CZ36999A3 - Dlouho působící farmaceutika a farmaceutické sloučeniny, které obsahují tyto látky - Google Patents

Dlouho působící farmaceutika a farmaceutické sloučeniny, které obsahují tyto látky Download PDF

Info

Publication number
CZ36999A3
CZ36999A3 CZ99369A CZ36999A CZ36999A3 CZ 36999 A3 CZ36999 A3 CZ 36999A3 CZ 99369 A CZ99369 A CZ 99369A CZ 36999 A CZ36999 A CZ 36999A CZ 36999 A3 CZ36999 A3 CZ 36999A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
insulin
fmoc
radical
groups
carboxyl
Prior art date
Application number
CZ99369A
Other languages
English (en)
Inventor
Matityahu Fridkin
Yoram Shechter
Eytan Gershonov
Original Assignee
Yeda Research And Development Co. Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yeda Research And Development Co. Ltd. filed Critical Yeda Research And Development Co. Ltd.
Publication of CZ36999A3 publication Critical patent/CZ36999A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/555—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound pre-targeting systems involving an organic compound, other than a peptide, protein or antibody, for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/02—Local antiseptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

DLOUHO PŮSOBÍCÍ F ARMACEUFÍK A’A •·· 9 99
FARMACEUTICKÉ SLOUČENINY, KTERÉ OBSAHUJÍ TYTO LÁTKY
DLOUHO PŮSOBÍCÍ FARMACEUTIKA A FARMACEUTICKÉ SLOUČENINY, KTERÉ OBSAHUJÍ TYTO LÁTKY
Předmět vynálezu
.....Předkládaný vynález se týká nových, dlouho působících .
p.roléčiv, které jsou schopny chemické transformace v lidském těle z inaktivní formy na bioaktivní formu, přičemž uvedená proléčiva jsou nositeli funkčních skupin, které jsou senzitivní na středně zásadité podmínky, obzvláště fluormethoxykarbony 1 (Fmoc)- a fluorenylmethyl (Fm)- substituovaná proléčiva a na farmaceutické sloučeniny, které je obsahují.
Podstata vynálezu +
Terapeutická farmaceutika, která jsou běžně používána v lidské terapii a veterinářství, mohou být klasifikována podle různých kritérií. Například mohou být farmaceutika kategorizována jako molekuly, které mají proteinově-peptidický, tj. jsou složeny ze stavebních jednotek na bázi aminokyselin, nebo nepeptidický charakter, nebo pomocí kritéria, které se nevztahuje ke struktuře, jako jsou farmaceutika, absorbovaná orálně nebo užívána jinými způsoby, tj. injekčně, intransálně nebo zevně aby bylo dosaženo krevní cirkulace.
Orálně absorbované sloučeniny mají všeobecně nízkou molekulární hmotnost, poměrně stabilní, lipofilické (olejové) a nepeptidické povahy. Virtuálně se všechna peptidická a proteinová farmaceutika v důsledku svých vnitřních hydrofilických (nelipofilických) a polárních vlastností a metabolické nestability ί· 1>
neřídí těmito kritérii a musí být užívána věť4íOO*y*injgJížiíe. Pj*ótQ^e
L* jsou dále tyto molekuly rychle degradovány v lidském těle pomocí různých mechanizmů, obzvláště proteolýzy, jsou to obvykle molekuly s krátkou životností.
Nepeptidická farmaceutika jsou velice často dostatečně hydrofobická a mohou dosáhnout krevní cirkulace gastrointenstinálním způsobem. V důsledku svojí relativní chemické stability mají nepeptidická farmaceutika obvykle dlouhou životnost.
Proteinová a peptidová farmaceutika jsou používána v celé řadě klinických aplikací, např. inzulín při léčbě cukrovky, gonadotropin uvolňující hormonové (GnRH) analogie při léčbě rakoviny prostaty, kalcitonin při léčbě kostních potíží. Potenciál využití pro tuto velice důležitou skupinu molekul je rozsáhlý, ale byl prozkoumán pouze částečně, jestliže ne nevýznamně. Toto je ve velkém rozsahu důsledkem krátké životnosti v lidském těle a nevhodnosti způsobu užívání. Nepeptidická farmaceutika, jako jsou antibiotika, třebaže mají relativně dlouhou životnost, musí být užívána několikrát denně po dobu jednoho týdne nebo delší, aby byly udrženy požadované nepřetržité cirkulační hladiny.
Orální absorpce farmaceutik jsou vysoce požadovaným cílem při léčbě lidských onemocnění, obzvláště pak při dlouhodobých terapeutických léčbách. Strukturální změny farmaceutik mohou mít za následek zvýšení orální a zevní absorpce, biostability a dočasně bio využitelnosti. Hlavní snaha a úsilí jsou v současné době namířeny směrem dosaženi těchto cílů. Většina přístupů zahrnuje modifikaci farmaceutik takovým způsobem, že je uchována jejich přirozená architektura, tj. bioaktivní struktura. Tato přirozená struktura je rozlišována specificky farmaceutickým cílem a je předpokládanou vlastností možnosti využití farmaceutika. V mnoha případech je vsak naneštěstí přirozená struktura zjišťována pomocí
4' <····«*· ···« 'clearing machinery systém', který je schopný váTžfct fa Citrát eutíjcifftl, degradovat nebo metabolizovat ho a tak akcelerovat jeho likvidaci. Takže o stabilizaci bioaktivní struktury je často usilováno jako průvodního jevu o požadované zvýšení metabolické stability. K dosažení tohoto cíle jsou používány metody, jako je enkapsulace, snížená rozpustnost a chemická modifikace
Je velice žádoucí, aby byla prodloužena poloviční životnost virtuálně mnoha, jestliže ne všech peptidických a stejně tak i nepeptidických farmaceutik, která existují na současném trhu nebo která mají být vyvinuta v budoucnosti včetně antibiotik, antivir álriích, antihypertensivních, protizánětlivých, analgesických, anticholesterolemických, antikarcinogenních, antidiabetických, růst podporujících a dalších farmaceutik. Farmaceutika, týkající se přírodních léků, která jsou toxická nad určité prahové koncentrace, by mohla být obzvláště prospěšná.
Souhrn vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí nových proléčiv, charakterizovaných svojí vysokou citlivostí na střední zásadité podmínky a svojí schopností transformace z inaktivní na bioaktivní formu za fyziologických podmínek v lidském těle.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí proléčiv, odvozených z léčiv, která mají volné amino, karbony!, hydroxyl a/nebo řnerkapto skupiny, přičemž uvedená proléčiva jsou v podstatě biologicky neaktivní, ale jsou schopná spontánní a pomále konverze na původní aktivní molekulu farmaceutika v lidském těle po podání.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí proléčiv, která představují vyšší metabolíckou stabilitu a bio využitelnost.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu’^psítycniiťí··:
proléčiv, která představují alternativní možnosti podávání farmaceutik, např. orální a transdermální a které jsou dále schopny pronikat přes fyziologické bariéry, např. krevní mozkové bariéry.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí proléčiv, která umožňují specifické zamíření léčiva do zasažených oblastí v lidském těle.
Předkládaný vynález se tak týká nových proléčiv, odvozených z léčiv, ve kterých je jedna nebo více skupin molekuly uvedeného farmaceutika, vybraných ze skupiny, obsahující volné amino, karboxyl, hydroxyl a/nebo merkapto skupiny, nahrazena funkčními skupinami, které jsou senzitivní na zásady a odstranitelné v případě středně zásaditých, např. fyziologických podmínek.
Nový pojem vynálezu pro pomalu působící farmaceutika zahrnuje jejich derivatizaci do nových, všeobecně mnohem více hydrofobických farmaceutických derivátů. V tomto přístupu je dávána přednost ztrátě., spíše než uchování, přírodní konformace, biologické potence a rozlišovací identity farmaceutika degradativními systémy. Výhoda tohoto přístupu však spočívá ve skutečnosti, že takto modifikovaný derivát může pomalu a spontánně hydro lyžovat zpět do přírodního aktivního farmaceutika za in vivo podmínek.
Ve specifickém vyjádření mají proléčiva vynálezu vzorec:
kde
Y je podíl farmaceutika, nesoucí přinejmenším jednu funkční skupinu, vybranou z volných amino, karboxyl, hydroxyl a/nebo merkapto radikálů, a
X je radikál, vybraný z radikálů vzorců (i) až (iv):
amonium, karboxyl, PO3H2 nebo ΟΡΌ.3Η2; R3 a R4 jsou stejné nebo různé radikály jako vodík, alkyl nebo aryl, a A je kovalentní vazba, kde je radikál připojen ke karboxylové nebo merkapto skupině farmaceutika A nebo A je OCO-, kde je radikál připojen k nějaké amino nebo hydroxyl skupině Y.
Podle předkládaného vynálezu je Y podíl farmaceutika pro lidské a veterinární použití, nesoucí přinejmenším jednu funkční skupinu, vybranou z amino, karboxyl, hydroxyl a/nebo merkapto skupin, jako jsou, ale nejsou omezeny na antidiabetická farmaceutika, např. inzulín; růstové promotéry, např. lidské růstové hormony, kostní růstové hormony; antibiotika, jako jsou aminoglykosidy, např. gentamicin, neomycin a streptomycin, βlaktamy, jako je penicilín, např. amoxicilin, amoicilin, piperacilín a cephalosporiny, např. cefaclor, cemfionox a cephalexin, makrolidy, např. karbomycin a ěrythromycin a ρ o 1 y p e t i d i c k á, a n t i b i o t i k a, např. bacitracin, gramcidiny a polymyxiny; syntetické antibakteriální látky, např. trimethoprim, kyselina pyromidická a sulfamethazin; analgesická a anti-zánětlivá farmaceutika, např. acetaminophen, aspirin, ibufenac, indomethacin; antialergická a antiastmatická farmaceutika, např. amlexanox a cromolyn;
antihypercholesteromická farmaceutika, např. kyselina clofibrická,
4 4 » 0·· 0000 kyselina oxiníacická a triparanol; P-adrenergĚcřóíb44k«iUáě« *».· *..*
404 «0 0« ΐ »· «9 antihypertensi vní farmaceutika, např. bupranolol, captopril, indenolol, propanolol a kyselina 4-aminobutanoická; antineoplastická farmaceutika, např. daunorubicin, azacitidín, 6merkaptopurin, interferony, interleukin-2, methotrěxát, taxol a vinblastin; antivirální farmaceutika, např. acyclovir, ganciclovir, amantadin, interferony, AZT a ribavirin, atd. Pojem farmaceutika podle vynálezu je určen k zahrnutí také feromonů,
Pojmy “alkyl“, “alkoxy“, “alkoxyalkyl“, “aryl“, “alkaryl“ a “aralkyl v definicích Rl, R2, R3 a R4, které jsou zde používány k popisu alkylových radikálů 1-8, přednostně pak 1-4 uhlíkových atomů, např. metyl, etyl, isopropyl a butyl a arylové radikály 6-10 uhlíkových atomů, např. fenyl a naftyl. Pojem “halogen“ zahrnuje bromo, fluoro, chloro a jodo.
V preferovaném provedeni vynálezu je funkční skupina radikál (i), kde Rl, R2, R3 a R4 jsou vodík a A je OCO-, tj. dobře známý
9-fluorenyl-methoxykarbonylový (Fmoc) radikál, který je široce používán v peptidové syntéze pro dočasnou reverzibilní ochranu aminoskupin (ohledně přehledu, viz L.A. Carpino, Acc. Chem. Res.
( 1987) 20,401-407). Skupina Fmoc je obzvláště vhodná pro peptidovou syntézu v důsledku příznivé syntetické manipulaci pro její zavedení a odstranění a preferenční stabilitě jako předpokladu pro peptidovou syntézu a vhodné čištění. Kromě toho je uvedená 9fluorenylmetyl (Fm) skupina také využitelná pro reverzibilní maskováni karboxylických funkcí, např. aminokyselin. Vznikající 9flurenylmetyl estery (Fm-estery) generují základní volné karboxylické funkce v důsledku cesty β-eliminační reakce při středně zásadité úpravě a tak mohou být podobně využity pro reverzibilní maskování karboxylických funkcí farmaceutik. Skupina totototo ·*· «to·· • toto « · » « «toto· •Ů to «·«·« **·· to toto····
Fmoc je další potenciální podobné použití v,íev£fzibxhií ÍOchwTiš.· hydroxylových skupin tyrosinu, šeřinu a threoninu.
Halogenované Fmoc radikály (i), kde je nejméně jeden z Rl a R2 halogen v poloze 2 nebo 7, přednostně Cl nebo Br, 2-chloro-lindenylmethoxykarbonylový (CLIMOC) radikál (ii), 1benzol[f]indenylmethoxykarbonyl uretanový (BIMOC) radikál (iii), uretan sulfonový radikál (iv) a odpovídající radikály (i) až (iv), kde A je kovalentní vazba, mohou být použity podobně jako Fmoc a Fm pro substituci volných amino, karboxyl, hydroxyl a merkapto funkcí farmaceutik, čímž je zajištěn široký rozsah citlivosti ve směru odstranění těchto skupin při zásaditých, např, fyziologických podmínkách. Ve skutečnosti výše uvedené radikály (i) až (iv) patří do hlavní skupiny vzácných chemických entit, které podléhají hydrolýze při neutrálním nebo mírně alkalickém pH a středních podmínkách a mohou být proto používány pro dočasnou reverzibilní ochranu a- a ε-aminoskupin, například v peptidové synteze a mohou být odstraněny z aminofunkce pomocí β-eliminační reakce za středně zásaditých podmínek.
Podle vynálezu radikál (i) až (iv), přednostně Fmoc kovalentně spojený s amino a/nebo hydroxyl podíly, nebo Fm kovalentně připojený ke karboxyl a/nebo merkapto podílům, podléhá hydrolýze (přes β-eliminaci) zpět na volné amino, hydroxy, merkapto nebo karboxyl funkce za fyziologických podmínek v tělesné tekutině, zejména při pH 7,4 a 37°C.
Farmaceutika vynálezu mohou být připravena reakcí molekuly farmaceutika s vhodným činidlem, obsahujícím radikál (i) až (iv). Jsou využitelné některé deriváty 9-fluorenylmethylu (Fm), jako je 9-fluorenylmethyl-N-hydroxysuccinimid (Fmoc-OSu), velice specifické činidlo pro amino funkce; 9-fluorenylmethoxykarbonyl chlorid (Fmoc-CI), který reaguje s a kovalentně se připojuje k • · ·
·· * · 4 · * · · • «4* 4 4* · ' ' ů· · * · ie··· amino a hydroxylovým radikálům; 9-chlorom#1khý)ífu!Qfén;(Fm*-’ který reaguje s merkapto radikály za vzniku S-Fm derivátů (Bodanszky a Bednarek, 1982); a 9-fluorenylmethanol (Fra-OH), který reaguje s a esterifikuje karboxylické funkce.
Funkční skupiny, citlivé na zásadité podmínky, které mohou být odstraněny z amino, karboxylických, hydroxylických nebo merkapto funkcí, sledující cesty odlišné od β-eliminace, jsou také využitelné, ale obvykle vyžadují extenzivní manipulace neadekvátní pro farmaceutickou, ochranu. .Jedna známá výjimka je trifluor acetyl skupina (TFA), která je spíše podobná Fm-oc ve svém snadném odstranění z amino skupin, ale je potenciálně toxická a tak TFAderi vatizovaná farmaceutika nejsou doporučována pro terapeutické účely. Fmoc-aminokyseliny, např. Fmoc-leucin má na druhou stranu nízký index toxicity v experimentálních zvířecích modelech (Burch et al., 1991)
Vynález se dále týká farmaceutických sloučenin, které obsahují proléčiva podle vynálezu a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
Stručný popis výkresů
Obr. 1 ukazuje časový průběh aktivace (pH 7,4, 37°C) LysB 3 29N-(Fmoc)i-inzulínu (plné čtverečky), PheB1, Lysu29-N-(Fmoc)?inzulínu (prázdné Čtverečky) a G1 yA1, P h e B1, LysB29-N-(Fmoc)3inzulínu (substituován na všech třech amino skupinách, prázdná kolečka), jak je stanoveno bezbuněčným biologickým kvantitativním rozborem (fosforylace [ ρ o 1 y (G1 u 4 T y r) ] pomocí obohacené přípravy inzulínového receptoru tyrosine kinase).
Obr.2 ukazuje vliv jednoho intraperitoneálního podání (Fmoc)2-inzulínu (3 mg/krysa ve 2 ml 10% DMSO) a NPH-inzulínu (3 mg/krysa) na hladině krevní glukózy normálních krys.
* » I»
Obr.3 ukazuje vliv jednoho intraperitone^lnfrhjo· jJo$mÍí · *·«·’*.í *·· ·· ·· · ·♦ *» * (Sulfmoc)2-inzulínu a přírodního inzulínu (v obou případech 3 mg/krysa v 1 ml vody) na hladině krevní glukózy normálních krys.
Obr.4 ukazuje degradaci inzulínu (prázdné Čtverečky) a GlyA1, Phe81, LysB29-N-(Fmoc)3-inzulínu (plné čtverečky) pomocí směsí trypsinu a chymotrypsinu.
Obr.5 ukazuje vliv jednoho podání GlyA1, PheB1, LysB29-N(Fmoc)3-inzulínu (plné čtverečky) na hladinách krevní glukózy diabetického streptozocinu (STZ)-léěené krysy ve srovnání s podáním přírodního inzulínu (prázdné čtverečky).
Obr.6 ukazuje , že jedno podání Phe81, LysB29-N-(Fmoc)2inzulínu STZ-léčeným hyperglykemickým krysám vyvolává prodloužený efekt sníženi hladin krevní glukózy.
Obr.7 ukazuje β-adrenergickou antagonistickou potenci NFmoc-propanololu přes generaci aktivního přopanololu při inkubaci.
Předkládaný vynález se týká farmaceutik, navržených podle nové koncepce pro vyvinuti lepších způsobů podávání farmaceutik a z toho vyplývající zvýšenou stabilitu a bio aktivitu farmaceutik.
Podle nového přístupu předkládaného vynálezu je preferována spíše ztráta něž uchování přírodní struktury farmaceutika, biologické aktivity a cílové rozlišovací schopnosti, ale dodržením aplikace bude takto modifikované farmaceutikum spontánně a pomalu konvertovat zpět v těle ňa původní aktivní molekulu.
Podle nové koncepce předkládaného vynálezu může být celá řada běžně aplikovaných farmaceutik konvertována na inaktivní proléČiva, která mají dlouhou životnost, protože se vyhýbají všeobecné a receptorem zprostředkované degradace v organizmu. ProléČiva vynálezu jsou navržena tak, aby byla podrobena spontánní
Ti * ·· ··* φφ φφ ·· · · · φ φ ·«« regeneraci do původních farmaceutik ža in **;* * fyziologických podmínek. Široké spektrum chemických postupů, využitelných pro výrobu proléčiv podle vynálezu, umožňuje dosáhnout vysoké nebo nízké rychlosti reaktivace podle potřeby. Tato uvedená proléčiva mohou být připravena s fyzikálními atributy, jako je snížená rozpustnost a z tohoto důvodu i nižší rychlost s.c. absorpce. Kromě toho změna indexu hydrofobicity proléčiv kombinovaná s funkcí spontánní regenerace v krevním oběhu umožňuje konvertovat orálně neabsorptivní farmaceutika na gastrointestineálně přijímatelná farmaceutika.
Proléčiva podle vynálezu zahrnují modifikovaná farmaceutika pro použití u lidí a zvířat a dále modifikované insekticidní fenomény.
Z jednoho hlediska vynálezu je prolečivem inzulín. V současnosti je unzulín predominantním farmaceutikem pro diabetes mellitus, skupinu syndromů charakterizovaných hyperglykemií, změněným metabolismem lipidů, uhlovodanů a proteinů a zvýšeným nebezpečím komplikací v důsledku vaskulárních onemocnění.
Většina pacientů může být klasifikována klinicky tak, že mají buďto na inzulínu závislý (IDDM, typ 1) nebo na inzulínu nezávislý diabetes mellitus (NIDDM, typ 2). V západním světě je okolo 90% diabetických pacientů typu II a většina ze zbývajících jsou pacienti typu I. Okolo 70% diabetiků typu II ve Spojených státech jsou také obézní pacienti, což je faktor, který významně přispívá k inzulínové rezistenci. U diabetiků typů I existuje extenzivní a selektivní ztráta pankreatických β-buněk a stavu hypoinzulinemie. Na rozdíl od toho neexistují žádné významné ztráty β-buněk z ostrůvků diabetických pacientů typu II, u kterých je průměrná plazma koncentrace inzulínu po dobu 24-hodin v podstatě normální nebo dokonce zvýšená v důsledku periferní rezistence na činnost » · »» * fcfc *9 • fc 9 * ··· · 9 <
• 9 · • fcfc říj fc fc hormonu. Nicméně jednotlivci s diabetem typií.ll.fnajufeláti vqj* nedostatek inzulínu. Toto je způsobeno tím, že normální pankreatické β-buňky by měly být schopné vyměšovat taková množství inzulínu, která jsou významně větší než normální množství, když jsou konfrontována s hyperglykemií, což umožňuje jednotlivci udržet euglykemii ve stavu mírné rezistence na inzulín.
Virtuálně jsou všechny formy diabetes mellitus důsledkem buďto snížení cirkulační koncentrace inzulínu (nedostatek inzulínu) nebo snížení odezvy -periferních tkání na inzulín (inzulínová rezistence) ve spojení s nadbytkem hormonů s činnostmi opačnými než jsou Činnosti inzulínu (glukagon, růstový hormon, kortizol a katecholaminy). Tyto hormonální abnormality vedou ke změnám metabolismu uhlovodanů, lipidů, ketonů a aminokyselin. Hlavní charakteristikou je syndrom hyperglykemie.
Poloviční životnost inzulínu v plazme jé zhruba 5-6 minut. K degradaci inzulínu dochází, převážně v játrech a v menším rozsahu v ledvinách a svalech. Okolo 50% inzulínu, který se dostane do jater portál ní žilou je zničen a nikdy se nedostane do hlavní cirkulace. Inzulín je filtrován renální glumerulií a je znovu reabsorbován trubicemi, které do také degradují.
Proteolytická degradace inzulínu v játrech je převážně zprostředkována receptorem. Následující inzulínový receptorové navázaný komplex je pak internalizován do malých měchýrků, známých jako endosomy, kde je zahájena degradace. Část inzulínu je také dodána do lysosomů ohledně degradace. V hepatocytech je degradováno okolo 5 0% internalizovaného inzulínu.
Inzulín je kritický pro řízení diabetes ketoacidozy a důležitý při léčbě hyper.glykemického neketonického komatu a v perioperativním řízení diabetických pacientů typu I a typu II. Podkožní (s.c.) podávání inzulínu je primární léčba pro všechny ft ft · 99 ft «··
9·· *99 · 9 · * ,, 9···»·····9 '4 9····· 9····· ftft· ··· pacienty typu I a většinu diabetických pacienti? t7pu*kí, kteří nejsou adekvátně pod kontrolou pomocí diety a/nebo orálních hypoglykemických činidel. Ve všech případech je cílem normalizovat nejenom pouze krevní glukózu, ale také všechny ostatní aspekty nevyváženého metabolizrriu, vznikajícího z hypoinzulinomie a hyperglykemie.
Dlouhodobá léčba, která je prvotně založena na s.c. podávání inzulínu, nenapodobuje normální rychlé zvýšení a snížení sekrece
......inzulínu „v „odezvě na injektované nutrienty a vykazuje spíše, preferenční periferálňí než hepatické efekty inzulínu, ale s touto léčbou bylo nicméně dosaženo značných úspěchů.
Preparáty inzulínu, tradičně používané pro s.c. aplikaci, jsou - klasifikovány podle doby trvání jejich činnosti na krátkodobě, střednědobě a dlouhodobě působící inzulíny a podle původu léku. Nyní je široce využitelný lidský inzulín a teoreticky se očekává, že bude méně imunogenní než porcinové nebo bovinové inzulíny, protože poslední dva druhy se liší od lidského inzulínu o jednu a tři aminokyseliny. Avšak když jsou vysoce čisté, mají všechny tři inzulíny malou·, ale změ.řitelnou schopnost stimulovat imunní odezvu. Preparáty při hodnotách neutrálního pH jsou všeobecně stabilní a umožňují skladování po dlouhou dobu při pokojové teplotě. Pro tradiční a terapeutické účely je dávkování a koncentrace vyjádřena v jednotkách (U) na základě množství, které je potřebné k vyvolání normoglykemie u králíků. Homogenní přípravy inzulínu obsahují okolo 25 U/mg. Téměř všechny komerční preparáty inzulínu jsou dodávány v roztoku o koncentraci 100 U/ml.
Krátkodobě a rychle působící inzulíny jsou rozpustné preparáty krystalického zinkového inzulínu, rozpuštěného v bufru s neutrálním pH, obvykle injektovaného 30-45 minut před jídlem.
* « · »i · ·· ·· • ♦ ♦ · » » « « · « « • t · · « · · ·*«· l> ♦ ·«♦♦♦····♦♦·»* ·«·
Tyto preparáty mají nejrychlejší náběhovou 6ínnx»št á.ífejfcratšÍ’do.Bu trvání.
Při stabilních metabolických podmínkách jsou běžné a obyčejné inzulíny obvykle podávány společně dohromady se středně době nebo dlouhodobě působícími preparáty. Středně době působící inzulíny byly navrženy jako méně rozpustné ve vodných roztocích, protože se rozpouštějí postupněji při podkožním podávání a doba jejich působení je delší. Dva preparáty, které jsou nejčastěji používány, jsou NPH inzulín (NPH je zkratka pro Neutrál
Protamine Hagedorn), suspenze zinkově-inzulino vých krystalů ve fosfátovém bufou, modifikovaném přídavkem protaminového sulfátu a Leňte inzulínu, suspenze inzulínu v acetátovém bufou, modifikovaném chloridem zineČnatým k minimalizací rozpustnosti inzulínu.
Protože sé očekává, že krátkodobě působící inzulín pokryje dobu 0.4-7 hodin a střednědobě působící inzulín může pokrýt dobu
1.5-20 hodin, pak správné načasování a dávky kombinace dvou inzulínů musí vzít do úvahy proměnné parametry, jako je nutriční chováni, noční (zrychlená) hypoglykemie a ranní hyperglykemie, když je zvýšena aktivita protiregulačních hormonů (na inzulín). Jestliže jsou rychle působící a dlouhodobě nebo střednědobě působící inzulínové preparáty podávány společně dohromady, pak je všeobecnou nevýhodou takovýchto kombinací to,, že míšení některých rychle působících inzulínů může být komplikováno nadbytkem Zn2+ nebo protaminu dlouhodobě nebo středně době působícího preparátu, který je tak konvertován na střednědobě a dokonce dlouhodobě působící inzulín.
Dlouhodobě působící inzulíny, jako je Ultralente inzulín nebo prodloužený zinkový inzulín nebo protamin-zinek-inzulinové suspenze, jsou inzulínové preparáty, do kterých byl zinek nebo *“Γ ·♦ · ·♦ ·« · « 9 «9 • · * 9 9 9 9999
999 «99* · 9 · « ·«· «9 9 9999 9 «99 «9« zinek plus protamin přidán v nadbytku za úč«3era»*dosožetíí nerozpustných preparátů inzulínu. Jsou to suspenze minutových Částic zinkového inzulínu a liší se pouze velikostí částic, která určuje dobu trvání jejich činnosti. Na rozdíl od běžného inzulínu mají Ultralente inzulíny velice pomalý náběh a prodloužený (plochý) pík činnosti. Obhajují poskytnutí nízkobazálních koncentrací inzulínu během dne, ale jejich dlouhá poloviční životnost způsobuje obtížné stanovení optimálního dávkování a je potřebné provést několika denní léčbu před tím než může být dosaženo koncentrace v ustáleném stavu. Bovinový a porcinový Ultralente inzulín mají mnohem více prodloužený průběh činnosti než to vykazuje lidský Ultralente inzulín. Je doporučováno zahájit terapii s třikrát aplikovanou normální denní dávkou jako zaváděcí dávkou a potom používat jednu nebo dvě denní injekce.
Inzulín má tři amino a šest karboxylových skupin, které jsou využitelné pro modifikaci. Inzulínové deriváty vynálezu jsou substituovány na inzulínové A a B-řetězce pomocí jednoho nebo více radikálů (i) až (iv) nad jednu nebo více terminálových amino
9« «9 skupin G1 yA1 a P h e u 1 radikálů, na ε-amino skupinu Lys
B 29 na terminálové karboxyl skupiny AsnA2' a ThrilJl' a/nebo na volné
TyrB26, Thr karboxylové skupiny Glu , Glu , Glu ‘, Glu . Kromě toho takto substituované karboxyl a/nebo amino inzulínové deriváty mohou být dále substituovány jednou nebo více funkčními skupinami (i) až (iv) na jedné nebo více volných hydroxylových skupinách zbytků ThrA8, SerA9, TyrAU, TyrA19, SerB9, Tyr016, 027 a ThrB3°.
V jednom preferovaném vyjádření tohoto vynálezu jsou inzulínové deriváty substituovány jedním nebo více Fmoc podíly na volných terminálových amino skupinách GlyA1 a PheB1 a/nebo na εamino skupině Lys029, takže získané inzulínové deriváty mají 1 až 3 • '00 00 · 00 00 0· 0 · «♦· 000« • 0 0 · 0 0 4 0 00 0 * 0····· 000« 0000 0··
Fmoc substituenty v polohách A1, B1 a/nebo ^*9*řózubňové ··* ·<* molekuly, obzvláště GlyA1-N-(Fmoc)i-, PheBI-N-(Fmoc)i- a LysB29N-(Fmoc)i-inzulín, GlyA1, PheB 1 -N-(Fmoc)2-, GlyA1, Lys B29-N(Fmoc)2- a PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-inzulín a GIyAI, PheB1, LysB29N-(Fmoc)3-inzulín.
Reakce inzulínu s aktivovaným Fmoc, například s 9fluorenylmethyl-N^-hydoxýsuccinimidem (Fmoc-OSu) dává mono-, di a tri-N-Fmoc-inzulíny, které mohou být snadno rozpuštěny použitím HPLC postupů a individuálně získány v čisté formě. K získání di-NFmoč-inzulínu jako jediného produktu je nejprve ochráněna jedna z volných amino skupin, např. pomocí t-Boc skupiny, ochráněný inzulínový derivát se pak nechá reagovat s přebytkem Fmoc-OSu a ochranná skupina je pak odstraněna a vznikne požadovaný di-NFmoc-inzulín. Když jsou podávány diabetickým pacientům, jsou mono-, di- a tr.i-N-Fmoc konvertovány na přírodní inzulín in vivo vedoucí k antidiabetickým efektům s různými, včetně prodlouženými časovými periodami.
Pro substituci pouze karboxylových skupin inzulínu (C-Fmj, tj. v terminálových Asn421 a Thr030 a v GluA\ GtuA17, GluBn a Glu112’ zbytcích, jsou nejprve ochráněny volné amino skupiny molekuly inzulínu, např. pomocí t-Boc skupin a pak je provedena reakce 3 kroků, kde (1) volné karboxylové skupiny’jsou konvertovány na aktivní ester skupiny pomocí reakce, např. s onitrofenolem nebo N-hydřoxy-succinimidem; (2) reakce aktivované ester skupiny s 9-fluorenyl methanolem je provedena v přítomnosti imidazolu; a (3) ochranné t-Boc skupiny jsou odstraněny. Alternativní postup zahrnuje jednokrokovou přímou esterifikaci karboxylických skupin pomocí N,N -dicyklohexylkarbodiimidu, 9fluorenylmethanolu a 4-dimethylaminópyridinu po které následuje odstraněni t-Boc skupin.
• ·· ·* · ·· H ti 9 t · · · « β « · μ ·····♦· « fc·»
Když jsou požadovány Fmoc-inzulinové díerfVZatjE, ! **;* * ··; ··; substituované na amino a karboxylových skupinách (N-Fmoc, CFm), je nejprve připraven derivát N-Fmoc pomocí Fmoc-OSu a NFmoc inzulín je pak konvertován na aktivní estery po čemž následuje reakce s 9-fluorenylmethanolem, jak je popsáno výše.
Pro přípravu Fm, Fmoc-inzulinových derivátů, substituovaných na karboxylových a hydroxylových funkcích (C-Fm, Ο-Fmoc), jsou nejprve ochráněny amino skupiny pomocí t-Boc, C-Fm inzulínový derivát je připraven tak, jak je uvedeno výše a potom následuje reakce s 9-fluorenylmethoxykarbonyl chloridem a odstranění ochranných N-t-Boc skupin.
Pro přípravu Fm, Fmoc-inzulinových derivátů, substituovaných na amino, karboxylových a hydroxylových funkcích (N, Ο-Fmoc, CFm) je N-Fmoc, C-Fm inzulín připraven tak, jak je uvedeno výše a je pak provedena reakce s 9-fluorenylmethoxykarbonyl chloridem.
Modifikované inzulíny podle vynálezu mohou být připraveny z jakéhokoliv inzulínu, který je vhodný pro lidské použití, jako je přirozený, rekombinantní nebo mutovaný lidský, porcinový nebo bovinový inzulín. Příklady mutovaných inzulínů jsou B16-Tyr-»His lidský inzulínový analog (Kaarsholm and Ludvigsen, 1995) a Lysli28ProB29 lidský inzulínový analog (inzulín lispro), ve kterých je přirozeně se vyskytující sekvence aminokyselin v polohách B28 a B29 obrácena. Inzulín lispro je ekvipotentní lidskému inzulínu a je absorbován ještě mnohem rychleji z míst podkožních injekcí (Campbell et al., 1996). V preferovaném uspořádání je inzulín lidský inzulín, buďto přirozený nebo rekombinantní.
Mono-N-Fmoc-inzulinové deriváty předkládaného vynálezu mají 40-80% přirozené inzulínové biologické potence, jak je stanoveno pomocí [poly(Glu4Tyr)j fosforylační kvantitativní analýzy. Di- a tri-N-Fmoc-inzulinové deriváty mají 2-9% a <1% • 99 ·· 9 »· »· • · · · · * · «·©· ι< *···»···» přirozené inzulínové biologické potence, jak je. sj^no^Vó· pómtxn ’í [poly(GlUíTyr)] fosforylační kvantitativní analýzy. Když jsou správně používány a ve správných množstvích, pak tyto tri prototypy mohou v podstatě nahradit tradiční směsi rychle, střednědobě a pomalu působících inzulínů, které jsou běžně aplikovány v podkožní terapii diabetiků. S ohledem na příslušný inzulín vynález poskytuje farmaceutické sloučeniny, které obsahují jeden nebo více inzulínových derivátů vynálezu a farmaceuticky akceptovatelný nosič. Pro dlouhodobě působící efekt bude sloučenina přednostně obsahovat buďto samotný N-(Fmoc)3inzulínový nebo N-(Fmoc)2-inzulínový derivát nebo směs obou derivátů. Farmaceutická sloučenina může být také prezentována v jakékoliv vhodné formě, například jako orální formulace nebo pro podkožní injekci.
V dalším vyjádření tohoto stejného aspektu se vynález týká metody pro léčbu diabetů, která se skládá z podávání efektivní dávky jednoho nebo více inzulínových derivátů diabetickým pacientům. V preferovaných vyjádřeních je derivát buďto přirozený nebo rekombinantní lidský N-(Fmoc)3-inzulín nebo N-(Fmoc)2inzulín nebo směs obou, podávaných v intervalech 5-8 dní. Jestliže je to nezbytné, je léčba pomocí Fmoc-inzulínového derivátu doplněna denním podáváním rychle působícího inzulínu.
Pro dlouhodobé léčení je inzulín hlavně podáván jako podkožní injekce. Běžná léčba pomocí dlouhodobě působících inzulínů, podávaných podkožně, naráží na problémy velkých změn v absorpci mezi jednotlivými diabetickými pacienty v důsledku skutečnosti, že dávkované látky mohou potenciálně difundovat stranou od místa podkožní injekce. Předkládaný vynález poskytuje inzulínové deriváty se zabudovanou' sníženou rozpustností v rámci samotné molekuly inzulínu. Očekává se od toho, že to bude v
ΙΟ • ·· ·· 9 99 99 *· 999 «999 ·»«99·9·9·«
999 9 9 9 9999 Λ 99« 999 lidských tělech eliminovat velkou změnu v poitk©.žn{‘ailso^pci.a* minimalizovat nebo dokonce i eliminovat interference při míšení analogů. Správná směs třech N-(Fmoc)-inzulinových prototypů může pokrýt prodlouženou dobu účinnosti, protože kombinuje potřebu na rychle působící inzulín společně s efekty pomalého uvolňování N-(Fmoc)2 a N-(Fmoc)3-inzulínu, přičemž všechny mohou být míšeny společně bez interferujících efektů.
V dalším vyjádření tohoto stejného aspektu se sloučenina . vynálezu skládá ze směsi mono, di a tri-N-Fmoc-inzulí nových derivátů. N-(FmOc)3-inzulín je v podstatě dlouhodobě působící inzulín; N-(Fmoc)!-inzulíny jsou 40-80% biologicky aktivní, jak je stanoveno pomocí [poly(Glu4Týr)] fosforylační kvantitativní analýzy a vykazují vyšší rozpustnost ve vodných roztocích a N(Fmoc)2-inzulíny jsou 2-9% biologicky aktivní, jak je stanoveno pomoci [poly(Glu4Tyr)J fosforylační kvantitativní analýzy a jsou méně rozpustné ve vodných roztocích. Všechny tři analogy se vrací na plně aktivní inzulíny pří inkubaci při 37°C a fyziologických hodnotách pH. Takže správná směs tří analogů může dávat rychlý, střednědobý a dlouhodobý efekt, kterého je v současnosti dosaženo vícenásobnou injekcí běžného inzulínu společně s preparáty, obsahujícími zinek a protamin.
V dalších aspektech předkládaného vynálezu jsou proléčiva odvozena z farmaceutik pro lidské nebo veterinární použití včetně, ale nejsou omezena na antidiabetická, antizánětlivá, antibakteriální', antivirální, antineoplastická a antihypertenži vní farmaceutika, stejně tak jako na farmaceutika pro léčbu imunologických, dermatologických a neurologických onemocnění.
Farmaceutické sloučeniny vynálezu obsahují proléčiva nebo farmaceuticky akceptovatelnou sůl a farmaceuticky akceptovatelný nosič. Jakékoliv vhodné způsoby podávání farmaceutik lidem a
94 94 * Wt |9 «*·· «99 · 9 9 9 ♦ •9 99·»· 99» • 999 99 9 4999 9 999 999 zvířatům jsou použitelné podle vynálezu, na p«k*kád fwínoící ..· konvenčního injektovatelného, implantovatelného, orálního, rektálního nebo povrchového podávání. Tyto preparáty mohou být připraveny konvenčními metodami, které jsou známy zkušeným pracovníkům v oboru a které jsou například popsány v publikaci Remingotn's Pharmaceutical Science, A.R. Gennaro, ed., 17th edition, 1985, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA.
Vynález bude nyní doložen následujícími neomezujícími příklady.
PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU Biologické postupy:
(i) Příprava upravených dávek streptozotocinu (STZ)
Mužské Wístar dávky (18O-.2.00g) byly aplikovány oddělením
Department of Hormone Research, Weizmann Institute of Science. Diabety byly vyvolány jednou nitrožilni injekcí čerstvě připraveného roztoku streptozotocinu (55 mg/kg tělesné váhy) v 0.1M citrátovém bufru (pH 4.5) podle publikace Meyerovitch et al., 1 987.
(ii) Obohacený preparát inzulínového receptor tyrosine kinase byl získán z dávky játrových membrán, jak je popsáno v publikaci Meyerovitch et al., 1990, Stručně řečeno byla játra zhomogenizována za přítomnosti inhibitorů proteinázy, rozpuštěna v 1% Triton X-100 a odstředěna. Na povrchu plovoucí část Byla převedena pres sloupec pšeničných zárodků agglutinin (WGA)agaťose (Sigma). Adsorbovaná část inzulínového receptorů byla eluována použitím 0.3M N-acetyl-D-glucose aminu v 50mM HEPES bufru, pH 7.4, obsahujícím 0.1% Triton X-100, 10% glycerol a
0.1 5M NaCl. Biologické potence inzulínu a inzulínových derivátů byly eluovány použitím kvantitavních rozborů (iii) a (iv) níže.
ΑΛΤ
44 44 4 44 «4 • 4 4 4 4 · · 4 · t 4 • 4 « 4 4 4 4 4 4 4 4 '
4*4 4 4 4 ··*· 4 44· «44 (iii) Lipogeneze (zapravení značkované glukózy vlo fipídfc **' ·· intaktnich adipocytéz)
Dávka adipocytéz byla připravena v podstatě metodou Rodbell, 1964. Tukové polštářky mužských Wistar dávek byly nakrájeny na malé kousky žiletkami a suspendovány ve 3 ml KRB bufru, obsahujícího NaCí, 110 mM; NaHC03, 25 mM; KC1, 5 mM; KH2PO4, 1.2 mM; CaCl2, 1.3 mM; MgSO4, 1.3 mM; a 0.7% BSA (pH 7.4). Vyluhování bylo provedeno pomocí kollagenázy (1 mg/ml) v 25 ml lahvi z pružného plastu v atmosféře karbogenu (95% O2. 5% CO2) po dobu 40 minut při 37°C a za současného silného třepání. Pak bylo přidáno pět mililitrů bufru a buňky byly propasírovány přes síto. Buňky pak byly odstaveny na několik minut v 15 ml plastické testovací trubici při pokojové teplotě a ponechány vznášení a bufr pod nimi byl odstraněn. Tento postup (suspenze, vznášení a odstranění bufru pod) by lopakován třikrát.
Adipocytové suspenze (3x1 O5 buněk/ml) byly rozděleny do plastických lahviček (0.5 ml na lahvičku) a inkubovány po dobu 60 minut při 37°C v atmosféře karbogenu s 0.2 mM [U-l4C] glukózou buďto v za nepřítomnosti nebo za přítomnosti inzulínu. Lipogeneze byla ukončena přidáním scintilační tekutiny na bázi toluenu (1.0 mi na lahvičku) a byla vypočítána radioaktivita v extraktovaných lipidech (Moody et al., 1 974). V typickém experimentu byla inzulínem stimulovaná lipogeneze 4-5-krát vyšší než bazátní (bazální “2000 cpm na 3x1 05 buňky./hod; Vin2U|in 8,000-10,000 cpm na3xl05 buňky/hod*). V této analýze inzulín stimuluje lipogenezi s ED?o hodnotou = O.15+Ó.O3 ng/ml (Shechter and Ron, 1986). Inzulínový analog, vykazující ED50 hodnotu = 15 ng/ml, je považován za látku, mající « 1% biologické potence přirozeného hormonu.
(iv) Měření aktivity receptorů (yrosine kinea.se « · 4 · 4 ·
4 4 »4
V této analýze inzulín aktivuje svůj vlastní: rčftJeĎCoiZ lf®’ · ··; *' • 4444 44 4 44 ·, fosforylátový náhodný kopolymer, obsahující L-glutamickou kyselinu a L-tyrosin v molárním poměru 4:1 [Poly(Glu4Tyr)]. Standardní enzymová směs analýzy (konečný objem 60 μΐ v 50 mM Hepes, pH 74 - 0.1% Triton X-100) obsahovala WGA čistý inzulínový receptor (5μ§ protein), 20 mM MgCh, 2 mM MnCl2, 100 μΜ ATP a různé koncentrace (od 1 ng/ml do 10 mg/ml) inzulínu nebo inzulínového derivátu. Po 30 minutách preinkubace při 22°C byla zahájena reakce přidáním Poíy(Glu4Tyr) (konečná koncentrace 0.7 mg/ml) a pokračovala po dobu 20 minut při 22°C a byla ukončena přidáním EDTA (20 mM). Obsah fosfotyrosinu v PolyGlu4Tyr byl kvantitativně stanoven pomocí procedury radioimunoanalýzy použitím specifických monoklonálních antitělísek ke konjugaci fosfotyrosinu (konečné ředění 1:100,000) a IB S Afosfotyrosinu. V této zvláštní analýze inzulín umožňuje poloviční maximální efekt při koncentraci 20^3 ng/ml. Inzulínový analog, vykazující ED50 hodnotu = 2 mg/mi, je považován za látku, mající « 1% biologické potence přirozeného hormonu.
PŘÍKLAD 1: Příprava N-Fmoc-inzulínových derivátů (a) Syntéza
Lidský inzulín (100 mg, 17.2 pmolů) (laskavě zapůjčen Biotechnology-Generál, Rehovot, Israel) byl suspendován ve 4 ml analytického dimethylformamidu (DMF), obsahujícího 17.4 mg (172 pmolů) triet.anolamyinu. Fmoc-OSui (58 mg, 172 pmolů) byl pak přidán. Homogenní reakční směs pak byla míchána při 25°C po dobu 20 hodin a pak byl přidáván ethylacetát dokud se roztok nestal zakaleným a potom byl přidán éter k dokončení srážení.
Rozpouštědlo bylo odstraněno odstředěním a sraženina byly dvakrát promyta éterem a dvakrát vodou. Tímto postupem byla získána směs * 00 0« 0 0 0 00 • · 0 0 0 · 0···
0 0000 0 00 0 • «00 00 0 0000 0 000 000 mono, di a tri-N-Fmoc-inzulínovych derivátů, Jíteté* býly* sdparQi/áa.ý a vyčištěny použitím preparativní ho postupu HPLC. monomodifikovaný N-Fmoc-inzulínové deriváty mohou být separovány z di a tri-modifikovaných derivátů promýváním surové pevné fáze pro panolem.
(b) Izolace a čištěni N-Fmoc-inzulinových derivátů Surová pevná fáze byla vystavena obrácené fázi HPLC (Spectra-Physics SP 8800 systém kapalné chromatografie), vybavené HPLC předplněnou kolonou (Merck, LIChrosC ART 250- 10 mm obsahující LICrosorb RP-18 (7 μ-ra]. Byl vytvořen lineární gradient z 0.1% trifluoroctové kyseliny (TFA) v H2O (roztok A) a 0.1% TFA v acetonitrilu:H2O, 75:25 (roztok B). Rychlost průtoku byla 1 ml/min. N-(Fmoc)i-inzulínové deriváty se objevily ž kolony s retenčními časy 21.1, 21.9 a 22.8 minut, N-(Fmoc)2-inzulíno vé deriváty s retenčními časy 26.3, 27.1 a 27.7 minut a N-(Fmoc)3inzulín s retenčním časem 31.5 minut. Frakce, odpovídající 21-23 minutám, 26-28 minutám a 3 1.5 minutám byly shromážděny, lyofilizovány a chemicky charakterizovány. Frakce, odpovídající 21-23 minutám (monomodiftkované inzulíny) a 26-28 minutám (dimodifikované inzulíny), byly dále Čištěny na jednotlivé monoFrnoc a di-Fmoc-inzuf íno vé deriváty. Množství Fmoc skupin připojených k molekule inzulínu bylo stanoveno spektrofotometricky při 301 nm a potom následovala úprava množství N-Fmoc-inzulínových derivátů pomocí 50% piperidinu v CHŮČlz (c) Chemická charakterizace N-Fmoc-inzulínových derivátů Následující preparativní separací použitím HPLC procedury bylo získáno sedm N-Fmoc-inzulínových derivátů. Zahrnovaly tři monomodifikováné, tři dimodifikované a jeden trimodifikovaný derivát (tabulka I). Retenční časy a výtěžky každé jednotlivé
B9 · · 9 9 9
9 9 *.··.·.
»
9 9 1 sloučeniny jsou uvedeny v tabulce I. Odlišné NiFrtfoe-ítnřtftftiY
9 9« «9 9 mohou být snadno odděleny vzájemně od sebe a získány v čisté !
formě za těchto aplikovaných experimentálních podmínek . PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-inzulín (retenční čas = 27.7 minut) a GlyA1, PheB1, LysB29-N-(Fmoc)3-inzulín byly charakterizovány pomocí několika postupů zahrnujících hmotové spektrum (tabulka I).
(d) Syntéza PheBi, LysS29-N-(Fmoc)2-inzu1inu
Protože bioanalýzy zjistily, že Phe8’1, LysB29-N-(Fmoc)2inzulín je obzvláště vhodný jako dlouhodobě působící inzulín, byla vyvinuta alternativní procedura pro jeho syntézu. GlyA1 podíl byl
9 «9 specificky ochráněn pomocí t-boc skupiny za stanovených experimentálních podmínek použitím jednoho ekvivalentu di-tertbutyldikarbonátu a DMSO/Et3N, 20:1 jako rozpouštědla. Po separaci použitím HPLC procedury byl GlyA1-N-Boc-inzulín vystaven reakci s přebytkem Fmoc-OSu (10 ekvivalentů), použitím DMF jako rozpouštědla a DIEA jako báze. Úprava pomocí TFA a čistění na HPLC produkovalo PheBI, LysB29-N-(Fmoc)2-inzulín s dobrým výtěžkem (-50%).
(e) Biologické charakterizace N-Fmoc-inzulinových derivátů
Několik charakteristických vlastností N-Fmoc-inzulínových derivátů předkládaného vynálezu je shrnuto v tabulkách II a III. Rozpustnost derivátů ve vodných roztocích se snižovala se zvýšenou modifikací. N-(Fmoc) i-inzulín je pouze mírně méně rozpustný než přírodní inzulín, zatímco N-(Fmoc)3-inzulín je zhruba 20-krát méně rozpustný než přírodní hormon. Biologické potence se snížily také se zvýšenou derivatizací. Takže mono, di a tri-N-Fmoc-inzulíny vykazují 40-80%, 2-9% a <1% biologickou potenci přírodního inzulínu, jak bylo posouzeno použitím [poly(Glu4Tyr)] fosforylační analýzy. Podle mnohem senzitivnější biologické analýzy lipogeneze pomocí intaktní dávky adipocytů • 4 * »*·««· vykazují Fmoc-inzulínové deriváty mnohem nižší bicjlogicjlřé:
• ••«0 * 0 « - - potence. Takže GlůyA1 -N-Fmoc-inzuiín a di-N-Fmoc-inzulíny vykazují 4,7% a 0.4-1.4% biologické potence přírodního inzulínu použitím analýzy lipogeneze (tabulka III). Všech sedm derivátů je revertováno na přírodní hormon při inkubaci po dobu 2 dnů pří pH 8.5. Toto bylo dokázáno opětovným získáním plné biologické potence (tabulky II a III) a zmizením píku derivátů souběžně s objevením se píku přírodního hormonu (retenční čas = 15 minut) při separaci použitím analytické HPLC procedury.
* «0 0 • 0 0 · « 00 0 0 0 0 • ·
kw ‘Tabulka I: Chemická charakterizace N-Fmoc-inztilínových derivátů
44
co
o *ti
ti ti VI v>
•w 4> ΜΊ r-
c O 4-» CJ rr
ti ε itň irt Ό Ό
X '«“i
jd N
4J ***
o. ti u sa
*ti ti
“O i—T ti
> 4->
44 ».4
<U >o
*—* o CM rr
d O ti. ΜΊ r-
ti ε >k CJ rf
tn · o - Ό
c 3
O υ
»N ja
O CL.
>
>1 O\ Λ
O o PM Ώ ti CJ 3
ti CA o CQ «0
ti >a X ' «t >>
tli J ft, >» -3
ti U» 6 .
Λ rt PM rt rt rt
O << CQ I < < 3 <
CA u 4)
o rt— 3c X a-M »—t X —M
CM o U CM O o PM O
o
ε
Q
0 ti 00 <N σ> r- O rr .
ε ti o __ o CM rb
Pm *·-
«_ ti
o N
2 ti
n
X
v Cb Ό O\ . cj SO ‘rf O
«Ν «—· n
>4>
f·^·.
> sp σ''
00
ti
xj
•, 1 — O 00 m r- v>
.c >o 0) >% CJ ’so Γ- Γ' -
t-l CJ CJ cj CJ CJ CM
u ti
CM ti
4) tn —
& ’ί-ζ a
ti ti ti ti ti ti ti
rt-a M-a Mrt Mrt -«-a
a—a ·—1 1-rt p. -H wM •—a
3 ti 3 ti a ti ti
N N N N .N N N
ti ti - ti fl c ti' ti
T 7 • «Μ 7
L Ci e. «Λ
Z“\ /—H,
Q O o O O υ o
O O o O O o o
> e a Θ a ε 6 . a
·- Pm P^l Pm u, Pm Pm
X-z '^-z s-z x_z i^r *-z 'MM'
<υ 1 1 I 1 1 1 1
Q 2 2 2 2 2 2 2
• ti., ’4dř o; w
N
O «Μ* so o
O
-4-J •ti cu
O +-> X' ti •4Í G a '3 « a
Q >
>
-ti *-* ti “ti .
’’ > · ti'.' •«H O
V
TJ i
O
O a
x o
4>
O rr ti
N m
λ o
w řQ
O
O
JS.
• * . · a, · 0 · · « ·'·
.·. >¥ ·· '· t ·' ti <U >N
O ti L- ti .ti
V «
Ξί *Λ
CJ ·η +- r-
—I >N * u
ti ti ti u
o X ► Ό O > P. X
Ό n
ti ti ti
> ti 1—1 o
se O · —
i—l Irt ti
CU O 4-i Ό
ti 44 ti 4>
a >u >
O >N
O &
X» >1 ti >>
O ti • —4 a
ti ti
N ti ti <
ti a
β
N
O
P0 =t
Pm
Pí o
o
4)
X
Cl, w
o uX u
O υ
e ti
O a
o ti υ
>
o ti ti
4>
O ti <
Pm
H ti
Ό
4J «
“ti ti
O 0
OQ HD ti
ti ti 44
44 M
O i—4
4-1 N
N O —t
sd *<
O rr xu
Ό o
>
v >
<
pt,
H ti a
s •o <=>
ίΛ ti
S ti ti o
ti
OJ *a
O ti
N
\ a ·
I v
« * « k »
4··
Tabulka II: Několik reprezentativních charakteristických vlastností Fmoc-inzulínových derivátů
+ ''S •o •rt O 00 * Ρ· μ- O *—» t-H — « U Q, 00 U α o a X> - — 0 3 O Q 0 o a t'' fQ . Λ — f> 100 95 Os <Λ O ÍO Os r- O\ v> Os 00 Os·
Biologická potence (%) O O +1 O -t Ti 00 . r- Ti ό Γ' p** +1 n +i m Ti Os v
Rozpustnost ve vodním bufru ( pH 7.4, mg/ml) -rt tm tm ^Ί > O X o d 4T 1 rs 1 r*i 1 t*Y ( CI 1 n 1 ci 1 n o I
Vzhled ve vodním bufru (pH 7.4) d ČQ cd l 'ΪΑ d m od A-, *υ s o SA d m Cd I“> Λ- o E *o SA 3 OT cd >Ui O a . Ό 4-1 SA d <υ « X ed N SA tí . v cd X cd N Sa 3 υ cd X cd N SA tí ύ d X od N OJ O o· >
Poloha F móc vložení S SA e ΓΜ 33 cn ÍA uJ <U X CU. 7, N a oq Sa X < Sa O D O X 0-1 < Ta o Os T w M A _2 23 d> X Pd B O X Ol, ’ A 3] crt , U < Sa O
Původ X <rt TJ f1 >> X CO TJ • rM X w TJ SA. X VI Ό x . « TJ •R* sa X m TJ •w Sa X « •tí • w Sa X tň *O
Derivát c 3 N d d •tí o Ui' »u- d 3 N tí -rH 1 1 O ό 0 LU 1 z d 3 N C3 1 U O 0 Í-U % d 3 N C χΆ - O O 0 Pu 1 £ 3 3 N 3 1 Γ4 O o a . Pm z ď 3 N d 1 ΓΊ /•“X O O a Pu _ t z d 3 N d Γ4 z-S O O a Pu 4 Z d 3 N d 1 <n z-A O o a Pu · 1 Z
Ό3
XJ r—H
4-» d
<U e
R4
Ui
O . cl κ o >
·»<
a
SA
O cd
M
CL o
CL #
>
a cd
N
SA ď
β cd
X o
CJ3
O
O xi cd x
o cd tí υ
>
o tí es
CQ cd >1
X υ
o d
o
O
CL *ce d
X o
•3 o
cl □
d
N d
d x
Θ
-cd d
N
O
CL, • to '» · · fc' fc * · · · to I • * . <
·*' toto
Tabulka III: Biologické potence a časový průběh aktivace několika N-Fmec-inzulínů použitím lipogenetické analýzy (s intaktní dávkou adipocytů)
při pH 8.5, ti *13 O X] r- 10 0 00 ó>
Aktivita následující inkubaci 3 7eC (%) 20 hodin 100 | 20 4 0 o CM'
. ti Ό o XI o* 50 O 18 10 .. . 1 J
Relativní biologická potence (%) 00 I I> 0.4 -
υ N O ti v oů o B .i? — .« o , *Ί Q XI Κ0-Ζ0 r- hb o tn 12.3
Derivát Přírodní inzulín ‘ n]inzni-oomj-(í-tviíio ti ti N ΰ et O o 6 (X i 1 ?. h B CO >> u < o ti ti N ti 1 IH Λ O O a tu 1 fc B «ti < >> O ti ti N ti 1 IH Z“». O o a 1 Z 1 λ IH B « < >v O
9 9 9 9 • 999· ·
PŘÍKLAD 2. Biologická aktivita N-Fmoe-inzulín&
ί) ·>
(a) Časový průběh aktivace N-Fmoc-inzulinů při pH 7.4
Před studováním anti diabetických potencí N-Fmoc-inzulínů v diabetických krysách byla testována rychlost jejich reaktivace (která představuje jejich konverzi na přírodní hormon) v testovací trubici. Deriváty byly rozpuštěny v Hepes-bufru (50 nM, pH 7.4), obsahujícím 10% dimetylsulfoxid (DMSO) a inkubovány při 37°C (tj. při fyziologickém pH a tělesné teplotě). V indikovaných časových bodech byly odebrány alikvotní podíly pro stanovení biologické potence relativně vůči přírodnímu inzulínu. Biologické aktivity byly vyhodnoceny pomocí aktivace inzulínového receptoru tyrosine kinase (analýza bez buněk, jak je popsána výše v Biologických procedurách, část (iv)) a stimulace lipogeneze v intaktních krysích adipocytech, jak je popsáno v Biologických procedurách, část (ii). Výsledky jsou ukázány na obr.l. Poloviční maximální aktivace se objevila pro N-(Fmoc)3-inzulin v čase ti/2~14 dní a téměř plná aktivace byla patrná po 2 1 dnech inkubace.
Jako pravidlo platí, že rychlost aktivace N-(Fmoc)i-inzuIínu při pH 7.4 byla rychlejší. Perioda zpoždění šesti dnů, pozorovaná u N-(Fmoc)3-inzulínu, nebyla patrná u N-(Fmoc)2-inzulínu. Takže se zdá, že N-(Fmoc)3-inžulín má pomaleji hydrolyzovatelný Fmoc podíl, který limituje reaktivaci analogu. Po jeho hydrolýze je rychlost aktivace zvýšena. Z praktického hlediska to implikuje, že směs dvou analogů může uvolňovat aktivní inzulín po prodlouženou dobu s pokrytím počátečních a pozdějších časových period. Relativně aktivní monomodifikováný Fmoc-inzulín znovu získal plnou biologickou potenci při pH 7.4 během tj/2 - 5 dní.
Když se dostávají do cirkulace, očekává se, že N-(Fmoc)2- a N-(Fmoc)3- poskytnou nízkou bazální koncentraci hormonu po ft ft* ft* « ftft ft ft « » » ft ** prodloužené Časové periody. Toto může být pri+ná^Řě jlittojv^ne·· * ft • ftft rychlostí konverze inaktivního derivátu na aktivní přírodní hormon s krátkou životností. Naštěstí N-(Fmoc)2,3-inzulíny vykazují pomalé rychlosti aktivace (jak je ukázáno na obr.l). Vysoká (náhlá) rychlost (tj. spíše během minut než hodin) by mohla mít za následek hypoglykemické příhody.
Phe81, LysB29-N-(Fmoc)2-inzulín je 9% biologicky aktivní, jak je stanoveno použitím [poly(Glu4Tyr)] fosforylační analýzy a vykazuje střední rozpustnost mezi přírodním a N-(Fmoc)3inzulínem. Narozdíl od N-(Fm oc)3-i n zul i nu začíná konverze N(Fmoc)2-inzulínu krátce (během hodin) po inkubaci, jak je ukázáno na obr.l. Takže u N-(Fm'oc)2-inzulínu se očekává (je a priori aktivnější), že bude mít rychlejší náběh činnosti po podání. Takže správná kombinace N-(Fmoc)2- a N-(Fmoc)3- inzulínů může vytvořit ideální recept pro bazální uvolnění inzulínu, které je charakterizováno rychlým náběhem a dlouhou dobou působení po jednom podání a ustanovuje jedno preferované vyjádření vynálezu.
Tabulka IV: Vliv jednoho podání Phe61, LysB29-N-(Fmoc)2inznlínii na denní přírůstek váhy STZ krys
Skupina i’ 0 p i s Denní přírůstek váhy gra m/k ry sa (během prvních 3 dnů)
Λ ( n = 5 ) STZ krysy, které přijaly pouze nositele (2.0- ml, 2 0% DMSO/krysa 2.0 + 0.2
B (n = 5) STZ krysy, které přijaly jednu podkožní dávku NPH-lidského inzulínu (Humulin N) (3 mg/krysa) 12.0 +.2
C (n = 5) STZ krysy, které přijaly jednu podkožní injekci N - ( F m oe j 2 -1 nzti 1 ί n u (3 mg/krysa) 11.5 + 1.3
(b) Vliv jednoho intraperitoneálního podáni PheBI, LysB29-N(Frnoc)2-inzulin.tí na normální krysy
JV • ·« ·♦ · · · ·· • · · d · · 9 ·*· · • · « · « · · « · · «·« * ····· » »*·»+·
-Ž-C- dlouho 4JŮsjobícíi^chí)p-n-QSí-ΰ*
Kvůli dalšímu potvrzení (Fmoc)2-inzulínu je důsledkem jeho pomalé konverze na přirozený hormon za fyziologických podmínek, byly navržena další živá analýza. Tato analýza odráží post-podkožní dlouho působící vlastnost inzulínu (nebo inzulínových derivátů) během cirkulace. Normální krysy přijaly jednu i ntraperitoneální injekci přírodního inzulínu, NPH-inzulínu a (Fmoc)2-inzulí nu (3 mg/krysa) a hladiny jejich krevní glukózy byly monitorovány po dobu třech dnů.
Výsledky jsou ukázány na obr.2._ Takže přírodní inzulín (obr.3) a NPH-inzulín (obr.2) vyvolaly hypoglykemii po dobu okolo 12 a 15 hodin. K zotavení ze stavu hypoglykemie došlo během tni 8 a 10 hodin. (Fmoc)2-inzulín redukoval hladiny krevní glukózy po dobu zhruba 48 hodin a k zotavení ze stavu hypoglykemie došlo během tj/2 26 hodin. Tyto výsledky podporovaly naše dojmy a představy, že vskutku prodloužená činnost (Fmoc)2-inzulínu vyplývá z jeho intrinsických charakteristik a není důsledkem konvenčního mechanizmu NPH-inzulínu, tj. srážení v místě injekce a jeho pomalého rozpouštění-vstupu do cirkulace. Jak je očekáváno, odlišnosti ve schopnostech přírodního inzulínu a NPH-inzulínu ke snížení hladin krevní glukózy v této analýze jsou menší ve srovnání s jejich podáváním podkožním způsobem. Tato skutečnost je důsledkem velkého objemu kapalin, které existují v peri.toneální dutině a z toho plyne rychlá konve rzeZn-krystalické ho inzulínu k získání monomerické formy. Dva další (Fmoc)2-inzulínové deriváty, [GlyAI, Lys 13 29] a [GlyAI, Phe131], byly synteticky připraveny a také vyhodnoceny v této analýze. Výsledky (nejsou ukázány) vykazovaly podobné dlouhodobě působící schopnosti jako pro Phe131, LysB29-N(Fmoc)2-inzulín s 11/2 22-24 hodin pro oba dva deriváty.
(c) N-(Fmoc) ^-inzulín je rezistentní vůči proteolýze
J A.
Přírodní inzulín nebo N-ÍFmocU-inzulín (.£,m‘g^®ř.,ý fc fcfc * • fc »fc«
Hepes, pH 7.4, 10% DMSO) byl inkubován při 37°C. Pak byl přidán chymotrypsin a trypsin (0.5% hm./hm.). V indikovaných časových bodech byly odebrány alikvotní podíly a podrobeny analytické HPLC proceduře. Bylo stanoveno procento degradace zmenšením plochy píku přírodního inzulínu (retenční čas 15 minut) a N(Fmoc)3-inzulinového píku (retenční čas 31.5 minut). Výsledky jsou ukázány na obr.4,
B y 1 o. z j i š t ě n o, že N - (F tn o c ) 3 - i n z u 1 í n je vy s o c e r ez i s t e n t n í vůči proteolýze pomocí směsi chymotrypsinu a trypsinu při pH 7.4. Proteolýza probíhala s ti/2 hodnotami 0.5 a 7.5 hodin pro přírodní a N-(Fmoc)3-inzulín.
PŘÍKLAD 3: Vliv jednoho podkožního přidání PheB1, Lys®29N-(Fmoc)2- a N-(Fmoc)3-inzulínu STZdiabetickým krysám
STZ krysa je vynikajícím modelem pro vyhodnocení in vivo inzulínové terapie. V tomto modelu bylo okolo 90% β-buňkové funkce zničeno streptozotocinem, jak je zjištěno histologickými studiemi (jak je popsáno v práci Pedersen et al., 198 9). Krysy jsou hypoinzulinemické (mají 10-30% normální hladinu inzulínu), hyperglykemické (>300 mg/dl; normální hladina glukózy kontrolních krys je 90-100 mg/dl) a katabolické.. Viditelné vnější symptomy jsou nemocně bledý' vzhled a tři- až čtyřikrát vyšší příjem tekutin a exkrece moče. Denní přírůstek váhy je snížen na 10-20% (0.3-0.8 g/den/krysa) normálního přírůstku váhy kontrolních krys. Patologické změny v tkáních STZ-krys jsou enormní. Některé nápadnější biochemické změny jsou snížená aktivita klíčových enzymů glykogenového metabolizmu, vyčerpání jaterního glykogenu, snížení počtu transportérů glukózy v • ·' «9 * *· *· • 9« 9 · · »999 «9 9 »··· ***· < ··« 99 9 9999 · ··· ··*
9« periferál nich tkáních 3 zvýšení vázací sehopnčřšTHnzirnnu; ktďřá není doprovázena zvýšením citlivosti na inzulín.
V tomto diabetickém krysím modelu je vhodná inzulínová terapie nepřetržité podávání inzulínu (5 jednotek/den(krysa) po dobu jednoho týdnu. Tato léčba normalizuje hladiny krevní glukózy, vrací diabetické krysy do anabolického stavu a zlepšuje mnoho patologických efektů, vyvolaných hyperglykémií a hypoinžulinemií. Jedno podání rychle působícího (obyčejného) inzulínu je efektivní pouze po dobu několika hodin, po ukončení sedmidenního protokolu terapie se hyperglykemiee také znovu objeví během 24-30 hodin.
K vyhodnocení toho, zdali N-(Fmoc)3-inzulín má prolongovaný antidiabetický efekt, byla STZ-krysám dva týdny po inkubaci diabetů podána buďto jedna podkožní injekce přírodního inzulínu (skupina A, 25 jednotek, 1 mg, rozpuštěno v 1.0 ml H20-10% DMSO, n = 4), nebo N-(Fmoc)3-inzulín (skupina Β, 1 mg, rozpuštěno v 1.0 ml H2O-10% DMSO, n = 4). Úrovně krevní glukózy a denní přírůstky váhy byly sledovány po dobu sedmi dnů.
Výsledky jsou ukázány v obr.5. Každý bod představuje aritmetický průměr i SEMplazmové glukózy pro 4 krysy. Hladiny cirkulační glukózy ve skupině B byly významně nižší. Takže úrovně glukózy byly 90-110 mg/dl nižší ve skupině B počínajíce ode dne dva po podání a tyto nižší hladiny glukózy existovaly až do dne šest. Ve dne sedm zde neexistoval žádný významný rozdíl mezi dvěma skupinami krys v hladinách cirkulační glukózy. Krysy, které přijaly N-(Fmoc)3-inzulín, měly mnohem zdravější' vzhled. Denní přírůstky váhy byly téměř třikrát vyšší ve skupině B a dosahovaly 0.57 + 0.08 a 1.43 4^0. 14 g/krysa/den ve skupině A B, resp. (není ukázáno). Takže jedno podání N-(Fmoc)3-inzulínu dávalo prolongované a uspokojivé antidiabetické účinky, trvající po dobu • 00 0 0 0 0 0 0 0 φ čtyř dnů (sledující zpožděný náběh přibližně dvfctl.tfcnjLij. íftcJltp*..:
0 9 9*0 9'* φ
- »··* 9# 5 9 9- 4*5- - ς;
dlouho trvající efekt in vivo může být vysvětlen schopností derivátu uvolňovat receptorové zprostředkovanou endocytózu a také jeho rezistencí vůči proteolýze. Kromě toho je N-(Fmoc)3-inžuIín velice nerozpustný ve vodných roztocích. Takže v lidských tělech může celkový trvající efekt pokračovat substitucí starého terapeutického principu, tj. postupné rozpouštění 'zabudovaného' nerozpustného inzulínu po podkožním podání společně s novým principem cirkulace kovalentně modifikovaného inaktivního inzulínového derivátu s dlouhou životností, který je pomalu konvertován na přírodní hormon. Protože je tento inzulínový derivát inakťivní, mohou být větší dávky podávány bez obavy z hypoglykemických příhod.
K testování vlivu PheB1, LysB29-N-(Fmoc)2-inzulínu při nižších hladinách krevní glukózy u experimentálních diabetických krys byla STZ-léčeným krysám, 9 dnů po vyvolání diabetů, podána jedna s.C. injekce N-(Fmoc)2-inzuIínu (skupina A, 3 mg/krysa, v 2.0 ml 20% DMSO, n = 5) nebo jedna s.c. injekce dlouhodobě působícího inzulínu (NPH-lidský inzulín, Humuíin N, HI-310) (skupina B* 0.75 ml (3 mg) na krysu, n = 5). Skupina C (n = 5) přijala pouze nosič (2.0 ml 20% DMSO). Hladiny krevní glukózy byly stanoveny denně.
Výsledky jsou ukázány na obr.6, ve kterém horizontální čárkovaná čára indikuje aritmetický průměr plazmové glukózy pro kontrolní krysy. Jak je ukázáno na* obr.6 jedno podkožní, podání HPLC-čiŠtěného PheB1, LyšB29-N-(Fmoc)2-inzulínu vyvolalo normoglykemii po dobu 4 dnů a zvýšilo denní váhový přírůstek těchto katabolických STZ-krysích modelů (tabulka III). N-(Fmoc)2inzulín byl stejně účinný jako komerčně využitelné (nerozpustné) dlouho působící preparát. Rychle působící (rozpustný) inzulín je efektivní při nižších hladinách krevní glukózy v tomto
JT φ φ 9 · · «9 i * · 9 a 9 » 9 9 9 O 9 9 a
199 99 9 9999 9 99« *99 experimentálním systému pouze-pe dobu něko&Rs'^^ (není »·=-* ··’ ukázáno). Tento preparát je úplně rozpustný ve vodném roztoku (při pH 7.4) a skutečnost, že může být výhodnější před nerozpustným N-(Fmoc)3-inzulínem, protože suspenze nemohou být přesně podávány pomocí s.c. injekce.
PŘÍKLAD 4: Příprava a biologická aktivita (2-s u!fo)Fmocinzulín u (a) Syntéza (2-sulfo)Fmoc-inzttlínu (Šulfmoc-inzulín)
Samotná Fmoc skupina byla modifikována za účelem snížení Fmoc-i nzulínové hy drofobicity a v důsledku toho ke zvýšení její rozpustnosti ve vodných bufrech a dále k modifikování rychlosti rekonverze na inzulín. Toho může být dosaženo zavedením polárních, nebo přednostně nabitých skupin do fluorenového řetězce, jako jsou halogen, nitro, karboxyl, amino, amonium a sulfo skupiny. V elektrofilických substitučních reakcích je fluoren nejprve atakován v poloze 2 a všeobecně platí, že povaha substituentu v poloze 9 (např, CHtOCO-OSu) nemá žádný vliv na orientací substituce. Takže úprava Fmoc-OSu pomocí 0.9 ekvivalentu kyseliny chlorsulfonové v díchlormetanu (DCM) při 0°C dávala (2-sulfo)Fmoc-OSu s vysokým výtěžkem (vzorec (i),
Rj = SO?H v poloze 2, R2 = R3 = R4 = H, A = OCO-OSu). Úprava pomocí více než 1 ekvivalentu bude mít za následek také substituci v poloze 7 fluorenového řetězce.
(2-sulfo)Fmoc skupiny byly zavedeny do inzulínu připojením aktivního (2-su!fo)Fmoc-OSu esteru k amino skupinám inzulínu. Reakce byly provedena ve vodných bufrech (pH 7.4) a přebytku činidla (~ 20 ekvivalentů). Po následující dialýze a lyofilizaci se produkt stal vodorózpustným. HPLC analýza ukázala převahu jednoho hlavního produktu, zjevně (Sulfmoc)2-inzUlínu, jak bylo 1 · fcfc · · ·· ♦ fc 'stanoveno pomocí hmotového spektra (m/z 64 1-1 J**jC<Íýž;líy*l,a’r*®a5c*e^ i w i -« wi 'w ' ».» · ·« provedena ve směsi acetonitril: voda, 1:1, byl hlavní produkt (Sulfmoc)3-inzulín, jak bylo stanoveno pomocí hmotového spektra (m/z 6713).
(b) Časový průběh aktivace (2-sulfo)Fmoc-inzulinu (Sulfmoc)2-inzulín byl úplně revertován na přírodní hormon při inkubaci při 37°G po dobu 36 hodin při pH 8.5 (0.1 M NaHCOj) nebo po dobu 10 dnů při pH 7.4 (50 mM Hepes bufr) s ti/2 hodnotami 12-15 hodin a 6 dnů, resp. Toto bylo prokázáno zmizením píku inzulínového derivátu současně s objevením se píku přírodního hormonu použitím analytické HPLC procedury. Upozorňujeme, že hydrolýza (Sulfmóc)2-inzulínu na přírodní hormon je rychlejší ve srovnání s hydrolýzou (Fmoc)2-inzulínu (21 dnů při pH 7.4, 37°C).
(Sulfmoc)2-inzulín je 0.5% biologicky aktivní a vykazuje dobrou rozpustnost ve vodě. Při inkubaci při pH 8.5, 3 7°C se (Sulfmoc)2-inzulín vrací do stavu 'plně aktivního přírodního inzulínu s ti,2 hodnotou 4-6 hodin, jak bylo stanoveno časově závislým zvýšením biologické potence (analýza lipogeneze v krysích adipocytech).
(c) Vliv jednoho intraperitoneálniho podání (2-sulfo)Fmocinzulínu na normální krysy
K vyhodnocení schopnosti dlouhodobého působení (Sulfmoc)2irtzulínu po podkožní absorpci byla normálním krysám podána jedna intraperitoneální injekce přírodního inzulínu, NPH-inzulín, nebo (Sulfmoc)2-inzulín. Hladiny krevní glukózy byly sledovány po dobu dvou dnů. Obr.3 ukazuje, že (Sulfmoc)2-inzu lín vyvolal hypoglykemii po dobu 24 hodin. K zotavení z hypoglykemie došlo při hodnotě ti/2 = 14 hodin. V případě rychlého a NPH-iňzulínu tyto hodnoty tj/2 dosahovaly 8 (obr.3) a 10 hodin (obr.2). Takže jedno © *« ·· · ·· ·· * · · © · · · · · » © • « · © ♦ · · · © • ··· * © · ···· » ··· ··· • © 9 © .9 · © podaní (suitmoc jz-inzuiinu vykazovalo stredirr’amiaiaoenvKou činnost, která je 1.5-2-krát delší než rychlý nebo NPH-inzulín.
Tyto výsledky souhlasí se zvýšenou rychlostí hydrolýzy Sulfmocinzulínu, což bylo před tím zjištěno. Takže skupina sulfonové kyseliny v poloze 2 fluorenového řetězce zvýšila rychlost abstrakce protonu v poloze 9 a z tohoto důvodu hydrolýzu Sulfmoc podílu 23-krát. Dřívější studie, prováděné ohledně lability sulfmoc skupiny na různých bázích, vykazovaly větší základní citlivost než původní systém. Kromě toho byla rychlostní konstanta pro uvolnění Sulfmoc skupiny z glycinu například mnohem vyšší než Fmoc skupiny (faktor okolo 30). Proto zvýšení rozpustnosti zavedením Sulfmoc skupiny do inzulínu recipročně snižuje dlouho trvající efekt působení tohoto derivátu. Takže princip dlouho trvajícího antidiabetického efektu přes uvolnění receptorové zprostředkované endocytózy a degradaci je platný také i pro suífmoc-inzulínové deriváty.
Zvýšená rychlost odstranění Sulfmoc skupiny z inzulínu může být výhodná v určitých aplikacích podávání inzulínu jako střednědobých preparátů. Takovéto preparáty budou mít zřejmě úspěch z důvodu úplné rozpustnosti ve vodných bufrech na rozdíl od využitelných komerčních preparátů. Kromě toho mohou být do fluorenového řetězce zavedeny i další skupiny s opačnou aciditou nebo polaritou. Takže řízení typu a počtu skupin, zavedených do Fmoc skupiny, může určovat stupeň rozpustnosti a rychlost reaktivace modifikovaného inzulínu.
PŘÍKLAD 5: Příprava amino a karboxyl·terminálově modifikovaných (N-Fmoc- a C-Fm-inzulinových) derivátů
N-(Fmoc)3-inzulín (64.5 mg; 60 pmol karboxylových podílů, tj. vztahující se k 4 intrařetězcovým Glu a dvěma C-terminálovým
9 9 99 9 99 9« *9 99 9 9 999« ····*«··» 9 99« 9 9 9 9999 9 «99 *99 zbytkům) byl rozpuštěn v 8 ml dimetylformami-du <·Γ>ΜΈ.β (Kab. .··*_··* Scan, Dublin, Ireland). současně s o-nitrofenolem (250 pmol; 35 mg) nebo N-hydrosuccinimidem (250 μπιοί; 28 mg) a roztok byl chlazen při 4°C. Roztok Ν,Ν-dicyklohexylkarbodiimidu (DCC; 250 mmol, 53 mg) v 0.5 ml DMF byl přidán a reakční směs byla odstavena na dobu 1 hodiny při 4°C a pak na 6 hodin při pokojové teplotě. Vysrážená Ν,Ν-dicyklohexyl močovina byla odstraněna odstředěním a o-nitrofenyl nebo N-hydroxysuccinimidové estery N(Fmoc)a.inzulínu byly vysráženy suchého, ledem chlazeného éteru. Pevná fáze byla promyta dvakrát suchým éterem, vysušena a rozpuštěna v 8 ml DMF. Byl přidán roztok 9-fluorenylmetanolu (250 μ mol; 50 mg) a imidažolu (250 μτηοΐ; 17 mg) v 1 ml DMF. Reakční směs byla odstavena přes noc při pokojové teplotě. Vysrážeňí pomočí suchého éteru poskytlo 62 mg N-(Fmoc)3, C(Fm)n-inzulínu. Hlavní reakční produkt byl hexa-9-fluorenylmetyl ester C-(Fm.)e N-(Fmoc)3-inzulínu (n = 6).
PŘÍKLAD 6: Příprava karboxyl-term ínálových Fm-inzulínů (CF m-inzulíny)
Pro přípravu t-butylkarbonyl (t-Boc)3-inzuIínu byl di-tertbutyldikarbonát (56 mg, 25 8 pmol) přidán do ledem chlazené a míchané suspenze inzulínu (100 mg, 17.2 pmol) a trietylaminu (174 mg, 172 pmol) v DMF (4 ml). Reakční směs byla odstavena k vyhřátí na pokojovou teplotu a míchána po dobu 5 hodin (postupně se stávala jasnou). Pak byl přidáván etylacetát dokud se roztok nezakalil, potom následovalo přidání éteru a roztok byl odstředěn a dvakrát promyt éterem. Vzniklá surová pevná fáze (95 mg) byla dále použita bez jakéhokoliv čištění. Analytická HPLC procedura ukázala jeden hlavní produkt, který byl eluován při 27,5 min.
«4« *4 · 44 4·
44 4 4 4 · · 4 4 * Produkt byl rozpuštěn v 10 ml DMF a uprjavwi ojnřfoffsiřeJSem··
444 44 44 4 í· '4· nebo N-succinimidem, jak je uvedeno výše, k získání příslušných aktivních esterů. Tyto estery byly podrobeny reakci s 9fluorenylmetanolem v přítomnosti imidazolu, jak je uvedeno výše a byl získán N-(t-Boc)3, C-(Fm)n-inzuIín jako prášek (87 mg) po vysrážení použitím suchého éteru. Prášek byl vysušen ve vakuu přes Ρ·2·Ο5 a pak upravován po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě použitím 5 ml kyseliny trifluoroctové za účelem odstranění Nterminálových t-Boc ochranných skupin. Během této procedury se většina inzulínového derivátu rozpustila. Přidání ledem chlazeného suchého éteru vedlo k prášku, který byl izolován odstředěním a dokonale promýván suchým éterem. Výtěžek produktu, převážně C(Fmje-inzulínu, byl 79 mg.
., V r
PŘIKLAD 7; Příprava (Fmoc)i-lidského růstového hormonu (FmocrhGH)
Za normálních fyziologických podmínek jsou hGH hladiny ve zdravých subjektech zvyšovány denně několikrát pulzačním způsobem (ve dne a v noci). hGH má krátkodobou životnost. Běžný terapeutický protokol zahrnuje jednu injekci hGH denně a je pravděpodobně účinný pouze po dobu několika hodin. Dlouhodobě působící (pomalu se uvolňující) hGH preparát, který doplňuje prahovou hladinu hGH během 24 hodin ve dne a v noci, je velíce žádoucí přípravek. ·
Přírodní hGH (Biotechnology General, Rehovot, Israel, 9.2 mg) byl rozpuštěn v 0.1 M NaHCOj (2.0 ml; pH 8.5), DMSO (0.1 ml) byl přidán (konečná DSMO koncentrace, « 5%) a roztok byl ochlazen na 0°C. Jeden ekvivalent Fmoc-OSu v 10 μΐ (odebráno ze zásobního roztoku 18.5 mg/ml v DMSO) byl přidán a reakce probíhala po dobu 30 minut při 0°C za mírného promíchávání. Pak
44
4 4 ·
• 4
i.. — i. _ _ * : .1 r _ j _ 1 * ΐ . i.
uyiu μιιιιαιιυ uaisivu » · « 4 4 4 4 4 9 4 4 • 4 4 9 9 4 ····· ·« 4 fe· · • «44· 44
i. i μι
Z λ W η n..l* »« i ί λι λΚ ( u uůq ji u j i vi vn „ V , Λ» a n i m.zA' _ n SAl.V *s
VIVVlYtlJIViiK * v v v χ *.· po 30 minutách byla směs dialyzována přes noc při 7°C proti H2O. Semipreparativní HPLC procedura vytěžila dva hlavní proteinové píky, odpovídající přírodnímu hGH (-20% celkem; retenční čas 30 min; RP-8 kolona, 250 x 1 0 mm; Merck) a modifikovanému FmochGH (-80% celkem; retenční čas 32 minut).
Tabulka V ukazuje konverzi Fmoc-hGH (1 mg/ml) na přírodní hGH po inkubaci při 37°C v 0.1 M NaHCO3 (pH 8.5). V indikovaných časových bodech byly odebrány alikvotní podíly a podrobeny analytické HPLC proceduře (RP-8 kolona). Byla vyhodnocena konverze Fmoc-hGH na přírodní hGH pomocí zvýšení píkové oblasti, odpovídající přírodnímu hGH.
Jak je ukázáno v tabulce V, Fmoc-hGH má 15% receptorově vázanou potenci přírodního hormonu. Inkubace Fmoc-hGH při pH
8.5 (37°C) po dobu zhruba 6 dnů nebo při pH 10.5 (37°C) po dobu čtyř dnů zajistila výtěžek plně aktivního přírodního hGH, jak bylo zjištěno HPLC analýzou a použitím receptorově vázaných analýz.
Tabulka V: Generace přírodního hGH z Fmoc-hGH po inkubaci při 3 7 0 C
Sloučenina Úprava Schopnost přesunout jodovaný hormon (1 ’ (%) Konverze na hGH
hG H 100 •
F m 0 c - h G H 1 5
Fmoc-hG I í I den, ρH 10.5 2 5
Fmoc-hGH 4 dny, ρ H 10.5 100
Fmoc-hGH 1 den, ρH 8.5 2 3
Fmoc-hGH 2 dny, pH 8.5 62
Fmoc-hG H 6 dnů, ρ H 8.5 100
• 00 00 0 00 00 * 0 » » 0 0 000« «00 00*0 000» « 000 0 φ 0 0000 0 000 000 (ί) Přesunutí jodovaného nGH bylo proveuerió*po3’e*yár€& ·-G-s^M-sc* et al., 1 984. Přírodní hGH byl plně stabilní za podmínek, aplikovaných na Fmoc-hGH (pH 10,5, 37°C, 4 dny).
(2) Fmoc-hGH (1 mg/ml) byl inkubován při 37°C v 0.1 M NaHCOj (pH 8.5). V indikovaných časových bodech byly odebrány alikvotní podíly a podrobeny analytické HPLC proceduře. Konverze FmochGH na přírodní hGH byla vyhodnocena zvýšením píkové oblasti, odpovídající přírodnímu hGH.
PŘÍKLAD 8: Příprava N-Fmóc-Cephalexínii a Cephalexin-O-Fm esteru
Cephalexin [7-(D-aaminofenylacetamido)desacetoxycephalosporariická kyselina] je βlaktamové antibiotikum se širokým spektrem aktivity proti baktérii Gram (-) a Gram ( + ). Dva monosubstituované cephalexiny byly připraveny kovalentním připojením flu orenyl metyl (Fm) podílu buďto k amino skupině (N-Fmoc-cephalexin) nebo ke karboxylové skupině přes esterifikaci (cephalexin-O-Fm).
(i) (a) Příprava N-Fmoc-cephalexinu
Do rozmíchané suspenze cephalexin hydrátu (Sigma, USA; 50 mg, 0,144 mmol) a trietylaminu (29 mg, 0.288 mmol) v dichlormetanu (DCM.; 2.5 ml) byl přidáván po kapkách roztok Fmoc-OSu (145 mg, 0,432 mmol) v DCM (2.5 ml) po dobu 5 minut. Reakční směs, která se stala jasnou po 1 hodině, byla míchána přes noc při pokojové teplotě a během této doby se.zakalila. Po koncentraci pod vakuem byl do směsi přidán éter a vzniklá sraženina byla zfiltrována a dvakrát promyta éterem. Filtrát byl rozpuštěn v ĎCM a extrahován okyselenou vodou (pH«2), vodou a solankou a sušen přes bezvodý MgSCh. Po filtraci a koncentraci roztoku byl přidán éter. Vysrážený produkt byl
4] • 9 ·♦ · ·» ·9
I * φ·· 9 9 9 9 )*> 9 9 9 9 9 9 9 9 «·* 9 * · 9*·* 9 9*9 99*
9 9 9 * 9
*. λ ., 1 _ . „ * Α.Ι____1- ±. . -Λ Λ ί. 1.ι riiirOvan a profnyř eterěřn k ziSKani rmOC-cepTratcTíiiiu^jffiCV Cisrcefro' produktu, jak bylo stanoveno pomocí TLC (1-butanol: :kyselina octová : voda, 8:1:1) a použitím analytické HPLC procedury (eluováno při 33 min, zatímco za podobných podmínek je přírodní cephalexin eluován při 6.5 min). Hmotová spektrální analýza (Past Atom Bombardment, FAB) určila očekávanou molekulovou hmotnost pro N-Fmoc-cephal exin (M/Z 570.1 [M + H] + ).
(i) (b) Aníibakteriálni potence F-moc cephalexinu
Pro stanovení antibakteriálních potencí přírodního ccphalcxinu a Fmoč-cephalexinu byly trubice, obsahující žřéděnou suspenzi Siaphylococus aure-u-s (0.5 ml/skleňěná trubice) inkubovány po dobu 6 hodin při 37°C za nepřítomnosti a v přítomnosti zvýšených koncentraci přírodního cephalexinu nebo Fmoc-cephalexinu před a po úpravě, specifikované v tabulce IV. V indikovaných časových bodech byly odebrány alikvotní podíly a analyzovány ohledně jejich potence k zastavení růstu Siaphylococus aureus. Bakteriální růst pak byl vyhodnocen zvýšenou zakaleností, naměřenou spektrometricky při 700 nm.
Tabulka IV: A ntibakteriáln í potence přírodního cephalexinu a N-Fmoc-cephalexiiiu
Sloučenina Ϊ Inkubace při pil 7 .'4, 37 ’C Koncentrace i n li i b i t o v á η í 5 0% bakteriálního růstu (μ m ) (1 C ) Antimikrobiální
potence'1J (%)
přírodní cephalexin 0.9 1 0 0
přírodní cephalexin 1 den I . 5 100
přírodní cephalexin 3 dny 5.3 1 00
přírodní cephalexin 6 dní 1 8 1 00
Fmoc-cephalexin — 23 6
Fmoc-cephalexin 1 den •1 5 1 0
Fmoc-ccphalexin 3 dny 9 59
Fmoc-ceph a.l exin 6 dní 4.5 1 00
• ·· ·· · ·· v ·*♦···,· ···· (1) Čísla se vztahují k potenci cephalexinu, pbilžjaélto Zj&Jk) a « * · · a « a a i a o a a a · ' 'ϊ'ϊ kontrola během analýz.
Inkubace byly provedeny při pH 7.4 s přírodním cephalexinem nebo s N-Fmoc-cephalexinem (100pg/mI) v 50 mM Hepes bufru, 20% DMSO.
Jak je ukázáno v tabulce VI, je N-Fmoc-cephalexin inaktivní («6%), Preinkubace po dobu 6 dnů (pH 7.4, 37°C) generovala přírodní cephalexin, jak bylo stanoveno HPLC monitorováním.a opětovným získáním okolo 50% antibakteriální potence původní sloučeniny. Přírodní cephalexin podléhá silné, časově závislé spontánní inaktivaci při inkubaci, zatímco N-Fmoc-cephalexin je značně mnohem stabilnější za stejných podmínek. Takže očekávaná prodloužená činnost N-Fmoc-cephalexinu in vivo je pravděpodobně způsobena jak vyšší chemickou stabilitou při fyziologickém pH a teplotě tak i unikající degradací. N-Fmoc-cephalexin je mnohem stabilnější vůči hydrolýze pomocí penicillinázy než původní sloučenina (není ukázáno).
(ii) Příprava cephaiexin-O-Fm-estern (Cephalexin fluor enylmetyl esíer) (a) N-Boc-cephalexin
Do ledem vychlazené rozmíchané suspenze cephalexin hydrátu (50 mg, 0.144 mmol) a trietylaminu (29· mg, 0.288 mmol) v DCM (3 ml) byl přidán roztok di-fert-butyl dikarbonátu (94.2 mg, 0.432 mmol) v DCM (2 ml). Reakční směs pak byla odstavena k zahřátí na pokojovou teplotu a přes noc míchána dokud nebyl pozorován žádný ninhydrin-pozitivní startovní materiál použitím TLC (1butanol.kyselina octová:H2o, 8:1:1). Reakční směs pak byla zředěna pomocí DCM (2.5 ml), extrahována okyselenou vodou (pH»2), vodou a solankou a sušena přes bezvodý MgŠO4. Po koncentraci byl produkt vysrážen použitím ropného éteru (bod varu 40-60°C), filtrován a opět promýván pomocí ropného éteíjui^o^utí J>yl *«* 9 » · ···· 9 *99 *99 · · * 9 9 · · homogenní, jak bylo potvrzeno procedurami TL'C a’ HPLC. ' (b) Cephalexin-O-Fm-ester
Do ledem vychlazeného rozmíchaného roztoku N-Boccephalexinu (25 mg, 0.056 mmol), 9-fluorenylmetanolu (22 mg, 0.112 mmol) a 4-dimetylaminopyridinu (13.7 mg, 0.112 mmol) v DCM (2 ml) byl přidáván po kapkách roztok DCC (23.1 mg, 0.112 mmol) v DCM (I ml) po dobu 20 minut. Reakční směs pak byla odstavena při pokojové teplotě a roztok byl filtrován k odstranění dicyklohexylmočo viny. Filtrát býl zředěn pomocí DCM (2:5ml) a pak dvakrát extrahován použitím roztoku 1M NaHCCh, 10% kyseliny citrické, vody a solanky a sušen přes bezvodý MgSO4.
I
Roztok byl odpařen k získání olejové pevné fáze, která byla rozetřena s ropným éterem k získání Boc-cephalexin-OFm produktu (jak bylo potvrzeno pomocí TLC a HPLC). Boc podíl byl odstraněn rozpuštěním surové pevné fáze (25 mg) v 1 ml roztoku TFA:DCM (1:1, v/v). Po odstavení na dobu 20 minut při pokojové teplotě byl TFA odstraněn odpařením a pevný zbytek byl rozpuštěn v isopropanolu, který byl pak odpařen. Tento postup byl opakován dvakrát. Surová pevná fáze byla rozetřena s ropným éterem k vytvoření finálního Čistého esteru, jak bylo stanoveno TLC a HPLC procedurami.
PŘÍKLAD 9:
Příprava di-9-(fluorenyImethoxykarbonyl)polymixinu B [JF.moch-PMXB
Polymixin-B (PMXB), reprezentativní Člen skupiny cyklických peptidických antibiotik, je efektivní proti Gram(-) baktérii. PMXB obsahuje 5 zbytků kyseliny diaminobutyrické, která může být modifikována vložením F moc skupin použitím činidla 4-(90 0 0 0 » · * «0 • 000 000 00·« fluor enyl methoxy karbony l)fenyl-dimethy lsulfobiUaí mfetii^ís^lřfl^u ·.!
i - - ± 0 0 0.. 0 0 (Fmoc-DSP). Molární poměr Fmoc-DSP činidla a peptidu bude určovat rozsah modifikace molekuly PMXB.
Pro přípravu (Fmoc)2-PMXB byl do rozmíchaného roztoku PMXB (Sigma, USA. 10 mg, 7.2 pmol) a (Fmoc-DSP; 7.1 mg 14.4 pmol) v H2O (1 ml) přidáván po kapkách roztok NaHCOa (0.1 M, 0.15 ml). Reakční směs, která se postupně zakalovala, byla míchána přes noc při pokojové teplotě. Výsledná sraženina byla odstředěna, dvakrát promyta vodou, rozpuštěna v malém objemu DMF a vysrážena éterem za vzniku surové pevné fáze.
Tabulka VII: Antibakteriální potence (Fmot)i-PMXB a přírodního PMXB
Sloučenina Úprava Koncentrace inhibitováni 50% bakteriálního růstu (μΜ) Ant i mikrobiální potence(l) 2 (%)
přírodní PMXB 0.05 100
přírodní PMXB 3 dny, 37°C, pH 8.5^’ 0. I i 00
p ř í r o d ii í Ρ Μ X tí 6 dnu, 37°C, pil g.5'2-' 0,2 1 Of)
přírodní PMXB 3 dny, 37’C, pH 8.5f 3 ’ 0.055 1.0 0
přírodní PMXB 6 dnů, 37’C, pH 8.5l3' 0.228 1 00
(F moc)rPMXB 5 J
( Fmoc )2-PMXB 3 dny, 37°C, pil 8.5 <2 > 0.125 80
(F mo c )2 - Ρ MXB ,6 dnů, 37°C, ρII 8.5U1 0.2 100
(Fmoc)j-PMXB 3 dny, 37’C, pH 7.U3’ 0.227 2 5
(Finoc)í-PMXB 3 dny, 37’C, pH 7.4(1) •0.35 1 64
(1) Čísla se vztahují k potenci PMXB, použitého jako kontrola během analýz.
(2) Inkubace byla provedena při pH 8.5 s PMXB nebo (Fmoc)2PMXB (100 pg/ml) v 0.1M NaFÍCOs obsahujícím 1% DMSO.
(3) Inkubace byla provedena při pH 7.4 s PMXBcde<bb '*..í * L Ϊ ť i ’ : ťo» <· í ΟΓ '< iJiř ' s·»
PMXB (100 pg/ml) v 50 mM Hepes-bufru (pH 7,4), obsahujícím 1%
DMSO.
Analytická HPLC (RP-lfc; 250 x 4 mm; Merck), používající 1 * 4 lineární gradient, vytvořený ze 70% roztoku A (0.1% TFA ve vodě) ' ; i , a 30% roztok B (0.1% TFA v acetonitril: H20, 75:25), na 100% roztok B za 40 minut (průtoková rychlost 0.8 ml/min.), ukazovala ' * - ’ I jeden hlavní produkt, eluováný při 39 min. (retenční Čas PMXB za t 1 . ' l ' - . 1 i ' .. i . ; .* :-1. ‘ΐ t : í těchto podmínek je 13.5 minut). Surová pevná fáze byla aplikována na preparativní HPLC k poskytnutí čistého produktu. Analýza ' 1 '' 4 ! r ... » ' 1 * ' ' í Jř· Uf 1 (FmocL-PMXB pomocí hmotového spektra (FAB) vykázala ' . r 1 Ϊ f /1 n
·. ' >· - 1 y F · i očekávanou molekulární hmotnost pro tuto sloučeninu (M/Z 1647 : 1 1 J ’ [M-Hf.
- . J. ' <
Antibiotické potence (Fmoe)2-PMXB a přírodního PMXB byly * i , · > » - * . ». .
analyzovány za různých experimentálních podmínek následujícím ’ “ . ’ O \ , ,· -· » způsobem: zředěná suspenze A. coi/ (0.5 ml na skleněnou testovací * · ' ' r' * >.1 5 ; ’ trubici) byla inkubována po dobu 6 hodin při 37°C bez nebo se zvýšenými koncentracemi (Fmoc)i-PMXB a přírodního PMXB. V : · . ’ 1 t · < n. t indikovaných časových bodech byly odebrány alikvotni podíly a analyzovány ohledně jejich potencí k zastavení růstu E. co li a bakteriální růst pak byl vyhodnocen měřením zakalení při 700 nm.
- t )ak je ukázáno v tabulce Vil je (Fmoc)2-PMXB inaktivní (»1%) a je velice hydrolyzován zpět na aktivní PMXB s tn2 hodnotami ~3 a ^1 den při pH 8.5 a 7.4.
PŘÍKLAD 10; Příprava Piperacillin-fluoreny iměthy l esteru (Piperacillin-O-Fm) i
Piperaci 1 lin (4-etyl-2,3-dioxopiperazinekarbonyl ampicilin) je
Široko spektrální polosyhtetické antibiotikum, vztažené k ·* ’ + * . \ * .1 ' , r penicilinu, které není účinné, když je podáváno orálně.
- « ·· ’ „ · i 'i
i) w « ·· » · » «••to « ií toto·· • •••••to···· • ··· · « · *··· · ··· *··
Piperacillin (volný karboxyl) byl připravVft 2’e sotfnέ *so 11’’ ” piperacillinu (Sigma, USA) acidickou extrakcí pomocí etylacetátu. Piperacillin-OFm byl synteticky připraven tak, jak je to popsáno pro cephalexin-OFtn ester v příkladu 8 výše zreagováním 1 ekvivalentu karboxylu s 2 ekvivalenty 9-fluorenylmetanoulu, 4dimetylaminopyridinu a DCC. Surová pevná fáze byla rekrystalizována z DCM éteru se získáním čistého produktu, jak bylo potvrzeno TLC a HPLC procedurami.
PŘÍKLAD 11: Příprava Fmoc-propranololu
Propananolol [ 1-(isopropyl ami no )-3-.( 1 -nafty! oxy l)-2propanol)], reprezentativní člen skupina beta blokovačů, je βadrenergický antagonist, který je používán jako antihypertensivní, z· antianginální a antiarytmická látka. Propranólol váže, ale neaktivuje β-adrenergický receptor. Konkurence pro tato místa s βadrenergickými antagonisty redukuje patologické hy.pertezivní stavy. Pacienti přijímají proprán o lol orálně na denní bázi. Avšak velká většina β-adrenergických antagonistů má spíše hydrofilickou povahu a nejsou absorbována účinně, když jsou podávána orálně, např. acetylbutolol, athenolol, betaxolol, karteolol, nadolol a sotalol.
Pro přípravu Fmoc-propranololu byl roztok Fmoc-OSu (170 mg, 0.50 mmol) v DCM (2.5 ml) přidáván po kapkách po dobu 5 minut do míchaného roztoku (jj-propranolol hydrochloridu (50 mg, ýJ7 mmol) a trietanolaminu (34 mg, 0.34 mmol) v dichlormetanu (DCM, 2.5 ml).
Po míchání přes noc při pokojové teplotě byla reakční směs extrahována okyselenou vodou (pH~2), vodou a solankou a sušena přes bezvodý MgSO4. Roztok byl odpařen k získání surové pevné fáze, která pak byla rozmělněna pomocí hexanu a získán Fraoc47 • fc fc» · fcfc fcfc • fc fcfcfe fcfcfcfc fcfc fcfc·· fcfcfcfc • fcfc fcfc · ··· ó fcfcfc fcfcfc .fcfcfc · « fc fc · ' · · propranolol; Produkt byl přezkoušen použitím«iFL‘C (ibutanol.kyselina octová voda, 8:1:1) a HPLC a bylo dokázáno, že je čistý (retenční časy propranololu a Fmoc-propranololu za stejných podmínek jsou 16 a 51 min.). Hmotové spektrum (FAB) dávalo správnnou M/Z'. 482 [M + H] + .
Byla analyzována β-adrenergická potence Fmoc-propranololu. Výsledky jsou ukázány v obr.7. Čerstvě připravené krysí adipocyty byly inkubóvány po dobu 2 hodin při 37°C s isoproterenolem (konečná koncentrace 1 pg/ml, 4 μΜ) a indikovanými koncentracemi propranololu (kolečka), Fmoc-propranololu (plná kolečka) nebo Fmoc-propranololu, který byl inkubován po dobu 7 dnů při 37°C, pH 8.5 (čtverečky). Množství glycerolu, uvolněného do média, pak bylo stanoveno podle Shechtera, 1982. IC50 je množství propranololu nebo N-Fmoc-propranolol derivátu (v μΜ), které inhibitovalo uvolnění isoprotenerolem zprostředkovaný glycerol, maximálně polovinu.
Jak je ukázáno na obr.7, Fmoc-propranolol má «7% potenci přírodního propranololu. Inkubace Fmoc-propranololu po dobu 7 dnů při pH 8.5 (37°C) generovala 5 0-70% β-adrenergickou potenci přírodního léčiva. Derivát je v podstatě hydrofobický, což je vlastnost, která může pomáhat při gastrointéstinální absorpci.
4» * · 0*0 00 00 • 000 0·* 0*0,
0« 0«*· 000
000 « « « ··« « 000 0» *r τ. m τι n a m ττ Τ» . *. 009«* «
Ij Í i Íj IV A I U ΚΛ «00 0* 00 · 00 *«
1. Bodanszky, M. and Bednarek, M. (1982) Int. J. Peptide Protein Res. 20, 434-37.
2. Burch, R.M., Weitzberg, M., Blok, N., Muhlhauser, R., Martin, D , Farmer, S.G., Bator, LM., Connoer, J.R., Ko, C., Kuhn,
W., MCMillan, B.A., Maureen, R., Shearer, B.G., Tiffany, C. a nd Wilkins, D.E. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci, USA 88, 3553 59.
3. Cambell, R.K., Campbell, L K., White, J R. ( 1 996) Ann. , Ph armacother. 30, 1 263-7 1.
4. Gertler, A., Ashkenazi, A. and Madar, Z. (1 984) Mol. Cell Endocrinol. 34, 5 1-57.
5. Kaarsholm, N.C. and Ludvigsen, S. (1995) Receptor 5, 1-8.
6. Meyerovitch, J., Farfel, Z., Sack, J. and Shechter, Y. (1 987) J. Biol. Chem. 262, 6658-6662.
7. Meyerovitch, J., Kahn, C.R. and Shechter, Y. (1 990) Biochemistry 29, 3654-3660.
8. Moody, A.J., Stan, M.A., Stan, M. and Gliemann, J. (1974) Honu. Metab. Res. 6, 12-16.
9. Pedersen, R.A., Ramanadham, S., Buchán, A.M.J. and MCNeill,
J.H. (1989) Diabetes 38, 1390-1395.
10. Rodbell, M. (1964) J. Biol. Chem. 239, 375-380.
Shechter, Y. (1982) Endocrinology 110, 1579-1583.
12. Shechter, Y. and Ron, A. (198.6) J. Biol. Chem. 261, 1494514950

Claims (26)

  1. - .-ft.ft.sft_· · / 'ftft _’ ·-*** ř · ft » »»',“ · » · ft ' ·.·.·,· T ft ft
    1. Proléčivo nebo farmaceuticky akceptovatelná sůl proléčivá, schopná pomalého hydrolyzováni na původní molekulu aktivního léčiva za fyziologických podmínek, charakterizované tím, žě v uvedeném proléčívu je nejméně jedna volná amino, hydroxy, merkapto a/nebo karboxyl skupina molekuly původního léčiva substituována funkčními skupinami, které jsou senzitivní na střední . zásady a odstranitelné při středné zásaditých podmínkách:
  2. 2. Proléčivo podle nároku 1 vzorce:
    —· · χ _ γ - : ‘. ·.
    kde
    Y je podíl farmacéutika, nesoucí přinejmenším jednu funkční skupinu, vybranou z volných amino, karboxyl, hydroxyl ' Jt a/nebo merkapto radikálů, a
    X je radikál, vybraný z radikálů vzorců (i) až (iv):
    kde R1 a R2 jsou stejné nebo různé radikály jako vodík, alkyl, alkoxy, alkoxyalkyl, aryl, alkaryl, halogen, nitro, sulfo, amino, amonium, karboxyl, PO3H2 nebo OPO3H2; R3 a R4 jsou stejné nebo různé radikály jako vodík, alkyl nebo aryl; a A je kovalentní vazba, kde je radikál připojen ke karboxylové nebo merkapto skupině farmacéutika A nebo A je OCO-, kde je radikál připojen k nějaké n nkn ti.tj Η-· Λ· *.· 1 il VUU π JU I UA V I
    5Λ____ i a ta r rn a c eu i i cřy áx c e pro váté inv • · · ·«· soli.
  3. 3. Proléčivo podle nároku 2, kde Y je podíl farmaceutika pro lidské a veterinární použití, vybraného ze skupiny obsahující antidiabetická farmaceutika, antibiotika, syntetické antibakteriály, analgesická a antizánětli vá farmaceutika, antialergická a antiastmatická farmaceutika, antihypercholesteromická farmaceutika, β-adrenergické blokovače a antihypertenži vní farmaceutika, antineoplastícká farmaceutika a antivirální farmaceutika.
  4. 4. Proléčivo podle nároku 2, ve kterém je podíl Y substituován nejméně jedním radikálem, obsahujícím radikál (i), kde Rj je vodík nebo sulfo a R2) R3 a R4 jsou vodíky.
  5. 5. Proléčivo podle nároku 4, ve kterém Y je podíl inzulínu, ve kterém jsou volné amino a/nebo karboxyl skupiny a volitelně volné hydroxyl. skupiny molekuly inzulínu substituovány nejméně jedním uvedeným radikálem (i).
  6. 6. Inzulínový derivát podle nároku 5, kde je jedna nebo více
    Jh aminoskupin substituována 9-fluorenylmethoxykarbonyl radikálem (i), kde Ri až R4 jsou vodík a A je OCO- (dále N-Fmoc-inzulín).
  7. 7. Inzulínový derivát podle nároku 5, kde je jedna nebo více aminoskupin substituována 9-fluorenyí methoxykarbonyl radikálem (i), kde R| až R4 jsou vodík a A je kovalentní vazba (dále C-(Fm)inzulín).
  8. 8. Inzulínový derivát podle nároku 5, kde je jedna nebo více aminoskupin substituováno Fmoc radikálem a jedna nebo více karboxylových skupin je substituováno Fm radikálem (dále N(Fmoc), C-(Fm)-inzulín),
  9. 9. Inzulínový derivát podle nároku 5, kde je jedna nebo více karboxylových skupin je substituováno Fm radikálem a jedna nebo *» * · · ·« ·***♦······ více hydroxylových skupin substituováno FmoJ faďik51€>r&.^-d-ále»IC«I (Fm),O-(Fmoc)-inzulín).
  10. 10. Inzulínový derivát podle nároku 5, kde je jedna nebo více amino a hydroxylových skupin substituováno Fmoc radikálem a jedna nebo více karboxylových skupin je substituováno Fm radikálem (dále N,O-(Fmoc)-C-(Fm)-inzulín).
  11. 11. Inzulínový derivát podle nároku 5, mající 1 až 3 Fmoc substituenty na volných amino skupinách v polohách GlyA1, PheBI nebo LysB29, Kde A a B jsou řetězce inzulínové molekuly, vybrané zé skupiny inzulínových derivátů, obsahujících GlyA1-N-(Fmoc)inzulín, PheB1-N-(Fmoc)-mzulín, LysB29-N-(Fmoc)-inzulín, GlyA1, PheB1-N-(Fmoc)2-inzulín, LysB29-N-(Fmoc)2-inzulín a GlyA1, PheBI, LysB29-N-(Fmoc)3-inzuIí n,
  12. 12. Inzulínový derivát podle nároku 5, mající 1 až 3 2-sulfo-Fmoc (dále Sulfmoc) substituenty na volných amino skupinách v polohách GlyA1, PheB1 nebo LysB29, Kde A a B jsou řetězce inzulínové molekuly, vybrané ze skupiny inzulínových derivátů, obsahujících GlyA1-N-(Sulfmoc)-inzulín, PheRI-N-(Sulfmoc)-inzulín, LysB29-N(Sulfmoc)-inzulín, GlyA1, PheB1-N-(Su!fmoc)2-inzulín, GlyA1, LysB29-N-(Suifmoc)2-inzulín a GlyA1, PheBI a GlyAl, PheBI, LysB29-N- (Sulfmoc) 3- inzulín,
  13. 13. (Fmoc, Sulfmoc nebo Fm)-inzulínový derivát podle jakéhokoliv z nároků 5 až 12, kde inzulín je přírodní, rekombin antní nebo mutovaný lidský, bovinový nebo porcinový inzulín.
  14. 14. Fmoc-růstový hormon, vybraný z lidského a bovinového růstového hormonu.
  15. 15. Fmoc cephalexin, vybraný z N-Fmoc-cephalexinu nebo cephalexin fluorenylmethyl esteru.
  16. 16. Di-(fluorenylmethoxykarbonyl)-polymyxin B.
    4 44 4 4
    4 *441
    4 4 4 4 4 1
    4444 4 444 * · <
    V · <
    • 44 '»4 ··
  17. 17. Piperacillin fluorenylmethyl ester.
  18. 18. Fmo c-pr op ra η o 1 o 1.
  19. 19. Farmaceutický prostředek, obsahující proléčivo podle jakéhokoliv z nároků 1 až 18 nebo jeho farmaceuticky akceptovatelná sůl a farmaceuticky akceptovatelný nosič.
  20. 20. Farmaceutický prostředek podle nároku 19, obsahující N(Fmoc)-inzulin podle jakéhokoliv z nároků 5 až 13.
  21. 21. Farmaceutický prostředek podle nároku 20, obsahující přírodní nebo rekombinantní lidský N-(Fmoc)3-inzulín a/nebo přírodní a/nebo rekombinantní lidský N-(Fmoc)2-inzulín.
  22. 22. Farmaceutický prostředek podle jakéhokoliv z nároků 19 až 21 pro podkožní injekci, třansdermáln í nebo orální podání.
  23. 23. Použití proléčiva podle jakéhokoliv z nároků 1 až 18 pro výrobu farmaceutického prostředku.
  24. 24. Způsob pro léčbu diabetů, který zahrnuje podávání efektivní dávky jednoho nebo více inzulínových derivátů diabetickým pacientům podle jakéhokoliv z nároků 5 až 13.
  25. 25. Způsob podle požadavku 24, kde jsou efektivní dávky N(Fmoc)?-inzulínu a N-(Fmoc)3-inzulínu podávány pacientovi v 5-8 denních intervalech.
    2.6. Způsob podle nároku 24 nebo 25, kde jsou N-(Fmoc)-inzulíny ‘' t podávány podkožní injekcí.
  26. 27 Způsob podle jakéhokoliv z nároků 24 až 26 dáte zahrnuj íeé podávání denních injekcí inzulínu.
CZ99369A 1996-08-07 1997-08-05 Dlouho působící farmaceutika a farmaceutické sloučeniny, které obsahují tyto látky CZ36999A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL11902996A IL119029A0 (en) 1996-08-07 1996-08-07 Long-acting drugs and pharamaceutical compositions comprising them

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ36999A3 true CZ36999A3 (cs) 1999-07-14

Family

ID=11069166

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ99369A CZ36999A3 (cs) 1996-08-07 1997-08-05 Dlouho působící farmaceutika a farmaceutické sloučeniny, které obsahují tyto látky

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6504005B1 (cs)
EP (1) EP1019089B1 (cs)
JP (1) JP4416184B2 (cs)
KR (1) KR20000029806A (cs)
CN (1) CN1227501A (cs)
AT (1) ATE308998T1 (cs)
AU (1) AU725468B2 (cs)
BR (1) BR9711045A (cs)
CA (1) CA2261835C (cs)
CZ (1) CZ36999A3 (cs)
DE (1) DE69734607T2 (cs)
DK (1) DK1019089T3 (cs)
ES (1) ES2252787T3 (cs)
HU (1) HUP0000809A2 (cs)
IL (3) IL119029A0 (cs)
NO (1) NO990518L (cs)
NZ (1) NZ333845A (cs)
WO (1) WO1998005361A2 (cs)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL139400A0 (en) * 2000-11-01 2001-11-25 Yeda Res & Dev Long-acting cytokine derivatives and pharmaceutical compositions comprising them
AU3938402A (en) * 2000-12-13 2002-06-24 Lilly Co Eli Chronic treatment regimen using glucagon-like insulinotropic peptides
PL211116B1 (pl) 2001-10-19 2012-04-30 Idexx Lab Komozycja do podawania ssakowi związku farmakologicznie czynnego i sposób wytwarzania preparatu do wstrzyknięć
US6946137B2 (en) * 2001-10-19 2005-09-20 Idexx Laboratories, Inc. Methods for the controlled delivery of pharmacologically active compounds
US20030171285A1 (en) * 2001-11-20 2003-09-11 Finn Rory F. Chemically-modified human growth hormone conjugates
BE1015608A6 (fr) * 2003-07-15 2005-06-07 Messadek Jallal Traitement des arterites.
JP4033382B2 (ja) * 2002-04-08 2008-01-16 久光製薬株式会社 インスリン投与装置
EP2259068B1 (en) * 2003-01-16 2013-08-14 caprotec bioanalytics GmbH Capture compounds and methods for analyzing the proteome
PL1620118T3 (pl) 2003-04-08 2014-11-28 Yeda Res & Dev Leki odwracalnie pegylowane
WO2004091601A1 (fr) * 2003-04-17 2004-10-28 Jallal Messadek Formulations orales flottantes pour la liberation controlee de la betaine
PL2107069T3 (pl) 2003-08-05 2013-06-28 Novo Nordisk As Nowe pochodne insuliny
BE1016128A6 (fr) * 2004-07-22 2006-03-07 Messadek Jallal Combinaisons therapeutiques
US7282487B2 (en) * 2004-10-28 2007-10-16 Idexx Laboratories Method for treating bacterial infections in horses or pigs with tilmicosin
WO2006050581A2 (en) * 2004-11-10 2006-05-18 Jallal Messadek Betaine as agent against arthropod - or mosquito -borne diseases
MX2007013486A (es) * 2005-04-27 2008-03-14 Jallal Messadek Combinaciones de insulinas.
DK1969004T3 (da) 2005-12-28 2011-11-28 Novo Nordisk As Insulinsammensætninger og metode til at lave en sammensætning
WO2008152106A1 (en) * 2007-06-13 2008-12-18 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical formulation comprising an insulin derivative
WO2009065193A1 (en) * 2007-11-21 2009-05-28 Jallal Messadek Treatment of aspirin resistance with betaine and/or betaine enriched molasses
EP2910569B1 (en) 2008-03-18 2016-10-05 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, acylated insulin analogues
WO2009158668A1 (en) 2008-06-26 2009-12-30 Prolynx Llc Prodrugs and drug-macromolecule conjugates having controlled drug release rates
US20110171312A1 (en) * 2008-09-19 2011-07-14 Nektar Therapeutics Modified therapeutic peptides, methods of their preparation and use
JP5765813B2 (ja) * 2008-09-19 2015-08-19 ウェルズ ファーゴ バンク ナショナル アソシエイション 治療用ペプチドのポリマーコンジュゲート
JP5775820B2 (ja) * 2008-10-21 2015-09-09 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 遊離可能ｐｅｇ試薬を有するプロドラッグｐｅｇタンパク質結合体において活性成分（インビトロ脱ペグ化）を決定する方法
AU2009309623B9 (en) 2008-10-30 2014-10-02 Novo Nordisk A/S Treating diabetes melitus using insulin injections with less than daily injection frequency
EP2403537A1 (en) 2009-03-05 2012-01-11 Ascendis Pharma A/S Interferon alpha carrier prodrugs
WO2011013128A2 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Vectors for delivery of neurotherapeutics to the central nervous system
US8754190B2 (en) * 2010-05-05 2014-06-17 Prolynx Llc Controlled release from macromolecular conjugates
RU2013123515A (ru) 2010-10-27 2014-12-10 Ново Нордиск А/С Лечение сахарного диабета с помощью инъекций инсулина, вводимых с различными интервалами
EP2490378B1 (en) 2011-02-18 2014-07-09 NTT DoCoMo, Inc. Apparatus and method for determining a control unit using feasibility requests and feasibility responses
AU2012261869B2 (en) 2011-06-02 2017-01-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting GLP-1/Glucagon receptor agonists
US10166295B2 (en) 2011-06-02 2019-01-01 Opko Biologics Ltd. Pegylated OXM variants
JP6199956B2 (ja) 2012-04-11 2017-09-20 ノヴォ ノルディスク アー／エス インスリン製剤
SG11201408054RA (en) 2012-06-04 2015-01-29 Opko Biolog Ltd Pegylated oxm variants
US20150111820A1 (en) 2012-07-09 2015-04-23 Novo Nordisk A/S Novel use of insulin derivatives
US10137172B2 (en) 2013-04-30 2018-11-27 Novo Nordisk A/S Administration regime
JP6690062B2 (ja) 2016-12-16 2020-04-28 ノヴォ ノルディスク アー／エス インスリン含有医薬組成物
US10335464B1 (en) 2018-06-26 2019-07-02 Novo Nordisk A/S Device for titrating basal insulin
KR20210126088A (ko) 2019-02-11 2021-10-19 옵코 바이오로직스 리미티드 지속성 glp-2 유사체

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU906340D0 (en) * 1986-10-13 1991-04-29 Sandoz Ag Synthesis in solid phase for producing peptonic alcohols
GB8717446D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Merck Sharp & Dohme Chemical compounds
US6313094B1 (en) * 1990-12-11 2001-11-06 Japan Energy Corporation β-amino-α-hydroxycarboxylic acid derivatives and HIV protease inhibitors
JPH0687887A (ja) * 1992-08-19 1994-03-29 Upjohn Co:The ペプチドのエナミン誘導体およびそれをプロドラッグとして含有するペプチド製剤
US5631222A (en) 1993-06-25 1997-05-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Endothelin-antagonizing peptide
US5880131A (en) * 1993-10-20 1999-03-09 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
WO1995021622A1 (en) 1994-02-09 1995-08-17 Brigham & Women's Hospital Gel-forming polypeptide derivatives
DE4437604A1 (de) 1994-10-21 1996-04-25 Basf Ag Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung
AU5377296A (en) * 1995-03-30 1996-10-16 Southpac Trust International, Inc. Self-erecting container which is collapsible to be substanti ally flat
US5688992A (en) 1995-03-31 1997-11-18 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services O-malonyltryrosyl compounds, O-malonyltryrosyl compound-containing peptides, and use thereof
US5846934A (en) * 1996-02-20 1998-12-08 American Cyanamid Company Pure somatostatin antagonist and methods of use thereof
US6057297A (en) * 1996-08-06 2000-05-02 Polifarma S.P.A. Inhibitor compounds of zinc-dependent metalloproteinases associated with pathological conditions, and therapeutic use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO1998005361A3 (en) 1998-06-18
WO1998005361A2 (en) 1998-02-12
HUP0000809A2 (hu) 2000-11-28
AU725468B2 (en) 2000-10-12
CN1227501A (zh) 1999-09-01
DK1019089T3 (da) 2006-03-13
EP1019089A2 (en) 2000-07-19
ATE308998T1 (de) 2005-11-15
US6504005B1 (en) 2003-01-07
KR20000029806A (ko) 2000-05-25
NZ333845A (en) 2000-09-29
IL128274A (en) 2006-08-01
AU3706097A (en) 1998-02-25
NO990518L (no) 1999-04-06
BR9711045A (pt) 1999-08-17
NO990518D0 (no) 1999-02-04
ES2252787T3 (es) 2006-05-16
DE69734607D1 (de) 2005-12-15
CA2261835C (en) 2008-07-29
EP1019089B1 (en) 2005-11-09
JP2000515542A (ja) 2000-11-21
DE69734607T2 (de) 2006-08-03
JP4416184B2 (ja) 2010-02-17
IL119029A0 (en) 1996-11-14
CA2261835A1 (en) 1998-02-12
IL128274A0 (en) 1999-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ36999A3 (cs) Dlouho působící farmaceutika a farmaceutické sloučeniny, které obsahují tyto látky
EP2437786B1 (en) Prodrugs containing albumin binding probe
CN102625695B (zh) 长效胰岛素组合物
CN100425284C (zh) 抑制胰高血糖素的方法
JP4113778B2 (ja) 真性糖尿病の治療方法
ES2542146T3 (es) Insulinas extendidas PEGiladas.
US9480751B2 (en) Albumin binding probes and drug conjugates thereof
CN102933598A (zh) 新型胰高血糖素类似物
EA008433B1 (ru) Производные инсулина длительного действия и способы их использования
CN104402989A (zh) 酰化的glp-1化合物
TWI672315B (zh) 醯化之胰島素化合物
EP2994152B1 (de) Konjugate zum schutz vor nephrotoxischen wirkstoffen
Shechter et al. Reversible pegylation of insulin facilitates its prolonged action in vivo
EP3570874B1 (en) Zwitterionic polymer-insulin compositions and related methods
CN1964989B (zh) 长效胰岛素衍生物及其方法
Gershonov Novel strategy for preparation of long-acting drugs: Studies on insulin

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic