CN103724402A

CN103724402A - 旋毛虫副肌球蛋白的补体功能相关抗原表位及抗体

Info

Publication number: CN103724402A
Application number: CN201410023652.7A
Authority: CN
Inventors: 诸欣平; 杨静; 赵夕; 郝瑜婉
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2014-01-20
Filing date: 2014-01-20
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2034-01-20
Also published as: CN103724402B

Abstract

本发明属于免疫生物学领域，涉及旋毛虫副肌球蛋白的补体功能相关抗原表位及抗体。具体地，本发明涉及一种抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1－2中任一项所示。本发明的抗原表位具有有效的旋毛虫减虫率，从而具有作为防治旋毛虫感染或其所致疾病的药物（例如疫苗）的潜力。

Description

旋毛虫副肌球蛋白的补体功能相关抗原表位及抗体

技术领域

本发明属于免疫生物学领域，涉及旋毛虫副肌球蛋白的补体功能相关抗原表位及抗体。

背景技术

旋毛虫病（Trichinellosis）是一种常见的食源性人兽共患寄生虫病，严重危害人类健康和畜牧业生产。旋毛虫病呈世界性分布，目前在俄罗斯及东欧国家、拉美国家及泰国等地流行严重。据世界卫生组织（WHO）最新统计结果，1986～2009年间，有41个国家报道了旋毛虫病的流行，病例达65,818人（Murrell,K.D.and E.Pozio,Worldwide occurrence and impact of human trichinellosis,1986-2009.Emerg Infect Dis,2011.17(12):p.2194-202）。我国是世界上旋毛虫病危害最严重的国家之一，故该病不仅被列为我国三大食源性人兽共患寄生虫病之一，同时也是政府提出的让人民吃上“放心肉”的首检和必检的人兽共患病病种。伴随我国经济发展和生活水平提高，人们的饮食习惯和饮食谱也随之发生改变。近年来由于生食、涮、烤等食肉方式的多样化，加之人们越来越多地食用狗肉及野生动物肉类，使得我国旋毛虫病发病率呈上升趋势。2004～2009年间，仅西南三省就暴发旋毛虫病15起，总病例1,387人，死亡4人（Cui,J.,Z.Q.Wang andB.L.Xu,The epidemiology of human trichinellosis in China during2004-2009.Acta Trop,2011.118(1):p.1-5）。卫生部“第二次全国人体重要寄生虫病现状调查”结果显示，旋毛虫病血清阳性率平均高达3.38%（抽样调查9.3万人血清）（许隆祺等,全国人体重要寄生虫病现状调查报告.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2005.23第5期增刊），某些流行区（云南）人群感染阳性率高达8.26%，提示当前我国旋毛虫病流行形势比较严峻。

副肌球蛋白（paramyosin）是多种无脊椎动物主要的结构蛋白，脊椎动物则无此蛋白（Gobert,G.N.and D.P.McManus,Update onparamyosin in parasitic worms.Parasitol Int,2005.54(2):p.101-7）。早期的研究认为副肌球蛋白的功能只是参与肌原纤维的聚集和粗肌丝的组装，在肌肉收缩机制中起作用(Elfvin,M.,R.J.Levine and M.M.Dewey,Paramyosin in invertebrate muscles.I.Identification andlocalization.J Cell Biol,1976.71(1):p.261-72)。旋毛虫的副肌球蛋白基因（Ts-Pmy GenBank accession No.:EF429310）全长为2996bp，其开放读码框架（ORF）2655bp，编码885个氨基酸，理论分子量为102kDa。

旋毛虫副肌球蛋白Ts-Pmy是一个具有前景的抗旋毛虫病疫苗候选抗原分子，将其免疫动物后可诱导产生Th1/Th2混合型免疫应答，产生的免疫保护力导致36.2%的肌幼虫减虫率（Yang,J.,et al.,Identification and characterization of a full-length cDNA encodingparamyosin of Trichinella spiralis.Biochem Biophys Res Commun,2008.365(3):p.528-33)。随后的研究发现：旋毛虫副肌球蛋白Ts-Pmy可分布在新生幼虫和成虫的肌层及体表；虫体体表的Ts-Pmy可与补体膜攻击复合物（membrane attackcomplex，MAC）中的重要组分C9结合，抑制C9聚合反应，进而阻碍宿主MAC的组装，使旋毛虫得以部分逃避宿主补体系统的杀伤；反之，用抗Ts-Pmy抗体封闭虫体体表的Ts-Pmy，则增强了宿主补体系统对虫体的杀伤效应，揭示了除可作为抗旋毛虫病疫苗候选抗原分子外，旋毛虫Ts-Pmy还具有免疫调节功能，参与虫体的免疫逃避作用（Zhang,Z.,et al.,Trichinellaspiralis paramyosin binds to C8and C9and protects thetissue-dwelling nematode from being attacked by host complement.PLoS Negl Trop Dis,2011.5(7):p.e1225）。

综上所述，需要筛选获得补体C9功能相关的抗原表位及抗体，从而为抗旋毛虫病疫苗的研制提供关键准确的分子靶标。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的工作，将Ts-Pmy分九段表达表达部分重叠的蛋白片段（PmyN、PmyM、PmyC、PmyCN、PmyCM、PmyCC、PmyCCN、PmyCCM、PmyCCC），与人补体C9蛋白进行相互作用，发现其中羧基端片段可结合补体C9（PmyC、PmyCC、PmyCCC）。之后本发明人根据PmyCCC的氨基酸序列设计合成了12段多肽，并发现其中多肽P8与P10可结合补体C9，获得了补体C9功能相关的抗原表位（Ts-Pmy⁸⁶⁶Val-⁸⁷⁹Met）。本发明人发现，获得的表位多肽对补体C9聚合反应及补体介导细胞溶解反应均具有抑制作用，且特异性识别该抗原表位的单克隆抗体被动免疫动物后导致有效的旋毛虫减虫率，从而具有作为防治旋毛虫感染或其所致疾病的药物（例如疫苗）的潜力。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种抗原表位，其氨基酸序列如SEQ IDNO：1－2中任一项所示。所述抗原表位在本发明中亦称为旋毛虫副肌球蛋白的补体功能相关抗原表位。

抗原表位（P10）的氨基酸序列：14aa

VSMGKSLSSKVYVM（SEQ ID NO：1）

抗原表位（P8）的氨基酸序列：15aa

VSMGKSLSSKVYVME（SEQ ID NO：2）

所述抗原表位可以通过人工化学合成的方式得到，也可以通过将其编码的核苷酸通过蛋白表达纯化得到。例如，可以在合适的培养基中，在允许多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳和氮源以及无机盐的合适的培养基中，采用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果多肽被分泌到培养基中，则可以直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以从细胞裂解物中回收。

本发明的另一方面涉及编码本发明任一项所述抗原表位的核苷酸序列；具体地，所述核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3－4中任一项所示。

抗原表位（P10）的核苷酸序列：42bp

GTTTCCATGGGAAAAAGTCTCTCTTCCAAGGTTTACGTGATG（SEQ ID NO：3）

抗原表位（P8）的核苷酸序列：45bp

GTTTCCATGGGAAAAAGTCTCTCTTCCAAGGTTTACGTGATGGAA（SEQ ID NO：4）

本发明的再一方面涉及一种多肽，其具有本发明任一项所述的抗原表位；具体地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5－7中任一项所示。

PmyC：⁵⁷¹Asn-⁸⁸⁵Tyr，其氨基酸序列如下：315aa

NRANLEAQKTIKKQADQLRALQSSFEDCQRQLQQTLDQYAIAQRKLSALSAELEDCKSALDTAIRVRKQAEADLEEAQGKIADLVSLNNNLTAIKGKLETDLSTCQADLDETTKELRAADDRANRAQQDAVRAMEQLHEEQEHSMKIDAMRKALEEHVKQLQVQIQEAEAAALLGGKRVIAKLETRIRDLEMALDEESRRHKETQACLRKKDRRVKEMQMQVDEEHKNFVMAQDTAERLAEKLNIYKRQLTEAESLTMQNLQRVRRYQHELEDAEGRAEQAESSLHLIRAKHRSSVS MGKSLSSKVYVMEEGHEY（SEQ ID NO：5）

PmyCC：⁷⁶¹Glu-⁸⁸⁵Tyr，其氨基酸序列如下：125aa

EMALDEESRRHKETQACLRKKDRRVKEMQMQVDEEHKNFVMAQDTAERLAEKLNIYKRQLTEAESLTMQNLQRVRRYQHELEDAEGRAEQAESSLHLIRAKHRSSVSMGKSLSSKVYVMEEGHEY（SEQ ID NO：6）

PmyCCC：⁸³¹Leu-⁸⁸⁵Tyr，其氨基酸序列如下：55aa

LQRVRRYQHELEDAEGRAEQAESSLHLIRAKHRSSVSMGK SLSSKVYVMEEGHEY（SEQ ID NO：7）

本发明的再一方面涉及编码本发明任一项所述多肽的核苷酸序列；具体地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9或SEQID NO：10所示。

PmyC的核苷酸序列如下：945bp

AACCGGGCCAATTTGGAAGCACAAAAGACGATCAAAAAACAAGCAGACCAACTGAGGGCTTTGCAAAGCAGCTTCGAAGATTGCCAACGTCAACTGCAACAAACGCTCGACCAGTATGCAATTGCCCAGCGCAAGTTGTCCGCTTTGTCGGCCGAATTGGAAGACTGCAAGAGTGCCTTGGACACGGCGATCCGGGTGCGCAAACAAGCCGAAGCGGATCTGGAAGAAGCCCAGGGGAAAATTGCCGATTTGGTCAGCTTGAACAACAATTTGACCGCGATCAAGGGCAAATTGGAGACCGACTTGTCGACATGCCAAGCCGATTTGGACGAGACGACCAAAGAACTGCGAGCCGCCGACGACCGTGCCAACCGAGCTCAGCAGGATGCGGTCCGGGCTATGGAACAACTCCACGAAGAGCAGGAACATTCGATGAAAATCGACGCCATGCGCAAAGCGTTGGAAGAGCACGTCAAACAGTTGCAAGTGCAAATCCAAGAAGCCGAAGCGGCAGCTCTGCTCGGTGGCAAGCGCGTCATTGCCAAACTCGAGACCAGGATTCGAGATTTGGAAATGGCGTTGGATGAAGAATCGAGACGACACAAAGAAACCCAAGCCTGCTTGCGCAAAAAGGACCGTCGCGTCAAGGAAATGCAAATGCAAGTGGACGAGGAGCACAAAAATTTCGTCATGGCCCAAGATACTGCCGAACGATTGGCCGAAAAATTGAACATCTACAAGCGACAGTTGACTGAAGCGGAATCGTTGACAATGCAAAATTTGCAACGTGTCCGTCGTTACCAGCACGAATTGGAAGATGCCGAAGGTCGAGCCGAACAAGCCGAAAGTAGCTTGCACTTGATCCGTGCCAAGCATCGTTCTTCCGTTTCCATGGGAAAAAGTCTCTC TTCCAAGGTTTACGTGATGGAAGAAGGACATGAATAT（SEQID NO：8）

PmyCC的核苷酸序列如下：375bp

GAAATGGCGTTGGATGAAGAATCGAGACGACACAAAGAAACCCAAGCCTGCTTGCGCAAAAAGGACCGTCGCGTCAAGGAAATGCAAATGCAAGTGGACGAGGAGCACAAAAATTTCGTCATGGCCCAAGATACTGCCGAACGATTGGCCGAAAAATTGAACATCTACAAGCGACAGTTGACTGAAGCGGAATCGTTGACAATGCAAAATTTGCAACGTGTCCGTCGTTACCAGCACGAATTGGAAGATGCCGAAGGTCGAGCCGAACAAGCCGAAAGTAGCTTGCACTTGATCCGTGCCAAGCATCGTTCTTCCGTTTCCATGGGAAAA AGTCTCTCTTCCAAGGTTTACGTGATGGAAGAAGGACATGAATAT（SEQ ID NO：9）

PmyCCC的核苷酸序列如下：165bp

TTGCAACGTGTCCGTCGTTACCAGCACGAATTGGAAGATGCCGAAGGTCGAGCCGAACAAGCCGAAAGTAGCTTGCACTTGATCCGTGCCAAGCATCGTTCTTCCGTTTCCATGGGAAAAAG TCTCTCTTCCAAGGTTTACGTGATGGAAGAAGGACATGAATAT（SEQ ID NO：10）

本发明的再一方面涉及一种重组载体，其含有本发明任一项所述的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，所述重组载体为重组表达载体。

可以将本发明的任一项的核苷酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体，该载体可以包括1或多个方便的限制位点，以便在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者，可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时，可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。

其中，术语“控制序列”定义为包括表达本发明的抗原表位所必需或有利的所有组分。每个调控序列对于编码多肽（抗原表位）的核酸序列可以是天然含有的或外来的。这些调控序列包括，但不限于，前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度，调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以提供带接头的调控序列。术语“可操作连接”在文中定义为这样一种构象，其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位置，以使调控序列指导多肽的表达。

重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。

本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明任一项所述的重组载体。

可将包含本发明之核酸序列的重组载体导入宿主细胞，从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于多肽编码基因及其来源。

宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如细菌或酵母细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。

本发明的再一方面涉及一种抗原表位偶联物，包括抗原表位和偶联部分，其中，所述抗原表位为本发明任一项所述的抗原表位，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、和生物素中的一种或多种；具体地，所述偶联部分为载体蛋白BSA或KLH。

本发明的再一方面涉及一种组合物，其包含一种或多种本发明任一项所述的抗原表位，和/或一种或多种本发明任一项所述的多肽，和/或一种或多种本发明任一项所述的抗原表位偶联物；具体地，所述组合物为疫苗组合物。

本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的抗原表位或者本发明任一项所述的多肽或者本发明任一项所述的抗原表位偶联物在制备治疗和/或预防旋毛虫感染的药物中的用途。

实施例2的数据显示，本发明的抗原表位制得的单克隆抗体具有有效的旋毛虫减虫率，能够有效地防治旋毛虫感染或旋毛虫感染所致疾病。本发明的抗原表位具有作为防治旋毛虫感染或其所致疾病的药物（例如疫苗）的潜力。

本发明的再一方面涉及一种抗体，其能够特异性地结合本发明任一项所述的抗原表位或者本发明任一项所述的多肽或者本发明任一项所述的抗原表位偶联物。

在本发明中，术语“特异性结合”具有免疫学的一般含义，例如抗原抗体间的结合。

本发明的再一方面涉及一种抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部分，其中，所述抗体部分为本发明任一项所述的抗体，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、和生物素中的一种或多种。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的抗体偶联物；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。

本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包含本发明任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的抗体偶联物。

本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的抗体或者本发明任一项所述的抗体偶联物在制备治疗和/或预防旋毛虫感染的药物中的用途。

本发明的再一方面涉及一种杂交瘤细胞株9G3，其分类命名为BALB/c小鼠杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.8767，保藏日期为2014年1月14日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。

本发明的再一方面涉及一种单克隆抗体，其由本发明的杂交瘤细胞株分泌。

发明的有益效果

本发明的单克隆抗体具有效的旋毛虫减虫率。本发明的抗原表位具有作为防治旋毛虫感染或其所致疾病的药物（例如疫苗）的潜力。

附图说明

图1：9个截短基因片段的氨基酸序列的示意图。

图2：Western blot实验分析9个Ts-Pmy重组截短片段与补体C9的结合。抗HisTag单抗识别Ts-Pmy重组截短片段。抗C9单抗识别可结合C9的重组截短片段。M，蛋白分子量。

图2A，Ts-Pmy重组截短片段分别为PmyN、PmyM、PmyC；

图2B，Ts-Pmy重组截短片段分别为PmyCN、PmyCM、PmyCC；

图2C，Ts-Pmy重组截短片段分别为PmyCCN、PmyCCM、PmyCCC。

图3：重叠多肽P1－P12的示意图。

图4：Dot blot实验分析重叠多肽与补体C9的结合。黑点表示阳性结果的实验组。

图5：SDS-PAGE电泳鉴定腹水纯化后的单克隆抗体。其中：

泳道1：Marker；

泳道2：纯化前腹水；

泳道3：纯化后腹水单抗。

图6：单克隆抗体亲和力常数曲线。

图7：腹水单抗与不同发育阶段虫体抗原及rTs-Pmy蛋白的Western blot鉴定。其中：

1：成虫；

2：肌幼虫（ML）；

3：新生幼（NBL）；

4：rTsPmy；

5：BSA；

6：非相关蛋白Ts-Hsp70。

图8：单抗9G3对Pmy与C9结合的竞争性抑制的Western blot鉴定。其中：

1.pmy+9G3(0μg)+C9；

2.pmy+9G3(2μg)+C9；

3.pmy+9G3(4μg)+C9；

4.pmy+BSA+C9；

5.pmy+7E2(10μg)+C9。

图9：mAb9G3及自然感染血清抗旋毛虫感染的免疫保护实验结果。LPG为每克肌肉的肌幼虫数，以均数±标准差表示。^**表示与PBS空白对照组比较，p<0.01。

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及以下生物材料：

BALB/c小鼠杂交瘤细胞株9G3，其于2014年1月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC.8767，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：Ts-Pmy的补体C9抗原表位的制备和鉴定

1.旋毛虫副肌球蛋白Ts-Pmy截短基因片段的扩增

（1）根据抗原即旋毛虫副肌球蛋白基因（Ts-Pmy，GenBank No.EF429310）开放读码框序列，设计截短基因片段。

抗原读码框的氨基酸序列如下：885aa

MSLYRSPSASVMRSASMLSRSGGFDAYGFGGYGAPSLNVADLGSLTRLEDKIRLLQDDLETERELRNRIERERADLSCQLISLTDRLEEAEGTTDAQIDANRKRESELQKLRKILEDSQLESEDSLNQLRKKHQESLLDYQQQIEQLQKKNSKIDRERQRLQHEVIELTAGIDQMQKDKHAAEKAAEKHEAHARELQNRVDDLAKNLNDLASQRQRLQQENNDLMKELHDVKVQMENIQHVKTQLAQQLEEARRRLEDAERERSQMQTQLHQMQLELDSIQGALEEESSARAEAEHKLSLANTEISQWKSKFDAEVSLHQEEVDDLRKKMIQKQAEYEEQIEIMLQKISQLEKAKSRLQSEVEVLIVDLEKAQSTIAILERQKEQLERMVAEMKTRLDEVTQELEATQRELRATQAELQKMKHLYEKAVEQKEALARENKKLQDDLHEAKEALADANRKLHELDLENARLAGEIRELQIALKEAEAARRDAESRAQRAVAELQALRVEMERRLQEKEEEMEALRKNMQFEIDRLAAALADAEARMKAEISRLKKKYQAEIAELEMTIDNLNRANLEAQKTIKKQADQLRALQSSFEDCQRQLQQTLDQYAIAQRKLSALSAELEDCKSALDTAIRVRKQAEADLEEAQGKIADLVSLNNNLTAIKGKLETDLSTCQADLDETTKELRAADDRANRAQQDAVRAMEQLHEEQEHSMKIDAMRKALEEHVKQLQVQIQEAEAAALLGGKRVIAKLETRIRDLEMALDEESRRHKETQACLRKKDRRVKEMQMQVDEEHKNFVMAQDTAERLAEKLNIYKRQLTEAESLTMQNLQRVRRYQHELEDAEGRAEQAESSLHLIRAKHRSSVSMGKSLSSKVYVMEEGHEY（SEQ ID NO：11）

抗原的核苷酸序列：2655bp

ATGTCTCTGTATCGCAGTCCCAGTGCGTCAGTGATGAGATCAGCAAGCATGCTCAGCCGAAGTGGCGGATTCGATGCTTACGGATTTGGAGGTTACGGTGCGCCAAGCCTCAACGTTGCCGACTTGGGTTCTTTGACCAGACTCGAGGATAAAATTCGCCTGCTTCAAGATGATTTGGAAACGGAAAGAGAATTGCGAAACCGAATTGAACGCGAACGTGCCGATTTGTCCTGCCAACTGATCAGCTTAACCGATCGATTGGAAGAGGCTGAAGGAACCACCGATGCCCAGATCGACGCCAATCGAAAGCGTGAATCCGAATTGCAAAAGTTGAGAAAAATATTGGAAGATTCGCAATTGGAAAGCGAAGATTCGCTGAACCAGCTGCGCAAGAAGCACCAAGAATCCCTTTTAGATTATCAGCAGCAAATTGAACAACTTCAAAAGAAAAATAGCAAAATCGACAGAGAACGACAACGTTTGCAGCATGAAGTCATTGAACTTACTGCCGGAATTGATCAGATGCAAAAAGACAAGCATGCCGCGGAAAAAGCTGCCGAAAAGCACGAAGCGCATGCCAGAGAGCTTCAGAACAGAGTTGACGATCTGGCAAAAAATTTGAACGACCTGGCCTCGCAGCGTCAACGTCTGCAACAGGAAAACAACGATTTGATGAAAGAGTTGCACGATGTCAAAGTGCAAATGGAAAATATTCAACACGTCAAGACTCAACTTGCTCAACAGCTCGAAGAAGCACGTCGTCGACTCGAAGATGCGGAACGTGAACGTTCGCAAATGCAAACCCAGTTGCATCAGATGCAGCTGGAATTGGATTCAATTCAAGGTGCGTTGGAAGAGGAATCGTCCGCACGTGCCGAAGCAGAGCACAAATTGTCGTTGGCAAATACGGAAATTTCCCAGTGGAAGAGCAAATTCGACGCCGAAGTTTCACTCCACCAAGAAGAAGTTGACGATCTGCGTAAAAAAATGATCCAAAAACAAGCAGAATATGAGGAACAAATTGAAATTATGCTGCAAAAGATTTCCCAATTGGAAAAAGCGAAAAGCCGTCTGCAGTCGGAAGTTGAAGTTTTGATAGTTGATTTGGAAAAGGCTCAAAGCACCATTGCCATTTTGGAAAGACAAAAAGAACAGCTCGAAAGAATGGTCGCCGAGATGAAGACACGCCTGGACGAGGTGACACAAGAGCTCGAAGCTACGCAACGAGAACTCAGAGCGACGCAAGCGGAATTGCAAAAGATGAAGCATCTTTATGAAAAAGCCGTCGAACAGAAAGAAGCTCTGGCTAGGGAGAACAAAAAATTGCAAGACGATTTGCATGAAGCAAAGGAAGCTTTGGCCGACGCGAACAGAAAATTGCACGAGCTGGATTTGGAGAATGCACGTCTGGCCGGTGAAATCAGAGAACTGCAAATCGCGCTCAAGGAAGCCGAAGCGGCTAGACGTGACGCGGAAAGTCGCGCACAGCGTGCAGTAGCTGAATTGCAAGCTCTGCGCGTGGAAATGGAACGTCGTTTACAAGAAAAAGAAGAAGAAATGGAAGCATTGCGCAAAAATATGCAGTTCGAAATTGACCGACTGGCTGCAGCGTTGGCTGACGCTGAGGCTCGCATGAAGGCGGAAATTTCCCGTCTGAAGAAGAAATACCAGGCGGAAATTGCCGAACTGGAAATGACCATCGACAATTTGAACCGGGCCAATTTGGAAGCACAAAAGACGATCAAAAAACAAGCAGACCAACTGAGGGCTTTGCAAAGCAGCTTCGAAGATTGCCAACGTCAACTGCAACAAACGCTCGACCAGTATGCAATTGCCCAGCGCAAGTTGTCCGCTTTGTCGGCCGAATTGGAAGACTGCAAGAGTGCCTTGGACACGGCGATCCGGGTGCGCAAACAAGCCGAAGCGGATCTGGAAGAAGCCCAGGGGAAAATTGCCGATTTGGTCAGCTTGAACAACAATTTGACCGCGATCAAGGGCAAATTGGAGACCGACTTGTCGACATGCCAAGCCGATTTGGACGAGACGACCAAAGAACTGCGAGCCGCCGACGACCGTGCCAACCGAGCTCAGCAGGATGCGGTCCGGGCTATGGAACAACTCCACGAAGAGCAGGAACATTCGATGAAAATCGACGCCATGCGCAAAGCGTTGGAAGAGCACGTCAAACAGTTGCAAGTGCAAATCCAAGAAGCCGAAGCGGCAGCTCTGCTCGGTGGCAAGCGCGTCATTGCCAAACTCGAGACCAGGATTCGAGATTTGGAAATGGCGTTGGATGAAGAATCGAGACGACACAAAGAAACCCAAGCCTGCTTGCGCAAAAAGGACCGTCGCGTCAAGGAAATGCAAATGCAAGTGGACGAGGAGCACAAAAATTTCGTCATGGCCCAAGATACTGCCGAACGATTGGCCGAAAAATTGAACATCTACAAGCGACAGTTGACTGAAGCGGAATCGTTGACAATGCAAAATTTGCAACGTGTCCGTCGTTACCAGCACGAATTGGAAGATGCCGAAGGTCGAGCCGAACAAGCCGAAAGTAGCTTGCACTTGATCCGTGCCAAGCATCGTTCTTCCGTTTCCATGGGAAAAAGTCT CTCTTCCAAGGTTTACGTGATGGAAGAAGGACATGAATAT（SEQ ID NO：12）

一共设计9个截短基因片段，分别命名为：

PmyN，PmyM，PmyC，PmyCN，PmyCM，PmyC，PmyCCN，PmyCCM，PmyCCC。

上述9个截短基因片段的氨基酸序列的示意图如图1所示。

上述9个截短基因片段的氨基酸序列起止和长度如下面的表1所示。

表1：9个截短基因片段的氨基酸序列起止和长度

（2）引物设计：

如下面的表2所示。

引物合成与序列测定均由上海英骏公司完成。

表2：引物设计（下划线表示酶切位点）

（3）扩增条件：95℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min。反应体系如下面的表3所示。

表3：PCR反应体系

10×Pyrobest Buffer	5μl
		Pyrobest DNA聚合酶	0.25μl
模板DNA	0.2μl
		10mM dNTP Mixture	4μl
无菌去离子水	40.55μl
		终体积	50μl

注：模板DNA为pET28a-Ts-Pmy质粒（Yang,J.,et al.,Identification and characterization of a full-length cDNA encodingparamyosin of Trichinella spiralis.Biochem Biophys Res Commun,2008.365(3):p.528-33.）。

将PCR扩增产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。结果正确。

2.pET28a/Ts-Pmy截短基因片段（PmyN、PmyM、PmyC、PmyCN、PmyCM、PmyCC、PmyCCN、PmyCCM、PmyCCC）重组质粒的构建

质粒：pET28a原核表达载体；

宿主菌：BL21（DE3）菌株。

（1）Ts-Pmy截短基因片段PCR产物和pET-28a质粒的双酶切

酶切条件：37℃，30min。反应体系如下面的表4所示。

表4：酶切反应体系

10×酶切缓冲液	2μl
		BamH I	0.5μl
EcoR I	0.5μl
		模板DNA	5μl
无菌去离子水	12μl
		终体积	20μl

酶切产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，酶切片段用试剂盒回收。

（2）Ts-Pmy截短基因片段和pET-28a质粒双酶切产物的连接连接反应条件：16℃，30min。反应体系如下面的表5所示。

表5：连接反应体系

2×连接缓冲液	5μl
		pET-28a质粒	1μl
Ts-Pmy截短基因片段	3μl
		T4DNA连接酶	1μl
终体积	10μl

3.pET28a/Ts-Pmy截短基因片段重组质粒的转化

（1）取5μl上述连接产物，加入至100μl感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，轻轻混匀，置于冰上30min；

（2）42℃热休克90sec；

（3）将离心管快速置于冰上，使细胞冷却2min；

（4）加入900μl LB培养基，37℃，50rpm，45min，使细菌复苏；

（5）取100μl上述细菌涂布于含卡那霉素及IPTG、X-gal的LB固体培养基上，37℃培养12－16h；

（6）转化后携带Ts-Pmy截短基因片段质粒菌株的鉴定：于转化后的平板中挑取单菌落于含卡那霉素的LB液体培养基中，过夜培养后提取质粒进行PCR和酶切鉴定。之后进行测序鉴定。

测序结果正确。

4.Ts-Pmy重组截短片段的原核表达

（1）挑取转化了pET28a/Ts-Pmy截短基因片段重组质粒的BL21单菌落，加入5ml含卡那霉素（30μg/ml）的LB培养液中37℃，150rpm振荡培养过夜；

（2）次日，将5ml培养物加入500ml含卡那霉素的LB培养基中37℃，300rpm，继续振荡培养直至OD600≈0.6；

（3）加入IPTG至终浓度为1mM诱导表达，37℃，150rpm，继续培养4h；

（4）离心收集菌体，1×Binding Buffer（500mM NaCl，20mMTris-HCl，5mM imidazole，pH7.9）充分悬浮细菌沉淀；

（5）在冰上充分超声，超声输出强度40%，每次8sec，间隔5sec，共10次；

（6）加入新鲜配制的溶菌酶（100μg/ml），置冰上30min，其间搅拌混匀数次；

（7）再次超声，之后离心取上清4℃保存。

5.蛋白的分离纯化

亲和层析法，使用HisBind纯化试剂盒试剂盒（购自Novagen公司）。操作步骤如下，亦可参照试剂盒说明书进行。

（1）准备亲和层析柱：震荡悬浮HisBind树脂，向空层析柱中加入2.5ml HisBind树脂，轻弹柱体以去除气泡；

（2）依次加入15ml去离子水，12ml1×Charge Buffer，9ml1×Binding Buffer平衡层析柱；

（3）将超声上清45μm滤器过滤，之后缓慢加入柱中；

（4）再依次加入12ml1×Binding Buffer、9ml1×Wash Buffer清洗层析柱，12ml1×Elute Buffer洗脱目的蛋白；

（5）透析：将洗脱后收集液倾入透析袋中（截留分子量为3-5kDa），放入50倍体积的20mM Tris-HCl（pH7.9）中，4℃透析3h；

（6）转入同样体积的透析液中，4℃透析过夜。

（7）次日，收集蛋白溶液，用BCA法测定蛋白浓度，-20℃保存。

6.Ts-Pmy重组截短片段与补体C9的Western blot结合实验

（1）将九个重组截短片段蛋白进行SDS-PAGE电泳，并转移至NC膜上。

（2）加入封闭剂室温孵育1h。

（3）加入人补体C9蛋白4℃共孵育过夜。

（4）以小鼠抗人C9单抗为一抗，山羊抗小鼠IgG为二抗，检测重组截短片段与C9的结合情况。

实验结果如图2A、2B、2C所示。

结果表明：重组截短片段PmyC、PmyCC和PmyCCC可结合补体C9。

7.应用固相合成法制备重叠多肽

根据筛选到的可与C9结合的重组截短片段，设计多条重叠的多肽序列（表6），其示意图如图3所示。利用多肽自动合成仪以固相合成法合成多肽，质谱仪鉴定产物质量。

表6：重叠多肽P1－P12

8.重叠多肽与人补体C9蛋白的结合实验

合成的重叠多肽与人补体C9蛋白进行Dot blot实验，分析补体C9功能相关抗原表位的准确位置。

（1）将多肽用窄口移液管点到NC膜上并烘干。

（2）加入人补体C9蛋白4℃共孵育过夜。

（3）以小鼠抗人C9单抗为一抗，山羊抗小鼠IgG为二抗，检测重叠多肽与C9的结合情况。

实验结果如图4所示。

结果表明：多肽P8和P10可结合补体C9，显示补体C9功能相关的抗原表位定位于Ts-Pmy羧基端的14肽序列（⁸⁶⁶Val-⁸⁷⁹Met）（图4）。

实施例2：识别补体C9抗原表位的单克隆抗体的制备和鉴定

1.杂交瘤细胞株9G3及单克隆抗体制备

用以上过程制备的多肽P10偶联BSA作为抗原免疫BALB/c小鼠，经过4次免疫，末次免疫后取免疫小鼠脾细胞与对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞融合，经HAT培养液选择培养。在96孔培养板中，可见融合细胞生长，待细胞集落生长至1/3孔时，通过间接ELISA及Western blot鉴定，挑选出培养上清液中有抗多肽P25的抗体存在，并能与rTs-Pmy及幼虫虫体蛋白识别的阳性杂交瘤细胞株。经3次亚克隆将筛选获得一株杂交瘤细胞株命名为9G3，其分泌的抗体属于分泌Th2型的IgG1亚类抗体，经连续传代培养20代，分别取其中的F5、F10、F15和F20代细胞培养上清，用间接ELISA方法测定抗体效价，结果见表7。

表7：杂交瘤细胞株9G3稳定性的ELISA鉴定

传代次数	9G3(A值)
		F5	2.283
F10	2.011
		F15	1.968
F20	2.042

连续传代后的杂交瘤细胞抗体分泌稳定，选作进一步研究使用。取6周龄BALB/c小鼠10只，经腹腔注射液体石蜡（0.5ml/只），10d后腹腔内接种杂交瘤细胞310⁵－8×10⁵/只，2－4周左右待其腹部明显增大后，用2ml无菌注射器抽取腹水，3000rpm离心10min，取上清，4℃10000g离心15min，除去细胞残渣及小颗粒物质，上清液分装，-80℃冻存。

2.单克隆抗体9G3的鉴定

（1）ELISA检测9G3细胞株的细胞培养上清液和腹水中单抗的滴度，分别为1∶3200和1∶516000。分泌的抗体亚类均为IgG1亚类（表8）。单克隆抗体腹水经HiTrap rProtein A柱纯化后进行SDS-PAGE电泳，分别于50kDa和25kDa处有条带显现，符合IgG抗体重链和轻链的位置（图5）。

（2）为明确单抗在一定抗原浓度下与抗原结合时相对亲和力的大小，采用间接非竞争ELISA法。以稀释倍数的对数值即l g（C0/C）为横坐标（C0为单抗初始浓度，C为单抗稀释后浓度），以A值为纵坐标，绘出该株单抗的相对亲和力曲线（图6）。按公式计算单抗9G3的抗体亲和常数Ka值为4.67×10⁸M^-（表8）。

表8：单克隆抗体9G3的鉴定

（3）单抗9G3与不同发育阶段虫体Ts-Pmy及rTs-Pmy蛋白的Western blot鉴定结果显示，单抗9G3能够很好的识别旋毛虫成虫、肌幼虫及新生幼虫虫体蛋白（约110kDa）及rTs-Pmy（约110kDa）。（图7）。

3.单克隆抗体9G3的竞争抑制作用

为鉴定单克隆抗体9G3对Ts-Pmy与C9结合的竞争抑制作用，将rTs-Pmy（2μg）行SDS-PAGE电泳，半干转印至PVDF膜上，5%脱脂牛奶4℃封闭过夜，在于C9共孵育前，预先将膜分别9G3(0μg、2μg、4μg)，BSA（阴性对照），7E2(另一株单抗，对应Ts-Pmy-N，作为非相关对照)室温孵育1h，之后再与C9（1μg/ml）在37℃孵育2h，PBST洗膜后，以抗C9多抗（兔源）（稀释浓度1:4000）作为一抗，红外标记羊抗兔IgG（1:5000）作为二抗，奥德赛红外成像扫描。Western blot结果显示，单克隆抗体9G3可抑制Ts-Pmy与C9的结合，且抑制作用呈剂量依赖性（图8）。

4.单克隆抗体9G3被动免疫保护性实验

（1）实验样品：9G3细胞株分泌的单克隆抗体

（2）实验动物及分组：6－8周龄BALB/c雌性小鼠随机分为3组，分别为单抗组，自然感染血清组和PBS对照组，每组6只。

（3）实验方法：使用尾静脉注射抗体的方法被动免疫小鼠，单抗组每只小鼠注射500μg的纯化抗体（溶于100μl PBS中）；自然感染血清组每只小鼠注射100μl的BALB/c小鼠感染血清（血清效价为1∶3000）；PBS对照组每只小鼠注射100μl的PBS。被动免疫后2小时每只小鼠攻虫400条。于攻虫后第四天以同样剂量分别加强免疫一次。攻虫后第45天剖杀小鼠，计数每只小鼠的肌幼虫数，评价被动免疫的效果。

（4）实验结果：被动免疫单抗9G3，在BALB/c小鼠体内获得了抗旋毛虫感染的免疫保护力。注射单抗9G3的实验组和自然感染血清组小鼠与注射PBS的对照组相比，分别获得42%和34%的肌幼虫减虫率(p<0.01)。但单抗组与自然感染血清组的肌幼虫数（LPG）差别无显著性(图9)。证实单抗9G3具有被动免疫保护性。

总之，通过以上实验，本发明人获得了Ts-Pmy补体C9功能相关的抗原表位及单克隆抗体。本发明的单克隆抗体被动免疫动物后具有有效的旋毛虫减虫率。本发明的抗原表位具有作为防治旋毛虫感染或其所致疾病的药物（例如疫苗）的潜力。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.一种抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1－2中任一项所示。

2.编码权利要求1所述抗原表位的核苷酸序列；具体地，所述核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3－4中任一项所示。

3.一种多肽，其具有权利要求1所述的抗原表位；具体地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5－7中任一项所示。

4.编码权利要求3所述多肽的核苷酸序列；具体地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示。

5.一种重组载体，其含有权利要求2或4所述的核苷酸序列。

6.一种重组宿主细胞，其含有权利要求5所述的重组载体。

7.一种抗原表位偶联物，包括抗原表位和偶联部分，其中，所述抗原表位为权利要求1所述的抗原表位，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、和生物素中的一种或多种；具体地，所述偶联部分为载体蛋白BSA或KLH。

8.一种组合物，其包含一种或多种权利要求1所述的抗原表位，和/或一种或多种权利要求3所述的多肽，和/或一种或多种权利要求7所述的抗原表位偶联物；具体地，所述组合物为疫苗组合物。

9.权利要求1所述的抗原表位或者权利要求3所述的多肽或者权利要求7所述的抗原表位偶联物在制备治疗和/或预防旋毛虫感染的药物中的用途。

10.一种抗体，其能够特异性地结合权利要求1所述的抗原表位或者权利要求3所述的多肽或者权利要求7所述的抗原表位偶联物。

11.一种抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部分，其中，所述抗体部分为权利要求10所述的抗体，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、和生物素中的一种或多种。

12.一种药物组合物，其包含权利要求10所述的抗体或者权利要求11所述的抗体偶联物；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。

13.一种试剂盒，其包含权利要求10所述的抗体或者权利要求11所述的抗体偶联物。

14.权利要求10所述的抗体或者权利要求11所述的抗体偶联物在制备治疗和/或预防旋毛虫感染的药物中的用途。

15.一种杂交瘤细胞株9G3，其保藏编号为CGMCC.8767，保藏日期为2014年1月14日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。

16.一种单克隆抗体，其由权利要求15所述的杂交瘤细胞株分泌。