CN104788556A - 人胰岛素类似物及其酰化衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人胰岛素类似物及其酰化衍生物。具体而言,本发明涉及一种人胰岛素类似物及其酰化衍生物、其生理耐受盐、其制备方法及其在医药上的应用,以及它们作为治疗剂特别是作为糖尿病治疗剂的用途。本发明提供的胰岛素衍生物具有改进的生物药效的性质,可用于治疗糖尿病以及阿尔茨海默病、ICU危重病人血糖控制。
Description
本申请是申请号为201280011736.8,申请日为2012年11月22日,发明名称为“人胰岛素类似物及其酰化衍生物”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种人胰岛素类似物及其酰化衍生物,其制备方法及含有该类似物及其酰化衍生物的药物组合物,以及其作为治疗剂特别是作为糖尿病治疗剂的用途。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种常见的代谢内分泌疾病,是由于体内胰岛素绝对或相对缺乏,或靶组织对胰岛素不敏感而引起的慢性高血糖为特征的伴随糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱的临床慢性、全身性代谢综合症。它由遗传和环境因素相互作用而引起,涉及人体各个系统,包括心脑血管、肾、眼、神经等脏器并发症,严重危害人类健康,是一种终生疾病。
糖尿病已成为一种常见病、多发病,是继癌症、心脑血管病之后,第三大威胁人类生命的疾病,是全人类的挑战,其对人们生命健康的危害不分种族和国家。据国际糖尿病联盟(IDF)的统计,上个世纪八十年代中期至九十年代中期十年间,糖尿病患者总量增长4倍,达到1.2亿。2007年全球糖尿病患者人数为2.46亿,其中46%为40-59岁劳动力人口。预计到2025年全世界糖尿病患者将增加到3.8亿,占到世界成年人口的7.1%。
据ADA(American Diabetes Association,美国糖尿病联合会)2011年1月公布的数据,美国已有2560万糖尿病患者,占美国人口的8.3%。在美国庞大的医疗费用中,每10美元中就有一美元为糖尿病支出!我国糖尿病患病率近20年来显著增加。流行病学调查显示糖尿病患病率2002年以前在4%以下。近期一项全国糖尿病流行病学调查结果表明,我国成人(20岁以上)糖尿病患病率超过10%!总体糖尿病患病率为9.7%。目前有超过9200万的糖尿病患者,另外还有1亿5000人将成为患者,已超过印度,成为全球拥有糖尿病患者最多的国家。
糖尿病主要分为胰岛素依赖型糖尿病(I型糖尿病)、非胰岛素依赖性糖尿病(II型糖尿病)以及其他特殊类型糖尿病。I型糖尿病多为儿童和青少年,发病高峰为12岁,占总糖尿病患者10%以内。II型糖尿病多发于成年人,占总糖尿病患者90%以上。糖尿病的准确病理机制目前还未知,尚无根治的办法。药物治疗及控制是目前糖尿病治疗的重点。除了小部分Ⅱ型糖尿病病人可以经饮食和运动治 疗控制病情外,绝大部分病人都需要进行药物治疗。治疗药物包括中成药和西药。而西药占主导地位,主要有两大类药物:以胰岛素及类似物为代表的蛋白质多肽类药物和口服小分子抗糖尿病药物。
随着糖尿病全球患者数量急剧增加,全球糖尿病药物市场规模也急速增长。据统计,2005年糖尿病药物市场达到186亿美元,较上年增长11.5%。2006年为212亿美元,增长14%。2007年为241亿美元,增长13.7%,在全球药品市场中排名第5位。预计每年以15~20%的速度增长。据Research and Markets公司报告显示胰岛素及其类似物占整个糖尿病药物市场比例达40.1%,口服降糖药占58%,剩余的1.9%的市场份额由其他药物占据。
目前已公开了一系列在天然人胰岛素序列的不同位点上有氨基酸取代的胰岛素类似物的专利申请。EP0425482B1公开了一种在B25位上有His或Tyr取代的胰岛素类似物。EP0419504B1公开了一种在B3有取代,同时在A5或A15有Gln取代,或在A18或A21有Asn取代的胰岛素类似物。US5008241A公开了一种在A21有特定氨基酸取代,同时在A4、A17、B13或B21有特定氨基酸取代的胰岛素类似物。US5164366A公开了在B24、B25、B26或B27位其中有一位缺失的胰岛素类似物。CN1195777C公开了在A8、A9、A10、B30上有取代的胰岛素类似物。US7193035B2公开了在B3和至少在B27、B28或B29中的一位有取代的胰岛素类似物晶型。CN1780854公开了一种A0(Arg)A21(Gly)B31(Arg)B32(Arg)胰岛素类似物。
尽管如此,为达到更好的改性效果,以获得更好的药效,降低和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)受体的结合活性,提供更多的选择性药物,仍需更多的改性胰岛素类似物,以用于糖尿病治疗。
发明内容
因此,本发明的目的是为了提供一种新型的具有优良性能的糖尿病治疗药物,更具体地,新型的人胰岛素类似物及其酰化衍生物,以及制备所述类似物及衍生物的方法,含有它们的药物组合物,和所述人胰岛素衍生物在糖尿病治疗中的应用。
本发明的第一方面提供一种人胰岛素类似生物或其生理耐受盐,包括具有下式序列的人胰岛素类似物:
其中,A0可以是R,也可以缺失;A21可以是N或G;
B3可以是K、D或N;
B27可以是E、T、D、或K;
B28可以是E、D、P或K;
B29可以是E、K或P;
B30可以是K、R、E、T或者缺失;
B31、B32可以是R或者单个缺失或两者缺失,
其中当所述的A0缺失,A21是N,B3是N时:B31B32缺失,B27B28B29B30不是TPKT、TKPT或TDKT;
或者B30B31B32缺失,B27B28B29不是TPK;
又或者当A0缺失,A21是N,B3是K,B31B32缺失时,B27B28B29B30不是TEKT;
又或者当A0缺失,A21是G,B3是N时,B27B28B29B30B31B32不是TPKTRR。
优选地,其中B3、B27-B30位氨基酸残基中只有一个是赖氨酸(K)残基。
当A链的A0缺失,B链的B3是N时:优选的B28是E或D,B29是E、K或P,B30是R、E或者缺失,B31、B32缺失;更优选的当B30B31B32缺失时,B28B29是KE。
当B链的B3是D时:优选的B28、B29是P或K,B30是T或者缺失,B31、B32是R或者缺失;更优选的B28B29是PK。
当A链的A0缺失,B链的B3是K时:优选的B28、B29是P或E,B30是E或R,B31是R或者缺失,B32缺失;更优选的B28B29是PE。
本发明所提供的人胰岛素类似物或其生理耐受盐,其中所述的人胰岛素类似物的序列A链和B链以二硫键(A7-B7,A20-B19)相连,A链内A6和A11以二硫键相连;所述的序列选自,但不限于如下所述的序列:
本发明还提供一种上述人胰岛素类似物或其生理耐受盐的优选例,其中所述的人胰岛素类似物被PEG化,得到本发明的PEG化胰岛素;所述的PEG分子的分子量为5-100KD,优选10-80KD,更优选15-45KD,最优选20-40KD;所述的PEG分子为支链型或直链型。
本发明还提供一种人胰岛素类似物或其生理耐受盐的制备方法,包括构建表达载体,转化至宿主细胞中的表达,分离纯化表达前体产物,用化学或/和酶方法从表达前体产物中释放所述胰岛素类似物;所述的人胰岛素类似物任选进一步被PEG化,得到本发明的PEG化胰岛素,所述的PEG化优选为化学酰化修饰方法,包括酰化试剂的合成,人胰岛素类似物中氨基的酰化和酰化集团中保护基的脱除。
其中所述的表达前体产物的通式(I)为:
A-R1-B I
其中:
R2为0-5个氨基酸残基肽段,该氨基酸残基肽段由丙氨酸(A)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)组成;
A、B分别为所述胰岛素类似物对应的A链和B链。
所述的表达前体产物优选为:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO.19,FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG
SEQ ID NO.20,
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO.21,FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG
SEQ ID NO.77。
本发明还提供编码所述的胰岛素类似物的表达前体产物的DNA-序列。
本发明还提供含有所述的DNA-序列的表达载体。
本发明还提供所述的任一项表达载体转化的宿主细胞。
其中所述的宿主细胞优选为细菌,更优选为大肠杆菌。
其中所述的宿主细胞也优选为酵母菌,更优选为毕赤酵母,或酿酒酵母。
本发明还提供一种胰岛素衍生物,在所述的胰岛素A和B-链N-末端的α-氨基或者在B3、B27-B30的赖氨酸(K)残基的ε-氨基处连接了酰化修饰基团,形成了酰化胰岛素,该酰化胰岛素具有如下通式:
S-W-X-Y-Z
其中S为胰岛素,或如上述第一方面所述的胰岛素类似物;
-W-X-Y-Z为胰岛素类似物的酰化修饰基团,其中W为:
●具有-OC(CH2)mCO-的二酰基结构,其中m为2~10之间整数,该结构以其羧酸基团之一和母体胰岛素或其类似物的A-链或B-链N-末端氨基酸残基的α-氨基或B-链上存在的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键;
●侧链上带有羧基的α-氨基酸残基或含有侧链上带有羧基的α-氨基酸组成的2-4肽,其中该残基或肽与母体胰岛素或其类似物的A-链或B-链N-末端氨基酸残基的α-氨基或B-链上存在的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键连接;
X为:
●-CO-;
●含羧酸基团的二氨基化合物,该化合物以其氨基之一与W中的羧基形成酰胺键连接;
a)当W为氨基酸残基或2-4肽时,上述X基团通过-CO-与W上的氨基形成酰胺键,或
b)当W为二酰基结构时,上述X基团以其氨基基团之一与二酰基结构连接;
Y为:
●-A(CH2)m-,其中m为6-32的整数,A为不存在或CO-;
●酰基二价烃链,其中含有1、2或3个-CH=CH-基团和足以在链上获得10-32个碳原子总数的-CH2-基团;
●通式-B(CH2)vC6H4(CH2)w-的二价烃链,其中v和w为整数或其中一为0,使得v与w之后在6-30的范围,B为不存在或CO-;
a)当X为CO-时A或B为不存在,或
b)当X为二氨基化合物时A或B为CO-;
Z为:
●-OH;
●-NH2;
●-COOH;
●-SO3H;
●-PO3H。
本发明中胰岛素衍生物又一优选例,其中酰化修饰基团-W-X-Y-Z与母体胰岛素B3、B27-B30的赖氨酸(K)残基的ε-氨基连接。
本发明中胰岛素衍生物又一优选例,其中酰化修饰基团-W-X-Y-Z与母体胰岛素A和B-链N-末端α-氨基连接。
本发明中胰岛素衍生物又一优选例,其中S为胰岛素类似物,选自以下组:
A链:GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1
B链:FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE SEQ ID NO.10
A链:GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1
B链:FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.9
A链:GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2
B链:FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.16
本发明中胰岛素衍生物又一优选例,其中酰化修饰基团-W-X-Y-Z优选自下组中:
Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu;
Nα-(HO(CH2)15CO)-γ-Glu;
Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(3-酰基丙酸*)-Lys
(*处为胰岛素连接点)。
本发明中胰岛素衍生物又一优选例,其选自下组中:
B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素(代号:HS061);
B28D-NεB29-(Nα-(HO(CH2)15CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素(代号:HS062);
Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(B28D-NεB29-B30E人胰岛素))-Lys-OH(代号:HS067);
NεB3-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B29E-B30E人胰岛素(代号:HS605);
Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(NεB3-B29E-B30E人胰岛素))-Lys-OH(代号:HS606);
NεB3-(Nα-(HOC(CH2)15CO)-γ-Glu)-B29E-B30E人胰岛素(代号:HS607);
NεB3-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B29E-B30E,A21G人胰岛素(代号:HS608);
Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(NεB3-B29E-B30E,A21G人胰岛素))-Lys-OH(代号:HS609);
NεB3-(Nα-(HOC(CH2)15CO)-γ-Glu)-B29E-B30E,A21G人胰岛素(代号:
HS610)。
本发明还提供药物制剂,其含有本发明所述的的胰岛素类似物和/或其生理耐受盐,或含有如前所述的胰岛素衍生物。
其中所述的药物制剂,含有溶解的、非晶型的和/或结晶形式的胰岛素类似物和/或其生理耐受盐。
其中所述的药物制剂,含有长效佐剂,所述的和长效佐剂与药物以共结晶的方式存在。
本发明还提供具有胰岛素活性的可注射的溶液,其含有溶解形式的上述的药物制剂。
本发明还提供所述的胰岛素类似物和/或其生理耐受盐,或含有如前所述的胰岛素衍生物,在制备治疗II型糖尿病、高血糖症、肥胖症或胰岛素抵抗症的药物中的用途。
本发明还提供所述的胰岛素类似物和/或其生理耐受盐在制备速效和/或长效的具有胰岛素活性的药物制剂中的用途。
本发明提供了新型的重组人胰岛素类似物,具有良好的改性效果,更好的药物活性,为临床提供更多的选择性药物,用于糖尿病治疗。
术语本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
在DNA序列中,A为腺嘌呤,C为胞嘧啶,G为鸟嘌呤,T为胸腺嘧啶。
“人胰岛素类似物”是指人胰岛素中的一个或多个氨基酸残基已被删除和/或被其他氨基酸残基替换的人胰岛素,或包含附加氨基酸残基,即51个氨基酸残基以上的人胰岛素。
“胰岛素衍生物”,在本发明中指在胰岛素A和B-链N-末端的α-氨基或者在B3、B27-B30的赖氨酸残基的ε-氨基处连接了酰化修饰基团,形成了酰化胰岛素,该酰化胰岛素具有如下通式:S-W-X-Y-Z;其中各代码定义如说明书中所定义。
“PEG化胰岛素”,指被PEG化的人胰岛素类似物;所述的PEG分子的分子量为5-100KD,优选10-80KD,更优选15-45KD,最优选20-40KD;所述的PEG分子为支链型或直链型;本发明中PEG(20KD)化胰岛素表示与每个人胰岛素类似物亚基结合的PEG分子量为20KD;PEG(30KD)化胰岛素表示与每个人胰岛素类似物亚基结合的PEG分子量为30KD;PEG(分支型40KD)化胰岛素表示与每个人胰岛素类似物亚基结合的PEG是分子量为40KD的支链型PEG。
“长效佐剂”指硫酸鱼精蛋白。
“速效的具有胰岛素活性的药物制剂”指具有速效胰岛素活性的人胰岛素类似物或其生理耐受盐的制剂。
“长效的具有胰岛素活性的药物制剂”指具有长效胰岛素活性的人胰岛素类似物或其生理耐受盐的制剂。
本发明的序列设计基于天然人胰岛素的蛋白质氨基酸序列。全长由A和B链两条链组成。A和B链以二硫键连接,A链内还有一个二硫键,共3个二硫键,均以连线标出。每条链上的氨基酸序号按如下规则命名:如A链1-21位氨基酸分别标为A1,A2,A3……。B链1-30位氨基酸分别标为B1,B2,B3……。此外,如果在A和B链的N端添加氨基酸的话,其标记分别为A0,A(-1),A(-2)……,B(0),B(-1),B(-2)……等。如果在A和B链的C端添加氨基酸的话,其标记分别为A22,A23,……,B31,B32……等。在具体表示人胰岛素衍生物通式时,确定的氨基酸用氨基酸代码表示,有不确定替代或删除的位置用该位的氨基酸序号表示,如本发明的人胰岛素类似物通式所示。
本发明实施例中,所用的B(1-29)是指人胰岛素B1到B29缩短的B链,B(1-30)是指人胰岛素B1到B30的B链,B(1-31)是指人胰岛素B1到B31的B链,B(1-32)是指人胰岛素B1到B32的B链;A(1-21)是指人胰岛素的A链,A(0-21)是指在A0位加一个氨基酸残基的人胰岛素A链。根据本发明的具体实施例,在人胰岛素分子中的取代残基是用参照于人胰岛素的氨基酸序号表示的。例如,B(1-2)-D-B(4-30),A(1-21)人胰岛素指一个在B链3位上N被D所取代的人胰岛素类似物。序列简写B(1-30),A(1-21)指天然人胰岛素;B(1-29),A(1-21)是指B30位缺失的人胰岛素;B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)是指B3位为K所取代,B29B30为EE所取代的重组人胰岛素(实施例六),除非另外加以说明。此外,与人胰岛素一样,B链和A链是由A(7)Cys和B(7)Cys之间的二硫键,A(20)Cys和B(19)Cys之间的二硫键联结起来的。同时A链含有A(6)Cys和A(11)Cys间的内二硫键。
本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。从表达前体产物中释放所述胰岛素类似物的 化学和/或酶方法可用本领域技术人员熟知的常规技术进行,比如胰蛋白酶、羧肽酶B、赖氨酸内肽酶C等。
附图说明
图1、重组人胰岛素B(1-30),A(1-21)前体的克隆方法示意图。
图2、重组人胰岛素B(1-30),A(1-21)前体克隆插入片段的PCR鉴定电泳图。
图3、HS061和HS060体内长效活性检测结果比较。
图4、HS062和HS060体内长效活性检测结果比较。
图5、HS067和HS060体内长效活性检测结果比较。
图6、PEG(20kD)化B(1-27)-D-K-E,A(1-21)(PEG(20kD)-156)和PEG(20kD)化B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)(PEG(20kD)-107)胰岛素体内长效活性检测结果。
图7、PEG(30kD)-107、PEG(40kD)-107、PEG(30kD)-156、PEG(40kD)-156体内长效活性检测结果。
具体实施方式
以下结合实施例进一步描述解释本发明,但这些实施例并非意味着限制本发明的范围。
本发明中所用部分试剂配方如下:
YPD培养液(1L)(1%酵母粉,2%蛋白胨,2%葡萄糖):
1、将10g酵母粉,20g蛋白胨溶于900mL水中;
2、高压蒸气灭菌20min;
3、加入100mL无菌的20%的葡萄糖。
基本葡萄糖培养基(1L)(1.34%YNB;4X10-5%生物素;2%葡萄糖):
1、800mL水高压蒸气灭菌20min,(如配制平板,可在灭菌前,加入15~20g的琼脂);
2、冷却至60℃,随后加入:
100mL无菌的10X YNB;2mL无菌的0.02%的生物素和100mL无菌的20%的葡萄糖。
BMMY液体培养基(1L):
1、将10g酵母粉、20g蛋白胨溶于700mL水中;
2、高压蒸气灭菌20min;
3、冷却至室温,随后加入以下物质混匀:
100mL无菌的1M磷酸钾缓冲液pH6.0,100mL无菌的10X YNB,2mL无菌的0.02%生物素,100mL无菌的5%甲醇。
诱导表达培养基(1L)(BMGY):
1、将10g酵母粉、20g蛋白胨溶于700mL水中;
2、高压蒸气灭菌20min;
3、冷却至室温,随后加入以下物质混匀:
100mL无菌的1M磷酸钾缓冲液pH6.0,100mL无菌的10X YNB,2mL无菌的0.02%生物素,100mL无菌的10%甘油。
本发明实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件,毕赤酵母表达实验手册(版本:10April 2009),或按照商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂,为市场购买的常规试剂。本发明下述实施例中提及的分子量的单位均为道尔顿(Dalton)。
实施例
实施例1、重组人胰岛素B(1-30),A(1-21)和B(1-29),R-A(1-21)的制备
步骤1:重组人胰岛素B(1-30),A(1-21)前体的克隆和表达
1、重组人胰岛素B(1-30),A(1-21)前体的表达载体的构建:
重组人胰岛素B(1-30),A(1-21)前体编码基因用聚合酶链反应(PCR)的方法进行3轮合成,由Invitrogen公司合成5段单链DNA片段作为PCR引物,序列如下:
引物1:
5’GTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCAAGCGTGGCATTG3’ SEQ ID NO.45
引物2:
5’GTAGAGGGAGCAGATGCTGGTACAGCATTGTTCCACAATGCCACGCTTGG3’ SEQ ID NO.46
引物3:
5’TGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGG3’ SEQ ID NO.47
引物4:
5’CTGACTGAATTCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTAGAGGGAGCAGAT3’ SEQ ID NO.48
引物5:
5’ACTTGCTCGAGAAAAGATTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTG3’ SEQ ID NO.49。
第1轮PCR的合成用KOD试剂盒(TOYOBO,Cat.KOD-201)50μL体系:5μL10×KOD缓冲液,2μL 2mM dNTPs,1.5μL引物1(10μM),1.5μL引物2(10μM),0.5μL KOD plus,2μL 25mM MgSO4,38μL ddH2O。扩增程序为94℃2min,94℃ 30sec,55℃30sec,68℃30sec,扩增25个循环后,再68℃孵育2min以结束PCR扩增程序。合成的85个核苷酸PCR产物1用1.2%琼脂糖凝胶鉴定并回收。
第2轮PCR的合成用50μL体系:5μL 10×KOD缓冲液,2μL 2mM dNTPs,1μL产物1,1.5μL引物3(10μM),1.5μL引物4(10μM),0.5μL KOD plus,2μL 25mM MgSO4,37μL ddH2O。扩增程序为94℃2min,94℃30sec,55℃30sec,68℃30sec,扩增25个循环后,再68℃孵育2min以结束PCR扩增程序。合成的155个核苷酸的PCR产物2用1.2%琼脂糖凝胶鉴定并回收。
第3轮PCR的合成用50μL体系:5μL 10×KOD缓冲液,2μL 2mM dNTPs,1μL产物2,1.5μL引物4(10μM),1.5μL引物5(10μM),0.5μL KOD plus,2μL 25mM MgSO4,37μL ddH2O。合成程序为94℃2min,94℃30sec,55℃30sec,68℃30sec,扩增25个循环后,再68℃孵育2min以结束PCR扩增程序。用1.2%琼脂糖凝胶鉴定并回收,得到产物3。
产物3用T载体试剂盒(Takara,Cat.D103A)连接到T载体上,再用EcoR I/Xho I(New England Biolabs,Cat.R0101S/R0146V)进行双酶切,得到的目的片段经1.2%琼脂糖凝胶回收,用T4连接酶(New England Biolabs,Cat.M0202S)连接到pPIC9K表达载体(Invitrogen,Cat.K1750-01)上。结构如图1所示。
所得到的重组表达载体由Invitrogen公司作序列分析,验证包含人胰岛素B(1-30),A(1-21)前体编码基因序列的产物3,序列如下:
TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG SEQ ID NO.32。
2、重组人胰岛素B(1-30),A(1-21)前体表达载体的转化:
将5-10μg的上述步骤中得到的重组人胰岛素前体的表达载体用SalI(Takata,Cat.D1080a)进行线性化,再加入1/10体积的3M醋酸钠,2倍体积的无水乙醇。充分混合后,放置于-20℃,2hr。混合物高速离心(13,000rpm)5min,去处上清,用75%乙醇清洗沉淀2次。将沉淀倒置晾干后,用10μL ddH2O溶解。将线性化的质粒与80μL电转化感受态细胞(毕赤酵母GS115,Invitrogen,Cat.K1750-01)混合转入电转化杯(Bio Rad,Cat.1652086)中,并置冰浴5min。将电转化仪(Bio Rad Micropulser)参数设至2kV,25Ω,200uF,进行电转化。结束后迅速加入1mL冰浴的D-Sorbitol(生工生物工程有限公司)混合,将100-300μL混合物涂布于MD培养板上,30℃培养3d至形成菌落。
3、重组人胰岛素前体克隆的G418筛选:
用3mL YPD培养液洗脱MD培养板上的菌落,重悬,并用分光光度仪(Beckman,DU800)测定重悬的细胞浓度(1OD600=5X107个cell/mL)。将1X105个细胞涂在不同浓度G418(GIBCO,Cat.11811-031)的YPD培养板上(0.25、 0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL),30℃培养5d至形成菌落。从不同浓度上挑选单克隆共30个,进行重组片段PCR(Polymerase chain reaction)鉴定。
4、重组人胰岛素B(1-30),A(1-21)前体克隆插入片段的PCR鉴定:
利用PCR方法对G418抗性的菌落进行插入片段的鉴定。将18μL菌液放置于1.5mL离心管内,并加入2μL溶胞酶(5U/μL)(Sigma,Cat.L2524),30℃孵育10min。然后将样品放置于–80℃10min进行完全裂解。用KOD试剂盒(TOYOBO,Cat.KOD-201)25μL PCR体系进行鉴定:2.5μL 10X反应缓冲液,1.5μL 25mM MgCl2,2.5μL 2mM dNTPs,1μL 5′AOX1引物(10pmol/μL),1μL 3′AOX1引物(10pmol/μL),0.5μL KOD聚合酶,15μL ddH2O,1μL细胞裂解液。将混合体系放置于PCR仪(Eppendorf,22331型)中,扩增程序为94℃30sec,55℃30sec,68℃4min,扩增25个循环后,再68℃孵育10min以结束PCR扩增程序。取10μL PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶(Sigma,A9539)进行鉴定。结果见图2,可以看见2条明显的扩增条带。2.2Kb的大条带为GS115自身所带的AOX基因,635bp的小条带为插入的外源基因。图2中泳道6为克隆1001-17号。为进一步的使用选择了克隆1001-17号。
5、重组人胰岛素B(1-30),A(1-21)前体的表达和鉴定:
将克隆1001-17号单菌落于50mL BMGY培养基,30℃、250rpm培养过夜。第二天检测OD600值,应处于2-6之间。于室温用离心机(Beckman Coulter)低速(1,500g)离心5min收集细胞,并用BMMY培养基重悬至OD600为1.0。在培养基中加入1/200总体积的100%甲醇(终浓度为0.5%),并于28℃、250rpm培养72hr,其中每24hr补加1/200总体积的100%甲醇。诱导结束后,用离心机低速(1,500g)离心并收集上清。SDS-PAGE(Invitrogen,Cat.No.456-1083)电泳结果表明1001-17号表达了前体蛋白,挑选其进行下一步发酵。
步骤2:重组人胰岛素B(1-30),A(1-21)前体的发酵
1、菌种:1001-17号表达菌株。
2、5L发酵罐发酵操作流程:
2.1菌种活化与培养:
取上述菌种的甘油菌1mL接入100mL BMGY培养基中,30℃,220r/min(rpm)培养20hr。
2.2接种:
接种量为5%,并加入0.4%已消毒好的PTM1溶液。开始发酵。
2.3初始发酵培养阶段:
菌种经过一段适应期(10-12hr)后进入指数生长期,通过不断加大搅拌转速和通气量满足菌体生长所需的DO>30%,转速每次调高50-100rpm。自动流加25%工业氨水将pH控制在设定值。
2.4甘油补料生长阶段:
初始培养基中底物消耗完(18-24hr)后,开始流加50%甘油,并且使之处于限制性速率。
2.5甲醇诱导阶段:
甘油过渡相菌体生长4~6h后,停止补甘油,维持饥饿状态30min,让甘油彻底耗尽,然后补入甲醇开始诱导。96hr后停止发酵下罐。
步骤3:发酵产物分离纯化
取上述发酵液常规超滤浓缩后,过SP Sepharose FF(GE,cat.17-0729-10)和QSepharose FF(GE,cat.17-0510-10)层析柱纯化。纯化产物用HPLC分析(Waters e2695-2489液相仪,色谱柱:phenomenex,Jupiter,C18,250x 4.6mm,5μm,),纯度大于90%。所得表达前体产物:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO.22
LC-MS(液相质谱)分析分子量为:6074,和理论分子量6074一致。
步骤4:发酵产物的酶切制备、纯化
上述纯化产物用50mM Tris调节pH至pH9.0,用胰蛋白酶(sigma,Cat.T1426)和CPB(Sigma,C9584)酶切。HPLC分析反应进程。待酶切完全后,加入1M HCL调节pH至2以终止反应。反相制备(Jupiter C4,10μm,50×250mm)得以下两个胰岛素产物:
产物一,重组人胰岛素B(1-30),A(1-21)(简称hI):
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT,SEQ ID NO.5
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1
LC-MS分析结果所得产物的分子量为5807,和理论分子量5807.7一致。
产物二,重组人胰岛素B(1-29),R-A(1-21):
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO.78
RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.4
LC-MS分析结果所得产物的分子量为5863,和理论分子量5862.7一致。
步骤5:酶切产物二硫键结构分析
分别取上述制备好的产物一和二,用GluC(Sigma,P6181)37℃酶切反应4h。反应完成后加入1M HCl 2ul终止反应,LC-MS分析产物。结果如下:
人胰岛素B(1-30),A(1-21)二硫键结构分析结果:
片段号 | 肽段 | LC-MS分子量 | 理论分子量 |
I | GIVE | 416 | 416.47 |
II | QCCTSICSLYQLE | 2969 | 2969.39 |
上述结果证实重组人胰岛素B(1-30),A(1-21)二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6、A7、A11和B7位Cys两两配对而成。
人胰岛素B(1-29),R-A(1-21)二硫键结构分析结果:
上述结果证实重组人胰岛素B(1-29),R-A(1-21)二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6、A7、A11和B7位Cys两两配对而成。
实施例2、重组人胰岛素B(1-29),A(1-21)的制备
步骤1:重组人胰岛素B(1-29),A(1-21)前体的克隆和表达
1、重组人胰岛素B(1-29),A(1-21)前体的表达载体的构建:
B(1-29),A(1-21)用聚合酶链反应(PCR)的方法进行定点突变完成,由Invitrogen公司合成2单链DNA片段作为定点突变引物序列如下:
引物1:5'CTTCTACACACCCAAGCGTGGCATTGTGGAAC 3'SEQ ID NO.50
引物2:5'GTTCCACAATGCCACGCTTGGGTGTGTAGAAG 3'SEQ ID NO.51
定点突变过程以实施例1最终获得的重组载体为模版,采用KOD试剂盒(TOYOBO,Cat.KOD-201)25μL体系:2.5μL 10×KOD缓冲液,2.5μL 2mM dNTPs,1μL引物1(10μM),1μL引物2(10μM),0.5μL KOD plus,1μL 25mM MgSO4,16μL ddH2O。扩增程序为94℃2min,94℃30sec,55℃30sec,68℃11min,扩增25个循环后,再68℃孵育11min以结束PCR扩增程序。在PCR产物中直接加入DpnI(NEB,Cat.R0176L)1μL消化1hr后,用TOP10感受态细胞转化,得到目的质粒。所得到的重组表达载体送Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、序列分析结果:
由Invitrogen公司对连接的重组质粒作序列分析,得到编码人胰岛素B(1-29),A(1-21)前体产物的基因序列如下:
TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG SEQ ID NO.33。
3、重组人胰岛素B(1-29),A(1-21)前体的表达载体的电转化:
重组人胰岛素前体表达载体的电转化同实施例1。
4、重组人胰岛素B(1-29),A(1-21)前体克隆的G418筛选:
重组人胰岛素前体克隆的G418筛选同实施例1。
5、重组人胰岛素前体克隆插入片段的PCR鉴定:
重组人胰岛素前体克隆插入片段的PCR鉴定同实施例1。为进一步的使用选择了克隆006-15号。
6、重组人胰岛素B(1-29),A(1-21)前体的表达和鉴定:
重组人胰岛素前体的表达鉴定同实施例1。结果表明006-15号克隆表达了目的蛋白,挑选其进行以下发酵。
步骤2:重组人胰岛素B(1-29),A(1-21)前体的发酵
选006-15号克隆发酵。发酵方法同实施例1。
步骤3:发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例1。所得表达前体产物:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO.23。
LC-MS分析分子量为:5844.7,理论分子量为5846.2。
步骤4:发酵产物的酶切制备、纯化
酶切、制备、纯化方法同实施例1。优化酶切反应体系后,反相制备得以下酶切产物:
重组人胰岛素B(1-29),A(1-21)(简称Des(B30)-hI):
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK, SEQ ID NO.78
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为5578,和理论分子量5578一致。
步骤5:酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例1。
人胰岛素B(1-29),A(1-21)二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-29),A(1-21)二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6、A7、A11和B7位Cys两两配对而成。
实施例3、重组人胰岛素B(1-27)-K-E-R,A(1-21)的制备
步骤1:重组人胰岛素B(1-27)-K-E-R,A(1-21)前体的克隆和表达
1、重组人胰岛素B(1-27)-K-E-R,A(1-21)前体的表达载体的构建:
B(1-27)-K-E-R,A(1-21)用聚合酶链反应(PCR)的方法进行定点突变完成,由Invitrogen公司合成2单链DNA片段作为定点突变引物序列如下:
引物1:
5'GGTTTCTTTTACACCAAGGAAAGAGCTGCTAAAGGTATCGTTGAGC 3'
SEQ ID NO.52
引物2:
5'GCTCAACGATACCTTTAGCAGCTCTTTCCTTGGTGTAAAAGAAACC 3'
SEQ ID NO.53
定点突变过程以实施例1最终获得的重组载体为模版,采用KOD试剂盒(TOYOBO,Cat.KOD-201)25μL体系:2.5μL 10×KOD缓冲液,2.5μL 2mM dNTPs,1μL引物1(10μM),1μL引物2(10μM),0.5μL KOD plus,1μL 25mM MgSO4,16μL ddH2O。扩增程序为94℃2min,94℃30sec,55℃30sec,68℃11min,扩增25个循环后,再68℃孵育11min以结束PCR扩增程序。在PCR产物中直接加入DpnI(NEB,Cat.R0176L)1μL消化1hr后,用TOP10感受态细胞转化,得到目的质粒。所得到的重组表达载体送Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、序列分析结果:
由Invitrogen公司对连接的重组质粒作序列分析,得到编码人胰岛素B(1-27)-K-E-R,A(1-21)前体产物的基因序列如下:
TTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCAAGGAAAGAGCTGCTAAAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA SEQ ID NO.34。
3、重组人胰岛素B(1-27)-K-E-R,A(1-21)前体的表达载体的电转化:
同实施例1。
4、重组人胰岛素B(1-27)-K-E-R,A(1-21)前体克隆的G418筛选:
同实施例1。
5、重组人胰岛素B(1-27)-K-E-R,A(1-21)前体克隆插入片段的PCR鉴定:
方法同实施例1。为进一步的使用,选择了克隆064-6号。
6、重组人胰岛素B(1-27)-K-E-R,A(1-21)前体的表达和鉴定:
方法同实施例1,结果表明064-6号克隆表达了目的蛋白。挑选其进行发酵。
步骤2:重组人胰岛素前体的发酵
选064-6号克隆发酵。发酵方法同实施例1。
步骤3:发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例1。所得产物为:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKERAAKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.24。
LC-MS分析分子量为:6147,和理论分子量6147一致。
步骤4:发酵产物的酶切制备、纯化
上述纯化产物用50mM Tris调节pH至pH9.0,用胰蛋白酶(sigma,Cat.T1426)酶切。HPLC分析反应进程。待酶切完全后,加入1M HCl调节pH至2以终止反应。反相制备(Jupiter C4,10μm,50×250mm)得以下酶切产物:
人胰岛素B(1-27)-K-E-R,A(1-21):
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKER, SEQ ID NO.6
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为5894,和理论分子量5894.7一致。
步骤5:酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例1。
人胰岛素B(1-27)-K-E-R,A(1-21)二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-27)-K-E-R,A(1-21)二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6、A7、A11和B7位Cys两两配对而成。
实施例4、重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-21)的制备
步骤1:重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-21)前体的克隆和表达
1、重组人胰岛素前体的表达载体的构建:
B(1-27)-K-E,A(1-21)用聚合酶链反应(PCR)的方法进行定点突变完成,由Invitrogen公司合成2单链DNA片段作为定点突变引物,序列如下:
引物1:5'GGTTTCTTTTACACCAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3'
SEQ ID NO.54
引物2:5'CAACGATACCTCTTTTTTCCTTGGTGTAAAAGAAACC 3'
SEQ ID NO.55。
定点突变过程以实施例1最终获得的重组载体为模版,采用KOD试剂盒(TOYOBO,Cat.KOD-201)25μL体系:2.5μL 10×KOD缓冲液,2.5μL 2mM dNTPs,1μL引物1(10μM),1μL引物2(10μM),0.5μL KOD plus,1μL 25mM MgSO4,16μL ddH2O。扩增程序为94℃2min,94℃30sec,55℃30sec,68℃11min,扩增25个循环后,再68℃孵育11min以结束PCR扩增程序。在PCR产物中直接加入DpnI(NEB,Cat.R0176L)1μL消化1hr后,用TOP10感受态细胞转化,得到目的质粒。所得到的重组表达载体送Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、序列分析结果:
由Invitrogen公司对连接的重组质粒作序列分析,得到编码人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-21)前体产物的基因序列如下:
TTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA SEQ ID NO.35。
3、重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-21)前体的表达载体的电转化:
重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-21)前体的表达载体的电转化同实施例1。
4、重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-21)前体克隆的G418筛选:
重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-21)前体克隆G418筛选同实施例1。
5、重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-21)前体克隆插入片段的PCR鉴定:
重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-21)前体克隆插入片段的PCR鉴定同实施例1。为进一步的使用,选择了克隆062-6号。
6、重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-21)前体的表达和鉴定:
重组人胰岛素前体的表达鉴定同实施例1,结果表明062-6号克隆表达了预期蛋白,挑选其进行以下发酵。
步骤2:重组人胰岛素前体的发酵
选062-6号克隆发酵。发酵方法同实施例1。
步骤3:发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例1。所得产物为:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.25。
LC-MS分析分子量为:6004.91,理论分子量为6006.3。
步骤4:发酵产物的酶切制备、纯化
酶切、制备、纯化方法同实施例1。优化酶切反应体系后,反相制备得以下酶切产物:
人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-21):
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKE SEQ ID NO.7
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为5738.54,和理论分子量5738.8一致。
步骤5:酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例1。
人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-21)二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-21)二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6、A7、A11和B7位Cys两两配对而成。
实施例5、重组人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21)的制备
步骤1:重组人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21)前体的克隆和表达
1、重组人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21)前体的表达载体的构建:
B(1-27)-K-P-E,A(1-21)用聚合酶链反应(PCR)的方法进行定点突变完成,由Invitrogen公司合成2条单链DNA片段作为定点突变引物,序列如下:
引物1:5'GGTTTCTTTTACACCAAGCCTGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3'
SEQ ID NO.56
引物2:5'CAACGATACCTCTTTTTTCAGGCTTGGTGTAAAAGAAACC 3'
SEQ ID NO.57。
定点突变过程以实施例1最终获得的重组载体为模版,采用KOD试剂盒(TOYOBO,Cat.KOD-201)25μL体系:2.5μL 10×KOD缓冲液,2.5μL 2mM dNTPs,1μL引物1(10μM),1μL引物2(10μM),0.5μL KOD plus,1μL 25mM MgSO4,16μL ddH2O。扩增程序为94℃2min,94℃30sec,55℃30sec,68℃11min,扩增25个循环后,再68℃孵育11min以结束PCR扩增程序。在PCR产物中直接加入DpnI(NEB,Cat.R0176L)1μL消化1hr后,用TOP10感受态细胞转化,得到目的质粒。所得到的重组表达载体送Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、序列分析结果:
由Invitrogen公司对连接的重组质粒作序列分析,得到编码人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21)前体产物的基因序列如下:
TTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCAAGCCTGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA SEQ ID NO.36。
3、重组人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21)前体的表达载体的电转化:
重组人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21)前体质粒的电转化同实施例1。
4、重组人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21)前体克隆的G418筛选:
重组人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21)前体克隆的G418筛选同实施例1。
5、重组人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21)前体克隆插入片段的PCR鉴定:
重组人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21)前体克隆插入片段的PCR鉴定同实施例1。为进一步的使用选择了克隆61-5号。
6、重组人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21)前体的表达和鉴定:
重组人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21)前体的表达鉴定同实施例1,结果表明061-5号表达了预期的蛋白,挑选其进行以下发酵。
步骤2:重组人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21)前体的发酵
选061-5号克隆发酵。发酵方法同实施例1。
步骤3:发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例1。所得产物为:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.26。
LC-MS分析分子量为6102,和理论分子量6102一致。
步骤4:发酵产物的酶切制备、纯化
酶切、制备、纯化方法同实施例1。优化酶切反应体系后,反相制备得以下酶切产物:
人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21):
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPE, SEQ ID NO.8
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为5835,和理论分子量5835.7一致。
步骤5:酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例1。
人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21)二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-27)-K-P-E,A(1-21)二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6、A7、A11和B7位Cys两两配对而成。
实施例6、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)的制备
步骤1:重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)前体的克隆和表达
1、重组人胰岛素前体的表达载体的构建:
B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)用聚合酶链反应(PCR)的方法进行定点突变完成,由Invitrogen公司合成单链DNA片段作为定点突变引物,序列如下:
引物1:5'GAGAAAAGATTCGTCAAGCAGCACTTGTGTGG 3'
SEQ ID NO.58
引物2:5'CCACACAAGTGCTGCTTGACGAATCTTTTCTC 3'
SEQ ID NO.59
引物3:5'GTTTCTTTTACACCCCTGAAGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3'
SEQ ID NO.60
引物4:5'CAACGATACCTCTTTTTTCTTCAGGGGTGTAAAAGAAAC 3'
SEQ ID NO.61。
定点突变过程以实施例1最终获得的重组载体为模版,采用KOD试剂盒(TOYOBO,Cat.KOD-201)25μL体系:2.5μL 10×KOD缓冲液,2.5μL 2mM dNTPs,1μL引物1(10μM),1μL引物2(10μM),0.5μL KOD plus,1μL 25mM MgSO4,16μL ddH2O。扩增程序为94℃2min,94℃30sec,55℃30sec,68℃11min,扩增25个循环后,再68℃孵育11min以结束PCR扩增程序。在PCR产物中直接加入DpnI(NEB Cat.R0176L)1μL消化1hr后,用TOP10感受态细胞转化,得到目的质粒。所得到的重组表达载体送Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、序列分析结果:
由Invitrogen公司对连接的重组质粒作序列分析,得到编码人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)前体产物的基因序列如下:
TTCGTCAAGCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTGAAGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA SEQ ID NO.37。
3、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)前体的表达载体的电转化:
重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)前体的表达载体电转化同实施例1。
4、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)前体克隆的G418筛选:
重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)前体克隆的G418筛选同实施例1。
5、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)前体克隆插入片段的PCR鉴定:
重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)前体克隆插入片段的PCR鉴定同实施例1。为进一步的使用选择了070-4号克隆。
6、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)前体的表达和鉴定:
重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)前体的表达鉴定同实施例1。结果表明070-4号表达了预期蛋白。挑选其进行以下发酵。
步骤2:重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)前体的发酵
选070-4号克隆发酵。发酵方法同实施例1。
步骤3:发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例1。所得产物为:
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.21。
LC-MS分析分子量为6117,和理论分子量6117一致。
步骤4:发酵产物的酶切制备、纯化
酶切、制备、纯化方法同实施例1。优化酶切反应体系后,反相制备得以下酶切产物:
人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21):
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE, SEQ ID NO.9
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为5850,和理论分子量5850.7一致。
步骤5:酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例1。
人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6、A7、A11和B7位Cys两两配对而成。
实施例7、重组人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)和B(1-27)-D-K-E,A(1-20)-G的制备
一、重组人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)的制备
步骤1:重组人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)前体的克隆和表达
1、重组人胰岛素前体的表达载体的构建:
B(1-27)-D-K-E,A(1-21)用聚合酶链反应(PCR)的方法进行定点突变完成,由Invitrogen公司合成单链DNA片段作为定点突变引物,序列如下:
引物1:5'GGTTTCTTTTACACCGATAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3'
SEQ ID NO.62
引物2:5'CAACGATACCTCTTTTTTCCTTATCGGTGTAAAAGAAACC 3'
SEQ ID NO.63。
定点突变过程以实施例1最终获得的重组载体为模版,采用KOD试剂盒(TOYOBO,Cat.KOD-201)25μL体系:2.5μL 10×KOD缓冲液,2.5μL 2mM dNTPs,1μL引物1(10μM),1μL引物2(10μM),0.5μL KOD plus,1μL 25mM MgSO4,16μL ddH2O。扩增程序为94℃2min,94℃30sec,55℃30sec,68℃ 11min,扩增25个循环后,再68℃孵育11min以结束PCR扩增程序。在PCR产物中直接加入DpnI(NEB,Cat.R0176L)1μL消化1hr后,用TOP10感受态细胞转化,得到目的质粒。所得到的重组表达载体送Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、序列分析结果:
由Invitrogen公司对连接的重组质粒作序列分析,得到编码人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)前体产物的基因序列如下:
TTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCGATAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA SEQ ID NO.38。
3、重组人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)前体的表达载体的电转化:
重组人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)前体的表达载体的电转化同实施例1。
4、重组人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)前体克隆的G418筛选:
重组人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)前体克隆的G418筛选同实施例1。
5、重组人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)前体克隆插入片段的PCR鉴定:
重组人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)前体克隆插入片段的PCR鉴定同实施例1。为进一步的使用,选择了克隆068-4号。
6、重组人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)前体的表达和鉴定:
重组人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)前体的表达鉴定同实施例1。结果表明068-4号表达了预期蛋白。挑选其进行以下发酵。
步骤2:重组人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)前体的发酵
选068-4号克隆发酵。发酵方法同实施例1。
步骤3:发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例1。所得产物为:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.19。
LC-MS分析分子量为6119.99,和理论分子量6119.5一致。
步骤4:发酵产物的酶切制备、纯化
酶切、制备、纯化方法同实施例1。优化酶切反应体系后,反相制备得以下酶切产物:
人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21):
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE, SEQ ID NO.10
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为5853.6,和理论分子量5853一致。
步骤5:酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例1。
人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6,A7,A11和B7位Cys两两配对而成。
二、重组人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-20)-G的制备
重复重组人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-21)的制备步骤1到步骤3,不同之处在于所用引物及模板:
1、步骤1中所用的定点突变引物,序列如下:
引物1:5'GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3'
SEQ ID NO.66
引物2:5'CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3'
SEQ ID NO.67。
定点突变过程以B(1-27)-D-K-E,A(1-21)的重组载体(SEQ ID NO.38)为模版。
2、步骤2选115-1号克隆发酵。发酵方法同实施例1。
3、步骤3中发酵产物的分离纯化同实施例1。所得产物为:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.77。
4、步骤4中发酵产物的酶切、制备、纯化方法同实施例1。优化酶切反应体系后,反相制备得以下酶切产物:
人胰岛素B(1-27)-D-K-E,A(1-20)-G:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE, SEQ ID NO.10
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2。
5、步骤5中酶切产物二硫键结构分析方法同实施例1,证实本实施例得到的产物构型正确。
实施例8、重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R-R,A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-30)-R,R-A(1-20)-G的制备
步骤1:重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R-R,A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-30)-R,R-A(1-20)-G前体的克隆和表达
1、重组人胰岛素前体的表达载体的构建:
B(1-2)-D-B(4-30)-R-R,A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-30)-R,R-A(1-20)-G前体用聚合酶链反应(PCR)的方法进行定点突变完成,由Invitrogen公司合成4条单链DNA片段作为定点突变引物,序列如下:
引物1:5'GGTTTCTTTTACACCCCTAAGACTAGAAGAGGTATCGTTGAG3'
SEQ ID NO.64
引物2:5'CTCAACGATACCTCTTCTAGTCTTAGGGGTGTAAAAGAAACC3'
SEQ ID NO.65
引物3:5'GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3'
SEQ ID NO.66
引物4:5'CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3'
SEQ ID NO.67。
定点突变过程采用KOD试剂盒(TOYOBO,Cat.KOD-201)25μL体系:2.5μL 10×KOD缓冲液,2.5μL 2mM dNTPs,1μL引物1(10μM),1μL引物2(10μM),0.5μL KOD plus,1μL 25mM MgSO4,16μL ddH2O。扩增程序为94℃2min,94℃30sec,55℃30sec,68℃11min,扩增25个循环后,再68℃孵育11min以结束PCR扩增程序。在PCR产物中直接加入DpnI(NEB,Cat.R0176L)1μL消化1hr后,用TOP10感受态细胞转化,得到目的质粒。所得到的重组表达载体送Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、序列分析结果:
由Invitrogen公司对连接的重组质粒作序列分析,得到编码人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R-R,A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-30)-R,R-A(1-20)-G前体产物的基因序列如下:
TTCGTCGATCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTAAGACTAGAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCGGTTAA SEQ ID NO.39。
3、重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R-R,A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-30)-R,R-A(1-20)-G前体的表达载体的电转化:
重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R-R,A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-30)-R,R-A(1-20)-G前体的表达载体的电转化同实施例1。
4、重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R-R,A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-30)-R,R-A(1-20)-G前体克隆的G418筛选:
重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R-R,A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-30)-R,R-A(1-20)-G前体克隆的G418筛选同实施例1。
5、重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R-R,A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-30)-R,R-A(1-20)-G前体克隆插入片段的PCR鉴定:
重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R-R,A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-30)-R,R-A(1-20)-G前体克隆插入片段的PCR鉴定同实施例1。为进一步的使用,选择了克隆073-16号。
6、重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R-R,A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-30)-R,R-A(1-20)-G前体的表达和鉴定:
重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R-R,A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-30)-R,R-A(1-20)-G前体的表达鉴定同实施例1。结果表明073-16号克隆表达了预期蛋白。挑选其进行以下发酵。
步骤2:重组人胰岛素前体的发酵
选073-16号克隆发酵。发酵方法同实施例1。
步骤3:发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例1。所得产物为:
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG
SEQ ID NO.27。
LC-MS分析分子量为6046.3,和理论分子量6045.96一致。
步骤4:发酵产物的酶切制备、纯化
酶切、制备、纯化方法同实施例3。优化酶切反应体系后,反相制备得以下酶切产物:
产物一:人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R-R,A(1-20)-G:
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR, SEQ ID NO.11
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为6064.8,和理论分子量6063.96一致。
产物二:人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R,R-A(1-20)-G:
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTR, SEQ ID NO.12
RGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.3。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为6064.8,和理论分子量6063.96一致。
步骤5:酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例1。
人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R-R,A(1-20)-G二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R-R,A(1-20)-G二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6、A7、A11和B7位Cys两两配对而成。
人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R,R-A(1-20)-G二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-2)-D-B(4-30)-R,R-A(1-20)-G二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6,A7,A11和B7位Cys两两配对而成。
实施例9、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21)的制备
步骤1:重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21)前体的克隆和表达
1、重组人胰岛素前体的表达载体的构建:
B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21)前体用聚合酶链反应(PCR)的方法进行定点突变完成,由Invitrogen公司合成2条单链DNA片段作为定点突变引物,序列如下:
引物1:5'CTTTTACACCCCTGAAAGAAGAGGTATCGTTGAG 3'
SEQ ID NO.68
引物2:5'CTCAACGATACCTCTTCTTTCAGGGGTGTAAAAG 3'
SEQ ID NO.69。
定点突变过程以实施例6所获得的载体为模版,采用KOD试剂盒(TOYOBO,Cat.KOD-201)25μL体系:2.5μL 10×KOD缓冲液,2.5μL 2mM dNTPs,1μL引物1(10μM),1μL引物2(10μM),0.5μL KOD plus,1μL 25mM MgSO4,16μL ddH2O。 扩增程序为94℃2min,94℃30sec,55℃30sec,68℃11min,扩增25个循环后,再68℃孵育11min以结束PCR扩增程序。在PCR产物中直接加入DpnI(NEB,Cat.R0176L)1μL消化1hr后,用TOP10感受态细胞转化,得到目的质粒。所得到的重组表达载体送Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、序列分析结果:
由Invitrogen公司对连接的重组质粒作序列分析,得到编码人胰岛素
B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21)前体产物的基因序列如下:
TTCGTCAAGCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTGAAAGAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA SEQ ID NO.40。
3、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21)前体的表达载体的电转化:
重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21)前体的表达载体的电转化同实施例1。
4、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21)前体克隆的G418筛选:
重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21)前体克隆的G418筛选同实施例1。
5、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21)前体克隆插入片段的PCR鉴定:
重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21)前体克隆插入片段的PCR鉴定同实施例1。为进一步的使用,选择了克隆072-16号。
6、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21)前体的表达和鉴定:
重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21)前体的表达鉴定同实施例1。结果表明072-16号表达了预期蛋白。挑选其进行以下发酵。
步骤2:重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21)前体的发酵
选072-16号克隆发酵。发酵方法同实施例1。
步骤3:发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例1。所得产物为:
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPERRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO.28。
LC-MS分析分子量为6015.1,和理论分子量6015.93一致。
步骤4:发酵产物的酶切制备、纯化
酶切、制备、纯化方法同实施例3。优化酶切反应体系后,反相制备得以下酶切产物:
人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21):
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPERR, SEQ ID NO.13
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为6064.8,和理论分子量6063.96一致。
步骤5:酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例1。
人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21)二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-R-R,A(1-21)二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6、A7、A11和B7位Cys两两配对而成。
实施例10、重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21)和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-21)的制备
步骤1:重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21)和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-21)前体的克隆和表达
1、重组人胰岛素前体的表达载体的构建:
B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21)和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-21)前体用聚合酶链反应(PCR)的方法进行定点突变完成,由Invitrogen公司合成2条单链DNA片段作为定点突变引物,序列如下:
引物1:5'CTTTTACACCCCTAAGAGAGGTATCGTTGAGCAATG 3'
SEQ ID NO.70
引物2:5'CATTGCTCAACGATACCTCTCTTAGGGGTGTAAAAG 3'
SEQ ID NO.71。
定点突变过程采用KOD试剂盒(TOYOBO,Cat.KOD-201)25μL体系:2.5μL10×KOD缓冲液,2.5μL 2mM dNTPs,1μL引物1(10μM),1μL引物2(10μM),0.5μL KOD plus,1μL 25mM MgSO4,16μL ddH2O。扩增程序为94℃2min,94℃30sec,55℃30sec,68℃11min,扩增25个循环后,再68℃孵育11min以结束PCR扩增程序。在PCR产物中直接加入DpnI(NEB,Cat.R0176L)1μL消化1hr 后,用TOP10感受态细胞转化,得到目的质粒。所得到的重组表达载体送Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、序列分析结果:
由Invitrogen公司对连接的重组质粒作序列分析,得到编码人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21)和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-21)前体产物的基因序列如下:
TTCGTCGATCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTAAGAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCAACTAA
SEQ ID NO.41。
3、重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21)和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-21)前体的表达载体的电转化:
重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21)和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-21)前体的表达载体的电转化同实施例1。
4、重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21)和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-21)前体克隆的G418筛选:
重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21)和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-21)前体克隆的G418筛选同实施例1。
5、重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21)和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-21)前体克隆插入片段的PCR鉴定:
重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21)和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-21)前体克隆插入片段的PCR鉴定同实施例1。为进一步的使用,选择了克隆087-1号。
6、重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21)和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-21)前体的表达和鉴定:
重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21)和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-21)前体的表达鉴定方法同实施例1。结果表明该087-1号克隆表达了预期蛋白。挑选其进行以下发酵。
步骤2:重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21)和B(1-2)-D-B(4-29),
R-A(1-21)前体的发酵
选087-1号克隆发酵。发酵方法同实施例1。
步骤3:发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例1。所得产物为:
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
SEQ ID NO.29。
LC-MS分析分子量为5846.2,和理论分子量5845.74一致。
步骤4:发酵产物的酶切制备、纯化
酶切、制备、纯化方法同实施例3。优化酶切反应体系后,反相制备得以下酶切产物一:
人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21):
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK, SEQ ID NO.14
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为5707.53,和理论分子量5708一致。
步骤3产物,用Lys-C(Sigma,P3428)酶切。反相制备得以下酶切产物二:
人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-21):
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK, SEQ ID NO.14
RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.4。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为5864.5,和理论分子量5863.72一致。
步骤5:酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例1。
人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21)二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-21)二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6、A7、A11和B7位Cys两两配对而成。
人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-21)二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-21)二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6,A7,A11和B7位Cys两两配对而成。
实施例11、重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-20)-G的制备
步骤1:重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-20)-G前体的克隆和表达
1、重组人胰岛素前体的表达载体的构建:
B(1-27)-K-E,A(1-20)-G前体用聚合酶链反应(PCR)的方法进行定点突变完成,由Invitrogen公司合成2条单链DNA片段作为定点突变引物,序列如下:
引物1:5'GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3'
SEQ ID NO.72
引物2:5'CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3'
SEQ ID NO.73。
定点突变过程以实施例4所获得的重组载体为模版,采用KOD试剂盒(TOYOBO,Cat.KOD-201)25μL体系:2.5μL 10×KOD缓冲液,2.5μL 2mM dNTPs,1μL引物1(10μM),1μL引物2(10μM),0.5μL KOD plus,1μL 25mM MgSO4,16μL ddH2O。扩增程序为94℃2min,94℃30sec,55℃30sec,68℃11min,扩增25个循环后,再68℃孵育11min以结束PCR扩增程序。在PCR产物中直接加入DpnI(NEB,Cat.R0176L)1μL消化1hr后,用TOP10感受态细胞转化,得到目的质粒。所得到的重组表达载体送Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、序列分析结果:
由Invitrogen公司对连接的重组质粒作序列分析,得到编码人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-20)-G前体产物的基因序列如下:
TTCGTCAACCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAG SEQ ID NO.42。
3、重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-20)-G前体的表达载体的电转化:
重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-20)-G前体的表达载体的电转化同实施例1。
4、重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-20)-G前体克隆的G418筛选:
重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-20)-G前体克隆的G418筛选同实施例1。
5、重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-20)-G前体克隆插入片段的PCR鉴定:
重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-20)-G前体克隆插入片段的PCR鉴定同实施例1。为进一步的使用,选择了克隆094-4号。
6、重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-20)-G前体的表达和鉴定:
重组人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-20)-G前体的表达鉴定同实施例1。结果表明094-4号表达了预期蛋白。挑选其进行以下发酵。
步骤2:重组人胰岛素前体的发酵
选094-4号克隆发酵。发酵方法同实施例1。
步骤3:发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例1。所得B(1-27)-K-E,A(1-20)-G前体产物为:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG
SEQ ID NO.30。
LC-MS分析分子量为5948,和理论分子量5947.85一致。
步骤4:发酵产物的酶切制备、纯化
酶切、制备、纯化方法同实施例1。优化酶切反应体系后,反相制备得以下酶切产物:
人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-20)-G:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKE, SEQ ID NO.15
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为5681,和理论分子量5681.49一致。
步骤5:酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例1。
人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-20)-G二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-27)-K-E,A(1-20)-G二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6、A7、A11和B7位Cys两两配对而成。
实施例12、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G的制备
步骤1:重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G前体的克隆和表达
1、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G前体的表达载体的构建:
B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G前体用聚合酶链反应(PCR)的方法进行定点突变完成,由Invitrogen公司合成2条单链DNA片段作为定点突变引物,序列如下:
引物1:5'GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3'
SEQ ID NO.74
引物2:5'CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3'
SEQ ID NO.75。
定点突变过程以实施例6所获得的重组载体为模版,采用KOD试剂盒(TOYOBO Cat.KOD-201)25μL体系:2.5μL 10×KOD缓冲液,2.5μL 2mM dNTPs,1μL引物1(10μM),1μL引物2(10μM),0.5μL KOD plus,1μL 25mM MgSO4,16μL ddH2O。扩增程序为94℃2min,94℃30sec,55℃30sec,68℃11min,扩增25个循环后,再68℃孵育11min以结束PCR扩增程序。在PCR产物中直接加入DpnI(NEB Cat.R0176L)1μL消化1hr后,用TOP10感受态细胞转化,得到目的质粒。所得到的重组表达载体送Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、序列分析结果:
由Invitrogen公司对连接的重组质粒作序列分析,得到编码人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G前体产物的基因序列如下:
TTCGTCAAGCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTGAAGAAAAAAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG
SEQ ID NO.43。
3、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G前体的表达载体的电转化:
重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G前体的表达载体的电转化同实施例1。
4、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G前体克隆的G418筛选:
重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G前体克隆的G418筛选同实施例1。
5、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G前体克隆插入片段的PCR鉴定:
重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G前体克隆插入片段的PCR鉴定同实施例1。为进一步的使用,选择了克隆093-15号。
6、重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G前体的表达和鉴定:
重组人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G前体的表达鉴定同实施例1。结果表明093-15号表达了预期蛋白。挑选其进行以下发酵。
步骤2:重组人胰岛素前体的发酵
选093-15号克隆发酵。发酵方法同实施例1。
步骤3:发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例1。所得产物为:
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYC G SEQ ID NO.20。
LC-MS分析分子量为6060,和理论分子量6060一致。
步骤4:发酵产物的酶切制备、纯化
酶切、制备、纯化方法同实施例,1。优化酶切反应体系后,反相制备得以下酶切产物:
人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G:
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE, SEQ ID NO.16
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为5793,和理论分子量5793.6一致。
步骤5:酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例1。
人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6、A7、A11和B7位Cys两两配对而成。
实施例13、重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29),A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-20)-G的制备
步骤1:重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29),A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-20)-G前体的克隆和表达
1、重组人胰岛素前体的表达载体的构建:
B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29),A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-20)-G前体用聚合酶链反应(PCR)的方法进行定点突变完成,由Invitrogen公司合成2条单链DNA片段作为定点突变引物,序列如下:
引物1:5'GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3'
SEQ ID NO.76
引物2:5'CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3'
SEQ ID NO.67。
定点突变过程以实施例10所获得的重组载体为模版,采用KOD试剂盒(TOYOBO,Cat.KOD-201)25μL体系:2.5μL 10×KOD缓冲液,2.5μL 2mM dNTPs,1μL引物1(10μM),1μL引物2(10μM),0.5μL KOD plus,1μL 25mM MgSO4,16μL ddH2O。扩增程序为94℃2min,94℃30sec,55℃30sec,68℃11min,扩增25个循环后,再68℃孵育11min以结束PCR扩增程序。在PCR产物中直接加入DpnI(NEB,Cat.R0176L)1μL消化1hr后,用TOP10感受态细胞转化,得到目的质粒。所得到的重组表达载体送Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、序列分析结果:
由Invitrogen公司对连接的重组质粒作序列分析,得到编码人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29),A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-20)-G前体产物的基因序列如下:
TTCGTCGATCAGCACTTGTGTGGTTCCCATTTGGTTGAGGCTCTGTACTTGGTCTGTGGAGAAAGAGGTTTCTTTTACACCCCTAAGAGAGGTATCGTTGAGCAATGTTGCACCTCTATTTGTTCCCTGTATCAGTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG SEQ ID NO.44。
3、重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29),A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-20)-G前体的表达载体的电转化:
重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29),A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-20)-G前体的表达载体的电转化同实施例1。
4、重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29),A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-20)-G前体克隆的G418筛选:
重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29),A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-20)-G前体克隆的G418筛选同实施例1。
5、重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29),A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-20)-G前体克隆插入片段的PCR鉴定:
重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29),A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-20)-G前体克隆插入片段的PCR鉴定同实施例1。为进一步的使用,选择了克隆096-4号。
6、重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29),A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-20)-G前体的表达和鉴定:
重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29),A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-20)-G前体的表达鉴定同实施例1。结果表明096-4号表达了预期蛋白。挑选其进行以下发酵。
步骤2:重组人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G、B(1-2)-D-B(4-29),A(1-20)-G和B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-20)-G前体的发酵
选096-4号克隆发酵。发酵方法同实施例1。
步骤3:发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例1。所得产物为:
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTP KRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG
SEQ ID NO.31。
LC-MS分析分子量为5789,和理论分子量5788.67一致。
步骤4:发酵产物的酶切制备、纯化
酶切、制备、纯化方法同实施例3。优化酶切反应体系后,反相制备得以下酶切产物一:
人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G:
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKR, SEQ ID NO.17
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为5807,和理论分子量5806.67一致。
酶切、制备、纯化方法同实施例1。优化酶切反应体系后,反相制备得以下酶切产物二:
人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-20)-G:
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK, SEQ ID NO.18
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为5651,和理论分子量5650.48一致。
步骤3(096-4发酵)产物,用与实施例10酶切产物二相同的方法酶切。反相制备得以下酶切产物三:
人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-20)-G:
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK, SEQ ID NO.18
RGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.3。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为5807,和理论分子量5806.7一致。
步骤5:酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例1。
人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6、A7、A11和B7位Cys两两配对而成。
人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),A(1-20)-G二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6、A7、A11和B7位Cys两两配对而成。
人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29),R-A(1-20)-G二硫键结构分析结果:
上述结果证实人胰岛素B(1-2)-D-B(4-29)-R,A(1-20)-G二硫键构型为:一个是A20-B19;另外两个由A6、A7、A11和B7位Cys两两配对而成。
实施例14、B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素(HS061)的制备
1、甲基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OMe的制备
将十六烷二酸(5.0g,17.48mmol)溶于无水甲醇(50mL),用液氮冷却至-10℃后滴加二氯亚砜(3.2mL,43.7mmol),保持-10℃20min,将反应液慢慢升温至回流并保持4hr。停止反应,将反应液冷却至室温后浓缩蒸干,得5.15g(94%)十六烷二酸二甲酯。
将十六烷二酸二甲酯(5.0g,15.92mmol)溶于无水甲醇(50mL),将甲醇溶解的Ba(OH)2·8H2O(5.0g,15.8mmol)溶液滴加到十六烷二酸二甲酯中,将反应液慢慢升温至30℃并将该混合物搅拌24hr。减压浓缩除去甲醇后将残余物溶于乙酸 乙酯并用0.1M HCl洗涤三次,收集有机相并用无水硫酸钠干燥,过滤并减压浓缩,真空干燥得4.55g(收率95%)十六烷二酸单甲酯。
将十六烷二酸单甲酯(2.0g,6.67mmol)溶于DCM(50mL)后加入HOSu(0.92g,8.0mmol),溶解后加入DCC(2.06g,10mmol)室温搅拌24hr。将反应液过滤后用200mL 0.1M HCl洗有机相三次,用无水硫酸钠干燥有机相,过滤并减压浓缩得2.45g(92%)甲基十六烷二酸琥珀酰亚胺酯。
用5mL纯化水溶解H-Glu-OMe(0.81g,5.04mmol)后加入到甲基十六烷二酸琥珀酰亚胺酯(1.0g,2.52mmol)的THF(50mL)溶液中,加入DIEA(0.65g,5.04mmol)室温搅拌24hr。过滤反应液并减压浓缩,用乙酸乙酯溶解残余物后用200mL 0.1M HCl洗涤有机相三次,收集有机相并用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩后进行反相高效液相色谱纯化,浓缩后得0.7g(63%)甲基十六烷二酰-Glu-OMe,ESI-MS:444.3([M+H]+)。
将甲基十六烷二酰-Glu-OMe(0.3g,0.677mmol)溶于DCM(20mL),加入HOSu(85.7mg,0.745mmol)和DCC(0.167g,0.812mmol)后室温搅拌24hr,过滤后用0.1M HCl洗涤并收集有机相,加入无水硫酸钠干燥,过滤后减压浓缩,真空干燥得0.3g(82%)甲基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OMe。其结构式如下。
2、B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素前体的制备
取重组B(1-27)-D-K-E,A(1-21)人胰岛素(50mg,8.5mmol)(实施例7)加入10mL10mM HCl溶解后用0.2M NaOH溶液将其pH调节至约10.5。将甲基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OMe(13.9mg,25.6mmol)溶于10mL乙腈后加入到上述B(1-27)-D-K-E,A(1-21)人胰岛素溶液中开始反应,采用RP-HPLC对反应过程进行中控。40min后用10%HCl将溶液pH调节至约2.2终止反应得前体粗品溶液。
3、B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素前体的纯化
将上述前体粗品溶液加入水稀释使有机相含量约30%(v:v),用0.45μm滤膜过滤后采用RP-HPLC对其进行纯化,其中反相柱为Luna C18,250×25mm,5μm,流动相A为0.1%TFA/H2O,流动相B为0.1%TFA/ACN,在60min内用38%-68%的B相梯度以20mL/min的流速洗脱产物并收集目标产物得前体纯化液,ESI-MS:1570.8([M+4H]4+)。
4、B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素前体的皂化
减压浓缩除去前体纯化液中乙腈后用10%NaOH溶液将其pH调节至8.0,加入等体积冰浴的0.2M NaOH开始皂化,采用RP-HPLC分析皂化产物,反应50min后加入10%HCl终止反应。
5、B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素前体皂化溶液的纯化及冻干
将上述前体皂化溶液加入乙腈稀释使有机相含量约30%(v:v),用0.45μm滤膜过滤后采用RP-HPLC对其进行纯化,其中反相柱为Luna C18,250×25mm,5μm, 流动相A为0.1%TFA/H2O,流动相B为0.1%TFA/ACN,在60min内用35%-65%的B相梯度以20mL/min的流速洗脱产物并收集目标产物,冻干得产物3.6mg(纯度97.9%)。所得产物的结构如下。
6、B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素结构确证
B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素采用ESI-MS测定分子量为6251.65,和理论分子量6251.16一致。
B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素用胰蛋白酶解,酶解产物进行LC-MS分析,结果显示两个片段F1和F2的分子量分别为4865和1403,与理论酶解片段分子量相符,其中片段F2对应被修饰的B-链片段。证明修饰位点和预期一致。
实施例15、B28D-NεB29-(Nα-(HO(CH2)15CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素(HS062)的制备
1、16-羟基十六酰基-Glu(OSu)-OMe的制备
将16-羟基十六烷酸(3.0g,11.03mmol)溶于DCM(50mL)后加入O-(N-琥珀酰亚胺)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯和N,N-二异丙基乙胺(1.71g,13.2mmol),室温搅拌反应24hr。过滤反应液,用0.1M HCl洗涤有机相三次后用无水硫酸钠干燥有机相,减压浓缩得3.5g(70%)16-羟基十六烷酰琥珀酰亚胺基酯。
用5mL纯化水溶解H-Glu-OMe(3.4g,21.64mmol)后加入到16-羟基十六烷酰琥珀酰亚胺基酯的THF(50mL)溶液中,加入DIEA(2.8g,21.64mmol)室温搅拌24hr。过滤反应液并用减压浓缩,用乙酸乙酯溶解残余物后用200mL 0.1M HCl 洗涤有机相三次,收集有机相并用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩后进行反相高效液相色谱纯化,浓缩后得2.5g(45%)16-羟基十六酰基-Glu-OMe,ESI-MS:417([M+H]+)。
将16-羟基十六酰基-Glu-OMe(1.0g,2.4mmol)溶于DCM(20mL),加入HOSu(0.305g,2.65mmol)和EDC·HCl(0.69g,3.61mmol)后室温搅拌24hr。过滤,用0.1M HCl洗涤并收集有机相,加入无水硫酸钠干燥,过滤后减压浓缩,真空干燥得0.9g(73%)16-羟基十六酰基-Glu(OSu)-OMe。其结构式如下。
2、B28D-NεB29-(Nα-(HO(CH2)15CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素前体的制备
取重组B(1-27)-D-K-E,A(1-21)人胰岛素(50mg,8.5mmol)加入10mL 10mM HCl溶解后用0.2M NaOH溶液将其pH调节至约10.5。将16-羟基十六酰基-Glu(OSu)-OMe(13.2mg,25.5mmol)溶于10mL乙腈后加入到上述B(1-27)-D-K-E,A(1-21)人胰岛素溶液中开始反应,采用RP-HPLC对反应过程进行中控。40min后用10%HCl将溶液pH调节至约2.2终止反应得前体粗品溶液。
3、B28D-NεB29-(Nα-(HO(CH2)15CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素前体的纯化
将上述前体粗品溶液加入水稀释使有机相含量约30%(v:v),用0.45μm滤膜过滤后采用RP-HPLC对其进行纯化,其中反相柱为Luna C18,250×25mm,5μm,流动相A为0.1%TFA/H2O,流动相B为0.1%TFA/ACN,在60min内用35%-65%的B相梯度以20mL/min的流速洗脱产物并收集目标产物得前体纯化液,ESI-MS:1563.4([M+4H]4+)。
4、B28D-NεB29-(Nα-(HO(CH2)15CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素前体的皂化
减压浓缩除去前体纯化液中乙腈后用10%NaOH溶液将其pH调节至8.0,加入等体积冰浴的0.2M NaOH开始皂化,采用RP-HPLC分析皂化产物,反应50min后加入10%HCl终止反应。
5、B28D-NεB29-(Nα-(HO(CH2)15CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素前体皂化溶液的纯化及冻干
将上述前体皂化溶液加入乙腈稀释使有机相含量约30%(v:v),用0.45μm滤膜过滤后采用RP-HPLC对其进行纯化,其中反相柱为Luna C18,250×25mm,5μm, 流动相A为0.1%TFA/H2O,流动相B为0.1%TFA/ACN,在60min内用35%-65%的B相梯度以20mL/min的流速洗脱产物并收集目标产物,冻干得产物10mg(纯度94.3%)。所得分子结构式如下。
6、B28D-NεB29-(Nα-(HO(CH2)15CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素结构确证
B28D-NεB29-(Nα-(HOC(CH2)15CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素采用ESI-MS测定分子量为6237.52,和理论分子量6237.17一致。
B28D-NεB29-(Nα-(HOC(CH2)15CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素用胰蛋白酶酶解,酶解产物进行LC-MS分析,结果显示两个片段F1和F2的分子量分别为4865和1389,与理论酶解片段分子量相符,其中片段F2对应被修饰的B-链片段。证明修饰位点和预期一致。
实施例16、Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(B28D-NεB29-B30E人胰岛素))-Lys-OH(HS067)的制备
1、Nα-(甲基十六烷二酰基)-Nε-(3-酰基丙酸-OSu)赖氨酸甲酯的制备
用5mL纯化水溶解H-Lys(Fmoc)-OMe(4.33g,11.29mmol)后加入到甲基十六烷二酸琥珀酰亚胺酯(3.0g,7.55mmol)的THF(50mL)溶液中,加入DIEA(1.46g,11.29mmol)室温搅拌24hr。过滤反应液并用减压浓缩,用乙酸乙酯溶解残余物后用200mL 0.1M HCl洗涤有机相三次,收集有机相并用无水硫酸钠干燥,过滤,减压浓缩后用200mL乙腈:水=10:1(v:v)析晶得5.0g(99.6%)甲基十六烷二酰基-Lys(Fmoc)-OMe。
将甲基十六烷二酰基-Lys(Fmoc)-OMe(5.0g,7.52mmol)用THF(80mL)溶解后加入六氢吡啶(20mL),室温搅拌20min。减压浓缩,所得固体用乙酸乙酯(100mL)溶解后用水洗涤三次,有机相用无水硫酸钠干燥30min。过滤后减压浓缩,所得固体用氯仿(100mL)溶解后加入丁二酸酐(11.34g,113.4mmol)和N,N-二异丙基乙胺(14.1g,113.4mmol),室温搅拌反应2hr。向反应液中加入100℃纯化水(100mL)洗涤三次,有机相用无水硫酸钠干燥30min。过滤,滤液减压浓缩后将所得固体进行反相高效液相色谱纯化,浓缩后得3.45g(84.7%)Nα-(甲基十六烷二酰基)-Nε-(3-酰基丙酸)赖氨酸甲酯,ESI-MS:543.6([M+H]+)。
将Nα-(甲基十六烷二酰基)-Nε-(3-酰基丙酸)赖氨酸甲酯(0.5g,0.9mmol)溶于 DCM(50mL),加入HOSu(0.116g,2.0mmol)和EDC·HCl(0.265g,2.0mmol)后室温搅拌48hr,过滤后用0.1M HCl洗涤并收集有机相,加入无水硫酸钠干燥30min,过滤后减压浓缩,真空干燥得0.36g(63%)Nα-(甲基十六烷二酰基)-Nε-(3-酰基丙酸-OSu)赖氨酸甲酯。其结构式如下。
2、Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(B28D-NεB29-B30E人胰岛素))-Lys-OH前体的制备
取重组B(1-27)-D-K-E,A(1-21)人胰岛素(50mg,8.5mmol)加入10mL 10mM HCl溶解后用0.2M NaOH溶液将其pH调节至约10.5。将Nα-(甲基十六烷二酰基)-Nε-(3-酰基丙酸-OSu)赖氨酸甲酯(16.4mg,25.6mmol)溶于10mL乙腈后加入到上述B(1-27)-D-K-E,A(1-21)重组人胰岛素溶液中开始反应,采用RP-HPLC对反应过程进行中控。40min后用10%HCl将溶液pH调节至约2.2终止反应得前体粗品溶液。
3、Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(B28D-NεB29-B30E人胰岛素))-Lys-OH前体的纯化
将上述前体粗品溶液加入水稀释使有机相含量约30%(v:v),用0.45μm滤膜过滤后采用RP-HPLC对其进行纯化,其中反相柱为Luna C18,250×25mm,5μm,流动相A为0.1%TFA/H2O,流动相B为0.1%TFA/ACN,在60min内用38%-68%的B相梯度以20mL/min的流速洗脱产物并收集目标产物得前体纯化液,ESI-MS:1595([M+4H]4+)。
4、Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(B28D-NεB29-B30E人胰岛素))-Lys-OH前体的皂化
减压浓缩除去前体纯化液中乙腈后用10%NaOH溶液将其pH调节至8.0,加入等体积冰浴的0.2M NaOH开始皂化,采用RP-HPLC分析皂化产物,反应50min后加入10%HCl终止反应。
5、Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(B28D-NεB29-B30E人胰岛素))-Lys-OH前体皂化溶液的纯化及冻干
将上述前体皂化溶液加入乙腈稀释使有机相含量约30%(v:v),用0.45μm滤膜过滤后采用RP-HPLC对其进行纯化,其中反相柱为Luna C18,250×25mm,5μm, 流动相A为0.1%TFA/H2O,流动相B为0.1%TFA/ACN,在60min内用35%-65%的B相梯度以20mL/min的流速洗脱产物并收集目标产物,冻干得产物4.0mg(纯度94.5%)。所得分子结构式如下。
6、Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(B28D-NεB29-B30E人胰岛素))-Lys-OH结构确证
Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(B28D-NεB29-B30E人胰岛素))-Lys-OH ESI-MS测定分子量为6350.68和理论分子量6350.28一致。
用胰蛋白酶对Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(B28D-NεB29-B30E人胰岛素))-Lys-OH进行酶解并对酶解产物进行LC-MS分析,结果显示两个片段F1和F2的分子量分别为4865和1502,与理论酶解片段分子量相符,其中片段F2对应被修饰的B-链片段。证明修饰位点和预期一致。
实施例17、NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-Des(B30)人胰岛素(HS060)的制备
用重组Des(B30)人胰岛素(50mg,8.76mmol)(实施例2)代替实施例14中B(1-27)-D-K-E,A(1-21)(序列6)人胰岛素,其余方法同实施例14制备NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-Des(B30)人胰岛素。
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-Des(B30)人胰岛素用ESI-MS测定分子量为6103.9,和理论分子量6103.5一致。
NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-Des(B30)人胰岛素用胰蛋白酶酶解,酶解产物进行LC-MS分析,结果显示两个片段F1和F2的分子量分别为4865和1256,与理论酶解片段分子量相符,其中片段F2对应被修饰的B-链片段。证明修饰位点和预期一致。所得分子结构式如下。
实施例18、NεB3-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B29E-B30E人胰岛素(HS605)的制备
用重组B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)人胰岛素(27.2mg,4.65mmol)(实施例6)代替实施例14中B(1-27)-D-K-E,A(1-21)人胰岛素,其余方法同实施例14制备NεB3-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B29E-B30E人胰岛素。
NεB3-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B29E-B30E人胰岛素用ESI-MS测定分子量为6249,和理论分子量6248.23一致。
NεB3-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B29E-B30E人胰岛素用胰蛋白酶酶解,酶解产物进行LC-MS分析,结果显示两个片段F1和F2的分子量分别为5277.2和989,
与理论酶解片段分子量相符,其中片段F1对应被修饰的B-链片段。证明修饰位点和预期一致。所得分子结构式如下。
实施例19、Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(NεB3-B29E-B30E人胰岛 素))-Lys-OH(HS606)的制备
用重组B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)人胰岛素(25mg,4.27mmol)(实施例6)代替实施例16中B(1-27)-D-K-E,A(1-21)人胰岛素,其余方法同实施例16制备Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(NεB3-B29E-B30E人胰岛素))-Lys-OH。
Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(NεB3-B29E-B30E人胰岛素))-Lys-OH用ESI-MS测定分子量为6248,和理论分子量6247.4一致。
Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(NεB3-B29E-B30E人胰岛素))-Lys-OH用胰蛋白酶酶解,酶解产物进行LC-MS分析,结果显示两个片段F1和F2的分子量分别为5376.3和989,与理论酶解片段分子量相符,其中片段F1对应被修饰的B-链片段。证明修饰位点和预期一致。所得分子结构式如下。
实施例20、NεB3-(Nα-(HOC(CH2)15CO)-γ-Glu)-B29E-B30E人胰岛素(HS607)
的制备
用重组B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)人胰岛素(27.2mg,4.65mmol)(实施例6)代替实施例15中B(1-27)-D-K-E,A(1-21)人胰岛素,其余方法同实施例15制备NεB3-(Nα-(HOC(CH2)15CO)-γ-Glu)-B29E-B30E人胰岛素。
NεB3-(Nα-(HOC(CH2)15CO)-γ-Glu)-B29E-B30E人胰岛素用ESI-MS测定分子量为6236,和理论分子量6234.3一致。
NεB3-(Nα-(HOC(CH2)15CO)-γ-Glu)-B29E-B30E人胰岛素用胰蛋白酶酶解,酶解产物进行LC-MS分析,结果显示两个片段F1和F2的分子量分别为5263.2和989,与理论酶解片段分子量相符,其中片段F1对应被修饰的B-链片段。证明修饰位点和预期一致。所得分子结构式如下。
实施例21、NεB3-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B29E-B30E,A21G人胰岛素(HS608)的制备
用重组B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G人胰岛素(24.3mg,4.19mmol)(实施例12)代替实施例14中B(1-27)-D-K-E,A(1-21)人胰岛素,其余方法同实施例14制备NεB3-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B29E-B30E,A21G人胰岛素。
NεB3-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B29E-B30E,A21G人胰岛素用ESI-MS测定分子量为6192.5,和理论分子量6190.5一致。
NεB3-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B29E-B30E,A21G人胰岛素用胰蛋白酶酶解,酶解产物进行LC-MS分析,结果显示两个片段F1和F2的分子量分别为5219.5和989,与理论酶解片段分子量相符,其中片段F1对应被修饰的B-链片段。证明修饰位点和预期一致。所得分子结构式如下。
实施例22、Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(NεB3-B29E-B30E,A21G人胰岛素))-Lys-OH(HS609)的制备
用重组B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G人胰岛素(24.1mg,4.16mmol)(实施例12)代替实施例16中B(1-27)-D-K-E,A(1-21)人胰岛素,其余方法同实施例16制备Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(NεB3-B29E-B30E,A21G人胰岛素))-Lys-OH。
Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(NεB3-B29E-B30E,A21G人胰岛素))-Lys-OH用ESI-MS测定分子量为6289,和理论分子量6289.6一致。
Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(NεB3-B29E-B30E,A21G人胰岛素))-Lys-OH用胰蛋白酶酶解,酶解产物进行LC-MS分析,结果显示两个片段F1和F2的分子量分别为5318.5和989,与理论酶解片段分子量相符,其中片段F1对应被修饰的B-链片段。证明修饰位点和预期一致。所得分子结构式如下。
实施例23、NεB3-(Nα-(HOC(CH2)15CO)-γ-Glu)-B29E-B30E,A21G人胰岛素(HS610)的制备
用重组B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G人胰岛素(24.8mg,4.28mmol)(实施例12)代替实施例15中B(1-27)-D-K-E,A(1-21)人胰岛素,其余方法同实施例15制备NεB3-(Nα-(HOC(CH2)15CO)-γ-Glu)-B29E-B30E,A21G人胰岛素。
NεB3-(Nα-(HOC(CH2)15CO)-γ-Glu)-B29E-B30E,A21G人胰岛素用ESI-MS测定分子量为6177,和理论分子量6176.5一致。
NεB3-(Nα-(HOC(CH2)15CO)-γ-Glu)-B29E-B30E,A21G人胰岛素用胰蛋白酶酶解,酶解产物进行LC-MS分析,结果显示两个片段F1和F2的分子量分别为5205.4和989,与理论酶解片段分子量相符,其中片段F1对应被修饰的B-链片段。证明修饰位点和预期一致。所得分子结构式如下。
实施例24PEG(20KD)化胰岛素的制备
1.B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素的PEG(20KD)化
将50mg B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素溶于25ml水中,用1.0M Na2CO3水溶液调节pH=11.40,再慢慢加入500mg m-PEG-OSu(m-PEG-OSu溶于10ml乙腈和6ml THF的混合溶剂)的溶液,室温搅拌反应2hr。反应结束后用0.1M HCl调节反应体系pH=6.0淬灭反应,减压除去有机溶剂。反应终止后以GE SP-Sepharose阳离子交换凝胶纯化。反应终产物以A液(A液20mM Gly pH3.0,B液:20mM Gly pH3.0 1M NaCl)10倍稀释后上样,再以A液平衡5个柱体积后开始线性梯度洗脱,梯度为0~100%B/20柱体积。收集洗脱峰以10KD截留的超滤浓缩管脱盐并浓缩,得到目标产物,简称PEG(20KD)-156。
2.B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素的PEG(20KD)修饰位置的鉴定
将PEG化前后的B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素用GLu-C酶切,各个酶切产物见下表:
HPLC分析比较各个酶切产物,发现酶切片段F-I,F-II和F-III修饰前后均无改变,而PEG修饰的B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素酶切所得到的F-IV片段疏水性极大增加,从而证实PEG化位置在B29K。其结构如下:
3.PEG化B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)胰岛素的制备同上述步骤1,得到目标产物,简称PEG(20KD)-107。用步骤2所示方法进行鉴定,所得分子以DTT(10mM)还原,检测到A链无变化,B链疏水性大大增加。证实修饰位置在B3K。所得修饰产物的分子结构如下:
实施例25PEG(30KD)化胰岛素的制备
1.B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素的PEG(30KD)化
将50mg B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素溶于25ml水,用1.0M Na2CO3水溶液调节pH=11.40,再慢慢加入750mg m-PEG-OSu(30K)(m-PEG-OSu溶于10ml乙腈和6ml THF的混合溶剂)的溶液,室温搅拌反应2hr。反应结束后用0.1M HCl调节反应体系pH=6.0淬灭反应,减压除去有机溶剂。反应终止后以GESP-Sepharose阳离子交换凝胶纯化。反应终产物以A液(A液20mM Gly pH3.0,B液:20mM Gly pH3.0 1M NaCl)10倍稀释后上样,再以A液平衡5个柱体积后开始线性梯度洗脱,梯度为0~100%B/20柱体积。收集洗脱峰以10KD截留的超滤浓缩管脱盐并浓缩,得到目标产物,简称PEG(30KD)-156。
2.B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素的PEG(30KD)修饰位置的鉴定
将PEG化前后的B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素用GLu-C酶切,各个酶切产物见下表:
HPLC分析比较各个酶切产物,发现酶切片段F-I,F-II,和F-III修饰前后均无改变,而PEG修饰的B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素酶切所得到的F-IV片段疏水性 极大增加,从而证实PEG化位置在B29K。其结构如下:
3.PEG(30KD)化B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)胰岛素的制备同上述步骤1,得到目标产物,简称PEG(30KD)-107。用步骤2所示方法进行鉴定,所得分子以DTT(10mM)还原,检测到A链无变化,B链疏水性大大增加。证实修饰位置在B3K。所得修饰产物的分子结构如下:
实施例26PEG(分支型40KD)化胰岛素的制备
1.B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素的PEG(40KD)化
将50mg B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素溶于25ml水,用1.0M Na2CO3水溶液调节pH=11.40,再慢慢加入1000mg m-PEG-OSu(40K)(m-PEG-OSu溶于10ml乙腈和6ml THF的混合溶剂)的溶液,室温搅拌反应2hr。反应结束后用0.1M HCl调节反应体系pH=6.0淬灭反应,减压除去有机溶剂。反应终止后以GE SP-Sepharose阳离子交换凝胶纯化。反应终产物以A液(A液20mM Gly pH3.0,B液:20mM Gly pH3.0 1MNaCl)10倍稀释后上样,再以A液平衡5个柱体积后开始线性梯度洗脱,梯度为0~100%B/20柱体积。收集洗脱峰以10KD截留的超滤浓缩管脱盐并浓缩,得到目标产物,简称PEG(40KD)-156。
2.B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素的PEG(40KD)修饰位置的鉴定
将PEG化前后的B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素用GLu-C酶切,各个酶切产物见下表:
HPLC分析比较各个酶切产物,发现酶切片段F-I,F-II,和F-III修饰前后均无改变,而PEG修饰的B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素酶切所得到的F-IV片段疏水性极大增加,从而证实PEG化位置在B29K。其结构如下:
3.PEG(40KD)化B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)胰岛素的制备同上述步骤1,得到目标产物,简称PEG(40KD)-107。用步骤2所示方法鉴定,所得分子以DTT(10mM)还原,检测到A链无变化,B链疏水性大大增加。证实修饰位置在B3K。所得修饰产物的分子结构如下:
生物学评价
测试例1:人胰岛素类似物同胰岛素受体(IR)、胰岛素样生长因子受体1(IGF1-R)的结合力测定
本发明的人胰岛素类似物与胰岛素受体及胰岛素样生长因子-1受体的相对结合强度通过受体竞争性结合实验来测定。
表达有胰岛素受体和胰岛素样生长因子-1受体的细胞膜分别从IM-9和H19-7细胞(ATCC)提取。收集5×108个细胞,用PBS洗涤后重悬于细胞裂解液中(50mMTris-HCl,pH7.8,150mM NaCl,蛋白酶抑制剂(Roche)),使细胞密度为6×107个细胞/mL,置于冰上。用电动匀浆器以25000rpm处理10sec,处理两次后低速离心(2000g,15min),收集上清。沉淀部分重悬于适量细胞裂解液中,重复上述匀浆步骤。共重复三次,合并三次上清。将上清高速离心(4℃,35000rpm,60min),去掉上清,将沉淀部分重悬于适量细胞裂解液中,得到实验用膜蛋白。从IM-9细 胞中提取的膜蛋白为胰岛素受体,简称IM-9细胞膜蛋白;从H19-7细胞中提取的膜蛋白为胰岛素样生长因子-1受体,简称H19-7细胞膜蛋白,用Bradford法进行蛋白浓度定量。
在胰岛素受体结合实验中,在96孔板的每个孔加入40μL 125pM的同位素[125I]胰岛素(Perkin Elmer,Cat.No.420010UC),3μg IM-9细胞膜蛋白(50μL)和10μL待测的人胰岛素类似物的梯度稀释溶液。上述溶液都配制在反应液中(50mM Tris-HCl,pH7.8,150mM NaCl,0.1%BSA)。将上述混合液在室温轻轻振摇1hr。孵育好的膜蛋白用FilterMate Havester(Perkin Elmer,Cat.No.S/N:DA12073369)收集到经0.3%的PEI预先湿润的MicroBeta Filtermat B膜上(Perkin Elmer,Cat.No.1450-521)并用反应液洗涤三次后在60℃烘箱干燥1hr。把干燥好的滤膜放入封膜内,加入15mL闪烁液,并密封。最后用Microbeta Plate Counter(Perkin Elmer,Cat.No.1450)读数。
在胰岛素样生长因子-1受体结合实验中,在96孔板的每个孔加入40μL 125pM的同位素[125I]IGF-1,9μg H19-7细胞膜蛋白(50μL)和10μL待测的人胰岛素类似物的梯度稀释溶液。其余步骤与胰岛素受体结合实验相同。
上述实验中得到的数据用Graphpad Prism进行非线性拟合曲线,得到人胰岛素类似物物在胰岛素受体或胰岛素样生长因子-1受体结合竞争实验中的IC50值(nM)。结果见下表。
表1:胰岛素及其类似物同胰岛素受体(IR)、胰岛素样生长因子受体1(IGF1-R)的结合力测定
序列号 | 实施例 | 人胰岛素类似物简码 | IR | IGF1-R |
hI | 1 | B(1-30),A(1-21) | 0.46 | 316.5 |
Des(B30)-hI | 2 | B(1-29),A(1-21) | 0.92 | 134.5 |
5 | 6 | B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21) | 0.45 | 1058 |
6 | 7 | B(1-27)-D-K-E,A(1-21) | 0.19 | 120.9 |
13 | 12 | B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G | 0.24 | >2000 |
注:hI,人胰岛素;Des(B30)-hI,B30缺失人胰岛素,均为阳性对照。
上述结果表明本发明获得的序列的结合力与阳性对照相当,其中B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G和IR的结合力是hI 1.9倍,而它和IGF1-R的结合力不到hI的十分之一,优于阳性对照。
测试例2:人胰岛素类似物体内活性评价
1.实验用ICR雄鼠(购自西普尔·必凯实验动物有限公司),18-20g,实验室环境饲养3天,温度20-25℃;湿度40-60%。
2.实验用药物Humulin R(Lilly Egypt,HRE046,100IU/mL),用0.05N HCl配制成1IU/mL(0.05mg/kg),再用0.9%NaCl稀释成0、0.01、0.02、0.04、0.08、 0.16、0.32、0.64IU/mL溶液。
3.取雄鼠40只,实验前禁食16hr。实验开始时称重后测定基础血糖值(小鼠剪尾,使用罗氏血糖仪及相应的血糖试纸检测,下同),根据血糖值大小随机分为8组,每组5只。每组给药剂量分别为:0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2IU/kg(给药体积为每20g体重100μL)。
4.给药后1hr测定各小鼠的血糖值(mmol/L)。
5.数据分析:将所测得的血糖值以给药前血糖值的百分比表示。采用Graphpad Prism 5绘制药物反应(降血糖)曲线,得到ED50值(IU/kg或mg/kg),即最大降血糖反应的50%所需药物的皮下注射剂量。
6.各人胰岛素类似物ED50值见下表:
表2:人胰岛素类似物体内活性评价
注:相对活性,指各个人胰岛素类似物ED50相对于Des(B30)-hI的活性。每次试验以Des(B30)-hI为对照,Des(B30)-hI的ED50值定为1。
上述结果表明,本发明的人胰岛素类似物体内活性与阳对对照相当,其中B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-20)-G等体内活性比hI(人胰岛素)、Des(B30)-hI(B30缺失人胰岛素)活性提高50%以上,明显优于阳性对照。
测试例3:胰岛素衍生物体内长效效果评价
实验用SD大鼠,雄性,购自西普尔·必凯实验动物有限公司,许可证: SCXK(沪)2008-0016,18-20g,饲养环境:SPF级。取ICR雄鼠,实验室环境饲养3天,温度20-25℃;湿度40-60%。实验前禁食8hr。100mg/kg STZ腹腔注射,完成大鼠糖尿病模型制作,2天后测空腹血糖值,血糖大于11.1mmol/l的大鼠为糖尿病大鼠。实验开始时称重后测定血糖值(剪尾,使用罗氏血糖仪及相应的血糖试纸检测,下同),根据血糖值大小随机分组,每组43只。将实验用药物配成所需浓度,皮下注射给药后在多个时间点测定各大鼠的血糖值。根据血糖值计算长效指数IP(Index of Prolongation)。
阳性对照:
1、Humulin R:重组人胰岛素注射液为礼来公司产品。
2、Detemir:地特胰岛素注射液为诺和诺得公司产品。
3、HS060是诺和诺得公司三期临床分子Degludec,NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-Des(B30)人胰岛素,见实施例17。
待测化合物为胰岛素衍生物,即酰化的人胰岛素类似物,具体如下:
1、HS061,B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E,见实施例14。
2、HS062,B28D-NεB29-(Nα-(HO(CH2)15CO)-γ-Glu)-B30E,见实施例15。
3、HS067,Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(B28D-NεB29-B30E人胰岛素))-Lys-OH,见实施例16。
表3结果表明HS061(IP:117.9)、HS062(IP:112.3)、HS067(IP:132.9)的体内长效活性比Detemir(IP:100)以及HS060(IP:105.9)都要好,特别是HS067维持血糖平稳达到12hr(结果见图3、图4、图5)。
表3:HS060、HS061、HS062及HS067体内长效活性检测结果
测试例4:PEG化胰岛素同胰岛素受体(IR)的结合力测定
一、测试方法同测试例1。
二:待测化合物:
PEG(20KD)化胰岛素:PEG(20KD)-107表示分子量20KD的PEG(20KD)化B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)胰岛素;PEG(20KD)-156表示PEG(20KD)化B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素。具体见实施例24。
三、PEG(20KD)化胰岛素在胰岛素受体结合竞争实验中的IC50值(nM)结果见如下表4,从下表可知本发明的优选序列经PEG化后仍能同胰岛素受体(IR)结合。
表4:PEG化胰岛素同胰岛素受体(IR)的结合力测定
序列号 | 对应实施例 | 胰岛素类似物简码 | IR(nM) |
6 | 24 | PEG(20KD)-107 | 18.8 |
5 | 24 | PEG(20KD)-156 | 71.8 |
测试例5:PEG化胰岛素体内长效效果评价
一:测试方法同测试例3。
二:待测化合物:
1、PEG(20KD)化胰岛素:PEG(20KD)-107表示分子量20KD的PEG(20KD)化B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)胰岛素;PEG(20KD)-156表示PEG(20KD)化B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素。具体见实施例24。
2、PEG(30KD)化胰岛素:PEG(30KD)-107表示PEG(30KD)化B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)胰岛素;PEG(30KD)-156表示PEG(30KD)化B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素。具体见实施例25。
3、PEG(40KD)化胰岛素:PEG(40KD)-107表示PEG(分支型40KD)化B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)胰岛素;PEG(40KD)-156表示PEG(分支型40KD)化B(1-27)-D-K-E,A(1-21)胰岛素。具体见实施例26。
三:测试结果
1、PEG(20KD)化胰岛素体内长效效果评价结果见如下表5、图6。
表5:PEG(20KD)化B(1-27)-D-K-E,A(1-21)和PEG(20KD)化B(1-2)-K-B(4-28)-E-E,A(1-21)胰岛素体内长效活性检测结果
结论:表5结果表明PEG(20KD)-107和PEG(20KD)-156维持血糖平稳时间达到32-46hr,见图6。两者的长效指数(IP)接近,分别为207.36和204.26(见表5),明显优于阳性对照。
2、PEG(30KD)化胰岛素、PEG(40KD)化胰岛素体内长效效果评价结果见如下表6、图7。
表6:PEG(30KD)-107、PEG(40KD)-107、PEG(30KD)-156、PEG(40KD)-156体内长效活性检测结果
结论:表6、图7结果表明,PEG(30KD)-107(IP:282.5)在小鼠体内维持血糖平稳时间达到48hr;PEG(40KD)-107(IP:285.0)在小鼠体内维持血糖平稳时间达到60hr;PEG(30KD)-156(IP:289.8)在小鼠体内维持血糖平稳时间达到56hr;PEG(40KD)-156(IP:297.4)在小鼠体内维持血糖平稳时间达到76hr,明显优于阳性对照。
Claims (31)
1.一种人胰岛素类似物或其生理耐受盐,其具有下式A链和B链序列及结构:
其中,
A0可以是R,也可以缺失;A21可以是N或G;
B3是K;
B27可以是E、T、D、或K;
B28可以是E、D、P或K;
B29是E;B30是E;
B31、B32可以是R或者单个缺失或两者缺失;
当B3、B27-B29是赖氨酸残基时,其ε-氨基可以是被酰化修饰的;
可选地,A及B链N-末端的α-氨基也是被酰化修饰的。
2.如权利要求1所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐,其特征在于,A0缺失。
3.如权利要求1所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐,其特征在于,所述的A链和B链序列选自如下所述的序列组合:
A链:GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1
B链:FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.9
A链:GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2
B链:FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.16。
4.如权利要求1所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐,其特征在于,所述的人胰岛素类似物被PEG化。
5.如权利要求4所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐,其特征在于所述的人胰岛素类似物被PEG所修饰;所述的PEG分子的分子量为5-100KD;所述的PEG分子为支链型或直链型。
6.如权利要求4所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐,其特征在于所述的PEG分子的分子量为10-80KD。
7.如权利要求4所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐,其特征在于所述的PEG分子的分子量为15-45KD。
8.如权利要求4所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐,其特征在于所述的PEG分子的分子量为20-40KD。
9.一种如权利要求1至8任一项所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐的制备方法,包括构建表达载体,转化至宿主细胞中的表达,分离纯化表达前体产物,用化学或/和酶方法从表达前体产物中释放所述的胰岛素类似物;任选人胰岛素类似物被PEG化。
10.一种如权利要求9所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐的制备方法,所述的PEG化化学酰化修饰方法,包括酰化试剂的合成,人胰岛素类似物中氨基的酰化和酰化集团中保护基的脱除。
11.一种用于制备如权利要求1所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐的表达前体产物,其结构通式(I)为:
A-R1-B(I)
其中:
R1为0-5个氨基酸残基肽段,该氨基酸残基肽段由丙氨酸(A)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)组成;
A、B分别为所述胰岛素类似物对应的A链和B链。
12.如权利要求11所述的表达前体产物,其特征在于,所述的表达前体产物选自:
SEQ ID NO.20:
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCG,SEQ ID NO.21:
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEEKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN。
13.一种编码如权利要求11或12所述的表达前体产物的DNA序列。
14.一种含有如权利要求13所述的DNA序列的表达载体。
15.一种用如权利要求14所述的表达载体转化的宿主细胞。
16.如权利要求15所述的宿主细胞,其特征在于,所述的宿主细胞为细菌。
17.如权利要求16所述的宿主细胞,其特征在于,所述的宿主细胞为大肠杆菌。
18.如权利要求15所述的宿主细胞,其特征在于,所述的宿主细胞为酵母菌。
19.如权利要求18所述的宿主细胞,其特征在于,所述的宿主细胞为毕赤酵母或酿酒酵母。
20.一种胰岛素衍生物,其特征在于,在胰岛素A和B-链N-末端的α-氨基或者在B3的赖氨酸残基的ε-氨基处连接了酰化修饰基团,形成了酰化胰岛素,该酰化胰岛素具有如下通式:
S-W-X-Y-Z
其中S为胰岛素,或权利要求1-3之一所述的人胰岛素类似物;
-W-X-Y-Z为人胰岛素类似物的酰化修饰基团,其中W为:
●具有-OC(CH2)mCO-的二酰基结构,其中m为2~10之间的整数,该结构以其羧酸基团之一和母体胰岛素或其类似物的A-链或B-链N-末端氨基酸残基的α-氨基或B-链上存在的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键;
●侧链上带有羧基的α-氨基酸残基或含有侧链上带有羧基的α-氨基酸的2-4肽,其中该残基或肽与母体胰岛素或其类似物的A-链或B-链N-末端氨基酸残基的α-氨基或B-链上存在的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键连接;
X为:
●-CO-;
●含羧酸基团的二氨基化合物,该化合物以其氨基之一与W中的羧基形成酰胺键连接;
a)当W为氨基酸残基或2-4肽时,上述X基团通过-CO-与W上的氨基形成酰胺键,或
b)当W为二酰基结构时,上述X基团以其氨基基团之一与二酰基结构连接;Y为:
●-A(CH2)m-,其中m为6-32的整数,A为不存在或CO-;
●酰基二价烃链,其中含有1、2或3个-CH=CH-基团和足以在链上获得10-32个碳原子总数的-CH2-基团;
●通式-B(CH2)vC6H4(CH2)w-的二价烃链,其中v和w为整数或其中一为0,使得v与w之后在6-30的范围,B为不存在或CO-;
a)当X为CO-时A或B为不存在,或
b)当X为二氨基化合物时A或B为CO-;
Z为:
●-OH;
●-NH2;
●-COOH;
●-SO3H;
●-PO3H。
21.如权利要求20所述的胰岛素衍生物,其中酰化修饰基团-W-X-Y-Z与母体胰岛素B3的赖氨酸残基的ε-氨基连接。
22.如权利要求20所述的胰岛素衍生物,其中酰化修饰基团-W-X-Y-Z与母体胰岛素A和B-链N-末端α-氨基连接。
23.如权利要求20所述的胰岛素衍生物,其中S为人胰岛素类似物,选自以下组:
A链:GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1
B链:FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.9
A链:GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2
B链:FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.16。
24.如权利要求20所述的胰岛素衍生物,其中酰化修饰基团-W-X-Y-Z选自下组中:
Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu;
Nα-(HO(CH2)15CO)-γ-Glu;
Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(3-酰基丙酸*)-Lys,所述的*处为胰岛素连接点。
25.如权利要求20所述的胰岛素衍生物,其选自下组中:
NεB3-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B29E-B30E人胰岛素;
NεB3-(Nα-(HOC(CH2)15CO)-γ-Glu)-B29E-B30E人胰岛素;
Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(NεB3-B29E-B30E人胰岛素))-Lys-OH;
NεB3-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B29E-B30E,A21G人胰岛素;
NεB3-(Nα-(HOC(CH2)15CO)-γ-Glu)-B29E-B30E,A21G人胰岛素;
Nα-(HOOC(CH2)14CO)-Nε-(OCCH2CH2CO-(NεB3-B29E-B30E,A21G人胰岛素))-Lys-OH。
26.一种药物制剂,其含有如权利要求1至8任一项所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐或含有如权利要求20至25任一项所述的胰岛素衍生物。
27.如权利要求26所述的药物制剂,其含有溶解的、非晶型的和/或结晶形式的人胰岛素类似物或其生理耐受盐。
28.如权利要求26所述的药物制剂,其含有长效佐剂,所述的长效佐剂与药物以共结晶的方式存在。
29.一种具有胰岛素活性的可注射的溶液,其含有溶解形式的、如权利要求26所述的药物制剂。
30.一种如权利要求1至8任一项所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐或如权利要求20至25任一项所述的胰岛素衍生物在制备治疗II型糖尿病、高血糖症、肥胖症或胰岛素抵抗症的药物中的用途。
31.一种如权利要求1至8任一项所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐在制备速效和/或长效的具有胰岛素活性的药物制剂中的用途。
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