäuren, z.B. Fmoc-Leucin, einen geringen Toxizitätsindex bei Versuchstiermodellen aufweisen (Burch et al., 1991).
Die Erfindung betrifft ferner Arzneimittel, die eine Arzneistoffvorstufe gemäß der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.
1 zeigt den Zeitverlauf der Aktivierung (pH 7,4, 37°C) entweder von Lys^B29-N-(Fmoc)₁-Insulin (geschlossene Quadrate), Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₂-Insulin (offene Quadrate) und Gly^A1,Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₃-Insulin (an allen drei Aminogruppen substituiert, offene Kreise), wie er durch einen zellfreien biologischen Assay bestimmt wird (Phosphorylierung von [Poly(Glu₄Tyr)] durch angereicherte Zubereitung von Insulinrezeptor-Tyrosinkinase).
2 zeigt die Wirkung einer einzelnen intraperitonealen Verabreichung von (Fmoc)₂-Insulin (3 mg/Ratte in 2 ml 10%igem DMSO) und NPH-Insulin (3 mg/Ratte) auf den Blutzuckerspiegel normaler Ratten.
3 zeigt die Wirkung einer einzelnen intraperitonealen Verabreichung von (Sulfmoc)₂-Insulin und natürlichem Insulin (beide 3 mg/Ratte in 1 ml Wasser) auf den Blutzuckerspiegel normaler Ratten.
4 zeigt den Abbau von Insulin (offene Quadrate) und Gly^A1,Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₃-Insulin (geschlossene Rauten) durch ein Gemisch aus Trypsin und Chymotrypsin.
5 zeigt die Wirkung einer einzelnen Gly^A1,Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₃-Insulin-Verabreichung (geschlossene Kreise) auf die Blutzuckerspiegel diabetischer Streptozotocin (STZ)-behandelter Ratten im Vergleich zur Verabreichung natürlichen Insulins (offene Quadrate).
6 zeigt, dass eine einzelne Verabreichung von Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₂-Insulin an STZ-behandelte hyperglykämische Ratten eine verlängerte Wirkung beim Senken von Blutzuckerspiegeln induziert.
7 zeigt die β-adrenerge antagonistische Wirksamkeit von N-Fmoc-Propranolol durch die Erzeugung von wirksamem Propranolol nach Inkubation.
Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneistoffvorstufen, die gemäß einem neuen Konzept zur Entwicklung besserer Wege der Arzneistoffverabreichung und folglich verbesserter Arzneistoffstabilität und biologischer Wirksamkeit gedacht sind. Gemäß dem neuen Ansatz der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, die natürliche Struktur, biologische Wirksamkeit und Zielerkennungskapazität des Arzneistoffs lieber zu verlieren als zu erhalten, aber im Anschluss an eine Anwendung wird sich der so modifizierte Arzneistoff im Körper spontan und langsam zurück zum ursprünglichen wirksamen Molekül umwandeln.
Gemäß dem neuen Konzept der vorliegenden Erfindung können zahlreiche gegenwärtig angewandte Arzneistoffe in unwirksame Arzneistoffvorstufen umgewandelt werden, die langlebige Spezies sind, da sie einem allgemeinen und Rezeptor-vermittelten Abbau im Organismus entgehen. Die Arzneistoffvorstufen der Erfindung sind dafür gedacht, sich einer spontanen Rückbildung zu den ursprünglichen Arzneistoffen unter physiologischen in vivo-Bedingungen und in homogener Art und Weise zu unterziehen. Das breite Spektrum chemischer Verfahren, das für die Herstellung der Arzneistoffvorstufen der Erfindung verfügbar ist, erlaubt es, nach Bedarf eine rasche oder langsame Reaktivierungsrate zu erhalten. So können vorgegebene Arzneistoffvorstufen mit physikalischen Eigenschaften, wie verminderter Löslichkeit und deshalb einer langsameren s.c.-Absorptionsrate, hergestellt werden. Außerdem gestattet Verändern des Hydrophobieindexes der Arzneistoffvorstufen zusammen mit der Fähigkeit zu einer spontanen Rückbildung im Blutkreislauf, oral nicht absorptionsfähige Arzneistoffe in gastrointestinal durchlässige Arzneistoffvorstufen umzuwandeln.
Die Arzneistoffvorstufen gemäß der Erfindung schließen modifizierte Arzneistoffe zur Verwendung bei Menschen und Tieren sowie modifizierte Insektenpheromone ein.
Unter einem Aspekt der Erfindung ist die Arzneistoffvorstufe modifiziertes Insulin. Gegenwärtig ist Insulin der vorherrschende Arzneistoff für Diabetes mellitus, eine Gruppe von Syndromen, die durch Hyperglykämie, veränderten Metabolismus von Lipiden, Kohlehydraten und Proteinen und ein erhöhtes Risiko für Komplikationen aus Gefäßerkrankungen gekennzeichnet ist. Die meisten Patienten können klinisch klassifiziert werden, dass sie entweder Insulin-abhängigen (IDDM, Typ I) oder Insulin-unabhängigen Diabetes mellitus (NIDDM, Typ II) haben. In der westlichen Welt haben etwa 90% der diabetischen Patienten Typ II-Diabetes und die meisten des Rests haben Typ I. Etwa 70% der Typ II-Diabetiker in den Vereinigten Staaten sind auch fettleibig, ein Faktor, der maßgeblich zur Insulinresistenz beiträgt. Bei Typ I-Diabetes gibt es einen weitgehenden und selektiven Verlust von Pankreas-β-Zellen und einen Insulinmangelzustand. Im Gegensatz dazu gibt es keinen signifikanten Verlust von β-Zellen aus den Inseln bei Typ II-diabetischen Patienten, wobei bei diesen Patienten die mittlere Plasmakonzentration von Insulin über einen Zeitraum von 24 Stunden aufgrund peripherer Resistenz gegen die Hormonwirkung im Wesentlichen normal oder sogar erhöht ist. Dennoch weisen Personen mit Typ II-Diabetes einen relativen Insulinmangel auf. Dies liegt daran, dass eine normale Pankreas-β-Zelle imstande sein sollte, Insulinmengen zu sezernieren, die beträchtlich größer sind als gewöhnlich, wenn sie mit Hyperglykämie konfrontiert wird, was folglich einer Person erlaubt, angesichts mäßiger Insulinresistenz einen normalen Blutzuckerspiegel zu erhalten.
Nahezu alle Formen von Diabetes mellitus beruhen entweder auf einer Abnahme der zirkulierenden Insulinkonzentration (Insulinmangel) oder einer Abnahme der Reaktion der peripheren Gewebe auf Insulin (Insulinresistenz) im Zusammenhang mit einem Überschuss von Hormonen mit Wirkungen, die denen des Insulins entgegengesetzt sind (Glukagon, Wachstumshormon, Kortisol und Katecholamine). Diese hormonalen Anomalien führen zu Veränderungen beim Metabolismus von Kohlenhydraten, Lipiden, Ketonen und Aminosäuren. Das zentrale Merkmal des Syndroms ist Hyperglykämie.
Die Halbwertszeit von Insulin in Plasma beträgt etwa 5–6 min. Der Abbau von Insulin erfolgt hauptsächlich in der Leber und in geringerem Ausmaß in Nieren und Muskeln. Etwa 50% des Insulins, das die Leber in der Pfortader erreicht, wird zerstört und erreicht nie den allgemeinen Kreislauf. Insulin wird durch die Nierenglomeruli filtriert und wird durch die Tubuli resorbiert, die es auch abbauen.
Der proteolytische Abbau von Insulin in der Leber ist hauptsächlich Rezeptor-vermittelt. Im Anschluss an die Insulin-Rezeptorbindung wird der Komplex in kleine Vesikel, Endosomen genannt, internalisiert, wo der Abbau eingeleitet wird. Etwas Insulin wird auch zum Abbau an Lysosomen abgegeben. In Hepatozyten wird etwa 50% des internalisierten Insulins abgebaut.
Insulin ist entscheidend für das Management der Diabetes-Ketoazidose und wichtig bei der Behandlung des hyperglykämischen nicht-ketonischen Komas und beim perioperativen Management sowohl diabetischer Typ I- als auch Typ II-Patienten. Die subkutane (s.c.) Verabreichung von Insulin ist die hauptsächliche Behandlung für alle diabetischen Typ I-Patienten und die meisten Typ II-Patienten, die nicht angemessen durch Diät und/oder orale blutzuckersenkende Mittel kontrolliert werden. In allen Fällen ist das Ziel, nicht nur den Blutzucker, sondern auch alle anderen Aspekte des unausgewogenen Metabolismus, der aus einem Insulinmangel und einer Hyperglykämie resultiert, zu normalisieren.
Die Langzeitbehandlung, die hauptsächlich auf der s.c.-Verabreichung von Insulin basiert, imitiert nicht den normalen raschen Anstieg und Abfall der Insulinsekretion als Reaktion auf eingespeiste Nährstoffe und besitzt bevorzugt eher periphere als hepatische Wirkungen von Insulin, aber dennoch ist ein beachtlicher Erfolg mit dieser Behandlung erreicht worden.
Insulinzubereitungen, die traditionell zur s.c.-Anwendung verwendet werden, werden gemäß ihrer Wirkungsdauer in kurz-, intermediär- oder lang-wirkende Insuline und nach dem Ursprung der Spezies klassifiziert. Humaninsulin ist jetzt weitgehend verfügbar und theoretisch wird erwartet, dass es weniger immunogen ist als Schweine- oder Rinderinsuline, da sich die letzten beiden von Humaninsulin durch eine bzw. drei Aminosäuren unterscheiden. Wenn sie jedoch hoch gereinigt sind, haben alle drei Insuline eine geringe, aber messbare Kapazität, die Immunreaktion zu stimulieren. Zubereitungen bei neutralen pH-Werten sind im Allgemeinen stabil und gestatten eine Lagerung über lange Zeiträume bei Raumtemperatur. Zu traditionellen und therapeutischen Zwecken werden Insulindosen und -konzentrationen in Einheiten (U) ausgedrückt, die auf die Menge bezogen sind, die erforderlich ist, um eine Normoglykämie bei nüchternen Kaninchen zu induzieren. Homogene Insulinzubereitungen enthalten etwa 25 U/mg. Fast alle handelsüblichen Insulinzubereitungen werden in Lösung mit einer Konzentration von 100 U/ml geliefert.
Kurz- oder rasch-wirkende Insuline sind lösliche Zubereitungen aus kristallinem Zinkinsulin, gelöst in einem Puffer mit neutralem pH-Wert, die üblicherweise 30–45 Minuten vor den Mahlzeiten injiziert werden. Diese Zubereitungen weisen den raschesten Beginn der Wirkung und die kürzeste Dauer auf.
Unter stabilen metabolischen Bedingungen werden reguläre Insuline üblicherweise zusammen mit intermediär- oder langwirkenden Zubereitungen verabreicht. Intermediär-wirkende Insuline wurden so ausgelegt, dass sie in wässrigen Lösungen weniger löslich sind; deshalb lösen sie sich allmählicher nach subkutaner Verabreichung und ihre Wirkungsdauer ist länger. Zwei Zubereitungen, die am häufigsten verwendet werden, sind NPH-Insulin (NPH steht für Neutrales Protamin Hagedorn), eine Suspension von Zinkinsulinkristallen in Phosphatpuffer, der durch den Zusatz von Protaminsulfat modifiziert ist, und Lente-Insulin, eine Suspension von Insulin in Acetatpuffer, der durch den Zusatz von Zinkchlorid modifiziert ist, um die Löslichkeit des Insulins zu minimieren.
Da erwartet wird, dass kurz-wirkendes Insulin einen Zeitraum von 0,4–7 Stdn. abdeckt, und intermediär-wirkendes Insulin einen Bereich von 1,5–20 Stdn. abdecken kann, müssen die richtige Zeiteinteilung und die Dosen der Kombination der zwei Insuline die veränderlichen Parameter, wie Ernährungsverhalten, nächtliche (nüchterne) Unterzuckerung und morgendliche Hyperglykämie, berücksichtigen, wenn die Wirksamkeit der entgegengesetzt-regulatorischen Hormone (zu Insulin) erhöht ist. Falls rasch-wirkende und lang- oder intermediär-wirkende Insulinzubereitungen zusammen verabreicht werden, ist ein häufiger Nachteil solcher Kombinationen, dass nach dem Mischen etwas der rasch-wirkenden Insuline mit überschüssigem Zn²⁺ oder Protamin der lang- oder intermediär-wirkenden Zubereitung komplexiert werden kann, und so in ein intermediär- und sogar lang-wirkendes Insulin umgewandelt werden.
Lang-wirkende Insuline, wie Ultralente-Insulin oder verlängerte Zink-Insulin- oder Protamin-Zink-Insulin-Suspensionen, sind Insulinzubereitungen, bei denen Zink oder Zink plus Protamin im Überschuss zugesetzt wurde, um unlösliche Insulinzubereitungen zu erreichen. Sie sind Suspensionen winziger Zinkinsulinteilchen und unterscheiden sich nur in der Teilchengröße, die die Dauer ihrer Wirkung bestimmt. Im Gegensatz zu regulärem Insulin weisen Ultralente-Insuline einen sehr langsamen Beginn und einen anhaltenden ("flachen") Peak der Wirkung auf. Es wird dafür eingetreten, eine geringe Basiskonzentration von Insulin während des ganzen Tages bereitzustellen, aber ihre lange Halbwertszeit erschwert es, die optimale Dosierung zu bestimmen, und mehrere Behandlungstage sind erforderlich, bevor eine stationäre Konzentration erreicht werden kann. Rinder- und Schweine-Ultralente-Insulin haben einen verlängerten Wirkungsverlauf als menschliches Ultralente-Insulin. Es wird empfohlen, die Therapie mit dreimaligen normalen täglichen Dosen als Beladungsdosis einzuleiten, worauf einmal oder zweimal tägliche Injektionen folgen.
Insulin weist drei Amino- und sechs Carboxylgruppen auf, die für eine Modifikation verfügbar sind. Die Insulinderivate der Erfindung sind an den A- und B-Ketten des Insulins durch einen oder mehrere der vorstehenden Reste (i) bis (iv) an einer oder mehreren der endständigen Aminogruppen der Gly^A1- und Phe^B1-Reste, an der ε-Aminogruppe von Lys^B29, an den endständigen Carboxylgruppen von Asn^A21 und Thr^B30 und/oder an den freien Carboxylgruppen von Glu^A4, Glu^A17, Glu^B13 und Glu^B21 substituiert. Außerdem können die so substituierten Carboxyl- und/oder Amino-Insulinderivate weiter durch eine oder mehrere der funktionellen Gruppen (i) bis (iv) an einer oder mehreren der freien Hydroxylgruppen der Reste Thr^A8, Ser^A9, Ser^A12, Tyr^A14, Tyr^A19, Ser^B9, Tyr^B16, Tyr^B26, Thr^B27 und Thr^B30substituiert sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Insulinderivate durch eine oder mehrere Fmoc-Einheiten an den freien endständigen Aminogruppen von Gly^A1 und Phe^B1 und/oder an der ε-Aminogruppe von Lys^B29 substituiert, wobei so Insulinderivate mit 1 bis 3 Fmoc-Substituenten an den Positionen A¹, B¹ und/oder B²⁹ des Insulinmoleküls, insbesondere Gly^A1-N-(Fmoc)₁-, Phe^B1-N-(Fmoc)₁- und Lys^B29-N-(Fmoc)₁-Insulin, Gly^A1,Phe^B1-N-(Fmoc)₂-, Gly^A1,Lys^B29-N-(Fmoc)₂- und Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₂-Insulin und Gly^A1,Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₃-Insulin erhalten werden.
Die Umsetzung von Insulin mit aktiviertem Fmoc, zum Beispiel mit 9-Fluorenylmethyl-N-hydroxysuccinimid (Fmoc-OSu) liefert Mono-, Di- und Tri-N-Fmoc-insuline, die durch HPLC-Verfahren leicht getrennt und einzeln in reiner Form erhalten werden können. Um ein Di-N-Fmoc-insulin als einziges Produkt zu erhalten, wird zuerst eine der freie Aminogruppen z.B. mit der t-Boc-Gruppe geschützt, das geschützte Insulinderivat mit überschüssigem Fmoc-OSu umgesetzt und die Schutzgruppe dann entfernt, was zum gewünschten Di-N-Fmoc-insulin führt. Wenn sie diabetischen Patienten verabreicht werden, werden die Mono-, Di- und Tri-N-Fmoc-insuline in vivo in natürliches Insulin umgewandelt, was zu antidiabetischen Wirkungen über verschiedene einschließlich verlängerte Zeiträume führt.
Um nur die Carboxylgruppen des Insulins (C-Fm), d.h. beim endständigen Asn^A21 und Thr^B30 und bei den Glu^A4-, Glu^A17-, Glu^B13- und Glu^B21-Resten, zu substituieren, werden zuerst die freien Aminogruppen des Insulinmoleküls z.B. mit t-Boc-Gruppen geschützt und dann wird eine dreistufige Umsetzung ausgeführt, wobei (1) die freien Carboxylgruppen durch Umsetzung z.B. mit o-Nitrophenol oder N-Hydroxysuccinimid in aktive Estergruppen umgewandelt werden; (2) eine Umsetzung der aktivierten Estergruppen mit 9-Fluorenylmethanol in Gegenwart von Imidazol durchgeführt wird; und (3) die schützenden t-Boc-Gruppen entfernt werden. Ein alternatives Verfahren umfasst eine einstufige direkte Veresterung der Carboxylgruppen mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, 9-Fluorenylmethanol und 4-Dimethylaminopyridin, gefolgt von einer Entfernung der t-Boc-Gruppen.
Wenn Fmoc-Insulinderivate, die sowohl an den Amino- als auch Carboxylgruppen (N-Fmoc, C-Fm) substituiert sind, gewünscht sind, wird zuerst mit Fmoc-OSu das N-Fmoc-Derivat hergestellt und das N-Fmoc-Insulin wird dann in aktive Ester umgewandelt, worauf eine Umsetzung mit 9-Fluorenylmethanol folgt, wie es vorstehend beschrieben ist.
Zur Herstellung von Fm, Fmoc-Insulinderivaten, die an den Carboxyl- und Hydroxylfunktionen (C-Fm, O-Fmoc) substituiert sind, werden die Aminogruppen zuerst mit t-Boc geschützt, wird das C-Fm-Insulinderivat wie vorstehend hergestellt, worauf eine Umsetzung mit 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid und eine Entfernung der schützenden N-t-Boc-Gruppen folgt.
Zur Herstellung von Fm, Fmoc-Insulinderivaten, die an den Amino-, Carboxyl- und Hydroxylfunktionen (N, O-Fmoc, C-Fm) substituiert sind, wird das N-Fmoc, C-Fm-Insulin wie vorstehend hergestellt und dann mit 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid umgesetzt.
Die modifizierten Insuline gemäß der Erfindung können aus einem beliebigen Insulin, das zur Verwendung beim Menschen geeignet ist, wie natürlichem, rekombinantem oder mutiertem Human-, Schweine- oder Rinder- Insulin hergestellt werden. Beispiele mutierter Insuline sind das B16-Tyr→His-Humaninsulinanalogon (Kaarsholm und Ludvigsen, 1995) und das Lys^B28Pro^B29-Humaninsulinanalogon (Insulin Lispro), wobei die natürlich vorkommende Aminosäuresequenz der Positionen B28 und B29 umgekehrt ist. Insulin Lispro ist gleich wirksam wie Humaninsulin und wird sogar schneller aus subkutanen Injektionsstellen absorbiert (Campbell et al., 1996). In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Insulin entweder natürliches oder rekombinantes Humaninsulin.
Die Mono-N-Fmoc-insulinderivate der vorliegenden Erfindung weisen 40–80% der biologischen Wirksamkeit natürlichen Insulins auf, wie sie durch den [Poly(Glu₄Tyr)]-Phosphorylierungs-Assay bestimmt wird. Die Di- und Tri-N-Fmoc-insulinderivate weisen 2–9% bzw. < 1% der biologischen Wirksamkeit natürlichen Insulins auf, wie sie durch den [Poly(Glu₄Tyr)]-Phosphorylierungs-Assay bestimmt wird. Wenn sie genau in den richtigen Anteilen verwendet werden, können diese drei Prototypen im Prinzip die traditionellen Gemische rasch-, intermediär- und lang-wirkender Insuline, die gegenwärtig in der subkutanen Therapie von Diabetes angewandt werden, ersetzen. Unter dem Insulin betreffenden Aspekt stellt die Erfindung Arzneimittel bereit, die ein oder mehrere Insulinderivate der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Für einen lang-wirkenden Effekt wird die Zusammensetzung vorzugsweise entweder das N-(Fmoc)₃-Insulin- oder das N-(Fmoc)₂ Insulinderivat allein oder ein Gemisch aus beiden umfassen. Das Arzneimittel kann in einer beliebigen geeigneten Form, zum Beispiel als orale Formulierung oder zur subkutanen Injektion, vorgelegt werden.
In einer anderen Ausführungsform des gleichen Aspekts betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Diabetes, das das Verabreichen einer wirksamen Dosis eines oder mehrerer Insulinderivate der Erfindung an einen diabetischen Patienten umfasst. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Derivat entweder natürliches oder rekombinantes menschliches N-(Fmoc)₃-Insulin oder N-(Fmoc)₂-Insulin oder ein Gemisch aus beiden, das in 5- bis 8-tägigen Intervallen verabreicht wird. Falls notwendig, wird die Behandlung mit dem Fmoc-Insulinderivat durch tägliche Verabreichung rasch-wirkenden Insulins vervollständigt.
Zur Langzeitbehandlung wird Insulin hauptsächlich durch subkutane Injektionen verabreicht. Die gegenwärtige Behandlung mit lang-wirkenden Insulinen, die subkutan verabreicht werden, leidet aufgrund der Tatsache, dass die zugefügten Stoffe möglicherweise an der Stelle der subkutanen Injektion wegdiffundieren können, an großen Schwankungen in der Absorption unter den einzelnen diabetischen Patienten. Die vorliegende Erfindung stellt Insulinderivate mit "eingebauter" verminderter Löslichkeit innerhalb des Insulinmoleküls selbst bereit. Es wird erwartet, dass dies bei Menschen die große Schwankung in der subkutanen Absorption elimiert und auch Störungen nach dem Mischen der Analoga minimiert oder sogar elimiert. Das richtige Gemisch der drei N-(Fmoc)-Insulin-Prototypen kann eine anhaltende Wirkungsdauer abdecken, da es den Bedarf an rasch-wirkendem Insulin zusammen mit den langsam freigegebenen Wirkungen von N-(Fmoc)₂- und N-(Fmoc)₃-Insulin kombiniert, die alle ohne störende Wirkungen miteinander gemischt werden können.
In einer anderen Ausführungsform des gleichen Aspekts umfasst die Zusammensetzung der Erfindung ein Gemisch aus Mono-, Di- und Tri-N-Fmoc-Insulinderivaten. N-(Fmoc)₃-Insulin ist grundsätzlich ein lang-wirkendes Insulin; N-(Fmoc)₁-Insuline sind 40–80% biologisch wirksam, wie es durch den [Poly(Glu₄Tyr)]-Phosphorylierungs-Assay bestimmt wird, und zeigen höhere Löslichkeit in wässrigen Lösungen und N-(Fmoc)₂-Insuline sind 2–9% biologisch wirksam, wie es durch den [Poly(Glu₄Tyr)]-Phosphorylierungs-Assay bestimmt wird, und sind in wässrigen Lösungen weniger löslich. Alle drei Analoga kehren nach Inkubation bei 37°C bei physiologischen pH-Werten zu voll wirksamen Insulinen zurück. So kann das richtige Gemisch der drei Analoga einen rasch-, intermediär- und lang-wirkenden Effekt ergeben, der derzeit durch mehrfache Injektionen regulären Insulins zusammen mit Zink und Protamin enthaltenden Zubereitungen erreicht wird.
Unter anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung sind die Arzneistoffvorstufen von Arzneistoffen für die menschliche oder tierärztliche Verwendung abgeleitet, die antidiabetische, entzündungshemmende, antibakterielle, antivirale, antineoplastische und blutdrucksenkende Arzneistoffe sowie Arzneistoffe zur Behandlung immunologischer, dermatologischer und neurologischer Störungen einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind.
Die Arzneimittel der Erfindung umfassen die Arzneistoffvorstufe oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Ein beliebiger geeigneter Verabreichungsweg der Arzneistoffe an Menschen und Tiere wird von der Erfindung vorgesehen, zum Beispiel über herkömmliche injizierbare, implantierbare, orale, rektale oder topische Verabreichung. Diese Zubereitungen können durch herkömmliche Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden, zum Beispiel wie es in "Remington's Pharmaceutical Science", A. R. Gennaro, Hrsg., 17. Auflage, 1985, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA beschrieben ist.
Die Erfindung wird jetzt durch die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele veranschaulicht werden.
BEISPIELE
Biologische Verfahren:
(i) Vorbereitung Streptozotocin (STZ)-behandelter Ratten
Männliche Wistar-Ratten (180–200 g) wurden vom Department of Hormone Research, Weizmann Institute of Science geliefert. Diabetes wurde durch eine einzige intravenöse Injektion einer frisch hergestellten Streptozotocinlösung (55 mg/kg Körpergewicht) in 0,1 M Citrat-Puffer (pH 4,5) gemäß Meyerovitch et al., 1987 induziert.
(ii) Eine angereicherte Zubereitung der Insulinrezeptortyrosinkinase wurde aus Rattenlebermembranen erhalten, wie es von Meyerovitch et al., 1990 beschrieben ist. In Kürze, die Leber wurde in Gegenwart von Proteinase-Inhibitoren homogenisiert, mit 1% Triton X-100 löslich gemacht und zentrifugiert. Der Überstand wurde durch eine Weizenkeimagglutinin (WGA)-Agarose-Säule (Sigma) laufen gelassen. Der adsorbierte Insulinrezeptoranteil wurde mit 0,3 M N-Acetyl-D-glucoseamin in 50 mM HEPES-Puffer, pH 7,4, der 0,1% Triton X-100, 10% Glycerin und 0,15 M NaCl enthielt, eluiert. Die biologischen Wirksamkeiten des Insulins und der Insulinderivate wurden durch die nachstehenden Assays (iii) und (iv) bewertet.
(iii) Lipogenese (Einlagerung markierter Glucose in die Lipide intakter Adipozyten)
Rattenadipozyten wurden im Wesentlichen durch das Verfahren von Rodbell, 1964 hergestellt. Die Fettpolster männlicher Wistar-Ratten wurden mit Scheren in kleine Stücke geschnitten und in 3 ml KRB-Puffer, der 110 mM NaCl, 25 mM NaHCO₃, 5 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,3 mM CaCl₂, 1,3 mM MgSO₄, und 0,7% BSA (pH 7,4) enthielt, suspendiert. Die Digestion wurde mit Kollagenase (1 mg/ml) in einer flexiblen 25 ml Plastikflasche unter einer Carbogenatmosphäre (95% O₂, 5% CO₂) 40 min bei 37°C unter kräftigem Schütteln durchgeführt. Fünf Milliliter Puffer wurden dann zugesetzt, und die Zellen wurden durch ein Maschensieb passiert. Die Zellen wurden dann einige Minuten in einem 15 ml Plastikreagenzglas bei Raumtemperatur schwimmend stehengelassen und der Puffer darunter wurde entfernt. Dieses Verfahren (Suspension, Aufschwimmen und Entfernung des Puffers darunter) wurde dreimal wiederholt.
Adipozytensuspensionen (3 × 10⁵ Zellen/ml) wurden in Plastikfläschchen (0,5 ml pro Fläschchen) aufgeteilt und 60 min bei 37°C unter einer Carbogenatmosphäre mit 0,2 mM [U¹⁴C]Glucose entweder in Anwesenheit oder Anwesenheit von Insulin inkubiert. Die Lipogenese wurde durch Zusatz einer Szintillationsflüssigkeit auf Toluolbasis (1,0 ml pro Fläschchen) beendet und die Radioaktivität in den extrahierten Lipiden wurde gezählt (Moody et al., 1974). In einem typischen Experiment war die Insulin-stimulierte Lipogenese 4–5 mal höher als der Grundwert (Grundwert 2000 cpm pro 3 × 10⁵ Zellen/h; V_insulin 8000–10000 cpm pro 3 × 10⁵ Zellen/h). Bei diesem Assay stimuliert Insulin die Lipogenese mit einem ED₅₀-Wert = 0,15 ± 0,03 ng/ml (Shechter und Ron, 1986). Man zieht in Erwägung, dass ein Insulinanalogon, das einen ED₅₀-Wert = 15 ng/ml zeigt, ~ 1% der biologischen Wirksamkeit des natürlichen Hormons aufweist.
(iv) Messung der Rezeptortyrosinkinase-Aktivität
Bei diesem Assay aktiviert Insulin seinen eigenen Rezeptor, um ein Zufallscopolymer [Poly(Glu₄Tyr)], das L-Glutaminsäure und L-Tyrosin in einem Molverhältnis von 4:1 enthält, zu phosphorylieren. Das Standardenzymassaygemisch (Endvolumen 60 μl in 50 mM Hepes, pH 7,4–0,1% Triton X-100) enthielt WGA gereinigten Insulinrezeptor (5 μg Protein), 20 mM MgCl₂, 2 mM MnCl₂, 100 μM ATP und schwankende Konzentrationen (von 1 ng/ml bis 10 mg/ml) des Insulins oder des Insulinderivates. Im Anschluss an eine 30 minütige Vorinkubation bei 22°C wurde die Umsetzung durch Zusatz von Poly(Glu₄Tyr) (Endkonzentration 0,7 mg/ml) eingeleitet, sie ging 20 min bei 22°C vonstatten und wurde durch Zusatz von EDTA (20 mM) beendet. Der Phosphotyrosingehalt in PolyGlu₄Tyr wurde durch ein Radioimmunassay-Verfahren unter Verwendung spezifischer monoklonaler Antikörper für Phosphotyrosin (Endverdünnung 1: 100000) und ¹²⁵I-BSA-Phosphotyrosin-Konjugat quantitativ bestimmt. Bei diesem besonderen Assay ermöglicht Insulin die halbmaximale Wirkung bei einer Konzentration von 20 ± 3 ng/ml. Es wird in Erwägung gezogen, dass ein Insulinanalogon, das einen ED₅₀-Wert = 2 mg/ml zeigt, ~ 1% der biologischen Wirksamkeit des natürlichen Hormons aufweist.
BEISPIEL 1: Herstellung von N-Fmoc-Insulinderivaten
(a) Synthese
Humaninsulin (100 mg, 17,2 μmol) (freundlicherweise von Biotechnology-General, Rehovot, Israel gespendet) wurde in 4 ml Dimethylformamid (DMF) analytischer Qualität, das 17,4 mg (172 μmol) Triethylamin enthielt, suspendiert Fmoc-OSu (58 mg, 172 μmol) wurde dann zugefügt. Das homogene Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden bei 25°C gerührt und Essigester wurde dann zugesetzt, bis die Lösung trübe wurde, worauf der Zusatz von Ether folgte, um die Ausfällung zu vervollständigen. Das Lösungsmittel wurde durch Zentrifugation entfernt und der Niederschlag zweimal mit Ether und zweimal mit Wasser gewaschen. Dieses Verfahren lieferte ein Gemisch aus Mono-, Di- und Tri-N-Fmoc-Insulinderivaten, die durch präparative HPLC getrennt und gereinigt wurden. Die monomodifizierten N-Fmoc-Insulinderivate können durch Waschen des rohen Feststoffs mit Isopropanol von den di- und trimodifizierten Derivaten getrennt werden.
(b) Isolierung und Reinigung von N-Fmoc-Insulinderivaten
Der rohe Feststoff wurde einer Umkehrphasen-HPLC (Spectra-Physics SP 8800 Flüssig-Chromatographie-System) unterworfen, die mit einer vorgepackten HPLC-Säule (Merck, LIChroCART 250-10 mm, LIChrosorb RP-18 [7 μm] enthaltend) ausgerüstet war. Ein linearer Gradient wurde von 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in H₂O (Lösung A) und 0,1% TFA in Acetonitril:H₂O, 75:25 (Lösung B) gebildet. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 1 ml/min. Die N-(Fmoc)₁-Insulinderivate kamen aus der Säule mit Retentionszeiten von 21,1, 21,9 und 22,8 min heraus, die N-(Fmoc)₂-Insulinderivate mit Retentionszeiten von 26,3, 27,1 und 27,7 min und das N-(Fmoc)₃-Insulin mit einer Retentionszeit von 31,5 min. Die Fraktionen, die 21–23 min, 26–28 min und 31,5 min entsprachen, wurden zusammengefasst, gefriergetrocknet und chemisch charakterisiert. Die Fraktionen, die 21–23 min (monomodifizierte Insuline) und 26–28 min (dimodifizierte Insuline) entsprachen, wurden weiter zu den einzelnen Mono-Fmoc- bzw. Di-Fmoc-insulinderivaten gereinigt. Die Mengen der am Insulinmolekül hängenden Fmoc-Gruppen wurden spektrophotometrisch bei 301 nm bestimmt, wobei man der Behandlung bekannter Mengen von N-Fmoc-Insulinderivaten mit 50% Piperidin in CH₂Cl₂ folgte.
(c) Chemische Charakterisierung von N-Fmoc-Insulinderivaten
Im Anschluss an die präparative Trennung durch ein HPLC-Verfahren wurden sieben N-Fmoc-Insulinderivate erhalten. Dies schließt drei monomodifizierte, drei dimodifizierte bzw. ein trimodifiziertes Derivat ein (Tabelle I). Die Retentionszeiten und die Ausbeuten jeder einzelnen Verbindung sind in Tabelle I angegeben. Die verschiedenen N-Fmoc-Insuline können leicht voneinander getrennt und in gereinigter Form unter den hier angewandten Versuchsbedingungen erhalten werden. Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₂-Insulin (Retentionszeit = 27,7 min) und Gly^A1,Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₃-Insulin wurden durch mehrere Verfahren einschließlich Massenspektren charakterisiert (Tabelle I).
(d) Synthese von Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₂-Insulin
Da die Bioassays erkennen ließen, dass Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₂-Insulin als lang-wirkendes Insulin besonders geeignet ist, wurde ein alternatives Verfahren für seine Synthese vorgesehen.
Die Gly^A1-Einheit wurde speziell mit der t-Boc-Gruppe unter den vorgesehenen Versuchsbedingungen unter Verwendung eines Äquivalents Di-tert-butyldicarbonat und DMSO/Et₃N, 20:1, als Lösungsmittel geschützt. Im Anschluss an die Abtrennung durch ein HPLC-Verfahren wurde Gly^A1-N-Boc-Insulin mit einem Überschuss Fmoc-OSu (10 Äquiv.) unter Verwendung von DMF als Lösungsmittel und DIEA als Base umgesetzt. Die Behandlung mit TFA und Reinigung durch HPLC erzeugte Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₂-Insulin in einer guten Ausbeute (~ 50%).
(e) Biologische Charakterisierungen von N-Fmoc-Insulinderivaten
Mehrere Merkmale der N-Fmoc-Insulinderivate der vorliegenden Erfindung sind in den Tabellen II und III zusammengefasst. Die Löslichkeit der Derivate in wässrigen Lösungen nahm mit gesteigerter Modifikation ab. N-(Fmoc)₁-Insulin ist nur etwas weniger löslich als natürliches Insulin, während N-(Fmoc)₃-Insulin etwa 20 mal weniger löslich ist als das natürliche Hormon. Die biologischen Wirksamkeiten nahmen auch mit gesteigerter Derivatisierung ab. So zeigen Mono-, Di- und Tri-N-Fmoc-Insuline 40–80%, 2–9% bzw. < 1% der biologischen Wirksamkeit des natürlichen Insulins, wie es durch einen [Poly(Glu₄Tyr)]-Phosphorylierungs-Assay beurteilt wird. Gemäß dem empfindlicheren biologischen Assay der Lipogenese mit intakten Rattenadipozyten zeigen die Fmoc-Insulinderivate viel geringere biologische Wirksamkeiten. So zeigen Gly^A1-N-Fmoc-Insulin und Di-N-Fmoc-Insuline unter Verwendung des Lipogenese-Assays 4,7% bzw. 0,4–1,4% der biologischen Wirksamkeit des natürlichen Insulins (Tabelle III). Alle sieben Derivate werden nach 2-tägiger Inkubation bei pH 8,5 in das natürliche Hormon zurückverwandelt. Dies wurde sowohl durch das Wiedergewinnnen der vollen biologischen Wirksamkeit (Tabellen II und III) als auch durch das Verschwinden der Peaks der Derivate zusammen mit dem Erscheinen des Peaks des natürlichen Hormons (Retentionszeit = 15 min) nach Trennung durch ein analytisches HPLC-Verfahren bewiesen.
BEISPIEL 2: Biologische Wirksamkeit von N-Fmoc-Insulinen
(a) Zeitverlauf der Aktivierung von N-Fmoc-Insulinen bei pH 7,4
Vor dem Untersuchen der antidiabetischen Wirksamkeiten von N-Fmoc-Insulinen bei diabetischen Ratten wurde deren Reaktivierungsgeschwindigkeit (die deren Umwandlung in das natürliche Hormon wiedergibt) im Reagenzglas geprüft. Die Derivate sind in Hepes-Puffer (50 mM, pH 7,4), der 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) enthielt, gelöst und bei 37°C (d.h. bei physiologischem pH-Wert und Körpertemperatur) inkubiert worden. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Teilmengen entnommen, um die biologische Wirksamkeit relativ zu natürlichem Insulin zu bestimmen. Die biologischen Wirksamkeiten wurden durch Insulinrezeptortyrosinkinase-Aktivierung (ein zellfreier Assay, wie er vorstehend bei Biologische Verfahren, Abschnitt (iv) beschrieben ist) und durch Stimulation der Lipogenese bei intakten Rattenadipozyten, wie es in Biologische Verfahren, Abschnitt (ii) beschrieben ist, bewertet. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Die halbmaximale Aktivierung trat für N-(Fmoc)₃-Insulin bei t_1/2 = 14 Tage auf und nahezu vollständige Aktivierung wurde im Anschluss an 21-tägige Inkubation offensichtlich.
In der Regel war die Aktivierungsgeschwindigkeit von N-(Fmoc)₂-Insulin bei pH 7,4 schneller. Der sechstägige Verzögerungszeitraum, der mit N-(Fmoc)₃-Insulin beobachtet wurde, wurde mit N-(Fmoc)₂-Insulin nicht gesehen. So scheint N-(Fmoc)₃-Insulin eine langsamer hydrolysierbare Fmoc-Einheit aufzuweisen, die die Reaktivierung des Analogons beschränkt. Im Anschluss an ihre Hydrolyse ist die Aktivierungsgeschwindigkeit erhöht. Vom praktischen Standpunkt aus impliziert es, dass das Gemisch der zwei Analoga wirksames Insulin über einen anhaltenden Zeitraum durch Abdecken früherer und späterer Zeiträume freigeben kann. Das relativ wirksame monomodifizierte Fmoc-Insulin gewann die vollständige biologische Wirksamkeit bei pH 7,4 mit t_1/2 = 5 Tage zurück.
Sobald N-(Fmoc)₂- und N-(Fmoc)₃-Insuline im Kreislauf angekommen sind, wird erwartet, dass sie eine geringe Grundkonzentration des Hormons über anhaltende Zeiträume bereitstellen. Dies kann hauptsächlich durch die Geschwindigkeit der Umwandlung des unwirksamen Derivats in das wirksame kurzlebige natürliche Hormon diktiert werden. Glücklicherweise zeigen die N-(Fmoc)_2,3-Insuline langsame Aktivierungsgeschwindigkeiten (wie in 1 gezeigt). Eine rasche (plötzliche) Geschwindigkeit (d.h. eher innerhalb von Minuten als Stunden) könnte zu hypoglykämischen Vorfällen geführt haben.
Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₂-Insulin ist 9 % biologisch wirksam, wie es durch den [Poly(Glu₄Tyr)]-Phosphorylierungs-Assay bestimmt wird, und zeigt intermediäre Löslichkeit zwischen dem natürlichen und N-(Fmoc)₃-Insulin. Im Gegensatz zu N-(Fmoc)₃-Insulin beginnt die Umwandlung des (N-Fmoc)₂-Insulins in das natürliche Hormon kurz (innerhalb von Stunden) nach der Inkubation, wie es in 1 gezeigt ist. So wird erwartet, dass N-(Fmoc)₂-Insulin (das a priori wirksamer ist) im Anschluss an eine Verabreichung einen schnelleren Wirkungseintritt aufweist. So kann eine richtige Kombination von N-(Fmoc)₂- und (N-Fmoc)₃-Insulinen die ideale Formel für eine grundlegende Insulinfreigabe bilden, die durch einen raschen Eintritt und eine lange Dauer der Wirkung im Anschluss an eine einzige Verabreichung charakterisiert ist und eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ausmacht.
Tabelle IV: Wirkung einer einzelnen Verabreichung von Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₂ Insulin auf die tägliche Gewichtszunahme von STZ-Ratten.
(b) Wirkung einer einzelnen intraperitonealen Verabreichung von Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₂-Insulin an normale Ratten
Um weiter zu bestätigen, dass die lang-wirkende Kapazität des (Fmoc)₂-Insulins auf seiner langsamen Umwandlung in das natürliche Hormon unter physiologischen Bedingungen beruht, ist ein zusätzlicher in vivo-Assay entworfen worden. Dieser Assay spiegelt das post-subkutane lang-wirkende Merkmal von Insulin (oder Insulinderivaten) innerhalb des Kreislaufs wieder. Normale Ratten bekamen eine einzige intraperitoneale Injektion von natürlichem Insulin, NPH-Insulin und (Fmoc)₂-Insulin (3 mg/Ratte), und ihre Blutzuckerspiegel wurden über einen Zeitraum von drei Tagen überwacht. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. So induzierte natürliches Insulin (3) und NPH-Insulin (2) eine Unterzuckerung über einen Zeitraum von etwa 12 bzw. 15 Stunden. Die Erholung von der Unterzuckerung trat mit t_1/2 von 8 bzw. 10 Stunden auf. (Fmoc)₂-Insulin reduzierte die Blutzuckerspiegel über einen Zeitraum von etwa 48 Stunden, und die Erholung von der Unterzuckerung trat mit t_1/2 von 26 Stunden auf. Diese Ergebnisse stützten unsere Auffassung, dass die anhaltende Wirkung des (Fmoc)₂-Insulins in der Tat aus seinen intrinsischen Eigenschaften hervorgeht und nicht auf dem herkömmlichen Mechanismus des NPH-Insulins, d.h. Ausfällung an der Injektionstelle und sein Eintritt in den Kreislauf durch langsame Auflösung, beruht. Wie erwartet, sind die Unterschiede in den Kapazitäten von natürlichem Insulin und NPH-Insulin zum Reduzieren von Blutzuckerspiegeln bei diesem Assay geringer als im Vergleich zu ihrer Verabreichung auf die subkutane Weise. Diese Tatsache beruht auf dem großen Volumen von Flüssigkeiten, die in der Bauchfellhöhle vorliegen, und daher schnellen Umwandlung des Zn-kristallinen Insulins, wobei die monomere Form erhalten wird. Die zwei anderen (Fmoc)₂-Insulinderivate, [Gly^A1,Lys^B29] und [Gly^A1,Phe^B1], wurden synthetisiert und auch in diesem Assay bewertet. Die Ergebnisse (nicht gezeigt) zeigten ein ähnliches lang-wirkendes Muster wie für Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₂-Insulin mit t_1/2 von 22–24 Stunden für beide Derivate.
(c) N-(Fmoc)₃-Insulin ist proteolysebeständig
Natürliches Insulin oder N-(Fmoc)₃-Insulin (jeweils 1 mg/ml in 50 mM Hepes, pH 7,4, 10 % DMSO) wurden bei 37°C inkubiert. Chymotrypsin und Trypsin (jeweils 0,5% Gew./Gew.,) wurden dann zugefügt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Teilmengen entnommen und einem analytischen HPLC-Verfahren unterworfen. Das Prozent Abbau wurde durch die Abnahme der Fläche des Peaks des natürlichen Insulins (Retentionszeit 15 min) und des Peaks des N-(Fmoc)₃-Insulins (Retentionszeit 31,5 min) bestimmt. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Es wurde gefunden, dass N-(Fmoc)₃-Insulin gegen eine Proteolyse durch ein Gemisch aus Chymotrypsin und Trypsin bei pH 7,4 höchst beständig ist. Die Proteolyse verlief mit t_1/2 Werten von 0,5 und 7,5 Stunden für das natürliche bzw. N-(Fmoc)₃-Insulin.
Beispiel 3: Wirkung einer einzelnen subkutanen Verabreichung von Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₂- und N-(Fmoc)₃-Insulin an STZ-diabetische Ratten
Die STZ-Ratte ist ein ausgezeichnetes Modell zum Bewerten einer in vivo-Insulintherapie. Bei diesem Modell ist etwa 90% der β-Zellfunktion durch Streptozotocin zerstört worden, wie es durch histologische Untersuchungen beurteilt wird (wie sie von Pederson et al., 1989 beschrieben sind). Die Ratten sind hypoinsulinämisch (wobei sie 10–30% des normalen Insulinspiegels aufweisen), hyperglykämisch (> 300 mg/dl; der normale Glukosespiegel von Kontrollratten beträgt 90–100 mg/dl) und katabolisch. Sichtbare äußerliche Symptome sind "krankes" Aussehen und eine drei- bis vierfache Zunahme der Flüssigkeitsaufnahme und Urinausscheidung. Die tägliche Gewichtszunahme nahm auf 10–20% (0,3–0,8 g/Tag/Ratte) der normalen Gewichtszunahme von Kontrollratten ab. Die pathologischen Veränderungen in Geweben von STZ-Ratten sind enorm. Einige der bedeutenderen biochemischen Veränderungen sind verminderte Wirksamkeit von Schlüsselenzymen des Glykogenmetabolismus, Verarmung an Leberglykogen, eine Abnahme der Zahl an Glukosetransportern in peripheren Geweben und eine Zunahme der Insulinbindungskapazität, die nicht mit einer Zunahme der Insulinempfindlichkeit begleitet wird.
Bei diesem diabetischen Rattenmodell ist eine zweckmäßige Insulintherapie die kontinuierliche Verabreichung von Insulin (5 Einheiten/Tag/Ratte) über einen Zeitraum von einer Woche. Diese Behandlung normalisiert Blutzuckerspiegel, kehrt diabetische Ratten in einen anabolen Zustand um und verbessert viele der pathologischen Wirkungen, die durch Hyperglykämie und Insulinmangel induziert werden. Eine einzige Verabreichung von rasch-wirkendem (regulärem) Insulin ist nur über einen Zeitraum von mehreren Stunden wirksam. Auch im Anschluss an die Beendung des siebentägigen Therapieprotokolls tritt eine Hyperglykämie innerhalb von 24–30 Stunden wieder auf.
Um zu bewerten, ob N-(Fmoc)₃-Insulin eine anhaltende antidiabetische Wirkung aufweist, wurde STZ-Ratten zwei Wochen nach Diabetesinduktion entweder eine einzige subkutane Injektion natürliches Insulin (Gruppe A, 25 Einheiten, 1 mg, gelöst in 1,0 ml H₂O – 10 % DMSO, n = 4) oder N-(Fmoc)₃-Insulin (Gruppe B, 1 mg, gelöst in 1,0 ml H₂O – 10 % DMSO, n = 4) verabreicht. Die Blutzuckerspiegel und täglichen Gewichtszunahmen wurden über einen Zeitraum von sieben Tagen verfolgt.
Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Jeder Punkt stellt den arithmetischen Mittelwert ± SEM der Plasmaglukosewerte für 4 Ratten dar. Die zirkulierenden Glukosespiegel in Gruppe B waren signifikant niedriger. So waren die Glukosespiegel in Gruppe B ausgehend von Tag zwei im Anschluss an eine Verabreichung 90–110 mg/dl niedriger, und diese niedrigeren Glukosespiegel bestanden bis zum Tag sechs. Am Tag sieben gab es zwischen den zwei Rattengruppen keinen signifikanten Unterschied in den zirkulierenden Glukosespiegeln. Die N-(Fmoc)₃-Insulin bekommenden Ratten wiesen ein "gesunderes" Aussehen auf. Die täglichen Gewichtszunahmen waren in Gruppe B nahezu dreimal höher und betrugen 0,57 ± 0,08 und 1,43 ± 0,14 g/Ratte/Tag in den Gruppen A bzw. B (nicht gezeigt). So ergab eine einzige Verabreichung von N-(Fmoc)₃-Insulin anhaltende und zufriedenstellende antidiabetische Wirkungen, die über einen Zeitraum von vier Tagen andauerten (im Anschluss an einen verzögerten Beginn von etwa zwei Tagen). Diese langdauernde Wirkung in vivo kann durch die Fähigkeit des Derivats, einer Rezeptorvermittelten Endozytose zu entgehen, und auch durch seine Proteolysebeständigkeit erklärt werden. Außerdem ist N-(Fmoc)₃-Insulin in wässrigen Lösungen weitgehend unlöslich. So kann bei Menschen die gesamte andauernde Wirkung durch Substitution des alten therapeutischen Prinzips, d.h. schrittweise Auflösung "eingebauten" unlöslichen Insulins im Anschluss an eine subkutane Verabreichung zusammen mit dem neuen Prinzip, nämlich dem zirkulierenden langlebigen kovalent modifizierten unwirksamen Insulinderivat, das langsam in das natürliche Hormon umgewandelt wird, stattfinden. Da dieses Insulinderivat unwirksam ist, können größere Dosen ohne Angst vor hypoglykämischen Vorfällen verabreicht werden.
Um die Wirkung von Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₂-Insulin beim Senken von Blutzuckerspiegeln bei diabetischen Versuchsratten zu prüfen, bekamen STZ-behandelte Ratten 9 Tage nach der Diabetesinduktion entweder eine einzige s.c.-Injektion des N-(Fmoc)₂ Insulins (Gruppe A, 3 mg/Ratte, in 2,0 ml 20 %igem DMSO, n = 5) oder eine einzige s.c.-Injektion lang-wirkenden Insulins (NPH-Humaninsulin, Humulin N, HI-310) (Gruppe B, 0,75 ml (3 mg) pro Ratte, n = 5). Gruppe C (n = 5) bekam nur das Vehikel (2,0 ml 20 %iges DMSO). Die Blutzuckerspiegel wurden täglich bestimmt.
Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt, wobei die waagerechte gestrichelte Linie den arithmetischen Mittelwert der Plasmaglukose für Kontrollratten angibt. Wie es in 6 gezeigt ist, induzierte eine einzige subkutane Verabreichung von HPLC-gereinigtem Phe^B1,Lys^B29-N-(Fmoc)₂-Insulin eine Normoglykämie über einen Zeitraum von 4 Tagen und erhöhte die tägliche Gewichtszunahme dieser katabolischen STZ-Rattenmodelle (Tabelle III). N-(Fmoc)₂-Insulin war so wirksam wie die im Handel erhältliche (unlösliche) lang-wirkende Zubereitung. Raschwirkendes (lösliches) Insulin ist beim Senken von Blutzuckerspiegeln bei diesem Versuchssystem nur über einen Zeitraum von mehreren Stunden wirksam (nicht gezeigt). Diese Zubereitung ist in wässriger Lösung (bei pH 7,4) ganz löslich, eine Tatsache, die gegenüber dem unlöslichen N-(Fmoc)₃-Insulin vorteilhaft sein kann, da Suspensionen durch s.c.-Injektion nicht genau verabreicht werden können.
BEISPIEL 4: Zubereitung und biologische Wirksamkeit von (2-Sulfo)-Fmoc-Insulin
(a) Synthese von (2-Sulfo)-Fmoc-Insulin (Sulfmoc-Insulin)
Die Fmoc-Gruppe selbst wurde modifiziert, um die Hydrophobie des Fmoc-Insulins zu reduzieren und folglich seine Löslichkeit in wässrigen Puffern zu erhöhen sowie die Geschwindigkeit der Rückumwandlung zu Insulin zu modifizieren. Dies kann durch Einführen polarer oder vorzugsweise geladener Gruppen, wie Halogen-, Nitro-, Carboxyl-, Amino-, Ammonium- und Sulfogruppen, in den Fluorenring erledigt werden. Bei elektrophilen Substitutionsreaktionen wird Fluoren zuerst in der 2-Position angegriffen und im Allgemeinen hat die Beschaffenheit des Substituenten in Position 9 (z.B. CH₂OCO-OSu) keine Wirkung auf die Orientierung der Substitution. So ergab die Behandlung von Fmoc-OSu mit 0,9 Äquiv. Chlorsulfonsäure in Dichlormethan (DCM) bei 0°C (2-Sulfo)-Fmoc-OSu in hoher Ausbeute (Formel (i), R₁ = SO₃H in Position 2, R₂ = R₃ = R₄ = H, A = OCO-OSu). Die Behandlung mit mehr als 1 Äquiv. wird auch zur Substitution in Position 7 des Fluorenrings führen.
Die (2-Sulfo)-Fmoc-gruppen wurden durch Kuppeln des wirksamen (2-Sulfo)-Fmoc-Osu-esters an die Aminogruppen des Insulins in Insulin eingeführt. Die Umsetzung wurde in wässrigen Puffern (pH 7,4) und überschüssigem Reagens (~ 20 Äquiv.) ausgeführt. Im Anschluss an Dialyse und Gefriertrocknung wurde das Produkt umgewandelt, um wasserlöslich zu sein. Die HPLC-Analyse zeigte die Vorherrschaft eines Hauptprodukts, offensichtlich (Sulfmoc)₂-Insulin, was durch Massenspektren (m/z 6411) bestimmt wurde. Wenn die Umsetzung in Acetonitril/Wasser, 1:1, ausgeführt wurde, war das Hauptprodukt (Sulfmoc)₃-Insulin, was durch Massenspektren (m/z 6713) bestimmt wurde.
(b) Zeitverlauf der Aktivierung von (2-Sulfo)-Fmoc-Insulin
Das (Sulfmoc)₂-Insulin wurde nach Inkubation bei 37°C für 36 Stunden bei pH 8,5 (0,1 M NaHCO₃) oder für 10 Tage bei pH 7,4 (50 mM Hepes-Puffer) mit t_1/2-Werten von 12–15 Stunden bzw. 6 Tagen völlig in das natürliche Hormon zurückverwandelt. Dies wurde durch Verschwinden des Peaks des Insulinderivats zusammen mit dem Erscheinen des Peaks des natürlichen Hormons unter Verwendung analytischer HPLC-Verfahren bewiesen. Man beachte, dass die Hydrolyse des (Sulfmoc)₂-Insulins zum natürlichen Hormon schneller ist als im Vergleich zur Hydrolyse des (Fmoc)₂-Insulins (21 Tage bei pH 7,4, 37 °C).
(Sulfmoc)₂-Insulin ist 0,5% biologisch wirksam und zeigt gute Löslichkeit in Wasser. Nach Inkubation bei pH 8,5, 37°C kehrt (Sulfmoc)₂-Insulin zum voll wirksamen natürlichen Insulin mit einem t_1/2-Wert von 4–6 Stunden zurück, wie es durch eine zeitabhängige Zunahme der biologischen Wirksamkeit beurteilt wird (Assay der Lipogenese in Rattenadipozyten).
(c) Wirkung einer einzelnen intraperitonealen Verabreichung von (2-Sulfo)-Fmoc-Insulin an normale Ratten
Um die lang-wirkende Kapazität des (Sulfmoc)₂-Insulins, die einer subkutanen Absorption nachgeschaltet ist, zu bewerten, bekamen normale Ratten eine einzige intraperitoneale Injektion von natürlichem Insulin, NPH-Insulin oder (Sulfmoc)₂-Insulin. Die Blutzuckerspiegel wurden für zwei Tage verfolgt. 3 zeigt, dass (Sulfmoc)₂-Insulin eine Unterzuckerung über einen Zeitraum von 24 Stunden induzierte. Die Erholung von der Unterzuckerung trat mit einem t_1/2-Wert = 14 h auf. Im Fall von raschem und NPH-Insulin betrugen diese t_1/2-Werte 8 (3) bzw. 10 Stunden (2). So ergab eine einzige Verabreichung von (Sulfmoc)₂-Insulin eine intermediär antidiabetische Wirkung, die 1,5- bis 2-mal länger ist als die des raschen oder NPH-Insulins. Diese Ergebnisse stimmen mit der beschleunigten Hydrolysegeschwindigkeit des Sulfmoc-Insulins überein, die vorher in vitro gefunden wurde. So erhöhte die Sulfonsäuregruppe in Position 2 des Fluorenrings die Geschwindigkeit der Protonenabstraktion in Position 9 und deshalb die Hydrolyse der Sulfmoc-Einheit um das 2- bis 3-Fache. Frühere Untersuchungen, die über die Unbeständigkeit der Sulfmoc-Gruppe gegenüber verschiedenen Basen ausgeführt wurden, zeigten eine größere Basenempfindlichkeit als das Stammsystem. Außerdem war die Geschwindigkeitskonstante für die Freigabe der Sulfmoc-Gruppe aus Glycin zum Beispiel viel höher als die der Fmoc-Gruppe (Faktor von etwa 30). Deshalb vermindert die Zunahme der Löslichkeit durch Einführen der Sulfmoc-Gruppe in Insulin umgekehrt die lang-andauernde Wirkung dieses Derivats. So gilt das Prinzip der lang-andauernden antidiabetischen Wirkung durch Entgehen einer Rezeptor-vermittelten Endozytose und eines Abbaus auch für das Sulfmoc-Insulinderivat.
Die erhöhte Geschwindigkeit der Entfernung der Sulfmoc-Gruppe aus Insulin kann bei bestimmten Anwendungen der Insulinverabreichung, wie intermediären Zubereitungen, vorteilhaft sein. Solche Zubereitungen werden offensichtlich den Vorteil aufweisen, im Gegensatz zu den verfügbaren handelsüblichen Zubereitungen in wässrigen Puffern vollständig löslich zu sein. Außerdem können andere Gruppen mit diversen Aciditäten oder Polaritäten in den Fluorenring eingeführt werden. Deshalb kann das Steuern des Typs und der Zahl der in die Fmoc-Gruppe eingeführten Gruppen den Grad der Löslichkeit und die Geschwindigkeit der Reaktivierung des modifizierten Insulins bestimmen.
BEISPIEL 5: Herstellung von Amino- und Carboxyl-endständigen modifizierten Insulin (N-Fmoc- und C-Fm-Insulin)-Derivaten
N-(Fmoc)₃-Insulin (64,5 mg; 10 μmol; 60 μmol Carboxyleinheiten, d.h. in Bezug auf 4 Glu-Einheiten innerhalb der Kette und zwei C-endständige Reste) wurde in 8 ml Dimethylformamid (DMF) (Lab. Scan., Dublin, Irland) zusammen mit o-Nitrophenol (250 μmol; 35 mg) oder N-Hydroxysuccinimid (250 μmol; 28 mg) gelöst und die Lösung wurde auf 4°C abgekühlt. Eine Lösung von N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC; 250 mmol, 53 mg) in 0,5 ml DMF wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 4°C und dann 6 h bei Raumtemperatur gehalten. Ausgefallener N,N-Dicyclohexylharnstoff wurde durch Zentrifugation entfernt und die jeweiligen o-Nitrophenyl- oder N-Hydroxysuccinimidester des N-(Fmoc)₃-Insulins wurden mit trockenem, eiskaltem Ether ausgefällt. Der Feststoff wurde zweimal mit trockenem Ether gewaschen, getrocknet und in 8 ml DMF gelöst. Eine Lösung aus 9-Fluorenylmethanol (250 μmol; 50 mg) und Imidazol (250 μmol; 17 mg) in 1 ml DMF wurde zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Ausfällung mit trockenem Ether lieferte 62 mg N-(Fmoc)₃,C-(Fm)_n-Insulin. Das Hauptreaktionsprodukt war der Hexa-9-fluorenylmethylester C-(Fm)₆ des N-(Fmoc)₃-Insulins (n = 6).
BEISPIEL 6: Herstellung von Fm-Insulinen (C-Fm-Insulinen) mit endständigem Carboxyl
Zur Herstellung von t-Butyloxycarbonyl (t-Boc)₃-Insulin wurde Di-tert.-butyldicarbonat (56 mg, 258 μmol) einer eisgekühlten, gerührten Suspension aus Insulin (100 mg, 17,2 μmol) und Triethylamin (174 mg, 172 μmol) in DMF (4 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und 5 h gerührt (wobei es schrittweise klar wurde). Essigester wurde dann zugesetzt, bis die Lösung trübe wurde, worauf Zusatz von Ether folgte, und der Niederschlag wurde zentrifugiert und zweimal mit Ether gewaschen. Der resultierende rohe Feststoff (95 mg) wurde ohne irgendeine Reinigung weiter verwendet. Analytische HPLC zeigte ein Hauptprodukt, das bei 27,5 min eluierte.
Das Produkt wurde in 10 ml DMF gelöst und mit o-Nitrophenol oder N-Hydroxysuccinimid, wie vorstehend, behandelt, wobei die entsprechenden aktiven Ester erhalten wurden. Diese wurden mit 9-Fluorenylmethanol in Gegenwart von Imidazol, wie vorstehend, umgesetzt und N-(t-Boc)₃,C-(Fm)_n-Insulin wurde nach Ausfällung mit trockenem Ether als Pulver (87 mg) erhalten. Das Pulver wurde im Vakuum über P₂O₅ getrocknet und dann 1 h bei Raumtemperatur mit 5 ml Trifluoressigsäure behandelt, um eine Entfernung der N-endständigen t-Boc-Schutzgruppen zu bewirken. Während dieses Verfahrens löste sich das meiste des Insulinderivats. Zugabe von eiskaltem trockenem Ether führte zu einem Pulver, das durch Zentrifugation isoliert und gründlich mit getrocknetem Ether gewaschen wurde. Die Ausbeute eines Produkts, hauptsächlich C-(Fm)₆ Insulin, betrug 79 mg.
BEISPIEL 7: Herstellung von menschlichem (Fmoc)₁-Wachstumshormon (Fmoc₁-hGH)
Unter normalen physiologischen Bedingungen sind hGH-Spiegel bei gesunden Personen täglich in pulsierender Weise mehrmals (bei Tag und Nacht) erhöht. hGH ist eine kurzlebige Spezies. Das gegenwärtige therapeutische Protokoll schließt eine einzige tägliche hGH-Injektion ein und wird wahrscheinlich nur für mehrere Stunden wirksam sein. Eine lang-wirkende (langsamfreigegebene) hGH-Zubereitung, die einen auf dem Schwellenwert basierenden hGH-Spiegel während 24 h Stunden bei Tag und Nacht liefert, ist äußerst wünschenswert.
Natürliches hGH (Biotechnology General, Rehovot, Israel; 9,2 mg) wurde in 0,1 M NaHCO₃ (2,0 ml; pH 8,5) gelöst, DMSO (0,1 ml) wurde zugesetzt (DMSO-Endkonzentration, ~ 5%), und die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt. Ein Äquivalent Fmoc-OSu in 10 μl (entnommen aus einer Vorratslösung von 18,5 mg/ml in DMSO) wurde dann zugesetzt, und die Umsetzung verlief 30 min bei 0°C unter mäßigem Rühren. Weitere 10 μl (die 1 Äquivalent Fmoc-OSu enthielten) wurden dann zugesetzt, und nach 30 min wurde das Gemisch über Nacht bei 7°C gegen H₂O dialysiert. Halbpräparative HPLC lieferte zwei Hauptproteinpeaks, die natürlichem hGH (~ 20 % der Gesamtmenge; Retentionszeit 30 min; RP-8 Säule; 250 × 10 mm; Merck) und modifiziertem Fmoc-hGH (~ 80 % der Gesamtmenge; Retentionszeit 32 min) entsprachen.
Tabelle V zeigt die Umwandlung von Fmoc-hGH (1 mg/ml) in natürliches hGH nach Inkubation bei 37°C in 0,1 M NaHCO₃ (pH 8,5). Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Teilmengen entnommen und einem analytischen HPLC-Verfahren (RP-8 Säule) unterworfen. Die Umwandlung von Fmoc-hGH in natürliches hGH wurde durch die Zunahme der Peakfläche, die natürlichem hGH entsprach, bewertet.
Wie in Tabelle V gezeigt, weist Fmoc-hGH 15% der Rezeptorbindungswirksamkeit des natürlichen Hormons auf. Inkubation von Fmoc-hGH bei pH 8,5 (37°C) für etwa 6 Tage oder bei pH 10,5 (37°C) für vier Tage lieferte voll wirksames, natürliches hGH, wie es durch eine HPLC-Analyse und durch Rezeptorbindungs-Assays beurteilt wird.
Tabelle V: Erzeugung von natürlichem hGH aus Fmoc-hGH nach Inkubation bei 37°C

(1) Das Ersetzen iodierten hGH's wurde gemäß Gertler et al., 1984 ausgeführt. Natürliches hGH war unter den Bedingungen, die auf Fmoc-hGH angewandt wurden, (pH 10,5, 37°C, 4 Tage) völlig stabil.
(2) Fmoc-hGH (1 mg/ml) wurde bei 37°C in 0,1 M NaHCO₃ (pH 8,5) inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Teilmengen entnommen und einer analytischen HPLC unterworfen. Umwandlung von Fmoc-hGH in natürliches hGH wurde durch die Zunahme der Peakfläche, die natürlichem hGH entsprach, bewertet.

BEISPIEL 8: Herstellung von N-Fmoc-Cephalexin- und Cephalexin-O-Fm-Ester
Cephalexin [7-(D-α-Aminophenylacetamido)desacetoxycephalosporansäure) ist ein β-Lactamantibiotikum mit einem breiten Wirkungsspektrum gegen gram-negative und grampositive Bakterien. Zwei monosubstituierte Cephalexine wurden durch kovalentes Anhängen einer Fluorenylmethyl (Fm)-Einheit entweder an die Aminogruppe (N-Fmoc-Cephalexin) oder an die Carboxylgruppe über Veresterung (Cephalexin-O-Fm) hergestellt.
(i)(a) Herstellung von N-Fmoc-Cephalexin
Einer gerührten Suspension von Cephalexinhydrat (Sigma, USA; 50 mg, 0,144 mmol) und Triethylamin (29 mg, 0,288 mmol) in Dichlormethan (DCM; 2,5 ml) wurde eine Lösung von Fmoc-OSu (145 mg, 0,432 mmol) in DCM (2,5 ml) tropfenweise über 5 min zugesetzt. Das Reaktionsgemisch, das nach 1 h klar wurde, wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, während dessen es trübe wurde. Nach Einengen unter Vakuum wurde dem Gemisch Ether zugesetzt, und der resultierende Niederschlag wurde filtriert und zweimal mit Ether gewaschen. Das Filtrat wurde in DCM gelöst und mit angesäuertem Wasser (pH ~ 2), Wasser und Kochsalzlösung extrahiert und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Nach Filtration und Einengen der Lösung wurde Ether zugefügt. Das ausgefallene Produkt wurde filtriert und mit Ether gewaschen, wobei Fmoc-Cephalexin als reines Produkt erhalten wurde, wie es durch DC (1-Butanol : Essigsäure : Wasser, 8:1:1) und durch ein analytisches HPLC-Verfahren (eluierte bei 33 min, während unter ähnlichen Bedingungen natürliches Cephalexin bei 6,5 min eluiert wird) beurteilt wird. Massenspektrums-Analyse (Fast Atom Bombardment, FAB) ergab das erwartete Molekulargewicht für N-Fmoc-Cephalexin (m/z 570,1 [M+H]⁺).
(i)(b) Antibakterielle Wirksamkeit von Fmoc-Cephalexin
Zur Bestimmung der antibakteriellen Wirksamkeiten von natürlichem Cephalexin und Fmoc-Cephalexin wurden Röhrchen, die eine verdünnte Suspension von Staphylococcus aureus (0,5 ml/Glasröhrchen) enthielten, 6 Stunden bei 37°C in Abwesenheit und Anwesenheit erhöhter Konzentrationen von natürlichem Cephalexin oder Fmoc-Cephalexin vor der in Tabelle VI spezifizierten Behandlung und im Anschluss daran inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Teilmengen entnommen und auf ihre Wirksamkeit, das Wachstum von Staphylococcus aureus anzuhalten, analysiert. Das bakterielle Wachstum wurde dann durch erhöhte Trübung, die spektroskopisch bei 700 nm gemessen wurde, bewertet.
Tabelle VI Antibakterielle Wirksamkeiten von natürlichem Cephalexin und N-Fmoc-Cephalexin

(1) Zahlen betreffen die Wirksamkeit von Cephalexin, das während der ganzen Assays als Kontrolle eingesetzt wurde.

Die Inkubationen wurden bei pH 7,4 mit natürlichem Cephalexin oder mit N-Fmoc-Cephalexin (100 μg/ml) in 50 mM Hepes-Puffer, 20 % DMSO ausgeführt.
Wie in Tabelle VI gezeigt, ist N-Fmoc-Cephalexin unwirksam (~ 6%). Vorinkubation über einen Zeitraum von 6 Tagen (pH 7,4, 37°C) erzeugte natürliches Cephalexin, wie es durch HPLC-Überwachung und durch Wiedergewinnnen von etwa 50 % der antibakteriellen Wirksamkeit der Stammverbindung beurteilt wurde. Natürliches Cephalexin war nach der Inkubation einer beachtlichen zeitabhängigen spontanen Inaktivierung ausgesetzt, während N-Fmoc-Cephalexin unter denselben Bedingungen signifikant stabiler ist. So hat die erwartete anhaltende Wirkung von N-Fmoc-Cephalexin in vivo wahrscheinlich ihre Ursache sowohl in der höheren chemischen Stabilität bei physiologischem pH-Wert und Temperatur als auch darin, dass es einem Abbau entgeht. N-Fmoc-Cephalexin ist stabiler gegen eine Hydrolyse durch Penicillinase als die Stammverbindung (nicht gezeigt).
(ii) Herstellung von Cephalexin-O-Fm-Ester (Cephalexinfluorenylmethylester)
(a) N-Boc-Cephalexin
Einer eisgekühlten gerührten Suspension aus Cephalexinhydrat (50 mg, 0,144 mmol) und Triethylamin (29 mg, 0,288 mmol) in DCM (3 ml) wurde eine Lösung aus Di-tert.-butyldicarbonat (94,2 mg, 0,432 mmol) in DCM (2 ml) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und über Nacht gerührt, bis kein Ninhydrinpositives Ausgangsmaterial durch DC (1-Butanol : Essigsäure : H₂O, 8:1:1) beobachtet wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit DCM (2,5 ml) verdünnt, mit angesäuertem Wasser (pH 2), Wasser und Kochsalzlösung extrahiert und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Nach Einengen wurde das Produkt mit Petrolether (Sdp. 40–60°C) ausgefällt, filtriert und wieder mit Petrolether gewaschen. Das Produkt war homogen, wie durch DC- und HPLC-Verfahren bestätigt wurde.
(b) Cephalexin-O-Fm-Ester
Einer eisgekühlten gerührten Lösung aus N-Boc-Cephalexin (25 mg, 0,056 mmol), 9-Fluorenylmethanol (22 mg, 0,112 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (13,7 mg, 0,112 mmol) in DCM (2 ml) wurde eine Lösung aus DCC (23,1 mg, 0,112 mmol) in DCM (1 ml) tropfenweise über 20 min zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und die Lösung wurde filtriert, um Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Das Filtrat wurde mit DCM (2,5 ml) verdünnt und dann zweimal mit 1 M NaHCO₃-Lösung, 10 %iger Citronensäure, Wasser und Kochsalzlösung extrahiert und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Die Lösung wurde eingedampft, wobei ein öliger Feststoff erhalten wurde, der mit Petrolether verrieben wurde, wobei das Boc-Cephalexin-Ofm-Produkt geliefert wurde (wie durch DC und HPLC bestätigt wurde). Die Boc-Einheit wurde durch Auflösen des rohen Feststoffs (25 mg) in 1 ml Lösung aus TFA:DCM (1:1 Vol./Vol.) entfernt. Nach 20-minütigem Stehen bei Raumtemperatur wurde TFA durch Verdampfen entfernt und der feste Rückstand in Isopropanol gelöst, das dann abgedampft wurde. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt. Der rohe Feststoff wurde mit Petrolether verrieben, wobei der endgültige reine Ester gebildet wurde, wie es sowohl durch DC- als auch HPLC-Verfahren beurteilt wurde.
BEISPIEL 9: Herstellung von Di-9-(fluorenylmethoxycarbonyl)polymyxin B[(Fmoc)₂-PMXB]
Polymyxin-B (PMXB), ein typischer Angehöriger der Familie der cyclischen peptidischen Antibiotika, ist gegen gram-negative Bakterien wirksam. PMXB enthält 5 Reste von Diaminobuttersäure, die durch Einführung von Fmoc-Gruppen unter Verwendung des Reagens 4-(9-Fluorenylmethoxycarbonyloxy)phenyldimethylsulfoniummethylsulfat (Fmoc-DSP) modifiziert werden können. Das Molverhältnis von Fmoc-DSP-Reagens und Peptid wird den Modifikationsgrad des PMXB-Moleküls bestimmen.
Zur Herstellung von (Fmoc)₂-PMXB wurde einer gerührten Lösung aus PMXB (Sigma, USA; 10 mg, 7,2 μmol) und (Fmoc-DSP; 7,1 mg, 14,4 μmol) in H₂O (1 ml) eine Lösung aus NaHCO₃ (0,1 M, 0,15 ml) tropfenweise zugesetzt. Das Reaktionsgemisch, das schrittweise trübe wurde, wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der resultierende Niederschlag wurde zentrifugiert, zweimal mit Wasser gewaschen, in einem kleinen Volumen DMF gelöst und mit Ether ausgefällt, wobei weißer roher Feststoff erhalten wurde.
Tabelle VII: Antibakterielle Wirksamkeiten von (Fmoc)₂-PMXB und natürlichem PMXB

(1) Zahlen betreffen die Wirksamkeit von PMXB, das während der ganzen Assays als Kontrolle eingesetzt wurde.
(2) Inkubation wurde bei pH 8,5 mit PMXB oder (Fmoc)₂-PMXB (100 μg/ml) in 0,1 M NaHCO₃-Lösung, die 1%DMSO enthielt, ausgeführt.
(3) Inkubation wurde bei pH 7,4 mit PMXB oder (Fmoc)₂-PMXB (100 μg/ml) in 50 mM Hepes-Puffer (pH 7,4), der 1 % DMSO enthielt, ausgeführt.

Analytische HPLC (RP-18; 250 × 4 mm; Merck) unter Anwendung eines linearen Gradienten, der von 70 % Lösung A (0,1 % TFA in Wasser) und 30 % Lösung B (0,1 % TFA in Acetonitril:Wasser, 75:25) bis 100 % Lösung B in 40 Minuten (Durchflussgeschwindigkeit von 0,8 ml/min) gebildet wurde, zeigte ein Hauptprodukt, das bei 39 min eluiert wurde (die Retentionszeit von PMXB unter diesen Bedingungen ist 13,5 min). Der rohe Feststoff wurde einer präparativen HPLC unterworfen, wobei ein reines Produkt bereitgestellt wurde. Die Analyse von (Fmoc)₂-PMXB durch Massenspektrum (FAB) ergab für diese Verbindung das erwartete Molekulargewicht (m/z 1647 [M-H]⁺).
Die antibakteriellen Wirksamkeiten von (Fmoc)₂-PMXB und natürlichem PMXB wurden unter verschiedenen Versuchsbedingungen folgendermaßen untersucht: eine verdünnte Suspension von E. coli (0,5 ml pro Reagensglas) wurde 6 Stunden bei 37°C ohne oder mit erhöhten Konzentrationen von (Fmoc)₂-PMXB und natürlichem PMXB inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Teilmengen entnommen und auf ihre Wirksamkeiten, das Wachstum von E. coli anzuhalten, analysiert und das bakterielle Wachstum wurde dann durch Messen der Trübung bei 700 nm bewertet.
Wie in Tabelle VII gezeigt, ist (Fmoc)₂-PMXB unwirksam (~ 1%) und wird weitgehend zum wirksamen PMXB mit t_1/2-Werten von ~ 3 Tagen und ~ 1 Tag bei pH 8,5 bzw. 7,4 zurück hydrolysiert.
BEISPIEL 10: Herstellung von Piperacillinfluorenylmethylester (Piperacillin-O-Fm)
Piperacillin (4-Ethyl-2,3-dioxopiperazincarbonylampicillin) ist ein dem Penicillin verwandtes halbsynthetisches Breitbandantibiotikum, das nicht wirksam ist, wenn es oral verabreicht wird.
Piperacillin (freies Carboxyl) wurde aus dem Piperacillin-Natriumsalz (Sigma, USA) durch saure Extraktion mit Essigester hergestellt. Piperacillin-OFm wurde, wie es für den Cephalexin-Ofm- Ester im vorstehenden Beispiel 8 beschrieben ist, durch Umsetzen von 1 Äquivalent Carboxyl mit jeweils 2 Äquivalenten 9-Fluorenylmethanol, 4-Dimethylaminopyridin und DCC synthetisiert. Der rohe Feststoff wurde aus DCM-Ether umkristallisiert, wobei ein reines Produkt erhalten wurde, wie durch DC- und HPLC-Verfahren bestätigt wurde.
BEISPIEL 11: Herstellung von Fmoc-Propranolol
Propranolol [1-(Isopropylamino)-3-(1-naphthyloxy)-2-propanol], ein typischer Angehöriger der β-Blocker-Familie, ist ein β-adrenerger Antagonist, der als Antihypertonikum, Antianginosum und Antiarrhythmikum verwendet wird. Propranolol bindet den β-adrenergen Rezeptor, aber aktiviert ihn nicht. Die Konkurrenz mit β-adrenergen Antagonisten für diese Stellen verringert pathologische hypertensive Zustände. Patienten bekommen Propranolol oral auf einer täglichen Basis. Jedoch ist eine überwältigende Mehrheit der β-adrenergen Antagonisten naturgemäß eher hydrophil und wird nicht effizient absorbiert, während sie oral verabreicht werden, z.B. Acetylbutolol, Athenolol, Betaxolol, Carteolol, Nadolol und Sotalol.
Zur Herstellung von Fmoc-Propranolol wurde eine Lösung von Fmoc-OSu (170 mg, 0,50 mmol) in DCM (2,5 ml) einer gerührten Lösung von (±)-Propranololhydrochlorid (50 mg, 0,17 mmol) und Triethylamin (34 mg, 0,34 mmol) in Dichlormethan (DCM, 2,5 ml) tropfenweise über 5 min zugesetzt.
Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit angesäuertem Wasser (pH ~ 2), Wasser und Kochsalzlösung extrahiert und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Die Lösung wurde eingedampft, wobei der rohe Feststoff geliefert wurde, der dann mit Hexan verrieben wurde, wobei Fmoc-Propranolol erhalten wurde. Das Produkt wurde durch DC (1-Butanol : Essigsäure : Wasser, 8:1:1) und HPLC untersucht und erwies sich als rein (Retentionszeiten von Propranolol und Fmoc-Propranolol unter denselben Bedingungen sind 16 bzw. 51 min). Das Massenspektrum (FAB) ergab das korrekte m/z: 482,2 [M+H]⁺.
Die β-adrenerge Wirksamkeit von Fmoc-Propranolol wurde analysiert Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. Frisch hergestellte Rattenadipozyten wurden 2 Stdn. bei 37°C mit Isoproterenol (Endkonzentration 1 μg/ml, 4 μM) und den angegebenen Konzentrationen von Propranolol (Kreise), Fmoc-Propranolol (gefüllte Kreise) oder Fmoc-Propranolol, das 7 Tage bei 37°C, pH 8,5 inkubiert wurde, (Quadrate) inkubiert. Die an das Medium freigegebene Glycerinmenge wurde dann gemäß Shechter, 1982 bestimmt. IC₅₀ ist die Menge an Propranolol oder N-Fmoc-Propranolol-Derivat (in μM), die die Isoproterenol-vermittelte Glycerinfreigabe halbmaximal hemmte.
Wie in 7 gezeigt, weist Fmoc-Propranolol ~ 7% der Wirksamkeit des natürlichen Propranolols auf. Die 7-tägige Inkubation von Fmoc-Propranolol bei pH 8,5 (37°C) erzeugte 50–70 % der β-adrenergen Wirksamkeit des natürlichen Arzneistoffs. Das Derivat ist im Wesentlichen hydrophob, ein Merkmal, das bei der gastrointestinalen Absorption helfen kann.
LITERATURANGABEN

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Claims

Verbindung der Formel: X-Y wobei Y eine Arzneistoffeinheit ist, die mindestens eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus freiem Amino, Carboxyl, Hydroxyl und/oder Mercapto, trägt und X ein aus den Resten der Formeln (i) bis (iv) ausgewählter Rest ist:
wobei R₁ und R₂, gleich oder verschieden, jeweils Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Aryl, Alkaryl, Aralkyl, Halogen, Nitro, Sulfo, Amino, Ammonium, Carboxyl, PO₃H₂ oder OPO₃H₂ sind; R₃ und R₄, gleich oder verschieden, jeweils Wasserstoff, Alkyl oder Aryl sind; und A eine kovalente Bindung ist, wenn der Rest an eine Carboxyl- oder Mercaptogruppe des Arzneistoffs Y gebunden ist, oder A OCO- ist, wenn der Rest an eine Amino- oder Hydroxylgruppe von Y gebunden ist, und pharmazeutisch verträgliche Salze davon, mit der Maßgabe, dass, wenn R₁ bis R₄ Wasserstoff sind und A OCO- ist, Y keine Arzneistoffeinheit ist, die eine O-Malonyltyrosylgruppe enthält.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei Y eine Einheit eines Arzneistoffs für die humane oder veterinäre Verwendung ist, ausgewählt aus antidiabetischen Arzneistoffen, Antibiotika, synthetischen antibakteriellen Mitteln, Analgetika und entzündungshemmenden Arzneistoffen, antiallergischen und antiastmatischen Arzneistoffen, antihypercholesterinämischen Arzneimitteln, β-adrenergen Blockern und antihypertensiven Arzneistoffen, antineoplastischen Arzneistoffen; und antiviralen Arzneistoffen.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei die Einheit Y durch mindestens einen Rest X, bestehend aus einem Rest (i) in welchem R₁ Wasserstoff oder Sulfo ist und R₂, R₃ und R₄ Wasserstoff sind, substituiert ist.
Verbindung gemäß Anspruch 3, wobei Y eine Insulineinheit ist, in welcher freie Amino- und/oder Carboxylgruppen und gegebenenfalls freie Hydroxylgruppen des Insulinmoleküls durch mindestens einen Rest (i) substituiert sind.
Insulinderivat gemäß Anspruch 4, wobei eine oder mehrere Aminogruppen durch den 9-Fluorenylmethoxycarbonylrest (i), in welchem R₁ bis R₄ Wasserstoff sind und A OCO- ist (hierin N-(Fmoc)-Insulin), substituiert sind.
Insulinderivat gemäß Anspruch 4, wobei eine oder mehrere Carboxylgruppen durch den 9-Fluorenylmethylrest (i), in welchem R₁ bis R₄ Wasserstoff sind und A eine kovalente Bindung ist (hierin nachstehend C-(Fm)-Insulin), substituiert sind.
Insulinderivat gemäß Anspruch 4, wobei eine oder mehrere Aminogruppen durch den Fmoc-Rest substituiert sind und eine oder mehrere Carboxylgruppen durch den Fm-Rest substituiert sind (hierin N-(Fmoc), C-(Fm)-Insulin).
Insulinderivat gemäß Anspruch 4, wobei eine oder mehrere Carboxylgruppen durch den Fm-Rest substituiert sind und eine oder mehrere Hydroxylgruppen durch den Fmoc-Rest substituiert sind (hierin C-(Fm), O-(Fmoc)-Insulin).
Insulinderivat gemäß Anspruch 4, wobei eine oder mehrere Amino- und Hydroxylgruppen durch den Fmoc-Rest substituiert sind und eine oder mehrere Carboxylgruppen durch den Fm-Rest substituiert sind (hierin N, O-(Fmoc), C-(Fm)-Insulin).
Insulinderivat gemäß Anspruch 4, mit 1 bis 3 Fmoc-Substituenten an den freien Aminogruppen der Positionen Gly^A1, Phe^B1 oder Lys^B29, wobei A und B die Ketten des Insulinmoleküls sind, ausgewählt aus den Insulinderivaten Gly^A1-N-(Fmoc)-Insulin, Phe^B1-N-(Fmoc)-Insulin, Lys^B29-N-(Fmoc)-Insulin, Gly^A1, Phe^B1-N-(Fmoc)₂-Insulin, Gly^A1, Lys^B29-N-(Fmoc)₂-Insulin, Phe^B1, Lys^B29-N-(Fmoc)₂-Insulin und Gly^A1, Phe^B1, Lys^B29-N-(Fmoc)₃-Insulin.
Insulinderivat gemäß Anspruch 4 mit 1 bis 3 2-Sulfon-Fmoc-Substituenten (hierin Sulfmoc) an den freien Aminogruppen der Positionen Gly^A1, Phe^B1 oder Lys^B29, wobei A und B die Ketten des Insulinmoleküls sind, ausgewählt aus den Insulinderivaten Gly^A1-N-(Sulfmoc)-Insulin, Phe^B1-N-(Sulfmoc)-Insulin, Lys^B29-N-(Sulfmoc)-Insulin, Gly^A1, Phe^B1-N-(Sulfmoc)₂-Insulin, Gly^A1, Lys^B29-N-(Sulfmoc)₂-Insulin, Phe^B1, Lys^B29-N-(Sulfmoc)₂-Insulin und Gly^A1, Phe^B1, Lys^B29-N-(Sulfmoc)₃-Insulin.
(Fmoc, Sulfmoc oder Fm)-Insulinderivat gemäß einem der Ansprüche 4 bis 11, wobei das Insulin natürliches, rekombinantes oder mutiertes menschliches Insulin, Rinder- oder Schweineinsulin ist.
Fmoc-Wachstumshormon, ausgewählt aus menschlichem Wachstumshormon und Rinderwachstumshormon.
Fmoc-Cephalexin, ausgewählt aus N-Fmoc-Cephalexin und Cephalexinfluorenylmethylester.
Di(fluorenylmethoxycarbonyl)-polymyxin B.
Piperacillinfluorenylmethylester.
Fmoc-propranolol.
Arzneimittel, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Arzneimittel gemäß Anspruch 18, umfassend ein N-(Fmoc)-Insulin nach einem der Ansprüche 4 bis 12.
Arzneimittel gemäß Anspruch 19, umfassend natürliches oder rekombinantes humanes N-(Fmoc)₃-Insulin und/oder natürliches oder rekombinantes humanes N-(Fmoc)₂-Insulin.
Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, zur subkutanen Injektion, transdermalen oder oralen Verabreichung.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, zur Herstellung eines Arzneimittels.