CN102580073A - 一种多糖和蛋白的偶联物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多糖和蛋白的偶联物。上述多糖和蛋白的偶联物，是由霍乱弧菌脂多糖和霍乱毒素无毒亚单位蛋白偶联而成。所述霍乱弧菌脂多糖来自霍乱弧菌0139。所述霍乱弧菌脂多糖中蛋白含量不大于2％，核酸含量不大于5％，所述霍乱弧菌脂多糖的分子量为8Kd。本发明提供的多糖和蛋白的偶联物的免疫效果高于常用的rBS-WC疫苗、单一的LPS疫苗或单一的CTB疫苗，其即能增强LPS的免疫原性，使诱导的免疫反应具有免疫记忆和加强效应，产生大量的杀菌抗体，适用于各种人群；又能引发机体的粘膜免疫，使肠分泌液和胆汁中大量存在IgA抗体。

Description

一种多糖和蛋白的偶联物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种多糖和蛋白的偶联物。

背景技术

霍乱是一种烈性肠道传染病，由革兰氏阴性霍乱弧菌引起。人类是霍乱弧菌的天然宿主，通过食入被霍乱弧菌污染的水或食物而感染。在感染人群中病死率可在20％以上，全球每年约有12万人死于霍乱。它的流行特点是爆发式，历史上爆发过7次霍乱大流行。开始在数个不同地点同时发生，然后迅速传播流行可累及许多国家并持续多年，尤其在非洲、亚洲和拉丁美洲等一些发展中国家较为严重。而控制它的有效途径之一就是免疫预防接种，因此寻求研制一种适用于各种人群的有效的霍乱疫苗极其重要。

目前致病的霍乱弧菌有01和0139血清型两种。这两种血清型的霍乱弧菌均产生霍乱毒素(CT)，并且其蛋白质分子组成和致病机制均一致。但是，在菌体表面抗原、脂多糖构成、0抗原成分和表层结构有无荚膜等方面，这两种血清型有所不同。目前已有分别针对01和0139霍乱的重组霍乱毒素B亚单位/全菌体(rBS-WC)疫苗和减毒活疫苗。虽然rBS-WC苗具有较好的安全性和稳定性，但存在需给以2次服菌并且对小于2岁的儿童保护力弱的缺点。而减毒活疫苗最大的特点是仅需口服1次，但存在着致腹泻副反应以及潜在的通过基因突变重新获得霍乱毒素与其它毒力基因的可能的弱点。并且研究认为，霍乱保护性免疫主要是由肠道粘膜局部产生和分泌到肠粘膜表面的sIgA抗体介导的，这些抗体通过抑制细菌的定居和繁殖、封闭肠毒素的活性而起保护作用。

已证实霍乱弧菌细胞壁上的脂多糖(LPS)即菌体抗原(0抗原)既是毒力因子又是重要的保护性抗原，能诱导机体产生杀弧菌抗体。但是LPS分子量较小，免疫原性弱，且再次免疫后不能产生免疫加强效应。而CTB是霍乱毒素无毒的B亚单位部分，具有良好的免疫原性，能产生重要的抗毒抗体。并且已经证实CTB是一种很好的粘膜佐剂，能够诱导机体产生粘膜免疫反应。

因此，利用LPS和CTB研制新霍乱疫苗成为一个新的研究方向。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种多糖和蛋白的偶联物。

本发明提供的多糖和蛋白的偶联物，名称为LPS-CTB，是由霍乱弧菌脂多糖和霍乱毒素无毒亚单位蛋白偶联而成。

上述偶联物中，所述霍乱弧菌脂多糖来自霍乱弧菌0139。

上述偶联物中，所述霍乱弧菌脂多糖具有如下至少一种的特征：

1)所述霍乱弧菌脂多糖中蛋白含量不大于2％(质量百分含量)；

2)所述霍乱弧菌脂多糖的核酸含量不大于5％(质量百分含量)；

3)所述霍乱弧菌脂多糖的单体分子量为8Kd。

上述偶联物中，所述霍乱毒素无毒亚单位蛋白的氨基酸序列为序列表中序列1。

上述偶联物中所述霍乱弧菌脂多糖和所述霍乱毒素无毒亚单位蛋白的偶联比为5-40，所述霍乱弧菌脂多糖和所述霍乱毒素无毒亚单位蛋白的偶联比具体为7.636、10.833、26.034或20.300。

上述偶联物中的霍乱弧菌脂多糖采用苯酚法提取，所述苯酚法提取包括如下步骤：

1)将所述霍乱弧菌0139用苯酚水溶液萃取，离心取有机相；

2)先将步骤1)得到的有机相加入无水乙醇至乙醇终浓度为70％、然后依次进行静置、离心取沉淀、沉淀溶于PH值为7.6的2mM MgSO₄-50mM Tris缓冲液、消化，得到消化后产物；

3)将步骤2)得到的消化后产物依次进行透析、透析后溶液一次离心取上清、上清液再次离心收集沉淀，得到霍乱弧菌脂多糖。

上述苯酚法提取的提取方法中，步骤1)中，所述苯酚水溶液为体积百分含量为95％的苯酚水溶液；

所述萃取温度为65℃-68℃，所述萃取时间为25min-35min，

所述萃取温度具体为68℃，所述萃取时间具体为30min，

所述离心的离心力为7000g-7500g，所述离心的时间为0.8小时-1.2小时，所述离心的温度为0℃-10℃；

所述离心的离心力具体为7300g，所述离心的时间具体为1小时，所述离心的温度具体为10℃；

步骤2)中，所述静置的温度为0℃-4℃，所述静置的时间为8小时-12小时，所述静置的温度具体为4℃，所述静置的时间具体为12小时；

所述离心的离心力为7000g-7500g，所述离心的时间为0.8小时-1.2小时，所述离心的温度为0℃-10℃；

所述离心的离心力具体为7300g，所述离心的温度具体为4℃，所述离心时间具体为1小时；

所述消化为先加入DNA酶和RNA酶在37℃消化8小时-12小时，再加入蛋白酶K在37℃温度消化24小时；

所述消化具体为先加入DNA酶和RNA酶在37℃消化12小时，再加入蛋白酶K在37℃温度消化24小时；

步骤3)中，所述透析为先在37℃以2mM MgSO₄-50mM Tris缓冲液为透析液进行24小时的截留分子量为3500道尔顿的透析，再在4℃以水为透析液进行48小时的截留分子量为3500道尔顿的透析，

所述一次离心的离心力为4800g-5200g，所述一次离心的温度为0℃-4℃，所述一次离心的时间为25分钟-35分钟；

所述一次离心的离心力具体为5000g，所述一次离心的温度具体为4℃，所述一次离心的时间具体为30分钟；

所述再次离心的离心力为63000g-65000g，所述再次离心的温度为0℃-10℃，所述再次离心的时间具体为4.5小时-5.5小时；

所述再次离心的离心力具体为64000g，所述再次离心的温度具体为10℃，所述再次离心的时间具体为5小时。

上述苯酚法提取的提取方法中，PH值为7.6的浓度为2mM MgSO₄-50mM Tris缓冲液的制备方法如下：

Tris：购自amresco公司(Solon Ohio，USA)，货号：0497-1kg.分子量：121.1.

1M Tris(pH8.0)的配制：取121.1克Tris，溶于900ml去离子水中，使用浓盐酸调节pH到8.0，然后加水至1000ml。

MgSO₄：购自北京化学试剂公司(北京市东四南大街160号)，货号：7487-88-9.分子量：120.37.

20mM MgSO₄的配制：取无水MgSO₄ 2.4074克，溶入900ml去离子水中，然后加水定容至1000ml。

2mM MgSO₄-50mM Tris缓冲液配方：取1M Tris(pH8.0)20ml，20mM MgSO₄ 100ml，使用盐酸调节pH到7.6，加水定容至1000ml。

上述偶联物中，所述霍乱毒素无毒亚单位蛋白的氨基酸序列为序列表中序列1。

上述偶联物中，所述霍乱弧菌脂多糖和所述霍乱毒素无毒亚单位蛋白的偶联比为5-40，所述霍乱弧菌脂多糖和所述霍乱毒素无毒亚单位蛋白的偶联比具体为7.636、10.833、26.034或20.300。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述的偶联物的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

将上述偶联物中的所述霍乱弧菌脂多糖和所述霍乱毒素无毒亚单位蛋白偶联，得到偶联物；

所述偶联物中所述霍乱弧菌脂多糖和所述霍乱毒素无毒亚单位蛋白的偶联比具体为5-40，所述霍乱弧菌脂多糖和所述霍乱毒素无毒亚单位蛋白的偶联比进一步具体为7.636、10.833、26.034或20.300。

本发明的第三个目的是提供一种霍乱疫苗。

本发明提供了一种霍乱疫苗，其活性成分为上述的偶联物；

本发明的第四个目的是提供一种激发机体产生IgA和/或IgG产品。

本发明提供的一种激发机体产生IgA和/或IgG产品，其活性成分为上述的偶联物。

上述的偶联物在制备霍乱疫苗中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的偶联物在制备激发机体产生IgA和/或IgG产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的实验证明：与目前常用的rBS-WC疫苗相比，该多糖和蛋白的偶联物免疫产生的抗CTB抗体IgA明显高于rBS-WC疫苗免疫产生的抗体IgA，抗CTB抗体IgG与rBS-WC疫苗免疫产生的抗体IgG相当；该偶联物产生了抗LPS抗体IgA和IgG，其中，抗体IgA的抗体滴度能达抗体IgG的4倍，且在多次免疫后，抗体IgA和IgG显著升高。与单一的LPS疫苗或CTB疫苗相比，该偶联物产生的抗体水平有显著性提高。因此，本发明提供的多糖和蛋白的偶联物的免疫效果高于常用的rBS-WC疫苗、单一的LPS疫苗或单一的CTB疫苗，其既能增强LPS的免疫原性，使其由T细胞非依赖抗原成为T细胞依赖抗原，使诱导的免疫反应具有免疫记忆和加强效应，产生大量的杀菌抗体，适用于各种人群；又能引发机体的粘膜免疫，使肠分泌液和胆汁中大量存在IgA抗体(肠分泌液和胆汁中的IgA抗体会出现在粪便中，因此，检测了小鼠的粪便，来说明IgA抗体的存在)。

附图说明

图1为聚丙烯酰胺凝胶电泳检测LPS的电泳图

图2为BCA法检测蛋白含量标准曲线

图3为层析紫外吸光监测图

图4为层析组分SDS-PAGE电泳图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、多糖和蛋白的偶联物的制备

I、脂多糖(LPS)的提取和纯化

一、LPS的提取

LPS的提取方法记载在秦敏，杨国友，周富昌等，甲型副伤寒沙门氏菌LPS提取和O-SP纯化.微生物学免疫学进展，2005，33(01)，27-31，具体如下：

每次取约30g霍乱弧菌0139(购自中国食品药品检定研究院)加入300mL 95％的苯酚水溶液，再加入水至混合物总体积为600mL。将混合的溶液置于68℃水浴震摇30分钟，冰浴冷却，然后于7300×g、10℃离心1小时。取上清液，剩余溶液再加入水至总体积600mL，重复如前所述的68℃水浴和离心步骤。重复操作两次，所取上清液与前一次上清液混合。

混合的上清液再于7300×g、4℃离心1小时，收集上清液后加入无水乙醇至乙醇终浓度为70％(乙醇的作用：使蛋白、核酸、脂多糖溶解度降低，易形成沉淀)，置于4℃12小时。然后混合液于7300×g、4℃离心1小时，倒掉上清液，将沉淀溶于45mL 2mM MgSO₄-50mMTris(pH7.6)缓冲液。在溶液中加入Dnase(购自Sigma，cat#D-5025-100mg)和Rnase(购自北京欣经科，目录号6052-100mg)各7.5mg，置于37℃温箱中12小时。然后加入15mg蛋白酶K(Proteinase K，购自Roche，cat#14059725)在37度消化24小时，将溶液转入透析袋(3500道尔顿)内置于37℃透析24小时，透析时采用的透析液为上述2mM MgSO₄-50mMTris(pH7.6)缓冲液。然后将透析袋放入2L水中，置于4℃透析2天，每12小时换一次水。透析后的溶液于5000×g、4℃离心30分钟。取上清液，于64000×g、10℃离心5小时，倒掉上清液，将沉淀溶于少量的水中，冻干保存，即为LPS。

PH值为7.6的浓度为2mM MgSO₄-50mM Tris缓冲液的制备方法如下：

Tris：购自amresco公司(Solon Ohio，USA)，货号：0497-1kg.分子量：121.1.

1M Tris(pH8.0)的配制：取121.1克Tris，溶于900ml去离子水中，使用浓盐酸调节pH到8.0，然后加水至1000ml。

MgSO₄：购自北京化学试剂公司(北京市东四南大街160号)，货号：7487-88-9.分子量：120.37.

20mM MgSO₄的配制：取无水MgSO₄ 2.4074克，溶入900ml去离子水中，然后加水定容至1000ml。

2mM MgSO₄-50mM Tris缓冲液配方：取1M Tris(pH8.0)20ml，20mM MgSO₄ 100ml，使用盐酸调节pH到7.6，加水定容至1000ml。

二、LPS的指标检测：

将上述获得的LPS进行如下检测：

1、LPS分子量检测

采用14％聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳检测上述步骤获得的LPS，并采用LPS银染法显色。结果如图1所示，O-SP是O-特异性多糖，LPS的电泳图谱呈现不均一的梯形条带，条带的颜色深浅与LPS含量呈正相关性。

霍乱弧菌0139LPS单体分子量的大小约为8Kd。

2、LPS的总核酸检测

用吸紫外分光光度计(型号：DU650，购自美国BECKMAN公司。)检测LPS的总核酸，使用纯净水做参照，测定在OD₂₆₀的吸光值，结果显示：2mg/mL的脂多糖样品吸光值为0.8528，则经过换算DNA(1OD为50μg/ml)含量约为0.8528*50＝42.64μg/mL，即2.1％；RNA(1OD为40μg/ml)含量约为0.8528*40＝34μg/mL，即1.7％。LPS的总核酸含量≤5％。

3、LPS中蛋白质含量检测

采用BCA法测定，BCA法蛋白定量试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，cat#PP1001。具体操作步骤如下：

1)将Solution A摇晃均匀，根据样品数量，按50体积Solution A加1体积Solution B(50∶1)配制适量BCA工作液，充分混匀。

2)完全溶解蛋白标准品(5mg/ml BSA)，取10μl稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。

3)将稀释后标准品(0.5mg/ml BSA)按0，1，2，4，8，12，16，20μl分别加到96孔板中，加标准品稀释液将所有标准品补足到20μl。

4)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。

5)各孔加入200μl BCA工作液，轻轻用加样枪吹打均匀，室温放置2小时。

6)用酶标仪测定A562。

7)根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

结果显示：标准曲线y＝0.0011x+0.0233，R²＝0.9929(图2所示)。2mg/mL的LPS样品A562为0.048，经计算，样品中的蛋白含量为22.45g/mL，LPS中残余的蛋白含量≤2％。

II、重组霍乱毒素B亚单位(CTB)获得

重组霍乱毒素B亚单位(CTB)购自Sigma公司，目录：C9903-2MG，其氨基酸序列为序列表中的序列1。

III、LPS-CTB的制备

一、LPS与CTB的偶联和纯化：

在由步骤I获得的2mL LPS(10mg/mL，溶剂为水)中加入60μl 100mg/mL的1-氰-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)溶液(用乙腈将CDAP配成100mg/mL的溶液，CDAP购自sigma，cat#C2776-500mg)，控制pH5.8，反应30秒。然后加入140μl三乙胺(TEA)(购自北京化学试剂公司)水溶液至pH7.0，反应2分钟。再加入2mL1mg/ml CTB溶液，用0.1M的NaOH调pH8.0，4℃反应8小时。最后加入100ul乙醇胺溶液终止反应。

将反应产物通过Superdex 200凝胶过滤层析柱(GE Healthcare，目录号：17-1043-02)进行纯化，洗脱液为0.2M NaCl(洗脱液的流速1.5ml/min)。检测紫外280nm处的吸光值，收集各洗脱峰对应的物质，结果如图3所示，洗脱下来3个峰，将收集有峰1、2、3的收集管中的样品进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图4所示，收集管14(收集峰2)、18(收集峰2)含有较多13Kd的目的蛋白条带，说明含有CTB，将含有CTB的物质命名为LPS-CTB1(CTB蛋白的理论分子量为13875.08道尔顿，故用蛋白分子量标准进行标注)。

根据LPS-CTB1的制备方法，另外生产制备了3批LPS-CTB，分别命名为LPS-CTB2、LPS-CTB3和LPS-CTB4。

二、LPS-CTB的检测：

将由上述步骤获得的偶联物：LPS-CTB1、LPS-CTB2、LPS-CTB3和LPS-CTB4，进行蛋白质含量及多糖含量的测定。

1、采用BCA法测定偶联物中的蛋白质含量

BCA法蛋白定量试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，cat#PP1001。具体操作同实施例1中的BCA检测蛋白法。

2、采用苯酚-硫酸法测定偶联物中的多糖含量

具体测定方法如下：

1)取250mg葡萄糖溶于250ml水中，制成1mg/ml的葡萄糖标准溶液。

2)分别取10，20，30，40，60，80，100，120，140μl上述标准溶液于9个试管中，加水将所有标准溶液补足2ml。

3)分别取上述糖溶液0.5ml于9个试管中。

4)加适当体积待测样品于空试管中，加水稀释到0.5ml。

5)各试管中加入0.5ml 6％的苯酚溶液，混匀。

6)各试管中加入5ml的浓硫酸。

7)冷却后各取200μl加入96孔板中，测定A490。

8)根据标准曲线计算出样品中的多糖浓度。

经检测，四种LPS-CTB偶联物的多糖和CTB含量的化学组成测定结果如表1所示，偶联比为多糖含量和CTB含量的摩尔比。

表1四种LPS-CTB偶联物的化学组成测定结果

实施例2、动物免疫实验

1、免疫

选取5周龄大的BALB/c小鼠(BALB/C小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。雌性。)随机分为2大组，即腹腔注射组和鼻腔滴注组。每大组又分为5小组，即生理盐水对照组(生理盐水浓度为0.9％(质量百分含量))、LPS(由实施例1获得)免疫组、CTB(由实施例1获得)免疫组、rBS-WC疫苗免疫组(rBS-WC疫苗购自上海联合赛尔生物工程有限公司)和LPS-CTB3(由实施例1获得，记作L-C)免疫组，每小组6只小鼠。

每组小鼠共免疫3次，分别于第1、15和29天(将第一次免疫记作第1天)进行免疫。腹腔注射组每只小鼠每针次注射体积为0.1ml，鼻腔免疫组每只小鼠每次滴注体积为10μl。除生理盐水对照组外，其它组别的每只小鼠进行相应的免疫剂量分别为2.5μg多糖LPS、2.5μg的CTB、含有2.5μg rBS的rBS-WC疫苗(溶剂为水)和含有2.5μg多糖的LPS-CTB(溶剂为水)。

分别于第8、22、36和57天(第8、22、36和57天分别为一免后1周、二免后1周、三免后1周、三免后4周)取小鼠尾静脉血(血清分离后于-70℃保存)。

2、血清学检测

用间接ELISA法测定各组小鼠血清中抗LPS和抗CTB的IgG和IgA抗体水平：包被抗原分别为100μl由实施例1获得的LPS(10μg/ml，溶剂为水)和100μl由实施例1获得的CTB(5μg/ml，溶剂为水)。二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG和IgA(羊抗鼠IgG(HRP标记)购自Santa Cruz，cat#sc-2005；羊抗鼠IgA(HRP标记)购自SantaCruz，cat#sc-3791)。将各组小鼠血清从1∶20开始进行倍比稀释，检测显色后测定A450nm值。以生理盐水对照组小鼠血清OD值作为阴性对照，以免疫组OD值大于阴性对照2倍时的最大稀释倍数记为血清抗体滴度。

间接ELISA法：

1.包被：用0.05M PH9.0碳酸盐包被缓冲液将包被抗原稀释至上述浓度。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml上述稀释后的包被抗原，4℃12小时。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

2.加样：加一定稀释梯度的待检血清0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1.5小时。然后洗涤。(同时做空白孔(去离子水)，阴性对照孔(生理盐水组小鼠血清))。

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml。37℃孵育1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB(可溶型单组分TMB底物溶液购自天根，cat#PA107-01)底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2倍，即为阳性。

试剂

(1)包被缓冲液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液)：Na₂CO₃ 1.59克，NaHCO₃ 2.93克，加蒸馏水至1000ml。

(2)洗涤缓冲液(PH7.4PBST)：KH₂PO₄ 0.24克，Na₂HPO₄·12H₂O 3.58克，NaCl8.0克，KCl 0.2克，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。

(3)稀释液：牛血清白蛋白(BSA)1克加洗涤缓冲液至100ml配成1％溶液使用。

(4)终止液(2M H₂SO₄)：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。

下面的表2-7中的“/”表示在血清原液未检测到相应抗体。

用间接ELISA法检测免疫小鼠后血清抗LPS的IgG和IgA抗体水平，分别如表2、3所示。表中结果显示，仅腹腔注射免疫能诱导血清中产生抗LPS的抗体，而鼻腔滴注免疫采用血清原液也几乎检测不到抗LPS的抗体。腹腔注射免疫组中，单一的LPS免疫小鼠后诱导产生的血清抗IgG和IgA两种抗体水平均没有LPS-CTB偶联物免疫产生的抗体水平高，rBS-wc免疫几乎不产生LPS的抗体，并且只有LPS-CTB偶联物的免疫能产生免疫加强反应，即第二次免疫后与第一次免疫后、第三次免疫后与第二次免疫后相比，血清中抗LPS的IgG和IgA抗体水平均有显著性升高。此外，可以看出LPS-CTB免疫后，血清中抗LPS的IgA抗体水平明显高于IgG。

表2小鼠免疫后血清抗LPS的IgG抗体滴度(腹腔免疫组)

表3小鼠免疫后血清抗LPS的IgA抗体滴度(腹腔免疫组)

与LPS抗体水平类似，用间接ELISA法检测免疫小鼠后血清抗CTB的IgG和IgA抗体水平，分别如表4、5、6、7所示。表中结果显示，腹腔注射免疫和鼻腔滴注免疫均能诱导血清中产生抗CTB的抗体，并且抗体水平都较高。无论腹腔注射还是鼻腔滴注，单一的CTB免疫小鼠后诱导产生的血清抗IgG和IgA两种抗体水平均没有LPS-CTB偶联物免疫产生的抗体水平高。LPS-CTB偶联物免疫产生的IgG抗体水平和rBS-wc免疫组水平相当，而偶联物免疫产生的IgA抗体水平均明显高于rBS-wc组。

表4小鼠免疫后血清抗CTB的IgG抗体滴度(腹腔注射组)

表5小鼠免疫后血清抗CTB的IgG抗体滴度(鼻腔滴注组)

表6小鼠免疫后血清抗CTB的IgA抗体滴度(腹腔注射组)

表7小鼠免疫后血清抗CTB的IgA抗体滴度(鼻腔滴注组)

综上，腹腔免疫的小鼠体内产生了高水平的IgG和IgA抗体，并且抗LPS的IgA抗体滴度最高能达到IgG的4倍，说明本发明的偶联物的免疫效果非常有效。

3、粪便检测

于第36天(三免后1周)取各组小鼠的粪便，每组称取200mg溶于5ml PBS(PBS：0.24g KH₂PO₄，1.44g Na₂HPO₄，8g NaCl，0.2g KCl，加蒸馏水至1000ml。)中。用吸管吹打，置于4℃摇床上翻滚旋转30分钟。然后于4000r的转速离心5分钟，取上清作为待测液。ELISA检测步骤同血清检测相同。由于实际操作不便于做各只小鼠的粪便分析，实验中将各组小鼠的粪便混合进行检测。以盐水组小鼠粪便的OD值作为阴性对照，阴性对照OD值的2倍，即判定为阳性，以OD值大于阴性对照2倍时的最大稀释倍数记为抗体滴度。

经检测，LPS-CTB3组40mg/ml的小鼠粪便溶液中检测到抗LPS的IgA抗体滴度大约为1∶40，抗CTB的IgA抗体滴度大约为1∶80，说明该LPS-CTB结合物能有效诱导小鼠机体产生抗LPS和CTB的抗体，这是对霍乱免疫极为重要的分泌型IgA抗体。

采用上述方法检测由实施例1获得LPS-CTB1、LPS-CTB2、LPS-CTB4，结果与LPS-CTB3无显著差异。

Claims (10)

1.一种多糖和蛋白的偶联物，由霍乱弧菌脂多糖和霍乱毒素无毒亚单位蛋白偶联而成。

2.根据权利要求1所述的偶联物，其特征在于：所述霍乱弧菌脂多糖来自霍乱弧菌0139。

3.根据权利要求1或2所述的偶联物，其特征在于：所述霍乱弧菌脂多糖具有如下至少一种的特征：

1)所述霍乱弧菌脂多糖中蛋白含量不大于2％(质量百分含量)；

2)所述霍乱弧菌脂多糖的核酸含量不大于5％(质量百分含量)；

3)所述霍乱弧菌脂多糖的单体分子量为8Kd。

4.根据权利要求1-3中任一所述的偶联物，其特征在于：

所述霍乱毒素无毒亚单位蛋白的氨基酸序列为序列表中序列1。

5.根据权利要求1-4中任一所述的偶联物，其特征在于：所述偶联物中的所述霍乱弧菌脂多糖和所述霍乱毒素无毒亚单位蛋白的偶联比为5-40，所述霍乱弧菌脂多糖和所述霍乱毒素无毒亚单位蛋白的偶联比具体为7.636、10.833、26.034或20.300。

6.根据权利要求1-5中任一所述的偶联物，其特征在于：

所述霍乱弧菌脂多糖采用苯酚法提取；

所述苯酚法提取具体包括如下步骤：

1)将所述霍乱弧菌0139用苯酚水溶液萃取，离心取有机相；

2)先将步骤1)得到的有机相加入无水乙醇至乙醇终浓度为70％、然后依次进行静置、离心取沉淀、沉淀溶于PH值为7.6的2mM MgSO₄-50mM Tris缓冲液、消化，得到消化后产物；

3)将步骤2)得到的消化后产物依次进行透析、透析后溶液一次离心取上清、上清液再次离心收集沉淀，得到霍乱弧菌脂多糖。

7.根据权利要求1-6中任一所述的偶联物，其特征在于：

步骤1)中，所述苯酚水溶液为体积百分含量为95％的苯酚水溶液；

所述萃取温度为65℃-68℃，所述萃取时间为25min-35min，

所述萃取温度具体为68℃，所述萃取时间具体为30min，

所述离心的离心力为7000g-7500g，所述离心的时间为0.8小时-1.2小时，所述离心的温度为0℃-10℃；

所述离心的离心力具体为7300g，所述离心的时间具体为1小时，所述离心的温度具体为10℃；

步骤2)中，所述静置的温度为0℃-4℃，所述静置的时间为8小时-12小时，所述静置的温度具体为4℃，所述静置的时间具体为12小时；

所述离心的离心力为7000g-7500g，所述离心的时间为0.8小时-1.2小时，所述离心的温度为0℃-10℃；

所述离心的离心力具体为7300g，所述离心的温度具体为4℃，所述离心时间具体为1小时；

所述消化为先加入DNA酶和RNA酶在37℃消化8小时-12小时，再加入蛋白酶K在37℃温度消化24小时；

所述消化具体为先加入DNA酶和RNA酶在37℃消化12小时，再加入蛋白酶K在37℃温度消化24小时；

步骤3)中，所述透析为先在37℃以2mM MgSO₄-50mM Tris缓冲液为透析液进行24小时的截留分子量为3500道尔顿的透析，再在4℃以水为透析液进行48小时的截留分子量为3500道尔顿的透析，

所述一次离心的离心力为4800g-5200g，所述一次离心的温度为0℃-4℃，所述一次离心的时间为25分钟-35分钟；

所述一次离心的离心力具体为5000g，所述一次离心的温度具体为4℃，所述一次离心的时间具体为30分钟；

所述再次离心的离心力为63000g-65000g，所述再次离心的温度为0℃-10℃，所述再次离心的时间具体为4.5小时-5.5小时；

所述再次离心的离心力具体为64000g，所述再次离心的温度具体为10℃，所述再次离心的时间具体为5小时。

8.一种制备权利要求1-7中任一所述的偶联物的方法，包括如下步骤：

将权利要求1-7中任一所述偶联物中的所述霍乱弧菌脂多糖和所述霍乱毒素无毒亚单位蛋白偶联，得到偶联物；

所述偶联物中所述霍乱弧菌脂多糖和所述霍乱毒素无毒亚单位蛋白的偶联比具体为5-40，所述霍乱弧菌脂多糖和所述霍乱毒素无毒亚单位蛋白的偶联比进一步具体为7.636、10.833、26.034或20.300。

9.一种霍乱疫苗，其活性成分为权利要求1-7中任一所述的偶联物；

或一种激发机体产生IgA和/或IgG产品，其活性成分为权利要求1-7中任一所述的偶联物。

10.权利要求1-7中任一所述的偶联物在制备霍乱疫苗中的应用；

或权利要求1-7中任一所述的偶联物在制备激发机体产生IgA和/或IgG产品中的应用。

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