CN102558306A - 用于防治旋毛虫病的抗原表位、其组合物及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫生物学领域，涉及用于防治旋毛虫病的抗原表位、其组合物及用途。具体地，本发明涉及一种抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1-4中任一项所示。本发明的抗原表位具有效的旋毛虫减虫率，从而具有作为防治旋毛虫感染或其所致疾病的药物(例如疫苗)的潜力。
Description
技术领域
本发明属于免疫生物学领域，涉及用于防治旋毛虫病的抗原表位、其组合物及用途。
背景技术
旋毛虫病是一种呈全球性分布的人兽共患寄生虫病。人的感染主要来源于高致病性的旋毛形线虫(Pozio E.World distribution ofTrichinella spp.infections in animals and humans.[J].VetParasitol，2007，149(1-2)：3-21.)。由于旋毛虫病临床症状复杂，包括腹泻，发热，肌痛，水肿等，令其难以正确诊断，给及时的药物治疗造成了一定困难且药物治疗不能解决该虫的反复感染问题(Gottstein B，Pozio E，Nockler K.Epidemiology，diagnosis，treatment，and control of trichinellosis.[J].Clin MicrobiolRev，2009，22(1)：127-145.)。旋毛虫病的流行，不仅直接威胁着人类的身体健康，而且对畜牧业、肉食品业以及外贸出口等造成重大经济损失，是我国“十一五”期间重点攻克的食源性寄生虫病之一。
副肌球蛋白(paramyosin，Pmy)是多种无脊椎动物主要的结构蛋白，在寄生性蠕虫的不同发育阶段呈持续性表达，是参与肌肉收缩的粗肌丝的主要成分(Epstein HF，Miller DR，Ortiz I，et al.Myosinand paramyosin are organized about a newly identified corestructure[J].J Cell Biol，1985，100(3)：904-915.)。在某些寄生蠕虫的非肌肉部位，如体表、消化道和生殖道也有副肌球蛋白的分布(Zhao Q P，Moon S U，Na B K，et al.Paragonimus westermani：biochemical and immunological characterizations ofparamyosin.[J].Exp Parasitol，2007，115(1)：9-18.Matsumoto Y，Perry G，Levine R J，et al.Paramyosin and actinin schistosomal teguments[J].Nature，1988，333(6168)：76-78.)。副肌球蛋白同时也是免疫调节分子，在寄生性蠕虫与宿主的相互作用中发挥重要功能(Loukas A，Jones M K，King L T，et al.Receptorfor Fc on the surfaces of schistosomes.[J].InfectImmun，2001，69(6)：3646-3651.Deng J，Gold D，Loverde P T，et al.Inhibition of the complement membrane attack complex bySchistosoma mansoni paramyosin.[J].Infect Immun，2003，71(11)：6402-6410.)。旋毛虫的副肌球蛋白基因(Ts-Pmy GenBankaccession No.：EF429310)全长为2996bp，其开放读码框架(ORF)2655bp，编码885个氨基酸，理论分子量为102kDa。
但是目前对旋毛虫副肌球蛋白的抗原表位的研究尚不深入。使用旋盘尾丝虫感染病人的血清对犬恶丝虫副肌球蛋白的表位作图研究显示，感染血清主要识别副肌球蛋白分子的氨基端(Steel C，Limberger R J，Mcreynolds L A，et al.B cell responses toparamyosin.Isotypic analysis and epitope mapping of filarialparamyosin in patients with onchocerciasis.[J].JImmunol，1990，145(11)：3917-3923)，而在日本血吸虫和猪带绦虫的相关研究显示，感染血清主要识别蛋白的羧基端(Vazquez-TalaveraJ，Solis C F，Medina-Escutia E，et al.Human T and B cell epitopemapping of Taenia solium paramyos in.[J].Parasite Immunol，2001，23(11)：575-579.Nara T，Tanabe K，Mahakunkijcharoen Y，etal.The B cell epitope of paramyosin recognized by a protectivemonoclonal IgE antibody to Schistosoma japonicum[J].Vaccine，1997，15(1)：79-84.)。之所以识别不同的部位，可能是由于线虫纲与吸虫和绦虫纲的副肌球蛋白优势表位的分布有所不同。
故此，尚需要开发新的抗体和抗原表位，以期对旋毛虫感染及其所致疾病进行有效地防治。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，发现将Ts-Pmy分三段表达部分重叠的蛋白片段(rTs-Pmy-N1-322aa、rTs-Pmy-M 286-600aa、和rTs-Pmy-C 571-885aa)，与感染后27-45天的小鼠混合血清进行识别，发现其中主要识别副肌球蛋白的是N端片段(rTs-Pmy-N1-322aa)。本发明人基于该N端片段进行副肌球蛋白抗原分子表位的研究，得到了抗原表位。本发明人惊奇地发现，得到的抗原表位具有有效的旋毛虫减虫率，从而具有作为防治旋毛虫感染或其所致疾病的药物(例如疫苗)的潜力。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种抗原表位，其具有SEQ ID NO：1-4中任一项所述的氨基酸序列：
ALSTPTFSTLPA (SEQ ID NO：1)
LPWHFKSRHRYQ (SEQ ID NO：2)
SHWNSHSTPARA (SEQ ID NO：3)
LSTPYSKSQAST (SEQ ID NO：4)。
在本发明的一个实施方案中，所述抗原表位的氨基酸序列如SEQID NO：1-4中任一项所示。
所述抗原表位可以通过人工化学合成的方式得到，也可以本领域技术人员知晓的其它生物化学或者分子生物学的方法得到。
本发明的还涉及一种多肽，其具有SEQ ID NO：1-4中任一项所述的氨基酸序列。
本发明的再一方面涉及一种核苷酸序列，其编码本发明任一项所述的抗原表位；具体地，所述核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8-11中任一项所示：
GCGCTGAGTACTCCGACTTTTTCGACTCTGCCTGCG (SEQ ID NO：8)
CTTCCGTGGCATTTTAAGTCGCGTCATACGTATCAG (SEQ ID NO：9)
TCTCATTGGAATAGTCATTCGACTCCTGCGCGTGCG (SEQ ID NO：10)
CTGTCGACGCCTTATTCGAAGTCTCAGGCGTCGACT (SEQ ID NO：11)。
本发明的另一方面涉及一种抗原，其具有本发明任一项所述的抗原表位；具体地，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
MSLYRSPSASVMRSASMLSRSGGFDAYGFGGYGAPSLNVADLGSLTRLEDKIRLLQDDLETERELRNRIERERADLSCQLISLTDRLEEAEGTTDAQIDANRKRESELQKLRKILEDSQLESEDSLNQLRKKHQESLLDYQQQIEQLQKKNSKIDRERQRLQHEVIELTAGIDQMQKDKHAAEKAAEKHEAHARELQNRVDDLAKNLNDLASQRQRLQQENNDLMKELHDVKVQMENIQHVKTQLAQQLEEARRRLEDAERERSQMQTQLHQMQLELDSIQGALEEESSARAEAEHKLSLANTEISQWKSKFDAEVSLHQEE (SEQ ID NO：16)
本发明的还一方面涉及编码本发明的抗原的核苷酸序列；具体地，所述抗原的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
ATGTCTCTGTATCGCAGTCCCAGTGCGTCAGTGATGAGATCAGCAAGCATGCTCAGCCGAAGTGGCGGATTCGATGCTTACGGATTTGGAGGTTACGGTGCGCCAAGCCTCAACGTTGCCGACTTGGGTTCTTTGACCAGACTCGAGGATAAAATTCGCCTGCTTCAAGATGATTTGGAAACGGAAAGAGAATTGCGAAACCGAATTGAACGCGAACGTGCCGATTTGTCCTGCCAACTGATCAGCTTAACCGATCGATTGGAAGAGGCTGAAGGAACCACCGATGCCCAGATCGACGCCAATCGAAAGCGTGAATCCGAATTGCAAAAGTTGAGAAAAATATTGGAAGATTCGCAATTGGAAAGCGAAGATTCGCTGAACCAGCTGCGCAAGAAGCACCAAGAATCCCTTTTAGATTATCAGCAGCAAATTGAACAACTTCAAAAGAAAAATAGCAAAATCGACAGAGAACGACAACGTTTGCAGCATGAAGTCATTGAACTTACTGCCGGAATTGATCAGATGCAAAAAGACAAGCATGCCGCGGAAAAAGCTGCCGAAAAGCACGAAGCGCATGCCAGAGAGCTTCAGAACAGAGTTGACGATCTGGCAAAAAATTTGAACGACCTGGCCTCGCAGCGTCAACGTCTGCAACAGGAAAACAACGATTTGATGAAAGAGTTGCACGATGTCAAAGTGCAAATGGAAAATATTCAACACGTCAAGACTCAACTTGCTCAACAGCTCGAAGAAGCACGTCGTCGACTCGAAGATGCGGAACGTGAACGTTCGCAAATGCAAACCCAGTTGCATCAGATGCAGCTGGAATTGGATTCAATTCAAGGTGCGTTGGAAGAGGAATCGTCCGCACGTGCCGAAGCAGAGCACAAATTGTCGTTGGCAAATACGGAAATTTCCCAGTGGAAGAGCAAATTCGACGCCGAAGTTTCACTCCACCAAGAAGAA (SEQ ID NO：15)
本发明的再一方面涉及一种重组载体，其含有本发明任一项所述的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，所述重组载体为重组表达载体。
可以将本发明的任一项的核苷酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体，该载体可以包括1或多个方便的限制位点，以便在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者，可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时，可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。
其中，术语“调控序列”定义为包括表达本发明的抗原表位所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码多肽(抗原表位)的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导多肽的表达。
重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。
本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明任一项所述的重组载体。
可将包含本发明之核酸序列的重组载体导入宿主细胞，从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于多肽编码基因及其来源。
宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如细菌或酵母细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。
本发明的再一方面涉及一种抗原表位偶联物，包括抗原表位和偶联部分，其中，所述抗原表位为本发明任一项所述的抗原表位，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、和生物素中的一种或多种；具体地，所述偶联部分为载体蛋白BSA或KLH。
本发明的再一方面涉及一种组合物，其包含一种或多种本发明的抗原表位，和/或一种或多种本发明的抗原，和/或一种或多种本发明的抗原表位偶联物；具体地，所述组合物为疫苗组合物。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的抗原表位或者本发明任一项所述的抗原或者本发明任一项所述的抗原表位偶联物在制备治疗和/或预防旋毛虫感染的药物中的用途。
实施例6的数据显示，本发明的抗原表位具有有效的旋毛虫减虫率，能够有效地防治旋毛虫感染或旋毛虫感染所致疾病，具有作为防治旋毛虫感染或其所致疾病的药物(例如疫苗)的潜力。
本发明的再一方面涉及一种抗体，其能够特异性地结合本发明任一项所述的抗原表位或者本发明任一项所述的抗原或者本发明任一项所述的抗原表位偶联物。
在本发明中，术语“特异性结合”具有免疫学的一般含义，例如抗原抗体间的结合。
本发明的再一方面涉及一种抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部分，其中，所述抗体部分为本发明任一项所述的抗体，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、和生物素中的一种或多种。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的抗体偶联物；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。
本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包含本发明任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的抗体偶联物。在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒为旋毛虫感染或旋毛虫感染所致疾病的检测或诊断试剂盒。
本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的抗体偶联物在制备治疗和/或预防旋毛虫感染的药物中的用途。
发明的有益效果
本发明的抗原表位具有效的旋毛虫减虫率，从而具有作为防治旋毛虫感染或其所致疾病的药物(例如疫苗)的潜力。
附图说明
图1：SDS-PAGE鉴定纯化的腹水8F12mAb。1，低分子量蛋白marker；2，8F12株未纯化腹水；3，8F12株柱纯化后抗体。注：65kDa处的杂带应该是血清中白蛋白的位置，含量很大，所以纯化中很难完全去除。
图2：8F12抗体亲和力常数测定。注：C。为抗体初始浓度，C为抗体稀释后浓度。
图3：mAb 8F12及自然感染血清抗旋毛虫感染的被动免疫保护性。肌幼虫虫荷(LPG)为每克肌肉的肌幼虫数。以均数±标准差(n＝6)表示。注：**是与PBS对照组比较，p＜0.01。
图4：mAb 8F12与阳性噬菌体克隆的特异性识别(ELISA法鉴定)。以野生噬菌体M13作为阴性对照，BSA包被孔用以排除交叉反应。
图5：mAb 8F12与阳性噬菌体克隆的特异性识别(Western blot)
泳道1：噬菌体克隆8JJ；泳道2：噬菌体克隆8A1；
泳道3：噬菌体克隆8A9；泳道4：噬菌体克隆8F1；
泳道5：噬菌体克隆8F6；泳道6：噬菌体克隆8F7；
泳道7：噬菌体克隆8F10；泳道8：M13野生噬菌体克隆。
图6：合成多肽与mAb 8F12特异性结合的ELISA检测(多肽偶联载体BSA包被)。注：mAb 5A3作为无关腹水对照。
图7：各组免疫小鼠的肌幼虫数。注：与KLH对照组比较，**p＜0.01，*p＜0.05。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：rTs-Pmy-N1-322aa蛋白的制备
如下面的步骤1-6顺序所示。
1.Ts-Pmy-N1-322aa基因片段的扩增
根据副肌球蛋白基因(Ts-Pmy GenBank accession No.：EF429310)读码框序列，可得到Ts-Pmy-N1-322aa的核苷酸序列，如下：
ATGTCTCTGTATCGCAGTCCCAGTGCGTCAGTGATGAGATCAGCAAGCATGCTCAGCCGAAGTGGCGGATTCGATGCTTACGGATTTGGAGGTTACGGTGCGCCAAGCCTCAACGTTGCCGACTTGGGTTCTTTGACCAGACTCGAGGATAAAATTCGCCTGCTTCAAGATGATTTGGAAACGGAAAGAGAATTGCGAAACCGAATTGAACGCGAACGTGCCGATTTGTCCTGCCAACTGATCAGCTTAACCGATCGATTGGAAGAGGCTGAAGGAACCACCGATGCCCAGATCGACGCCAATCGAAAGCGTGAATCCGAATTGCAAAAGTTGAGAAAAATATTGGAAGATTCGCAATTGGAAAGCGAAGATTCGCTGAACCAGCTGCGCAAGAAGCACCAAGAATCCCTTTTAGATTATCAGCAGCAAATTGAACAACTTCAAAAGAAAAATAGCAAAATCGACAGAGAACGACAACGTTTGCAGCATGAAGTCATTGAACTTACTGCCGGAATTGATCAGATGCAAAAAGACAAGCATGCCGCGGAAAAAGCTGCCGAAAAGCACGAAGCGCATGCCAGAGAGCTTCAGAACAGAGTTGACGATCTGGCAAAAAATTTGAACGACCTGGCCTCGCAGCGTCAACGTCTGCAACAGGAAAACAACGATTTGATGAAAGAGTTGCACGATGTCAAAGTGCAAATGGAAAATATTCAACACGTCAAGACTCAACTTGCTCAACAGCTCGAAGAAGCACGTCGTCGACTCGAAGATGCGGAACGTGAACGTTCGCAAATGCAAACCCAGTTGCATCAGATGCAGCTGGAATTGGATTCAATTCAAGGTGCGTTGGAAGAGGAATCGTCCGCACGTGCCGAAGCAGAGCACAAATTGTCGTTGGCAAATACGGAAATTTCCCAGTGGAAGAGCAAATTCGACGCCGAAGTTTCACTCCACCAAGAAGAA (SEQ ID NO：15)
其编码的氨基酸序列如下：
MSLYRSPSASVMRSASMLSRSGGFDAYGFGGYGAPSLNVADLGSLTRLEDKIRLLQDDLETERELRNRIERERADLSCQLISLTDRLEEAEGTTDAQIDANRKRESELQKLRKILEDSQLESEDSLNQLRKKHQESLLDYQQQIEQLQKKNSKIDRERQRLQHEVIELTAGIDQMQKDKHAAEKAAEKHEAHARELQNRVDDLAKNLNDLASQRQRLQQENNDLMKELHDVKVQMENIQHVKTQLAQQLEEARRRLEDAERERSQMQTQLHQMQLELDSIQGALEEESSARAEAEHKLSLANTEISQWKSKFDAEVSLHQEE (SEQ ID NO：16)
Ts-Pmy-N1-322aa基因片段可以根据SEQ ID NO：15通过人工合成得到，也可以采用下面的PCR扩增的方法得到。
引物设计：如下面的表1所示。引物合成与序列测定均由上海英骏公司完成。
表1：引物数据
扩增条件：95℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min；PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。反应体系：
注：Ts-Pmy质粒菌液为转化有含有副肌球蛋白基因(Ts-PmyGenBank accession No.：EF429310)读码框全长质粒的大肠杆菌，等同于公开号为CN100999737A(申请号为200710000018.1)的专利申请中实施例2制备的转化有副肌球蛋白基因(Ts86cDNA)的大肠杆菌BL21，其制备方法亦可以参考该专利申请。
2.pET28a(+)/Ts-Pmy-N1-322aa重组质粒的构建
质粒与菌株：选用pET28a(+)/BL21(DE3)原核表达系统。BL21感受态菌购自TIANGEN公司。
(1)Ts-Pmy-N1-322aa基因片段的PCR产物和pET-28a(+)质粒的酶切
酶切条件：37℃，水浴2h。酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，酶切片段用试剂盒回收。反应体系如下：
(2)DNA的快速纯化回收(也可以参照试剂盒说明书)
1)切取含Ts-Pmy-N1-322aa基因片段或pET-28a(+)质粒的琼脂糖凝胶(100-300mg)，捣碎，按重量、体积比1∶3(DNA片段∶溶液B)的比例加入溶液B；
2)50℃水浴10min，直至胶完全溶化，期间涡旋振荡3次；
3)将溶液加入离心柱中，静置2min后高速离心1min；
4)向柱中加入500μl溶液C(用无水乙醇1∶1稀释)，高速离心，重复此步骤一次；
5)高速离心1min，以甩干剩余液体；
6)将离心柱置于一个新的离心管中，加入50℃预热的20μl溶液D，静置2min，离心收集DNA；
7)琼脂糖凝胶电泳观察回收效果，-20℃保存备用。
(3)Ts-Pmy-N1-322aa基因片段与pET-28a(+)载体酶切产物的连接反应条件：4℃过夜，连接体系如下：
3.pET28a(+)/Ts-Pmy-N1-322aa重组质粒的原核转化
(1)取5μl上述连接产物，加入至100μl感受态大肠杆菌(Top10)中，轻轻混匀，置于冰上30min；
(2)42℃热休克90sec；
(3)将离心管快速置于冰上，使细胞冷却2min；
(4)加入900μl LB培养基，37℃，50rpm，45min，使细菌复苏；
(5)取100μl上述细菌涂布于含卡那霉素及IPTG、X-gal的LB固体培养基上，37℃培养12-16h；
转化后携带Ts-Pmy-N1-322aa基因片段的质粒菌株的鉴定：
于转化后的平板中挑取单菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中，过夜培养后提取质粒进行PCR和酶切鉴定。或者进行测序鉴定。结果正确。
4.pET28a(+)/rTs-pmy-N1-322aa的原核表达
(1)挑取转化了pET28a(+)/Ts-Pmy-N1-322aa重组质粒的BL21单菌落，加入5ml含卡那霉素(30μg/ml)的LB培养液中。37℃，150rpm振荡培养过夜；
(2)次日，将5ml培养物加入500ml的含卡那霉素的LB培养基中。37℃，300rpm，继续振荡培养直至OD600≈0.6；
(3)加入IPTG至终浓度为1mM诱导表达，37℃，150rpm，继续培养4h；
(4)离心收集菌体，200ml 20mM Tris-HCl(pH7.9)充分悬浮细菌沉淀；
(5)在冰上充分超声，超声输出强度40％，每次8sec，间隔5sec，共10次；
(6)离心弃上清，100ml 20mMTris-HCl(pH7.9)悬浮沉淀；
(7)加入新鲜配制的溶菌酶(100μg/ml)，置冰上30min，其间搅拌混匀数次；
(8)再次超声，离心弃上清，沉淀物即为包涵体及细胞碎片；
(9)加入50ml含6M盐酸胍的1×binding buffer，超声使沉淀充分悬浮、溶解，4℃过夜。
5.亲和层析法操作步骤(His-Bind纯化试剂盒试剂盒，购自Novagen公司，可以参照试剂盒说明操作)
(1)亲和层析柱的制备：取出His-Bind Resin(结合树脂)，震荡悬浮。向亲和层析柱中加入2.5ml His-Bind Resin，轻弹柱体以去除气泡；
(2)依次加入15ml DDW，12ml 1×Charge Buffer，9ml 1×BindingBuffer(含6M盐酸胍)平衡层析柱；
(3)将溶解在含6M盐酸胍的1×Binding Buffer中的包涵体溶液离心取上清，45μm滤器过滤后缓慢加入柱中；
(4)再依次加入12ml 1×Binding Buffer(含6M盐酸胍)、15ml20mM咪唑缓冲液(11ml 1×Binding Buffer，4ml 1×Wash Buffer，均含6M盐酸胍)清洗层析柱，12ml 1×Elute Buffer(含6M盐酸胍)洗脱目的蛋白；
(5)透析：将1×Elute Buffer洗脱的收集液倾入透析袋中(截留分子量为12-14kDa)，放入50倍体积的20mM Tris-HCl(pH7.9)中，4℃透析3h以上。
(6)转入同样体积的透析液中，4℃透析过夜；
(7)透析袋中失去活性的蛋白质沉淀析出，将含有蛋白沉淀的溶液倾入离心管中，离心收集沉淀即为纯化的重组蛋白。
6.蛋白复性操作步骤(蛋白复性试剂盒，购自Novagen公司，可以参照试剂盒说明书)
(1)配制适量的1×IB Solubilization Buffer(从10×储存液中配制。10×IB Solubilization Buffer包括200mM Tis-HCl，pH7.5，100mM EDTA，10％Triton X-100)，并加入0.3％N-lauroylsarcosine及1mM DTT；
(2)以1-2mg/ml的浓度悬浮蛋白，室温静置10min，使蛋白充分溶解；
(3)离心后将上清转入透析袋中；
(4)放入50倍体积的、含0.1mM DTT的1×Dialysis Buffer(由50×Dialysis Buffer稀释而得，其中成分为1M Tris-HCl，pH8.5)的透析液中，4℃透析3h以上，然后换同样的透析液继续透析3h；
(5)放入50倍体积的、不含DTT的1×Dialysis Buffe的透析液中，4℃透析3h，换同样的透析液继续透析过夜；
次日，收集复性蛋白液，得到rTs-Pmy-N1-322aa蛋白(溶液)。
用BCA法测蛋白浓度，-20℃保存。
实施例2：杂交瘤细胞株的建立
用实施例1制备的rTs-Pmy-N1-322aa蛋白(溶液)免疫BALB/c小鼠，经过4次免疫，末次免疫后小鼠抗体效价达1∶128000。将免疫小鼠脾细胞与对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞融合，经HAT培养液选择培养。在96孔培养板中，可见融合细胞生长，待细胞集落生长至1/3孔时，通过间接ELISA及Western blot鉴定，挑选出培养上清液中有抗rTs-Pmy-N1-322aa抗体存在，并能与rTs-Pmy-N1-322aa及幼虫虫体蛋白识别的阳性杂交瘤细胞株。经3次亚克隆将筛选获得一株杂交瘤细胞株命名为8F12，其分泌的抗体属于分泌Th2型的IgG1亚类抗体，经连续传代培养20代，分别取其中的F5、F10、F15和F20代细胞培养上清及液氮保存半年后的复苏细胞培养上清，用间接ELISA方法测定抗体效价，结果见表2。连续传代及冻存复苏后的杂交瘤细胞抗体分泌稳定，选作进一步研究使用。
表2：杂交瘤细胞株8F12稳定性的ELISA鉴定
| 传代次数 | 8F12(A值) |
| F5 | 2.096 |
| F10 | 1.886 |
| F15 | 1.973 |
| F20 | 1.896 |
| 冻存复苏细胞 | 1.796 |
实施例3：8F12细胞株分泌的单克隆抗体(mAb)的鉴定
ELISA检测实施例2中的8F12细胞株的细胞培养上清液和腹水中mAb的滴度，分别为1∶3200和1∶64000。分泌的抗体亚类均为IgG1亚类κ型(表3)。单克隆抗体腹水经HiTrap rProtein A柱纯化后进行SDS-PAGE电泳，分别于50kDa和25kDa处有条带显现，符合IgG抗体重链和轻链的位置(图1)。
表3：单克隆抗体8F12的鉴定
为明确mAb在一定抗原浓度下与抗原结合时相对亲和力的大小，采用间接非竞争ELISA法。以稀释倍数的对数值即1g(C0/C)为横坐标(C0为mAb初始浓度，C为mAb稀释后浓度)，以A值为纵坐标，绘出两株mAb的相对亲和力曲线(图2)。按公式计算8F12mAb的抗体亲和常数Ka值为9.1×107M-(表3)。
实施例4：单克隆抗体(mAb)被动免疫保护性实验
1.实验样品：
8F12细胞株分泌的单克隆抗体(mAb)。
2.实验动物及分组：
6-8周龄BALB/c雌性小鼠随机分为3组，分别为单抗组，自然感染血清组和PBS对照组，每组6只。
3.实验方法：
使用尾静脉注射抗体的方法被动免疫小鼠，单抗组每只小鼠注射500μg的纯化抗体(溶于100μl PBS中)；自然感染血清组每只小鼠注射100μl的BALB/c小鼠感染血清(血清效价为1∶3000)；PBS对照组每只小鼠注射100μl的PBS。被动免疫后2小时每只小鼠攻虫400条。于攻虫后第四天以同样剂量分别加强免疫一次。攻虫后第45天剖杀小鼠，计数每只小鼠的肌幼虫数，评价被动免疫的效果。
4.实验结果：
如表4所示。
被动免疫mAb 8F12，在BALB/c小鼠体内获得了抗旋毛虫感染的免疫保护力。注射mAb 8F12的实验组和自然感染血清组小鼠与注射PBS的对照组相比，分别获得25.6％和24.6％的肌幼虫减虫率(p＜0.01)。但单抗组与自然感染血清组的肌幼虫数(LPG)差别无显著性(图3)。证实mAb 8F12具被动免疫保护性。可用于后续筛选具免疫保护性的B细胞抗原表位。
表4：各组免疫小鼠的肌幼虫检查结果
注：**经统计学检验，与PBS对照组和单纯佐剂组有非常显著性差异(p＜0.01)。
实施例5：单抗8F12抗原表位的筛选
本实验参照NEB噬菌体十二肽库说明书进行，试验结果如下：
1.噬菌体的富集
为观察噬菌体肽库筛选的有效性，计算了每轮噬菌体的回收率。每轮投入的噬菌体病毒子是2×1011，测定每轮洗脱下的噬菌体的滴度，计算回收率，结果如下(表5)：
表5：三轮噬菌体肽库筛选中噬菌体回收率的变化
| 筛选次数 | 加入的噬菌体 | 洗脱的噬菌体 | 噬菌体回收率 |
| 1 | 1.5×1011 | 1×103 | 6.6×10-9 |
| 2 | 1.5×1011 | 6×104 | 4×10-7 |
| 3 | 1.5×1011 | 2×105 | 1.3×10-6 |
表5中数据表明，淘洗噬菌体肽库的过程中噬菌体出现了富集现象，第三轮比第一轮淘洗后的产量高了200倍。
2.阳性克隆的鉴定
从第三轮筛选的洗脱物的测定滴度的平板上(噬斑数低于100个)随机挑取10个独立的蓝色噬菌斑，扩增后制备噬菌体原种贮液。以mAb 8F12包被酶标板，加入扩增的噬菌体克隆贮液，同时以野生噬菌体M13作为阴性对照。为避免筛选到与封阻液(主要成分是BSA)成分结合的假阳性噬菌体克隆，另设了BSA包被的系统对照。以OD492值高于阴性对照OD492值2.1倍以上作为阳性的判定标准，10个克隆全部为阳性噬菌体克隆。结果如下(图4)。
3.阳性克隆的碱基序列测定及编码氨基酸序列的分析
提取10个阳性噬菌体克隆的单链DNA后，测得DNA序列。阳性克隆序列测定的结果是互补链的序列(见表6)，须将其转变为编码链序列后再翻译为氨基酸序列(见表7)再进行序列比对分析。
表6：与8F12结合的阳性噬菌体克隆十二肽的DNA序列
表7：噬菌体展示肽序列
由上述10个阳性克隆DNA序列推导得到的编码氨基酸序列中，有4个是重复序列(重命名为8JJ)，因此共得到7种氨基酸表位肽序列。为进一步明确表位噬菌体是否为单抗8F12所识别，进行了Westernblot实验(Goatanti-MouseIRDye800CW作为生物素标记二抗)。实验结果显示(图5)：呈现上述7种表位肽序列的阳性噬菌体克隆在60kDa左右的位置，均出现了位置一致的条带。而M13野生噬菌体在该位置未见条带。由于展示肽连接于噬菌体的次要衣壳蛋白pIII上，进行SDS-PAGE电泳时，pIII通常跑在分子量60-65kDa附近。因此可以确定阳性噬菌体Clone 1-10的展示肽中含有mAb 8F12识别的抗原表位。
4.合成多肽与mAb 8F12的识别
将上述7种阳性噬菌体克隆所含有的表位肽序列送交公司合成表位多肽，分别命名为8J J(8A6、8A7、8A11、8A12所含有的表位肽序列另命名)、8A1、8A9、8F1、8F6、8F7、8F10。为增加多肽抗原性，将多肽与载体蛋白BSA或KLH偶联(北京奥维亚公司进行技术合成)，ELISA结果显示8JJ-BSA、8A1-BSA、8A9-BSA、8F1-BSA、8F6-BSA、8F7-BSA、8F10-BSA均可与8F12识别，ELI SA检测的OD值达到了蛋白r Ts-Pmy-N1-322aa与8F12的检测值(图6)。
实施例6：表位合成多肽免疫小鼠并评价其免疫保护性
1.实验样品：
实施例5中的步骤4中合成的8JJ-KLH、8A1-KLH、8A9-KLH、8F1-KLH、8F6-KLH、8F7-KLH、8F10-KLH。
2.实验动物及分组：
6-8周龄BALB/c雌性小鼠随机分为10组，每组6只。分别为表位合成肽组(7组)，r Ts-Pmy-N1-322aa组，以及KLH组和PBS对照组。
3.实验方法：
偶联KLH的表位多肽及rTs-Pmy-N1-322aa分别取50μg溶于75μlPBS中与等体积的ISA50V2佐剂充分混合，小鼠背部皮下多点注射。KLH及PBS以同样的剂量和方式免疫动物作为对照。每隔两周免疫一次，共免疫三次。末次免疫后10天，每只小鼠攻击感染旋毛虫肌幼虫400条，45天后剖杀小鼠，检查肌幼虫虫荷，评价各组的免疫保护性。
4.实验结果：
与KLH对照组相比，8A1-KLH组，8F1-KLH组、8F7-KLH组肌幼虫数(LPG)有非常显著性差异(p＜0.01)；分别获得15.9％，22.2％和26.3％的肌幼虫减虫率(表12)。与KLH对照组相比，8F6-KLH组肌幼虫数有显著性差异(p＜0.05)，获得18.7％的肌幼虫减虫率(表8)。
表8：各组免疫小鼠的肌幼虫检查结果
注：**经统计学检验，与KLH对照组有非常显著性差异(p＜0.01)；
*经统计学检验，与KLH对照组有非常显著性差异(p＜0.05)
总之，通过以上实验，本发明人获得了Ts-Pmy的4个保护性抗原表位，这些表位多肽免疫小鼠后均可诱导产生有效的免疫保护作用。以上结果提示：这些表位可作为候选疫苗组份，从而为制备抗旋毛虫病的多表位疫苗奠定了基础。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (14)
1.一种抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1-4中任一项所示。
2.编码权利要求1所述抗原表位的核苷酸序列；具体地，所述核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8-11中任一项所示。
3.一种抗原，其具有权利要求1所述的抗原表位；具体地，所述抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
4.编码权利要求3所述抗原的核苷酸序列；具体地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
5.一种重组载体，其含有权利要求2或4所述的核苷酸序列。
6.一种重组宿主细胞，其含有权利要求5所述的重组载体。
7.一种抗原表位偶联物，包括抗原表位和偶联部分，其中，所述抗原表位为权利要求1所述的抗原表位，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、和生物素中的一种或多种；具体地，所述偶联部分为载体蛋白BSA或KLH。
8.一种组合物，其包含一种或多种权利要求1所述的抗原表位，和/或一种或多种权利要求3所述的抗原，和/或一种或多种权利要求7所述的抗原表位偶联物；具体地，所述组合物为疫苗组合物。
9.权利要求1所述的抗原表位或者权利要求3所述的抗原或者权利要求7所述的抗原表位偶联物在制备治疗和/或预防旋毛虫感染的药物中的用途。
10.一种抗体，其能够特异性地结合权利要求1所述的抗原表位或者权利要求3所述的抗原或者权利要求7所述的抗原表位偶联物。
11.一种抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部分，其中，所述抗体部分为权利要求10所述的抗体，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、和生物素中的一种或多种。
12.一种药物组合物，其包含权利要求10所述的抗体或者权利要求11所述的抗体偶联物；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。
13.一种试剂盒，其包含权利要求10所述的抗体或者权利要求11所述的抗体偶联物。
14.权利要求10所述的抗体或者权利要求11所述的抗体偶联物在制备治疗和/或预防旋毛虫感染的药物中的用途。
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