CN102433343A - 旋毛虫与肿瘤相关蛋白基因制备方法和医用用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了旋毛虫与肿瘤细胞相关蛋白基因，利用酶联免疫吸附试验确定肿瘤细胞抗原与旋毛虫阳性血清、旋毛虫抗原与肿瘤细胞阳性血清间存在相关抗原；利用SP2/0 高免血清对旋毛虫cDNA表达文库进行筛选，得到本相关蛋白基因。提供的旋毛虫与肿瘤细胞相关蛋白基因，为一种新的蛋白基因物质；肿瘤细胞对异体鉴识物比较敏感，旋毛虫与肿瘤细胞相关蛋白基因能产生针对肿瘤强的特异性和非特异性免疫反应，同时旋毛虫与肿瘤细胞相关抗原易于制备和工业化。
Description
技术领域
本发明提供了旋毛虫与肿瘤相关蛋白基因及其制备方法，本发明还提供了该蛋白的医用用途，属于生物制药领域。
背景技术
旋毛虫是一种寄生于人和多种动物体内的线虫，近年来研究发现其具有较强的抗肿瘤活性，但对其抗肿瘤活性成分尚不清楚。据报导恶性肿瘤细胞对异体鉴识物比较敏感，异体抗原物所产生的免疫细胞对恶性肿瘤具有抵抗力。旋毛虫与肿瘤细胞相关基因蛋白能产生针对肿瘤强的特异性和非特异性免疫反应。
发明内容
本发明提供了旋毛虫与肿瘤细胞相关蛋白基因，为一种新的蛋白基因物质，具有生物活性。
本发明还提供了该相关基因蛋白的制备方法，适用于工业化生产。
本发明进一步公开了该蛋白的医用用途，用于制备治疗肿瘤的药物。
本发明公开的旋毛虫与肿瘤细胞相关蛋白基因，如SEQ ID NO.1所示。具有以下表征：
本基因蛋白是通过利用抗SP2/0高免血清对旋毛虫cDNA文库进行免疫筛选获得的，对阳性克隆进行扩增，得到全序列长有569bp，含有411bp的开放性阅读框，起始密码子ATG，终止密码子TGA，将其ORF命名为TS411。编码136个氨基酸。
推测它的分子量（MW）为15.6 KD。根据滴定曲线推测其等电点（pI ：Isolectric Point）为10.56。测序结果经登陆NCBI BLAST核酸同源性检索为旋毛虫基因,与旋毛虫核糖体蛋白S24基因的同源性为99%。ORF中有两个碱基存在差异，分别是地135位的C-A，第327位达到A-G，对应的氨基酸有一位存在差异，即45位的Asp-Glu，第109位是同义突变。应用DNAStar软件对TS411蛋白的抗原表位进行预测，发现其存在六个潜在的抗原表位位点。
本发明相关蛋白基因的制备方法如下：
利用酶联免疫吸附试验确定肿瘤细胞抗原与旋毛虫阳性血清、旋毛虫抗原与肿瘤细胞阳性血清间存在相关抗原；利用SP2/0 高免血清对旋毛虫cDNA表达文库进行筛选，得到本相关蛋白基因。
下述的药理实验证实了本发明蛋白基因具有显著的抑制肿瘤生长的作用，可以作为制备抗肿瘤药物被应用。
旋毛虫与肿瘤相关蛋白基因抗肿瘤效果
将18～22g的BalB/C小鼠随机分为TS411原核表达蛋白肌肉免疫组、TS411原核表达蛋白腹腔免疫组、TS411真核质粒免疫组、PBS对照组，免疫佐剂对照组，pVAX-1质粒对照组，每组10只。分别将原核表达的相关抗原200μg（2μg/μL）与等量的弗氏完全佐剂乳化均匀，肌肉/腹腔免疫。将真核质粒100μg（1μg/μL）与等量的司本甘油佐剂均匀混合，肌肉注射。两周后，分别以200μg(2μg/μL)加入等体积的弗氏不完全佐剂进行第二次肌肉/腹腔免疫。将真核质粒100μg（1μg/μL）与等量的司本甘油佐剂均匀混合，肌肉注射。各照组则与实验组平行进行首免和第二次免疫。按分组情况，第二次免疫后三天于每只小鼠的右后肢皮下注射接种1×106个SP2/0细胞。荷瘤30d后，颈椎脱臼处死各个实验组小鼠，并进行肿瘤体积、重量等物理指标的测定以及CD3+、CD4+ 、CD8+、CD19+等免疫指标的检测。所有结果数据均利用SPSS 14.0 for Windows 软件进行分析，检验差异显著性。
抗肿瘤试验结果：
结果表明
TS411基因真核质粒免疫组、TS411基因原核表达蛋白腹腔免疫组、TS411基因原核表达蛋白肌肉免疫组的体内平均抑瘤率分别为：28.3%，24.7%，21.3%。接种相关蛋白基因实验组的瘤重显著低于空白对照组（P<0.01）,各组蛋白基因的抗肿瘤情况见表1）。方差分析结果表明各组瘤重有显著差异。组间检验结果显示，不同免疫途径的抑瘤率没有显著差异。
表1 相关蛋白基因对SP2/0骨髓瘤细胞荷瘤小鼠肿瘤重量和肿瘤体积的影响( 
±s,n=10)
| 组别 | 数量 | 肿瘤重量(g) (抑瘤率 %) | 肿瘤体积(cm3) (抑瘤率 %) |
| TS411原核表达蛋白腹腔免疫组 | 10 | 3.49±0.19(27.4)* | 2.84±0.23(29.2)* |
| TS411原核表达蛋白肌肉免疫组 | 10 | 3.63±0.21(24.5)* | 3.01±0.17(24.9)* |
| TS411真核质粒免疫组 | 10 | 3.79±0.18(21.2)* | 3.15±0.16(21.4)* |
| PBS | 10 | 4.81±0.11 | 4.01±0.20 |
| 免疫佐剂（E） | 10 | 4.72±0.23 | 4.24±0.17 |
| 质粒pVAX1(F) | 10 | 4.84±0.22 | 4.037±0.21 |
P*<0.001
本发明的积极效果在于：
肿瘤细胞对异体鉴识物比较敏感，旋毛虫与肿瘤细胞相关蛋白基因能产生针对肿瘤强的特异性和非特异性免疫反应，同时旋毛虫与肿瘤细胞相关抗原易于制备和工业化。
附图说明：
图1为Western-bloting 鉴定旋毛虫抗原与抗SP2/0骨髓瘤细胞抗原血清；
图中：1、旋毛虫肌幼虫抗原与SP2/0骨髓瘤细胞高免血清反应；2、SP2/0骨髓瘤细胞抗原与SP2/0骨髓瘤高免血清反应；3、旋毛虫肌幼虫抗原与阴性小鼠血清反应；4、SP2/0骨髓瘤细胞抗原与阴性小鼠血清反应。
具体实施方式：
下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例1
利用酶联免疫吸附试验确定肿瘤细胞抗原与旋毛虫阳性血清、旋毛虫抗原与肿瘤细胞阳性血清间存在相关抗原；利用SP2/0高免血清对旋毛虫cDNA表达文库进行筛选，
具体方法为:
1. Western blotting法检测抗SP2/0骨髓瘤细胞抗原的血清与旋毛虫抗原的交叉反应：方法为：以PBS 为阴性对照，对旋毛虫肌幼虫抗原进行SDS－PAGE，然后进行Western blotting，检测抗血清、阴性血清、PBS与旋毛虫肌幼虫抗原反应原性。抗血清，阴性血清在使用之前都需去除与大肠杆菌交叉反应性抗体，去除大肠杆菌交叉抗体的方法是采用与大肠杆菌裂解液共温育的方法从抗血清中去除交叉反应性抗体。在LB培养基中培养100mL大肠杆菌XL1-Blue株达到饱和。于4℃以5000g离心10min收获细菌。细菌重悬于3ml细菌悬浮缓冲液中，反复冻融数次，超声破碎菌体。4℃12 000g/min离心30min，将上清液转至另一管内，即为大肠杆菌裂解液。用封闭液以1:10稀释用于筛选的抗体。每毫升抗血清中加入0.5毫升大肠杆菌裂解液。阴性对照进行同样处理。然后置室温缓慢摇动温育4h，处理后的抗体加入0.05%叠氮钠，保存于4℃以备免疫筛选时使用。
2.含旋毛虫cDNA的λ噬菌体的平板培养，方法为：取适当大肠杆菌菌株XL1-Blue的单克隆进行接种，制备用于铺平板的培养细菌。然后以每150mm平皿可长出2×104个噬菌斑铺板，置37℃培养5~6h，至噬菌斑长至针尖大小。
3.旋毛虫与SP2/0细胞相关抗原的免疫学筛选.方法为：利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG，10mmol/L）浸泡10min的无菌硝酸纤维素膜覆盖在噬菌体培养板表面，37℃ 10h诱导蛋白质的表达，用记号笔在平皿的正面作与平皿内滤膜对应的编号，以方便筛选完毕时挑取噬菌斑。用平头镊子从平板上剥离滤膜，迅速浸入大量TNT缓冲液中，轻摇以除去滤膜上残存的琼脂糖，然后将滤膜转移至封闭缓冲液中，室温在转动平台上轻摇4-6h或4℃过夜，将滤膜放入1:5 000稀释的羊抗鼠IgG中，于室温下轻摇2h，洗涤滤膜后利用DAB显色试剂进行显色。阳性斑点呈棕色。将滤膜和培养板重合，根据滤膜所示位置，将相应的噬菌斑进行分离，方法为用去尖的1ml枪头吸起阳性噬菌斑区域的琼脂块，置于含25μl氯仿的500μlSM缓冲液中，4℃过夜，使噬菌体从琼脂块中洗脱出来。确定洗脱液中噬菌体的滴度，重新按大约每个90mm平皿2000个噬菌斑的密度铺板培养。然后同样的筛选方法对阳性克隆进行反复筛选和铺板，直至得到一致的免疫阳性重组噬菌体。
4.阳性片段的克隆，方法为：提取阳性重组噬菌体的DNA，利用通用引物扩增阳性片段，并进行测序，测序结果经登陆NCBI BLAST核酸同源性检索是旋毛虫基因，然后在此基础上采用5’-RACE末端快速扩增法获得基因全长，并通过设计特异性引物引入限制性内切酶位点对目的基因进行正向克隆，最终得到旋毛虫与肿瘤细胞相关蛋白基因，基因序列见SEQ ID NO.1：
分子量（MW）为15.6 KD；等电点（pI ：Isolectric Point）为10.56；测序结果经登陆NCBI BLAST核酸同源性检索为旋毛虫基因,与旋毛虫核糖体蛋白S24基因的同源性为99%；ORF中有两个碱基存在差异，分别是地135位的C-A，第327位达到A-G，对应的氨基酸有一位存在差异，即45位的Asp-Glu，第109位是同义突变；应用DNAStar软件对TS411蛋白的抗原表位进行预测，发现其存在六个潜在的抗原表位位点。
实验例1
1.旋毛虫与SP2/0骨髓瘤细胞相关抗原确定
首先制备旋毛虫可溶性抗原和SP2/0骨髓瘤细胞抗原并分别免疫BalB/C小鼠制备两种抗原的阳性血清。按常规操作步骤包被旋毛虫可溶性抗原和SP2/0骨髓瘤细胞抗原并使其分别与SP2/0骨髓瘤细胞阳性血清、旋毛虫阳性血清、健康鼠血清反应，酶标仪测得OD490值，以P/N≥3为判定标准，ELISA结果显示旋毛虫肌幼虫抗原与SP2/0骨髓瘤细胞抗体以及SP2/0骨髓瘤细胞抗原与旋毛虫抗体均具有较好的免疫交叉反应，所获得的最佳抗体效价分别是：骨髓瘤细胞高免血清1：6 400；旋毛虫高免血清1：3 200，同时两种抗原都不与健康小鼠血清反应。
2. 旋毛虫与SP2/0骨髓瘤细胞相关抗原的western bloting检测
以PBS 为阴性对照，对旋毛虫抗原蛋白进行SDS-PAGE，然后进行Western blotting，检测抗血清、阴性血清、PBS与旋毛虫肌幼虫抗原反应原性。经过 Western blotting可以发现，抗SP2/0骨髓瘤细胞抗原的血清能与旋毛虫抗原、骨髓瘤细胞抗原特异结合，而阴性血清不能与旋毛虫抗原、骨髓瘤细胞抗原特异结合。
3.旋毛虫与SP2/0骨髓瘤细胞相关抗原的免疫筛选
利用抗SP2/0骨髓瘤细胞的高免血清对旋毛虫cDNA表达文库进行交叉免疫筛选，获得旋毛虫与SP2/0骨髓瘤细胞相关抗原，首先去除抗SP2/0骨髓瘤细胞的高免血清的交叉反应性抗体，方法是采用与XL1-Blue株大肠杆菌裂解液共温育的方法从抗血清中去除交叉反应性抗体。然后用旋毛虫cDNA文库的λ噬菌体铺平板，对噬菌斑进行免疫筛选。筛选方法是运用将与IPTG共孵育的无菌的硝酸纤维素膜无缝覆盖在噬菌斑上进行培养，噬菌体所表达的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜进行原位western bloting 检测，筛选旋毛虫与SP2/0骨髓瘤相关抗原的阳性克隆。分离阳性克隆噬菌斑并进行3次复筛，直至得到一致的免疫阳性重组噬菌体。
4.阳性克隆的PCR扩增
挑取阳性噬菌斑，均匀稀释到200μL SM buffer中，取50μL沸水裂解10min，得到含有阳性cDNA的噬菌体裂解液，以裂解液作为模板，用通用引物进行PCR扩增。将得到的PCR产物克隆入pMD-18T 载体中，送至生物公司测序。得到目的蛋白的核苷酸序列。含有一个411bp的开放阅读框。其精确分子量是15.6 KD，pI是10.56，共由136个氨基酸组成。
5.蛋白基因的原核表达和真核质粒的构建
利用特异性引物在PCR扩增的TS411基因片段两端引入特异性酶切位点，并连接到pMD-18T载体中，通过特异性的酶切位点，将TS411亚克隆入原核表达载体pET-28a(+)和真核表达载体pVAX-1载体中。获得原核表达质粒pET-28a-TS411和真核表达质粒pVAX-1-TS411。将获得的pET-28a-TS411转化至E.coli BL21（DE3）中，利用终浓度为1mM 的IPTG对TS411进行诱导表达，经验证原核表达菌种在37℃ 4h 的诱导条件下获得最佳表达效果，表达产物以包涵体的形式存在。利用镍柱法对表达获得的蛋白进行分离和纯化，并对纯化蛋白进行梯度复性，将复性的蛋白-80℃保存备用。无内毒素的真核质粒的大量获得方法为，将构建的pVAX-1-TS411转化至克隆菌E.coliTOP10中，利用无内毒素质粒大量提取试剂盒进行大量提取，并保存至-80℃备用。
SEQ ID NO.1
atggtgctta cggatagtac aattacagtg cgtactcgta aattgatgac caatcgtttg 60
ctttgtcgca agcagatgat tgtcgatgtt attcatccaa ataaagatgg agtttcaaaa 120
gctacccttt gtgaaatgct tgcaaagtcg tacaaaacta cgccggatgt tgtattttgt 180
ttcggctttc gaacttgcta tggtggtggc aggtcatccg gttttgcgtt gatttatgac 240
gctctggatt atgcaaaaaa attcgaaccc aaacatcgat tagtcaggaa aggtttgctc 300
acacgggagc gcacaggccg taaacagcgt aaagagcgta aaaatcgtat gaagaaggta 360
cgtggtacga tgaaaagcaa agtgggacaa gctgctaaaa aagaaaaatg a 411
Claims (3)
1. 一种旋毛虫与肿瘤细胞相关蛋白基因，如SEQ ID NO.1所示。
2. 如权利要求1所述相关基因蛋白的制备方法，包括以下步骤：
利用酶联免疫吸附试验确定肿瘤细胞抗原与旋毛虫阳性血清、旋毛虫抗原与肿瘤细胞阳性血清间存在相关抗原；利用SP2/0 高免血清对旋毛虫cDNA表达文库进行筛选，得到相关蛋白基因。
3. 旋毛虫与肿瘤细胞相关蛋白基因用于制备治疗肿瘤的药物。
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