CN109415431A - 与k180二甲基化h1.0蛋白相关的组合物和方法 - Google Patents

与k180二甲基化h1.0蛋白相关的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109415431A
CN109415431A CN201780038066.1A CN201780038066A CN109415431A CN 109415431 A CN109415431 A CN 109415431A CN 201780038066 A CN201780038066 A CN 201780038066A CN 109415431 A CN109415431 A CN 109415431A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
antibody
individual
protein
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780038066.1A
Other languages
English (en)
Inventor
V·伦亚克
J·R·托勒维
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alan Cell Technology Co
Original Assignee
Alan Cell Technology Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alan Cell Technology Co filed Critical Alan Cell Technology Co
Publication of CN109415431A publication Critical patent/CN109415431A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
    • C12Y201/01043—Histone-lysine N-methyltransferase (2.1.1.43)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Abstract

本文提供了H1.0K180me2抗体、H1.0K180me2蛋白和H1.0K180me2肽以及用于诊断和治疗的方法。这些H1.0K180me2抗体、H1.0K180me2蛋白和H1.0K180me2肽可用于治疗个体中甲基化H1.0相关的疾病或病状。这些H1.0K180me2抗体、H1.0K180me2蛋白和H1.0K180me2肽还可用于检测和量化在赖氨酸残基180(H1.0K180me2)处包含二甲基化赖氨酸的组蛋白H1.0蛋白或其片段；此类组合物和方法可用于检测复制性衰老、DNA损伤、基因毒性应激、辐射暴露、阿尔茨海默病，可用于监测治疗方案、患者分层、药物筛选，并可用作系统中生物老化的标志物。

Description

与K180二甲基化H1.0蛋白相关的组合物和方法
相关申请
本申请要求于2016年4月20日提交的美国临时申请序列号62/325,392、于2016年4月20日提交的美国临时申请序列号62/325,362、于2016年4月20日提交的美国临时申请序列号62/325,408、于2016年6月27日提交的美国临时申请序列号62/355,265以及于2016年6月27日提交的美国临时申请序列号62/355,277的优先权，将其各自通过引用以其整体并入本文。
发明背景
细胞染色质是一种动态聚合物，其能够进行多种配置，并且在接受生理学相关输入时易于重构和重组。组蛋白是染色质的主要蛋白质组分，并且双链DNA围绕组蛋白卷绕。组蛋白的变化可差异地改变一些基因的转录机制通路，同时保持其他基因的通路完整。通过组蛋白翻译后修饰(PTM)实现的染色质凝聚差异是染色质包装的基础(Lunyak和Rosenfeld 92008)Hum.Mol.Genet.,17:R28-36；Jenuwein和Allis(2001)Science,293:1074-1080)。组蛋白PTM，例如甲基化，可作为表观遗传密码，并且在与发育、损伤、疾病和衰老紧密相关的细胞应答的许多方面中起关键作用。
存在五个主要的组蛋白家族：H1、H2A、H2B、H3和H4。组蛋白H2A、H2B、H3和H4被称为核心组蛋白，而组蛋白H1和H5被称为接头组蛋白。近年来通过多项研究鉴定的大量H1.0结合蛋白指出了H1.0的蛋白质-蛋白质相互作用的重要作用，并且提出了H1.0结构和功能的新范例，超越了它对染色质构造的影响。
需要在各种细胞环境中检测H1.0甲基化；并且需要敏感的测定来区分各种类型的细胞环境，因为它们与疾病的发展、对损伤的响应和对治疗方案的响应有关。还需要治疗性地解决甲基化H1.0相关的疾病和病状。本文提供用于此目的的方法和组合物。
发明概述
本文提供了H1.0K180me2抗体、H1.0K180me2蛋白和H1.0K180me2肽以及用于诊断和治疗的方法。这些H1.0K180me2抗体、H1.0K180me2蛋白和H1.0K180me2肽可用于治疗个体中甲基化H1.0相关的疾病或病状。这些H1.0K180me2抗体、H1.0K180me2蛋白和H1.0K180me2肽还可用于检测和量化在赖氨酸残基180(H1.0K180me2)处包含二甲基化赖氨酸的组蛋白H1.0蛋白或其片段；此类组合物和方法可用于检测复制性衰老、DNA损伤、基因毒性应激、辐射暴露、阿尔茨海默病，可用于监测治疗方案、患者分层、药物筛选，并可用作系统中生物老化的标志物。
在一个方面，本文提供了一种特异性结合二甲基化抗原的抗体，其中该二甲基化抗原包含二甲基化赖氨酸残基，其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0的K180，并且其中该二甲基化赖氨酸残基是结合(H1.0K180me2抗体)所需的。在一些实施方案中，二甲基化抗原不包含甲基化的任何其他赖氨酸残基。在一些实施方案中，如果抗原在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K166、K172、K174、K175和/或K177的赖氨酸残基处包含二甲基化赖氨酸残基，则该抗体不结合或仅最低限度结合。在一些实施方案中，该抗体不结合或仅最低限度结合在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K166、K172、K174、K175、K177和/或K180的赖氨酸残基处包含单甲基化赖氨酸残基的抗原。在一些实施方案中，如果抗原在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K166、K172、K174、K175、K177和/或K180的赖氨酸残基处包含三甲基化赖氨酸残基，则该抗体不结合或仅最低限度结合。在一些实施方案中，该抗体对二甲基化抗原的特异性比单甲基化抗原高至少2倍，其中该单甲基化抗原包含单甲基化赖氨酸残基，并且其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体被标记。在一些实施方案中，该抗体是生物素酰化的。在一些实施方案中，该抗体附接至固体表面。在一些实施方案中，该抗体附接珠、柱、树脂或微板。在一些实施方案中，该抗体是细胞穿透抗体。在一些实施方案中，该抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中，该抗体是人抗体。在一些实施方案中，该抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，该抗体缀合至至少一种选自由以下组成的组的治疗剂：放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA和二抗。在一些实施方案中，该抗体能够清除样品中的H1.0K180me2。在一些实施方案中，该抗体能够清除包含H1.0K180me2的细胞。在一些实施方案中，该抗体能够清除衰老细胞。
在另一方面，本文提供了一种治疗个体中甲基化H1.0相关疾病或病状的方法，其包括向个体施用治疗有效量的本文提供H1.0K180me2抗体中的任一种。在一些实施方案中，甲基化H1.0相关疾病或病状选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒性应激物暴露、包含衰老细胞积聚的疾病或病状、以及伴随H1.0K180me2蛋白或肽水平升高的疾病或病状。在另一个相关方面，本文提供了一种清除个体中H1.0K180me2的方法，其包括向个体施用治疗有效量的本文提供H1.0K180me2抗体中任一种的抗体，例如用于治疗患有选自由以下组成的组的疾病或病状的个体：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒素暴露、DNA损伤剂暴露、以及包含衰老细胞积聚的病状。在相关方面，本文提供了包含本文所述H1.0K180me2抗体中任一种的药物组合物、试剂盒和其他制品。
在另一方面，本文提供了一种包含二甲基化赖氨酸残基的组蛋白H1.0肽，或一种包含二甲基化赖氨酸残基的组蛋白H1.0蛋白，其中该二甲基化赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0的K180(H1.0K180me2肽和H1.0K180me2蛋白)。在一些实施方案中，该肽包含选自由SEQID NO:3-35组成的组的序列。在一些实施方案中，该肽包含选自由SEQ ID NO:3-5组成的组的序列。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO:3的序列。在一些实施方案中，该肽或蛋白质不包含甲基化的任何其他赖氨酸残基。在一些实施方案中，该肽或蛋白质被标记。在一些实施方案中，该肽或蛋白质是生物素酰化的。在一些实施方案中，该肽或蛋白质附接至固体表面。在一些实施方案中，该肽或蛋白质附接珠、柱、树脂或微板。在一些实施方案中，该肽或蛋白质缀合至至少一种选自由以下组成的组的治疗剂：放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA和二抗。在一些实施方案中，该肽或蛋白质能够清除或阻断H1.0K180me2自身抗体。在一些实施方案中，该肽或蛋白质能够清除或阻断H1.0K180me2 IgG自身抗体。在一些实施方案中，该肽或蛋白质能够清除或阻断H1.0K180me2IgM自身抗体。
在另一方面，本文提供了一种治疗个体中甲基化H1.0相关疾病或病状的方法，其包括向个体施用治疗有效量的本文所述H1.0K180me2蛋白或H1.0K180me2肽中的任一种。在一些实施方案中，甲基化H1.0相关疾病或病状选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒性应激物暴露、包含衰老细胞积聚的疾病或病状、以及伴随H1.0K180me2自身抗体水平升高的疾病或病状。在相关方面，本文提供了一种清除、阻断或中和个体中H1.0K180me2自身抗体的方法，其包括向个体施用治疗有效量的本文所述H1.0K180me2蛋白或H1.0K180me2肽中的任一种。在一些实施方案中，该个体患有选自由以下组成的组的疾病或病状：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒性应激物暴露、包含衰老细胞积聚的疾病或病状、或伴随H1.0K180me2自身抗体水平升高的疾病或病状。在相关方面，本文提供了包含本文所述H1.0K180me2肽或蛋白质中任一种的药物组合物、试剂盒和其他制品。
在另一方面，本文提供了一种确定个体是否患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中的方法，其包括：(a)使来自个体的生物样品与本文提供的任何H1.0K180me2抗体接触；和(b)测定该样品中结合该抗体的H1.0K180me2抗原的浓度，其中该浓度相对于对照降低指示该个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。在一个实施方案中，当组蛋白H1.0蛋白的血清浓度小于或低于5.61nmol/ml时，个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。在一些实施方案中，当PLR(LR+)是3.6或更高时，个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。在一些实施方案中，当NLR(LR-)是0.26或更低时，个体不具有发展阿尔茨海默病的风险。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果确定个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗该个体。因此，本文提供了一种当组蛋白H1.0蛋白的血清浓度小于或低于5.61nmol/ml和/或当测量PLR(LR+)是3.6时(如由上述方法测定的)用阿尔茨海默病药物或方案治疗个体的方法。
在另一方面，本文提供了一种确定个体是否患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中的方法，其包括：(a)使来自个体的生物样品与本文提供的H1.0K180me2蛋白或H1.0K180me2肽接触；和(b)测定该样品中结合该蛋白质或肽的自身抗体的浓度，其中该浓度相对于对照增加指示该个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。在一些实施方案中，该方法包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgM自身抗体的浓度。在一些实施方案中，该方法包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgG自身抗体的浓度。在一些实施方案中，当归一化为总IgG水平，IgG自身抗体的血清浓度大于或等于9.69ug/ml时，个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。在一些实施方案中，当归一化为血清体积，IgG自身抗体的血清浓度大于或等于8.23ug/ml时，个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。在一些实施方案中，当归一化为血清体积，IgM自身抗体的血清浓度大于或等于409fMol/ml时，个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。在一些实施方案中，当IgM自身抗体的浓度与总IgM浓度的比率大于26.6x10-6时，个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。在一些实施方案中，当IgG自身抗体的PLR(LR+)是2.4或更大或者IgM自身抗体的PLR(LR+)是3.5或更大时，个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。在一些实施方案中，该方法包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgM自身抗体的浓度，并将该测量值与该样品中的总IgM浓度进行比较。在一些实施方案中，该方法包括如果确定个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗该个体。
在另一方面，本文提供了一种确定被诊断患有阿尔茨海默病并接受阿尔茨海默病治疗的个体是否将受益于该治疗或将继续受益于该治疗的方法，该方法包括：(a)使来自个体的生物样品与本文提供的任何H1.0K180me2抗体接触；(b)测定该样品中结合该抗体的H1.0K180me2抗原的浓度；以及(c)如果该浓度相对于对照增加，则确定该个体将受益于该治疗或将继续受益于该治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果确定个体将受益于或继续受益于该治疗，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗该个体。
在另一方面，本文提供了一种确定被诊断患有阿尔茨海默病并接受阿尔茨海默病治疗的个体是否将受益于该治疗或将继续受益于该治疗的方法，该方法包括：(a)使来自个体的生物样品与本文提供的H1.0K180me2蛋白或肽接触；(b)测定该样品中结合该蛋白质或肽的自身抗体的浓度；以及(c)如果该浓度相对于对照降低，则确定该个体将受益于该治疗或将继续受益于该治疗。在一些实施方案中，该方法包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgM自身抗体的浓度。在一些实施方案中，该方法包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgG自身抗体的浓度。
在另一方面，本文提供了一种确定被诊断患有阿尔茨海默病的个体是否将受益于候选治疗的方法，其中该个体尚未开始该治疗，该方法包括：(a)向个体施用候选治疗；(b)在施用候选治疗之后，使来自该个体的生物样品与本文提供的任何H1.0K180me2抗体接触；(c)测定该样品中结合该抗体的H1.0K180me2抗原的浓度和/或亚细胞定位；以及(d)如果相对于对照，该浓度增加或细胞质亚细胞定位减少，则确定该个体将受益于候选治疗。
在另一方面，本文提供了一种确定被诊断患有阿尔茨海默病的个体是否将受益于候选治疗的方法，其中该个体尚未开始该治疗，该方法包括：(a)使来自个体的生物样品与候选治疗接触；(b)使该生物样品与本文提供的任何H1.0K180me2抗体接触；(c)测定该样品中结合该抗体的H1.0K180me2抗原的浓度和/或亚细胞定位；以及(d)如果该浓度相对于对照增加或细胞质亚细胞定位相对于对照减少，则确定该个体将受益于候选治疗。
在另一方面，本文提供了一种确定被诊断患有阿尔茨海默病的个体是否将受益于候选治疗的方法，其中该个体尚未开始该治疗，该方法包括：(a)向个体施用候选治疗；(b)使来自该个体的生物样品与本文提供的H1.0K180me2蛋白或H1.0K180me2肽接触；(c)测定该样品中结合该蛋白质或肽的自身抗体的浓度；以及(d)如果该浓度相对于对照降低，则确定该个体将受益于该候选治疗。
因为其涉及与阿尔茨海默病方法有关的方法，在一些实施方案中，测量的变化(增加、减少或无变化)是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。在一些实施方案中，生物样品选自由以下组成的组：全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液和淋巴液。在一些实施方案中，该个体的年龄是60岁或更大。在一些利用抗体的实施方案中，该抗体被标记。在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体附接至珠、柱、树脂或微板。在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白或H1.0K180me2肽被标记。在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白或H1.0K180me2肽是生物素酰化的。在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白或H1.0K180me2肽附接至珠、树脂、柱或微板。在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白包含SEQID NO:2的序列。在一些实施方案中，H1.0K180me2肽包含SEQ ID NO:3-35序列中的任一个。在一些实施方案中，H1.0K180me2肽包含SEQ ID NO:3的序列。在一些实施方案中，测定对H1.0K180me2抗原具有特异性的自身抗体的浓度。在一些实施方案中，通过ELISA测定H1.0K180me2或H1.0K180me2自身抗体的浓度。在一些实施方案中，测定IgG自身抗体的浓度。在一些实施方案中，测定IgM自身抗体的浓度。在一些实施方案中，测定IgG和IgM自身抗体的浓度。
在与确定被诊断患有阿尔茨海默病的个体是否将受益于候选治疗，以及确定被诊断患有阿尔茨海默病并接受阿尔茨海默病治疗的个体是否将受益于该治疗或将继续受益于该治疗有关的各个方面中，该治疗选自由以下组成的组：APP合成抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂和调节剂、Aβ聚集抑制剂、Aβ免疫疗法、降胆固醇药物、抗tau药物、胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、非典型抗精神病药、蛋白质S-亚硝基化的阻断剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、雷帕霉素、rapalogue、内源性大麻素、大麻素、神经保护剂、控制钙内流的分子、抗氧化剂、抗炎药物、控制谷氨酸稳态控制的药物、自噬诱导剂、激素、激素调节剂、他汀类、胰岛素、胰岛素载体、多功能纳米载体、维生素、营养补充剂、小RNA分子、肽和超声疗法。
在另一方面，本文提供了一种确定个体是否已暴露于DNA损伤剂的方法，其包括：(a)使来自个体的生物样品与本文提供的任何H1.0K180me2抗体接触；和(b)测定该样品中结合该抗体的H1.0K180me2抗原的浓度，其中该浓度相对于对照增加指示该个体已暴露于DNA损伤剂。在一些实施方案中，该增加高于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。在一些实施方案中，DNA损伤剂是辐射。在一些实施方案中，生物样品选自由以下组成的组：全血、血浆、血清、唾液、尿液、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液和淋巴液。在一些实施方案中，该抗体被标记。在一些实施方案中，该抗体附接至珠、树脂、柱或微板。在一些实施方案中，通过ELISA测定该浓度。在一些实施方案中，该抗体对二甲基化K180抗原的特异性比单甲基化抗原高至少2倍，其中该单甲基化抗原包含单甲基化赖氨酸残基，并且其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。在一些实施方案中，该抗体对二甲基化抗原的特异性比三甲基化抗原高至少2倍，其中该三甲基化抗原包含三甲基化赖氨酸残基，并且其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。在一些实施方案中，该抗体是抗原结合片段。
在另一方面，本文提供了一种确定个体是否已暴露于DNA损伤剂的方法，其包括：(a)使来自个体的生物样品与本文提供的任何H1.0K180me2蛋白或H1.0K180me2肽接触；和(b)测定该样品中结合该蛋白质或肽的自身抗体的浓度，其中该浓度相对于对照增加指示该个体已暴露于DNA损伤剂。在一些实施方案中，该增加高于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。在一些实施方案中，DNA损伤剂是辐射。在一些实施方案中，生物样品选自由以下组成的组：全血、血浆、血清、唾液、尿液、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液和淋巴液。在一些实施方案中，该蛋白质或肽包含标记。在一些实施方案中，该蛋白质或肽附接至珠、树脂、柱或微板。在一些实施方案中，通过ELISA测定该浓度。在一些实施方案中，该肽包含SEQ IDNO:3-35序列中的任一个。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方案中，该肽包含SEQ ID NO:3的序列。
在另一方面，本文提供了一种确定接受用rapalogue进行的治疗的个体是否响应于这种治疗的方法，其包括：(a)使来自个体的生物样品与本文提供的任何H1.0K180me2抗体接触；(b)测定该样品中结合该抗体的H1.0K180me2抗原的浓度；以及(c)确定该个体是否响应于治疗，其中该浓度相对于对照降低指示该个体是响应的。在一些实施方案中，该降低低于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。在一些实施方案中，rapalogue选自由以下组成的组：雷帕霉素、西罗莫司、雷帕鸣、依维莫司、RA 001、Afinitor、Zortress、坦罗莫司、CCI-779、驮瑞塞尔、地磷莫司、AP23573、MK-8669、Deforolimus、佐他莫司、ABT-578、AZD8055、AZD2014、OSI-027、MLN0128、WYE-132、Torin1、PI-103、P7170、PF-04691502、PF-05212384、PKI-587、GNE477、PKI-180、WJD008、XL765、SAR245409、NVP-BEZ235、BGT226、SF1126、GSK2126458、Ku-0063794、WYE-354、NVP-BEZ235、PF-05212384、XL765、Torin 2、WYE-125132和OSI-027。在一些实施方案中，生物样品选自由以下组成的组：全血、血浆、血清、唾液、尿液、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液和淋巴液。在一些实施方案中，该抗体被标记。在一些实施方案中，该抗体附接至珠、树脂、柱或微板。在一些实施方案中，通过ELISA测定该浓度。在一些实施方案中，该抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中，该抗体对二甲基化K180抗原的特异性比单甲基化抗原高至少2倍，其中该单甲基化抗原包含单甲基化赖氨酸残基，并且其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。在一些实施方案中，该抗体对二甲基化抗原的特异性比三甲基化抗原高至少2倍，其中该三甲基化抗原包含三甲基化赖氨酸残基，并且其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。
在另一方面，本文提供了一种确定接受用rapalogue进行的治疗的个体是否响应于这种治疗的方法，其包括：(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2肽或H1.0K180me2蛋白接触；(b)测定该样品中结合该蛋白质或肽的自身抗体的浓度；以及(c)确定该个体是否响应于治疗，其中自身抗体浓度相对于对照变化指示该个体是响应的。在一些实施方案中，该变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。在一些实施方案中，rapalogue选自由以下组成的组：雷帕霉素、西罗莫司、雷帕鸣、依维莫司、RA 001、Afinitor、Zortress、坦罗莫司、CCI-779、驮瑞塞尔、地磷莫司、AP23573、MK-8669、Deforolimus、佐他莫司、ABT-578、AZD8055、AZD2014、OSI-027、MLN0128、WYE-132、Torin1、PI-103、P7170、PF-04691502、PF-05212384、PKI-587、GNE477、PKI-180、WJD008、XL765、SAR245409、NVP-BEZ235、BGT226、SF1126、GSK2126458、Ku-0063794、WYE-354、NVP-BEZ235、PF-05212384、XL765、Torin 2、WYE-125132和OSI-027。在一些实施方案中，生物样品选自由以下组成的组：全血、血浆、血清、唾液、尿液、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液和淋巴液。在一些实施方案中，该蛋白质或肽包含标记。在一些实施方案中，该蛋白质或肽附接至珠、树脂、柱或微板。在一些实施方案中，通过ELISA测定该浓度。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方案中，该肽包含SEQ ID NO:3-35序列中的任一个。在一些实施方案中，该肽包含SEQID NO:3的序列。
在另一方面，本文提供了一种包含H1.0K180me2肽或H1.0K180me2蛋白的诊断试剂盒。在一些实施方案中，该蛋白质或肽包含选自由SEQ ID NO:3-35组成的组的序列。在一些实施方案中，该蛋白质或肽包含标记。在一些实施方案中，该蛋白质或肽是生物素酰化的。在一些实施方案中，该蛋白质或肽附接至固体表面。在一些实施方案中，该蛋白质或肽附接珠、树脂、柱或微板。在一些实施方案中，提供该蛋白质或肽用于检测样品中的H1.0K180me2自身抗体。在一些实施方案中，提供该蛋白质或肽作为参考标准。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含H1.0K180me2抗体。在一些实施方案中，该试剂盒用于检测阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒素暴露或DNA损伤剂暴露。在一些实施方案中，该试剂盒用于药物筛选。在一些实施方案中，该试剂盒用于患者分层。在一些实施方案中，该试剂盒用于治疗选择。
在另一方面，本文提供了一种用于测量皮下靶分子浓度的透皮贴剂，其包含：(a)底物，其包含(1)H1.0K180me2抗体；或(2)H1.0K180me2蛋白或H1.0K180me2肽；和(b)多个微针。在一些实施方案中，该底物包含H1.0K180me2抗体。在一些实施方案中，该抗体被标记。在一些实施方案中，该抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中，该底物包含H1.0K180me2蛋白或H1.0K180me2肽。在一些实施方案中，该肽被标记。在一些实施方案中，该肽是生物素酰化的。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方案中，该肽包含SEQ ID NO:3-35序列中的任一个。在一些实施方案中，该肽包含SEQ ID NO:3的序列。在一些实施方案中，该贴剂是透皮微针阵列贴剂。在一些实施方案中，该底物是可弹性拉伸的。
在另一方面，本文提供了一种用于确定个体是否已暴露于辐射或DNA损伤剂的便携式单元，其包含：(a)样品收集单元；(b)读数器；(c)包含(1)H1.0K180me2抗体或者(2)H1.0K180me2蛋白或H1.0K180me2肽的测定模块；和(d)多个微针。在一些实施方案中，该底物包含H1.0K180me2抗体。在一些实施方案中，该抗体被标记。在一些实施方案中，该抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中，该底物包含H1.0K180me2蛋白或H1.0K180me2肽。在一些实施方案中，该蛋白质或肽包含标记。在一些实施方案中，该蛋白质或肽是生物素酰化的。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方案中，该肽包含SEQID NO:3-35序列中的任一个。在一些实施方案中，该肽包含SEQ ID NO:3的序列。在一些实施方案中，该肽包含SEQ ID NO:2的序列。
在另一方面，本文提供了一种适用于分析物的侧向流测定的测试条，其包括样品接收区，其中该样品接收区包含(1)H1.0K180me2抗体；或(2)H1.0K180me2蛋白或H1.0K180me2肽。在一些实施方案中，该接收区包含H1.0K180me2抗体。在一些实施方案中，该抗体被标记。在一些实施方案中，该抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中，该接收区包含H1.0K180me2蛋白或H1.0K180me2肽。在一些实施方案中，该蛋白质或肽包含标记。在一些实施方案中，该蛋白质或肽是生物素酰化的。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ IDNO:2的序列。在一些实施方案中，该肽包含SEQ ID NO:3-35序列中的任一个。在一些实施方案中，该肽包含SEQ ID NO:3的序列。在一些实施方案中，该肽包含SEQ ID NO:2的序列。
在另一方面，本文提供了一种用于二甲基化组蛋白H1.0肽或组蛋白H1.0蛋白的体外方法，其包括在产生特异性二甲基化蛋白质或肽的条件下使蛋白质或肽与甲基转移酶和甲基供体接触，其中该蛋白质或肽在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180的赖氨酸残基处被特异性二甲基化，并且其中该甲基转移酶是G9A甲基转移酶或GLP甲基转移酶。在一些实施方案中，该肽包含选自由SEQ ID NO:42-74组成的组的序列。在一些实施方案中，该蛋白质包含SEQ ID NO:1的序列。在一些实施方案中，该蛋白质或肽与G9A甲基转移酶接触。在一些实施方案中，该蛋白质或肽与GLP甲基转移酶接触。在一些实施方案中，甲基供体是S-腺苷-L-甲硫氨酸。在一些实施方案中，接触在甲基化缓冲液中进行。在一些实施方案中，大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％或甚至大于99％的产物在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180的赖氨酸残基处二甲基化。在相关方面，本文提供了一种抗体，其特异性结合由所提供的体外方法产生的二甲基化蛋白质或肽。
在另一方面，本文提供了一种由包括在允许特异性二甲基化的条件下使H1.0蛋白或H1.0肽与甲基转移酶和甲基供体接触的方法产生的在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180的赖氨酸残基处特异性二甲基化的组蛋白H1.0肽或组蛋白H1.0蛋白，其中该甲基转移酶是G9A甲基转移酶或GLP甲基转移酶。在一些实施方案中，该H1.0肽包含选自由SEQ ID NO:42-74组成的组的序列。在一些实施方案中，该H1.0蛋白包含SEQ ID NO:1的序列。在一些实施方案中，产生的特异性二甲基化H1.0蛋白包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方案中，产生的特异性二甲基化H1.0肽包含SEQ ID NO:3-35的序列。在相关方面，本文提供了一种抗体，其特异性结合由所提供的体外方法产生的二甲基化蛋白质或肽。
在另一方面，本文提供了一种用于H1.0蛋白或H1.0肽的体外甲基化的试剂盒，其包含：(a)H1.0蛋白或H1.0肽；(b)G9A甲基转移酶或GLP甲基转移酶；和甲基供体。在一些实施方案中，该试剂盒包含H1.0蛋白，其中该H1.0蛋白包含SEQ ID NO:1的序列。在一些实施方案中，该试剂盒包含H1.0肽。在一些实施方案中，该H1.0肽包含选自由SEQ ID NO:42-74组成的组的序列。在一些实施方案中，该试剂盒包含G9A甲基转移酶。在一些实施方案中，该试剂盒包含GLP甲基转移酶。在一些实施方案中，甲基供体是S-腺苷-L-甲硫氨酸。在一些实施方案中，该试剂盒进一步包含甲基化缓冲液。
在另一方面，本文提供了一种包含组蛋白H1.0肽和甲基转移酶的复合物，其中该复合物是体外的。在一些实施方案中，该H1.0肽包含选自由SEQ ID NO:42-74组成的组的序列。在一些实施方案中，该甲基转移酶是G9A甲基转移酶。在一些实施方案中，该甲基转移酶是GLP甲基转移酶。
附图简述
图1A-1B示出了使用基于发现的质谱分析的组蛋白H1.0蛋白的鉴定，其在残基180(H1.0K180me2)处包含二甲基化赖氨酸作为hADSC的细胞衰老后的翻译后修饰。图1A示出了质谱发现途径。图1B示出了未修饰的和二甲基化的肽的完整质谱。
图2A-2B示出了SR(自我更新)和REP-SEN(复制性衰老)hADSC中的组蛋白H1的六个不同变体的表达水平(图2A)和H1.0的RNA-seq读数(图2B)。
图3A-D示出了本文提供的H1.0K180me2抗体的特异性。图3A示出了侧接组蛋白H1.0K180的氨基酸，与H1.0K180me2.0蛋白和H3.0蛋白中其他赖氨酸残基的不同甲基化位点相比。图3B和图3C示出了狭缝印迹分析结果，并证明了抗体对H1.0K180me2的特异性。图3D证明了抗体对H1.0K180me2的特异性。图3E示出了组蛋白H1变体蛋白质序列的ClustalW2比对，描绘了H1.0K180嵌入其他H1变体中不存在的独特氨基酸序列中。
图4示出了使用标记的H1.0K180me2肽，使用间接ELISA检测体液样品中的H1.0K180me2自身抗体。
图5A示出了使用针对体液样品中的H1.0K180me2表位的抗体，使用夹心ELISA直接检测H1.0K180me2抗原。图5B示出了H1.0K180me2抗原夹心ELISA测试的标准曲线。
图6示出了H1.0mRNA表达在急性DNA损伤和基因毒性应激诱导的衰老后增加。
图7A示出了通过蛋白质印迹分析，在DNA损伤后立即发生的染色质的H1.0K180(H1.0K180me2)的二甲基化。图7B示出了在DNA损伤后H1.0K180me2的分泌。
图8A-8B示出了H1.0K180的二甲基化发生在PARP-1活性的上游。图8A示出了使用H1.0K180me2抗体的蛋白质印迹分析，揭示了H1.0K180甲基化发生在DNA损伤修复途径中PARP-1功能活性的上游。图8B验证了PARP-1抑制剂AG14361对PARP活性的抑制，以支持H1.0K180甲基化发生在DNA损伤修复途径中PARP-1功能活性的上游。
图9A和9B示出了对hADSC的SR、急性DNA损伤和基因毒性应激诱导的衰老的LC-MS/MS分析(图9A)和狭缝印迹分析(图9B)，揭示了二甲基化H1.0K180(H1.0K180me2)在基因毒性应激诱导的衰老后从染色质释放(图9A)，并从细胞中分泌到细胞外基质/细胞培养基中(图9B)。
图10A-10C示出了电离辐射对H1.0K180me2水平的影响。图10A示出了暴露于电离辐射诱导小鼠血清中循环H1.0K180me2水平增加。图10A和图10B示出了H1.0K180me2的存在(图10A)和量化(图10B)的狭缝印迹分析，其使用对血清中的H1.0K180me2表位具有特异性的抗体。图10C示出了在X射线照射(7Gy)后小鼠血清中H1.0K180me2表位水平的存在的蛋白质印迹分析，其使用对H1.0K180me2表位具有特异性的抗体。
图11A-11C示出了脑组织和血清中循环H1.0K180me2的年龄相关积聚。示出了小鼠(图11A)和人(图11B)脑组织中H1.0K180me2的蛋白质印迹分析，揭示了其丰度随着生物体年龄而增加。图11C示出了通过总IgG血清水平归一化的人血清样品中的H1.0K180me2水平。
图12A-12C证明了测量血清H1.0K180me2作为阿尔茨海默病的生物标志物的实用性。图12A示出了与年龄匹配对照相比时，患有阿尔茨海默病的个体的血清H1.0K180me2降低(通过血清体积归一化)。图12B示出了与年龄匹配对照相比时，患有阿尔茨海默病的个体的血清H1.0K180me2降低(通过总血清IgG水平归一化)。图12C示出了与年龄匹配对照相比时，患有阿尔茨海默病的个体的血清H1.0K180me2降低(通过总血清蛋白浓度归一化)。
图13A示出了使用间接ELISA方法可在不同的人生物流体(血浆、尿液、唾液)中检测针对H1.0K180me2产生的人IgG自身抗体。图13B证明了测量针对H1.0K180me2的IgG自身抗体作为阿尔茨海默病的生物标志物的实用性。
图14A示出了在测试和归一化条件下测量针对H1.0K180me2的IgM抗体的示意图。
图14B示出了总IgM的测量结果和抗IgM摩尔浓度对450nm处的光密度(O.D.)的标准曲线。从该曲线推断出IgM浓度。框图示出了总IgM浓度，证明了总IgM水平不会区分患有和未患有阿尔茨海默病(AD)的个体。
图14C是使用间接ELISA测定来测量和量化H1.0K180me2IgM自身抗体的示意图。
图14D示出了抗IgG摩尔浓度对450nm处的光密度(O.D.)的标准曲线。可从该曲线推断出IgM浓度。
图14E证明了测量针对H1.0K180me2的IgM自身抗体作为阿尔茨海默病的生物标志物的实用性(图中示出了原始非归一化数据)。
图15A证明了测量针对H1.0K180me2的IgM自身抗体作为阿尔茨海默病的生物标志物的实用性(图中示出了归一化为总IgM水平的数据)。
图15B证明了血清学间接ELISA在不同操作者和不同实验室环境之间测量和量化H1.0K180me2IgM自身抗体的诊断特征的稳定性和再现性。
图16A证明了在阿尔茨海默病和神经病学对照患者两者中，总IgM与H1.0K180me2IgM自身抗体之间的相关性不显著(基于R2值)。
图16B证明了总未修饰的H1.0蛋白水平(左图)和总H1.0IgM自身抗体水平(右图)不会区分患有和未患有阿尔茨海默病的个体。
图17证明了测量H1.0K180me2IgG和H1.0K180me2IgM自身抗体，并将这两个测量相关联，可将患有阿尔茨海默病的患者分层为不同的亚群。
图18示出了博来霉素治疗后SR hADSC中H1.0K180me2的蛋白质印迹分析，揭示了依维莫司(雷帕霉素的衍生物)可用于在DNA损伤后阻断H1.0K180me2的出现。
图19示出了博来霉素或替莫唑胺治疗后SR hADSC中H1.0K180me2的蛋白质印迹分析，揭示了替莫唑胺(一种可触发碱基切除修复途径的化学疗法药物)也导致H1.0K180的甲基化。
图20示出了mTOR和PI3K抑制剂对H1.0K180me2动力学的影响。
图21A-21B示出了体外G9A甲基转移酶甲基化测定的结果。G9A甲基转移酶能够甲基化H1.0肽(图21A)并且能够甲基化全长H1.0蛋白(图21B)。
图22A示出了在未甲基化H1.0肽存在下，G9A甲基转移酶特异性地且大量地二甲基化H1.0K180(所有肽的99.9％)。图22B是G9和GLP甲基转移酶的甲基化效率的表格表示。
图23示出了在二甲基化H1.0肽存在下，发生的进一步甲基化最少(仅2.64％的肽被进一步甲基化)。
图24示出了在重组的全长H1.0存在下，G9A甲基转移酶甲基化C-末端赖氨酸残基，包括H1.0K180me2。
图25示出了在未甲基化H1.0肽存在下，GLP甲基转移酶特异性地二甲基化H1.0K180(所有肽的96.6％)以产生H1.0K180me2。
图26示出了在K180二甲基化H1.0肽存在下，GLP甲基转移酶仅进一步甲基化H1.0K180和H1.0K174，并且仅具有非常低的效率(1.02％的肽被进一步甲基化)。
图27示出了用GLP甲基转移酶进行的重组全长H1.0蛋白的甲基化。
图28A-28B示出了人脂肪细胞来源的干细胞(hADSC)中G9A的siRNA敲低导致博来霉素治疗(图28A)后H1.0K180me2水平的降低(图28B)。
发明详述
本文提供了特异性结合二甲基化抗原的抗体，其中该二甲基化抗原是包含二甲基化赖氨酸残基的组蛋白H1.0肽或组蛋白H1.0蛋白，其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180，并且其中该二甲基化赖氨酸残基是结合(H1.0K180me2抗体)所需的。
本文还提供了包含二甲基化赖氨酸残基的组蛋白H1.0肽，或包含二甲基化赖氨酸残基的组蛋白H1.0蛋白，其中该二甲基化赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180(H1.0K180me2肽和H1.0K180me2蛋白)。
本文描述了这些H1.0K180me2抗体、H1.0K180me2肽和H1.0K180me2蛋白用于治疗和诊断用途。这些H1.0K180me2抗体、H1.0K180me2蛋白和H1.0K180me2肽可用于治疗个体中甲基化H1.0相关的疾病或病状。这些H1.0K180me2抗体、H1.0K180me2蛋白和H1.0K180me2肽还可用于检测复制性衰老、DNA损伤、基因毒性应激、辐射暴露、阿尔茨海默病，用于监测治疗方案、患者分层、药物筛选，并可用作系统中生物老化的标志物。
本文描述了这些和相关的组合物和方法。
I.二甲基化蛋白质和肽
A.二甲基化H1.0K180me2蛋白和肽
如本文所用的术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”是指氨基酸的聚合物，并且除非另有说明，否则包括以与天然存在氨基酸类似的方式起作用的非典型氨基酸。
本文提供了组蛋白H1.0蛋白和组蛋白H1.0肽，其包含二甲基化赖氨酸残基，其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。在对应于人H1.0蛋白的K180的残基处包含二甲基化赖氨酸的组蛋白H1.0蛋白在本文中称为“H1.0K180me2蛋白”。在对应于人H1.0蛋白的K180的残基处包含二甲基化赖氨酸的组蛋白H1.0肽在本文中称为“H1.0K180me2肽”。它们还可共同简称为“H1.0K180me2”。
本文讨论的H1.0蛋白中的残基位置是相对于参考氨基酸序列鉴定的。用于鉴定残基位置的人H1.0组蛋白蛋白是NCBI参考序列：NP_005309.1并且可访问http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_005309.1。在这种情况下，对“H1.0残基赖氨酸180”或“H1.0K180”或“K180”的引用标识是人组蛋白H1.0中从N-末端的第180个氨基酸的残基，其中该蛋氨酸是第一个残基。人H1.0中的第180个残基是赖氨酸(K)。本领域技术人员理解，K180残基可在来自不同物种或不同同种型的H1蛋白中具有不同的位置。
本文中术语“K180”的使用是指对应于人H1.0蛋白的K180的残基。类似地，术语“K172”是指对应于人H1.0蛋白的K172的残基等。
表1提供了全长人H1.0蛋白的194个氨基酸的序列(NCBI参考序列：NP_005309.1)，从1-194顺序编号。K180残基示出为K＊。
表1：人H1.0蛋白的全长序列
表2提供了在K180处二甲基化的全长人H1.0蛋白的194-氨基酸序列，从1-194顺序编号。K180me2残基示出为K(me2)。
表2：在K180处二甲基化的人H1.0蛋白的全长序列
在某些实施方案中，二甲基化H1.0K180me2肽(包含由本文提供的H1.0K180me2抗体识别的K180me2表位)包含选自表3A中所示序列的氨基酸序列。
表3A：示例性H1.0K180me2肽
本文的H1.0K180me2蛋白和肽可进一步缀合用于多种目的，包括但不限于用于治疗、检测、诊断、可视化、量化、分选和用于与其治疗用途相关的生物学测定。
在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白和肽包含标记(例如缀合至标记)，例如可检测标记、旋转标记、比色标记、放射性标记、酶标记、荧光标记或磁性标记。在示例性实施方案中，H1.0K180me2蛋白/肽是生物素酰化的。在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白/肽缀合或附接至固体表面，例如珠(例如磁性、玻璃或塑料珠)、柱、树脂或微板。在一些实施方案中，将H1.0K180me2蛋白/肽涂布在微板上。在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白/肽缀合至或包含效应分子，包括但不限于放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA和二抗。
在一些实施方案中，氨基酸序列进一步包含另外的末端残基，例如，出于缀合的目的。在一些实施方案中，氨基酸序列进一步包含末端C残基。在此类实施方案中，H1.0K180me2肽可包含氨基酸序列CAKPVKASKPKKAKPVKPK(SEQ ID NO:36)、CAKPVKASKPKKAKPVKPKC(SEQ ID NO:37)、AKPVKASKPKKAKPVKPKC(SEQ ID NO:38)、CAKPVKASKPKKAKPVK(me2)PK(SEQ ID NO:39)、CAKPVKASKPKKAKPVK(me2)PKC(SEQ ID NO:40)或AKPVKASKPKKAKPVK(me2)PKC(SEQ ID NO:41)。在一些实施方案中，H1.0K180me2肽包含本文提供的H1.0K180me2肽中的任一种的片段。在一些实施方案中，H1.0K180me2肽缀合至KLH(匙孔血蓝蛋白)、OVA(卵清蛋白)、BC(细菌纤维素)或BSA(牛血清白蛋白)。
本文提供的H1.0K180me2蛋白和肽两者均可用于检测病理生理学，并且在结合量化评估H1.0K180me2存在的方法中包含作为参考标准。
蛋白质或肽的体外甲基化传统上提出了特异性的挑战(例如待甲基化的底物的特异性；以及对其的控制)。本文描述了允许使用G9A甲基转移酶或GLP甲基转移酶将H1.0蛋白(或其肽片段)的K180残基选择性二甲基化的方法。
本文提供了与在赖氨酸残基180(K180)处特异性二甲基化组蛋白H1.0蛋白(具有K180me2的H1.0)以及在对应于K180的赖氨酸处特异性二甲基化组蛋白H1.0蛋白的肽片段相关的组合物和方法。
B.H1.0K180me2肽的产生
H1.0K180me2肽可用于间接检测病理生理学，并且用于作为参考标准包含用于量化以下方法中的数据，包括但不限于(1)以下项的分子诊断：至少DNA损伤、基因毒性应激(例如与环境暴露相关)、辐射暴露、用携带DNA损伤有效载荷的抗体进行的化学疗法和免疫疗法、放射疗法、以及阿尔茨海默病，(2)监测治疗方案和患者分层，(3)药物筛选和(4)治疗用途。
本文提供的H1.0K180me2肽的长度范围为5-193个氨基酸(aa)。在各种实施方案中，H1.0K180me2肽的长度是5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa、20aa、21aa、22aa、23aa、24aa、25aa、26aa、27aa、28aa、29aa或30aa。在某些示例性实施方案中，H1.0K180me2肽的长度是15aa、16aa、17aa、18aa、19aa或20aa。
表3A中列出的是可使用本文所述的方法和组合物合成产生的示例性1.0K180me2肽。在一些实施方案中，本发明的H1.0K180me2肽包含选自表3A中所示那些的序列之一。在一些实施方案中，H1.0K180me2肽由选自表3A中所示那些的序列之一组成。在示例性实施方案中，H1.0K180me2肽包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的序列。在示例性实施方案中，H1.0K180me2肽由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的序列组成。表3A中提供的肽可进一步包含标记，例如生物素。
本文提供了体外生产H1.0K180me2肽(合成产生的H1.0K180me2肽)的方法。通常，该方法包括使底物肽与G9A甲基转移酶或G9A样蛋白(GLP)甲基转移酶和甲基供体在允许特异性二甲基化对应于组蛋白H1.0蛋白的K180的赖氨酸残基的条件下接触(体外甲基化)。在各种实施方案中，底物H1.0肽包含选自由表3B中所示序列组成的组的序列。在相关的实施方案中，该肽是选自由表3B中所示序列组成的组的序列。
用于甲基化的肽可使用本领域技术人员熟悉的方法合成产生或产生。
表3B：用于体外甲基化的H1.0肽
通常，用于二甲基化组蛋白H1.0肽的方法包括在产生特异性二甲基化肽的条件下使肽与甲基转移酶和甲基供体接触，其中该肽在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180的赖氨酸残基处被特异性二甲基化，并且其中该甲基转移酶是G9A甲基转移酶或GLP甲基转移酶。
在体外生产H1.0K180me2肽的方法的实施方案中，G9A甲基转移酶可以是重组G9A甲基转移酶、纯化的G9A哺乳动物甲基转移酶、人G9A甲基转移酶、小鼠G9A甲基转移酶等。G9A甲基转移酶包括酶活性直向同源物、嵌合体和含有酶结构域的人工或天然产生的同种型。
在体外生产H1.0K180me2肽的方法的实施方案中，GLP甲基转移酶可以是重组GLP甲基转移酶、纯化的GLP哺乳动物甲基转移酶、人GLP甲基转移酶、小鼠GLP甲基转移酶等。GLP甲基转移酶包括酶活性直向同源物、嵌合体和含有酶结构域的人工或天然产生的同种型。
在体外生产H1.0K180me2肽的方法的实施方案中，甲基供体可以是S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)。
在体外产生H1.0K180me2肽的方法的实施方案中，接触可在甲基化缓冲液中进行。
在体外生产H1.0K180me2肽的方法的实施方案中，该肽可在甲基化之前包含标记(例如生物素)。
在体外生产H1.0K180me2肽的方法的实施方案中，该肽可在甲基化之后与标记(例如生物素)缀合。
在体外甲基化H1.0K180me2肽底物的方法的实施方案中，大于50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或甚至99.9％的产物包含K180me2。同样地，在体外生产H1.0K180me2肽的方法的实施方案中，在各种实施方案中，小于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、.5％、或小于0.35％的产物还含有其他甲基化残基(例如K172me1、K172me2、K172me3、K174me1、K174me2、K174me3、K175me1、K175me2、K175me3、K177me1、K177me2、K177me3、K166me1、K166me2、K166me3、K180me1和/或K180me3)。在示例性实施方案中，小于0.35％的具有K180me2的产物还包含K174me3、K175me3和K177me1；小于1.25％的具有K180me2的产物还包含K166me1；并且小于1.04％的具有K180me2的产物包含K174me1和K180me3。
在一些实施方案中，H1.0K180me2肽结合对H1.0K180me2抗原具有特异性的抗体(H1.0K180me2抗体)。本文提供了一种特异性结合二甲基化抗原的抗体，其中该二甲基化抗原是包含二甲基化赖氨酸残基的组蛋白H1.0肽，其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。
在某些实施方案中，H1.0K180me2肽以约0.0001nM至约1μM的解离常数(Kd)结合H1.0K180me2抗体。例如，该肽的Kd可以是约1μM、约100nM、约50nM、约10nM、约5nM、约1nM、约0.5nM、约0.1nM、约0.05nM、约0.01nM、约0.005nM、约0.001nM、约0.0005nM或甚至约0.0001nM。
在一些实施方案中，H1.0K180me2肽对抗人H1.0K180me2抗体具有特异性。在一些实施方案中，H1.0K180me2肽与来自其他物种的H1.0K180me2抗体交叉反应。
在一些实施方案中，H1.0K180me2肽对H1.0K180me2抗体具有选择性，并且表现出很少或不与H1.0K180me1或H1.0K180me3抗体结合。
在一些实施方案中，H1.0K180me2肽对H1.0K180me2抗体的结合偏好(例如亲和力)通常超过非特异性靶抗体(例如随机产生的抗体)至少约2倍、约5倍或至少约10倍、20倍、50倍、102倍、103倍、104倍、105倍或106倍。
H1.0K180me2肽对携带有效载荷的抗体(例如包括但不限于放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、拮抗剂、激动剂或受体诱饵)可具有相同特异性/选择性。
本文提供的H1.0K180me2肽可进一步缀合用于多种目的，包括但不限于用于检测、诊断、可视化、量化、分选、治疗和用于生物学测定。
在一些实施方案中，H1.0肽或H1.0K180me2肽包含标记(例如在甲基化之前或之后缀合)，例如可检测标记、旋转标记、比色标记、放射性标记、酶标记、荧光标记、磁性标记等。
在一些实施方案中，本文提供了一种包含组蛋白H1.0肽和甲基转移酶的复合物，其中该复合物是体外的(例如在试管、管子、反应室、反应容器等中)。在一些实施方案中，该H1.0肽包含选自由SEQ ID NO:42-74组成的组的序列。在一些实施方案中，该甲基转移酶是G9A甲基转移酶。在一些实施方案中，该甲基转移酶是GLP甲基转移酶。
C.H1.0K180me2蛋白的产生
本文所述的全长H1.0K180me2肽可用于检测病理生理学，并且用于作为参考标准包含在以下方法中，包括但不限于(1)以下项的分子诊断：至少DNA损伤、基因毒性应激(例如与环境暴露相关)、辐射暴露、用携带DNA损伤有效载荷的抗体进行的化学疗法和免疫疗法、放射疗法、以及阿尔茨海默病，(2)监测治疗方案和患者分层，(3)药物筛选和(4)用作治疗剂。
在一些实施方案中，本文提供了用于二甲基化组蛋白H1.0蛋白的体外方法，其包括在产生特异性二甲基化蛋白质的条件下使蛋白质与甲基转移酶和甲基供体接触，其中该蛋白质在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180的赖氨酸残基处被特异性二甲基化，并且其中该甲基转移酶是G9A甲基转移酶或GLP甲基转移酶。
在一些实施方案中，本文提供了体外生产H1.0K180me2蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括使全长H1.0蛋白与G9A甲基转移酶和甲基供体在允许特异性二甲基化K180残基的条件下接触。G9A甲基转移酶包括酶活性直向同源物、嵌合体和含有酶结构域的人工或天然产生的同种型。
在一些实施方案中，本文提供了体外生产H1.0K180me2蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括使全长H1.0蛋白与GLP甲基转移酶和甲基供体在允许特异性二甲基化K180残基的条件下接触。GLP甲基转移酶包括酶活性直向同源物、嵌合体和含有酶结构域的人工或天然产生的同种型。
用于体外甲基化的全长H1.0未甲基化蛋白质底物可使用本领域技术人员熟悉的方法分离、合成产生或重组产生。本文提供了编码H1.0K180me2蛋白的核酸。本文还提供了包含编码本文提供的H1.0K180me2蛋白的任何核酸的载体。
在体外甲基化或体外生产H1.0K180me2蛋白的方法的一些实施方案中，G9A甲基转移酶可以是重组G9A甲基转移酶、纯化的G9A哺乳动物甲基转移酶、人G9A甲基转移酶、小鼠G9A甲基转移酶等。
在体外甲基化或体外生产H1.0K180me2蛋白的方法的一些实施方案中，GLP甲基转移酶可以是重组GLP甲基转移酶、纯化的GLP哺乳动物甲基转移酶、人GLP甲基转移酶、小鼠GLP甲基转移酶等。
在体外生产H1.0K180me2蛋白的方法的一些实施方案中，该蛋白质可在甲基化之前包含标记(例如生物素)。
在体外生产H1.0K180me2蛋白的方法的一些实施方案中，该蛋白可在甲基化之后与标记(例如生物素)缀合。
在体外甲基化或体外生产H1.0K180me2蛋白的方法的一些实施方案中，甲基供体是S-腺苷-L-甲硫氨酸。
在体外生产H1.0K180me2蛋白的方法的一些实施方案中，接触在甲基化缓冲液中进行。
在体外甲基化H1.0K180me2蛋白底物的方法的实施方案中，大于50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至99.9％的产物可包含K180me2。同样地，在体外生产H1.0K180me2蛋白的方法的一些实施方案中，小于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、.5％、或小于0.35％的产物还含有其他甲基化残基(例如K172me1、K172me2、K172me3、K174me1、K174me2、K174me3、K175me1、K175me2、K175me3、K177me1、K177me2、K177me3、K166me1、K166me2、K166me3、K180me1和/或K180me3)。在示例性实施方案中，小于0.35％的具有K180me2的产物还包含K174me3、K175me3和K177me1；小于1.25％的具有K180me2的产物还包含K166me1；和/或小于1.04％的具有K180me2的产物包含K174me1和K180me3。
本文提供了一种特异性结合二甲基化抗原的抗体，其中该二甲基化抗原发现于包含二甲基化赖氨酸残基的组蛋白H1.0蛋白中，其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。
在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白对于对H1.0K180me2具有特异性的抗体(H1.0K180me2抗体)有选择性。在一些实施方案中，该肽结合对H1.0K180me2不具有特异性的抗体。
在某些实施方案中，H1.0K180me2蛋白以约0.0001nM至约1μM的解离常数(Kd)结合H1.0K180me2抗体。例如，该Kd可以是约1μM、约100nM、约50nM、约10nM、约5nM、约1nM、约0.5nM、约0.1nM、约0.05nM、约0.01nM、约0.005nM、约0.001nM、约0.0005nM或甚至约0.0001nM。
在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白对抗人H1.0K180me2抗体具有特异性。在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白与来自其他物种的H1.0K180me2抗体交叉反应。
在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白对H1.0K180me2抗体具有选择性，并且表现出很少或不与H1.0K180me1或H1.0K180me3抗体结合。
在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白对H1.0K180me2抗体的结合偏好(例如亲和力)通常超过非特异性靶抗体(例如随机产生的抗体)至少约2倍、约5倍或至少约10倍、20倍、50倍、102倍、103倍、104倍、105倍或106倍。
本文提供的H1.0K180me2蛋白可进一步缀合用于多种目的，包括但不限于用于检测、诊断、可视化、量化、分选、治疗和用于生物学测定。
在一些实施方案中，H1.0蛋白(H1.0底物)或H1.0K180me2蛋白缀合至标记(在甲基化之前或之后)，例如可检测标记、旋转标记、比色标记、放射性标记、酶标记、荧光标记、磁性标记等。
II.与二甲基化组蛋白H1.0蛋白和肽结合的抗体
A.H1.0K180me2抗体
本文提供了特异性结合二甲基化抗原的抗体，其中该二甲基化抗原是包含二甲基化赖氨酸残基的组蛋白H1.0肽或组蛋白H1.0蛋白，其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。此二甲基化抗原是H1.0K180me2抗原，也称为H1.0K180me2表位。这些抗体特异性结合H1.0K180me2蛋白和H1.0K180me2肽上的H1.0K180me2表位。这些抗体特异性结合二甲基化抗原(与H1.0K180me2表位特异性结合)并且需要在K180处存在二甲基以进行结合。术语“抗H1.0K180me2”或“H1.0K180me2抗体”或“抗H1.0K180me2抗体”可互换地指这些抗体。
如贯穿本文使用的术语“抗体”在最广泛的意义上并且包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、多功能抗原结合片段(例如Fab片段、Fab'2片段、CDR或ScFv)、抗体-药物缀合物以及其他保留对H1.0K180me2抗原的特异性的抗体片段。在一些实施方案中，该抗体是保留对H1.0K180me2抗原的特异性的单链抗体。
H1.0K180me2抗体的示意性结合在图5A中示出。
在一些实施方案中，本文提供的H1.0K180me2抗体是诊断性抗体。
在一些实施方案中，本文提供的H1.0K180me2抗体是治疗性抗体。
在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体以高滴度存在。
在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体是亲和纯化的抗体。
本文提供的H1.0K180me2抗体可进一步缀合用于多种目的，包括但不限于用于检测、诊断、可视化、量化、分选、治疗和用于生物学测定。
在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体包含标记(例如缀合至标记)，例如可检测标记、旋转标记、比色标记、放射性标记、酶标记、荧光标记或磁性标记。
在一些实施方案中，抗体缀合或附接至固体表面，例如珠(例如磁性、玻璃或塑料珠)、柱、树脂或微板。在一些实施方案中，将抗体涂布在微板上。
在一些实施方案中，抗体缀合至或包含效应分子，包括但不限于放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA和二抗。
应理解，H1.0K180me2生物标志物可以是染色质结合的，或者可从染色质释放到细胞核、细胞质或细胞外空间中。本文提供的抗体可结合细胞外H1.0K180me2和/或细胞内H1.0K180me2。如果在细胞内，则H1.0K180me2抗原可进一步与染色质结合，或在细胞核中释放，从细胞核释放到细胞质空间中，或进一步定位在细胞质亚结构中。
在一些实施方案中，该抗体(例如治疗性抗体)是中和抗体，并且该抗体中和H1.0K180me2的一种或多种生物活性。例如，该抗体可结合细胞外H1.0K180me2并且中和其可能具有的任何结合或信号传导活性。
本文提供的抗体可以是任何免疫球蛋白类型，诸如IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。在一些实施方案中，该抗体是IgG亚型，并且可以是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。
本文提供了对来自任何物种的H1.0K180me2具有特异性的抗体。在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体对人H1.0K180me2具有特异性。在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体与来自其他物种的H1.0K180me2交叉反应。
本文提供的抗体特异性地结合H1.0K180me2。在一些实施方案中，这些抗体特异性和选择性地结合H1.0K180me2。
本文提供的抗体特异性结合二甲基化抗原(H1.0K180me2抗原)，其中该二甲基化H1.0抗原包含二甲基化赖氨酸残基，其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180-在一些实施方案中，该二甲基化抗原不包含甲基化的任何其他赖氨酸残基。
在一些实施方案中，如果抗原包含二甲基化赖氨酸残基，则H1.0K180me2抗体不结合或仅最低限度结合，其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K166、K172、K174、K175和/或K177。
在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体不结合或仅最低限度结合包含以下残基中的一种或多种的抗原：K172me1、K172me2、K172me3、K174me1、K174me2、K174me3、K175me1、K175me2、K175me3、K177me1、K177me2、K177me3、K166me1、K166me2、K166me3、K180me1和/或K180me3。
在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体不结合或仅最低限度结合包含二甲基化K180残基但还包含以下残基中的一种或多种的抗原：K172me1、K172me2、K172me3、K174me1、K174me2、K174me3、K175me1、K175me2、K175me3、K177me1、K177me2、K177me3、K166me1、K166me2、K166me3、K180me1和/或K180me3。
在一些实施方案中，如果抗原在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K166、K172、K174、K175、K177和/或K180的赖氨酸残基处包含单甲基化赖氨酸残基，则H1.0K180me2抗体不结合或仅最低限度结合。
在一些实施方案中，如果抗原在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K166、K172、K174、K175、K177和/或K180的赖氨酸残基处包含三甲基化赖氨酸残基，则H1.0K180me2抗体不结合或仅最低限度结合。
在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体对残基K180处的二甲基化具有选择性，并且表现出很少或不结合H1.0K180me1表位或H1.0K180me3表位。
H1.0K180me2抗体在任何培养基中都结合H1.0K180me2表位。
在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体显示出的对K180处的二甲基化抗原(H1.0K180me2抗原)的特异性(结合偏好，亲和力)超过K180处的单甲基化抗原(H1.0K180me1抗原)至少1.5倍、2倍、2.5倍、2.7倍、5倍或甚至10倍更多。(图3D)在一些实施方案中，对H1.0K180me2抗原的特异性通常超过非特异性靶分子(例如，缺乏特异性识别位点的随机产生的分子)、单甲基化K180残基、三甲基化K180残基或任何其他残基处甲基化的H1.0蛋白至少约2倍、约5倍或至少约10倍、20倍、50倍、102倍、103倍、104倍、105倍或106倍。
在一些实施方案中，通过ELISA测定监测H1.0K180me2抗体的结合效率。在一些实施方案中，该抗体在结合H1.0K180me2肽时的有效性比结合H1.0K180me1肽时高至少2.7倍。在一些实施方案中，1个该抗体分子识别出117个H1.0K180me2肽分子中的1个，但仅识别出316个H1.0K180me1肽分子中的1个。
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有0.0001nM至1μM范围的解离常数(Kd)。例如，该抗体的Kd可以是约1μM、约100nM、约50nM、约10nM、约5nM、约1nM、约0.5nM、约0.1nM、约0.05nM、约0.01nM、约0.005nM、约0.001nM、约0.0005nM或甚至约0.0001nM。
B.H1.0K180me2抗体的产生
多种免疫测定形式可用于选择与H1.0K180me2特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定可用于选择对H1.0K180me2具有特异性的单克隆抗体(关于可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见例如，Harlow and Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York)。
本文提供的抗体的产生可通过本领域技术人员已知的任何方法进行。例如，在一些实施方案中，该抗体由重组细胞产生，该重组细胞被工程化以表达所需抗体的所需VH、VL和恒定结构域。在一些实施方案中，该抗体由杂交瘤产生。
在一些实施方案中，使用标准方案将任选地与免疫原性载体连接的包含H1.0K180me2抗原的肽用于进行免疫。在一些实施方案中，使用标准方案将任选地与免疫原性载体连接的包含表3A中所示序列的肽用于进行免疫。在示例性实施方案中，包含AKPVKASKPKKAKPVKme2PK(SEQ ID NO:3)的肽，任选地与免疫原性载体连接，并用于使用标准方案进行免疫。可使用本领域技术人员已知的技术评估产生的抗体的质量和滴度。
本文所述的本发明组合物还包括编码该抗体的核酸、包含编码该抗体的任何核酸的载体和包含任何此类载体的宿主细胞。
如本领域技术人员容易理解的，抗体还可通过许多商业服务中的任一种来制备。
III.诊断
A.H1.0K180me2的直接和间接检测
本文提供的H1.0K180me2抗体、H1.0K180me2蛋白和H1.0K180me2肽可用于多种诊断目的。
本文提供了用于直接和间接检测和量化H1.0K180me2浓度的测定。这种量化可用于检测复制性衰老、DNA损伤、基因毒性应激、辐射暴露、阿尔茨海默病和生物老化。量化还可用于监测治疗方案、药物筛选和将患者分层为如下药物治疗的应答者或无应答者，所述药物治疗旨在恢复细胞活力、防止DNA损伤、增加细胞代谢和自噬、抑制细胞衰老和阻断不溶性蛋白质废物在细胞质中积聚。取决于应用，可在体内、体外、离体、原位或无细胞系统中检测和量化H1.0K180me2。
H1.0K180me2的直接检测涉及使用H1.0K180me2抗体检测H1.0K180me2。
H1.0K180me2的间接检测涉及使用H1.0K180me2蛋白或H1.0K180me2肽，其结合响应于H1.0K180me2抗原的存在而产生的自身抗体。在此背景下，H1.0K180me2蛋白可称为H1.0K180me2自身抗体结合蛋白并且H1.0K180me2肽可称为H1.0K180me2自身抗体结合肽。
H1.0K180me2可通过本领域技术人员熟知的许多方法中的任一种来检测。本文提供的H1.0K180me2抗体、H1.0K180me2蛋白和H1.0K180me2肽易于用于各种免疫测定。这些免疫测定包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、流式细胞术、侧向流动免疫测定、狭缝印迹、磁免疫测定、放射免疫测定、间接免疫荧光测定、直接免疫荧光测定、包绕光纤免疫测定(SOFIA)、分光光度法、放射线照相术、电泳、免疫电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、高扩散色谱法、流体或凝胶沉淀反应、免疫扩散、光谱测定、质谱法、量化质谱法、任何类型的多重测定以及任何类型的微流体测定。
本文提供的H1.0K180me2抗体和H1.0K180me2蛋白或肽可包含标记(例如缀合至标记)，例如可检测标记、旋转标记、比色标记、放射性标记、酶标记、荧光标记或磁性标记。
本文提供的H1.0K180me2抗体和H1.0K180me2蛋白和肽可包含可检测标记。可检测基团可以是具有可检测的物理或化学特性(例如可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、荧光、电学、光学或化学方法检测)的任何材料。本发明中的可用标记包括但不限于磁珠(例如)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、红色、罗丹明等)、放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，LacZ、CAT、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及通常用作可检测酶的其他酶，无论用作标志物基因产物或用在ELISA中)、生物素、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白和比色标记，诸如胶体金色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠和纳米颗粒。在示例性实施方案中，生物素是该标记。
本文提供的标记可根据本领域熟知的方法直接或间接地偶联至所需的测定组分。如上所指示，可使用广泛多种的标记，其中标记的选择取决于所需要的灵敏度、化合物缀合的容易性、稳定性要求、可用仪表以及处置规定。标记经常通过间接方法附接。通常，配体分子(例如，生物素)与该分子共价结合。然后配体与抗配体(例如，链霉抗生物素蛋白)分子结合，该抗配体分子具有固有可检测性或与信号系统(诸如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物)共价结合。许多配体和抗配体可使用。当配体具有天然抗配体时(例如生物素)，其可与标记的天然存在的抗配体结合使用。可替代地，任何半抗原或抗原性化合物可与抗体组合使用。例如通过与酶或荧光团缀合，组分还可直接缀合至信号产生化合物。作为标记的感兴趣的酶包括但不限于水解酶、磷酸酶、酯酶、糖苷酶或氧转录因子还原酶和过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光化合物包括荧光素和2,3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。
检测标记的方法是本领域技术人员熟知的。因此，例如，当标记是放射性标记时，检测方法包括闪烁计数器或照相胶片，如在放射自显影中。当标记是荧光标记时，可通过用适当波长的光激发荧光染料并且例如通过显微镜检查、目视检查、通过照相胶片、通过使用电子检测器诸如电荷耦合设备(CCD)或光电倍增管等检测所得荧光来进行检测。类似地，可通过为酶提供适当底物并检测所得反应产物来检测酶标记。最后，可通过观察与标记相关的颜色简单地检测简单的比色标记。因此，在各种油尺测定中，缀合的金经常呈现粉红色，而各种缀合的珠呈现珠的颜色。
在检测对H1.0K180me2具有特异性的自身抗体的免疫测定中，特异性二级抗体可用于区分IgG、IgM、IgA、IgE和IgD自身抗体类型。
在检测时，可量化特定级分中H1.0K180me2的浓度，例如量化细胞内级分、可溶性和染色质结合级分或细胞质级分中H1.0K180me2。例如，细胞质级分中H1.0K180me2浓度的增加指示细胞的衰老状态。在一些实施方案中，对完整细胞、培养物中的细胞或切片培养物中的细胞进行成像以可视化H1.0K180me2的定位。例如，H1.0K180me2的非核子定位的增加指示衰老状态。在一些实施方案中，H1.0K180me2释放到胞质液或细胞外基质中指示衰老状态。
可对任何生物样品进行检测。生物样品包括但不限于源自个体的全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液、淋巴液或其级分。在一些实施方案中，生物样品包含细胞并且该细胞处于培养物中、悬浮液中、载玻片上、完整组织中、或准备好用于FAC分析的制剂中。
从个体获得生物样品。如本文所用，个体是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园、体育或宠物动物，诸如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。个体可以是男性或女性。在一个实施方案中，该个体是女性。在一个实施方案中，该个体是男性。
在一些实施方案中，该个体大于50岁。在本文所述方法的一些实施方案中，该个体小于50岁。在本文所述方法的一些实施方案中，该个体至少50岁、至少55岁、至少60岁、至少65岁、至少70岁、至少75岁或至少80岁。在示例性实施方案中，该个体至少60岁。
根据本领域技术人员熟知的标准方法获得生物样品。如果需要，则任选地根据需要通过在适当缓冲溶液中稀释或浓缩来预处理样品。可使用许多标准水性缓冲溶液中的任一种，其在生理pH下采用各种缓冲液(诸如磷酸盐、Tris等)中的一种。
本文所述的直接检测方法可用于量化生物样品中H1.0K180me2的浓度。在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白或肽可串联使用，例如，作为竞争性免疫测定中的阳性对照或竞争剂，并且取决于待进行的测定形式可被标记或不标记。
本文所述的间接检测方法也可用于量化生物样品中H1.0K180me2自身抗体的浓度。在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体可串联使用，例如，作为竞争性免疫测定中的阳性对照或竞争剂，并且取决于待进行的测定形式可被标记或不标记。
技术人员将理解，在一些实施方案中，可能有必要将测定的H1.0K180me2抗原或自身抗体的浓度与对照(即参考对照)进行比较。相对比较可允许，例如，确定个体是否患有疾病(例如阿尔茨海默病)或处于发展疾病的风险中或者该个体是否响应或可响应于特定治疗(例如阿尔茨海默病治疗；或用rapalogue进行的治疗)。对照可以是年龄匹配对照；性别匹配对照；年龄和性别匹配对照；健康对照；未经调整的控制；或代表参考标准汇编的参考标准。还可在治疗(例如阿尔茨海默病治疗或rapalogue治疗)之前或在暴露于例如基因毒素、DNA损伤剂或辐射之前对来自同一个体的样品进行比较。还可对来自未受影响区域(例如来自未受影响组织)的同一个体的样品进行比较。
技术人员将理解，经常需要减少免疫测定中和分析物检测期间的非特异性结合。当该测定涉及固定在固体底物上的H1.0K180me2抗体或H1.0K180me2蛋白和肽时，可能需要最小化与该底物非特异性结合的量。减少这种非特异性结合的方法是本领域技术人员已知的。通常，这涉及用蛋白质组合物涂布该底物。在一些实施方案中，可利用蛋白质组合物，诸如牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉和明胶。
可为每个诊断测试设计计算灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值(PPV和NPV)以及阳性和阴性似然比(PLR和NLR)。统计方法有助于预测患者中疾病的存在与否。
灵敏度通常是当疾病存在时测试结果将是阳性的概率(真阳性率)。
特异性通常是当疾病不存在时测试结果将是阴性的概率(真阴性率)。
阳性预测值(PPV)通常是当测试是阳性时该疾病存在的概率，考虑疾病的先期测试患病率(例如阿尔茨海默病的先期测试患病率是10％)。
阴性预测值(NPV)通常是当测试是阴性时该疾病不存在的概率，考虑AD的先期测试患病率为10％(Prince,M.J.,Am J Epidemiol,1996)。
阳性似然比(LR+或PLR)通常是具有疾病测试阳性的人的概率除以不具有疾病测试阳性的人的概率。如果测试是阳性的，则阳性似然比(PLR)通常指示增加疾病概率的程度。PLR>1指示靶标病症存在的概率增加，PLR<1指示靶标病症存在的概率降低，并且PLR＝1意指该测试不改变该疾病的概率。
阴性似然比(LR-或NLR)通常是具有疾病测试阴性的人的概率除以不具有疾病测试阴性的人的概率。如果测试是阴性的，则阴性似然比(NLR)通常指示降低疾病概率的程度。
在一些实施方案中，将对为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值水平进行比较。针对本文提供的每个测试设计示出了ROC曲线、阈值和曲线下面积(AUC)。
在一些实施方案中，本文提供的诊断方法可用于确认测试，例如，明确地确认个体患有疾病，例如阿尔茨海默病。
在其他实施方案中，本文提供的诊断方法可用于其预测值(用于测试、筛选)，例如，确定个体将发展疾病(例如阿尔茨海默病)的可能性。在此类实施方案中，诊断可涉及似然比的计算。
在其他实施方案中，本文提供的诊断方法可用作伴随诊断。在此类实施方案中，诊断可涉及阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)的计算。
在一些实施方案中，本文提供的诊断方法可用于建立诊断几率比(OR)。在此类实施方案中，诊断可涉及灵敏度和特异性的计算，并且是诊断测试的有效性的量度。
B.诊断H1.0K180me2抗体-H1.0K180me2的直接检测和量化
本文提供了特异性结合H1.0K180me2抗原的抗体，其可用于诊断。本文提供的H1.0K180me2抗体需要K180残基的二甲基化用于结合。
在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体包含标记(例如缀合至标记)，例如可检测标记、旋转标记、比色标记、放射性标记、酶标记、荧光标记或磁性标记。
在一些实施方案中，抗体缀合或附接至固体表面，例如珠(例如磁性、玻璃或塑料珠)、柱、树脂或微板。在一些实施方案中，将抗体涂布在微板上。
H1.0K180me2抗体在前述部分II中更详细地进行了讨论。
直接检测在图5A中示意性地示出。
C.诊断H1.0K180me2蛋白和肽-H1.0K180me2的间接检测和量化
本文提供了用于检测样品中天然存在的H1.0k180me2-自身抗体的H1.0K180me2蛋白和H1.0k180me2肽。
应理解，响应于某些刺激而在生物体中产生H1.0K180me2抗原可能引起产生天然存在的自身抗体，其对该抗原具有特异性。因此，在本发明的一些实施方案中，可能需要测定这些针对H1.0K180me2的天然存在自身抗体。自身抗体的检测和测量为H1.0K180me2的产生提供了替代测量。
本文提供了用于检测和测量对H1.0K180me2抗原具有特异性的天然存在的自身抗体的方法和组合物。如本文所用，对H1.0K180me2蛋白或其片段具有特异性的自身抗体可互换地称为H1.0K180me2自身抗体。
测量的自身抗体可以是任何免疫球蛋白类型，诸如IgG、IgM、IgE、IgD或IgA。在一些实施方案中，测量针对H1.0K180me2的IgG自身抗体。在一些实施方案中，测量针对H1.0K180me2的IgM自身抗体。在一些实施方案中，测量针对H1.0K180me2的多于一种类型的自身抗体；例如，在一些实施方案中，测量针对H1.0K180me2的IgG和IgM自身抗体。在一些实施方案中，测量针对H1.0K180me2的多于一种类型的自身抗体并计算比率；例如，在一些实施方案中，测量针对H1.0K180me2的IgG和IgM自身抗体，并计算针对H1.0K180me2的IgG自身抗体:针对H1.0K180me2的IgM自身抗体的比率。在其他实施方案中，测量H1.0K180me2IgM自身抗体:总IgM(例如血清IgM)的比率。在其他实施方案中，测量H1.0K180me2IgM自身抗体:总IgM(例如血清IgM)的比率并且作为函数与H1.0K180me2IgG自身抗体:总IgG(例如血清IgG)的比率相关。在一些实施方案中，测量针对H1.0K180me2的多于一种类型的自身抗体，并与转铁蛋白、铁蛋白或血清白蛋白含量进行比较。在其他实施方案中，测量针对H1.0K180me2的多于一种类型的自身抗体，并将其归一化为样品中蛋白质的总量或归一化为样品的体积。
在示例性实施方案中，阿尔茨海默病的筛选测试包括测量H1.0K180me2IgM自身抗体:总IgM的比率(图17)。在另一个示例性实施方案中，阿尔茨海默病的筛选测试包括测量H1.0K180me2IgG自身抗体:总IgG的比率(图17)。在一些实施方案中，将它们相互比较以将患者群体分层。(图17)。
转到示意图，图4和图14C示出了间接测量H1.0K180me2水平的方法。如图4和图14C所示，使标记的H1.0K180me2肽与样品接触；样品中响应于H1.0K180me2而产生的自身抗体与该标记的肽结合；加入标记的二级抗体以结合样品中的自身抗体，随后进行检测和量化。在图4中，样品中的自身抗体可以是任何类型(IgG、IgM、IgE、IgD或IgA)。在此测定中，用于结合自身抗体的二级抗体可区分IgG、IgM、IgE、IgD和IgA抗体，使得如果需要，则可独立地量化每种类型。在一些实施方案中，二级抗体是抗IgG抗体，并且将该测定用于量化针对H1.0K180me2的IgG自身抗体。在一些实施方案中，二级抗体是抗IgM抗体，并且将该测定用于量化针对H1.0K180me2的IgM自身抗体(图14C)。在一些实施方案中，利用两种类型的二级抗体来量化多于一种类型的自身抗体；例如在一些实施方案中，利用抗IgG和抗IgM二级抗体两者，并且将该测定用于量化针对H1.0K180me2的IgG和IgM自身抗体。
在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1.0K180me2肽包含选自表3A中提供的那些氨基酸序列(SEQ IDNO:3-35)的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1.0K180me2肽包含氨基酸序列AKPVKASKPKKAKPVK(me2)PK(SEQ ID NO:3)。在一些实施方案中，氨基酸序列进一步包含另外的末端残基，例如，出于缀合的目的。在一些实施方案中，氨基酸序列进一步包含末端C残基。在此类实施方案中，H1.0K180me2肽可包含氨基酸序列CAKPVKASKPKKAKPVKPK(SEQ IDNO:36)、CAKPVKASKPKKAKPVKPKC(SEQ ID NO:37)、AKPVKASKPKKAKPVKPKC(SEQ ID NO:38)、CAKPVKASKPKKAKPVK(me2)PK(SEQ ID NO:39)、CAKPVKASKPKKAKPVK(me2)PKC(SEQ ID NO:40)或AKPVKASKPKKAKPVK(me2)PKC(SEQ ID NO:41)。在一些实施方案中，H1.0K180me2肽包含本文提供的H1.0K180me2肽中的任一种的片段。在一些实施方案中，H1.0K180me2肽缀合至KLH(匙孔血蓝蛋白)、OVA(卵清蛋白)、BC(细菌纤维素)或BSA(牛血清白蛋白)。
在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白或肽是合成的，例如是体外甲基化的产物，例如在允许K180残基特异性二甲基化的条件(本文所述)下，使用G9A甲基转移酶或G9A样蛋白(GLP)甲基转移酶。
本文提供的H1.0K180me2蛋白和肽可进一步缀合用于多种目的，包括但不限于用于检测、诊断、可视化、量化、分选、治疗和生物学测定。在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白或肽包含标记(例如缀合至标记)，例如可检测标记、旋转标记、比色标记、放射性标记、酶标记、荧光标记或磁性标记。在示例性实施方案中，H1.0K180me2蛋白或肽是生物素酰化的。在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白或肽缀合或附接至固体表面，例如珠(例如磁性、玻璃或塑料珠)、柱或微板。在一些实施方案中，将H1.0K180me2蛋白或肽涂布在微板上。在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白或肽缀合至或包含效应分子，包括但不限于放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA和二抗。
在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白或肽对于对H1.0K180me2具有特异性的自身抗体有选择性。在一些实施方案中，该蛋白质或肽结合对H1.0K180me2不具有特异性的自身抗体。
在某些实施方案中，本文提供的H1.0K180me2蛋白或肽结合靶自身抗体，并且具有0.0001nM至1μM范围的解离常数(Kd)。例如，H1.0K180me2蛋白或肽的Kd可以是约1μM、约100nM、约50nM、约10nM、约5nM、约1nM、约0.5nM、约0.1nM、约0.05nM、约0.01nM、约0.005nM、约0.001nM、约0.0005nM或甚至约0.0001nM。
在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白或肽对人H1.0K180me2自身抗体具有特异性。在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白或肽与来自其他物种的H1.0K180me2自身抗体交叉反应。
在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白或肽对H1.0K180me2自身抗体具有选择性，并且表现出很少或不与1.0K180me1或H1.0K180me3自身抗体结合。在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白或肽结合H1.0K180me2自身抗体，但还表现出与H1.0K180me1和/或抗H1.0K180me3自身抗体结合。
在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白或肽对H1.0K180me2自身抗体的结合偏好(例如亲和力)通常超过非特异性自身抗体(例如针对另一个靶标的自身抗体)至少约2倍、约5倍或至少约10倍、20倍、50倍、102倍、103倍、104倍、105倍或106倍。
还可能的是使用本领域技术人员熟悉的方法评估H1.0K180me2自身抗体蛋白或肽以确定其是否对H1.0K180me2抗体具有特异性和/或选择性。
本文提供了编码本文所述的H1.0K180me2蛋白和肽的核酸。本文还提供了包含编码本文所述的H1.0K180me2蛋白和肽的任何核酸的载体。
D.阿尔茨海默病的检测
本文提供了H1.0K180me2抗体(以确定H1.0K180me2水平)以及H1.0K180me2蛋白和肽(以确定H1.0K180me2自身抗体水平)，用于筛选个体的阿尔茨海默病，用于鉴定个体是否处于发展阿尔茨海默病的风险中，用于估计个体是否将发展阿尔茨海默病的可能性，用于阿尔茨海默病的诊断，用于阿尔茨海默病的早期检测，用于阿尔茨海默病的预后，用于选择可能响应于用阿尔茨海默病药物或方案进行的阿尔茨海默病治疗的个体，用于诊断患有阿尔茨海默病的那些患者的治疗选择/确定诊断患有阿尔茨海默病的那些患者的治疗选项，用于监测诊断患有阿尔茨海默病并接受用阿尔茨海默病药物或方案进行的持续治疗的那些患者的治疗，或用于筛选阿尔茨海默病药物和方案。
本文还提供了H1.0K180me2蛋白和肽(以测定H1.0K180me2IgG和H1.0K180me2IgM自身抗体水平，也称为抗或自身抗H1.0K180me2IgG和抗或自身抗H1.0K180me2IgM)，用于将患者分层为不同的群体。在一个实施方案中，那些不同的群体可以是具有较高可能性响应于阿尔茨海默病的基于免疫疗法的治疗的那些对比具有较低或没有可能性响应于阿尔茨海默病的基于免疫疗法的治疗的那些。
图17证明了，基于患者血清中由总IgM归一化的抗H1.0K180me2IgM与由总IgG归一化的抗H1.0K180me2IgG之间的相关性，同时测量抗H1.0K180me2IgG和抗H1.0K180me2IgM自身抗体水平允许将患有阿尔茨海默病的那些患者分层为不同的亚群。
基于观察到患有阿尔茨海默病的患者中H1.0K180me2、针对H1.0K180me2的IgG自身抗体和针对H1.0K180me2的IgM自身抗体的水平改变，提供了这些用途。(图12A-12C、图13B、图14A-14E和图15A-15B)。
与健康年龄匹配的健康对照相比，阿尔茨海默病患者显示出较低的H1.0K180me2浓度，这指示H1.0K180me2浓度可有效地从健康个体中分离患有阿尔茨海默病的患者(图12A)。尽管H1.0K180me2的血清浓度足以用于鉴定阿尔茨海默病患者，但使用由总IgG(图12B)或总蛋白(图12C)进行的血清样品归一化允许直接比较个体而不论可改变总体血清浓度的变量(诸如用于获得血清的方案、操作者可变性、患者的水化状态和患者的活动状态)如何。例如，观察到健康老年个体中的H1.0K180me2血清水平相对于健康年轻个体是升高的，而患有阿尔茨海默病的患者相对于健康老年个体(>60岁)表现出显著较低的H1.0K180me2归一化血清水平(图12B、12C)。
与年龄匹配的健康对照相比，阿尔茨海默病患者还显示出H1.0K180me2自身抗体水平改变，这指示抗H1.0K180me2IgG和/或IgM血清浓度(H1.0K180me2IgG和/或IgM自身抗体浓度)可有效地从健康个体中分离患有阿尔茨海默病的患者。阿尔茨海默病患者显示出高于健康年龄匹配对照的血清抗H1.0K180me2IgG浓度(图13、14A-E、15A、15B)。使用生物素酰化的H1.0K180me2捕获肽(H1.0K180me2肽)，随后使用适当的二级抗体(针对IgG或IgM的抗体)，通过间接ELISA分析量化人血清中的抗H1.0K180me2IgG和IgM水平。分析来自30-40岁(n＝7)或>60岁(n＝9)的健康个体以及>60岁的临床诊断为阿尔茨海默病(n＝10)的个体的等体积血清。
图13B示出了在阿尔茨海默病患者和年龄匹配对照中通过间接ELISA测定的抗H1.0K180me2IgG水平的量化。使用由ELISA实验中包含的H1.0K180me2特异性抗体的系列稀释液产生的标准曲线计算每个血清样品中抗H1.0K180me2IgG的浓度。
图14E示出了在阿尔茨海默病(AD存在)患者和年龄匹配对照(AD不存在；神经病学对照)中通过间接ELISA测定的原始非归一化抗H1.0K180me2IgM水平的量化。
图15A和B示出了在阿尔茨海默病患者(AD存在)和年龄匹配对照(AD不存在；神经病学对照)中通过间接血清学ELISA测定的归一化抗H1.0K180me2IgM水平的量化。图15B证明了不论不同的测试操作者和实验室环境如何，诊断特征均不改变。
示例性方法，H1.0K180me2水平：更具体地，在一个实施方案中，本文提供了使用H1.0K180me2抗体来确定H1.0K180me2水平的方法，用于筛选个体的阿尔茨海默病，用于鉴定个体处于发展阿尔茨海默病的风险中，估计个体是否将发展阿尔茨海默病的可能性，用于确定个体是否患有阿尔茨海默病，用于检测个体中阿尔茨海默病的早期体征，以及用于个体中阿尔茨海默病的预后，该方法包括：(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2抗体接触；和(b)测定该样品中结合该抗体的H1.0K180me2的浓度，其中该浓度相对于对照降低指示该个体患有阿尔茨海默病、处于发展阿尔茨海默病的风险中或具有发展阿尔茨海默病的更大可能性，并且其中该浓度相对于对照增加或没有变化可能指示该个体未患有阿尔茨海默病、未处于发展阿尔茨海默病的风险中或不具有发展阿尔茨海默病的更大可能性。对照包括但不限于健康对照(例如年龄匹配、性别匹配)、代表健康对照汇编的参考标准、或来自早期分离的同一个体的对照样品。在一些实施方案中，测定循环H1.0K180me2的浓度。在一些实施方案中，该浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果确定个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗该个体。
在实践该方法的一个实施方案中，血清中的H1.0K180me2浓度小于或等于5.61nmol/ml指示该个体患有或可能发展阿尔茨海默病。在一个实施方案中，血清中的H1.0K180me2浓度小于或等于5.61nmol/ml指示该个体患有或可能发展阿尔茨海默病，其特异性为78％，灵敏度为80％并且阳性似然比为3.6。在一个实施方案中，这表示阿尔茨海默病的概率(后期测试概率)与先期测试概率相比增加了24％。基于以下公式计算后期测试概率：先期测试几率X LR/(1+先期测试几率x LR)，其中先期测试几率是测试之前对疾病存在的临床怀疑。后期测试概率通常由似然比列线图或Fagan列线图计算(NEJM 1975；293:257)
在实践该方法的另一个实施方案中，血清中的H1.0K180me2与总蛋白质的比率小于或等于4.76x10-4指示该个体患有或可能发展阿尔茨海默病。在一个实施方案中，血清中的H1.0K180me2与总蛋白质的浓度小于或等于4.76x10-4指示该个体患有或可能发展阿尔茨海默病，其特异性为70％、灵敏度为90％并且阳性似然比为3.00。在一个实施方案中，这表示阿尔茨海默病的概率与先期测试概率相比增加了14.8％。
示例性方法，H1.0K180me2自身抗体水平：在另一个实施方案中，本文提供了使用H1.0K180me2蛋白或肽(以确定H1.0K180me2自身抗体水平，例如IgG自身抗体水平或IgM自身抗体水平)的方法，用于筛选个体的阿尔茨海默病，用于鉴定个体处于发展阿尔茨海默病的风险中，用于估计个体是否将发展阿尔茨海默病的可能性，用于确定个体是否患有阿尔茨海默病，用于检测个体中阿尔茨海默病的早期体征，以及用于个体中阿尔茨海默病的预后，该方法包括：(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2蛋白或肽接触；和(b)测定该样品中结合该肽的自身抗体的浓度，其中该浓度相对于对照增加指示该个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中，并且其中该浓度相对于对照降低或没有变化可能指示该个体未患有阿尔茨海默病或未处于发展阿尔茨海默病的风险中。对照可包括但不限于健康对照(例如年龄匹配、性别匹配)、代表健康对照汇编的参考标准，或来自早期分离的同一个体的对照样品。在一些实施方案中，该浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果确定个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗该个体。
在一个实施方案中，血清中的针对H1.0K180me2的IgG自身抗体的浓度大于或等于9.69ug/ml(归一化为总IgG水平)指示该个体患有或可能发展阿尔茨海默病。在一个实施方案中，血清中的H1.0K180me2IgG自身抗体的浓度大于或等于9.69ug/ml指示该个体患有或可能发展阿尔茨海默病，其特异性为89％、灵敏度为60％并且阳性似然比为5.4。在一个实施方案中，这表示阿尔茨海默病的概率与先期测试概率相比增加了30％。
在一些实施方案中，当归一化为血清体积，IgG自身抗体的血清浓度大于或等于8.23ug/ml时，个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。在一些实施方案中，当归一化为血清体积，IgM自身抗体的血清浓度大于或等于409fMol/ml时，个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。在一些实施方案中，当IgM自身抗体的浓度与总IgM浓度的比率大于26.6x10-6时，个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。在一个实施方案中，当IgG自身抗体的PLR(LR+)是2.4或更大或者IgM自身抗体的PLR(LR+)是3.5或更大时，个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。
在相关的实施方案中，将本文提供的方法用于观察研究。观察研究的例子包括但不限于：(a)横向设计(单个时间点设计或时滞横向设计)-测试在单个时间点处收集的每个患者的一个或几个样本/样品；(b)纵向设计-测试在延长的时间段(例如数周、数月、数年)内收集的每个患者的多个样本/样品；(c)回溯设计-测试在该研究开始之前先前收集的样本(表征的样本)，该样本的分析物状态和患者临床状态是已知的；(d)勘察设计-测试在该研究之前或期间收集的样本，但该样本的分析物状态和患者临床状态两者在该研究期间建立；以及(e)勘察-回溯设计-测试先前收集的样本，该样本的临床状态是已知的但分析物状态是未知的且将在该研究期间建立。
在相关的实施方案中，本文提供的方法旨在用于诊断阿尔茨海默病，其中该方法可用于确定、验证或确认患者临床病状作为唯一决定因素。在这些实施方案中，这种类型的测试还包括单独的确认性测定(以验证先前测试的结果)和单独的排除测定(以排除特定病状)。
在相关的实施方案中，本文提供的方法旨在提供阿尔茨海默病的“辅助诊断”，其中该方法可用于提供另外信息以帮助确定或验证患者临床状态。该测试不一定是唯一决定因素，但可用于评估患者当前状态。
在相关的实施方案中，本文提供的方法旨在用于筛选阿尔茨海默病，其中该方法可用于确定无症状个体中疾病、病症或其他生理状态的状态。取决于病状的性质和靶标患者群体，筛选方法可常规使用或可限于“处于风险中”的患者。在此背景下，本文所述的方法用于评估患者当前状态。
在相关的实施方案中，本文提供的方法旨在确定阿尔茨海默病的倾向，其中本文所述的方法可用于确定症状前患者中疾病发作的可能性(例如评估未来发展该疾病的风险)，其中对于处于足够风险(如由测试结果确定)中的患者，可采取预防性干预。
在相关的实施方案中，本文提供的方法旨在用于阿尔茨海默病的预后，其中本文所述的方法可用于测量与临床结果相关的因素，而与治疗无关。本文所述的方法可用于估计疾病的自然进展(例如在不存在治疗的情况下的结果)，或者本文所述的方法被设计用于评估患者的未来状态。
在相关的实施方案中，本文提供的方法旨在用于确定老化群体的生理状态(“老化时钟”)，其中出于鉴定人的老化状况或特征或者伴老化的阿尔茨海默病的风险的目的，本文所述的方法可用于评估个体的生理状态。
在相关的实施方案中，H1.0K180me2抗原的量化和/或H1.0K180me2自身抗体的量化可用于提高阿尔茨海默病筛选、诊断或检测的置信度。
在相关的实施方案中，H1.0K180me2抗原的量化和/或H1.0K180me2自身抗体的量化可与其他脑脊液(CSF)测试(包括但不限于Aβ42、T-tau、p-tau、Aβ42/T-tau比率和Aβ42/p-tau的测量)结合使用。
在相关的实施方案中，H1.0K180me2抗原的量化和/或H1.0K180me2自身抗体的量化可与认知状态测试(例如MMSE(简短精神状态检查)、GDS(全球恶化率)和CDR(临床痴呆评定)测试)的评估结合使用。
在相关的实施方案中，H1.0K180me2抗原的量化和/或H1.0K180me2自身抗体的量化可与神经影像学结合使用。
在本文所述方法的一些实施方案中，H1.0K180me2的水平可针对生物样品中的总IgG归一化或针对生物样品中的总蛋白质归一化。在本文所述方法的一些实施方案中，H1.0K180me2的浓度可确定为与非甲基化的标记的合成H1.0肽的相对比。
在本文所述方法的实施方案中，该个体大于50岁。在本文所述方法的一些实施方案中，该个体小于50岁。在本文所述方法的一些实施方案中，该个体至少50岁、至少55岁、至少60岁、至少65岁、至少70岁、至少75岁或至少80岁。在示例性实施方案中，该个体至少60岁。
E.阿尔茨海默病的伴随诊断
本文还提供了H1.0K180me2抗体(以确定H1.0K180me2水平)以及H1.0K180me2蛋白和肽(以确定H1.0K180me2自身抗体水平，例如IgG自身抗体水平或IgM自身抗体水平)，用于选择可能响应于用阿尔茨海默病药物或方案进行的阿尔茨海默病治疗的个体的方法，用于诊断患有阿尔茨海默病的那些患者的治疗选择/确定诊断患有阿尔茨海默病的那些患者的治疗选项，用于监测诊断患有阿尔茨海默病并接受用阿尔茨海默病药物或方案进行的持续治疗的那些患者的治疗，或用于筛选阿尔茨海默病药物和方案。
在这些实施方案中，这些阿尔茨海默病药物和方案/治疗包括但不限于用以下进行的治疗：APP合成抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂和调节剂、Aβ聚集抑制剂、Aβ免疫疗法、降胆固醇药物、抗tau药物、胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、非典型抗精神病药、蛋白质S-亚硝基化的阻断剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、雷帕霉素、rapalogue、内源性大麻素、大麻素、神经保护剂、控制钙内流的分子、抗氧化剂、抗炎药物、控制谷氨酸稳态控制的药物、自噬诱导剂、激素、激素调节剂、他汀类、胰岛素、胰岛素载体、多功能纳米载体、维生素、营养补充剂、小RNA分子、肽或超声疗法。更具体地，APP合成抑制剂(+苯羟基丙氨酸)、β-分泌酶抑制剂(MK-8931、E2609、LY2811376、LY2886721、PF-05297909)、γ-分泌酶抑制剂和调节剂(司马西特LY450139、avagacestat BMS-708163、PF-3084014、ELND006、tarenflurbil、CHF5074)、Aβ聚集抑制剂(tramiprosate(3APS)、氯碘羟喹(PBT1)、PBT2、ELND005(鲨肌醇)、PQ912)、Aβ免疫疗法(GSK933776、AN1802+QS21、ACC-001、阿尔茨海默病-106、巴匹珠单抗、索拉珠单抗、Gantenerumab(RO4909832)、Ponezumab(PF-04360365)、MABT5102A(crenezumab)、BAN2401、静脉注射免疫球蛋白、gantenerumab(R1450或RO4909832))、抗tau药物(锂、Tideglusib(NP031112)、LMTX(亚甲基蓝))、胆碱酯酶抑制剂((加兰他敏)、(雷司替明)和(多奈哌齐)、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂(和 和多奈哌齐的组合)、非典型抗精神病药(奥氮平、喹硫平、利培酮)、蛋白质S-亚硝基化的阻断剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、雷帕霉素和rapalogue、内源性大麻素和大麻素、神经保护剂、控制钙内流的分子、抗氧化剂(维生素E、维生素C、α-硫辛酸、辅酶Q)、抗炎分子和药物、控制谷氨酸稳态控制的药物、自噬诱导剂、激素和激素调节剂、他汀类、胰岛素和胰岛素载体(包括鼻内胰岛素、长效胰岛素和沙利度胺)、雷米普利、白藜芦醇、多功能纳米载体、维生素和营养补充剂、小RNA分子、肽和超声疗法。在一些实施方案中，阿尔茨海默病药物和方案在FDA批准期间，选自FDA注册的药物批准临床试验列表，其可在美国食品和药物管理局的万维网地址获得。
示例性方法，H1.0K180me2水平：在一个实施方案中，本文提供了一种使用H1.0K180me2抗体用于确定被诊断患有阿尔茨海默病的个体是否接受持续治疗、是否将受益于或继续受益于该持续治疗的方法，其包括：(a)提供来自正在接受持续治疗的个体的生物样品；(b)使该生物样品与H1.0K180me2抗体接触；(c)测定该样品中结合该抗体的H1.0K180me2的浓度；以及(d)选择将受益于或继续受益于治疗的个体，其中该浓度相对于对照增加指示该个体将受益于或继续受益于治疗，并且其中该浓度相对于对照降低或没有变化可能指示该个体可能将不受益于或不继续受益于或响应于该治疗。对照包括但不限于来自未接受治疗的患有阿尔茨海默病的个体的样品，或来自在治疗开始之前早期分离的同一个体的对照样品。在一些实施方案中，测定循环H1.0K180me2的浓度。在一些实施方案中，该浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
本文还提供了一种使用H1.0K180me2抗体的方法，用于诊断患有阿尔茨海默病的个体的治疗选择，用于确定诊断患有阿尔茨海默病的个体的治疗选项，以及用于确定谁可受益于特定治疗。在一个实施方案中，该方法包括：(a)在治疗个体的阿尔茨海默病之前，提供来自该个体的生物样品；(b)使该生物样品与候选治疗接触；(c)使该生物样品与H1.0K180me2抗体接触；(d)测定该样品中结合该抗体的H1.0K180me2的浓度和/或亚细胞定位；以及(e)选择可能受益于该治疗的个体，其中相对于对照，该浓度增加或细胞质亚细胞定位减少指示该个体可受益于治疗，并且其中相对于对照，该浓度降低或没有变化或者细胞质亚细胞定位增加或没有变化可能指示该个体将不受益于治疗。在另一个实施方案中，该方法包括：(a)向个体施用候选治疗；(b)在施用该治疗之后，提供来自该个体的生物样品；(c)使该生物样品与H1.0K180me2抗体接触；(d)测定该样品中结合该抗体的H1.0K180me2的浓度和/或亚细胞定位；以及(e)选择可能受益于该治疗的个体，其中相对于对照，该浓度增加或细胞质亚细胞定位减少指示该个体可受益于治疗，并且其中相对于对照，该浓度降低或没有变化或者细胞质亚细胞定位增加或没有变化可能指示该个体将不受益于治疗。对照可包括但不限于来自健康个体的样品，或使该生物样品与安慰剂治疗接触。在一些实施方案中，测定循环H1.0K180me2的浓度。在一些实施方案中，该浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
示例性方法，H1.0K180me2自身抗体水平：在另一个实施方案中，本文提供了一种使用H1.0K180me2蛋白或肽用于确定被诊断患有阿尔茨海默病的个体是否接受持续治疗、是否将受益于或继续受益于该持续治疗的方法，其包括：(a)提供来自个体的生物样品；(b)使该生物样品与H1.0K180me2蛋白或肽接触；(c)测定该样品中结合该蛋白质或肽的自身抗体的浓度；以及(d)选择将受益于或继续受益于该治疗的个体，其中自身抗体的浓度相对于对照降低指示该个体将受益于或继续受益于治疗，其中自身抗体的浓度相对于对照没有变化或增加可能指示该个体将不受益于或不再继续受益于治疗。对照包括但不限于来自未接受治疗的患有阿尔茨海默病的个体的样品，或来自在治疗开始之前早期分离的同一个体的对照样品。在一些实施方案中，该浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。在一些实施方案中，测定抗H1.0K180me2IgG自身抗体的浓度。在一些实施方案中，测定抗H1.0K180me2IgM自身抗体的浓度。在一些实施方案中，测定抗H1.0K180me2IgG和IgM自身抗体的浓度。
本文还提供了如下的方法，其使用H1.0K180me2蛋白或肽，用于诊断患有阿尔茨海默病的个体的治疗选择，用于确定诊断患有阿尔茨海默病的个体的治疗选项，以及用于确定该个体是否可受益于特定治疗。在一个实施方案中，该方法可包括：(a)向个体施用候选治疗；(b)在该施用之后，提供来自该个体的生物样品；(c)使该样品与H1.0K180me2蛋白或肽接触；(d)测定该样品中结合该蛋白质或肽的自身抗体的浓度；以及(e)选择可能受益于该治疗的个体，其中自身抗体的浓度相对于对照降低指示该个体将受益于该特定治疗，并且其中自身抗体的浓度相对于对照没有变化或增加可能指示该个体将不受益于该特定治疗。参考对照可包括但不限于来自健康个体的样品，或使该生物样品与安慰剂治疗接触。在一些实施方案中，该浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。在一些实施方案中，测定抗H1.0K180me2IgG自身抗体的浓度。在一些实施方案中，测定抗H1.0K180me2IgM自身抗体的浓度。在一些实施方案中，测定抗H1.0K180me2IgG和IgM自身抗体的浓度。
本文还提供了一种使用H1.0K180me2蛋白或肽用于将阿尔茨海默病患者分层为如下不同的组的方法：一组可能将响应于任何类型的阿尔茨海默病治疗，并且一组可能将不响应于任何类型的阿尔茨海默病治疗(可能更具限制性)。在一个实施方案中，可能将响应于任何类型的阿尔茨海默病治疗的组可能响应于基于免疫疗法和基于非免疫疗法的阿尔茨海默病治疗两者。在一个实施方案中，可能将不响应于任何类型的阿尔茨海默病治疗的组可能仅响应于基于非免疫疗法的阿尔茨海默病治疗。在一些实施方案中，如本文所提供的，可通过计算抗H1.0K180me2IgG抗体浓度与抗H1.0K180me2IgM抗体浓度的比率和/或将抗H1.0K180me2IgG抗体浓度与抗H1.0K180me2IgM抗体浓度相关联以适配统计模型来进行这种分层。此类方法可为诊断患有阿尔茨海默病的个体提供可行的治疗选项，并且用于确定该个体是否可受益于特定治疗。在一个实施方案中，该方法可包括：(a)提供来自个体的生物样品；(b)使该样品与H1.0K180me2蛋白或肽接触；(c)测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgG和IgM自身抗体的浓度；以及(d)选择可能受益于基于免疫疗法的阿尔茨海默病治疗的个体。
在相关的实施方案中，本文提供的方法可用于确保H1.0K180me2或H1.0K180me2自身抗体水平保持在生理水平内或在建立的治疗药物范围内。
在相关的实施方案中，本文提供的方法可用于监测阿尔茨海默病，其中出于根据需要调整治疗/干预的目的，该方法可用于测量H1.0K180me2或H1.0K180me2自身抗体水平。在相关的实施方案中，本文提供的方法可用于监测接受此类治疗的个体中阿尔茨海默病药物或营养方案或生活方式调整的影响。
在相关的实施方案中，本文提供的方法可用于监测阿尔茨海默病的任何观察性或介入性临床研究中的临床表现，其中(a)观察性研究是指其中该研究期间获得的测试结果不用于患者管理并且不影响治疗决策的研究；和(b)介入性研究是其中该研究期间获得的测试结果可影响患者管理决策并可用于指导治疗的研究。
在相关的实施方案中，本文提供的方法可用于连续测量，由此随时间进行多次测定。这些类型的监测方法可用于检测/评估疾病进展/消退、疾病复发、最小残留疾病、对治疗的响应/抗性、和/或由治疗引起的不良作用。可设计这些类型的监测方法以评估个体状态的变化。
在相关的实施方案中，本文提供的方法可用于预测阿尔茨海默病治疗响应或反应，其中本文所述的方法可用于测量确定患者对特定疗法的响应或不良反应的可能性的因素。本文描述了专门设计用作伴随诊断的预测方法。
在本文所述方法的一些实施方案中，H1.0K180me2的水平可针对生物样品中的总IgG归一化或针对生物样品中的总蛋白质归一化。在本文所述方法的一些实施方案中，H1.0K180me2的浓度可确定为与非甲基化的标记的合成H1.0肽的相对比。
在本文所述方法的实施方案中，该个体大于50岁。在本文所述方法的一些实施方案中，该个体小于50岁。在本文所述方法的一些实施方案中，该个体至少50岁、至少55岁、至少60岁、至少65岁、至少70岁、至少75岁或至少80岁。在示例性实施方案中，该个体至少60岁。
在相关的实施方案中，该方法可用于筛选新的阿尔茨海默病药物和方案。
F.衰老的检测
本文提供了H1.0K180me2抗体和H1.0K180me2蛋白和肽，用于检测衰老。如本文所提供的，衰老与复制性衰老(REP-SEN)、基因毒性应激诱导的衰老和辐射诱导的衰老相关。
通常，用于检测衰老的方法包括直接检测H1.0K180me2或间接检测H1.0K180me2。对于直接检测H1.0K180me2，该方法通常包括(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2抗体接触；和(b)测定该样品中结合该抗体的H1.0K180me2抗原的浓度，其中该浓度相对于对照增加指示该生物样品包含衰老细胞。对于间接检测H1.0K180me2，该方法通常包括(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2蛋白或肽接触；和(b)测定该样品中结合该肽的H1.0K180me2抗原的浓度，其中该浓度相对于对照增加指示该生物样品包含衰老细胞。在一些实施方案中，该浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
在一些实施方案中，该方法可用于鉴定已经历由基因毒素诱导的衰老的个体。在一些实施方案中，基因毒性应激诱导的衰老是个体暴露于DNA损伤剂、药物或毒素(例如辐射、UV-光、博来霉素和任何其他基因毒性药物(包括但不限于曲唑酮、Etotifen、头孢氨苄、尼索地平(Nisoldipme)、CGS15943、克霉唑、5-壬基色胺、多虑平、培高利特(Pergolide)、帕罗西汀、白藜芦醇、槲皮素、和厚朴酚、7-硝基吲唑、甲地孕酮、氟伏沙明、依托泊苷、维利帕尼(Veliparib)、鲁卡帕尼(Rucaparib)、奥拉帕尼、喜树碱或特比萘芬以及一般的化学治疗药物))的结果。
在一些实施方案中，该方法可用于鉴定经历化学疗法治疗的个体的衰老，以确保化学疗法是有效的。这些实施方案中的化学治疗剂可选自由以下组成的组：阿仑单抗(Campath)、阿利维生素A酸(Panretin)、别嘌呤醇(Zyloprim)、六甲蜜胺(Hexalen)、氨磷汀(Ethyol)、阿那曲唑(Arimidex)、三氧化二砷(Trisenox)、天冬酰胺酶(Elspar)、活BCG(TICE BCG)、贝沙罗汀(Targretin)、博来霉素(Blenoxane)、白消安静脉注射(Busulfex)、白消安口服(Myleran)、卡普睾酮(Methosarb)、卡培他滨(Xeloda)、链脲霉素(Zanosar)、Tale(Sclerosol)、他莫昔芬(Nolvadex)、替莫唑胺(Temodar)、替尼泊苷、VM-26(Vumon)、睾内酯(Teslac)、硫鸟嘌呤、6-TG(硫鸟嘌呤)、噻替派(Thioplex)和拓扑替康(Hycamtin)。
G.DNA损伤的检测
本文提供了H1.0K180me2抗体和H1.0K180me2蛋白和肽，用于检测DNA损伤，例如急性DNA损伤。
通常，用于检测DNA损伤的方法包括直接检测H1.0K180me2或间接检测H1.0K180me2。对于直接检测H1.0K180me2，该方法通常包括(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2抗体接触；和(b)测定该样品中结合该抗体的H1.0K180me2抗原的浓度，其中该浓度相对于对照增加指示该生物样品已经历了DNA损伤。对于间接检测H1.0K180me2，该方法通常包括(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2蛋白或肽接触；和(b)测定该样品中结合该肽的H1.0K180me2抗原的浓度，其中该浓度相对于对照增加指示该生物样品已经历了DNA损伤。在一些实施方案中，该浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
在一些实施方案中，DNA损伤是细胞或个体暴露于DNA损伤剂、药物或毒素(例如辐射、博来霉素或其他DNA损伤剂(例如上文讨论的化学治疗药物))的结果。
在一些实施方案中，该方法可用于在这种基因毒素或DNA损伤剂暴露5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、24小时、48小时、3天、4天或最多5天内测定DNA损伤。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于检测DNA损伤的便携式单元。该单元可包括样品收集单元、读数器和包含H1.0K180me2抗体的测定模块。该单元还可包括样品收集单元、读数器和包含H1.0K180me2蛋白或肽的测定模块。
H.辐射暴露的检测
本文提供了H1.0K180me2抗体和H1.0K180me2蛋白和肽，用于检测辐射暴露。
通常，用于检测辐射暴露的方法包括直接检测H1.0K180me2或间接检测H1.0K180me2。对于直接检测H1.0K180me2，该方法通常包括(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2抗体接触；和(b)测定该样品中结合该抗体的H1.0K180me2抗原的浓度，其中该浓度相对于对照增加指示已发生了辐射暴露。对于间接检测H1.0K180me2，该方法通常包括(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2蛋白或肽接触；和(b)测定该样品中结合该肽的H1.0K180me2抗原的浓度，其中该浓度相对于对照增加指示已发生了辐射暴露。在一些实施方案中，该浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。在一个示例性实施方案中，在7Gy X射线暴露后2小时后H1.0K170me2抗原浓度的变化为从12umol/L至21umol/L，并且在48小时后为从26umol/L至35umol/L。
在一些实施方案中，该方法可用于在这种暴露5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、24小时、48小时、3天、4天或最多5天内测定辐射暴露。
在一些实施方案中，该方法可用于确定军事人员在野战情况下(例如在战斗区中)的这种暴露。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于检测辐射损伤的便携式单元。该单元可包括样品收集单元、读数器和包含H1.0K180me2抗体的测定模块。该单元还可包括样品收集单元、读数器和包含H1.0K180me2蛋白或肽的测定模块。
I.H1.0K180me2和rapalogue
雷帕霉素(mTOR)的哺乳动物靶标已成为一种有前途的治疗靶标。雷帕霉素和一些雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物以及其他mTOR抑制剂是FDA批准用于治疗某些疾病状态的药物。
发明人发现H1.0K180me2的检测可用于筛选个体对雷帕霉素、雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物以及其他mTOR抑制剂(统称为“rapalogue”)的响应性，并且可用于监测基于rapalogue的治疗方案。发明人还发现H1.0K180me2的检测可用于药物筛选目的，用于筛选另外的rapalogue。具体地，这里示出雷帕霉素衍生物和免疫抑制剂依维莫司在DNA损伤后阻断H1.0K180me2的出现(图18)。还观察到，在基因毒性应激暴露之前或与之同时，用rapalogue进行治疗可减轻基因毒性应激物的作用，如通过H1.0K180me2的浓度和/或亚细胞定位的变化所证明。
如本文所用，rapalogue包括FDA批准的rapalogue，以及目前正在经历临床试验的那些rapalogue。FDA批准的rapalogue包括雷帕霉素、西罗莫司、雷帕鸣、依维莫司、RAD001、Afinitor、Zortress、坦罗莫司、CCI-779、驮瑞塞尔、地磷莫司、AP23573、MK-8669、Deforolimus、佐他莫司和ABT-578。其他Rapalogue AZD8055、AZD2014、OSI-027、MLN0128、WYE-132、Torin1、PI-103、P7170、PF-04691502、PF-05212384、PKI-587、GNE477、PKI-180、WJD008、XL765、SAR245409、NVP-BEZ235、BGT226、SF1126、GSK2126458、Ku-0063794、WYE-354、NVP-BEZ235、PF-05212384、XL765、Torin 2、WYE-125132和OSI-027。
本文总体上提供了一种用于监测正在诊断患有癌症、免疫缺陷、糖尿病、关节炎、阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫疾病和其他年龄相关病理的个体中进行的基于rapalogue的治疗的效果的方法。
因此，在一个实施方案中，本文提供了一种确定接受用rapalogue进行的治疗的个体是否响应于这种治疗的方法，其包括：(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2抗体接触；(b)测定该样品中结合该抗体的H1.0K180me2的浓度和/或定位；以及(c)确定该个体是否响应于治疗，其中相对于对照，所建立浓度降低或定位改变指示该个体响应于rapalogue。在一些实施方案中，如果H1.0K180me2的细胞外浓度相对于对照增加，则确定rapalogue治疗无效或需要修改。在一些实施方案中，如果H1.0K180me2的细胞质定位相对于对照增加，则确定rapalogue治疗无效或需要修改。在一些实施方案中，该减少是相对于年龄匹配对照，其未被诊断患有要施用rapalogue的相关疾病。在一些实施方案中，如果H1.0K180me2蛋白的细胞外或细胞质浓度相对于对照降低，则确定该治疗有效并应继续。在一些实施方案中，该方法进一步包括使用该信息来修改治疗类型、疗程、持续时间和/或剂量。在一些实施方案中，测定循环H1.0K180me2的浓度。在一些实施方案中，该浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
同样地，当使用H1.0K180me2的自身抗体进行测量时，该方法包括：(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2蛋白或肽接触；(b)测定结合该蛋白质或肽的自身抗体的浓度；以及(c)确定该个体是否响应于治疗，其中自身抗体浓度相对于对照变化指示该个体响应于rapalogue。在一些实施方案中，如果H1.0K180me2自身抗体的浓度相对于对照不变化，则确定rapalogue治疗无效或需要修改。在一些实施方案中，该减少是相对于年龄匹配对照，其未被诊断患有要施用rapalogue的相关疾病。在一些实施方案中，如果H1.0K180me2自身抗体的浓度相对于对照变化，则确定该治疗有效并应继续。在一些实施方案中，该浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于选择诊断患有或怀疑患有癌症、免疫缺陷、糖尿病、阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫疾病、关节炎和其他年龄相关病理的，可能受益于rapalogue治疗的个体，或确定个体是否可响应于用rapalogue进行的治疗的方法。在一些实施方案中，此方法包括提供来自该个体的生物样品；在体外、离体、切片培养或组织培养中用rapalogue处理该样品；以及测定该样品中H1.0K180me2的浓度和/或亚细胞定位。在一些实施方案中，通过使用H1.0K180me2抗体测量样品中H1.0K180me2的浓度来测定H1.0K180me2的浓度。在一些实施方案中，通过测量样品中抗H1.0K180me2自身抗体的浓度来测定H1.0K180me2的浓度。在一些实施方案中，如果H1.0K180me2的细胞质或细胞外浓度相对于对照增加，则确定rapalogue治疗可能无效。在一些实施方案中，如果H1.0K180me2的细胞质定位相对于对照增加，则确定rapalogue治疗可能无效。在一些实施方案中，该减少是相对于年龄匹配对照，其未被诊断为个体可能接受rapalogue治疗的疾病。在一些实施方案中，如果相对于对照，H1.0K180me2蛋白的细胞质或细胞外浓度降低，则确定该治疗可能有效。在一些实施方案中，该浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括使用该信息来修改治疗类型、疗程、持续时间和/或剂量。
在其他实施方案中，本文提供了H1.0K180me2检测的用途，用于监测待鉴定新rapalogue的能力(药物筛选应用)。
J.生物老化的检测
本文提供了H1.0K180me2抗体和H1.0K180me2蛋白和肽，用于检测生物老化。如本文所提供的，预期生物老化标志物或老化的生物标志物将在生物学研究中发现许多用途，因为年龄是大多数生物体的基本特征。
在实足年龄与生物学年龄之间可能存在差异。一些个体老化更快速，而其他个体由于良好的习惯、基因和/或缺乏环境应激，老化更缓慢，从而使他们更长时间地更健康并且“看起来更年轻”。能够跟踪一个人的生物学年龄可能有助于改变生活方式(类似于跟踪身体质量指数)或有助于部署抗衰老程序。
通过老化标志物精确测量生物学年龄可用于测试生物老化的年龄相关疾病理论，诸如(i)诊断各种年龄相关疾病和定义癌症亚型，(ii)预测/预后诊断各种疾病的发作，以及用作(iii)用于评估治疗干预(包括再生方法)的替代标志物。
通常，用于检测生物老化的方法包括直接检测H1.0K180me2或间接检测H1.0K180me2。对于直接检测H1.0K180me2，该方法通常包括(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2抗体接触；和(b)测定该样品中结合该抗体的H1.0K180me2抗原的浓度，其中该浓度相对于对照增加指示该生物样品来自已经历了生物老化的个体。对于间接检测H1.0K180me2，该方法通常包括(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2蛋白或肽接触；和(b)测定该样品中结合该肽的H1.0K180me2抗原的浓度，其中该浓度相对于对照增加指示已经历了生物老化。在一些实施方案中，该浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
K.诊断试剂盒和制品
本文提供了可用于检测H1.0K180me2的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包含一种或多种如本文所述的H1.0K180me2抗体或H1.0K180me2肽。在某些实施方案中，该抗体或肽被标记。此外，该试剂盒可任选地包括用于进行本文所述任何方法的说明材料。虽然该说明材料通常包含书写或印刷材料，但其并不限于此。本文涵盖了能够存储此类说明并将其传达给终端用户的任何媒介。此类媒介包括但不限于电子存储媒介(例如，磁盘、磁带、磁片盒、芯片)、光学媒介(例如，CD ROM)等。此类媒介可包括提供此类说明材料的互联网站的网址。
该试剂盒还可包括另外组成部分以促进设计试剂盒所为的特定应用。因此，例如，当试剂盒含有被标记的抗H1.0K180me2时，该试剂盒可另外含有用于检测该标记的试剂(例如，用于酶标记的酶底物、用于检测荧光标记的滤光镜组、适当的二级标记等)。该试剂盒可另外包括缓冲剂和常规用于实施特定方法的其他试剂。
除H1.0K180me2抗体之外，可用于免疫测定以检测H1.0K180me2的示例性试剂盒可包括H1.0K180me2蛋白或肽。此肽可例如用作竞争性免疫测定中的阳性对照或竞争剂，并且取决于待进行的测定形式可被标记或不标记。
除抗H1.0K180me2肽之外，可用于免疫测定以检测H1.0K180me2的另一种示例性试剂盒将包括H1.0K180me2抗体。此抗体可例如用作竞争性免疫测定中的阳性对照或竞争剂，并且取决于待进行的测定形式可被标记或不标记。
本文还提供了用于测量皮下靶H1.0K180me2蛋白和肽浓度的透皮贴剂，其包含：包含H1.0K180me2抗体的底物；和多个微针。在另一个实施方案中，本文提供了用于测量H1.0K180me2自身抗体浓度的透皮贴剂，其包含底物和对H1.0K180me2自身抗体的检测具有特异性的H1.0K180me2结合蛋白或肽。在一些实施方案中，该贴剂是透皮微针阵列贴剂。在一些实施方案中，该贴剂的底物是可弹性拉伸的。在一些实施方案中，本文提供了包含贴剂(其包含本文提供的抗体或肽)以及任选的使用说明的试剂盒。在一些实施方案中，该贴剂可用于检测和测量H1.0K180me2的浓度，或可用于检测和测量生物样品中H1.0K180me2抗体的浓度(出于检测复制性衰老、DNA损伤、基因毒性应激、辐射暴露和阿尔茨海默病的目的)，可用于监测治疗方案，和可用于药物筛选。
本文还提供了一种便携式单元，用于检测，例如用于检测DNA损伤或辐射暴露。该单元可包括样品收集单元、读数器和包含H1.0K180me2抗体的测定模块。该单元还可包括样品收集单元、读数器和包含H1.0K180me2蛋白或肽的测定模块。
本文还提供了适用于分析物的侧向流测定的侧向流条或测试条，其包括样品接收区，其中该样品接收区包含H1.0K180me2抗体或抗H1.0K180me2结合肽。在一些实施方案中，抗体或肽包含标记。
IV.治疗剂
A.甲基化H1.0相关疾病和病状的治疗
本文提供了用于治疗甲基化H1.0相关疾病或病状的治疗性H1.0K180me2抗体、治疗性H1.0K180me2蛋白和治疗性H1.0K180me2肽。
如本文所用，“甲基化H1.0相关疾病或病状”是其中H1.0K180me2的水平增加、K180处的H1.0蛋白/肽底物的内源性二甲基化增加、H1.0K180me2从染色质的释放增加、H1.0K180me2从细胞核到细胞质的释放增加、H1.0K180me2的细胞质沉积增加、细胞外空间中的H1.0K180me2水平增加、体液(例如血清、尿液、唾液、脑脊液等)中的H1.0K180me2的循环水平增加、和/或对H1.0K180me2具有特异性的自身抗体的水平增加的疾病或病状。
甲基化H1.0相关疾病和病状包括但不限于与衰老细胞增加相关的年龄相关病理、阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒性应激物暴露、包括与外部和内部应激物相关的衰老细胞积聚的病状、以及与高水平的针对H1.0K180me2的自身抗体相关的疾病和病状的自身免疫组。
本文提供了通过结合和清除H1.0K180me2治疗个体中甲基化H1.0相关疾病或病状的方法，其包括向该个体施用治疗有效量的治疗性H1.0K180me2抗体。
本文还提供了结合和清除H1.0K180me2自身抗体治疗个体中甲基化H1.0相关疾病或病状的方法，其包括向该个体施用治疗有效量的治疗性H1.0K180me2蛋白或治疗性H1.0K180me2肽。
如本文所用，个体是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园、体育或宠物动物，诸如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。个体可以是男性或女性。
在本文所述方法的一些实施方案中，该个体大于50岁。在本文所述方法的一些实施方案中，该个体小于50岁。在本文所述方法的一些实施方案中，该个体至少50岁、至少55岁、至少60岁、至少65岁、至少70岁、至少75岁或至少80岁。在示例性实施方案中，该个体至少60岁。
更具体地，转到甲基化H1.0相关疾病和病状，在老化过程中，人脑组织中细胞质H1.0K180me2的积聚增加(图11B)。这些观察与血清学测试中观察到的循环H1.0K180me2抗原的年龄相关的增加相关(图11C)。
然而，当将对照群体(无阿尔茨海默病病理)与参考对照(诊断为阿尔茨海默病患者)进行比较时(图12A-12C)，在诊断患有阿尔茨海默病的个体中，在观察的血清学ELISA测试中H1.0K180me2抗原的循环水平下降(图11C)。
当与无病理的年龄匹配的个体相比时，阿尔茨海默病组中H1.0K180me2抗原的循环水平下降与针对H1.0K180me2表位的IgG和IgM自身抗体的水平增加相关(图13B、14B、14D、14E、15A、16A、16B)
因此，在阿尔茨海默病的背景下，提供了用治疗有效量的H1.0K180me2抗体(例如细胞穿透抗体或细胞清除抗体)进行的治疗。
另外，当与年龄匹配对照相比时，在患有阿尔茨海默病的个体中，响应于H1.0K180me2产生的天然存在的血清IgG和IgM自身抗体升高了(图13B、14B、14D、14E、15A、16A、16B)，这可能对攻击和破坏表达H1.0K180me2的细胞有害。因此，在此背景下，提供了用治疗有效量的H1.0K180me2抗体结合(中和)蛋白质或肽进行的治疗。
在DNA损伤剂的情况下，在用化学治疗剂博来霉素进行的急性DNA损伤后，在染色质上观察到H1.0K180的二甲基化(H1.0K180me2)(图7A)。因此，在此背景下，提供了用治疗有效量的H1.0K180me2抗体(例如细胞穿透抗体或细胞清除抗体)进行的治疗。另外，响应于H1.0蛋白的二甲基化中H1.0K180me2增加产生的天然存在的自身抗体提供了用治疗有效量的H1.0K180me2抗体结合(中和)蛋白质或肽进行的治疗的靶标。
在基因毒性应激的背景下，H1.0K180me2在基因毒性应激诱导的衰老后(在用DNA损伤剂处理后数天)从染色质中释放(图9A)，并从细胞分泌到细胞外空间中(图9B)。因此，在此背景下，提供了用治疗有效量的H1.0K180me2抗体进行的治疗。另外，响应于H1.0K180me2增加产生的天然存在的自身抗体提供了用治疗有效量的H1.0K180me2抗体结合(中和)蛋白质或肽进行的治疗的靶标。
在辐射暴露的背景下，暴露于电离辐射诱导血清中循环H1.0K180me2的水平增加(图10A和图10B)。因此，在此背景下，提供了用治疗有效量的H1.0K180me2抗体进行的治疗。另外，响应于H1.0K180me2增加产生的天然存在的自身抗体提供了用治疗有效量的H1.0K180me2抗体结合(中和)蛋白质或肽进行的治疗的靶标。
在一些实施方案中，进行诊断方法以确定待治疗的个体是否确实患有甲基化H1.0相关疾病或病状。在该治疗之前可进行用于测试指示甲基化H1.0相关疾病或病状的H1.0K180me2或H1.0K180me2抗体的存在、定位、染色质级分、细胞质积聚、血清水平、自身抗体水平的测定。
B.治疗性H1.0K180me2抗体
如上文部分(II)(A)中所讨论的，本文提供了识别H1.0K180me2表位并与其特异性结合并且可用于治疗的抗体。
除识别二甲基化K180抗原的H1.0K180me2抗体之外，在一些实施方案中，治疗性抗体是抗独特型抗体。此类独特型抗体识别患有阿尔茨海默病或其他甲基化H1.0相关疾病或病状的患者中与疾病相关的IgG-自身抗体或与疾病相关的IgM-自身抗体。在一些实施方案中，体外IgM(IVIgM)由阿尔茨海默病患者供体的血浆产生，并可用作阿尔茨海默病的预防性治疗或疫苗接种。此类IVIgM可含有抗独特型抗体，其识别患者中与疾病相关的自身抗体。因此，在一些实施方案中，IVIgM可具有独特型抗体，其中该独特型抗体可灭活针对H1.0K180me2的IgG和/或IgM自身抗体。
本文提供的治疗性抗体可以是任何免疫球蛋白类型，诸如IgG、IgA、IgE、IgD或IgM，或者针对IgG、IgA、IgE、IgD或IgM的抗独特型抗体。在一些实施方案中，该抗体是IgG亚型，并且可以是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在一些实施方案中，该抗体是IgM亚型。
本文提供的抗体可进一步缀合用于与其治疗用途有关的多种目的，包括但不限于用于检测、可视化、量化、分选、治疗和用于生物学测定。
在一些实施方案中，该治疗性抗体是中和抗体，并且该抗体中和H1.0K180me2的一种或多种生物活性。例如，该抗体可结合细胞外H1.0K180me2并且中和其可能具有的任何结合或信号传导活性。在一些实施方案中，该抗体可清除或阻断细胞或样品中的H1.0K180me2。在一些实施方案中，该抗体可清除包含H1.0K180me2的细胞。
在一些实施方案中，治疗性抗体可清除衰老细胞。在一些实施方案中，该抗体可清除引起阿尔茨海默病症状的细胞/组织或蛋白质产物。在一些实施方案中，该抗体可清除被辐射损伤、DNA损伤剂和其他基因毒素损伤的细胞。在一些实施方案中，该抗体是细胞穿透抗体。在其他实施方案中，包括受影响的细胞膜并允许本文提供的治疗性H1.0K180me2抗体进入。
在一些实施方案中，本文提供的治疗性抗体具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。在其细胞表面上携带Fcγ受体(FcγR或FCGR)的效应细胞(包括细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞或单核细胞)识别并结合抗体与靶细胞结合的Fc区。这种结合可触发细胞内信号传导途径的激活，从而导致细胞死亡。
在一些实施方案中，治疗性抗体具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。抗体诱导的CDC通过经典补体级联的蛋白介导，并且通过补体蛋白Clq与抗体的结合而触发。抗体Fc区与Clq结合可诱导补体级联的激活。
在一些实施方案中，治疗性抗体具有抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性。在其细胞表面上携带Fc受体的吞噬细胞(包括单核细胞和巨噬细胞)识别并结合抗体与靶细胞结合的Fc区。在Fc受体与抗体结合的靶细胞结合后，可启动靶细胞的吞噬作用。
在一些实施方案中，治疗性抗体可形成免疫复合物。例如，免疫复合物可以是表达或挤出被抗体覆盖的H1.0K180me2抗原的细胞。
C.治疗性H1.0K180me2蛋白和H1.0K180me2肽
H1.0K180me2抗原在患有甲基化H1.0相关疾病或病状的个体中的产生引起产生对H1.0K180me2抗原具有特异性的天然存在的自身抗体。因此，本文提供了结合和清除这些天然存在的自身抗体的治疗方法。出于此目的，本文提供了保留了对应于K180的二甲基化赖氨酸的治疗性H1.0K180me2蛋白和治疗性H1.0K180me2肽，其可结合并且在一些实施方案中另外中和响应于细胞或循环中的H1.0K180me2表位产生的天然存在的自身抗体。
在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2蛋白/肽可阻断个体血清中H1.0K180me2自身抗体的生物学作用。这种自身抗体水平的阻断可减轻免疫应答，并可改善甲基化H1.0疾病或病状的不良症状。
在一个实施方案中，治疗性H1.0K180me2蛋白是H1.0K180me2全长蛋白(SEQ IDNO:1)。本文提供的治疗性H1.0K180me2肽可以是全长H1.0K180me2蛋白的保留了二甲基化K180残基的任何片段。在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2肽的长度范围为5-193个氨基酸(aa)。在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2肽的长度是5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa、20aa、21aa、22aa、23aa、24aa、25aa、26aa、27aa、28aa、29aa或甚至30aa。在某些示例性实施方案中，治疗性H1.0K180me2肽的长度是15aa、16aa、17aa、18aa、19aa或20aa。表3A提供了本文提供的治疗性H1.0K180me2肽的示例性序列。因此，在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2肽包含选自表3A中所示那些的序列之一。在相关的实施方案中，治疗性H1.0K180me2肽由选自表3A中所示那些的序列之一组成。在示例性实施方案中，治疗性H1.0K180me2肽包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的序列。在示例性实施方案中，H1.0K180me2抗体结合肽由SEQ ID NO:3、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5的序列组成。
在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2蛋白或肽是合成的。在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2蛋白或肽是体外甲基化反应的产物，例如在允许K180残基特异性二甲基化的条件(本文更详细地描述)下，使用G9A甲基转移酶或G9A样蛋白(GLP)甲基转移酶。
如在部分I中所提供的，本文提供的治疗性H1.0K180me2蛋白/肽可进一步缀合用于多种目的，包括但不限于用于治疗和用于与其治疗用途相关的生物学测定。
在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2蛋白/肽包含标记(例如缀合至标记)，例如可检测标记、旋转标记、比色标记、放射性标记、酶标记、荧光标记或磁性标记。在示例性实施方案中，治疗性H1.0K180me2蛋白/肽是生物素酰化的。在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2蛋白/肽缀合或附接至固体表面，例如珠(例如磁性、玻璃或塑料珠)、柱或微板。在一些实施方案中，将治疗性H1.0K180me2蛋白/肽涂布在微板上。在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2蛋白/肽缀合至或包含效应分子，包括但不限于放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA和二抗。
在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2蛋白/肽对于对H1.0K180me2具有特异性的自身抗体有选择性。在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2蛋白/肽结合对H1.0K180me2不具有特异性的自身抗体。
在某些实施方案中，本文提供的治疗性H1.0K180me2蛋白/肽具有0.0001nM至1μM范围的解离常数(Kd)。例如，抗H1.0K180me2结合肽的Kd可以是约1μM、约100nM、约50nM、约10nM、约5nM、约1nM、约0.5nM、约0.1nM、约0.05nM、约0.01nM、约0.005nM、约0.001nM、约0.0005nM或甚至约0.0001nM。
在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2蛋白/肽对人H1.0K180me2自身抗体具有特异性。在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2蛋白/肽与来自其他物种的H1.0K180me2自身抗体交叉反应。
在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2蛋白/肽对H1.0K180me2自身抗体具有选择性，并且表现出很少或不与结合H1.0K180me1或H1.0K180me3的自身抗体结合。在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2蛋白/肽结合H1.0K180me2自身抗体，但还表现出与H1.0K180me1和/或H1.0K180me3自身抗体结合。
在一些实施方案中，治疗性H1.0K180me2蛋白/肽对H1.0K180me2抗体的结合偏好(例如亲和力)通常超过非特异性靶抗体(例如随机产生的抗体)至少约2倍、约5倍或至少约10倍、20倍、50倍、102倍、103倍、104倍、105倍或106倍。
还可能的是使用本领域技术人员熟悉的方法评估治疗性H1.0K180me2蛋白或肽以确定它们是否对H1.0K180me2抗体具有特异性和/或选择性。
本文提供了编码本文所述的治疗性H1.0K180me2肽的核酸。本文还提供了包含编码本文所述的治疗性H1.0K180me2肽的任何核酸的载体。
D.组合疗法
本文提供的任何治疗性H1.0K180me2抗体和治疗性H1.0K180me2蛋白/肽的施用可与体现在H1.0甲基化上的疾病的其他已知药物/治疗组合施用。
在阿尔茨海默病预防的背景下，任何治疗性H1.0K180me2抗体可与包括但不限于以下的阿尔茨海默病预防药物或方案的施用组合施用：APP合成抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂和调节剂、Aβ聚集抑制剂、Aβ免疫疗法、降胆固醇药物、抗tau药物、胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、非典型抗精神病药、蛋白质S-亚硝基化的阻断剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、雷帕霉素、rapalogue、内源性大麻素、大麻素、神经保护剂、控制钙内流的分子、抗氧化剂、抗炎药物、控制谷氨酸稳态控制的药物、自噬诱导剂、激素、激素调节剂、他汀类、胰岛素、胰岛素载体、多功能纳米载体、维生素、营养补充剂、小RNA分子、肽和超声疗法。
在阿尔茨海默病治疗的背景下，任何治疗性H1.0K180me2蛋白/肽可与包括但不限于以下的阿尔茨海默病药物或方案的施用组合施用：APP合成抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂和调节剂、Aβ聚集抑制剂、Aβ免疫疗法、降胆固醇药物、抗tau药物、胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、非典型抗精神病药、蛋白质S-亚硝基化的阻断剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、雷帕霉素、rapalogue、内源性大麻素、大麻素、神经保护剂、控制钙内流的分子、抗氧化剂、抗炎药物、控制谷氨酸稳态控制的药物、自噬诱导剂、激素、激素调节剂、他汀类、胰岛素、胰岛素载体、多功能纳米载体、维生素、营养补充剂、小RNA分子、肽和超声疗法。
E.治疗性H1.0K180me2抗体和治疗性抗H1.0K180me2结合蛋白/肽的施用
本文所述的治疗性H1.0K180me2抗体和治疗性H1.0K180me2蛋白/肽的体内施用可静脉内、肌肉内、皮下、局部、口服、透皮、腹膜内、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内进行。可施用有效量的治疗剂用于治疗体现出H1.0甲基化的疾病或病状，或体现出H1.0K180me2自身抗体水平升高的疾病或病状。治疗剂的适当剂量可基于以下确定：待治疗的疾病或病症的类型，治疗性抗体、蛋白质或肽的类型，疾病或病状的严重程度和病程，个体的临床病状，个体的临床病史和对治疗的响应，以及主治医师的判定。
对于本文所述的治疗性H1.0K180me2抗体和治疗性H1.0K180me2蛋白/肽的体内施用，取决于施用途径，正常剂量可从每天约1ng/kg至约1000mg/kg个体体重或更多变化。为了在若干天或更长时间内重复施用，根据待治疗的甲基化H1.0相关疾病或病状的严重程度，可持续治疗直至实现所需症状抑制。取决于医师所希望实现的药代动力学衰减的模式，剂量方案也是可用的。例如，本文提供了每周一至二十次对个体进行给药。在某些实施方案中，给药频率为每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天一次、每周一次、每两周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、或每月一次、每两个月一次、每三个月一次或更长时间。该疗法的进展可通过常规技术和测定进行监测。给药方案可随时间变化，与所用剂量无关。
F.药物组合物
本申请提供了包含治疗性H1.0K180me2抗体和治疗性H1.0K180me2蛋白/肽的组合物，包括包含本文所述治疗性抗体、蛋白质或肽中的任一种或多种与一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，该组合物是无菌的。该药物组合物通常包含有效量的治疗性抗体、蛋白质或肽。
G.试剂盒和制品
本申请提供了包含本文所述治疗性H1.0K180me2抗体、治疗性H1.0K180me2蛋白和治疗性H1.0K180me2肽组合物的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒进一步含有选自以下中的任一种的组分：二级抗体、用于免疫组织化学分析的试剂、药学上可接受的赋形剂和说明书及其任何组合。在一个实施方案中，该试剂盒包含本文所述治疗性组合物中的一种或多种一种或多种，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
本申请还提供了包含本文所述治疗性组合物或试剂盒中的任一种的制品。制品的例子包括小瓶(包括密封小瓶)。
包括以下实施例用于说明性目的，而不旨在限制本发明的范围。
实施例
实施例1：材料和方法
这里提供在后续实施例中使用的材料和方法。
H1.0蛋白和肽的体外甲基化-放射性标记体外甲基化测定
为了在体外可视化通过G9A甲基转移酶进行的H1.0肽甲基化，结合放射性标记的甲基供体进行甲基化测定，所述放射性标记的甲基供体允许在放射自显影曝光后在凝胶上可视化甲基化肽。在1.5ml管中建立以下甲基化反应：1X HMT反应缓冲液(50mM Tris-HCl、5mM MgCl2、4mM二硫苏糖醇，pH9.0)、10U G9A甲基转移酶(NEB，M0235S，批号0031201)、3.2mM腺苷-L-甲硫氨酸、S-[甲基-3H](Perkin Elmer，NET155H，批号1664720)、10μg H1.0肽(ThermoFisher Scientific，生物素-AKPVKASKPKKAKPVKPK(SEQ ID NO:75))，最终体积为10μl。还产生了如上所述但没有H1.0肽的对照反应。将反应在热循环仪中于37℃下孵育1小时。通过在冰上孵育5分钟终止反应，并且随后在16.5％Tricine凝胶(BioRad，4563063)上解析。将凝胶在30％甲醇、5％甘油中浸泡30分钟，然后在室温下真空干燥24小时。然后用磷成像仪(Molecular Dynamics)进行干凝胶的放射自显影分析，以评估通过G9A甲基转移酶进行的H1.0肽与甲基-3H基团的有效甲基化。
液相色谱和高分辨率质谱(LC-MS)
为了鉴定组蛋白H1.0上通过G9A和GLP甲基转移酶进行的甲基化的精确位点，进行体外甲基化测定，并且随后通过液相色谱和高分辨率质谱(LC-MS)分析进行分析。使用G9A甲基转移酶(NEB，M0235S，批号0031201)或GLP甲基转移酶(Cayman Chemical，10755)建立甲基化反应。每个反应中的甲基供体是未标记的S-腺苷-L-甲硫氨酸(NEB，B9003S)。每个反应中的H1.0底物是用生物素标记的未修饰的H1.0肽(ThermoFisher Scientific，生物素-AKPVKASKPKKAKPVKPK(SEQ ID NO:75))、二甲基化H1.0肽(ThermoFisher Scientific，生物素-AKPVKASKPKKAKPVK(me2)PK(SEQ ID NO:76))或全长重组人H1.0(NEB，M2501S)。对于每种条件，如下一式三份地建立甲基化反应：1X HMT反应缓冲液(50mM Tris-HCl、5mM MgCl2、4mM二硫苏糖醇，pH 9.0)；10U G9A或GLP甲基转移酶；3.2mM S-腺苷-L-甲硫氨酸；500ng未修饰的或修饰的H1.0肽，或1μg全长蛋白质；最终体积为10μl。作为对照，如上所述建立反应，但不存在任何甲基转移酶。将所有反应在热循环仪中于37℃下孵育1小时，并且随后通过在冰上孵育5分钟终止反应。在LC-MS分析之前将样品在-80℃下冷冻。
对于液相色谱和高分辨率质谱(LC-MS)分析，如上所述制备样品，并将约1μg产物注射到配置有10cm x 100um捕获柱和25cm x 100um ID解析柱的Thermo Scientific EasynLC系统上。缓冲液A是98％水、2％甲醇和0.2％甲酸。缓冲液B是10％水、10％异丙醇、80％乙腈和0.2％甲酸。以4uL/min装载样品10分钟，并且以375nL/min运行0-45％B的梯度超过130min，总运行时间为150min(包括再生和样品装载)。Thermo Scientific LTQ OrbitrapVelos质谱仪以标准的排名前10数据相关配置运行，不同之处在于使用更高的触发阈值(20K)来确保MS2不干扰全扫描占空比。这确保了用于量化的最佳全扫描数据。在离子捕获质量分析仪中进行MS2碎裂和分析。一式三份地运行样品。
LC-MS数据分析
使用RefSeqHuman序列数据库，使用Thermo Scientific Proteome Discoverer版本1.4(包括Sequest和Percolator算法)进行蛋白质鉴定。用缺乏任何甲基转移酶的对照反应进行这些搜索。将Percolator肽置信度过滤器设置为“高”。使用Pinpoint版本1.4软件进行蛋白质量化。Pinpoint量化工作流程包括导入Proteome Discoverer.msf文件作为光谱文库。随后使用Pinpoint峰值发现、色谱比对和面积计算算法在MS.raw文件中量化鉴定的肽。
为了鉴定G9A甲基化在未修饰的H1.0肽(AKPVKASKPKKAKPVKPK(SEQ ID NO:42))上的精确位置，建立了甲基化反应并通过LC-MS鉴定产物。甲基化反应包括重组G9A、未标记的甲基供体(S-腺苷-L-甲硫氨酸)和未修饰的H1.0肽。随后通过LC-MS分析甲基化反应，并且使用光谱计数鉴定和量化每个光谱峰(对应于最终反应中的肽种类)。图22A中“me”圆的数目表示赖氨酸残基的甲基化状态(单甲基化、二甲基化或三甲基化)。图22A示出了在未甲基化H1.0肽存在下，G9A特异性地且大量地二甲基化H1.0K180(所有肽的99.9％)。
hADSC的培养
人脂肪来源的间充质干细胞(hADSC)从Life Technologies(R7788-115)和美国典型培养物保藏所ATCC(PCS-500-011)商购获得。所有细胞系均从人脂肪组织中分离，所述人脂肪组织获自经历常规吸脂程序的三名年龄为38、45和49岁的健康成年女性白种人供体。流式细胞术分析和免疫染色分析确认细胞对CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166呈阳性，并且对CD14、CD31、CD34和CD45呈阴性。确认细胞系能够在体外条件下成脂、软骨形成和成骨分化。
在37℃/5％CO2下，使分离的脂肪来源的干细胞系在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和50U/ml青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基(Life Technologies，11330-057)中生长。在多次传代中，将累积群体倍增(PD)计算为PD＝log(N/N0)x 3.33，作为培养物中生长天数的函数，其中N0是在烧瓶中铺板的细胞数目，并且N是在此传代中收获的细胞数目。在所有实验中使用针对自我更新群体(SR)的hADSC PD 4-10和针对复制性衰老群体(REP-SEN)的PD 41-46。
衰老诱导和评估
对于复制性衰老，使hADSC在培养物中生长直至达到复制耗尽(PD41-46)。对于急性DNA损伤条件，将SR hADSC(PD 4-10)用50μg/ml硫酸博来霉素(Cayman Chemical，13877)在生长培养基中处理2小时。对于基因毒性应激诱导的衰老，将SR hADSC(PD 4-10)用50μg/ml硫酸博来霉素(Cayman Chemical，13877)在生长培养基中处理2小时，然后用PBS洗涤并给予不含博来霉素的新鲜生长培养基。然后在收集前使细胞生长3天。
为了评估细胞衰老，对细胞进行衰老标志物评分，包括生长停滞、SA-β-gal活性和持久性DNA损伤灶的存在。如制造商试剂盒(BioVision)中所述进行用于监测pH依赖性衰老相关β-半乳糖苷酶活性(SA-β-Gal)表达的测定。将培养的hADSC在室温下用固定溶液固定15分钟，用PBS洗涤两次并在37℃下用含有染色补充物的X-Gal染色过夜。用PBS洗涤细胞两次，并使用光学显微镜(Leica，DMiL)捕获图像。如下所述，通过对γH2A.X灶的免疫染色评估DNA损伤灶。γH2A.X灶外观指示DNA上的双链断裂或DNA损伤。γH2A.X灶是普遍接受的双链断裂的分子标志物。
抗体
使用的一级抗体：抗H1.0K180me2，1:100稀释，兔多克隆，Aviva SystemsBiology。抗H1.0总体，1:500稀释，EMD Millipore MABE446。抗γH2A.X(Ser139Ph)，1:500-1000稀释，EMD Millipore 05-636。抗β-肌动蛋白，1:2000，Abcam ab6276。抗聚-(ADP)-核糖，1:500，Enzo Life Sciences ALX-804-220-R100。抗G9A，1:500，Bethyl LaboratoriesA300-933A。抗GLP，1:500，Bethyl Laboratories A301-643A。抗H3K9me2，1:1000，AbcamA301-643A。
二级抗体：山羊抗小鼠-HRP，1:4000，Biorad 1706516。山羊抗兔-HRP，1:4000，Biorad 1706515。山羊抗人-HRP，1:4000，Biorad 1721050；AlexaFluor-488-驴抗小鼠，1:5000，Life Technologies A-21202；AlexaFluor-488-驴抗兔，1:5000，Life TechnologiesA-21206；AlexaFluor-555-驴抗小鼠，1:5000，Life Technologies A-31570；AlexaFluor-555-驴抗兔，1:5000，Life Technologies A-31572和抗IgM HRP(兔抗人IgM(Mu链)(HRP-缀合物)(Abcam，ab97210，批号GR169227-10))。
ELISA
以下方案描述了用于直接或间接检测血清H1.0K180me2IgG水平的通用酶联免疫吸附测定(ELISA)。
图4示出了使用夹心ELISA间接检测血清H1.0K180me2水平(例如间接检测IgG或IgM水平)。将ELISA用于检测针对体液样品中H1.0K180me2肽表位的抗体。以下方案描述了通用酶联免疫吸附测定(ELISA)，其使用生物素酰化的肽，以捕获血清样品中的特异性抗体(用于间接检测血清H1.0K180me2IgG或IgM水平)，随后是用缀合至HRP的二级抗体进行的检测和四甲基联苯胺(TMB)孵育。将链霉抗生物素蛋白涂布的微板(ThermoFisher，15501)的孔用洗涤缓冲液(Tris缓冲盐水(25mM Tris，150mM NaCl；pH 7.6)加0.1％BSA和0.05％Tween-20)洗涤3次。将50pmol定制生物素酰化的H1.0K180me2肽(ThermoFisher)在洗涤缓冲液中稀释，并在温和摇动下在室温下与每个孔结合2小时。通过用洗涤缓冲液洗涤3次洗去未结合的肽。产生洗涤缓冲液中的连续稀释H1.0K180me2抗体作为标准品(1:25000、1:50000、1:100000、1:200000、1:400000，储备浓度0.54mg/ml)。将血清样品在洗涤缓冲液中稀释(1:1000)。向孔中加入100μL标准品和样品，一式两份。将孔在温和摇动下在室温下孵育1小时。通过用洗涤缓冲液洗涤3次洗去未结合的标准品或样品。将缀合至HRP的二级抗体(抗IgG二级抗体或抗IgM二级抗体)在洗涤缓冲液中稀释(1:1000)(对于血清样品，山羊抗人-HRP，Biorad 1721050；对于标准品，山羊抗兔-HRP，BioRad 1706515)。向孔中加入100μL二级抗体稀释液。将孔在温和摇动下在室温下孵育1小时。通过用洗涤缓冲液洗涤3次洗去未结合的二级抗体。向每个孔中加入100μL TMB溶液(PeproTech)并在温和摇动下在室温下孵育15分钟。向每个孔中加入100μL终止溶液(0.18M H2SO4)并在温和摇动下在室温下孵育5分钟。在氧化时，TMB形成水溶性蓝色反应产物，其可在650nm下用分光光度法测量。在用终止溶液酸化后，反应产物变为黄色，其在450nm处具有吸收峰。用读板仪(MolecularDevices)测量每个孔在450nm处的吸光度。通过从标准曲线外推测定每个样品中H1.0K180me2IgG或IgM的浓度，并在下面进一步描述。图14C示出了使用ELISA间接检测体液中的自身抗H1.0K180me2IgM水平。
图5A示出了使用夹心ELISA直接检测体液样品中的H1.0K180me2肽表位。通常，提供对H1.0K180me2表位具有特异性的抗体，并将其固定(涂布)在微板上。提供含有H1.0K180me2表位用于量化的临床样品。向微板中加入该样品，并且H1.0K180me2表位与固定的抗体结合。洗去未结合的材料。然后加入检测抗体，例如HRP或任何其他标记的抗体。这些检测抗体结合捕获表位。洗去未结合的检测抗体。加入检测底物溶液，并测量荧光团或颜色变化。然后将其相对于标准曲线进行量化，以报告临床样品中H1.0K180me2表位的水平。
图5B示出了H1.0K180me2抗原夹心ELISA测试的标准曲线。将体外甲基化的全长H1.0K180me2用作50ng/ml至3.125ng/ml的2X稀释系列中的标准品。将标准浓度相对于450nm处的测量的O.D作图。在高于检测极限的点之间绘制线性趋势线，并计算该线的方程(在图上显示)。该插入示出原始数据。一式两份进行ELISA，并且将平均O.D.值用于产生曲线。
蛋白质印迹
将用于蛋白质印迹分析的材料(培养的细胞或组织)在冰冷的RIPA裂解缓冲液(Thermo Scientific 89900)中裂解并使用Covaris S2超声波仪进行超声处理(占空比为10％，强度为5，每分钟脉冲数为100，120秒)。按照制造商的方案，使用Quick StartBradford 1x Dye Reagent(BioRad，5000205)量化每个样品中的总蛋白质浓度。然后将样品与NuPAGE LDS样品上样缓冲液(ThermoFisher，NP0007)和NuPAGE样品还原缓冲液(ThermoFisher，NP0004)混合，并在70℃下加热变性10分钟。通过电泳在4％-12％预制聚丙烯酰胺凝胶(ThermoFisher，NP0321)上分离蛋白质，并转移至0.45μm硝化纤维素膜。将膜用PBS-T中的5％脱脂乳在室温下阻断30分钟，然后用上述一级抗体在4℃下免疫印迹过夜。将蛋白质用上文列出的HRP二级抗体在室温下检测1小时，随后使用制造商的说明书用ECL蛋白质印迹底物(ThermoFisher，32106)进行检测。步骤之间的所有洗涤均使用PBS-T。用Omega LUM-C成像系统(Gel Company)对膜进行成像。
免疫荧光
对于免疫荧光，将细胞进行培养并在室玻片中处理，在中性10％福尔马林中固定，并用含有0.5％Triton X-100的PBS透化。在洗涤后，使用含有1％BSA和4％驴血清的PBS来阻断载玻片。在洗涤后，将载玻片用以上列出的一级抗体孵育，再次洗涤，用以上列出的AlexaFluor二级抗体孵育，并用含有DAPI的慢褪金(slow-fade gold)(Molecular Probes)固定(以可视化细胞核)。通过荧光显微镜观察细胞，并使用Spotfire软件(DiagnosticsInstruments)获取图像用于分析。
狭缝印迹分析
将0.5μl血清样品或已知量的合成肽在200μl TBS中稀释。然后将样品在70℃下加热变性10分钟，然后使用真空歧管狭缝印迹装置(BioRad，1706542)转移至硝化纤维素膜。将膜用PBS-T中的5％脱脂乳在室温下阻断30分钟，然后用上述一级抗体在4℃下免疫印迹过夜。将蛋白质用上文列出的HRP二级抗体在室温下检测1小时，随后使用制造商的说明书用ECL蛋白质印迹底物(ThermoFisher，32106)进行检测。步骤之间的所有洗涤均使用PBS-T。用Omega LUM-C成像系统(Gel Company)对膜进行成像。然后使用ImageJ量化每个样品的狭缝印迹条带。
RNA-Seq分析
根据制造商的方案，使用TRIzol试剂(Invitrogen)从自我复制和复制性衰老细胞培养物样品中分离总RNA。针对相关条件，将来自两个不同hADSC细胞系的样品组合在一起，并使用RNA HS测定试剂盒(Invitrogen，Life technologies)用Qubit 2.0荧光计测量RNA浓度。向总RNA中加入ERCC RNA Spike-In Control混合物(Ambion，Life Technologies)用于质量控制分析。随后，用Low Input Ribominus Eukaryote System v2(Ambion，Lifetechnologies)进行rRNA消耗。用Ion total RNA-seq试剂盒v2(Ambion，Lifetechnologies)构建cDNA文库，并用Ion Xpress RNA-seq条形码(Ambion，Lifetechnologies)进行条形码化。在Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)上用DNA HSbioanalyzer试剂盒进行文库的大小分布和量化。用P1芯片(Life Technologies)在离子质子系统上进行文库测序，并对每个文库进行3次测序。
将来自单个离子质子系统测序运行的RNA-seq读数组合用于每个文库。使用Torrent映射比对程序(TMAP，Life technologies)将序列读数映射至参考人基因组组装hg19(GRCh37)。通过比较从制造商的网站获得的ERCC加标RNA序列的预期计数与映射至相同序列的RNA-seq标签的观察计数来评估每种条件的RNA-seq运行的质量。将初始基因表达水平作为单个NCBI RefSeq基因模型的外显子-映射读数的总和(c)，并且从随后的分析中去除低表达的基因(每百万的读取计数<1)。对于每个文库，使用β-肌动蛋白(ACTB)表达水平(cACTB)和每个基因的总外显子长度l对个体基因表达水平进行归一化。对于文库j，将β-肌动蛋白归一化因子sj计算为：
将文库j中基因i的最终归一化表达值计算为：
药物治疗
博来霉素治疗：用50μg/ml博来霉素(Cayman Chemical 13877)补充细胞生长培养基2小时以诱导DNA双链断裂。在博来霉素治疗后立即收集细胞(急性DNA损伤)，或使其在博来霉素治疗后生长3天(基因毒性应激诱导的衰老)。PARP-1抑制剂：在下游分析之前，用1μM有效的PARP-1抑制剂AG14361(Selleckchem S2178)补充细胞生长培养基24小时。雷帕霉素治疗：在下游分析或治疗之前，用500nM雷帕霉素(Cayman Chemical 11346)补充细胞生长培养基24小时。依维莫司治疗：在下游分析或治疗之前，用500nM依维莫司(CaymanChemical 11597)补充细胞生长培养基24小时。替莫唑胺治疗：在下游分析之前，用50μg/ml替莫唑胺(Cayman Chemical 14163)补充细胞生长培养基2小时。
在照射后小鼠中H1.0K180me2的分析
通过颊部穿刺从两只13个月大的小鼠收集血液，并使用具有SST血清分离器(BD，365956)的Microtainer 分离血清。然后将相同的小鼠暴露于7Gy电离辐射(以X射线的形式)。在照射后2小时从一只小鼠再次抽血，并且在照射后48小时从另一只小鼠抽血。使用Microtainer 再次将血清与血液分离。然后通过狭缝印迹和蛋白质印迹分析照射前后每只小鼠的血清。
从小鼠中分离脂肪来源的干细胞(ADSC)
从野生型小鼠中分离小鼠脂肪来源的干细胞。收集皮下或肾周白色脂肪组织并以1:3w/v比率悬浮于汉克氏缓冲盐溶液(HBSS)、3.5％牛血清白蛋白(BSA)、1％II型胶原酶(Sigma)中并在37℃下摇动50min。将细胞通过70μm网孔细胞过滤网(BD Falcon#352350)过滤，用红细胞裂解缓冲液(150mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM EDTA，pH 7.3)处理，并在37℃在10％CO2下在DMEM/F12完全培养基(DMEM/F12、10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2.5μg/ml两性霉素B；Invitrogen)中离体扩增并且以80％汇合传代，每72-96小时换一次培养基。然后将细胞用于如其他地方所述的蛋白质印迹分析。
实施例2：衰老中H1.0K180me2肽的发现
根据实施例1中描述的方法获得自我更新(SR)hADSC和复制性衰老(REP-SEN)hADSC。为了鉴定组蛋白的新的与老化相关的翻译后修饰(PTM)，根据图1A的发现途径，通过M/Z对标签LC-MS评估来自SR和REP-SEN hADSC的裂解物。在全扫描优化配置中处理自我更新和复制性衰老hADSC裂解物的五次技术重复注射。确定了用于最佳全扫描量化测量的色谱和仪器方法与最佳碎片扫描的方法相冲突。因此，通过将两个不同的数据测量进程结合到该分析中，开发了质谱仪的精确质量和宽动态范围能力。第一进程专注于获取未受损害和优化的全扫描(MS)数据，用于实现高度可再现量化。将这种第一全扫描量化进程用于产生可能感兴趣的特征的包含列表。然后，在数据样本子集的第二进程期间将包含列表用于靶向碎片扫描获取。如图1B所示，质谱揭示SR hADSC中的未修饰的(AKPVKASKPKKAKPVKPK(SEQ ID NO:42))肽，以及REP-SEN hADSC中的二甲基化(AKPVKASKPKKAKPVKme2PK(SEQ IDNO:3))肽。
根据实施例1中描述的方法进行比较SR和REP-SEN hADSC的表达谱的RNA-seq实验。如图2A所示，在SR(黑条)和REP-SEN(灰条)hADSC两者中，组蛋白H1均存在6种不同的变体：H1.0、H1.1、H1.2、H1.3、H1.4和H1.5。y轴上的值表示每个基因的外显子-映射读数的总和，通过每个样品中的相对β-肌动蛋白表达进行归一化，并且通过每个基因的总外显子长度进一步进行归一化。发现组蛋白H1.0是基因表达水平上第4最丰富的H1变体-H1.0mRNA占SR hADSC中总H1表达的8％和REP-SEN hADSC中总H1表达的14％。然而，与其他变体不同，其表达在复制性衰老期间保持恒定。通过RNA-seq分析鉴定的唯一映射至组蛋白H1.0基因的所有读数的基因组浏览器视图(图2B)显示SR hADSC(顶部轨迹)中的H1.0表达高于REP-SENhADSC(底部轨迹)中的H1.0表达。通过每个样品中的相对β-肌动蛋白表达归一化读取计数。
以已知的甲基化赖氨酸残基为中心的各个肽序列的比对揭示，围绕H1.0K180的氨基酸序列是独特的，并且与其他甲基化赖氨酸残基不相似(图3A)。
实施例3：H1.0K180me2抗体
如下制备对H1.0K180me2抗原具有特异性的多克隆抗体：将两只新西兰兔免疫以进行抗体生产。皮下施用(SQ)注射，作为缀合至H1.0K180me2肽的Keyhole LimpetHemocyanin(KLH)(肽：CAKPVKASKPKKAKPVK(me2)PK(SEQ ID NO:39)；缀合肽：(KLH-CAKPVKASKPKKAKPVK(me2)PK(SEQ ID NO:77))的乳剂，其中C-末端C被人工加入到肽的序列中以在完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(IFA)中产生与KLH的共价连接。在10个SQ位点处用0.5mg于CFA中的抗原进行初始免疫。在7-8周的时间内以常规间隔进行6次随后的加强免疫。4个SQ位点处的加强剂由0.25mg于IFA中的抗原组成。在第5周(每只兔子约25ml血液)和第8周(每只兔子约50ml血液)给兔子放血。通过比较免疫前和免疫后血液，使用ELISA评估免疫滴度。然后使用抗原亲和色谱法纯化抗体。用于纯化的抗原是生物素缀合或牛血清白蛋白(BSA)缀合H1.0K180me2肽(生物素-CAKPVKASKPKKAKPVK(me2)PK(SEQ ID NO:78))或BSA-CAKPVKASKPKKAKPVK(me2)PK(SEQ ID NO:79))。使用本文提供的体外甲基化方法二甲基化该肽。
如下测试H1.0K180me2抗体。为了检查H1.0K180me2抗体的特异性，在稀释系列中使用真空-歧管狭缝印迹将K172、K174、K175、K177或K180上甲基化的组蛋白H1.0肽转移至膜。然后使用H1.0K180me2抗体对膜进行免疫印迹以鉴定与其他甲基-赖氨酸基团的潜在交叉反应性。H1.0K180me2抗体对H1.0K180me2具有高度特异性，即使在低浓度下也是如此(图3B)。为了进一步检查H1.0K180me2抗体的特异性，在稀释系列中使用真空-歧管狭缝印迹将K4、K9、K27、K36或K79上甲基化的组蛋白H3肽转移至膜。然后使用H1.0K180me2抗体对膜进行免疫印迹以鉴定与其他甲基-赖氨酸基团的潜在交叉反应性。此抗体未表现出与所分析的任何甲基化H3肽的交叉反应性(图3C)。根据实施例1中描述的方法进行狭缝印迹分析方案。
使用抗H1.0K180me2IgG ELISA测试测定兔抗H1.0K180me2IgG抗体的特异性。在6.25pmol至781fmol的2X稀释系列中，将孔用H1.0K180me2肽、H1.0K180me1肽或未修饰的肽涂布。向每个孔中加入6.67fmol于100ul缓冲液中的兔抗H1.0K180me2IgG抗体，并且通过ELISA监测抗体结合效率。通过将肽量相对于450nm处的测量的O.D作图来产生每种肽的曲线。原始ELISA数据在两个实验重复的图表中给出。(图3D)
兔抗H1.0K180me2IgG抗体在结合H1.0K180me2肽方面的效率比H1.0K180me1肽高2.7倍。在最佳线性范围内，1个兔抗H1.0K180me2IgG抗体分子识别出117个H1.0K180me2肽分子中的1个，但仅识别出316个H1.0K180me1肽分子中的1个。未修饰的肽在此范围内无法被识别。
组蛋白H1变体蛋白序列的ClustalW2比对揭示H1.0K180嵌入其他H1变体中不存在的独特氨基酸序列中(图3E)。在初始发现实验中鉴定的肽以灰色突出显示。还示出了包含3个α-螺旋的球状结构域区域。
实施例4：在ELISA中使用H1.0K180me2肽间接检测血清H1.0K180me2IgG和H1.0K180me2IgM自身抗体水平
血清H1.0K180me2IgG自身抗体的间接检测
以下实施例描述了酶联免疫吸附测定(ELISA)，其使用生物素酰化的治疗性H1.0K180me2肽，以捕获血清样品中的特异性自身抗体，随后是用缀合至HRP的二级抗体进行的检测和四甲基联苯胺(TMB)孵育。将链霉抗生物素蛋白涂布的微板(ThermoFisher，15501)的孔用洗涤缓冲液(Tris缓冲盐水(25mM Tris，150mM NaCl；pH 7.6)加0.1％BSA和0.05％Tween-20)洗涤3次。将50pmol定制生物素酰化的H1.0K180me2肽(ThermoFisher)在洗涤缓冲液中稀释，并在温和摇动下在室温下与每个孔结合2小时。通过用洗涤缓冲液洗涤3次洗去未结合的肽。产生洗涤缓冲液中的连续稀释H1.0K180me2抗体作为标准品(1:25000、1:50000、1:100000、1:200000、1:400000，储备浓度0.54mg/ml)。将血清样品在洗涤缓冲液中稀释(1:1000)。向孔中加入100μL标准品和样品，一式两份。将孔在温和摇动下在室温下孵育1小时。通过用洗涤缓冲液洗涤3次洗去未结合的标准品或样品。将缀合至HRP的二级抗体(标记的二级抗体，如图4，步骤3所示)在洗涤缓冲液中稀释(1:1000)(对于血清样品，山羊抗人HRP，Biorad 1721050；对于标准品，山羊抗兔HRP，Biorad 1706515)。向孔中加入100μL二级抗体稀释液。将孔在温和摇动下在室温下孵育1小时。通过用洗涤缓冲液洗涤3次洗去未结合的二级抗体。向每个孔中加入100μL TMB溶液(PeproTech)并在温和摇动下在室温下孵育15分钟。向每个孔中加入100μL终止溶液(0.18M H2SO4)并在温和摇动下在室温下孵育5分钟。在氧化时，TMB形成水溶性蓝色反应产物，其可在650nm下用分光光度法测量。在用终止溶液酸化后，反应产物变为黄色，其在450nm处具有吸收峰。用读板仪(MolecularDevices)测量每个孔在450nm处的吸光度。通过从标准曲线外推测定每个样品中H1.0K180me2IgG的浓度。
使用ELISA间接检测血清H1.0K180me2IgG水平通常如图4所示。
血清H1.0K180me2IgM自身抗体的间接检测
血清H1.0K180me2IgM自身抗体的检测包括三个步骤。该测试包括使用可商购获得的夹心ELISA试剂盒测量患者血清中的总IgM(步骤1)，随后使用间接ELISA测定来测量同一样品中的抗H1.0K180me2IgM(步骤2)。作为最终步骤，通过样品中的总IgM将抗H1.0K180me2IgM水平归一化(步骤3)。
步骤1：使用可商购获得的购自Affymetrix eBioscience(Human IgM ELISAReady-SET-Go！，部件号88-50620，批号123620111)的夹心ELISA试剂盒测量患者血清中的总人IgM。
步骤2：使用定制的间接ELISA测定来测量患者血清中的抗H1.0K180me2IgM。将生物素标记的H1.0K180me2捕获肽涂布在96孔链霉抗生物素蛋白涂布的微板(ThermoFisher，15501，批号QH218700)上。用洗涤缓冲液(Tris缓冲盐水(25mM Tris，150mM NaCl；pH 7.6)加0.1％BSA和0.05％Tween-20)洗去过量的游离肽。使用含有d-生物素(VWR，97061-444，批号1405C080；用于阻断板表面上未结合的链霉抗生物素蛋白)的阻断缓冲液(ThermoScientific，37536，批号QJ222191)阻断微板上的非特异性结合位点，这降低了背景噪音。一式三份地向微板孔中加入稀释的患者血清。患者样品中的抗H1.0K180me2自身抗体识别并结合板表面上的捕获肽。同时，在同一板上处理抗H1.0K180me2IgG抗体标准品的稀释系列。然后用洗涤缓冲液洗涤孔以除去未结合的样品或标准品。然后使用加入到每个样品孔中的抗IgM HRP检测抗体(标记的二级抗体，如图4，步骤3所示；兔抗人IgM(Mu链)(HRP-缀合物)(Abcam，ab97210，批号GR169227-10))检测结合的抗H1.0K180me2IgM自身抗体。使用加入到每个标准孔中的抗IgG HRP检测抗体(山羊抗兔IgG(H+L)(HRP-缀合物)(BioRad，1706515，批号350003080))来检测标准品。然后用洗涤缓冲液洗掉过量的未结合的检测抗体。然后通过向孔中加入四甲基联苯胺(TMB)底物(KPL，52-00-01，批号10164336)测定结合的HRP活性。通过加入终止溶液((0.18M H2SO4)(KPL，50-85-04，批号10164328))停止此反应，并在450nm处读取孔内容物的吸光度。吸光度与样品中抗H1.0K180me2IgM的浓度成正比。然后通过从标准曲线外推并乘以初始稀释因子确定每个样品中抗H1.0K180me2IgM的摩尔浓度。
标准曲线利用了抗H1.0K180me2兔多克隆IgG抗体。此抗体被确认为对H1.0K180me2具有高度特异性。此抗体不识别H1.0上的任何其他赖氨酸甲基化，并且特异于甲基化程度，例如可区分赖氨酸K180的单(me1)、二(me2)和三(me3)(图3A)。其不与其他常见组蛋白上的甲基化位点交叉反应(图3A)。分别从这种抗H1.0K180me2IgG的稀释系列(72、36、18、12、9、4.5fmol/ml)或具有固定浓度的生物素酰化表位(合成肽AKPVKASKPKKAKPVKme2PK(SEQ ID NO:3))或固定量的二级抗IgM抗体的总IgM抗体的稀释系列(556、444、222、111、56、28、18或0fmol/ml)产生标准曲线。从抗H1.0K180me2IgG摩尔浓度的曲线推断出每个样品中抗H1.0K180me2IgM的摩尔浓度。
步骤3：通过总IgM血清浓度归一化抗H1.0K180me2IgM血清浓度。一式三份地进行患者血清中总IgM的测量。然后从一式三份重复计算每个样品中的平均总IgM浓度。一式三份地进行患者血清中抗H1.0K180me2IgM的测量。然后从一式三份重复计算每个样品中的平均抗H1.0K180me2IgM浓度。为了获得最终测试值，将每个患者样品的平均抗H1.0K180me2IgM浓度除以平均总IgM浓度。
使用ELISA间接检测血清H1.0K180me2IgM水平通常如图4所示。
患者血清中抗H1.0(未修饰的H1.0)IgM水平的测量
该程序与抗H1.0K180me2IgM的间接ELISA相同，但捕获肽不同。在这种情况下，该肽是缺乏K180me2的未修饰的肽(未修饰的H1.0)。另外，使用的标准是针对未修饰的肽产生的兔多克隆IgG。(图16B，右图)。
实施例5：H1.0K180me2抗体的使用显示H1.0K180me2与急性DNA损伤相关
图6示出，根据实施例1中描述的方法，H1.0mRNA表达在急性DNA损伤和基因毒性应激诱导的衰老后增加。对源自自我复制的hADSC、用博来霉素处理2小时(急性DNA损伤)的hADSC和用博来霉素处理并使其衰老3天(基因毒性应激诱导的衰老)的hADSC的总RNA进行组蛋白H1.0mRNA表达的RT-PCR分析。H1.0mRNA表达在急性DNA损伤后增加超过2倍，并且在基因毒性应激诱导的衰老后保持升高(比SR高1.5倍)。
为了评估H1.0K180甲基化与DNA损伤之间的关系，(根据实施例1中描述的方法)将用DNA损伤剂博来霉素处理2小时的SR hADSC和hADSC裂解并分级以获得染色质结合级分。用α-H1.0K180me2抗体进行(根据实施例1中描述的方法进行)的蛋白质印迹分析显示DNA损伤后染色质上的H1.0K180的甲基化(图7A)。(根据实施例1中描述的方法)用博来霉素处理SR hADSC以诱导DNA双链断裂后，H1.0K180me2定位于细胞质。
通过狭缝印迹免疫测定，发现在由博来霉素施加基因毒性损害后，在hADSC的条件培养基中以时间过程依赖性方式检测到H1.0K180me2的存在，其中在48小时内检测到最大H1.0K180me2分泌(图7B)。这表示细胞向外分泌。在处理后48小时开始，以类似于H1.0K180me2的方式，看到GSI-SEN上DNA片段因子(DFFB/DFF40/CAD)分泌的增加(图7B)。在急性DNA损伤(ADD)发作后，没有蛋白质以可测量的量分泌。
实施例6：H1.0K180甲基化独立于DNA损伤修复途径蛋白PARP-1活性并在其上游发生
为了进一步评估H1.0K180甲基化是否依赖于DNA损伤修复途径蛋白PARP-1活性，根据实施例1中描述的方法进行蛋白质印迹分析，以检查用博来霉素处理后染色质结合的H1.0K180me2和γH2A.X。根据实施例1中描述的方法，使用有效抑制剂AG14361抑制PARP-1(DNA损伤应答途径的早期参与者)。如图8A所示，H1.0K180me2在DNA损伤后出现在染色质上，并且其外观独立于PARP-1活性。事实上，PARP-1抑制导致H1.0K180me2和γH2A.X的积聚增加(图8A)。全细胞裂解物中PARP-1抑制剂活性的蛋白质印迹分析揭示，在博来霉素处理后，PARP-1活性导致细胞内聚-(ADP)-核糖(PAR)水平增加，这被PARP-1抑制剂消除，从而表明有效的PARP-1抑制(图8B)。因此确定H1.0K180甲基化独立于DNA损伤修复途径蛋白PARP-1活性。
实施例7：H1.0K180me2抗体的使用显示在基因毒性应激诱导的衰老后H1.0K180me2从染色质中释放并分泌到细胞外基质中
将SR hADSC、用博来霉素处理2小时(急性DNA损伤)的hADSC和用博来霉素处理并使其衰老3天(基因毒性应激诱导的衰老)的hADSC裂解并分级成可溶性和染色质结合的级分。然后使这些级分经受LC-MS/MS分析。将肽表达水平作为LC-MS/MS相对强度曲线下的总面积，并使用Pinpoint软件版本1.4(Thermo Scientific)将单个肽明确地分配给蛋白质。将分配给单个蛋白质的所有肽的面积相加以产生蛋白质表达水平，将其相对于每个样品的总蛋白质文库大小归一化。对于每种细胞级分，H1.0肽丰度表示为在每种条件下观察到的总H1.0肽的百分比。还示出了每种级分中H1.0肽水平的归一化绝对值。如图9A所示，染色质结合H1.0从SR和急性DNA损伤中总量的约60％降低至基因毒性应激诱导的衰老后总量的约30％。收集来自用博来霉素处理的SR hADSC的培养物用于α-H1.0和α-H1.0K180me2抗体狭缝印迹分析，以评估H1.0至细胞外基质(ECM)的分泌。根据实施例1中描述的方法进行该实验。在细胞培养基中可检测到分泌的H1.0，并且在博来霉素处理24小时后，也容易地检测到分泌的H1.0K180me2(图9B)。这些结果确认甲基化H1.0K180在基因毒性应激诱导的衰老后从染色质中释放并分泌到ECM中。
实施例8：H1.0K180me2抗体的使用显示暴露于离子辐射诱导血清中H1.0k180me2水平升高
检查电离辐射对血清中H1.0K180me2水平的影响。根据实施例1中描述的方法，在暴露于7Gy电离辐射之前和之后2小时或48小时从野生型小鼠收集血清。使用α-H1.0K180me2抗体狭缝印迹和免疫印迹，将照射后2小时(小鼠1)或48小时(小鼠2)的H1.0K180me2血清水平与处理前的初始水平进行比较(图10A)。使用每次分析中包括的H1.0K180me2肽的标准曲线计算每个血清样品中H1.0K180me2的浓度。将小鼠血清白蛋白用作上样对照。通过血清白蛋白量化并归一化H1.0K180me2斑点印迹条带。示出了照射后H1.0K180me2的相对增加(图10B)。在照射后，等体积小鼠血清的α-H1.0K180me2抗体蛋白质印迹分析也显示H1.0K180me2增加(图10C)。
实施例9：H1.0K180me2抗体和标记的H1.0K180me2肽的使用显示脑和血清中的H1.0K180me2水平是阿尔茨海默病的指示
根据实施例1中描述的方法，通过使用α-H1.0K180me2、α-H1.0、α-γH2A.X和α-β-肌动蛋白抗体的蛋白质印迹分析比较来自1个月(年轻)和24个月(老)小鼠的小鼠脑样品的全细胞裂解物。H1.0K180me2水平在24个月小鼠中增加，这与γH2A.X的水平增加相关(图11A)。
对人临床样品进行了进一步研究。
人血清获自Cooperative Human Tissue Network(CHTN)和NucleaBiotechnologies(NCB)。血清源自三个组：1)没有明显医学病状的中年健康供体(n＝7，年龄范围＝32-38岁)2)没有明显医学病状的老年健康供体(n＝9，年龄范围＝63-76岁)3)临床诊断为阿尔茨海默病的老年供体(n＝10，年龄范围＝75-103岁)。每个供体的进一步细节在表4中示出。
表4：组织供体的特征
<u>样品类型</u> <u>年龄</u> <u>性别</u> <u>种族</u> <u>患者诊断</u>
脑 23 女性 白种 正常
脑 60 女性 白种 正常
脑 73 女性 白种 正常
脑 77 女性 白种 正常
血清 32 女性 白种 正常
血清 32 女性 黑种 正常
血清 32 男性 黑种 正常
血清 36 女性 白种 正常
血清 36 男性 白种 正常
血清 37 男性 黑种 正常
血清 38 男性 白种 正常
血清 63 女性 白种 正常
血清 66 女性 白种 正常
血清 67 女性 白种 正常
血清 70 女性 白种 正常
血清 70 女性 白种 正常
血清 70 女性 白种 正常
血清 73 女性 黑种 正常
血清 74 女性 白种 正常
血清 76 女性 白种 正常
血清 83 男性 黑种 阿兹海默病
血清 103 男性 白种 阿兹海默病
血清 94 女性 白种 阿兹海默病
血清 77 男性 黑种 阿兹海默病
血清 78 女性 黑种 阿兹海默病
血清 78 男性 白种 阿兹海默病
血清 75 女性 白种 阿兹海默病
血清 91 女性 黑种 阿兹海默病
血清 93 女性 黑种 阿兹海默病
血清 90 女性 黑种 阿兹海默病
还通过使用上述抗体和方法的蛋白质印迹分析来自23岁(年轻)和/或大于60岁(老年)健康个体的人脑样品的全细胞裂解物。表4提供了脑组织供体的特征。如图11B所示，较老的个体表现出H1.0K180me2的表达增加。这些结果指示H1.0K180me2随着器官年龄的增加而增加。
本研究的目的是证明测量血清H1.0K180me2和/或测量针对H1的血清抗体的实用性。0K180me2作为阿尔茨海默病预测性能的生物标志物。为了确保新诊断生物标志物的正确预测能力，开发了患者分层方法并测试其诊断准确性。通过将其与有记录的参考标准(例如，由国家老龄化研究所-阿尔茨海默病协会(NIA-AA)针对AD的确定诊断推荐的几种测试的组合)进行比较来评估该测试的性能。本研究是根据诊断准确度报告标准(STARD)设计和进行的。统计分析包括诊断准确度参数、交叉验证和Youden指数优化。根据患者分层策略，以及分析的预测能力，患者可分层为具有阿尔茨海默病发展可能性的患者类别。每个测试设计均显示了灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值(PPV和NPV)以及阳性和阴性似然比(PLR和NLR)。在图12A-12C、图13B、图14B、图14E、图15A和图15B中，框图中心线显示中位数；框限指示如由R软件确定的第25和第75百分位数；须将第25百分位数与第75百分位数的四分位距延伸1.5倍，异常值由点表示；数据点绘制为空心圆。虚线证明了由ROC曲线(接受者工作特征曲线)分析计算的阈值。每个测试设计均显示了灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值(PPV和NPV)以及阳性和阴性似然比(PLR和NLR)。统计方法有助于预测患者中疾病的存在与否。测试结果修改疾病的先期测试概率的程度由基于贝叶斯定理的“似然比”表示。如果测试是阳性的，则阳性似然比(PLR)表示增加疾病概率的程度。如果测试是阴性的，则阴性似然比(NLR)表示降低疾病概率的程度。PLR>1指示靶标病症存在的概率增加，PLR<1指示靶标病症存在的概率降低，并且PLR＝1意指该测试不改变该疾病的概率。针对每个测试设计示出了ROC曲线、阈值和曲线下面积(AUC)。2x2矩阵(TP、FN、FP、TN)中的0值可使得不能计算比率。添加0.5的“伪计数”以对此进行控制。“伪计数”将添加到每个值，因此它们不影响相对值。图12A-12C、图13B、图14B、图14E、图15A和图15B中的框图中心线表示中位数；框限指示如由R软件确定的第25和第75百分位数；须将第25百分位数与第75百分位数的四分位距延伸1.5倍，异常值由点表示；数据点绘制为空心圆。
为了测试H1.0K180me2水平是否可用作阿尔茨海默病的诊断指示物，根据实施例1中描述的方法，使用α-H1.0K180me2抗体通过狭缝印迹分析来量化人血清中的H1.0K180me2水平。分析来自30-40岁(n＝7)或>60岁(n＝9)的健康个体以及>60岁的临床诊断为阿尔茨海默病(n＝10)的个体的等体积血清(表4提供了血清供体的特征)。
H1.0K180me2水平
图12A-C示出了人血清中H1.0K180me2抗原的检测(图12A、12B、12C)、天然存在的H1.0K180me2IgG自身抗体的检测(图13B)、以及天然存在的H1.0K180me2IgM自身抗体的检测(图14A-E；图15A-B)可用作阿尔茨海默病早期诊断工具。
图12A示出了在阿尔茨海默病患者和年龄匹配对照中通过狭缝印迹分析测定的H1.0K180me2水平的量化。在阿尔茨海默病患者和年龄匹配对照中通过狭缝印迹分析测定H1.0K180me2水平的量化。使用每次分析中包括的H1.0K180me2肽的标准曲线计算每个血清样品中H1.0K180me2的浓度。如图12A所示，阿尔茨海默病患者显示出低于健康年龄匹配对照的血清H1.0K180me2浓度，这指示H1.0K180me2血清浓度可有效地从健康个体中分离患有阿尔茨海默病的患者并且可用作阿尔茨海默病检测的诊断工具。如表5所示，血清中H1.0K180me2抗原浓度等于或低于5.61nmol/ml的测量指示与先期测试概率相比，该疾病的存在可能性为24％；并且阳性似然比(PLR或LR+)为3.6。基于以下公式计算后期测试概率：先期测试几率X LR/(1+先期测试几率x LR)，其中先期测试几率是测试之前对疾病存在的临床怀疑。这通常由似然比列线图或Fagan列线图计算(NEJM 1975；293:257)。
表5：通过血清体积归一化的H1.0K180me2抗原浓度
图12B示出了通过总IgG血清水平归一化的人血清中的H1.0K180me2水平。为了通过总IgG血清水平归一化人血清中的H1.0K180me2水平，使用山羊抗人IgG二级抗体通过狭缝印迹分析测定每个血清样品的总IgG水平。通过在每个样品中观察到的IgG水平归一化H1.0K180me2浓度。如图12B所示，健康>60岁个体中的H1.0K180me2水平相对于健康年轻个体(30-40岁)升高，而患有阿尔茨海默病的患者相对于健康老年个体(>60岁)表现出显著较低的H1.0K180me2归一化水平。框图的左部是没有前驱阿尔茨海默病诊断或轻度认知障碍(MCI)的患者。框图的右部示出了具有阿尔茨海默病病理的死后确认的患者。表6示出了来自ROC分析的值。
表6：通过总IgG浓度归一化的H1.0K180me2抗原浓度
图12C示出了通过总蛋白水平归一化的人血清中的H1.0K180me2水平。为了通过总蛋白水平归一化人血清中的H1.0K180me2水平，使用Qubit(Invitrogen)测量每个样品的总血清蛋白。然后通过在每个样品中测量的蛋白质浓度归一化H1.0K180me2浓度。如图12C所示，健康>60岁老年个体中的H1.0K180me2水平升高，而患有阿尔茨海默病的患者相对于健康老年个体(>60岁)表现出显著较低的H1.0K180me2归一化水平。图12C示出了H1.0K180me2抗原相对于血清的总蛋白质组成的血清学量化。表7示出了H1.0K180me2抗原与血清中总蛋白的比率低于4.76x10-4指示与先期测试概率相比，该疾病的存在可能性为24.8％，并且PLR为3.00。
表7：通过总蛋白归一化的H1.0K180me2抗原浓度
尽管H1.0K180me2的血清浓度足以用于鉴定阿尔茨海默病患者，但使用由总IgG(图12B)或总蛋白(图12C)进行的血清样品归一化允许直接比较个体而不论可能改变总体血清浓度的变量(诸如用于获得血清的方案、操作者可变性、患者的水化状态和患者的活动状态)如何。IgG在人血清中高度丰富，并且占血清蛋白的约11％。因此，IgG可用作血清浓度的指示物，并且可用于在患者之间进行归一化。总血清蛋白直接指示血清浓度，并且可用于在患者之间归一化H1.0K180me2的浓度。在每种情况下，观察到归一化的H1.0K180me2水平在健康老化(>60岁)后增加。阿尔茨海默病血清H1.0K180me2水平显著低于年龄匹配对照，这指示常规归一化程序不改变观察到的趋势，同时允许直接比较患者之间的H1.0K180me2水平，尽管血清收集和处理程序不同，或患者血清的基础浓度水平不同。
抗H1.0K180me2IgG(H1.0K180me2IgG自身抗体)水平
图13A示出了使用间接ELISA方法可在不同的人生物流体中检测人抗H1.0K180me2IgG。使用间接ELISA测试和标记的H1.0K180me2肽各自测试人血浆、尿液和唾液的H1.0K180me2IgG自身抗体。当血浆在上样缓冲液中稀释500倍、1000倍和2000倍时，检测到血浆浓度与在450nm处测量的O.D.之间的线性关系。类似地，当这些流体在上样缓冲液中稀释80倍和160倍时，检测到尿液和唾液浓度与在450nm处测量的O.D.之间的线性关系。这表明抗H1.0K180me2IgG间接ELISA测试具有检测多种人生物流体中的抗H1.0K180me2IgG的实用性。
在相关实验中，使用生物素酰化的H1.0K180me2捕获肽(H1.0K180me2自身抗体结合肽)，随后是对IgG抗体具有特异性的二级抗体，通过间接ELISA分析量化人血清中的抗H1.0K180me2IgG水平。分析来自30-40岁(n＝7)或>60岁(n＝9)的健康个体以及>60岁的临床诊断为阿尔茨海默病(n＝10)的个体的等体积血清。(图13B)
图13B示出了在阿尔茨海默病患者和年龄匹配对照中通过间接ELISA测定的自身抗H1.0K180me2IgG水平的量化。使用由图12E所示ELISA实验中包含的H1.0K180me2特异性抗体的系列稀释液产生的标准曲线计算每个血清样品中抗H1.0K180me2IgG(通过间接ELISA测定的自身抗体IgG水平)的浓度。阿尔茨海默病患者显示出高于健康年龄匹配对照的血清抗H1.0K180me2IgG浓度。抗H1.0K180me2IgG血清浓度可有效地从健康个体中分离患有阿尔茨海默病的患者，并可用作阿尔茨海默病检测的诊断工具。如表8中所示，自身抗H1.0K180me2抗体浓度等于或高于8.23ug/ml的测量指示与先期测试概率相比，该疾病的存在可能性为30％，其中PLR为5.4。图13B示出了人血清中H1.0K180me2自身抗体量化的标准曲线。使用Bradford测定来测量每个样品的总血清蛋白。通过在每个样品中测量的蛋白质浓度归一化抗H1.0K180me2IgG浓度。健康>60岁个体中的抗H1.0K180me2IgG水平相对于健康年轻个体(30-40岁)降低。患有阿尔茨海默病的患者相对于健康老年个体(>60岁)表现出增加的抗H1.0K180me2IgG归一化水平。
表8：通过血清体积归一化的抗H1.0K180me2IgG浓度
抗H1.0K180me2IgM(H1.0K180me2IgM自身抗体)水平
在另一个相关实验中，使用生物素酰化的H1.0K180me2捕获肽(H1.0K180me2自身抗体结合肽)，随后是对IgM抗体具有特异性的二级抗体，通过间接ELISA分析量化人血清中的抗H1.0K180me2IgM水平(通过体积归一化)。分析来自>60岁(n＝9)的健康个体以及>60岁的临床诊断为阿尔茨海默病(n＝10)的个体的等体积血清。(图14E中为原始数据；在图15A中数据归一化为总IgM水平)。
下表9示出了来自间接ELISA分析的原始数据，并在图14D-14E中进一步分析。对于每个患者样品，一式三份地进行ELISA。从图14D中所示的标准曲线计算每个重复的抗H1.0K180me2IgM浓度。从三个技术重复计算每个样品的平均抗H1.0K180me2IgM浓度。还计算了三个技术重复之间的样品标准偏差。将重复之间的实施方案的系数计算为CV％＝标准偏差/平均值x100％。
由于没有抗H1.0K180me2标准曲线，因此使用抗H1.0K180me2IgG抗体产生标准曲线(图14D)。将抗H1.0K180me2IgG的摩尔浓度对450nm处的OD作图。然后将该曲线用于推断每个样品中抗H1.0K180me2IgM的摩尔浓度。
表9：来自抗H1.0K180me2IgM ELISA的原始数据
图14E证明了测量针对H1.0K180me2的IgG自身抗体作为阿尔茨海默病的生物标志物的实用性(图中示出了原始数据)。左图示出了ROC曲线分析，用于评估总体预测性能，并用于选择最佳阈值截止值，以区分阳性和阴性测试结果。如所示绘制每个可能阈值处的百分比特异性与灵敏度之间的关系以产生经验ROC曲线(实线)。将经验ROC曲线用于计算右图中所示的最佳阈值截止值。最佳阈值示出为经验ROC曲线上的灰点。图14E的右图示出了患有阿尔茨海默病的患者和未患有阿尔茨海默病的那些患者(神经病学对照)中抗H1.0K180me2IgM浓度的框图分布。所有样品的单独测量值示出为点，并且示出每个分布的框图以及上四分位数、下四分位数以及上四分位数和下四分位数与最大和最低非外围点的距离。高于阈值截止(虚线)的样品被认为是测试的阳性。低于阈值截止的样品被认为是测试的阴性。图14E底部处的2x2矩阵示出了该分布可分为四组：真阳性(TP；其中指数为阳性，并且存在AD)；假阳性(FP；其中指数为阳性，但不存在AD)；真阴性(TN；其中指数为阴性，并且不存在AD)；和假阴性(FN；其中指数为阴性，但存在AD)。落在每组内的样品数目绘制在2x2矩阵上。
下表10示出了原始数据的抗H1.0K180me2IgM测试性能的评估。
表10：抗H1.0K180me2测试性能的评估
下表11示出了来自间接ELISA分析的归一化数据(通过总IgM水平归一化的抗H1.0K180me2IgM)，并在图15A、图15B中进一步分析。对于每个患者样品，一式三份地进行ELISA。从图14D中所示的标准曲线计算每个重复的抗H1.0K180me2IgM浓度，并通过样品中测量的平均总IgM浓度归一化(图14B)。从三个技术重复计算每个样品的平均归一化抗H1.0K180me2IgM浓度。还计算了三个技术重复之间的样品标准偏差。将重复之间的实施方案的系数计算为CV％＝标准偏差/平均值x 100％。
表11：来自抗H1.0K180me2IgM ELISA的归一化数据(通过总IgM水平)
图15A证明了测量针对H1.0K180me2的IgM自身抗体作为阿尔茨海默病的生物标志物的实用性(图中示出了归一化数据)。左图示出了ROC曲线分析，用于评估总体预测性能，并用于选择最佳阈值截止值，以区分阳性和阴性测试结果。如所示绘制每个可能阈值处的百分比特异性与灵敏度之间的关系以产生经验ROC曲线(实线)。将经验ROC曲线用于计算右图中所示的最佳阈值截止值。最佳阈值示出为经验ROC曲线上的灰点。图15A的右图示出了患有阿尔茨海默病的患者和未患有阿尔茨海默病的那些患者(神经病学对照)中归一化的抗H1.0K180me2IgM浓度的框图分布。所有样品的单独测量值示出为点，并且示出每个分布的框图。框图示出中位数值以及上四分位数、下四分位数以及上四分位数和下四分位数与最大和最低非外围点(non-outlying point)的距离。高于阈值截止(虚线)的样品被认为是测试的阳性。低于阈值截止的样品被认为是测试的阴性。图15A底部处的2x2矩阵示出了该分布可分为四组：真阳性(TP；其中指数为阳性，并且存在AD)；假阳性(FP；其中指数为阳性，但不存在AD)；真阴性(TN；其中指数为阴性，并且不存在AD)；和假阴性(FN；其中指数为阴性，但存在AD)。落在每组内的样品数目绘制在2x2矩阵上。图15B证明了测试特征不根据实验室环境和不同操作者而波动。
下表12示出了抗H1.0K180me2IgM/总IgM测试性能的评估。
表12
此测试的结果将疾病的概率从10％先期测试修改为63％后期测试。阳性似然比(LR+)为15.0(95％CI：0.98、229)，并且阳性预测值(PPV)为94％(95％CI：53、100)。阴性似然比(LR-)为0.26(95％Ci：0.09、0.78)，并且阴性预测值为79％(95％CI：47、95)。
对照
图14B示出了标准曲线：将人IgG稀释系列的摩尔浓度对450nm处的OD作图。然后使用该曲线外推每个样品中总IgM的摩尔浓度。
下表13示出了来自总IgM ELISA的数据。对于每个患者样品，一式三份地进行ELISA。从图14B中所示的标准曲线计算每个重复的总IgM摩尔浓度。从三个技术重复计算每个样品的平均总IgM摩尔浓度。还计算了三个技术重复之间的样品标准偏差。将重复之间的实施方案的系数计算为CV％＝标准偏差/平均值x 100％。
表13：使用ELISA测定来测量患者血清中总IgM水平
图14B证明了总IgM水平不会区分患有和未患有阿尔茨海默病的个体。所有样品的单独测量值示出为点，并且示出每个分布的框图。框图示出中位数值以及上四分位数、下四分位数以及上四分位数和下四分位数与最大和最低非外围点的距离。
图16A证明了患者样品中总IgM水平与抗H1.0K180me2IgM水平之间没有相关性。基于其测量的抗H1.0K180me2IgM浓度对比其测量的总IgM浓度，将所有患者样品分布在散点图上。抗H1.0K180me2IgM水平不受患者血清中总IgM水平的影响，如由低R2值所证明。
图16B证明了总未修饰的H1.0蛋白水平(左图)和总抗H1.0IgM水平不会区分患有和未患有阿尔茨海默病的个体。在左图中，将定制化学发光狭缝印迹免疫测定用于测量阿尔茨海默病和对照患者血清样品中的总H1.0(未修饰的)水平。在右图中，使用间接ELISA测量患者血清中针对H1.0未修饰肽的IgM自身抗体。针对未修饰的H1.0肽的IgM自身抗体的水平没有统计学上的显著差异(p＝0.72)，这指示阿尔茨海默病的诊断实用性对于患者血清中的抗H1.0K180me2IgM是独特的。对于所有样品，两个图的相对测量值示出为点，并且示出每个分布的框图。框图示出中位数值以及上四分位数、下四分位数以及上四分位数和下四分位数与最大和最低非外围点的距离。
抗H1.0K180me2IgG与IgM水平的相关性
图17证明了测量H1.0K180me2IgG和IgM自身抗体可将患有阿尔茨海默病的患者分层为不同的群体。测量在阿尔茨海默病患者样品中的抗H1.0K180me2IgG水平，并通过总IgG水平归一化这些水平。然后通过散点图将阿尔茨海默病患者样品中的归一化抗H1.0K180me2IgM水平与这些归一化的抗H1.0K180me2IgG水平相关联。此分析允许将阿尔茨海默病患者分层为不同的群体。图17中标为75、77、94和78的患者可能响应于任何阿尔茨海默病治疗。图17中标为90、91、93、83和103的患者可能仅响应于特定的阿尔茨海默病治疗，例如仅非免疫调节阿尔茨海默病治疗。
实施例10：雷帕霉素及其衍生物阻断DNA损伤后细胞质中H1.0K180me2的积聚
为了测试雷帕霉素衍生物是否可在DNA损伤后阻断H1.0K180me2的出现，在用或不用雷帕霉素或依维莫司(雷帕霉素的衍生物)预处理24小时的情况下，用博来霉素处理SRhADSC 2小时。然后根据实施例1中描述的方法裂解细胞，并对H1.0K180me2、γH2A.X和β-肌动蛋白进行蛋白质印迹分析。如图18所示，雷帕霉素和依维莫司两者在博来霉素治疗后均减少了H1.0K180me2的出现，这表明依维莫司也可在DNA损伤后阻断H1.0K180me2的出现。
用博来霉素或替莫唑胺(一种触发碱基切除修复途径的化合物)处理SR hADSC 2小时。然后裂解细胞，并对H1.0K180me2、γH2A.X和β-肌动蛋白进行蛋白质印迹分析。如图19所示，博来霉素和替莫唑胺两者均能够诱导H1.0K180me2甲基化。
实施例11：mTOR和PI3K抑制剂阻断DNA损伤后H1.0K180me2的积聚
图20示出了mTOR和PI3K抑制剂对H1.0K180me2动力学的影响。在用或不用mTOR1、mTOR2和/或PI3K的化学抑制剂预处理24小时的情况下，用博来霉素处理SR hADSC 2小时。裂解细胞并提取染色质用于通过蛋白质印迹分析H1.0K180me2、总H1.0、γH2A.X和总组蛋白H4。在药物名称旁边给出使用的药物浓度和每种药物的特定抑制靶标。所有测试的抑制剂均能够在博来霉素处理后减少H1.0K180me2的出现。
实施例12：用G9A进行的体外甲基化和产物分析
图21A-21B示出了这种体外G9A甲基化测定的结果。
能够甲基化H1.0肽的G9A甲基转移酶(图21A)。随后在凝胶上解析甲基化反应并通过放射自显影可视化。4kDa处条带的出现表明G9A甲基转移酶能够通过将氚标记的甲基转移至肽来甲基化H1.0肽，从而实现可视化。缺乏H1.0肽的对照反应未产生氚标记的产物。
能够甲基化全长重组H1.0的G9A甲基转移酶(图21B)。图21B示出了用增加量的G9A进行的重组全长组蛋白H1.0的体外甲基化测定。G9A能够在K180处二甲基化全长H1.0。
为了鉴定G9A甲基化在未修饰的H1.0肽(AKPVKASKPKKAKPVKPK(SEQ ID NO:36))上的精确位置，建立了甲基化反应并通过LC-MS鉴定产物。甲基化反应包括重组G9A、未标记的甲基供体(S-腺苷-L-甲硫氨酸)和未修饰的H1.0肽。随后通过LC-MS分析甲基化反应，并且使用光谱计数鉴定和量化每个光谱峰(对应于最终反应中的肽种类)。图22A中“me”圆的数目表示赖氨酸残基的甲基化状态(单甲基化、二甲基化或三甲基化)。图22A示出了在未甲基化H1.0肽存在下，G9A特异性地且大量地二甲基化H1.0K180(所有肽的99.9％)。
更具体地，该数据证明了G9A二甲基化赖氨酸K180而不是存在于同一肽片段中的其他赖氨酸(K166、K174、K175或K177)，其中估计的甲基化效率为约99％(图22A和图22B)。为了进一步解决G9A甲基化对H1.0肽的赖氨酸180的灵敏度和特异性，在类似的体外甲基化实验中将K180me2肽(H1.0AA 165-182)用作底物。仅检测到少量的进一步甲基化肽：H1.0K166me1K180me2(反应中总肽的1.27％)、H1.0K174me1K180me3(反应中总肽的1.06％)和H1.0K174me3K175me3K177me1K180me2(反应中总肽的0.35％)，如图22B、图23所示。
为了鉴定G9A甲基化在全长H1.0蛋白上的精确位置，建立了甲基化反应并通过LC-MS鉴定产物。甲基化反应包括重组G9A、未标记的甲基供体(S-腺苷-L-甲硫氨酸)和重组人H1.0蛋白。随后通过LC-MS分析甲基化反应，并鉴定甲基化的位点。图24中“me”圆的数目表示赖氨酸残基的甲基化状态(单甲基化、二甲基化或三甲基化)。图24示出了在重组的全长H1.0存在下，G9A甲基化C-末端赖氨酸残基，包括H1.0K180me2。
实施例13：用GLP进行的体外甲基化和产物分析
为了鉴定GLP甲基化在未修饰的H1.0肽(AKPVKASKPKKAKPVKPK(SEQ ID NO:36))上的精确位置，建立了甲基化反应并通过LC-MS鉴定产物。甲基化反应包括重组GLP、未标记的甲基供体(S-腺苷-L-甲硫氨酸)和未修饰的H1.0肽。随后通过LC-MS分析甲基化反应，并且使用光谱计数鉴定和量化每个光谱峰(对应于最终反应中的肽种类)。图25中“me”圆的数目表示赖氨酸残基的甲基化状态(单甲基化、二甲基化或三甲基化)。图25示出了在未甲基化H1.0肽存在下，GLP特异性二甲基化H1.0K180(所有肽的96.6％)。
为了鉴定GLP甲基化在K180二甲基化H1.0肽(AKPVKASKPKKAKPVK(me2)PK(SEQ IDNO:3))上的精确位置，建立了甲基化反应并通过LC-MS鉴定产物。甲基化反应包括重组GLP、未标记的甲基供体(S-腺苷-L-甲硫氨酸)和H1.0K180me2肽。随后通过LC-MS分析甲基化反应，并且使用光谱计数鉴定和量化每个光谱峰(对应于最终反应中的肽种类)。图26中“me”圆的数目表示赖氨酸残基的甲基化状态(单甲基化、二甲基化或三甲基化)。图26示出了在K180二甲基化H1.0肽存在下，GLP仅进一步甲基化H1.0K180和H1.0K174，并且仅具有非常低的效率(1.02％的肽被进一步甲基化)。
为了鉴定GLP甲基化在全长H1.0蛋白上的精确位置，建立了甲基化反应并通过LC-MS鉴定产物。甲基化反应包括重组GLP、未标记的甲基供体(S-腺苷-L-甲硫氨酸)和重组人H1.0蛋白。随后通过LC-MS分析甲基化反应，并鉴定甲基化的位点。图27中“me”圆的数目表示赖氨酸残基的甲基化状态(单甲基化、二甲基化或三甲基化)。图27示出了在重组全长H1.0存在下，在本文所述的条件下，GLP不甲基化全长H1.0。在本文提供的条件下，GLP甲基化在H1.0的C-末端尾部上的大量赖氨酸残基，其缺乏G9A的特异性。
实施例14：hADSC中G9A的siRNA敲低
siRNA转染
设计用于靶向G9A的siRNA池从Qiagen(GS10919)获得，并且随机乱序的siRNA池从ThermoFisher Scientific(4390843)获得。按照制造商的方案，使用Lipofectamine 3000(Life Technologies)将siRNA池转染到自我复制的hADSC中。在siRNA转染后24小时收集细胞，并通过qPCR或蛋白质印迹分析。
qPCR
将细胞培养物在Trizol(Invitrogen)中匀浆，并使用RNeasy试剂盒(Qiagen)分离总RNA。按照制造商的方案(Invitrogen)，用Qubit(Invirtogen)量化RNA，并使用SuperScript III进行反向转录。按照制造商的方案(Applied Biosystems)，用约5ngcDNA、1μM指定引物对和Fast-SYBR Green PCR主混合物，使用Applied Biosystems 7700序列检测器一式三份地进行定量PCR分析。引物对在下文列出。将每个基因的平均周期阈值(Ct)归一化为同一样品中的β-肌动蛋白水平(ΔCt)。使用未配对的双样本t检验用于确定治疗组之间的平均ΔCt值的差异。在适当的情况下，通过Δ-ΔCt方法计算倍数变化(倍数＝2ΔΔCt)。
表14：引物
结果
用乱序对照siRNA或靶向G9A的siRNA转染自我更新(SR)人脂肪来源的干细胞(hADSC)。然后使细胞经受2小时博来霉素处理。蛋白质印迹分析指示体内敲低G9A导致DNA损伤后H1.0K180me2出现减少。将H3K9me2(一种已知的G9A的甲基化产物)用于监测敲低后G9A活性的丧失。(图28A)
hADSC中G9A的siRNA敲低导致2小时博来霉素处理(ADD)后H1.0K180me2水平显著降低，同时伴随着H3K9me2(一种已知的由G9A提供的PTM)的减少(图28B)。
实施例15：体外甲基化的H1.0K180me2蛋白或肽的大量生产
如图21B和图24中所观察到的，G9A能够在全长重组人H1.0上有效且特异性地二甲基化K180。可利用此过程以便产生大量H1.0K180me2全长蛋白，其可并入ELISA试剂盒(例如夹心ELISA试剂盒)中作为检测生物样品中H1.0K180me2的参考标准。此过程可涉及建立大量甲基化反应，其包含1X HMT反应缓冲液(50mM Tris-HCl、5mM MgCl2、4mM二硫苏糖醇，pH9.0)、重组人或小鼠G9A甲基转移酶、3.2mM S-腺苷-L-甲硫氨酸、以及用N-末端标签(HA、His、GST、FLAG或适于下游纯化的其他标签)标记的重组全长人H1.0。可将反应在37℃下孵育1小时，以使G9A介导的H1.0K180me2甲基化能够进行。
然后将含有K180me2的全长H1.0在一步或两步过程中富集和纯化。首先，通过利用N-末端标签的亲和纯化将反应中的所有全长重组H1.0种类从反应混合物中纯化出来。在一种情况下，H1.0可用HA标签标记，并用固定在柱或树脂上的HA抗体纯化。在纯化后，如果需要，则可通过蛋白水解切割除去标签。此过程将在最终产物中仅富集全长H1.0K180me2，从而确保捕获和检测表位两者均存在。第二步将利用固定在柱或树脂上的H1.0K180me2抗体，以便仅进一步纯化含有H1.0K180me2的全长H1.0种类。然后可将此最终产物浓缩(例如使用冻干)，量化，并包含在ELISA试剂盒中作为参考标准，或用作治疗剂。在一些情况下，仅利用H1.0K180me2抗体纯化的一步纯化方法可能就足够了。

Claims (182)

1.一种特异性结合二甲基化抗原的抗体，其中该二甲基化抗原包含二甲基化赖氨酸残基，其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0的K180，并且其中该二甲基化赖氨酸残基是结合所需的。
2.权利要求1的抗体，其中该二甲基化抗原不包含甲基化的任何其他赖氨酸残基。
3.权利要求1的抗体，其中如果该抗原在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K166、K172、K174、K175和/或K177的赖氨酸残基处包含二甲基化赖氨酸残基，则该抗体不结合或仅最低限度结合。
4.权利要求1的抗体，其中如果该抗原在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K166、K172、K174、K175、K177和/或K180的赖氨酸残基处包含单甲基化赖氨酸残基，则该抗体不结合或仅最低限度结合。
5.权利要求1的抗体，其中如果该抗原在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K166、K172、K174、K175、K177和/或K180的赖氨酸残基处包含三甲基化赖氨酸残基，则该抗体不结合或仅最低限度结合。
6.权利要求1的抗体，其中该抗体对该二甲基化抗原的特异性比单甲基化抗原高至少2倍，其中该单甲基化抗原包含单甲基化赖氨酸残基，并且其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。
7.权利要求1的抗体，其中该抗体对该二甲基化抗原的特异性比三甲基化抗原高至少2倍，其中该三甲基化抗原包含三甲基化赖氨酸残基，并且其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。
8.权利要求1的抗体，其中该抗体包含标记。
9.权利要求8的抗体，其中该抗体是生物素酰化的。
10.权利要求1的抗体，其中该抗体附接至固体表面。
11.权利要求10的抗体，其中该抗体附接珠、柱、树脂或微板。
12.权利要求1的抗体，其中该抗体缀合至至少一种选自由以下组成的组的治疗剂：放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA和二抗。
13.权利要求1的抗体，其中该抗体能够清除样品中的H1.0K180me2。
14.权利要求1的抗体，其中该抗体能够清除包含H1.0K180me2的细胞。
15.权利要求1的抗体，其中该抗体能够清除衰老细胞。
16.一种包含二甲基化赖氨酸残基的合成组蛋白H1.0肽，或一种包含二甲基化赖氨酸残基的合成组蛋白H1.0蛋白，其中该二甲基化赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0的K180。
17.权利要求16的肽，其中该蛋白质或肽包含标记。
18.权利要求16的肽，其中该蛋白质或肽是生物素酰化的。
19.权利要求16的肽，其中该蛋白质或肽不包含二甲基化的任何其他赖氨酸残基。
20.权利要求16的肽，其中该蛋白质或肽不包含甲基化的任何其他赖氨酸残基。
21.权利要求16的肽，其中该蛋白质或肽附接至珠、微板、柱或树脂。
22.权利要求16的肽，其中该肽包含SEQ ID NO:3-35序列中的任一个。
23.权利要求22的肽，其中该肽包含SEQ ID NO:3的序列。
24.权利要求16的肽，其中该蛋白质包含EQ ID NO:2的序列。
25.权利要求16的肽，其中该蛋白质或肽缀合至至少一种选自由以下组成的组的治疗剂：放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA和二抗。
26.权利要求16的肽，其中该蛋白质或肽能够清除或阻断H1.0K180me2自身抗体。
27.权利要求26的肽，其中该蛋白质或肽能够清除或阻断H1.0K180me2IgG自身抗体。
28.权利要求26的肽，其中该蛋白质或肽能够清除或阻断H1.0K180me2IgM自身抗体。
29.一种确定个体是否患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中的方法，其包括：
(a)使来自该个体的生物样品与权利要求1的抗体接触；和
(b)测定该样品中结合该抗体的二甲基化抗原的浓度，其中该浓度相对于对照降低指示该个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。
30.权利要求29的方法，其中当该组蛋白H1.0蛋白的血清浓度小于或低于5.61nmol/ml时，该个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。
31.权利要求29的方法，其中该降低低于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
32.权利要求29的方法，其中当PLR(LR+)是3.6或更高时，该个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。
33.权利要求44的方法，其中当NLR(LR-)是0.26或更低时，该个体不具有发展阿尔茨海默病的风险。
34.权利要求29的方法，其进一步包括如果确定该个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗该个体。
35.一种确定被诊断患有阿尔茨海默病并接受阿尔茨海默病治疗的个体是否将受益于该治疗或将继续受益于该治疗的方法，该方法包括：
(a)使来自该个体的生物样品与权利要求1的抗体接触；
(b)测定该样品中结合该抗体的二甲基化抗原的浓度；以及
(c)如果该浓度相对于对照增加，则确定该个体将受益于该治疗或将继续受益于该治疗。
36.权利要求35的方法，其中该增加高于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
37.权利要求35的方法，其进一步包括如果确定该个体将受益于或继续受益于该治疗，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗该个体。
38.一种确定被诊断患有阿尔茨海默病的个体是否将受益于候选治疗的方法，其中该个体尚未开始该治疗，该方法包括：
(a)向该个体施用候选治疗；
(b)在施用该候选治疗之后，使来自该个体的生物样品与权利要求1的抗体接触；
(c)测定该样品中结合该抗体的二甲基化抗原的浓度和/或亚细胞定位；以及
(d)如果相对于对照，该浓度增加或细胞质亚细胞定位减少，则确定该个体将受益于该候选治疗。
39.权利要求38的方法，其中该浓度的增加高于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
40.权利要求38的方法，其进一步包括如果确定该个体将受益于该治疗，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗该个体。
41.一种确定被诊断患有阿尔茨海默病的个体是否将受益于候选治疗的方法，其中该个体尚未开始该治疗，该方法包括：
(a)使来自该个体的生物样品与候选治疗接触；
(b)使该生物样品与权利要求1的抗体接触；
(c)测定该样品中结合该抗体的二甲基化抗原的浓度和/或亚细胞定位；以及
(d)如果该浓度相对于对照增加或细胞质亚细胞定位相对于对照减少，则确定该个体将受益于该候选治疗。
42.权利要求41的方法，其中该增加是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
43.权利要求41的方法，其进一步包括如果确定该个体将受益于该治疗，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗该个体。
44.权利要求38-42中任一项的方法，其中该治疗选自由以下组成的组：APP合成抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂和调节剂、Aβ聚集抑制剂、Aβ免疫疗法、降胆固醇药物、抗tau药物、胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、非典型抗精神病药、蛋白质S-亚硝基化的阻断剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、雷帕霉素、rapalogue、内源性大麻素、大麻素、神经保护剂、控制钙内流的分子、抗氧化剂、抗炎药物、控制谷氨酸稳态控制的药物、自噬诱导剂、激素、激素调节剂、他汀类、胰岛素、胰岛素载体、多功能纳米载体、维生素、营养补充剂、小RNA分子、肽和超声疗法。
45.权利要求29-44中任一项的方法，其中该生物样品选自由以下组成的组：全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液和淋巴液。
46.权利要求29-45中任一项的方法，其中该个体是60岁或更大。
47.权利要求29-46中任一项的方法，其中该抗体包含标记。
48.权利要求29-47中任一项的方法，其中该抗体附接至珠、微板、柱或树脂。
49.权利要求29-48中任一项的方法，其中通过ELISA测定该浓度。
50.权利要求29-49中任一项的方法，其中该抗体对该二甲基化抗原的特异性比单甲基化抗原高至少2倍，其中该单甲基化抗原包含单甲基化赖氨酸残基，并且其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。
51.权利要求29-49中任一项的方法，其中该抗体对该二甲基化抗原的特异性比三甲基化抗原高至少2倍，其中该三甲基化抗原包含三甲基化赖氨酸残基，并且其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。
52.一种确定个体是否患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中的方法，其包括：
(a)使来自该个体的生物样品与权利要求16的蛋白质或肽接触；和
(b)测定该样品中结合该蛋白质或肽的自身抗体的浓度，其中该浓度相对于对照增加指示该个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。
53.权利要求52的方法，其包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgM自身抗体的浓度。
54.权利要求52的方法，其包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgG自身抗体的浓度。
55.权利要求52的方法，其中当归一化为总IgG水平，该IgG自身抗体的血清浓度大于或等于9.69ug/ml时，该个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。
56.权利要求52的方法，其中当归一化为血清体积，该IgG自身抗体的血清浓度大于或等于8.23ug/ml时，该个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。
57.权利要求52的方法，其中当归一化为血清体积，该IgM自身抗体的血清浓度大于或等于409fMol/ml时，该个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。
58.权利要求52的方法，其中当IgM自身抗体的浓度与总IgM浓度的比率大于26.6x10-6时，该个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。
59.权利要求52的方法，其中该增加高于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
60.权利要求52的方法，其中当IgG自身抗体的PLR(LR+)是2.4或更大或者IgM自身抗体的PLR(LR+)是3.5或更大时，该个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。
61.权利要求52的方法，其进一步包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgM自身抗体的浓度，并将该测量值与该样品中的总IgM浓度进行比较。
62.权利要求52的方法，其进一步包括如果确定该个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗该个体。
63.一种确定被诊断患有阿尔茨海默病并接受阿尔茨海默病治疗的个体是否将受益于该治疗或将继续受益于该治疗的方法，该方法包括：
(a)使来自该个体的生物样品与权利要求16的蛋白质或肽接触；
(b)测定该样品中结合该蛋白质或肽的自身抗体的浓度；以及
(c)如果该浓度相对于对照降低，则确定该个体将受益于该治疗或将继续受益于该治疗。
64.权利要求63的方法，其中该降低低于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
65.权利要求63的方法，其包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgM自身抗体的浓度。
66.权利要求63的方法，其包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgG自身抗体的浓度。
67.一种确定被诊断患有阿尔茨海默病的个体是否将受益于候选治疗的方法，其中该个体尚未开始该治疗，该方法包括：
(a)向该个体施用候选治疗；
(b)使来自该个体的生物样品与权利要求16的蛋白质或肽接触；
(c)测定该样品中结合该蛋白质或肽的自身抗体的浓度；以及
(d)如果该浓度相对于对照降低，则确定该个体将受益于该候选治疗。
68.权利要求67的方法，其中该降低低于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
69.权利要求67的方法，其包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgM自身抗体的浓度。
70.权利要求67的方法，其包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgG自身抗体的浓度。
71.权利要求63-70中任一项的方法，其中该治疗选自由以下组成的组：APP合成抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂和调节剂、Aβ聚集抑制剂、Aβ免疫疗法、降胆固醇药物、抗tau药物、胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、非典型抗精神病药、蛋白质S-亚硝基化的阻断剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、雷帕霉素、rapalogue、内源性大麻素、大麻素、神经保护剂、控制钙内流的分子、抗氧化剂、抗炎药物、控制谷氨酸稳态控制的药物、自噬诱导剂、激素、激素调节剂、他汀类、胰岛素、胰岛素载体、多功能纳米载体、维生素、营养补充剂、小RNA分子、肽和超声疗法。
72.权利要求52-71中任一项的方法，其中该生物样品选自由以下组成的组：全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液和淋巴液。
73.权利要求52-72中任一项的方法，其中该个体是60岁或更大。
74.权利要求52-73中任一项的方法，其中该蛋白质或肽包含标记。
75.权利要求52-74中任一项的方法，其中该蛋白质或肽是生物素酰化的。
76.权利要求52-75中任一项的方法，其中该蛋白质或肽附接至珠、微板、柱或树脂。
77.权利要求52-76中任一项的方法，其中该肽包含SEQ ID NO:3-35序列中的任一个。
78.权利要求52-76中任一项的方法，其中该肽包含SEQ ID NO:3的序列。
79.权利要求52-76中任一项的方法，其中该蛋白质包含SEQ ID NO:2的序列。
80.权利要求52-79中任一项的方法，其中测定了对H1.0K180me2具有特异性的自身抗体的浓度。
81.权利要求52-79中任一项的方法，其中测定了IgG自身抗体的浓度。
82.权利要求52-79中任一项的方法，其中测定了IgM自身抗体的浓度。
83.权利要求52-79中任一项的方法，其中测定了IgG和IgM自身抗体的浓度。
84.权利要求52-79中任一项的方法，其中测定了总IgG和/或IgM的浓度。
85.权利要求52-79中任一项的方法，其中测定了IgG自身抗体浓度与该总IgG浓度的比率。
86.权利要求52-79中任一项的方法，其中测定了IgM自身抗体浓度与该总IgM浓度的比率。
87.一种确定个体是否已暴露于DNA损伤剂的方法，其包括：
(a)使来自该个体的生物样品与权利要求1的抗体接触；和
(b)测定该样品中结合该抗体的二甲基化抗原的浓度，其中该浓度相对于对照增加指示该个体已暴露于DNA损伤剂。
88.权利要求87的方法，其中该增加高于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
89.权利要求87的方法，其中该DNA损伤剂是辐射。
90.权利要求87的方法，其中该生物样品选自由以下组成的组：全血、血浆、血清、唾液、尿液、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液和淋巴液。
91.权利要求87的方法，其中该抗体包含标记。
92.权利要求87的方法，其中该抗体附接至珠、微板、柱或树脂。
93.权利要求87的方法，其中通过ELISA测定该浓度。
94.权利要求87的方法，其中该抗体对该二甲基化抗原的特异性比单甲基化抗原高至少2倍，其中该单甲基化抗原包含单甲基化赖氨酸残基，并且其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。
95.权利要求87的方法，其中该抗体对该二甲基化抗原的特异性比三甲基化抗原高至少2倍，其中该三甲基化抗原包含三甲基化赖氨酸残基，并且其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。
96.一种确定个体是否已暴露于DNA损伤剂的方法，其包括：
(a)使来自该个体的生物样品与权利要求16的蛋白质或肽接触；和
(b)测定该样品中结合该蛋白质或肽的自身抗体的浓度，其中该浓度相对于对照增加指示该个体已暴露于DNA损伤剂。
97.权利要求96的方法，其中该增加高于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
98.权利要求96的方法，其包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgM自身抗体的浓度。
99.权利要求96的方法，其包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgG自身抗体的浓度。
100.权利要求96的方法，其中该DNA损伤剂是辐射。
101.权利要求96的方法，其中该生物样品选自由以下组成的组：全血、血浆、血清、唾液、尿液、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液和淋巴液。
102.权利要求96的方法，其中该蛋白质或肽包含标记。
103.权利要求96的方法，其中该蛋白质或肽附接至珠、微板、柱或树脂。
104.权利要求96的方法，其中通过ELISA测定该浓度。
105.权利要求96的方法，其中该肽包含SEQ ID NO:3-35序列中的任一个。
106.权利要求105的方法，其中该肽包含SEQ ID NO:3的序列。
107.权利要求96的方法，其中该蛋白质包含EQ ID NO:2的序列。
108.一种确定接受用rapalogue进行的治疗的个体是否响应于这种治疗的方法，其包括：
(a)使来自该个体的生物样品与权利要求1的抗体接触；
(b)测定该样品中结合该抗体的二甲基化抗原的浓度；以及
(c)确定该个体是否响应于治疗，其中该浓度相对于对照降低指示该个体是响应的。
109.权利要求108的方法，其中该降低低于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
110.权利要求108的方法，其中该rapalogue选自由以下组成的组：雷帕霉素、西罗莫司、雷帕鸣、依维莫司、RA 001、Afinitor、Zortress、坦罗莫司、CCI-779、驮瑞塞尔、地磷莫司、AP23573、MK-8669、Deforolimus、佐他莫司、ABT-578、AZD8055、AZD2014、OSI-027、MLN0128、WYE-132、Torin1、PI-103、P7170、PF-04691502、PF-05212384、PKI-587、GNE477、PKI-180、WJD008、XL765、SAR245409、NVP-BEZ235、BGT226、SF1126、GSK2126458、Ku-0063794、WYE-354、NVP-BEZ235、PF-05212384、XL765、Torin 2、WYE-125132和OSI-027。.
111.权利要求108的方法，其中该生物样品选自由以下组成的组：全血、血浆、血清、唾液、尿液、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液和淋巴液。
112.权利要求108的方法，其中该抗体包含标记。
113.权利要求108的方法，其中该抗体附接至珠、微板、柱或树脂。
114.权利要求108的方法，其中通过ELISA测定该浓度。
115.权利要求108的方法，其中该抗体对该二甲基化抗原的特异性比单甲基化抗原高至少2倍，其中该单甲基化抗原包含单甲基化赖氨酸残基，并且其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。
116.权利要求108的方法，其中该抗体对该二甲基化抗原的特异性比三甲基化抗原高至少2倍，其中该三甲基化抗原包含三甲基化赖氨酸残基，并且其中该赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K180。
117.一种确定接受用rapalogue进行的治疗的个体是否响应于这种治疗的方法，其包括：
(a)使来自该个体的生物样品与权利要求16的蛋白质或肽接触；
(b)测定该样品中结合该蛋白质或肽的自身抗体的浓度；以及
(c)确定该个体是否响应于治疗，其中自身抗体的浓度相对于对照变化指示该个体是响应的。
118.权利要求117的方法，其中该变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。
119.权利要求117的方法，其包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgM自身抗体的浓度。
120.权利要求117的方法，其包括测定该样品中结合该蛋白质或肽的IgG自身抗体的浓度。
121.权利要求117的方法，其中该rapalogue选自由以下组成的组：雷帕霉素、西罗莫司、雷帕鸣、依维莫司、RA 001、Afinitor、Zortress、坦罗莫司、CCI-779、驮瑞塞尔、地磷莫司、AP23573、MK-8669、Deforolimus、佐他莫司、ABT-578、AZD8055、AZD2014、OSI-027、MLN0128、WYE-132、Torin1、PI-103、P7170、PF-04691502、PF-05212384、PKI-587、GNE477、PKI-180、WJD008、XL765、SAR245409、NVP-BEZ235、BGT226、SF1126、GSK2126458、Ku-0063794、WYE-354、NVP-BEZ235、PF-05212384、XL765、Torin 2、WYE-125132和OSI-027。
122.权利要求117的方法，其中该生物样品选自由以下组成的组：全血、血浆、血清、唾液、尿液、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液和淋巴液。
123.权利要求117的方法，其中该蛋白质或肽包含标记。
124.权利要求117的方法，其中该蛋白质或肽附接至珠、微板、柱或树脂。
125.权利要求117的方法，其中通过ELISA测定该浓度。
126.权利要求117的方法，其中该肽包含SEQ ID NO:3-35序列中的任一个。
127.权利要求126的方法，其中该肽包含SEQ ID NO:3的序列。
128.权利要求117的方法，其中该蛋白质包含EQ ID NO:2的序列。
129.一种包含权利要求16的蛋白质或肽的诊断试剂盒。
130.权利要求129的试剂盒，其中该肽包含选自由SEQ ID NO:3-35组成的组的序列。
131.权利要求130的试剂盒，其中该蛋白质或肽包含标记。
132.权利要求131的试剂盒，其中该蛋白质或肽是生物素酰化的。
133.权利要求129的试剂盒，其中该蛋白质或肽附接至固体表面。
134.权利要求133的试剂盒，其中该蛋白质或肽附接珠、微板、柱或树脂。
135.权利要求129的试剂盒，其中提供该蛋白质或肽用于检测样品中的H1.0K180me2自身抗体。
136.权利要求130的试剂盒，其中提供该蛋白质或肽作为参考标准。
137.权利要求129的试剂盒，其中该试剂盒进一步包含H1.0K180me2抗体。
138.权利要求129的试剂盒，其中该试剂盒用于检测阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒素暴露或DNA损伤剂暴露。
139.权利要求129的试剂盒，其中该试剂盒用于药物筛选。
140.权利要求129的试剂盒，其中该试剂盒用于患者分层。
141.权利要求129的试剂盒，其中该试剂盒用于治疗选择。
142.一种用于测量皮下靶分子浓度的透皮贴剂，其包含：
(a)底物，其包含(1)权利要求1的抗体；或(2)权利要求16的蛋白质或肽；以及
(b)多个微针。
143.权利要求142的贴剂，其中该底物包含权利要求1的抗体。
144.权利要求143的贴剂，其中该抗体包含标记。
145.权利要求142的贴剂，其中该底物包含权利要求16的蛋白质或肽。
146.权利要求145的贴剂，其中该肽包含标记。
147.权利要求146的贴剂，其中该肽是生物素酰化的。
148.权利要求145的贴剂，其中该肽包含SEQ ID NO:3-35序列中的任一个。
149.权利要求148的贴剂，其中该肽包含SEQ ID NO:3的序列。
150.权利要求142的贴剂，其中该蛋白质包含EQ ID NO:2的序列。
151.权利要求142的贴剂，其中该贴剂是透皮微针阵列贴剂。
152.权利要求142的贴剂，其中该底物是可弹性拉伸的。
153.一种用于确定个体是否已暴露于辐射或DNA损伤剂的便携式单元，其包括：
(a)样品收集单元；
(b)读数器；
(c)测定模块，其包含(1)权利要求1的抗体；或(2)权利要求16的蛋白质或肽；以及
(d)多个微针。
154.权利要求153的单元，其中该底物包含权利要求1的抗体。
155.权利要求154的单元，其中该抗体包含标记。
156.权利要求153的单元，其中该底物包含权利要求16的蛋白质或肽。
157.权利要求153的单元，其中该蛋白质或肽包含标记。
158.权利要求157的单元，其中该蛋白质或肽是生物素酰化的。
159.权利要求153的单元，其中该肽包含SEQ ID NO:3-35序列中的任一个。
160.权利要求153的单元，其中该肽包含SEQ ID NO:3的序列。
161.权利要求153的单元，其中该蛋白质包含EQ ID NO:2的序列。
162.一种适用于分析物的侧向流测定的测试条，其包括样品接收区，其中该样品接收区包含(1)权利要求1的抗体；或(2)权利要求16的蛋白质或肽。
163.权利要求162的测试条，其中该接收区包含权利要求1的抗体。
164.权利要求163的测试条，其中该抗体包含标记。
165.权利要求162的测试条，其中该接收区包含权利要求16的蛋白质或肽。
166.权利要求162的测试条，其中该蛋白质或肽包含标记。
167.权利要求162的测试条，其中该蛋白质或肽是生物素酰化的。
168.权利要求162的测试条，其中该肽包含SEQ ID NO:3-35序列中的任一个。
169.权利要求168的测试条，其中该肽包含SEQ ID NO:3的序列。
170.权利要求162的测试条，其中该蛋白质包含EQ ID NO:2的序列。
171.一种治疗个体中甲基化H1.0相关疾病或病状的方法，其包括向该个体施用治疗有效量的权利要求1-15中任一项的抗体。
172.权利要求171的方法，其中该疾病或病状选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒性应激物暴露、包含衰老细胞积聚的疾病或病状、以及伴随H1.0K180me2蛋白或肽水平升高的疾病或病状。
173.一种治疗个体中甲基化H1.0相关疾病或病状的方法，其包括向该个体施用治疗有效量的权利要求16-28的蛋白质或肽中的任一种。
174.权利要求173的方法，其中该疾病或病状选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒性应激物暴露、包含衰老细胞积聚的疾病或病状、或伴随H1.0K180me2自身抗体水平升高的疾病或病状。
175.一种清除个体中H1.0K180me2的方法，其包括向该个体施用治疗有效量的权利要求1-15中任一项的抗体。
176.权利要求175的方法，其中该个体患有选自由以下组成的组的疾病或病状：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒素暴露、DNA损伤剂暴露、以及包含衰老细胞积聚的病状。
177.一种清除、阻断或中和个体中H1.0K180me2自身抗体的方法，其包括向该个体施用治疗有效量的权利要求16-28的蛋白质或肽中的任一种。
178.权利要求177的方法，其中该个体患有选自由以下组成的组的疾病或病状：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒性应激物暴露、包含衰老细胞积聚的疾病或病状、以及伴随H1.0K180me2自身抗体水平升高的疾病和病状。
179.一种药物组合物，其包含权利要求1-28的抗体、蛋白质或肽中的任一种和药学上可接受的赋形剂。
180.权利要求179的组合物，其中该组合物是无菌的。
181.一种试剂盒，其包含权利要求1-28或179-180的抗体、蛋白质、肽或组合物中的任一种。
182.一种制品，其包含权利要求1-28或179-181的组合物中的任一种。
CN201780038066.1A 2016-04-20 2017-04-20 与k180二甲基化h1.0蛋白相关的组合物和方法 Pending CN109415431A (zh)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662325408P 2016-04-20 2016-04-20
US201662325392P 2016-04-20 2016-04-20
US201662325362P 2016-04-20 2016-04-20
US62/325,362 2016-04-20
US62/325,408 2016-04-20
US62/325,392 2016-04-20
US201662355277P 2016-06-27 2016-06-27
US201662355265P 2016-06-27 2016-06-27
US62/355,277 2016-06-27
US62/355,265 2016-06-27
PCT/US2017/028686 WO2017184895A2 (en) 2016-04-20 2017-04-20 Compositions and methods related to κ180 dimethylated h1.0 protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109415431A true CN109415431A (zh) 2019-03-01

Family

ID=60116420

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780038066.1A Pending CN109415431A (zh) 2016-04-20 2017-04-20 与k180二甲基化h1.0蛋白相关的组合物和方法

Country Status (5)

Country Link
US (4) US10921324B2 (zh)
EP (1) EP3445782A4 (zh)
JP (3) JP6994469B2 (zh)
CN (1) CN109415431A (zh)
WO (2) WO2017184873A2 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020234729A1 (en) * 2019-05-17 2020-11-26 Insilico Medicine Ip Limited Deep proteome markers of human biological aging and methods of determining a biological aging clock
CN112480234A (zh) * 2020-12-14 2021-03-12 上海交通大学 一种生物活性肽aaggydveknnsriklglk及其制备方法和应用
CN112625113A (zh) * 2020-12-16 2021-04-09 熊猫乳品集团股份有限公司 一种生物活性肽agydveknnsriklglk及其制备方法和应用
US11260078B2 (en) 2017-07-25 2022-03-01 Insilico Medicine Ip Limited Method of treating senescence with multi-stage longevity therapeutics
US11373732B2 (en) 2017-07-25 2022-06-28 Deep Longevity Limited Aging markers of human microbiome and microbiomic aging clock
CN117904196A (zh) * 2024-01-05 2024-04-19 安徽大学 一种非小细胞肺癌组蛋白h1.4赖氨酸乙酰化点突变细胞模型的构建及其应用

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11291689B2 (en) 2015-06-03 2022-04-05 Aelan Cell Technologies, Inc. Methods and devices for the production and delivery of beneficial factors from adipose-derived stem cells
EP3445782A4 (en) 2016-04-20 2020-01-15 Aelan Cell Technologies, Inc. H1.0 DIMETHYLATED K180 PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS
CN111770761B (zh) * 2017-10-25 2024-07-09 爱兰细胞技术公司 H1.0k180me2抗体、其制造方法和用途
WO2020165775A1 (en) * 2019-02-11 2020-08-20 Qualus Research Spa Production and uses of artificial histone h1 for analyzing, diagnosing, treating, and/or preventing senescence
WO2024059515A2 (en) * 2022-09-13 2024-03-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Detection of natural antibody repertoire via detection of reactivity with adducts

Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070105105A1 (en) * 2003-05-23 2007-05-10 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Surrogate cell gene expression signatures for evaluating the physical state of a subject
CN101448857A (zh) * 2006-03-21 2009-06-03 惠氏公司 预防和治疗淀粉样蛋白生成疾病的方法
US20090143762A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-04 Alltranz Inc. Methods and Compositions for Enhancing the Viability Of Microneedle Pores
CN101538616A (zh) * 2002-04-09 2009-09-23 唐舜荣 改进的通过颗粒结合来检测靶分子的方法
CN101802007A (zh) * 2007-06-12 2010-08-11 Ac免疫有限公司 抗β淀粉样蛋白单克隆抗体
US20100305473A1 (en) * 2006-11-28 2010-12-02 Yuzhakov Vadim V Tissue conforming microneedle device for drug delivery or biological fluid collection
CN102558306A (zh) * 2011-12-29 2012-07-11 首都医科大学 用于防治旋毛虫病的抗原表位、其组合物及用途
US20130065254A1 (en) * 2011-08-23 2013-03-14 Buck Institute For Research On Aging Novel epigenetic mechanisms related to dna damage and aging
CN103314297A (zh) * 2010-09-30 2013-09-18 积水医疗株式会社 免疫层析测试条及其制造方法
US20140093865A1 (en) * 2012-09-28 2014-04-03 Clontech Laboratories, Inc. Lateral flow assays for tagged analytes
CN103869086A (zh) * 2014-04-14 2014-06-18 杭州凯保罗生物科技有限公司 一种血清自身抗体检测试剂盒
US20150119327A1 (en) * 2012-04-25 2015-04-30 The Regents Of The University Of California Drug screening platform for rett syndrome
US20150208985A1 (en) * 2014-01-28 2015-07-30 Micro Nipple Technology Co., Ltd. Transdermal microneedle array patch and method for manufacturing the same
CN105051005A (zh) * 2012-10-12 2015-11-11 武田药品工业株式会社 环丙胺化合物及其用途
CN105263958A (zh) * 2013-03-13 2016-01-20 比奥阿赛斯技术有限公司 p97片段及其应用
US9284272B2 (en) * 2014-03-28 2016-03-15 Abbvie Inc. Inhibitors of histone methyltransferase G9a
CN105403649A (zh) * 2015-12-01 2016-03-16 深圳大学 一种检测ad的方法及尿液多肽组ad生物标记物

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001285214A1 (en) * 2000-08-25 2002-03-13 University Of Virginia Patent Foundation Antibodies specific for methylated lysines in histones
EP1480597A4 (en) * 2001-05-11 2005-02-02 Burnham Inst SCREENING, DIAGNOSTIC AND THERAPY PROCEDURES IN CONNECTION WITH RIZ
AU2002357298B2 (en) 2001-12-17 2008-07-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Phospholipid:diacylglycerol acyltransferases
EP1599572A4 (en) * 2003-02-14 2007-06-13 Univ Southern California COMPOSITIONS AND METHODS FOR CANCER IMMUNOTHERAPY
GB0319376D0 (en) * 2003-08-18 2003-09-17 Chroma Therapeutics Ltd Histone modification detection
WO2005040798A1 (ja) * 2003-10-29 2005-05-06 Eisai Co., Ltd. アルツハイマー病の診断方法
JP5463036B2 (ja) * 2005-12-21 2014-04-09 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー 可溶性ｃｅａに対する抵抗性を有する医薬抗体組成物
GB0609119D0 (en) * 2006-05-09 2006-06-21 Univ Birmingham Histones
US8278112B2 (en) * 2006-12-21 2012-10-02 The Regents Of The University Of California Site-specific installation of methyl-lysine analogues into recombinant histones
WO2009018342A1 (en) * 2007-07-30 2009-02-05 The Regents Of The University Of Michigan Multi-analyte analysis of saliva biomarkers as predictors of periodontal and peri-implant disease
EP2151687A1 (en) 2008-08-08 2010-02-10 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Mannose-6-phosphate-binding antibodies and their uses
US20100317539A1 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Guo-Liang Yu Library of Engineered-Antibody Producing Cells
WO2011142952A1 (en) * 2010-05-11 2011-11-17 Children's Memorial Hospital Method of detecting and profiling progression of the risk of neurodegenerative diseases
US9555109B2 (en) 2012-01-20 2017-01-31 University Of Cincinnati Method of inhibiting cell proliferation induced by alternatively spliced tissue factor by administering a monoclonal antibody
ES2930180T3 (es) * 2012-03-02 2022-12-07 Sequenom Inc Métodos para enriquecer ácido nucleico canceroso a partir de una muestra biológica
US20130345115A1 (en) * 2012-06-22 2013-12-26 University Of Southern California Nuclear penetrating h4 tail peptides for the treatment of diseases mediated by impaired or loss of p53 function
CN104892753B (zh) 2014-03-07 2019-11-29 神州细胞工程有限公司 一种中和人感染h7n9甲型流感病毒的抗体及其用途
WO2017049296A1 (en) 2015-09-20 2017-03-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Monoclonal antibodies specific for fibroblast growth factor receptor 4 (fgfr4) and methods of their use
EP3445782A4 (en) 2016-04-20 2020-01-15 Aelan Cell Technologies, Inc. H1.0 DIMETHYLATED K180 PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS
CN111770761B (zh) 2017-10-25 2024-07-09 爱兰细胞技术公司 H1.0k180me2抗体、其制造方法和用途

Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101538616A (zh) * 2002-04-09 2009-09-23 唐舜荣 改进的通过颗粒结合来检测靶分子的方法
US20070105105A1 (en) * 2003-05-23 2007-05-10 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Surrogate cell gene expression signatures for evaluating the physical state of a subject
CN101448857A (zh) * 2006-03-21 2009-06-03 惠氏公司 预防和治疗淀粉样蛋白生成疾病的方法
US20100305473A1 (en) * 2006-11-28 2010-12-02 Yuzhakov Vadim V Tissue conforming microneedle device for drug delivery or biological fluid collection
CN101802007A (zh) * 2007-06-12 2010-08-11 Ac免疫有限公司 抗β淀粉样蛋白单克隆抗体
US20090143762A1 (en) * 2007-11-29 2009-06-04 Alltranz Inc. Methods and Compositions for Enhancing the Viability Of Microneedle Pores
CN103314297A (zh) * 2010-09-30 2013-09-18 积水医疗株式会社 免疫层析测试条及其制造方法
US20130065254A1 (en) * 2011-08-23 2013-03-14 Buck Institute For Research On Aging Novel epigenetic mechanisms related to dna damage and aging
US8981066B2 (en) * 2011-08-23 2015-03-17 Buck Institute For Research On Aging Epigenetic mechanisms related to DNA damage and aging
CN102558306A (zh) * 2011-12-29 2012-07-11 首都医科大学 用于防治旋毛虫病的抗原表位、其组合物及用途
US20150119327A1 (en) * 2012-04-25 2015-04-30 The Regents Of The University Of California Drug screening platform for rett syndrome
US20140093865A1 (en) * 2012-09-28 2014-04-03 Clontech Laboratories, Inc. Lateral flow assays for tagged analytes
CN105051005A (zh) * 2012-10-12 2015-11-11 武田药品工业株式会社 环丙胺化合物及其用途
CN105263958A (zh) * 2013-03-13 2016-01-20 比奥阿赛斯技术有限公司 p97片段及其应用
US20150208985A1 (en) * 2014-01-28 2015-07-30 Micro Nipple Technology Co., Ltd. Transdermal microneedle array patch and method for manufacturing the same
US9284272B2 (en) * 2014-03-28 2016-03-15 Abbvie Inc. Inhibitors of histone methyltransferase G9a
CN103869086A (zh) * 2014-04-14 2014-06-18 杭州凯保罗生物科技有限公司 一种血清自身抗体检测试剂盒
CN105403649A (zh) * 2015-12-01 2016-03-16 深圳大学 一种检测ad的方法及尿液多肽组ad生物标记物

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AJL COOPER等: "Lysine-Rich Histone (H1) Is a Lysyl Substrate of Tissue Transglutaminase: Possible Involvement of Transglutaminase in the Formation of Nuclear Aggregates in (CAG)n/Qn Expansion Diseases", 《DEVELOPMENTAL NEUROSCIENCE》 *
BRUCE GAYNOR等: "Peptide inhibition of glomerular deposition of an anti-DNA antibody", 《PNAS》 *
JNHNATTY SE等: "histone H1.0 [Homo sapiens]", 《GENBANK DATABASE》 *
PATRICK TROJER等: "L3MBTL1, a Histone-Methylation-Dependent Chromatin Lock", 《CELL》 *
THOMAS WEISS等: "Histone H1 variant-specific lysine methylation by G9a/KMT1C and Glp1/KMT1D", 《EPIGENETICS & CHROMATIN》 *
张洁等: "组蛋白甲基转移酶及其相应抑制剂在抗肿瘤领域的研究进展", 《中国新药杂志》 *
王维等: "组蛋白修饰及其生物学效应", 《遗传》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11260078B2 (en) 2017-07-25 2022-03-01 Insilico Medicine Ip Limited Method of treating senescence with multi-stage longevity therapeutics
US11373732B2 (en) 2017-07-25 2022-06-28 Deep Longevity Limited Aging markers of human microbiome and microbiomic aging clock
WO2020234729A1 (en) * 2019-05-17 2020-11-26 Insilico Medicine Ip Limited Deep proteome markers of human biological aging and methods of determining a biological aging clock
CN112480234A (zh) * 2020-12-14 2021-03-12 上海交通大学 一种生物活性肽aaggydveknnsriklglk及其制备方法和应用
CN112625113A (zh) * 2020-12-16 2021-04-09 熊猫乳品集团股份有限公司 一种生物活性肽agydveknnsriklglk及其制备方法和应用
CN112625113B (zh) * 2020-12-16 2022-03-29 熊猫乳品集团股份有限公司 一种生物活性肽agydveknnsriklglk及其制备方法和应用
CN117904196A (zh) * 2024-01-05 2024-04-19 安徽大学 一种非小细胞肺癌组蛋白h1.4赖氨酸乙酰化点突变细胞模型的构建及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2024016122A (ja) 2024-02-06
WO2017184895A3 (en) 2018-01-18
JP6994469B2 (ja) 2022-02-04
US20240255509A1 (en) 2024-08-01
JP2022046533A (ja) 2022-03-23
US20190322729A1 (en) 2019-10-24
US20190234948A1 (en) 2019-08-01
WO2017184873A3 (en) 2017-12-07
EP3445782A4 (en) 2020-01-15
US10921324B2 (en) 2021-02-16
WO2017184873A2 (en) 2017-10-26
US20210302429A1 (en) 2021-09-30
EP3445782A2 (en) 2019-02-27
JP2019521953A (ja) 2019-08-08
WO2017184895A2 (en) 2017-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109415431A (zh) 与k180二甲基化h1.0蛋白相关的组合物和方法
Ansotegui et al. IgE allergy diagnostics and other relevant tests in allergy, a World Allergy Organization position paper
Shimasaki et al. Evaluation of the Cunningham Panel™ in pediatric autoimmune neuropsychiatric disorder associated with streptococcal infection (PANDAS) and pediatric acute-onset neuropsychiatric syndrome (PANS): Changes in antineuronal antibody titers parallel changes in patient symptoms
US20230279147A1 (en) H1.0k180me2 antibodies, methods of making and uses thereof
Pyne et al. Oesophageal secretions reveal local food‐specific antibody responses in eosinophilic oesophagitis
US20150132744A1 (en) Methods of detecting cells latently infected with hiv
Chepy et al. Effects of immunoglobulins G from systemic sclerosis patients in normal dermal fibroblasts: a multi-omics study
JPWO2015019979A1 (ja) 統合失調症に関するバイオマーカー
US20240069023A1 (en) DETECTION OF ACE2 IgM AUTOANTIBODIES AS MARKERS OF SEVERITY AND MECHANISM IN COVID19 PATIENTS
WO2022133193A2 (en) Reagents, methods, and systems for detecting therapeutic agents to monitor adherence to nucleoside reverse transcriptase inhibitor metabolites
JP6614659B2 (ja) Ｃｉｄｅｃによるうつ病の検査方法
JP6315832B2 (ja) 非特異的間質性肺炎の診断のためのバイオマーカー
CN103748470A (zh) 一种预测治疗神经发育、神经学或神经精神病学疾病的临床益处的方法
Ding et al. A novel ELISA method to determine human MrgX2 in chronic urticaria
JP2010185831A (ja) 精神的ストレス抑制物質または増強物質のスクリーニング方法及び精神的ストレスの評価方法
US10155008B2 (en) Use of 15 male fertility related proteins or combination thereof
US11435368B2 (en) Biomarker for senescence and anti-senescence and use thereof
WO2018212261A1 (ja) ４リピートタウの質的違いを検出する特異的結合試薬、これを用いた検査方法、検査キット、及び医薬のスクリーニング方法
Wu et al. Seropositivity rates of water channel protein 4 antibodies compared between a cell-based immunofluorescence assay and an enzyme-linked immunosorbent assay in neuromyelitis optica patients**☆
CN118715440A (zh) 诊断脑损伤的方法和系统

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination