CN101448857A - 预防和治疗淀粉样蛋白生成疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种治疗以Aβ淀粉样沉积物为特征的疾病或病症的方法，其包含对个体投与治疗有效量的特异性结合RAGE且抑制RAGE结合搭配物的结合的抗体。

Description

预防和治疗淀粉样蛋白生成疾病的方法

相关申请案的交叉参考

本发明根据35 U.S.C.§119(e)主张2007年3月16日申请的美国临时专利申请案第60/895,303号和2006年3月21日申请的美国临时专利申请案第60/784,575号的优先权，这两项专利的内容是以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明大体来说涉及特异性结合晚期糖基化终产物受体(RAGE)的抗体和其片段，以及将所述抗体和其片段投与人类患者和非人类哺乳动物以治疗或预防RAGE相关疾病和病症的方法。

背景技术

阿兹海默氏病(Alzheimer′s disease，AD)是一种主要影响老年人的进行性、最终引起死亡的神经退化病症。其为痴呆的最常见形式，并且通常与认知能力(记忆、推理、定向和判断能力)的逐渐丧失和多种行为病症的进展相关联。所述疾病倾向于分为两类：迟发型，其是在年龄较长(大于65岁)时发生；和早发型，其在老年期前(即，35岁与60岁之间)良好发展。在这两类疾病中，病理学相同，但在年龄较轻即开始的情况下，异常往往更为严重且更为广泛。所述疾病是以至少两类脑损伤为特征：神经纤维缠结和老年斑。神经纤维缠结为微管相关τ蛋白的细胞内沉积物，其是由成对地关于彼此缠绕的两个纤丝组成。老年斑(即，淀粉样斑块)是由细胞外淀粉样沉积物所形成的跨多达150微米的组织受到破坏的神经纤维网区域，其中心通过脑组织切片的显微镜分析可见。脑内淀粉样斑块积累还与唐氏综合症(Down′s syndrome)和其它认知病症(诸如血清淀粉样蛋白A(SAA)淀粉样变性病和海绵状脑病)相关。

称为β淀粉样肽或Aβ的肽为淀粉样斑块的主要成分，且据悉其在AD的发病机理中起到主要作用。Aβ是称为淀粉样前体蛋白(APP)的较大跨膜糖蛋白中具有39-43个氨基酸残基的4kDa疏水性内部片段。作为β分泌酶和γ分泌酶蛋白水解加工APP的结果，Aβ主要是以40个氨基酸长的短型和42-43个氨基酸长的长型存在。脑中淀粉样斑块积累最终将导致神经元细胞死亡。据悉，阿兹海默氏病(AD)的缺陷和身体症状特征至少部分是由Aβ的神经毒性作用所引起的神经退化引起。通过抑制Aβ的产生或增强Aβ的清除率来降低Aβ含量是广泛认可的针对阿兹海默氏疾病的疾病缓和策略。

APP蛋白内的若干突变已与阿兹海默氏病的存在相关。所述突变的实例包括缬氨酸⁷¹⁷变为异亮氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸，以及赖氨酸⁵⁹⁵-甲硫氨酸⁵⁹⁶变为天冬酰胺⁵⁹⁵-亮氨酸⁵⁹⁶的双重突变。认为所述突变通过增加或改变APP成为Aβ的加工、尤其将APP加工成增加量的长型Aβ(即Aβ1-42和Aβ1-43)来引起阿兹海默氏病。据悉，诸如早老素(presenilin)基因PS1和PS2等其它基因的突变会间接影响APP的加工，从而产生增加量的长型Aβ。

已成功地使用小鼠模型来确定阿兹海默氏病中淀粉样斑块的重要性(盖姆斯(Games)等人，1995，自然(Nature)，373：523；约翰逊-伍德(Johnson-Wood)等人，1997，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，94：1550)。具体来说，当用长型Aβ注射表达突变形式的人类APP且在较小年龄时发展阿兹海默氏病的PDAPP转基因小鼠时，所述小鼠呈现阿兹海默氏病进展减慢且针对Aβ肽的抗体效价增加(申克(Schenk)等人，1999，自然，400：173)。上文所论述的观察结果表明，Aβ、尤其其长型为阿兹海默氏病的致病要素。

Aβ肽可存在于溶液中并且可以在CNS(例如CSF)和血浆中检测到。在某些条件下，可溶性Aβ转化成在AD患者的神经炎性斑和脑血管中所见的纤维状、有毒β折叠形式。已对涉及用针对Aβ的单克隆抗体进行免疫的治疗展开研究。已在AD小鼠模型中测试主动免疫和被动免疫。主动免疫在一定程度上引起脑中斑块负荷的降低，但只有在经鼻投与时才能达到。也已研究PDAPP转基因小鼠的被动免疫(贝德(Bard)等人，2000，自然医学(Nature Med.)，6：916-19)。已提出供有效清除的两种机制，即中枢降解和周围降解。中枢降解机制取决于能够跨血脑屏障、结合斑块且诱导清除预先存在的斑块的抗体。已证实，通过Fc受体介导的吞噬作用可促进清除(贝德等人，同上文)。Aβ清除的周围降解机制取决于投与抗体后，脑、CSF与血浆之间Aβ动态平衡的破坏，从而导致Aβ从一个隔室转运到另一隔室。将中枢来源的Aβ转运到使其降解的CSF和血浆中。近期的研究表明，甚至在不减少脑中淀粉样沉积的情况下，可溶且未结合的Aβ也涉及与AD相关的记忆障碍(多德(Dodel)等人，2003，柳叶刀(The Lancet)，2：215)。

晚期糖基化终产物受体(RAGE)为免疫球蛋白超家族的多配体细胞表面成员。RAGE是由细胞外结构域、单一跨膜结构域和胞浆尾(cytosolic tail)组成。所述受体的细胞外结构域是由一个V型免疫球蛋白结构域、随后两个C型免疫球蛋白结构域组成。RAGE也以可溶形式(sRAGE)存在。RAGE是由许多不同组织(包括肺、心脏、肾脏、骨骼肌和脑)中的许多细胞类型(例如内皮细胞和平滑肌细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)表达。在慢性炎症状态(诸如类风湿性关节炎和糖尿病性肾病)下，表达增加。尽管RAGE的生理学功能尚未了解，但其涉及炎症反应并且可在各种发育过程中起作用，包括成肌细胞分化和神经发育。

RAGE是一种不常见的模式识别受体，其结合若干不同种类的内源分子，从而引起各种细胞反应，包括细胞因子分泌、细胞氧化应力增加、神经突向外生长和细胞迁移。已证实，RAGE在多种淀粉样蛋白生成(amyloidogenic)疾病和病症中起到积极的致病作用。

需要治疗阿兹海默氏病和其它淀粉样蛋白生成疾病的新颖疗法和试剂。

发明内容

本发明提供通过投与治疗有效量的特异性结合RAGE(即抗RAGE抗体)且抑制RAGE结合搭配物(RAGE binding partner)结合的抗体来治疗患有以Aβ淀粉样沉积物为特征的疾病或病症的个体的方法。可通过所揭示的方法治疗的所述疾病或病症可以脑中Aβ淀粉样沉积物(诸如出现于阿兹海默氏病中)为特征。如本文所述的抗RAGE抗体也可用于抑制或减少个体体内Aβ淀粉样沉积物积累、抑制或减少个体神经退化、抑制或降低个体的认知能力下降和/或改善个体的认知能力。

附图说明

图1A-1C绘示小鼠、大鼠、兔(2种同功异型物)、狒狒、食蟹猴(cynomolgus monkey)和人类的RAGE的经比对氨基酸序列(SEQ ID NO：3、14、11、13、7、9、1)。

图2为直接结合ELISA的数据图，其表明XT-H2以90pM的EC50与hRAGE结合，且XT-M4以300pM的EC50与hRAGE-Fc结合。

图3为直接结合ELISA分析的数据图，其表明抗体XT-M4和XT-H2以100pM的EC50与hRAGE V结构域-Fc结合。

图4为配体竞争ELISA结合检定的数据图，其展现XT-H2和XT-M4阻断HMG1与hRAGE-Fc的结合的能力。

图5为抗体竞争ELISA结合检定的数据图，其展现XT-H2和XT-M4共有类似表位且结合人类RAGE上的重叠位点。

图6绘示鼠科抗RAGE抗体XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5和XT-H7以及大鼠抗RAGE抗体XT-M4的重链可变区的经比对氨基酸序列(SEQ ID NO：18、21、24、20、26、16)。

图7绘示鼠科抗RAGE抗体XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5和XT-H7以及大鼠抗RAGE抗体XT-M4的轻链可变区的经比对氨基酸序列(SEQ ID NO：19、22、25、23、27、17)。

图8绘示编码狒狒RAGE的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)。

图9绘示编码食蟹猴RAGE的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)。

图10绘示编码兔RAGE同功异型物1的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)。

图11绘示编码兔RAGE同功异型物2的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)。

图12A-12E绘示编码狒狒RAGE的经克隆狒狒基因组DNA(克隆18.2)的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)。

图13提供四个图，其展现如通过竞争ELISA结合检定所测定的嵌合XT-M4抗体和大鼠抗体XT-M4阻断RAGE配体HMGB1、淀粉样蛋白β1-42肽、S100-A和S100-B与hRAGE-Fc的结合的能力。

图14提供多个图，其展现如通过抗体竞争ELISA结合检定所测定的嵌合XT-M4与抗体XT-M4和XT-H2竞争与hRAGE-Fc的结合的能力。

图15描述食蟹猴、兔和狒狒的肺组织IHC染色，表明XT-M4结合这些组织中的内源性细胞表面RAGE。对照样本为表达接触XT-M4的hRAGE的CHO细胞、不表达RAGE的NGBCHO细胞和表达接触对照IgG抗体的hRAGE的CHO细胞。

图16绘示大鼠抗体XT-M4结合正常人的肺和患有慢性阻塞性肺病(COPD)的人的肺中的RAGE。

图17绘示人类化鼠科XT-H2 HV区的氨基酸序列。

图18绘示人类化鼠科XT-H2 HL区的氨基酸序列。

图19绘示人类化大鼠XT-M4 HV区的氨基酸序列。

图20A-20B绘示人类化大鼠XT-H2 HL区的氨基酸序列。

图21描述用于产生人类化轻链和重链多肽的表达载体。

图22绘示如通过竞争ELISA所测定的人类化XT-H2抗体与人类RAGE-Fc结合的ED50值。

图23绘示如通过BIACORE^TM结合检定所测定的XT-M4以及人类化抗体XT-M4-V10、XT-M4-V11和XT-M4-V14结合hRAGE-SA的动力学速率常数(k_a和k_d)以及缔合常数和解离常数(K_a和K_d)。

图24绘示如通过BIACORE^TM结合检定所测定的XT-M4以及人类化抗体XT-M4-V10、XT-M4-V11和XT-M4-V14结合mRAGE-SA的动力学速率常数(k_a和k_d)以及缔合常数和解离常数(K_a和K_d)。

图25绘示鼠科XT-H2 VL-VH ScFv构筑体的核苷酸序列(SEQ ID NO：51)。

图26绘示鼠科XT-H2 VH-VL ScFv构筑体的核苷酸序列(SEQ ID NO：52)。

图27绘示大鼠XT-M4 VL-VH ScFv构筑体的核苷酸序列(SEQ ID NO：54)。

图28绘示大鼠XT-M4 VH-VL ScFv构筑体的核苷酸序列(SEQ ID NO：53)。

图29为ELISA数据图，其展现XT-H2和XT-M4抗RAGE抗体的ScFv构筑体以VL/VH或VH/VL构型结合人类RAGE-Fc。

图30为ELISA数据图，其展现在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达为可溶性蛋白的XT-H2和XT-M4抗RAGE抗体的ScFv构筑体以VL/VH或VH/VL构型结合人类RAGE-Fc和BSA。ActRIIb为作为阴性对照的由相同载体表达的不结合蛋白。

图31示意性展现使用PCR将掺加示踪剂的突变(spiked mutation)引入XT-M4的CDR中。

图32绘示XT-M4 VL-VH ScFv构筑体的C末端的核苷酸序列(SEQ ID NO：56)。VH-CDR3加下划线。还绘示两个掺加示踪剂的寡核苷酸(SEQ ID NO：57-58)，其中各突变位点处具有标识用于在所述位点处突变的掺加示踪剂的比率的数字。也标识出具有与所述数字对应的掺加示踪剂的比率的核苷酸组成。

图33示意性展现核糖体展示载体pWRIL-3。“T7”表示T7启动子，“RBS”为核糖体结合位点，“间隔多肽”为将折叠蛋白与核糖体连接的间隔多肽，“Flag标签”为用于蛋白检测的Flag表位标签。

图34示意性展现噬菌体展示载体pWRIL-1。

图35示意性展现使用Fab展示载体pWRIL-6进行的掺加示踪剂的VL和VH的文库的组合组装。

图36为抗体竞争ELISA数据图，其展现在去除52位处的糖基化位点的突变后XT-M4抗体对hRAGE的亲和力增加。

图37为绘示在对小鼠单次静脉内投药后嵌合XT-M4的血清浓度的图。

图38为绘示嵌合XT-M4对Tg2576小鼠模型中记忆缺失的影响的图。

具体实施方式

抗RAGE抗体

本发明提供特异性结合如本文所述的RAGE(包括可溶性RAGE和内源性分泌型RAGE)的抗体。代表性抗RAGE抗体可包含SEQ ID NO：16-49中所示的抗体可变区氨基酸序列中的至少一种。

本发明的抗RAGE抗体包括特异性结合RAGE且具有与SEQ ID NO：16-49中的任一序列一致或实质上一致的氨基酸序列的抗体。实质上一致的抗RAGE抗体的氨基酸序列为与SEQ ID NO：16-49中任一序列具有至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％一致性的序列。

本发明的抗RAGE抗体包括一种抗体，其特异性结合RAGE，且(a)包含选自由SEQ ID NO：19、22、25、23、27和17组成的群组的轻链可变区，或(b)包含具有与SEQ ID NO：19、22、25、23、27和17中任一序列至少90％一致的氨基酸序列的轻链可变区，或为根据(a)或(b)的抗体的RAGE结合片段。

本发明的抗RAGE抗体还包括一种抗体，其特异性结合RAGE，且(a)包含选自由SEQ ID NO：18、21、24、20、26和16组成的群组的重链可变区，或(b)包含具有与SEQ ID NO：18、21、24、20、26和16中任一序列至少90％一致的氨基酸序列的重链可变区，或为根据(a)或(b)的抗体的RAGE结合片段。

本发明包括一种抗RAGE抗体，其特异性结合RAGE且：

(a)与选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体竞争与RAGE的结合；

(b)与结合选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体的RAGE的表位结合；

(c)包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体的轻链或重链的一个或多个互补决定区(CDR)；或

(d)为根据(a)、(b)或(c)的抗体的RAGE结合片段。

本发明包括在活体外和活体内特异性结合RAGE表达细胞的抗RAGE抗体，以及以在至少约1×10-⁷M到约1×10^-10M范围内的解离常数(Kd)结合人类RAGE的抗体。还包括特异性结合人类RAGE的V结构域的本发明的抗RAGE抗体，和阻断RAGE与RAGE结合搭配物(RAGE-BP)结合的抗RAGE抗体。

本发明还包括一种抗体，其特异性结合RAGE，并且阻断RAGE与Rage结合搭配物(例如，配体，诸如HMGB1、AGE、Aβ、SAA、S100、两性霉素(amphoterin)、S100P、S100A(包括S100A8和S100A9)、S100A4、CRP、β2-整合素(integrin)、Mac-1和p150,95)的结合，且具有具四个或四个以上以下特征的CDR(位置编号是关于如图6和7中关于VH和VL序列所示的氨基酸位置)：

1.VH CDR1中的氨基酸序列为Y-X-M(Y32、X33、M34)，其中X优选为W或N；

2.VH CDR2中的氨基酸序列为I-N-X-S(I51、N52、X53和S54)，其中X为P或N；

3.VH的CDR2中第58位氨基酸为苏氨酸；

4.VH的CDR2中第60位氨基酸为酪氨酸；

5.VH的CDR3中第103位氨基酸为苏氨酸；

6.VH的CDR3中具有一个或多个酪氨酸残基；

7.VL的CDR1中第24位为带正电残基(Arg或Lys)；

8.VL的CDR1中第26位为亲水性残基(Thr或Ser)；

9.VL的CDR1中第25位为小残基Ser或Ala；

10.VL的CDR1中第33位为带负电残基(Asp或Glu)；

11.VL的CDR1中第37位为芳香族残基(Phe或Tyr或Trp)；

12.VL的CDR2中第57位为亲水性残基(Ser或Thr)；

13.VL的CDR3末端处为P-X-T序列，其中X可为疏水性残基Leu或Trp。

本发明的抗RAGE抗体包括特异性结合人类RAGE的V结构域并且阻断RAGE与其配体的结合且具有具5、6、7、8、9、10、11、12或所有13个特征的CDR的抗体。

本发明的抗RAGE抗体包括如上文所述的抗RAGE抗体，或选自由以下组成的群组的RAGE结合片段：嵌合抗体、人类化抗体、单链抗体、四聚体抗体、四价抗体、多特异性抗体、结构域特异性抗体、结构域缺失抗体、融合蛋白、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)₂片段、Fv片段、ScFv片段、Fd片段、单结构域抗体、dAb片段和Fc融合蛋白(即，与免疫球蛋白恒定区融合的抗原结合结构域)。这些抗体可与细胞毒性剂、放射性治疗剂或可检测标记偶联。

举例来说，已制备包含大鼠XT-M4抗体的VH和VL结构域的ScFv抗体(SEQ ID NO：63)，且通过基于细胞的ELISA分析证实，其对狒狒、小鼠、兔和人类RAGE的结合亲和力可与嵌合和野生型XT-M4抗体的结合亲和力相当。

另外，预期本发明的抗体包括异源连结物、双特异性分子、单链分子以及嵌合分子和人类化分子，其对标的多肽中的一种具有由抗体的至少一个CDR区所赋予的亲和力。

特异性结合RAGE的本发明的抗体还包括本文所述的任一种抗体的变体，其可易于使用已知的分子生物学和克隆技术来制备。例如，参看美国公开专利申请案第2003/0118592号、第2003/0133939号、第2004/0058445号、第2005/0136049号、第2005/0175614号、第2005/0180970号、第2005/0186216号、第2005/0202012号、第2005/0202023号、第2005/0202028号、第2005/0202534号和第2005/0238646号，以及其相关专利家族成员，所有所述专利都是以全文引用的方式并入本文中。举例来说，本发明的变体抗体也可包含结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白，其包括与免疫球蛋白铰链或铰链作用区多肽融合或以其它方式与其连接的结合结构域多肽(例如，scFv)，而所述铰链或铰链作用区多肽又与包含一个或多个除CH1外的免疫球蛋白重链的天然或经工程改造的恒定区(例如，IgG和IgA的CH2和CH3区或IgE的CH3和CH4区)的区融合或以其它方式与其连接(有关更为完整的描述，例如参看莱德贝特J.(Ledbetter，J.)等人的US2005/0136049，其是以引用的方式并入本文中)。结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白可另外包括一个区，其包括天然或经工程改造的免疫球蛋白重链CH2恒定区多肽(或在全部或部分来自IgE的构筑体的情况下为CH3)，所述多肽与融合CH2恒定区多肽或以其它方式连接到CH2恒定区多肽(或在全部或部分来自IgE的构筑体的情况下为CH3)的铰链区多肽和天然或经工程改造的免疫球蛋白重链CH3恒定区多肽(或在全部或部分来自IgE的构筑体的情况下为CH4)融合或以其它方式与其连接。通常，所述结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白能够具有至少一种免疫活性，例如特异性结合RAGE、抑制RAGE与RAGE结合搭配物之间的相互作用、诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、诱导补体结合等。

本发明的抗体也可包含与其连接且能够检测的标记(例如，所述标记可为放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子)。

RAGE多肽

本发明还提供狒狒、食蟹猴和兔的经分离RAGE蛋白，其具有SEQ ID NO：7、9、11或13中所示的氨基酸序列；且另外包括具有与SEQ ID NO：7、9、11或13中所示的氨基酸序列实质上一致的氨基酸序列的RAGE蛋白，这是因为所述氨基酸序列与SEQ IDNO：7、9、11或13中任一序列的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％一致。

本发明还包括通过所属领域中已知的任何方式产生本发明的抗RAGE抗体和其RAGE结合片段的方法。

本发明还包括一种经纯化单克隆抗体制剂，其特异性结合如SEQ ID NO：1、3、7、9、11或13中任一序列所述的RAGE氨基酸序列的一个或多个表位。

定义

为简便起见，将本说明书、实例和随附权利要求书中所使用的某些术语收集于此。除非另作定义，否则本文所使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所了解相同的含义。

冠词“一”在本文中用于指所述冠词的一个或多个(即至少一个)语法体。举例来说，“一要素”意谓一个要素或多个要素。

除非上下文中另作清楚指示，否则术语“或”在本文中用于意谓术语“和/或”并且可与术语“和/或”互换使用。

“经分离”或“经纯化”多肽或蛋白(例如“经分离抗体”)是经纯化至超出其在自然界中所存在的状态的状态。举例来说，“经分离”或“经纯化”多肽或蛋白(例如“经分离抗体”)可实质上不含来自产生所述蛋白的细胞或组织来源的细胞材料或其它污染蛋白；或当化学合成时，实质上不含化学前体或其它化学物质。具有小于约50％的非抗体蛋白(在本文中也称为“污染蛋白”)或化学前体的抗体蛋白制剂被认为是“实质上不含”所述非抗体蛋白或化学前体。40％、30％、20％、10％且更优选5％(以干重计)的非抗体蛋白或化学前体被认为是实质上不存在的。当重组产生抗体蛋白或其生物活性部分时，也优选实质上不含培养基，即培养基占蛋白制剂的体积或质量的不足约30％、优选不足约20％、更优选不足约10％且最优选不足约5％。在本文中称为“重组体”的蛋白或多肽为通过重组核酸表达产生的蛋白或多肽。

术语“抗体”在本文中可与术语“免疫球蛋白”互换使用，且包括完整抗体、抗体片段(例如，Fab、F(ab′)₂片段)，以及恒定区和/或可变区已突变(例如，用于产生嵌合抗体、部分人类化抗体或完全人类化抗体以及用于产生具有所需特性(例如增强的IL 13结合和/或减弱的FcR结合)的抗体的突变)的完整抗体和片段。术语“片段”是指包含比完整或完全抗体或抗体链少的氨基酸残基的一部分抗体或抗体链。可经由化学或酶处理完整或完全抗体或抗体链而获得片段。也可通过重组方式获得片段。例示性片段包括Fab、Fab＇、F(ab′)₂、Fabc、Fd、dAb和scFv和/或Fv片段。术语“抗原结合片段”是指结合抗原或与完整抗体(即，产生所述片段的完整抗体)竞争抗原结合(即，特异性结合)的免疫球蛋白或抗体的多肽片段。因此，这些抗体或其片段包括在本发明的范围内，条件是所述抗体或片段特异性结合RAGE，并且中和或抑制一种或多种RAGE相关活性(例如，抑制RAGE结合搭配物(RAGE-BP)与RAGE的结合)。

所述抗体包括包含通过二硫键互连的四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)的分子结构。各重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，即CH1、CH2和CH3。各轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更为保守的区域，称为框架区(FR)。VH和VL各自是由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端到羧基末端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

预期术语“抗体”涵盖从任何来源(例如，人类和非人类灵长类动物，和啮齿动物、兔类、山羊、牛、马、绵羊等)获得的任何Ig种类或任何Ig亚类(例如IgG的IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄亚类)。

如本文所使用，术语“Ig种类”或“免疫球蛋白种类”是指已在人类和高级哺乳动物中鉴别出的5个免疫球蛋白种类：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。术语“Ig亚类”是指已在人类和高级哺乳动物中鉴别出的IgM的两个亚类(H和L)、IgA的三个亚类(IgA1、IgA2和分泌型IgA)和IgG的四个亚类(IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄)。所述抗体可以单体或聚合物形式存在；举例来说，IgM抗体以五聚体形式存在，且IgA抗体以单体、二聚体或多聚体形式存在。

术语“IgG亚类”是指已在人类和高级哺乳动物中分别通过免疫球蛋白的γ重链γ₁-γ₄鉴别出的免疫球蛋白IgG种类的四个亚类—IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。

术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(在本文中可互换使用)是指具有由重链和轻链组成的两条多肽链结构的蛋白，所述链例如是通过链间肽连接子达到稳定，所述蛋白具有特异性结合抗原的能力。术语“结构域”是指重链或轻链多肽的球形区，其包含例如通过β折叠片和/或链内二硫键达到稳定的肽环(例如，包含3到4个肽环)。根据在“恒定”结构域的情况下各类成员的结构域内序列变异的相对缺乏，或者在“可变”结构域的情况下各类成员的结构域内的明显变异，在本文中将结构域另外称为“恒定”或“可变”结构域。抗体或多肽“结构域”通常在所属领域中互换称为抗体或多肽“区”。抗体轻链的“恒定”结构域可互换称为“轻链恒定区”、“轻链恒定结构域”、“CL”区或“CL”结构域。抗体重链的“恒定”结构域可互换称为“重链恒定区”、“重链恒定结构域”、“CH”区或“CH”结构域。抗体轻链的“可变”结构域可互换称为“轻链可变区”、“轻链可变结构域”、“VL”区或“VL”结构域。抗体重链的“可变”结构域可互换称为“重链恒定区”、“重链恒定结构域”、“VH”区或“VH”结构域。

术语“区”也可以指抗体链或抗体链结构域的一部分(例如，重链或轻链的一部分或者恒定结构域或可变结构域的一部分，如本文所定义)以及所述链或结构域的更为分散的部分。举例来说，轻链和重链或轻链和重链可变结构域包括散布于“框架区”或“FR”间的“互补决定区”或“CDR”，如本文所定义。

术语“构象”是指蛋白或多肽(例如，抗体、抗体链、其结构域或区)的三级结构。举例来说，短语“轻(或重)链构象”是指轻(或重)链可变区的三级结构，且短语“抗体构象”或“抗体片段构象”是指抗体或其片段的三级结构。

抗体的“特异性结合”意谓所述抗体对特定抗原或表位展现可察觉的亲和力且通常不展现明显的交叉反应性。如本文所使用，术语“抗RAGE抗体”是指特异性结合RAGE的抗体。所述抗体可能不展现交叉反应性(例如，不与非RAGE肽或RAGE上的远端表位交叉反应)。“可察觉的”结合包括以至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹M^-1或10¹⁰M^-1的亲和力结合。具有高于10⁷M^-1或10⁸M^-1的亲和力的抗体通常相应地以较高特异性结合。预期本文所述值的中间值也在本发明的范围内，并且本发明的抗体以在一定范围内的亲和力(例如，10⁶到10¹⁰M^-1或10⁷到10¹⁰M^-1或10⁸到10¹⁰M^-1)结合RAGE。“不展现明显交叉反应性”的抗体为不会可察觉地结合除其标靶外的实体(例如，不同表位或不同分子)的抗体。举例来说，特异性结合RAGE的抗体将可察觉地结合RAGE，但不会与非RAGE蛋白或肽显著反应。例如，对特定表位具特异性的抗体将不会与同一蛋白或肽上的远端表位显著交叉反应。可根据所属领域认可的任何测定特异性结合的方式测定所述结合。优选根据斯卡恰特分析(Scatchard analysis)和/或竞争性结合检定测定特异性结合。

如本文所使用，术语“亲和力”是指单抗原组合位点与抗原决定基结合的强度。亲和力视抗体组合位点与抗原决定基之间立体化学拟合的接近程度、其间的接触区域的大小、带电和疏水性基团的分布等而定。可以通过平衡透析或动力学BIACORE^TM方法测量抗体亲和力。BIACORE^TM方法取决于当在金属/液体界面处激发表面等离子体波时出现的表面等离子体共振(SPR)现象。将光导向不与样本接触的表面侧且从所述侧面反射，并且在角度和波长的特定组合下，SPR引起反射光强度的降低。双分子结合事件引起表面层处折射率的改变，这可检测为SPR信号的改变。

解离常数Kd和缔合常数Ka为亲和力的定量度量。平衡时，游离抗原(Ag)和游离抗体(Ab)与抗原-抗体复合物(Ag-Ab)达到平衡，且速率常数ka和kd用数量表示个别反应的速率：

ka                  kd

Ab+Ag→Ab-Ag  和Ab-Ag→Ab+Ag。

平衡时，ka[Ab][Ag]＝kd[Ag-Ab]。解离常数Kd由下式提供：Kd＝kd/ka＝[Ag][Ab]/[Ag-Ab]。Kd具有浓度单位，最通常为M、mM、μM、nM、pM等。当比较以Kd表示的抗体亲和力时，由较低值指示对RAGE具有较大亲和力。缔合常数Ka由下式提供：Ka＝ka/kd＝[Ag-Ab]/[Ag][Ab]。Ka的单位为浓度的倒数，最通常为M^-1、mM^-1、μM^-1、nM^-1、pM^-1等。如本文所使用，术语“亲合力(avidity)”是指形成可逆复合物后抗原-抗体键的强度。可以Kd表征抗RAGE抗体与RAGE蛋白的结合，如“以在约(较低Kd值)到约(较高Kd值)范围内的解离常数(Kd)”结合。在此情况下，术语“约”意欲意谓所指示的Kd值±20％；即，约为1的Kd＝在0.8到1.2范围内的Kd。

如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指由产生抗体的细胞(例如，B淋巴细胞或B细胞)的克隆种群得到的抗体，所述克隆种群的结构和抗原特异性相同。术语“多克隆抗体”是指由产生抗体的细胞的不同克隆种群得到的多个抗体，所述克隆种群的结构和表位特异性不同，但识别共同的抗原。单克隆抗体和多克隆抗体可以粗制剂形式存在于体液内，或可如本文所述经纯化。

术语抗体的“结合部分”(或“抗体部分”)包括一个或多个完整结构域，例如一对完整结构域，以及保留特异性结合RAGE的能力的抗体片段。已证实，抗体的结合功能可通过全长抗体的片段来执行。通过重组DNA技术或完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解产生结合片段。结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fabc、Fd、dAb、Fv、单链、单链抗体(例如scFv)以及单结构域抗体(沐伊德曼斯(Muyldermans)等人，2001，26：230-5)和经分离互补决定区(CDR)。Fab片段为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段。F(ab′)₂片段为包含两个在铰链区通过二硫桥连接的Fab片段的二价片段。Fd片段是由VH和CH1结构域组成，并且Fv片段是由抗体单臂的VL和VH结构域组成。dAb片段是由VH结构域组成(沃德(Ward)等人，(1989)，自然，341：544-546)。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独基因编码，但其可使用重组方法通过能使其成为单一蛋白链(其中VL与VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)))的合成连接子连接(伯德(Bird)等人，1988，科学(Science)，242：423-426)。预期所述单链抗体也涵盖于术语抗体的“结合部分”内。也涵盖其它形式的单链抗体，诸如双功能抗体。双功能抗体为二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达于单一多肽链上，但使用过短而无法使同一链上的两个结构域配对，从而迫使所述结构域与另一链的互补结构域配对且产生两个抗原结合位点的连接子(例如，参看霍利格(Holliger)等人，1993，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90：6444-6448)。抗体或其结合部分也可为通过抗体或抗体部分与一个或多个其它蛋白或多肽的共价或非共价缔合所形成的较大免疫粘附分子的部分。所述免疫粘附分子的实例包括使用抗生蛋白链菌素(streptavidin)核心区来制备四聚scFv分子(基普亚诺夫S.M.(Kipriyanov，S.M.)等人，(1995)，人类抗体和杂交瘤(Human Antibodies and Hybridomas)，6：93-101)以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标签来制备二价和生物素化scFv分子(基普亚诺夫S.M.等人，(1994)，分子免疫学(Mol.Immunol.)，31：1047-1058)。可使用常规技术(诸如，分别以木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化全抗体)由全抗体制备结合片段，诸如Fab和F(ab′)₂片段。此外，也可使用如本文所述且如所属领域中已知的标准重组DNA技术来获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。应了解，除“双特异性”或“双功能”抗体外，抗体的各个结合位点一致。“双特异性”或“双功能抗体”为具有两个不同的重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体也可包括两个抗原结合区和插入恒定区。可通过多种方法(包括融合杂交瘤或连接Fab′片段)产生双特异性抗体。例如，参看松斯威莱(Songsivilai)等人，临床与实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)，79：315-321，1990.；克斯托林(Kostelny)等人，1992，免疫学杂志(J.Immunol.)，148，1547-1553。

术语“回复突变(back mutation)”是指将人类抗体的一些或全部体细胞突变的氨基酸用来自同源生殖系抗体序列的相应生殖系残基置换的方法。将本发明的人类抗体的重链和轻链序列单独与VBASE数据库中的生殖系序列比对以鉴别具有最高同源性的序列。通过使编码所述不同氨基酸的指定核苷酸位置突变而使本发明人类抗体的差异回复到生殖系序列。应关于在抗原结合中所起的直接或间接作用来研究由此鉴别为回复突变候选物的各氨基酸的作用，并且在最终人类抗体中不应包括突变后所发现的会影响人类抗体的任何所需特征的任何氨基酸；举例来说，不应使通过选择性诱变方法所鉴别的活性增强氨基酸经历回复突变。为使经历回复突变的氨基酸的数目降至最低，可保留所发现的与最接近的生殖系序列不同但与第二生殖系序列中的相应氨基酸一致的氨基酸位置，条件是所述第二生殖系序列在所论及的氨基酸两侧与本发明人类抗体的序列关于至少10个、优选12个氨基酸一致且具有共线性。回复突变可在抗体优化的任何阶段发生；优选地，回复突变是在选择性诱变方法之前或之后直接发生。更优选，回复突变是在选择性诱变方法之前直接发生。

完整抗体(也称为免疫球蛋白)通常为由各自约25kDa的两条轻(L)链和各自约50kDa的两条重(H)链构成的四聚体糖基化蛋白。称为λ和κ的两类轻链可见于抗体中。视重链恒定结构域的氨基酸序列而定，可将免疫球蛋白指定为五个主要种类：A、D、E、G和M，且其中若干类可进一步分为亚类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。各轻链是由N末端可变(V)结构域(VL)和恒定(C)结构域(CL)构成。各重链是由N末端V结构域(VH)、三个或四个C结构域(CH)和铰链区构成。将最接近VH的CH结构域称为CH1。VH和VL结构域是由称为框架区的四个相对保守的序列区(FR1、FR2、FR3和FR4)组成，所述框架区形成三个高变序列区(互补决定区，CDR)的支架。CDR含有负责抗体与抗原的特异性相互作用的大部分残基。CDR称为CDR1、CDR2和CDR3。因此，重链上的CDR组分称为H1、H2和H3，而轻链上的CDR组分称为L1、L2和L3。CDR3是抗体结合位点内分子多样性的最大来源。举例来说，H3可短至两个氨基酸残基或超过26个氨基酸。所属领域中众所周知不同种类免疫球蛋白的亚单元结构和三维构型。有关抗体结构的综述，参看抗体：实验手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)编，哈洛(Harlow)等人，1988。所属领域的技术人员将认识到，各亚单元结构(例如，CH、VH、CL、VL、CDR、FR结构)包含活性片段，例如VH、VL或CDR亚单元中结合抗原的部分，即结合片段；或例如CH亚单元中结合和/或活化例如Fc受体和/或补体的部分。

抗体多样性是通过使用多个编码可变区的生殖系基因以及多个体细胞事件而产生。体细胞事件包括将可变基因区段与多样性(D)和连接(J)基因区段重组以制得完整VH区，以及将可变基因区段与连接基因区段重组以制得完整VL区。重组方法本身并不严密，从而导致V(D)J连接处氨基酸的缺失或添加。所述多样性机制是在抗原暴露之前出现于发育的B细胞中。抗原刺激后，B细胞中所表达的抗体基因经历体细胞突变。根据所估计的生殖系基因区段的数目，随机重组这些区段并且使VH-VL随机配对，可产生多达1.6×10⁷种不同抗体(基础免疫学(Fundamental Immunology)，第3版(1993)，保罗(Paul)编，瑞文出版社(Raven Press)，纽约州纽约市(New York，NY))。当考虑有助于抗体多样性的其它方法(诸如体细胞突变)时，认为可产生超过1×10¹⁰种不同抗体(免疫球蛋白基因(Immunoglobulin Genes)，第2版(1995)，朱利诺(Jonio)等人，学术出版社(Academic Press)，加州圣迭戈(San Diego，CA))。由于许多方法涉及产生抗体多样性，所以独立产生的具有相同抗原特异性的单克隆抗体未必具有一致氨基酸序列。

术语“二聚化多肽”或“二聚化结构域”包括与另一多肽形成二聚体(或较高级别复合物，诸如三聚体、四聚体等)的任何多肽。视情况，将二聚化多肽与其它相同的二聚化多肽缔合，从而形成均多聚体。IgG Fc元件为倾向于形成均多聚体的二聚化结构域的实例。视情况，将二聚化多肽与其它不同的二聚化多肽缔合，从而形成杂多聚体。Jun亮氨酸拉链结构域与Fos亮氨酸拉链结构域形成二聚体，且因此为倾向于形成杂多聚体的二聚化结构域的实例。二聚化结构域可形成25种杂多聚体和均多聚体。

术语“人类抗体”包括具有与如卡贝特(Kabat)等人所述的人类生殖系免疫球蛋白序列对应的可变区和恒定区的抗体(参看卡贝特等人(1991)，免疫学关注的蛋白的序列(Sequences of proteins of Immunological Interest)，第5版，美国卫生和公共服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH公开案第91-3242号)。本发明的人类抗体可包括并非由例如CDR且尤其CDR3中的人类生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过活体外随机或位点特异性诱变或者活体内体细胞突变引入的突变)。优选使用本文所述的“选择性诱变方法”引入突变。人类抗体可具有至少一个经并非由人类生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，活性增强氨基酸残基)置换的位置。人类抗体可具有至多20个经并非人类生殖系免疫球蛋白序列的部分的氨基酸残基置换的位置。此外，至多10个、至多5个、至多3个或至多2个位置经置换。如下文详细描述，这些置换可在CDR区内。然而，如本文所使用，术语“人类抗体”不打算包括已将从另一哺乳动物物种(诸如小鼠)得到的CDR序列移植到人类框架序列上的抗体。

短语“重组人类抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的人类抗体，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(进一步描述于下文第II部分中)、从重组、组合人类抗体库分离的抗体(进一步描述于下文第III部分中)、从关于人类免疫球蛋白基因转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(例如，参看泰勒L.D.(Taylor，L.D.)等人(1992)，核酸研究(Nucl.Acids Res.)，20：6287-6295)；或通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列中的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。所述重组人类抗体具有来源于人类生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(参看卡贝特E.A.等人(1991)，免疫学关注的蛋白的序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第5版，美国卫生和公共服务部，NIH公开案第91-3242号)。然而，所述重组人类抗体可经历活体外诱变(或，当使用关于人类Ig序列转基因的动物时，活体内体细胞诱变)，且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列为尽管源于且涉及人类生殖系VH和VL序列，但可能不天然存在于活体内人类抗体生殖系谱系中的序列。然而，在某些实施例中，所述重组抗体可为选择性诱变方法或回复突变或二者的结果。

“经分离抗体”包括实质上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合RAGE的经分离抗体实质上不含特异性结合除hRAGE外的RAGE的抗体)。特异性结合RAGE的经分离抗体可结合来自其它物种的RAGE分子。此外，经分离抗体可实质上不含其它细胞材料和/或化学物质。

“中和抗体”(或“中和RAGE活性的抗体”)包括与hRAGE的结合导致调节hRAGE生物活性的抗体。可通过测量一种或多种hRAGE生物活性指示剂来评定所述hRAGE生物活性的调节，诸如在人类RAGE受体结合检定中抑制受体结合(例如参看实例6和7)。这些hRAGE生物活性指示剂可通过所属领域中已知的若干标准活体外或活体内检定中的一种或多种检定来评定(例如参看实例6和7)。

非人类(例如，鼠科)抗体的“人类化”形式为含有源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。一般地，人类化抗体为来自受体高变区的残基经来自具有所需特异性、亲和力和容量的非人类物种(诸如，小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)(供体抗体)高变区的残基置换的人类免疫球蛋白(受体抗体)。在一些情况下，人类免疫球蛋白的FR残基经相应非人类残基置换。此外，人类化抗体也可包含受体抗体或供体抗体中不可见的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体效能。一般来说，人类化抗体将包含实质上所有的至少一个且通常两个可变结构域，其中所有或实质上所有高变区与非人类免疫球蛋白的高变区对应，并且所有或实质上所有FR区为人类免疫球蛋白序列的FR区。人类化抗体视情况还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。有关其它细节，参看琼斯(Jones)等人，自然，321：522-525(1986)；里奇曼(Riechmann)等人，自然，332：323-329(1988)；和普雷斯塔(Presta)，结构生物学新观点(Curr.Op.Struct.Biol.)，2：593-596(1992)。

术语“活性”包括以下活性：诸如抗体对抗原的结合特异性/亲和力，例如抗hRAGE抗体结合RAGE；和/或抗体的中和效力，例如结合hRAGE的抗hRAGE抗体抑制RAGE的生物活性，例如在人类RAGE受体结合检定中抑制受体结合。

“表达构筑体”为任何重组核酸，其包括可表达的核酸以及足以介导可表达的核酸蛋白或多肽在适当宿主细胞中表达的调控元件。

术语“融合蛋白”和“嵌合蛋白”可互换，并且指具有特定氨基酸序列的蛋白或多肽，所述氨基酸序列具有与来自两种或两种以上蛋白的氨基酸序列对应的部分。来自两种或两种以上蛋白的序列可为完整蛋白或蛋白的部分(即片段)。融合蛋白也可在对应于蛋白的氨基酸序列的部分之间具有氨基酸的连接区。所述融合蛋白可通过重组方法制备，其中通过用核酸酶和连接酶处理来连接对应核酸，并将其并入表达载体中。所属领域的技术人员通常了解融合蛋白的制备。

术语“核酸”是指聚核苷酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)，且适当时是指核糖核酸(RNA)。也应了解，所述术语包括由核苷酸类似物构成的RNA或DNA的类似物(作为等效物)，以及可应用于所述实施例的单链(有义链或反义链)和双链聚核苷酸。

术语“一致百分比”或“一致性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的序列一致性。一致性百分比可通过比较可出于比较目的而比对的各序列的位置来测定。表述为一致性百分比是指在多个位置处所比较的序列共有的一致氨基酸或核酸的数目的函数。可使用各种比对算法和/或程序，包括FASTA、BLAST或ENTREZ。FASTA和BLAST可用作GCG序列分析包(威斯康星州威斯康星大学麦迪逊分校(University ofWisconsin，Madison，Wis.))的一部分，并且例如可使用默认设置。ENTREZ通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)、国家医学图书馆(National Library of Medicine)、美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)(马里兰州贝塞斯达(Bethesda，Md.))可用。可通过间隙权重为1的GCG程序测定两个序列的一致性百分比，例如对各氨基酸间隙加权，就如同其为两个序列之间的单一氨基酸或核苷酸错配。

供比对的其它技术描述于以下文献中：酶学方法(Methods in Enzymology)，第266卷：大分子序列分析的计算机方法(Computer Methods for Macromolecular SequenceAnalysis)(1996)，杜里特尔(Doolittle)编，学术出版公司(Academic Press，Inc.)，哈考特·布雷斯出版公司分公司(a division of Harcourt Brace & Co.)，美国加州圣迭戈(SanDiego，California，USA.)。优选利用允许序列中存在间隙的比对程序来比对序列。史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)为一类允许序列比对中存在间隙的算法。参看分子生物学方法(Meth.Mol.Viols.)，70：173-187(1997)。另外，也可利用使用尼德曼和温克斯(Needlenan and Wunsch)比对方法的GAP I程序来比对序列。另一研究策略使用在MASPAR计算机上运行的MPSRCH软件。MPSRCH使用史密斯-沃特曼算法在大规模并行计算机上对序列5评分。这一方法改善拣取远端相关匹配的能力，并且尤其耐受小间隙和核苷酸序列错误。可使用核酸编码的氨基酸序列来搜索蛋白和DNA数据库。

术语“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用。

如所属领域已知，“RAGE”蛋白为“晚期糖基化终产物受体”。代表性RAGE蛋白描述于图1A-1C中。RAGE蛋白包括可溶性RAGE(sRAGE)和内源性分泌型RAGE(esRAGE)。内源性分泌型RAGE为在细胞外释放的RAGE剪接变体，其中其能够结合AGE配体且中和AGE作用。例如，参看小山(Koyama)等人，ATVE，2005；25：2587-2593。已观察到人类血浆esRAGE与代谢综合症的若干组分(BMI、胰岛素抵抗、BP、高甘油三酯血症和IGT)之间呈反向相关。血浆esRAGE含量也已与患有或未患有糖尿病的个体的颈动脉和股动脉粥样硬化呈反向相关(通过超声波定量)。此外，经血管造影证实患有冠状动脉疾病的非糖尿病患者体内的血浆esRAGE含量明显低于年龄相当的健康对照。

“晚期糖基化终产物受体配体结合元件”或“RAGE-LBE”(在本文中也称为“RAGE-Fc”和“RAGE-strep”)包括跨膜RAGE多肽的任何细胞外部分和其保留结合RAGE配体的能力的片段。此术语也涵盖与RAGE多肽(例如，将结合RAGE配体或RAGE-BP的人类或鼠科多肽)具有至少85％一致性、优选至少90％一致性或更优选至少95％一致性的多肽。

“晚期糖基化终产物受体结合搭配物”或“RAGE-BP”包括在生理学环境中结合RAGE蛋白(受体多肽，诸如RAGE或RAGE-LBE)的细胞外部分的任何物质(例如，多肽、小分子、碳水化合物结构等)。

“RAGE相关病症”包括受影响细胞或组织展现RAGE或者一种或多种RAGE配体的表达和/或活性的增加或降低的任何病症。RAGE相关病症还包括可通过降低RAGE功能(例如，包括投与破坏RAGE：RAGE-BP相互作用的药剂)进行治疗(即，可消除或改善一种或多种症状)的任何病症。

“RAGE的V结构域”是指如尼普(Neeper)等人的＂RAGE的克隆和表达：蛋白晚期糖基化终产物的细胞表面受体(Cloning and expression of RAGE：a cell surface receptorfor advanced glycosylation end products of proteins)＂，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267：14998-15004(1992)(所述文献的内容是以引用的方式并入本文中)的图5中所示的免疫球蛋白样可变结构域。V结构域包括如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3中所示的第1位到第120位的氨基酸。

人类RAGE的cDNA具有1406个碱基对且编码具有404个氨基酸的成熟蛋白。参看尼普等人，1992的图3。

术语“重组核酸”包括包含至少两个在自然界中不会一起出现的序列的任何核酸。可在活体外例如通过使用分子生物学方法来产生重组核酸，或在活体内例如通过同源或非同源重组在新颖染色体位置处插入核酸，从而产生重组核酸。

关于个体的术语“治疗”是指改善所述个体的疾病或病症的至少一种症状。治疗可为治愈疾病或病况或者改善疾病或病况。

术语“载体”是指能够转运所连接的另一核酸的核酸分子。一类载体为附加体，即能够染色体外复制的核酸。另一类载体为整合载体，其是设计成与宿主细胞的遗传物质重组。载体可自主复制且可整合，并且载体的特性可视细胞环境而不同(即，载体可在一种宿主细胞类型中自主复制且在另一宿主细胞类型中完全整合)。能够引导可操作地连接的可表达核酸的表达的载体在本文中称为“表达载体”。

“特异性免疫反应性”是指当抗体与特定肽序列相互作用时，化合物[抗体]与特定肽序列的优先结合。

如本文所使用，短语“有效量”意谓在动物体内有效产生某种所需作用的一种或多种药剂、材料或包含一种或多种本发明药剂的组合物的量。应理解，当使用一种药剂来实现治疗作用时，包含“有效量”的实际剂量将视多种条件而变化，包括所治疗的特定病况、疾病的严重程度、患者的体格和健康情况、投药途径等。医药从业人员可使用医药技术领域中众所周知的方法容易地确定适当剂量。

短语“医药学上可接受”在本文中用于指在合理的医学判断范围内、适于与人类和动物组织接触使用而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症、与合理的效益/风险比相符的化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文所使用，短语“医药学上可接受的载剂”意谓涉及将标的药剂从一个器官或身体的一部分载运或转运到另一器官或身体的一部分的医药学上可接受的材料、组合物或媒剂，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。从与调配物中的其它成分可相容的意义上说，各载剂必须为“可接受的”。可用作医药学上可接受的载剂的材料的一些实例包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末状黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原质水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液(Ringer′ssolution)；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)用于医药调配物中的其它无毒可相容物质。

单克隆抗体的制备

可用全长蛋白或其片段或编码全长蛋白或其片段的cDNA(肽的免疫原形式)使哺乳动物(诸如小鼠、大鼠、仓鼠或兔)免疫。用于赋予蛋白或肽免疫原性的技术包括与载体连结或所属领域中众所周知的其它技术。可在存在佐剂的情况下投与多肽的免疫原性部分。可通过检测血浆或血清中的抗体效价来监测免疫的进展。可利用免疫原作为抗原，使用标准ELISA或其它免疫检定来评定抗体含量。

在用标的多肽的抗原制剂使动物免疫后，可获得抗血清，并且在必要时可从血清中分离多克隆抗体。为产生单克隆抗体，可从经免疫动物采集产生抗体的细胞(淋巴细胞)，并且通过标准体细胞融合程序将其与永生化细胞(诸如骨髓瘤细胞)融合以得到杂交瘤细胞。所属领域中众所周知所述技术，且其例如包括杂交瘤技术(最初是由柯勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)，(1975)自然，256：495-497提出)、人类B细胞杂交瘤技术(卡兹巴(Kozbar)等人(1983)，今日免疫学(Immunology Today)，4：72)和用于产生人类单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(柯尔(Cole)等人，(1985)单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss有限公司，第77-96页)。可通过免疫化学方法针对与RAGE多肽表位特异性反应的抗体以及从包含杂交瘤细胞的培养物分离的单克隆抗体的产生来筛选所述杂交瘤细胞。

人类化

嵌合抗体包含来自至少两个不同物种的序列。举一个实例，可使用重组克隆技术以包括来自非人类抗体(即，在经抗原免疫的非人类物种中制备的抗体)的可变区(其含有抗原结合位点)和来源于人类免疫球蛋白的恒定区。

人类化抗体是一类嵌合抗体，其中负责抗原结合的可变区残基(即，缩写为互补决定区的互补决定区残基，或参与抗原结合的任何其它残基)是来源于非人类物种，而剩余可变区残基(即框架区残基)和恒定区至少部分来源于人类抗体序列。人类化抗体的一小组框架区残基和恒定区残基可来源于非人类来源。人类化抗体的可变区也被描述为人类化(即，人类化轻链或重链可变区)。非人类物种通常为用于利用抗原免疫的物种，诸如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物或其它非人类哺乳动物物种。人类化抗体的免疫原性通常低于传统的嵌合抗体并且在投与人类后展现改善的稳定性。例如，参看本因克萨(Benincosa)等人(2000)，药理学和实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，292：810-6；卡罗芳斯(Kalofonos)等人(1994)，欧洲癌症杂志(Eur.J.Cancer)，30A：1842-50；萨伯拉曼尼安(Subramanian)等人(1998)，儿科传染病杂志(Pediatr.Infect.Dis.J.)，17：110-5。

互补决定区(CDR)为参与抗原结合的抗体可变区的残基。用于标识CDR的若干编号系统同样适用。卡贝特界定(Kabat definition)是基于序列可变性，且齐罗夏界定(Chothia definition)是基于结构环区的位置。AbM界定为卡贝特方法与齐罗夏方法之间的折衷。根据卡贝特、齐罗夏或AbM算法，通过第24位和第34位(CDR1-L)、第50位和第56位(CDR2-L)以及第89位和第97位(CDR3-L)残基限定轻链可变区CDR的边界。根据卡贝特界定，通过第31位和第35B位(CDR1-H)、第50位和第65位(CDR2-H)以及第95位和第102位(CDR3-H)(根据卡贝特进行编号)残基限定重链可变区的CDR的边界。根据齐罗夏界定，通过第26位和第32位(CDR1-H)、第52位和第56位(CDR2-H)以及第95位和第102位(CDR3-H)(根据齐罗夏进行编号)残基限定重链可变区的CDR的边界。根据AbM界定，通过第26位和第35B位(CDR1-H)、第50位和第58位(CDR2-H)以及第95位和第102位(CDR3-H)(根据卡贝特进行编号)残基限定重链可变区的CDR的边界。参看马丁(Martin)等人(1989)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86：9268-9272；马丁(Martin)等人(1991)酶方法(Methods Enzymol.)203：121-153；佩德森(Pedersen)等人(1992)免疫方法(Immunomethods)1：126；和芮斯(Rees)等人(1996)斯腾伯格M.J.E.(Sternberg M.J.E.)(编)，蛋白结构预测(Protein Structure Prediction)，牛津大学出版社(Oxford UniversityPress)，牛津(Oxford)，第141-172页。

如本文所使用，术语“CDR”是指如卡贝特或齐罗夏所界定的CDR；此外，可构筑本发明的人类化抗体可变区以包含一个或多个如卡贝特所界定的CDR，且也包含一个或多个如齐罗夏所界定的CDR。

特异性决定区(SDR)为直接与抗原相互作用的CDR内的残基。SDR对应于高变残基。参看(帕德兰(Padlan)等人(1995)美国实验生物学联合会会志(FASEB J.)9：133-139)。

框架残基为除高变或CDR残基外的抗体可变区的残基。框架残基可来源于天然存在的人类抗体，诸如实质上类似于本发明的抗RAGE抗体的框架区的人类框架。也可使用呈现个别序列间的一致性的人工框架序列。当选择框架区以供人类化时，人类中广泛呈现的序列可优于较不常见的序列。可对人类框架受体序列进行额外突变以恢复据悉涉及抗原接触的鼠科残基和/或涉及抗原结合位点的结构完整性的残基，或改善抗体表达。可使用肽结构预测来分析人类化可变重链和轻链区序列，从而鉴别并避免由人类化设计引入的翻译后蛋白修饰位点。

可使用包括镶饰(veneering)、互补决定区(CDR)移植、缩短的CDR的移植、特异性决定区(SDR)移植和弗兰肯斯坦组装(Frankenstein assembly)(如下文所述)在内的多种方法中的任一种来制备人类化抗体。人类化抗体还包括超人类化抗体，其中已在CDR中引入一种或多种改变。举例来说，可用人类残基取代CDR中的非人类残基。可将这些常用方法与标准诱变以及合成技术组合以产生具有任何所需序列的抗RAGE抗体。

镶饰是基于通过用人类氨基酸序列对抗体的溶剂可达外部进行表面重塑来减少啮齿动物或其它非人类抗体中的潜在免疫原性氨基酸序列的观念。因此，经镶饰抗体相对于人类细胞似乎比未经修饰的非人类抗体具有较少外来性。参看帕德兰(1991)，分子免疫学(Mol.Immunol.)28：489-98。通过鉴别非人类抗体中暴露的外部框架区残基(其不同于人类抗体框架区的相同位置处的残基)且用通常占据人类抗体的这些相同位置的氨基酸置换所述经鉴别的残基来镶饰非人类抗体。

CDR移植是通过用供体抗体(例如非人类抗体)的CDR置换受体抗体(例如，人类抗体或包含所需框架残基的其它抗体)的一个或多个CDR来进行。可基于候选受体抗体与供体抗体之间框架残基的相似性来选择受体抗体。举例来说，根据弗兰肯斯坦方法，将人类框架区鉴别为具有与相关非人类抗体的各框架区实质同源的序列，并且将所述非人类抗体的CDR移植到不同人类框架区的复合物上。同样适用于制备本发明抗体的相关方法描述于美国专利申请公开案第2003/0040606号中。

缩短的CDR的移植为一种相关方法。缩短的CDR包括特异性决定残基和相邻氨基酸，包括轻链第27d-34位、第50-55位和第89-96位的氨基酸以及重链第31-35b位、第50-58位和第95-101位的氨基酸(根据(卡贝特等人(1987))的编号惯例)。参看(帕德兰(Padlan)等人(1995)美国实验生物学联合会会志(FASEB J.)9：133-9)。特异性决定残基(SDR)移植是依据以下理解：抗体组合位点的结合特异性和亲和力是由各互补决定区(CDR)内最高度可变的残基来决定。可使用抗体-抗原复合物的三维结构分析以及可用氨基酸序列数据分析，以基于CDR内各位置处存在的氨基酸残基的结构差异建立序列可变性模型。将SDR鉴别为由接触残基组成的具有最小免疫原性的多肽序列。参看帕德兰(Padlan)等人(1995)美国实验生物学联合会会志(FASEB J.)9：133-139。

用于CDR或缩短的CDR的移植的受体框架可经进一步修饰以引入所需残基。举例来说，受体框架可包含人类亚群I一致序列的重链可变区，视情况以及在第1位、第28位、第48位、第67位、第69位、第71位和第93位中的一个或多个位置处的非人类供体残基。另举例来说，人类受体框架可包含人类亚群I一致序列的轻链可变区，视情况以及在第2位、第3位、第4位、第37位、第38位、第45位和第60位中的一个或多个位置处的非人类供体残基。移植后，可在供体和/或受体序列中进行其它改变以使抗体结合和功能性最优化。例如，参看PCT国际公开案第WO 91/09967号。

可用于制备人类化抗RAGE抗体的重链可变区的人类框架包括以下框架残基：DP-75、DP54、DP-54FW VH 3 JH4、DP-54 VH3 3-07、DP-8(VH1-2)、DP-25、VI-2b和VI-3(VH1-03)、DP-15和V1-8(VH1-08)、DP-14和V1-18(VH1-18)、DP-5和V1-24P(VH1-24)、DP-4(VH1-45)、DP-7(VH1-46)、DP-10、DA-6和YAC-7(VH1-69)、DP-88(VH1-e)、DP-3和DA-8(VH1-f)。

可用于制备人类化抗RAGE抗体的轻链可变区的人类框架包括人类生殖系克隆DPK24、DPK-12、DPK-9 Vk1、DPK-9 Jk4、DPK9 Vk1 02以及生殖系克隆亚群V_KIII和V_KI的框架残基。DPK24生殖系的以下突变可增加抗体表达：F10S、T45K、I63S、Y67S、F73L和T77S。

本发明的代表性人类化抗RAGE抗体包括具有一个或多个具有选自SEQ IDNO：16-27的可变区氨基酸序列的CDR的抗体。举例来说，人类化抗RAGE抗体可包含两个或两个以上CDR，其选自具有SEQ ID NO：16、18、21、24、20和26中任一者的重链可变区或者SEQ ID NO：17、19、22、25、23和27中任一者的轻链可变区的CDR。人类化抗RAGE抗体还可包含重链，其包含具有两个或三个具SEQ ID NO：16、18、21、24、20和26中任一者的CDR的可变区；和轻链，其包含具有两个或三个具SEQ ID NO：17、19、22、25、23和27中任一者的CDR的可变区。

可构筑本发明的人类化抗RAGE抗体，其中第一链的可变区(即，轻链可变区或重链可变区)经人类化，且其中第二链的可变区(即，在非人类物种中产生的抗体的可变区)未经人类化。这些抗体为一类称为半人类化抗体的人类化抗体。

嵌合和人类化抗RAGE抗体的恒定区可来源于IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和其任何同型(例如，IgG的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型)中任一者的恒定区。已知许多抗体恒定区的氨基酸序列。人类同型的选择以及同型中特定氨基酸的修饰可增强或消除宿主防御机制的活化并改变抗体生物分布。参看(雷夫(Reff)等人(2002)癌症控制(CancerControl)9：152-66)。为克隆编码免疫球蛋白恒定区的序列，可使内含子序列缺失。

可使用所属领域已知的标准技术构筑嵌合和人类化抗RAGE抗体。举例来说，可通过使编码可变区的重叠寡核苷酸在一起退火且将其连接到含有人类抗体恒定区的表达载体中来制备可变区。例如，参看哈洛(Harlow)和雷因(Lane)(1988)抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，冷泉港实验出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约(New York)；以及美国专利第4,196,265号、第4,946,778号、第5,091,513号、第5,132,405号、第5,260,203号、第5,677,427号、第5,892,019号、第5,985,279号、第6,054,561号。举例来说，可如PCT国际公开案第WO 02/096948号中所述来制备四价抗体(H₄L₄)，其包含两个完整的四聚体抗体(包括均二聚体和杂二聚体)。也可经由将促进链间二硫键形成的半胱氨酸残基引入抗体恒定区中；利用异型双功能交联剂(沃尔夫(Wolff)等人(1993)癌症研究(Cancer Res.)53：2560-5)；或通过重组产生以包括两个恒定区(史蒂芬孙(Stevenson)等人(1989)抗癌药物研究(Anticancer Drug Des.)3：219-30)来制备抗体二聚体。例如，可通过表达截短的抗体序列或通过全长抗体的翻译后消化来制备本发明抗体的抗原结合片段。

可容易地制备本发明的抗RAGE抗体的变体以使其包括各种改变、取代、插入和缺失。举例来说，可在用于抗体表达的细胞类型中关于密码子用法优化抗体序列。为增加抗体的血清半衰期，可将补救受体结合表位并入(如果尚不存在)抗体重链序列中。参看美国专利第5,739,277号。用于增强抗体稳定性的其它修饰包括用脯氨酸置换残基241处的丝氨酸来修饰IgG4。参看安格(Angal)等人(1993)分子免疫学(Mol.Immunol.)30：105-108。其它有用的改变包括视需要进行取代以使抗体与药物的连结效率最佳。举例来说，可对抗体的羧基末端进行修饰以使其包括供药物连接的氨基酸，例如可添加一个或多个半胱氨酸残基。可对恒定区进行修饰以引入供碳水化合物或其它部分结合的位点。

其它抗体变体包括引起功能特性改善的糖基化同功异型物。举例来说，Fc糖基化的修饰可引起效应功能的改变，例如增加与Fcγ受体的结合和改善ADCC，和/或可降低Clq结合和CDC(例如，将Fc寡糖从复合形式变为高甘露糖或杂合类型可降低Clq结合和CDC)(例如，参看康达(Kanda)等人，糖生物学(Glycobiology)，2007：17：104-118)。可通过生物工程改造细菌、酵母、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞进行修饰；还可通过操控经基因工程改造的有机体中的蛋白或天然产物糖基化路径来进行修饰。也可通过利用使糖连接酶(糖基转移酶)耐受多种不同底物的自由来改变糖基化。最后，所属领域的技术人员可通过多种化学方法使蛋白和天然产物糖基化：利用小分子、酶、蛋白连接、代谢生物工程改造或总体合成。N-聚糖加工的适当小分子抑制剂的实例包括栗精胺(Castanospermine，CS)、Kifunensine(KF)、脱氧甘露糖野尻霉素(Deoxymannojirimycin，DMJ)、苦马豆素(Swainsonine，Sw)、莫能霉素(Monensin，Mn)。

可使用包括定点诱变或重组克隆的标准重组技术来产生本发明的抗RAGE抗体的变体。可在转基因非人类动物中经由基因配置和基因转化方法(美国专利公开案第2003/0017534号)来制备抗RAGE抗体的多样化谱系，随后使用功能检定来测试其相关活性。在本发明的特定实施例中，使用有关使CDR突变(杨(Yang)等人(1995)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)254：392-403)、链改组(麦克斯(Marks)等人(1992)生物技术(纽约)(Biotechnology(NY))10：779-783)、使用大肠杆菌(E.coli)的增变菌株(罗(Low)等人(1996)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)260：359-368)、DNA改组(派顿(Patten)等人(1997)生物技术近期述评(Curr.Opin.Biotechnol.)8：724-733)、噬菌体呈现(辛普森(Thompson)等人(1996)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)256：77-88)和性别PCR(克拉梅利(Crameri)等人(1998)自然391：288-291)的亲和力成熟方案获得变体。对于免疫疗法应用来说，相关功能检定包括特异性结合人类RAGE抗原、抗体内化，和对荷瘤动物投药时靶向肿瘤部位(如下文所述)。

本发明另外提供表达本发明的抗RAGE抗体的细胞和细胞系。代表性宿主细胞包括哺乳动物和人类细胞，诸如CHO细胞、HEK-293细胞、HeLa细胞、CV-1细胞和COS细胞。所属领域中已知将异源构筑体转化到宿主细胞中后产生稳定细胞系的方法。代表性非哺乳动物宿主细胞包括昆虫细胞(伯特(Potter)等人(1993)国际免疫学评述(Int.Rev.Immunol.)10(2-3)：103-112)。也可在转基因动物(乌德宾(Houdebine)(2002)生物技术近期述评(Curr.Opin.Biotechnol.)13(6)：625-629)和转基因植物(斯蒂尔伯格(Schillberg)等人(2003)细胞与分子生命科学(Cell Mol.Life Sci.)60(3)：433-45)中产生抗体。

如上文所论述，已例如通过缺失、添加或取代抗体其它部分(例如恒定区)而修饰的单克隆、嵌合和人类化抗体也在本发明的范围内。举例来说，可如下对抗体加以修饰：(i)通过缺失恒定区；(ii)通过用另一恒定区(例如用于增加抗体半衰期、稳定性或亲和力的恒定区，或来自另一物种或另一类别的恒定区)置换所述恒定区；或(iii)通过修饰恒定区中的一个或多个氨基酸以例如改变糖基化位点数目、效应细胞功能、Fc受体(FcR)结合、补体结合等。

所属领域中已知用于改变抗体恒定区的方法。可通过用不同残基置换抗体恒定部分中的至少一个氨基酸残基来产生功能改变(例如，对效应配体(诸如细胞上的FcR或补体的C1组分)的亲和力改变)的抗体(例如，参看EP 388,151 A1、US 5,624,821和US5,648,260，所述专利文献的所有内容都是以引用的方式并入本文中)。也可描述其它类型的改变，如果将其应用于鼠科或其它物种，那么免疫球蛋白将减少或消除这些功能。

举例来说，可能通过用侧链具有适当官能性的残基置换特定残基，或通过引入带电官能团(诸如谷氨酸或天冬氨酸)或可能芳族非极性残基(诸如，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或丙氨酸)来改变抗体(例如，IgG，诸如人类IgG)Fc区对FcR(例如FcγR1)或Clq结合的亲和力(例如，参看US 5,624,821)。

可将抗体或其结合片段与细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子连结。在一个实施例中，经连结蛋白为抗体或其片段。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何药剂。非限制性实例包括刺孢霉素(calicheamicin)、紫杉酚(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasinB)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素C(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)、嘌呤霉素(puromycin)和其类似物或同系物。治疗剂包括(但不限于)抗代谢物(例如甲氨喋呤(methotrexate)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、氨烯咪胺(decarbazine))、烷化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、塞替派(thioepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法兰(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)和罗莫司丁(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链唑霉素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycin C)和顺-二氯二胺铂(cis-dichlorodiamine platinum(II)(DDP)，(顺铂(cisplatin))、蒽环类(例如柔红霉素(daunorubicin)和阿霉素(doxorubicin))、抗生素(例如更生霉素(dactinomycin)、博来霉素(bleomycin)、光辉霉素(mithramycin)和安曲霉素(anthramycin))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))。用于将所述部分与蛋白连结的技术已在所属领域中众所周知。

另外，现可能产生在免疫后能够在无内源免疫球蛋白产生的情况下产生完全人类抗体谱系的转基因动物(例如，小鼠)。举例来说，已描述在嵌合和生殖系突变小鼠中纯合性缺失抗体重链连接(JM)基因会导致内源抗体产生的完全抑制。在所述生殖系突变小鼠中转入人类生殖系免疫球蛋白基因阵列将在抗原激发后导致产生人类抗体。例如，参看雅克博维次(Jackobovits)等人，美国国家科学院院刊，90：2551(1993)；雅克博维次等人，自然，362：255-258(1993)；布鲁格曼(Bruggermann)等人，免疫年刊(Year in Immune)，7：33(1983)；和杜奇索(Duchosal)等人自然355：258(1992)。人类抗体还可来源于噬菌体展示文库(霍根伯姆(Hoogenboom)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)227：381(1991)；麦克斯(Marks)等人，分子生物学杂志，222：581-597(1991)；沃汉(Vaughan)等人，自然生物技术(Nature Biotech)14：309(1996))。

在某些实施例中，本发明的抗体可与作为组合疗法的一部分的其它药剂组合投与。举例来说，在发炎性病况的情况下，可将标的抗体与一种或多种可用于治疗发炎性疾病或病况的其它药剂组合投与。在心血管疾病病况且尤其由动脉粥样硬化斑块(认为其具有实质发炎性组分)引起的疾病病况的情况下，可将标的抗体与一种或多种可用于治疗心血管疾病的其它药剂组合投与。在癌症的情况下，可将标的抗体与一种或多种抗血管生成因子、化疗剂组合投与或作为放射疗法的佐剂投与。另外，预期投与标的抗体将充当可能组合多种不同癌症治疗剂的癌症治疗方案的一部分。在IBD的情况下，可将标的抗体与一种或多种消炎剂组合投与，并且可将其另外与经修改的饮食方案组合。

用于抑制RAGE-LBE与RAGE-BP之间的相互作用的方法

本发明包括用于抑制RAGE与RAGE-BP之间的相互作用或调节RAGE活性的方法。优选将所述方法用于治疗RAGE相关病症。

所述方法可包含投与如本文所揭示的针对RAGE的抗体。所述方法包含投与一种特异性结合RAGE蛋白的一个或多个表位的抗体，所述RAGE蛋白具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13中所述的氨基酸序列。在另一实施例中，所述方法包含投与抑制RAGE与一个或多个RAGE-BP结合的化合物。下文讨论鉴别所述化合物的例示性方法。

在某些实施例中，在活体外抑制诸如包含经纯化蛋白、细胞、生物样本、组织、人工组织等的反应混合物中的相互作用。在某些实施例中，在活体内例如通过投与结合RAGE或其RAGE结合片段的抗体来抑制相互作用。所述抗体或其片段结合RAGE并抑制RAGE-BP的结合。

本发明包括通过抑制RAGE与RAGE-BP的相互作用或者调节RAGE活性来预防或治疗RAGE相关病症的方法。所述方法包括将有效抑制所述相互作用的量的抗体投与RAGE且历时足以预防或治疗所述病症的时间。

核酸

核酸为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其单链、双链或三联体形式的聚合物。除非特别限定，否则核酸可含有已知的具有与参考天然核酸类似的特性的天然核苷酸的类似物。核酸包括基因、cDNA、mRNA和cRNA。可合成核酸，或者核酸可来源于任何生物来源，包括任何有机体。

本发明的代表性核酸包含编码SEQ ID NO：6、8、10、12(与所揭示的编码狒狒、食蟹猴和兔的RAGE的cDNA对应)中任一者所示或SEQ ID NO：15(与编码狒狒RAGE的基因组DNA序列对应)中所示的RAGE的核苷酸序列。本发明的核酸还包含编码SEQID NO：16-49中所示的任一抗体可变区氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明的核酸还可包含与SEQ ID NO：6、8、10、12和15中任一者实质上一致的核苷酸序列，包括与SEQ ID NO：6、8、10、12和15中任一者至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％一致的核苷酸序列。

本发明的核酸还可包含编码RAGE蛋白的核苷酸序列，所述RAGE蛋白具有与SEQID NO：7、9、11和13中所示的任一氨基酸序列实质上一致的氨基酸序列，所述核苷酸序列包括与SEQ ID NO：7、9、11和13中任一者至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％一致的核苷酸序列。

本发明的核酸还可包含编码抗RAGE抗体可变区的核苷酸序列，所述可变区具有与SEQ ID NO：16-49中所示的任一氨基酸序列实质上一致的氨基酸序列，所述核苷酸序列包括编码与SEQ ID NO：16-49中任一者至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％一致的氨基酸序列的核苷酸序列。

使用序列比较算法，使用编码SEQ ID NO：16-49中任一者的序列的全长可变区(即，编码具有SEQ ID NO：16-49中所示的任一序列的全长可变区的核苷酸序列)作为询探序列(如下文所述)或通过目测来比较序列以得到最大对应性。

实质上一致的序列可为多形序列，即可选序列或等位基因群集。等位基因差异可小至一个碱基对。实质上一致的序列也可包含诱变序列，包括包含沉默突变的序列。突变可包含一个或多个残基改变、一个或多个残基缺失或者一个或多个额外残基插入。

也将实质上一致的核酸鉴别为在严格条件下与SEQ ID NO：6、8、10、12或15中任一者的全长，或编码SEQ ID NO：7、9、11和13中所示的RAGE氨基酸序列的任何核苷酸序列的全长，或编码SEQ ID NO：16-49中所示的抗体可变区氨基酸序列的任何核苷酸序列的全长特异性杂交或实质上杂交的核酸。在核酸杂交的情况下，所比较的两个核酸序列可称为探针和标靶。探针为参考核酸分子，且标靶为测试核酸分子，通常见于异源核酸分子群内。标靶序列与测试序列同义。

对于杂交研究来说，有用探针与本发明核酸分子的至少约14到40个核苷酸序列互补或模拟本发明核酸分子的至少约14到40个核苷酸序列。优选探针包含14到20个核苷酸或必要时甚至更长核苷酸，诸如SEQ ID NO：6、8、10、12或15中任一者的30、40、50、60、100、200、300或500个核苷酸或多达其全长，或者编码SEQ ID NO：7、9、11和13中所示的RAGE氨基酸序列的任何核苷酸序列的全长，或编码SEQ ID NO：16-49中所示的抗体可变区氨基酸序列的任何核苷酸序列的全长。可易于例如通过片段的化学合成、通过应用核酸扩增技术或通过将所选序列引入供重组制备的重组载体中来制备所述片段。

特异性杂交是指当特定核苷酸序列存在于复杂核酸混合物(例如，全细胞DNA或RNA)中时，在严格条件下分子仅与所述序列结合、形成双链体或杂交。特异性杂交可视杂交条件的严格度而接受探针与靶序列之间的错配。

在诸如Southern和Northern印迹分析等核酸杂交实验的情况下，严格杂交条件和严格杂交洗涤条件具有序列和环境依赖性。较长序列在较高温度下特异性杂交。有关核酸杂交的深入指导见于迪积森(Tijssen)(1993)利用核酸探针的生物化学和分子生物学杂交的实验室技术(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic AcidProbes)，第I部分第2章，爱思唯尔(Elsevier)，纽约州纽约(New York，New York)。一般来说，所选的高度严格杂交和洗涤条件比在指定离子强度和pH值下特定序列的热熔点(T_m)低约5℃。通常，在严格条件下，探针将与其标靶序列而非其它序列特异性杂交。

T_m为50％标靶序列与良好匹配的探针杂交的温度(在指定离子强度和pH值下)。所选的极为严格的条件等于特定探针的T_m。具有超过约100个互补残基的互补核酸的Southern或Northern印迹分析的严格杂交条件的实例为在42℃下在50％甲酰胺和1mg肝素中杂交整夜。高度严格洗涤条件的实例为在65℃下在0.1×SSC中15分钟。严格洗涤条件的实例为在65℃下在0.2×SSC缓冲液中15分钟。有关SSC缓冲液的描述，参看萨布鲁克(Sambrook)等人编(1989)分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约(New York)。通常，在低严格度洗涤去除背景探针信号后进行高严格度洗涤。具有超过约100个核苷酸的双链体的中等严格度洗涤条件的实例为在45℃下在1×SSC中15分钟。具有超过约100个核苷酸的双链体的低严格度洗涤条件的实例为在40℃下在4×SSC到6×SSC中15分钟。对于短探针(例如，约10到50个核苷酸)，严格条件通常涉及在pH7.0-8.3下小于约1M Na⁺离子、通常为约0.01到1M Na⁺离子浓度(或其它盐)的盐浓度，且温度通常为至少约30℃。严格条件也可通过添加去稳定剂(诸如甲酰胺)来达到。一般来说，信杂比为在特定杂交检定中所观察的不相关探针的2倍(或更高)表明检测到特异性杂交。

以下为可用于鉴别与本发明的参考核苷酸序列实质上一致的核苷酸序列的杂交条件和洗涤条件的实例：探针核苷酸序列优选与标靶核苷酸序列在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中杂交，随后在50℃下在2×SSC、0.1％SDS中洗涤；更优选，探针与标靶序列在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中杂交，随后在50℃下在1×SSC、0.1％SDS中洗涤；更优选，探针与标靶序列在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中杂交，随后在50℃下在0.5×SSC、0.1％SDS中洗涤；更优选，探针与标靶序列在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中杂交，随后在50℃下在0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤；更优选，探针与标靶序列在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄、1mM EDTA中杂交，随后在65℃下在0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤。

两个核酸序列实质上一致的另一指示为由所述核酸编码的蛋白实质上一致、共有整个三维结构或为生物功能等效物。这些术语将在下文进一步定义。如果相应蛋白实质上一致，那么在严格条件下彼此不杂交的核酸分子也实质上一致。举例来说，当两个核酸序列包含如遗传密码所允许的保守取代变体时，可能出现这种情形。

保守取代变体为具有简并密码子取代的核酸序列，其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三个位置经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代。参看贝泽尔(Batzer)等人(1991)核酸研究(Nucleic Acids Res.)19：5081；大冢(Ohtsuka)等人(1985)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)260：2605-2608；和罗西里尼(Rossolini)等人(1994)分子细胞探针(Mol.Cell Probes)8：91-98。

本发明的核酸还包含与SEQ ID NO：6、8、10、12或15中任一者互补的核酸，或编码SEQ ID NO：7、9、11和13中所示的RAGE氨基酸序列的核苷酸序列，或编码SEQ IDNO：16-49中所示的抗体可变区氨基酸序列的核苷酸序列和其互补序列。互补序列为包含在碱基对间形成氢键后能够彼此配对的反向平行核苷酸序列的两个核苷酸序列。如本文所使用，术语互补序列意谓如可通过下文所述的相同核苷酸比较方法评定的实质上互补的核苷酸序列，或是定义为能够与所论及的核酸区段在相对严格的条件(诸如本文所述的条件)下杂交。互补核酸区段的特定实例为反义寡核苷酸。

子序列为包含较长核酸序列的一部分的核酸序列。例示性子序列为上文所述的探针或引物。如本文所使用，术语引物是指包含所选核酸分子的约8个或8个以上脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、优选10-20个核苷酸且更优选20-30个核苷酸的邻近序列。本发明的引物涵盖具有足够长度和适当序列的寡核苷酸，从而使本发明核酸分子的聚合起始。

延长序列包含并入核酸中的其它核苷酸(或其它类似分子)。举例来说，聚合酶(例如DNA聚合酶)可在核酸分子的3′末端添加序列。此外，核苷酸序列也可与其它DNA序列(诸如启动子、启动子区、增强子、聚腺苷酸化信号、内含子序列、其它限制酶位点、多克隆位点和其它编码区段)组合。因此，本发明也提供包含所揭示的核酸的载体，包括用于重组表达的载体，其中本发明的核酸可操作地连接到功能性启动子。当与核酸可操作地连接时，启动子为与核酸的功能性组合，以致核酸的转录受启动子区控制和调控。载体是指能够在宿主细胞中复制的核酸，诸如质粒、柯斯质粒(cosmid)和病毒载体。

本发明的核酸可经克隆、合成、改变、诱变或其组合。所属领域中已知用于分离核酸的标准重组DNA和分子克隆技术。用于产生碱基对改变、缺失或小插入的位点特异性诱变也为所属领域中已知。例如，参看萨布鲁克(Sambrook)等人(编)(1989)分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约(New York)；希尔哈维(Silhavy)等人(1984)基因融合实验(Experiments with Gene Fusions.)冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约；格洛弗(Glover)和珀斯(Hames)(1995)DNA克隆：实用方法(DNA Cloning：A Practical Approach)，第2版牛津大学出版社IRL出版(IRL Press at OxfordUniversity Press)，牛津/纽约(Oxford/New York)；阿苏贝尔(Ausubel)(编)(1995)分子生物学短方案(Short Protocols in Molecular Biology)，第3版威利(Wiley)编，纽约。

预防和治疗方法

本发明提供一种治疗患有以Aβ淀粉样沉积物为特征的疾病或病症(诸如阿兹海默氏病)的个体的方法，其包含对个体投与治疗有效量的特异性结合RAGE且抑制RAGE结合搭配物的结合的抗体。

本发明还提供一种抑制或减少个体Aβ淀粉样沉积物积累的方法，其包含对所述个体投与有效量的特异性结合RAGE且抑制RAGE结合搭配物的结合的抗体。本发明还包括一种抑制或减少个体神经退化的方法，其包含对所述个体投与有效量的特异性结合RAGE且抑制RAGE结合搭配物的结合的抗体。本发明另外包括一种抑制或降低个体认知能力下降或改善认知能力的方法，其包含对所述个体投与有效量的特异性结合RAGE且抑制RAGE结合搭配物的结合的抗体。本发明还提供一种治疗患有以淀粉样沉积物为特征的淀粉样蛋白生成疾病或病症的个体的方法，其包含投与治疗有效量的特异性结合RAGE且抑制RAGE结合搭配物的结合的抗体。

本发明提供一种治疗患有以Aβ淀粉样沉积物为特征的疾病或病症(诸如阿兹海默氏病)的个体的方法，其包含在个体体内产生有益治疗反应(例如，在患者体内降低斑块负荷、抑制斑块形成、减少神经营养不良，和改善认知功能，例如迅速改善认知能力和/或逆转、治疗或预防认知能力下降)的条件下对个体投与治疗有效量的特异性结合RAGE且抑制RAGE结合搭配物的结合的抗体。

脑部与Aβ淀粉样沉积物有关的疾病包括阿兹海默氏病、唐氏综合症和认知障碍。认知障碍可伴随出现或不出现其它淀粉样蛋白生成疾病的特征。

除在长期高血糖状态下形成的晚期糖基化终产物(AGE)外，RAGE的配体还包括具有β折叠原纤结构的蛋白(其为淀粉样沉积物和促炎性介质的特征)，包括β淀粉样蛋白(Aβ)、血清淀粉样蛋白(SAA)(纤维形式)、S100/钙粒蛋白(calgranulin)(例如，S100A12、S100B、S100A8-A9)和高迁移率族1染色体蛋白1(high mobility group box-1chromosomal protein，HMGB1，也称为两性霉素)。人们逐渐认识到RAGE在淀粉样蛋白生成疾病的病理进程中的作用。除引起阿兹海默氏病发病外，经证实RAGE还与脾中细胞应力和血清淀粉样蛋白A(SAA)的沉积密切相关(严(Yan)等人，2000，自然医学(Nature Med.)，6：643-51)。RAGE与肾脏中淀粉样蛋白积累和组织破坏关联，从而导致患有家族性淀粉样多发性神经病(FAP)的个体肾衰竭(松永(Matsunaga)等人，2005，斯堪的那维亚临床实验研究杂志(Scand.J.Clin.Lab.Invest.))。RAGE配体两性霉素(HMGB1)也含有淀粉样蛋白生成肽—一种与阿兹海默氏Aβ肽高度同源且当由天然蛋白释放时形成淀粉样肽的肽(科尔积域(Kallijarvi)等人，2001，生物化学(Biochem.)，40：10032-7)。

Aβ与血管壁中的含RAGE细胞的相互作用引起Aβ的跨血脑屏障(BBB)转运以及促炎性细胞因子和内皮素-1(ET-1)的表达，所述内皮素-1介导Aβ诱导的血管收缩。因此，本发明还提供减少Aβ诱导的血管收缩的方法。

已在阿兹海默氏样疾病的转基因小鼠模型中证实，抑制RAGE-配体相互作用将抑制脑实质中Aβ的积累(甸尼(Deane)等人，2003，自然医学(Nature Medicine)9：907-913)。RAGE在多种淀粉样蛋白生成疾病和病症中的主动、致病作用使得可能通过本发明的方法对患有这些淀粉样蛋白生成病症的患者提供治疗性有益治疗，所述方法提供特异性结合RAGE且抑制RAGE结合搭配物的结合的抗体。

本发明的方法可用于无症状患者和目前显现疾病症状的患者。用于所述方法中的抗体可为如本文所述的人类抗体、人类化抗体、嵌合抗体或非人类抗体，或其片段(例如，RAGE结合片段)。另一方面，本发明涉及投与由经Aβ肽免疫[假定其应为RAGE，但可能其应简单地缺失]的人类制备的抗体，所述人类可为将经抗体治疗的患者。本发明的方法可使用一种抗体进行，所述抗体：

(a)与选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体竞争与RAGE的结合；

(b)与结合选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体的RAGE的表位结合；

(c)包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体的轻链或重链的一个或多个互补决定区(CDR)；或

(d)为根据(a)、(b)或(c)的抗体的RAGE结合片段。

举例来说，可通过对个体投与抗体或RAGE结合抗体片段来进行本发明的方法，所述抗体或RAGE结合片段包含轻链可变区，其包含XT-M4轻链可变区(SEQ ID NO：17)的CDR；重链可变区，其包含XT-M4重链可变区序列(SEQ ID NO：16)的CDR；人类κ轻链恒定区；和人类IgG1重链恒定区。还可使用下述抗体或其RAGE结合片段来进行本发明的方法，所述抗体或其RAGE结合片段包含轻链可变区，其具有XT-M4轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)；重链可变区，其具有XT-M4重链可变区序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)；人类κ轻链恒定区；和人类IgG1重链恒定区。本文中描述可成功用于本发明方法中的这些和许多其它抗体的描述。

本发明的治疗剂通常实质上纯的，而无不需要的污染物。这意味着药剂通常至少约50％w/w(重量/重量)纯，且实质上不含干扰蛋白和污染物。有时，所述药剂至少约80％w/w纯且更优选至少90或约95％w/w纯。然而，使用常规蛋白纯化技术可获得至少99％w/w纯的均质肽。

本发明包括以医药组合物形式投与抗体和医药载剂。或者，可通过投与编码至少一条抗体链的聚核苷酸来对患者投与抗体。使所述聚核苷酸表达以在患者体内产生抗体链。聚核苷酸可编码抗体的重链和轻链。使聚核苷酸表达以在患者体内产生重链和轻链。在例示性实施例中，针对患者血液中所投与的抗体的含量来监测患者。

因此，本发明满足对用于预防或改善神经病理学以及一些患者的与阿兹海默氏病相关的认知障碍的治疗方案的长期需求。

减少认知能力下降和/或改善认知能力

本发明提供一种抑制或减少患有Aβ相关疾病或病症或淀粉样蛋白生成疾病或病症(例如AD)或者具有患所述疾病或病症的风险的患者的认知能力下降和/或改善其认知能力的方法，其包含对所述个体投与有效量的特异性结合RAGE且抑制RAGE结合搭配物的结合的抗体。

本发明涉及投与有效剂量的本发明抗体，从而实现认知能力下降的减少和/或认知能力的改善。举例来说，实现患者的一种或多种认知障碍(例如，过程学习和/或记忆障碍)的改善。认知障碍可为外显记忆(也称为“陈述性”记忆或“工作”记忆)障碍，其是定义为储存和重新取得有意识可用的特定信息并且因此可通过语言表达的能力(例如记起特定事实或事件的能力)。另外，认知障碍也可为程序记忆(也称为“内隐”记忆或“情境式”记忆)障碍，其是定义为获取、保留和重新取得有意识不可用的一般信息或知识且需要表达学习技能、关联、习惯或复杂反映的能力，例如记起如何执行一项特定任务的能力。罹患程序记忆障碍的个体正常活动的能力减弱的多。因此，有效改善程序记忆障碍的治疗将为特别需要且有益的。

适用治疗的患者

可通过本发明治疗的患者包括具有患Aβ相关疾病或病症或者淀粉样蛋白生成疾病或病症的风险但未显现症状的个体，以及目前显现症状的患者。在阿兹海默氏病的情况下，如果活的足够长久，那么实际上任何人都有罹患阿兹海默氏病的风险。因此，可对普通人群预防性地投与本发明的方法，而无需对目标患者的风险进行任何评定。

本发明的方法尤其适用于有AD风险的个体，例如展现AD风险因子的个体。AD的主要风险因子为年龄的增长。随着人群年龄的增长，AD的频率持续增加。当前的评估指出，超过65岁的人群中有多达10％患有AD且超过85岁的人群中有多达50％患有AD。

尽管罕见，但仍有某些个体可在年龄较轻时被鉴别为遗传上具有发展AD的倾向。可由完全证实的AD家族病史、已知当突变时引起AD的基因(例如APP或早老素基因)的分析来鉴别带有AD遗传形式的个体，称为“家族性AD”或“早发型AD”。良好表征的APP突变包括APP770密码子716和717处的“哈迪(Hardy)”突变(例如，缬氨酸⁷¹⁷突变为异亮氨酸(高特(Goate)等人(1991)，自然349：704)；缬氨酸⁷¹⁷突变为甘氨酸(查蒂尔(Chartier)等人(1991)自然353：844；默雷尔(Murrell)等人(1991)，科学254：97)；缬氨酸⁷¹⁷突变为苯丙氨酸(穆兰(Mullan)等人(1992)，自然—遗传学(NatureGenet.)1：345-7))、APP770密码子670和671处的“斯维蒂希(Swedish)”突变以及APP770密码子692处的“法兰德斯(Flemish)”突变。认为所述突变通过APP成为Aβ的加工、尤其将APP加工成增加量的长型Aβ(即Aβ1-42和Aβ1-43)的增加或改变来引起阿兹海默氏病。据悉，诸如早老素基因PS1和PS2等其它基因的突变会间接影响APP的加工，从而产生增加量的长型Aβ(参看哈迪(Hardy)，TINS 20：154(1997)；科瓦尔斯卡(Kowalska)等人，(2004)，波兰药理学杂志(Polish J.Pharmacol.)，56：171-8)。除AD外，APP的770个氨基酸同功异型物的氨基酸692或693处的突变已涉及脑淀粉样蛋白生成病症，称为遗传性脑出血伴Dutch型淀粉样变性病(Hereditary Cerebral Hemorrhagewith Amyloidosis of the Dutch-type，HCHWA-D)。

更常见的是，AD并非由患者遗传，而是因于各种遗传因素的复杂相互影响而发展。据悉，这些个体患有“散发性AD”(也称为“迟发型AD”)，即一种更难诊断的形式。尽管如此，可关于不会引起AD但已知以比一般群体高的频率与AD隔离的易感性等位基因或特性(例如载脂蛋白(apolipoprotein)E的ε2、ε3和ε4等位基因)的存在来筛选患者群体(科德(Corder)等人(1993)，科学，261：921-923)。具体来说，可将优选除AD的一些其它标记外还缺乏ε4等位基因的患者鉴别为具有患AD的“风险”。举例来说，可将有患AD或罹患高胆固醇血症或动脉粥样硬化症的亲属且缺乏ε4等位基因的患者鉴别为具有患AD的“风险”。另一潜在生物标记为脑脊髓液(CSF)Aβ42和τ含量的组合评定。低Aβ42和高τ含量为鉴别具有患AD的风险的患者的预测值。

具有患AD的风险的患者的其它指示包括活体内动态神经病理学数据，例如活体内检测脑β淀粉样蛋白、脑运动模式等。所述数据可使用例如三维磁共振成像(MRI)、正电子发射断层显像(PET)扫描和单光子发射计算机断层显像(SPECT)而获得。可能患AD的患者的指示包括(但不限于)患者(1)患有痴呆；(2)40-90岁；(3)例如两个或两个以上认知领域的认知障碍；(4)障碍进展超过6个月；(5)经镇静而清醒；和/或(6)无其它合理诊断。

然而，罹患散发性或家族性AD形式的个体通常是在呈现一个或多个AD特征症状后才被确诊。AD的常见症状包括影响常规技能或工作的执行的认知障碍、语言问题、时间或位置定向障碍、判断力较弱或降低、抽象思维障碍、运动控制丧失、情绪或行为改变、性格改变或缺乏能动性。患者所呈现的障碍的数目或认知障碍的程度通常反映疾病的进展程度。举例来说，患者可仅展现轻度认知障碍，因此患者展现记忆问题(例如情境式记忆)但仍能够良好活动。

本发明方法也适用于患有Aβ相关认知障碍(例如Aβ相关痴呆)的个体。具体来说，本发明方法尤其适用于患有由中枢神经系统(CNS)(例如，脑或CSF中)可溶性寡聚Aβ的存在引起或归因于所述存在的认知障碍或异常的个体。由Aβ引起或与Aβ有关的认知障碍也包括由以下引起或与以下相关的认知障碍：(1)脑中β淀粉样斑块的发展；(2)Aβ合成、加工、降解或清除的异常速率；(3)可溶性寡聚Aβ物质(例如，脑中)的形成或活性；和/或(4)异常Aβ形式的形成。不必在特定患者中建立Aβ异常与认知障碍的实际致病关联，但例如应通过上述AD标记中的一种来指示某种关联，以辨识罹患预期不会从Aβ免疫治疗剂治疗获益的非Aβ相关认知障碍的患者。

已开发若干种测试来评定人类个体(例如，有患痴呆症(例如AD)风险或具有痴呆症症状或病理学的个体)的认知技能或效能。可通过这些测试效能的削弱来鉴别认知障碍，并且已基于改善这些测试的效能的能力提出多种治疗。尽管一些工作已评估个体的行为或运动功能，但大部分工作仍设计成测试学习或记忆。

可使用包括(但不限于)以下测试的多种测试来评定人类的认知能力。ADAS-Cog(阿兹海默氏病评定量表-认知分量表)为需花费30分钟完成的11部分的测试。ADAS-Cog是一种优选的研究语言和记忆技能的简单测验。参看罗森(Rosen)等人(1984)美国精神病学杂志(Am J Psychiatry.)141(11)：1356-64；伊尔(Ihl)等人(2000)神经心理学(Neuropsychobiol.)41(2)：102-7；和维尔(Weyer)等人(1997)国际老年精神病学(IntPsychogeriatr.)9(2)：123-38。

布兰斯德测试(Blessed Test)是另一种评定日常生活和记忆、专心程度和定向活动的快速(约10分钟)认知测试。参看布兰斯德(Blessed)等人(1968)英国老年精神病学杂志(Br J Psychiatry)114(512)：797-811。

剑桥神经精神测试自动蓄电(Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery，CANTAB)是用于评定患有神经退化性疾病或脑损伤的人类的认知障碍。其是由13个相互关联的有关记忆、注意力和执行功能的计算机测试组成，并且经由个人计算机的触摸屏(touch sensitive screen)来投与。所述测试为语言与超文化测试，且经证实，其对阿兹海默氏病的早期检测和常规筛选极为灵敏。参看斯温森(Swainson)等人(2001)痴呆和老年认知病症(Dement Geriatr Cogn Disord.)；12：265-280；和傅雷(Fray)和罗宾斯(Robbins)(1996)神经毒理学和畸形学(Neurotoxicol Teratol.18(4)：499-504)；罗宾斯等人(1994)痴呆症(Dementia)5(5)：266-81。

阿兹海默氏病联合登录研究组织(Consortium to Establish a Registry for Alzheimer′sDisease，CERAD)临床和神经精神测试包括言语流畅性测试、波士顿命名测试(BostonNaming Test)、简易精神状态检查表(Mini Mental State Exam，MMSE)、十个单词回忆、结构行为(constructional praxis)和行为项延迟回忆(delayed recall of praxis items)。测试通常花费20-30分钟且对于评定和跟踪认知能力下降极为便利和有效。参看莫里斯(Morris)等人(1988)精神药理学通报(Psychopharmacol Bull.)24(4)：641-52；莫里斯等人(1989)神经学(Neurology)39(9)：1159-65；和威尔士(Welsh)等人(1991)神经学文献(Arch Neurol)48(3)：278-81。

简易精神状态检查表(MMSE)是1975年由佛尔斯坦(Folestein)等人提出的一种有关精神状态和认知功能的简易测试。其并不测量其它精神现象且因此不能替代完全精神状态检查。其适用于筛选痴呆症且其评分系统有助于跟踪随时间变化的进展。简易精神状态检查表MMSE使用广泛，其标准可关于年龄和教育而作出调整。其可用于筛选认知障碍、评估指定时间点时认知障碍的严重程度、跟踪个体随时间变化的认知改变过程和备案个体对治疗的反应。个体的认知能力评定可能需要正式的神经心理学测试，以及相隔9个月或更长时间(针对人类)的随访测试。参看佛罗斯坦(Folstein)等人(1975)精神病学研究杂志(J Psychiatr Res.)12：196-198；寇克瑞尔(Cockrell)和佛罗斯坦(Folstein)(1988)神经药理学通报(Psychopharm Bull.)24(4)：689-692；和克鲁姆(Crum)等人(1993)美国医学协会杂志(J.Am.Med.Association)18：2386-2391。

七分钟筛选是一种帮助鉴别需评估阿兹海默氏病的患者的筛选工具。所述筛选工具对于AD的早期病征极为灵敏，其使用一系列问题来评定不同类型的智能。测试是由四组问题组成，所述问题集中在定向、记忆、视觉空间技能和语言表达。其可辨识由正常老化过程引起的认知改变与因痴呆引起的认知障碍。参看所罗门(Solomon)和彭德尔伯里(Pendlebury)(1998)家族医学(Fam Med.)30(4)：265-71；所罗门等人(1998)神经学文献(Arch Neurol.)55(3)：349-55。

可由特征性痴呆以及上述风险因子的存在来识别目前罹患阿兹海默氏病的个体。此外，多种诊断测试也可用于鉴别患有AD的个体。这些测试包括测量CSFτ和Aβ42含量。τ含量升高和Aβ42含量降低表明AD的存在。罹患阿兹海默氏病的个体也可通过ADRDA标准进行诊断。

组合疗法

本发明的抗RAGE抗体可与一种或多种其它药剂组合使用，其可同时或以任何顺序依次投与个体。所揭示的组合疗法可引起协同治疗作用，即大于任一单独药剂的作用的作用。上文已描述可测量的治疗作用。举例来说，协同治疗作用可为比由单一药剂所引起的治疗作用高至少约2倍，或至少约5倍，或至少约10倍，或至少约20倍，或至少约50倍，或至少约100倍的作用。

举例来说，本发明包括投与治疗有效量的特异性结合RAGE且抑制RAGE结合搭配物的结合的抗体与特异性结合Aβ的另一抗体。结合Aβ的抗体可为特异性结合Aβ肽而不与全长淀粉样前体蛋白(APP)结合的抗体。或者，可将本发明的抗体与结合和/或捕获可溶性Aβ或者结合患者体内的淀粉样沉积物且诱导针对所述淀粉样沉积物的清除反应的抗体组合投与。所述清除反应可受Fc受体介导的吞噬作用影响。例如，可通过包括Fc受体结合结构域(例如，IgG2a恒定区)而将所述清除反应工程改造到抗体中。本发明的抗体也可投与已接收或正在接收Aβ疫苗的患者。在阿兹海默氏病和唐氏综合症(其中淀粉样沉积物出现在脑中)的情况下，本发明的抗体也可与使本发明药剂跨血脑屏障的通道增加的其它药剂组合投与。本发明的抗体也可与增强治疗剂对标靶细胞或组织的接取的其它药剂(例如，脂质体等)组合投与。共投与所述药剂可降低实现所需作用所需的治疗剂(例如，治疗抗体或抗体链)的剂量。

监测治疗过程

本发明提供监测罹患阿兹海默氏病或易患阿兹海默氏病的患者的治疗的方法，即用于监测对患者投与的治疗的过程的方法。所述方法可用于监测对有症状患者的治疗性治疗以及对无症状患者的预防性治疗。具体来说，所述方法适用于监测被动免疫(例如，测量所投与的抗体的含量)。

一些方法涉及在投与一定剂量的药剂之前测定患者体内(例如)抗体含量或分布的基线值，且将其与治疗后的分布或含量值相比较。所述含量或分布值的明显增加(即，在同一样本的重复测量中高于实验误差的典型界线，表示为与所述测量值的平均值的一个标准差)表明阳性治疗结果(即，投与所述药剂实现所需反应)。如果免疫反应值并无显著改变或降低，那么表明阴性治疗结果。

在其它方法中，关于对照群体来测定含量或分布的对照值(即，平均值与标准差)。通常，对照群体的个体未接收先前治疗。随后，将投与治疗剂后所测量的患者的含量或分布值与对照值相比较。相对于对照值的明显增加(例如，大于与平均值的一个标准差)表明阳性或充分的治疗结果。无明显增加或降低表明阴性或不足的治疗结果。在所述含量相对于对照值增加的同时，通常持续投与药剂。同以前一样，相对于对照值达到停滞期为可中断投药治疗或降低其剂量和/或频率的指示。

在其它方法中，由已经历治疗剂治疗且响应治疗，含量或分布已达停滞期的对照个体群体测定含量或分布的对照值(例如，平均值与标准差)。将所测量的患者的含量或分布值与对照值相比较。如果所测量的患者体内的含量与对照值并无明显不同(例如，高于一个标准差)，那么可中断治疗。如果患者体内的含量明显低于对照值，那么确保持续投与药剂。如果患者体内的含量始终低于对照值，那么表明改变治疗。

在其它方法中，监测目前未接收治疗但已经历先前治疗过程的患者的抗体含量或分布以确定是否需要重新开始治疗。可将患者体内的所测量含量或分布与先前治疗过程后患者先前所达到的值相比较。相对于先前测量值明显降低(即，大于同一样本的重复测量值的典型误差界线)表明可重新开始治疗。或者，可将患者体内所测量的值与在经历治疗过程后的患者群体中所测定的对照值(平均值加标准差)相比较。或者，可将患者的测量值与仍无疾病症状的经预防性治疗的患者群体或者展现疾病特征的改善的经治疗性治疗的患者群体的对照值相比较。在所有这些情况下，相对于对照值明显降低(即，大于一个标准差)为应对患者重新开始治疗的指示。

供分析的组织样本通常为来自患者的血液、血浆、血清、粘液或脑脊髓液。例如，可分析样本中针对RAGE肽的抗体的含量或分布，例如人类化抗体的含量或分布。检测对RAGE具特异性的抗体的ELISA方法将在实例中加以描述。在一些方法中，如本文所述例如在活体外吞噬作用检定中，使用清除检定测定所投与的抗体的含量或分布。在所述方法中，使所测试的患者的组织样本与淀粉样沉积物(例如来自PDAPP小鼠)和载有Fc受体的吞噬细胞接触。随后，监测淀粉样沉积物的后续清除。清除反应的存在和程度提供有效清除所测试患者的组织样本中的Aβ的抗体的存在和含量的指示。

被动免疫后抗体的分布通常展现抗体浓度的即时峰值，随后呈指数下降。在无额外剂量的情况下，视所投与的抗体半衰期而定，下降在数天到数月内接近预治疗含量。

在一些方法中，在投药前取得患者体内抗RAGE抗体的基线测量值，在投药后立即取得第二测量值以测定抗体峰含量，且以特定时间间隔取得一个或多个其它测量值以监测抗体含量下降。当抗体含量已下降到基线或预定的低于基线的峰值百分比(例如，50％、25％或10％)时，投与另一抗体剂量的投与。在一些方法中，将低于背景的峰值或后续测量含量与先前测定的参考含量相比较以构成其它患者的有益预防或治疗性治疗方案。如果所测量的抗体含量明显低于参考含量(例如，小于从治疗获益的患者群体的参考值的平均值减一个标准差)，那么表明需投与额外剂量的抗体。

监测治疗过程和患者状况的可测量指标包括监测(降低)患者脑中Aβ含量、监测淀粉样蛋白池和监测Aβ诱发的神经元功能障碍的改善。其它可测量的指标包括监测阿兹海默氏病中血管嗜刚果红淀粉样血管病(vascular congophilic amyloid angiopathy，CAA)的病理状况或改变且监测患者包括Aβ介导的细胞内信号转导和炎症的改变。后者将提供有关利用多种发散的信号转导路径通过配体调控RAGE的信息，例如转录因子NF-κB的活化，活化RAGE启动子并且通过活化细胞信号转导(MAP激酶级联(MAPK)、ERK1/2、Akt、JNK、p38)介导细胞毒性反应且抗RAGE MAb阻断JNK、p38、NFκB磷酸化。有用测量还包括监测由RAGE加强的Aβ诱导的信号转导及神经突触可塑性，并且由RAGE和LRP介导的跨血/脑屏障的Aβ的差异脑流入/排出可介导跨血脑屏障的Aβ的差异脑流入/排出。因此，本发明提供减少与Aβ有关的细胞内信号转导(例如，减少MAPK级联)和炎症的方法。

其它方法包括随治疗过程监测任何所属领域认可的生理学症状(例如，身体或精神症状)，这通常取决于由研究人员或医师对淀粉样蛋白生成疾病(例如阿兹海默氏病)的诊断或监测。举例来说，可监测认知障碍。认知障碍为阿兹海默氏病和唐氏综合症的一种症状，并且也可在无所述疾病中任一种的其它特征的情况下发生。举例来说，可根据整个治疗过程的惯例，通过测定患者关于简易精神状态检查表的得分来监测认知障碍。

医药制剂

本发明的标的蛋白或核酸最优选是以适当组合物的形式投与。作为适当的组合物，可例举通常用于全身或局部投与药物的所有组合物。医药学上可接受的载剂应实质上为惰性的，从而不与活性组分作用。适当的惰性载剂包括水、醇、聚乙二醇、矿物油或石油凝胶、丙二醇、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、抑菌注射用水(BWFI)、注射用无菌水(SWFI)等。可调配所述医药制剂(包括标的抗体或编码标的抗体的核酸)以便以用于人类或兽医学的任何常规方式投与。

因此，本发明的另一方面提供医药学上可接受的组合物，其包含有效量的抗体与一种或多种医药学上可接受的载剂(添加剂)和/或稀释剂的调配物。如下文将详细描述，可特别调配本发明的医药组合物以便以固体或液体形式投与，包括适于以下方式的形式：(1)经口投与，例如浸液(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂、大丸剂、散剂、颗粒剂、施用于舌的糊剂；(2)不经肠投与，例如通过皮下、肌肉内或静脉内注射投与，例如无菌溶液或悬浮液；(3)局部施用，例如乳膏、油膏或施用于皮肤的喷雾剂；或(4)经阴道内或经直肠内投与，例如阴道栓、乳膏或泡沫。然而，在某些实施例中，可将标的药剂简单地溶解或悬浮于无菌水中。在某些实施例中，医药制剂为无热原质的，即，不会引起患者体温升高。不经肠投药、尤其皮下和静脉内注射为优选的投药途径。

在某些实施例中，一种或多种药剂可含有碱性官能团，诸如氨基或烷基氨基，且因此能够与医药学上可接受的酸形成医药学上可接受的盐。就此方面看，术语“医药学上可接受的盐”是指本发明化合物的相对无毒、无机和有机酸加成盐。可在本发明化合物的最终分离和纯化过程中当场制备这些盐，或者通过单独使经纯化的游离碱形式的本发明化合物与适当的有机或无机酸反应且分离由此形成的盐来制备。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。(例如，参看伯格(Berge)等人(1977)＂药物盐(Pharmaceutical Salts)＂，药学杂志(J.Pharm.Sci.)66：1-19)。

所述药剂的医药学上可接受的盐包括例如由无毒有机或无机酸形成的化合物的常规无毒盐或季铵盐。举例来说，所述常规无毒盐包括由无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等)得到的盐，和由有机酸(诸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷二磺酸、羟乙基磺酸等)制备的盐。

在其它情况下，所述一种或多种药剂可含有一个或多个酸性官能团，且因此能够与医药学上可接受的碱形成医药学上可接受的盐。同样，可在所述化合物的最终分离和纯化过程中当场制备这些盐，或通过单独使游离酸形式的经纯化化合物与适当碱(诸如医药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)、氨或医药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备。代表性碱金属盐或碱土金属盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等。适用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(例如，参看伯格等人，同上文)。

所述组合物中也可存在润湿剂、乳化剂和润滑剂(诸如，月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。

医药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血基棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

本发明的调配物包括适于经口、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、经直肠、经阴道和/或不经肠投与的调配物。所述调配物可便利地以单位剂型提供且可通过药学领域中众所周知的任何方法制备。可与载剂材料组合产生单一剂型的活性成分的量将视所治疗的宿主、特定投药模式等而变化。可与载剂材料组合产生单一剂型的活性成分的量通常将为产生治疗作用的化合物的量。一般来说，以100％计，此量将在约1％到约99％活性成分、优选约5％到约70％、最优选约10％到约30％的范围内。

制备这些调配物或组合物的方法包括使药剂与载剂以及视情况一种或多种附加成分组合的步骤。一般来说，通过使本发明的药剂与液体载剂或适时分开的固体载剂均匀且充分地组合，且随后视需要使产物成型来制备调配物。

适于经口投与的本发明的调配物可为胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、散剂、颗粒剂，或水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或者水包油或油包水液体乳液，或酏剂或糖浆，或软锭(使用惰性基质，诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或漱口液等的形式，其各自含有预定量的本发明化合物作为活性成分。本发明化合物也可以大丸剂、药糖剂或糊剂形式投与。

在供经口投与的本发明的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣锭、散剂、颗粒剂等)中，将活性成分与一种或多种医药学上可接受的载剂(诸如柠檬酸钠或磷酸氢钙)和/或以下各物中的任一种混合：(1)填充剂或增积剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液延迟剂，诸如石蜡；(6)吸收加速剂，诸如季铵化合物；(7)润湿剂，诸如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸附剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和其混合物；和(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，医药组合物还可包含缓冲剂。还可使用诸如乳糖(lactose或milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等作为赋形剂，将类似类型的固体组合物用作软和硬明胶胶囊中的填充剂。

可通过压缩或模制，视情况用一种或多种附加成分制成片剂。可使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羧甲淀粉钠(sodium starch glycolate)或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备压缩片剂。可通过在适当机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制成模制片剂。

本发明医药组合物的片剂和其它固体剂型(诸如，糖衣锭、胶囊、丸剂和颗粒剂)可视情况用包衣和外壳(诸如，肠衣和医药调配领域众所周知的其它包衣)刻痕或制备。也可使用用于提供所需释放概况的不同比例的(例如)羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、脂质体和/或微球对其进行调配，从而提供其中活性成分的缓慢或受控释放。可例如通过滤过细菌截留过滤器，或通过并入在使用前可溶解于无菌水或一些其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式的灭菌剂来使其灭菌。这些组合物也可视情况含有遮光剂且还可具有使其在胃肠道的某一部分中视情况以延缓方式只释放或优先释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。必要时，活性成分还可为与上述赋形剂中的一种或多种形成的微胶囊化形式。

供经口投与本发明化合物的液体剂型包括医药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性成分外，液体剂型还可含有所属领域中常用的惰性稀释剂，诸如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃基醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯，和其混合物。

除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。

除活性化合物外，悬浮液还可含有悬浮剂，诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶，和其混合物。

供经直肠或阴道投与的本发明的医药组合物的调配物可以栓剂形式提供，其可通过将一种或多种本发明的化合物与一种或多种适当的无刺激性的赋形剂或载剂混合来制备，所述赋形剂或载剂例如包含可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐，且其在室温下为固体，而在体温下为液体且因此将在直肠或阴道腔中熔融并释放所述药剂。

适于经阴道投与的本发明的调配物还包括阴道栓、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或含有诸如所属领域中已知的载剂的喷雾调配物。

供局部或经皮投与本发明化合物的剂型包括散剂、喷雾剂、油膏、糊剂、乳膏、洗液、凝胶、溶液、贴片和吸入剂。可在无菌条件下将活性化合物与医药学上可接受的载剂以及可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。

除本发明的活性化合物外，油膏、糊剂、乳膏和凝胶还可含有赋形剂，诸如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅树脂、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。

除本发明的化合物外，散剂和喷雾剂还可含有赋形剂，诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂可另外含有常用推进剂，诸如氯氟烃和未经取代的挥发性烃，诸如丁烷和丙烷。

经皮贴片具有向身体提供本发明化合物的受控传递的额外益处。所述剂型可通过将所述药剂悬浮或分散于适当介质中而制得。还可使用吸收增强剂来增加所述药剂穿过皮肤的通量。可通过提供速率控制膜或将所述化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制所述通量的速率。

预期眼用调配物、眼用油膏、散剂、溶液等也在本发明的范围内。

适于不经肠投与的本发明的医药组合物包含一种或多种本发明化合物以及一种或多种医药学上可接受的等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，或无菌散剂，其可在使用前在无菌可注射溶液或分散液中复水，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使调配物与所需受体的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。

可用于本发明的医药组合物中的适当水性和非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其适当混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。例如，可利用包衣材料(诸如卵磷脂)，在分散液的情况通过保持所需粒径且利用表面活性剂来保持适当流动性。

这些组合物还可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过包涵各种抗菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸等)来确保防止微生物作用。组合物中还可能需要包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等。此外，可通过包涵延缓吸收的试剂(诸如单硬脂酸铝和明胶)而使可注射医药形式延迟吸收。

在一些情况下，为延长药剂的作用，需要减缓皮下或肌肉内注射的药剂的吸收。这可利用具有弱水溶性的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。所述药剂的吸收速率则视其溶解速率而定，而其溶解速率又可视晶体大小和结晶形式而定。另外，不经肠投与的药剂的延缓吸收是通过将所述药剂溶解或悬浮于油媒剂中来实现。

通过在生物可降解聚合物(诸如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成标的化合物的微胶囊基质来制得可注射储槽形式。视药剂与聚合物的比例和所使用的特定聚合物的性质而定，可控制药剂释放速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。也可通过将所述药剂包入可与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储槽式可注射调配物。

当将本发明的化合物作为医药剂投与人类和动物时，其可以原样给与或以例如含有与医药学上可接受的载剂组合的0.1到99.5％(更优选0.5到90％)活性成分的医药组合物形式给与。

除上述组合物外，也可使用含有适量治疗剂的覆盖层，例如熟石膏、绷带、敷料、纱布垫等。如上文详细描述，可在躯干、装置、假体和植入物上投与/传递治疗性组合物。

供分析的组织样本通常为来自患者的血液、血浆、血清、粘液或脑脊髓液。例如，分析样本中针对RAGE肽的抗体的含量或分布，例如人类化抗体的含量或分布。检测对RAGE具特异性的抗体的ELISA方法将在实例中加以描述。

被动免疫后抗体的分布通常展现抗体浓度的即时峰值，随后呈指数衰退。在无额外剂量的情况下，视所投与的抗体半衰期而定，下降在数天到数月内接近预治疗含量。

在一些方法中，在投药前取得患者体内抗RAGE抗体的基线测量值，在投药后立即取得测定抗体峰含量的第二测量值，且以特定时间间隔取得一个或多个其它测量值以监测抗体含量下降。当抗体含量已下降到基线或低于基线的预定峰值百分比(例如，50％、25％或10％)时，投与另一抗体剂量的投与。在一些方法中，将低于背景的峰值或后续测量含量与先前测定的构成其它患者的有益预防或治疗性治疗方案的参考含量相比较。如果所测量的抗体含量明显低于参考含量(例如，小于从治疗获益的患者群体的参考值的平均值减一个标准差)，那么表明需投与额外剂量的抗体。

实例

鉴于现已大体描述本发明，参考以下实例将更易于了解本发明，所述实例仅出于说明本发明某些方面和实施例的目的而包括在内且不意欲限制本发明。

实例1

RAGE构筑体的制备

鼠科RAGE(mRAGE，基因库登陆号第NP_031451号；SEQ ID NO：3)和人类RAGE(hRAGE，基因库登陆号第NP_00127.1号；SEQ ID NO：1)的氨基酸序列绘示于图1A-1C中。将编码mRAGE(登录号第NM_007425.1号；SEQ ID NO：4)和hRAGE(登录号第NM_001136号；SEQ ID NO：2)的全长cDNA插入Adori1-2表达载体中，所述表达载体包含驱动cDNA序列表达的巨细胞病毒(CMV)启动子，并且含有用于病毒产生的腺病毒元件。通过将人类RAGE的氨基酸1-344附加到人类IgG的Fc结构域所形成的人类RAGE-Fc融合蛋白是通过使用Adori表达载体在经培养细胞中表达编码所述融合蛋白的DNA构筑体而制备得到。类似地制备通过将人类RAGE的氨基酸1-118附加到人类IgG的Fc结构域所形成的人类RAGE V区-Fc融合蛋白。通过将抗生蛋白链菌素(strep)标签序列(WSHPQFEK)(SEQ ID NO：5)分别附加到人类或鼠科RAGE的氨基酸1-344所形成的人类和鼠科RAGE-strep标签融合蛋白也是通过使用Adori表达载体表达编码所述RAGE-strep标签融合蛋白的DNA构筑体而制备得到。通过大量限制性消化分析且通过质粒内cDNA插入物的序列分析来验证所有构筑体。

通过在人类胚肾细胞系293(HEK293)(ATCC，马里兰州罗克兰德(Rockland，MD))中同源重组产生表达全长RAGE、hRAGE-Fc和hRAGE V-结构域-Fc的重组腺病毒(Ad5Ela/E3缺失)。分离重组腺病毒且随后使其在HEK293细胞中扩增。通过三个冷冻解冻循环从受感染HEK293细胞中释放所述病毒。通过两个氯化铯离心梯度进一步纯化病毒并且在4℃下对磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)(pH7.2)透析。透析后，添加甘油以达到10％的浓度且在-80℃下储存病毒待用。通过感染性(293细胞上的空斑形成单位)、病毒的PCR分析、编码区的序列分析、转基因的表达和内毒素测量来表征病毒构筑体。

使用阳离子脂质体(lipofectin)(英杰公司(Invitrogen))将含有编码人类RAGE-Fc、人类RAGE-V区-Fc以及人类和鼠科RAGE-strep标签融合蛋白的DNA的Adori表达载体稳定转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。在20nM和50nM甲氨喋呤中选择稳定转染体。采集个别克隆的条件培养基并且使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹加以分析以证实RAGE表达。(考夫曼R.J.(Kaufman，R.J.)，1990，酶学方法(Methods in Enzymology)，185：537-66；考夫曼R.J.，1990，酶学方法，185：487-511；皮特曼D.D.(Pittman，D.D.)等人，1993，酶学方法，222：236-237)。

培养表达可溶RAGE融合蛋白的CHO或经转导HEK293细胞以采集条件培养基以供蛋白纯化。使用所述的亲和标签方法纯化蛋白。使经纯化蛋白经历还原和非还原性SDS-PAGE，通过考马斯蓝染色(Coomassie Blue staining)(当前蛋白科学方案(CurrentProtocols in Protein Sciences)，Wiley Interscience)使其显现且证实其具有预期的分子量。

实例2

鼠科抗RAGE单克隆抗体的产生

使用基因枪(GeneGun)装置(伯乐公司(BioRad)，加州赫拉克勒斯(Hercules，CA))，经皮下对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(查尔斯河(Charles River)，马萨诸塞州安杜佛(Andover，MA))进行免疫。将含有编码全长人类RAGE的cDNA的pAdori表达载体预先吸收到胶体金颗粒(伯乐公司(BioRad)，加州赫拉克勒斯)上，随后经皮下投与。每周2次用3μg载体对小鼠免疫，持续2周。在最后一次免疫后一周对小鼠进行抽血，并且评估抗体效价。在细胞融合前三天，使具有最高RAGE-抗体效价的小鼠再接收1次10μg重组人类RAGE-strep蛋白注射。

使用50％聚乙二醇(MW 1500)(罗氏诊断有限公司(Roche Diagnostics Corp)，德国曼海姆(Mannheim，Germany))，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653(ATCC，马里兰州罗克威尔(Rockville，MD))以4:1的比率融合。融合后，对细胞接种并以1×10⁵个细胞/孔培养于96孔培养板中的RPMI1640选择培养基中，所述培养基含有20％FBS、5％Origen(IGEN国际公司(IGEN InternationalInc.)，马里兰州盖塞斯堡(Gaithersburg，MD))、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml盘尼西林(penicillin)、100μg/ml链霉素、10mMHEPES和1×次黄嘌呤-氨喋呤(aminopterin)-胸苷(西格玛公司(Sigma)，密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))。

实例3

大鼠抗RAGE单克隆抗体的产生

使用基因枪(伯乐公司，加州赫拉克勒斯)，经皮下对LOU大鼠(哈伦(Harlan)，马萨诸塞州哈伦(Harlan，MA))免疫。将含有编码全长鼠科RAGE的cDNA的pAdori表达载体预先吸收到胶体金颗粒(伯乐公司(BioRad)，加州赫拉克勒斯)上，随后经皮下投与。每2周1次用3μg载体对大鼠免疫，共计4次。在最后一次免疫后一周对大鼠进行抽血，并且评估抗体效价。在细胞融合前三天，使具有最高RAGE-抗体效价的大鼠再接收1次10μg重组鼠科RAGE-strep蛋白注射。

使用50％聚乙二醇(MW1500)(罗氏诊断有限公司(Roche Diagnostics Corp)，德国曼海姆(Mannheim，Germany))，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653(ATCC，马里兰州罗克威尔(Rockville，MD))以4:1的比率融合。融合后，对细胞接种并以1×10⁵个细胞/孔培养于96孔培养板中的RPMI1640选择培养基中，所述培养基含有20％FBS、5％ Origen(IGEN国际公司(IGEN InternationalInc.)，马里兰州盖塞斯堡(Gaithersburg，MD))、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml盘尼西林(penicillin)、100μg/ml链霉素、10mMHEPES和1×次黄嘌呤-氨喋呤-胸苷(西格玛公司(Sigma)，密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))。

实例4

杂交瘤筛选

通过使用基因枪和表达鼠科或人类RAGE的全长编码区的Adori表达质粒使cDNA免疫而产生多种大鼠抗鼠科RAGE和鼠科抗人类RAGE mAb。通过ELISA和针对瞬时表达RAGE的人类胚肾细胞(HEK-293)的FACS分析，关于与重组人类或鼠科RAGE-Fc的结合筛选杂交瘤上清液。另外测试阳性上清液中和RAGE与配体HMGB1的结合的能力。鉴别出7种大鼠单克隆抗体(XT-M系列)和7种小鼠单克隆抗体(XT-H系列)。通过4次连续稀释和1次FACS拣选来亚克隆所选杂交瘤。采集稳定杂交瘤培养物的条件培养基，并且使用蛋白A抗体纯化柱(马萨诸塞州毕莱卡，密理博公司(Millipore Billerica，MA))纯化免疫球蛋白。使用如所述的小鼠mAb同型试剂盒或大鼠mAb同型试剂盒(IsoStrip；宝灵曼有限公司(Boehringer Mannheim Corp.))来确定各mAb的Ig类别。所选大鼠和小鼠单克隆抗体的同型陈述于表1(下表)中。

实例5

FACS分析

用人类和鼠科RAGE腺病毒感染人类293细胞。使受感染细胞以4×10⁴个细胞/毫升的密度悬浮于含有1％BSA的PBS中。在4℃下，将细胞与100μl样本(稀免疫血清、杂交瘤上清液或经纯化抗体)一起培养30分钟。洗涤后，在4℃下在暗处将细胞与PE标记的山羊抗小鼠IgG F(ab′)₂(DAKO有限公司，丹麦哥洛斯卓普(Glostrup Denmark))一起培养30分钟。通过每次处理使用5000个细胞的FACScan流式细胞荧光计(贝迪公司(Becton Dickinson))来测量细胞相关荧光信号。使用碘化丙啶(propidium iodide)鉴别死亡细胞，将其排除在分析之外。通过FACS分析证实7种鼠科单克隆抗体XT-H1到XT-H7和7种大鼠单克隆抗体XT-M1到XT-M7与细胞表面hRAGE结合(表2)。

实例6

ELISA结合检定

使用标准程序从杂交瘤上清液中纯化抗体。使用ELISA来评估经纯化抗体与可溶形式的RAGE的结合。用100μl重组人类RAGE-Fc或重组人类RAGE V区-Fc(1μg/ml)涂布96孔培养板(康宁公司(Corning)，纽约康宁市(Corning，NY))并且在4℃下培养整夜。用含有1％BSA和0.05％吐温-20(Tween-20)的PBS洗涤并阻断后，添加100μl样本(样本呈若干种形式：稀免疫血清、杂交瘤上清液或经纯化抗体，如所述)并且在室温下培养1小时。将培养板用PBS(pH 7.2)洗涤，并且借助于使用过氧化物酶联结的山羊抗小鼠IgG(H+L)(IgG)(皮尔斯公司(Pierce)，伊利诺伊州洛克夫(Rockford，IL))，随后将其与底物TMB(BioFX Laboratories公司，马里兰州奥文斯米尔实验室(Owings Mills，MD Laboratories)一起培养来检测已结合的抗RAGE抗体。利用分光光度计在450nm下测定吸光率值。使用过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(Fcγ)(皮尔斯公司，伊利诺伊州洛克夫)来测定单克隆抗体的浓度，并且由经纯化、同型匹配的小鼠IgG产生标准曲线。有关7种鼠科抗体XT-H1到XT-H7和7种大鼠抗体XT-M1到XT-M7与hRAGE-Fc、hRAGE V区-Fc、mRAGE-Fc和mRAGE-strep结合的能力的ELISA结果概述于表2中。如图2和3中所示，大鼠抗体XT-M4和鼠科抗体XT-H2都结合人类RAGE-Fc和hRAGE的V结构域。XT-M4与人类RAGE和人类RAGE V结构域结合的EC50值分别为300pM和100pM。XT-H2与人类RAGE和人类RAGE V结构域结合的EC50值分别为90pM和100pM。

实例7

RAGE配体和抗体竞争性ELISA结合检定

为确定RAGE单克隆抗体是否影响RAGE配体(HMGB1；西格玛公司，密苏里州圣路易斯)与RAGE的结合，进行竞争性ELISA结合检定。在4℃下，用1μg/ml HMGB1涂布96孔培养板整夜。如上文所述，洗涤并阻断各孔，并且在室温下，将其暴露于100μl预先培养的0.1μg/ml RAGE-Fc或TrkB-Fc(非特异性Fc对照)与各种形式的所述抗体制剂(免疫血清稀释液、杂交瘤上清液或经纯化抗体)的混合物达1小时。将培养板用PBS(pH7.2)洗涤，并且借助于使用过氧化物酶联结的山羊抗人类IgG(Fcγ)(皮尔斯公司，伊利诺伊州洛克夫)，随后将其与底物TMB(BioFX Laboratories公司，马里兰州奥文斯米尔实验室(Owings Mills，MD Laboratories)，马里兰州奥文斯米尔)一起培养来检测配体结合的重组人类RAGE-Fc。将在不存在任何抗体或存在稀免疫前血清的情况下重组人类RAGE-Fc与配体的结合用作对照，并将其定义为100％结合。如通过竞争性ELISA结合检定所确定的7种鼠科抗体XT-H1到XT-H7和7种大鼠抗体XT-M1到XT-M7阻断HMGB1与hRAGE-Fc结合的能力展示于表3中。表3还概述如通过类似竞争性ELISA结合检定所确定的鼠科抗体XT-H1、XT-H2和XT-H5阻断hRAGE的另一配体淀粉样β1-42肽与RAGE结合的能力，和大鼠抗体XT-M1到XT-M7阻断HMGB1与鼠科RAGE-Fc结合的能力。如图4所示，大鼠抗体XT-M4和鼠科抗体XT-H2都阻断HMGB1与人类RAGE的结合。

使用类似竞争方法来确定抗体对之间的相关结合表位。首先，在4℃下在96孔培养板上涂布1μg/ml重组人类RAGE-Fc整夜。洗涤和阻断(参看上文)后，在室温下将各孔暴露于100μl预先培养的生物素化标靶抗体与竞争抗体稀释液的混合物达1小时。使用过氧化物酶联结的抗生蛋白链菌素(皮尔斯公司)来检测已结合的生物素化抗体。使用类似竞争方法来确定抗体对之间的相关结合表位。首先，在4℃下在96孔培养板上涂布1μg/ml重组人类RAGE-Fc整夜。洗涤和阻断(参看上文)后，在室温下将各孔暴露于100μl预先培养的生物素化标靶抗体与竞争抗体的稀释液的混合物达1小时。使用过氧化物酶联结的抗生蛋白链菌素(皮尔斯公司，伊利诺伊州洛克夫)，随后将其与底物TMB(BioFX Laboratories公司，马里兰州奥文斯米尔实验室)一起培养，来检测已结合的生物素化抗体。将在不存在任何竞争抗体的情况下生物素化抗体与重组人类RAGE-Fc的结合用作对照且将其定义为100％。分析大鼠与鼠科抗体之间关于结合hRAGE的竞争的竞争性ELISA结合检定的结果展示于表3中。图5提供竞争性ELISA结合检定的数据图，其分析大鼠XT-M4和抗体XT-H1、XT-H2、XT-H5、XT-M2、XT-M4、XT-M6和XT-M7之间关于结合hRAGE的竞争。图5中所示的竞争性ELISA结合数据表明，XT-M4和XT-H2结合人类RAGE上的重叠位点。

实例8

鼠科和大鼠抗RAGE抗体与人类和鼠科RAGE-Fc的结合的BIACORETM结合检定

A.与人类和鼠科RAGE结合

通过

直接结合检定来分析所选鼠科和大鼠抗RAGE抗体与人类和鼠科RAGE以及人类和鼠科RAGE的V结构域的结合。使用标准胺偶联，使用以高密度(2000RU)涂布于CM5芯片上的人类或鼠科RAGE-Fc进行检定。一式两份，在固定的RAGE-Fc蛋白上运行50nm和100nm两种浓度的抗RAGE抗体溶液。BIACORE^TM技术利用抗RAGE抗体与固定RAGE抗原结合后表面层处折射率的改变。通过从所述表面折射的激光的表面等离子体共振(SPR)来检测结合。BIACORE^TM直接结合检定的结果概述于表4中。

通过BIACORE^TM直接结合检定来确定鼠科和大鼠抗RAGE抗体与人类和鼠科RAGE结合的动力学速率常数(k_a和k_d)以及缔合常数和解离常数(K_a和K_d)。有关缔合速率和解离速率的信号动力学数据的分析使得能区别非特异性相互作用与特异性相互作用。通过针对鼠科XT-H2抗体和大鼠XT-M4抗体与hRAGE-Fc的结合的BIACORE^TM直接结合检定所确定的动力学速率常数和平衡常数展示于表5中。

B.与人类RAGE V结构域结合

同样通过BIACORE^TM直接结合检定来确定鼠科和大鼠抗RAGE抗体与人类RAGE V结构域结合的动力学速率常数以及缔合常数和解离常数。由涂布于CM5芯片上的抗人类Fc抗体捕获人类RAGE V结构域-Fc，并且如上文关于与全长RAGE-Fc结合的检定所述进行鼠科和大鼠抗RAGE抗体与固定hRAGE V结构域-Fc的结合的BIACORE^TM直接结合检定。

实例9

抗RAGE抗体可变区的氨基酸序列

克隆编码鼠科抗RAGE抗体XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5和XT-H7以及大鼠抗RAGE抗体XT-M4的轻链和重链可变区的DNA序列，并且对其进行测序，且确定所述可变区的氨基酸序列。所述6种抗体的重链可变区的经比对氨基酸序列绘示于图6中，并且轻链可变区的经比对氨基酸序列绘示于图7中。

实例10

编码RAGE的兔、狒狒和食蟹猴cDNA序列的分离

使用标准反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法分离并克隆编码RAGE的cDNA序列。使用Trizol(吉普科-英杰公司(Gibco Invitrogen)，加州卡斯坝(Carlsbad，CA))，经由制造商的方案从肺组织中提取RNA并加以纯化。使用TaqMan反转录试剂(罗氏应用化学公司(Roche Applied Science)，印第安纳州印第安纳波里斯(Indianapolis，IN))和制造商的方案使mRNA反转录以产生cDNA。使用英杰公司的Taq DNA聚合酶(英杰公司，加州卡斯坝)和方案以及添加有Spel和EcoRV限制性位点的寡核苷酸(5′-GACCCTGGAAGGAAGCAGGATG(SEQ ID NO：59)和5′-GGATCTGTCTGTGGGCCCCTCAAGGCC(SEQ ID NO：60))，由cDNA扩增食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和狒狒(黄狒狒(Papio cvanocephalus))RAGE序列。用Spel/EcoRV消化PCR扩增产物，并且将其克隆到质粒pAdori1-3的相应位点中。使用如上文所述的RT-PCR，使用添加有Spel和NotI位点的寡核苷酸：5′-ACTAGACTAGTCGGACCATGGCAGCAGGGGCAGCGGCCGGA(EQ ID NO：61)和5′-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTCAGGGCTCTCCTGTACCGCTCTC(SEQ ID NO：62)来克隆兔RAGE，并将其克隆到pAdori1-3中的相应位点中。确定所得质粒中编码狒狒、猴和兔RAGE两种同功异型物的经克隆cDNA序列的核苷酸序列。编码狒狒RAGE的核苷酸序列绘示于图8中(SEQ ID NO：6)，且编码食蟹猴RAGE的核苷酸序列绘示于图9中(SEQ ID NO：8)。编码兔RAGE两种同功异型物的核苷酸序列绘示于图10(SEQID NO：10)和图11(SEQ ID NO：12)中。

实例11

编码狒狒RAGE的基因组DNA序列的分离

使用标准基因组克隆技术(例如，参看萨布鲁克J(Sambrook J.)等人，分子克隆： 实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，1989，冷泉港实验出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约(New York))来分离编码RAGE的狒狒基因组DNA序列。使用³²P随机引物人类RAGE cDNA，以λDASH II载体筛选狒狒(黄狒狒)λ基因组文库(Stratagene公司，加州拉赫亚(La Jolla，C))。分离阳性噬菌体斑，并使其再经历两轮筛选以获得单一分离株。制备λDNA，用NotI消化并且使用常用程序进行尺寸分离以从λ基因组中分离出插入物DNA。将NotI片段与NotI消化的pBluescript SK+连接，并使用RAGE特异性引物对插入物进行测序。所获得的克隆称为克隆18.2。编码狒狒RAGE的经克隆狒狒基因组DNA的核苷酸序列绘示于图12A-12E中(SEQ ID NO：15)。

实例12

嵌合XT-M4抗体

通过将大鼠抗鼠科RAGE抗体XT-M4的轻链和重链可变区分别与人类κ轻链和IgG1重链恒定区融合来产生嵌合XT-M4。为减少潜在的Fc介导的抗体的效应活性，将嵌合突变L234A和G237A引入XT-M4的人类IgG1 Fc区中。所述嵌合抗体的分子编号指定为XT-M4-A-1。嵌合XT-M4抗体含有93.83％的人类氨基酸序列和6.18％的大鼠氨基酸序列。

实例13

评定嵌合XT-M4与RAGE的结合

通过ELISA和BIACORE^TM结合检定来测量嵌合抗体XT-M4以及所选大鼠和鼠科抗RAGE抗体结合人类RAGE和其它物种的RAGE以及阻断RAGE配体结合的能力。

A.通过BIACORE ^TM 结合检定测量的与可溶人类RAGE的结合

通过BIACORE^TM捕获结合检定来测量嵌合抗体XT-M4、亲代大鼠抗体XT-M4以及鼠科抗体XT-H2和XT-H5与可溶人类RAGE(hRAGE-SA)的结合。通过将抗体以5000-7000 RU涂布于CM5BIA芯片上来进行检定。一式三份，使浓度为100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.12nM、1.56nM和0nM的抗生蛋白链菌素标记的经纯化可溶人类RAGE(hRAGE-SA)的溶液流过固定抗体，并且确定关于结合hRAGE-SA的动力学速率常数(k_a和k_d)以及缔合常数和解离常数(K_a和K_d)。结果展示于表6中。

XT-M4抗体和嵌合抗体XT-M4以类似动力学结合单体可溶人类RAGE。嵌合XT-M4对人类可溶单体RAGE的亲和力为约5.5nM。

B.RAGE配体竞争性ELISA结合检定

通过如实例7中所述的配体竞争性ELISA结合检定来确定嵌合抗体XT-M4抗体和大鼠抗体XT-M4阻断RAGE配体HMGB1、淀粉样蛋白β1-42肽、S100-A和S100-B与hRAGE-Fc结合的能力。如图13所示，嵌合抗体XT-M4与XT-M4阻断HMGB1、淀粉样蛋白β1-42肽、S100-A和S100-B与人类RAGE-Fc结合的能力大致相同。

C.抗体竞争性ELISA结合检定

以实例7中所述的方式，通过抗体竞争性ELISA结合检定，使用生物素连接的XT-M4和XT-H2抗体来确定嵌合抗体XT-M4抗体与大鼠抗体XT-M4和鼠科抗体XT-H2竞争与hRAGE-Fc的结合的能力。如图14中所示，嵌合抗体XT-M4与大鼠抗体XT-M4和鼠科抗体XT-H2竞争与hRAGE-Fc的结合。

实例14

通过基于细胞的ELISA测量抗体与不同物种的RAGE的结合

细胞转染

以每10平方厘米组织培养板5×10⁶个细胞涂布人类胚肾293细胞(美国典型组织保藏中心(American Tissue Type Culture)，维吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA))，并且在37℃下培养整夜。次日，使用制造商的方案，使用LF2000试剂(英杰公司，加州卡斯坝)利用RAGE表达载体(编码小鼠、人类、狒狒、食蟹猴或兔RAGE的pAdori1-3载体)以4:1的试剂：质粒DNA比率转染细胞。使用胰蛋白酶进行的转染后48小时，采集细胞，用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤1次，随后使其以2×10⁶个细胞/毫升的浓度悬浮于无血清生长培养基中。

基于细胞的ELISA

将1μg/ml初级抗体以1:2或1:3连续稀释于96孔培养板中含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中。将无血清生长培养基中2×10⁶个细胞/毫升的经RAGE转染的293细胞或对照亲代293细胞(50μl)添加到U形底的96孔培养板中以达1×10⁵个细胞/孔的最终浓度。以1600rpm将细胞离心2分钟。借助于用手快速掠过而小心地弃去上清液，并且小心地轻拍培养板以使细胞小球松散。将含有10％胎牛血清(FCS)的冷PBS中的经稀释的初级抗RAGE抗体或同型匹配的对照抗体(100μl)添加到细胞中并在冰上培养1小时。在冰上用100μl经稀释的二级抗IgG抗体HRP连结物(皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology)，伊利诺伊州洛克夫(Rockford，IL))对细胞染色达1小时。在初级抗体和二级抗体培养的各步骤后，用冰冷的PBS将细胞洗涤3次。将100μl底物TMB1组分(BIO FX，TMBW-0100-01)添加到培养板中并在室温下培养5-30分钟。通过添加100μl0.18M H₂SO₄来终止显色。离心细胞并将上清液转移到新培养板中，并在450nm(Soft MAX pro 4.0，分子装置有限公司(Molecular Devices Corporation)，加州桑尼维尔(Sunnyvale，CA))下读取。

如通过基于细胞的ELISA所确定的抗体嵌合XT-M4和XT-M4结合人类和狒狒RAGE的能力绘示于图14中。如通过基于细胞的ELISA所确定的嵌合抗体XT-M4和XT-M4结合由293细胞表达的细胞表面人类、狒狒、猴、小鼠和兔RAGE的EC50值展示于表7中。

实例15

与不同物种的RAGE的结合—通过免疫组织化学染色来确定

通过肺组织切片的免疫组织化学(IHC)染色来确定嵌合抗体XT-M4、大鼠XT-M4抗体以及鼠科抗体XT-H1、XT-H2和XT-H5结合人类、食蟹猴、狒狒和兔的肺组织中的内源细胞表面RAGE的能力。

对稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行工程改造以使其表达鼠科和人类RAGE全长蛋白。将鼠科和人类RAGE cDNA克隆到哺乳动物表达载体中，使其线性化并使用阳离子脂质体将其转染到CHO细胞中(考夫曼R.J.(Kaufman，R.J.)，1990，酶学方法(Methods in Enzymology)，185：537-66；考夫曼R.J.，1990，酶学方法，185：487-511；皮特曼D.D.(Pittman，D.D.)等人，1993，酶学方法，222：236)。另外，以20nM甲胺喋呤选择细胞并且采集个别克隆的细胞提取物，并通过SDS(十二烷基硫酸钠)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹加以分析以确定表达。

使用标准技术进行从狒狒、食蟹猴、兔中分离的RAGE肺组织或过度表达人类RAGE的中国仓鼠卵巢细胞或对照CHO细胞的免疫组织化学。使用1-15mg的RAGE抗体和大鼠IgG2b同型对照或小鼠同型对照。将嵌合XT-M4、XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.10、XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.11、XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.14生物素化，并使用0.2、1、5和10μg/ml的西格玛(Sigma)IgG1生物素化对照抗体。在用HRP和Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 488或与FITC连结的抗生物素检测后，另外用4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对切片染色。

图15绘示嵌合抗体XT-M4结合食蟹猴、兔和狒狒的肺组织中的RAGE。产生RAGE的细胞与嵌合XT-M4接触的样本中可见阳性IHC染色图案，但不存在RAGE或RAGE结合抗体的样本中并无图案。图16绘示大鼠抗体XT-M4结合正常人肺以及患有慢性阻塞性肺病(COPD)的人的肺中的RAGE。如通过肺组织切片的IHC染色所确定的大鼠XT-M4抗体和鼠科抗体XT-H1、XT-H2和XT-H5与脓毒症狒狒的肺和正常食蟹猴肺中的内源细胞表面RAGE的结合概述于表8中。将用表达编码hRAGE的DNA的表达载体稳定转染的CHO细胞用作阳性对照。

实例16

人类化鼠科抗人类RAGE抗体XT-H2的分子建模

鼠科抗人类RAGE抗体XT-H2HV结构域的分子建模

基于针对蛋白数据库(PDB)序列数据库的BLASTP搜索来选择用于建立鼠科XT-H2重链模型的抗体结构模板。使用InsightII的同源模组(homology module)(艾斯瑞公司(Accelrys)，圣迭戈(San Diego))，基于6个模板结构1SY6(抗CD3抗体)、1MRF(抗RNA抗体)和1RIH(抗肿瘤抗体)建构鼠科XT-H2的分子模型。基于各分子的Cα距离矩阵来确定模板的结构保守区(SCR)，并且基于SCR中相应原子的最小RMS差来叠加模板结构。将标靶蛋白大鼠XT-H2VH的序列与叠加模板蛋白的序列相比对，并且将SCR的原子坐标分配给标靶蛋白的相应残基。基于标靶与各SCR的模板之间的序列相似性程度，对不同SCR使用来自不同模板的坐标。通过如同源模组中所实施的搜索循环(Search Loop)或生成循环(Generate Loop)方法生成未包括在SCR中的环和可变区的坐标。

简单来说，搜索循环法扫描将模拟2个SCR之间的区域的蛋白结构，其是通过将侧接SCR残基的Cα距离矩阵与从具有相同侧接残基数和指定长度的插入的肽区段的蛋白结构得到的预先计算的矩阵相比较来进行的。评估搜索循环法的输出，首先发现侧接SCR残基中具有最小RMS差和最大序列一致性的匹配。随后，评估潜在匹配与标靶环序列之间的序列相似性。在搜索循环无法发现最佳匹配的情况下，使用生成循环法重新生成原子坐标。如果模板和标靶中的氨基酸残基一致，那么使氨基酸侧链的构象与模板中的氨基酸侧链构象保持相同。另一方面，进行旋转异构体的构象搜索并且使与模板和标靶中的残基不一致的残基保持能量最有利的构象。为优化两个相邻SCR(其坐标是根据不同模板而修改)之间以及SCR与环之间的剪接点，使用同源模组的剪接修复(Splice Repair)功能。剪接修复建立一个用于得出2个SCR之间或SCR与可变区之间的剪接点处的最佳键长和键角的分子力学模拟。最后，使所述模型经历使用最陡下降算法进行的能量最小化直到达到5千卡/(摩尔埃)或500个循环的最大梯度，并且使其经历共轭梯度算法直到达到5千卡/(摩尔埃)或2000个循环的最大梯度。使用同源模组的ProStat/Struct_Check效用来评估模型品质。

人类化抗RAGE XT-H2 HV结构域的分子建模

除所使用的模板不同外，遵循与关于小鼠XT H2抗体重链建模所述相同的程序，利用Insight II建构人类化(移植CDR)抗RAGE抗体XT-H2重链的分子模型。在此情况中所使用的结构模板为1L7I(抗Erb B2抗体)、1FGV(抗CD18抗体)、UPS(抗组织因子抗体)和1N8Z(抗Her2抗体)。

框架回复突变-人类化的模型分析和预测

关于以下特征中的一个或多个特征，比较亲代小鼠抗体模型与CDR移植的人类化型式的模型：CDR框架接触、影响CDR构象的潜在氢键和各个区域(诸如框架1、框架2、框架3、框架4和所述3个CDR)的RMS差。

预测单独以下回复突变和其组合对于通过CDR移植成功人类化极为重要：E46Y、R72A、N77S、N74K、R67K、K76S、A23K、F68A、R38K、A40R。

实例17

人类化大鼠抗RAGE抗体XT-M4的分子建模

大鼠抗鼠科RAGE抗体XT-M4HV结构域的分子建模

基于针对蛋白数据库(PDB)序列数据库的BLASTP搜索来选择用于建立大鼠XT-M4重链模型的抗体结构模板。使用InsightII的同源模组(艾斯瑞公司，圣迭戈)，基于6个模板结构1QKZ(抗肽抗体)、1IGT(抗犬淋巴瘤单克隆抗体)、8FAB(抗胂酸对偶氮苯酯抗体)、1MQK(抗细胞色素C氧化酶抗体)、1HOD(抗血管生长素抗体)和1MHP(抗α1β1抗体)建构大鼠XT-M4的分子模型。基于各分子的Cα距离矩阵来确定模板的结构保守区(SCR)，并且基于SCR中相应原子的最小RMS差来叠加模板结构。将标靶蛋白大鼠XT-M4VH的序列与叠加模板蛋白的序列相比对，并且将SCR的原子坐标分配给标靶蛋白的相应残基。基于标靶与各SCR的模板之间的序列相似性程度，对不同SCR使用来自不同模板的坐标。通过如同源模组中所实施的搜索循环或生成循环法生成未包括在SCR中的环和可变区的坐标。

简单来说，搜索循环法扫描将模拟2个SCR之间的区域的蛋白结构，其是通过将侧接SCR残基的Cα距离矩阵与从具有相同侧接残基数和指定长度的插入的肽区段的蛋白结构得到的预先计算的矩阵相比较来进行的。评估搜索循环法的输出，首先发现侧接SCR残基中具有最小RMS差和最大序列一致性的匹配。随后，评估潜在匹配与标靶环序列之间的序列相似性。在搜索循环无法发现最佳匹配的情况下，使用生成循环法重新生成原子坐标。如果模板和标靶中的氨基酸残基一致，那么使氨基酸侧链的构象与模板中的氨基酸侧链构象保持相同。另一方面，进行旋转异构体的构象搜索，并且使与模板和标靶中不一致的残基保持能量最有利的构象。为优化两个相邻SCR(其坐标是根据不同模板而修改)之间以及SCR与环之间的剪接点，使用同源模组的剪接修复功能。剪接修复建立一个用于得出2个SCR之间或SCR与可变区之间的剪接点处的最佳键长和键角的分子力学模拟。最后，使所述模型经历使用最陡下降算法进行的能量最小化直到达到5千卡/(摩尔埃)或500个循环的最大梯度，并且使其经历共轭梯度算法直到达到5千卡/(摩尔埃)或2000个循环的最大梯度。使用同源模组的ProStat/Struct_Check效用来评估模型品质。

XT-M4轻链可变结构域

使用1K6Q(抗组织因子抗体)、1WTL、1D5B(抗体AZ-28)和1BOG(抗p24抗体)作为模板，利用Modeler 8v2产生XT M4轻链可变结构域的结构模型。对于各标靶，如通过分子概率密度函数所界定，在100个初始模型中选择具有最低抑制违反的一个模型以供进一步优化。为进行模型优化，使用如Discovery Studio 1.6(艾斯瑞软件公司(Accelrys Software Inc.))中所实施的Charmm 27力场(艾斯瑞软件公司)和GeneralizedBorn虚拟溶剂(implicit solvation)来进行由最陡下降、共轭梯度和公认的基础牛顿-拉斐森方法(Adopted Basis Newton Raphson method)组成的能量最小化级联，直到满足0.01的RMS梯度。在能量最小化期间，使用10个质量力的简谐限制(harmonic constraint)来约束主链原子的移动。

人类化抗RAGE XT-M4 VH结构域的分子建模

除所使用的模板不同外，遵循与关于大鼠XT M4抗体重链建模所述相同的程序，利用Insight II建构人类化(移植CDR)抗RAGE XT M4抗体重链的分子模型。在此情况中所使用的结构模板为1MHP(抗α1β1抗体)、1IGT(抗犬淋巴瘤单克隆抗体)、8FAB(抗胂酸对偶氮苯酯抗体)、1MQK(抗细胞色素C氧化酶抗体)和1HOD(抗血管生成素抗体)。

人类化XT-M4轻链可变结构域

除所使用的模板不同外，遵循与关于大鼠XT M4抗体轻链建模所述相同的程序，使用Modeler 8v2建构人类化(移植CDR)抗RAGE XT M4抗体轻链的分子模型。在此情况中所使用的结构模板为作为模板的1B6D、1FGV(抗CD18抗体)、1UJ3(抗组织因子抗体)和1WTL。

框架回复突变-人类化的模型分析和预测

关于以下特征中的一个或多个特征，比较亲代大鼠抗体模型与CDR移植的人类化型式的模型：CDR框架接触、影响CDR构象的潜在氢键、各个区域(诸如框架1、框架2、框架3、框架4和所述3个CDR)的RMS差和计算的残基-残基相互作用的能量。将所鉴别的潜在回复突变单独或组合并入使用Insight II或Modeler 8v2建构的另一轮模型中，并且将所述突变体的模型与亲代大鼠抗体模型相比较以在电脑中(in silico)评估突变体的适应性。

预测单独以下回复突变和其组合对于通过CDR移植成功人类化极为重要：

重链：L114M、113V和A88S；

轻链：K45R、L46R、L47M、D70I、G66R、T85D、Y87H、T69S、Y36F、F71Y。

实例18

具有鼠科XT-H2和大鼠XT-M4抗体的CDR的人类化可变区

通过将鼠科XT-H2和大鼠XT-M4抗体的CDR移植到表9中所示的人类生殖系框架序列上并引入所选回复突变来制备人类化重链可变区。

人类化鼠科XT-H2重链和轻链可变区的氨基酸序列分别绘示于图17(SEQ ID NO：28-31)和图18(SEQ ID NO：32-35)中。

人类化大鼠XT-M4重链和轻链可变区的氨基酸序列分别绘示于图19(SEQ ID NO：36-38)和图20A-20B(SEQ ID NO：39-49)中。

产生框架序列的生殖系序列和人类化可变区的特定回复突变标识于表10中。

将编码人类化可变区的DNA序列亚克隆到含有编码人类免疫球蛋白恒定区的序列的表达载体中，并且使用标准程序在COS细胞中表达编码全长轻链和重链的DNA序列。将编码重链可变区的DNA亚克隆到pSMED2hIgG1m_(L234，L237)cDNA载体中，从而产生人类化IgG1抗体重链。将编码轻链可变区的DNA亚克隆到pSMEN2hκ载体中，从而产生人类化κ抗体轻链。参看图21。

实例19

竞争性ELISA方案

通过竞争性酶联免疫吸附剂检定(ELISA)来表征人类化XT-H2和XT-M4抗体以及嵌合XT-M4与人类RAGE-Fc的结合。为产生竞争剂，将亲代大鼠XT-M4抗体生物素化。用1μg/ml人类RAGE-Fc涂布ELISA板整夜。一式两份，将不同浓度的生物素化XT-M4添加到各孔(0.11-250ng/ml)中，培养，洗涤并用抗生蛋白链菌素-HRP检测。经计算的生物素化亲代大鼠XT-M4的ED50为5ng/ml。计算当与12.5ng/ml生物素化亲代XT-M4抗体竞争时嵌合和各人类化XT-M4抗体的IC50值。简单来说，用1μg/ml人类RAGE-Fc涂布各板整夜。一式两份，将与12.5ng/ml生物素化亲代大鼠XT-M4混合的不同浓度的嵌合抗体或人类化抗体添加到各孔(在9ng/ml到20μg/ml范围内)中。利用抗生蛋白链菌素-HRP检测生物素化亲代大鼠XT-M4抗体并计算IC50值。通过竞争性ELISA分析所测定的人类化抗体的IC50值展示于表11中。

类似地，通过竞争性ELISA来测定人类化XT-H2抗体与人类RAGE-Fc的结合的ED50值，并且将其绘示于图22中。

实例20

嵌合和人类化XT-M4抗体与其它细胞表面受体的交叉反应性

测试人类化XT-M4抗体XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.10和XT-M4-hVH-V2.0-2m/hVL-V2.11以及嵌合XT-M4与其它类RAGE受体的交叉反应性。由于这些受体与RAGE一样是在细胞表面表达并且其与配体的相互作用类似地依赖于电荷，故选择所述受体。所测试受体为rhVCAM-1、rhICAM-1-Fc、rhTLR4(C末端His标签)、rhNCAM-1、rhB7-H1-Fc、mLox1-Fc、hLoxl-Fc和hRAGE-Fc(作为阳性对照)。用1μg/ml所列受体蛋白涂布ELISA板整夜。一式两份，将不同浓度的上文所列的人类化和嵌合XT-M4抗体添加到各孔(0.03-20μg/ml)中，培养，洗涤并用抗人类IgG HRP检测。表12展示嵌合和人类化XT-M4抗体与人类和小鼠细胞表面蛋白的结合的直接结合ELISA分析的结果。所示数据为受体与20μg/ml(所测试的最高浓度)抗体之间所检测的结合的OD450值。

实例21

结合可溶人类RAGE的BIACORETM结合检定

通过BIACORE^TM捕获结合检定测量嵌合抗体XT-M4和人类化XT-M4抗体与可溶人类RAGE(hRAGE-SA)和可溶鼠科RAGE(mRAGE-SA)的结合。通过将抗人类Fc抗体以5000 RU涂布于流通池1-4中的CM5 BIA芯片(pH 5.0，7min.)上来进行所述检定。通过使2.0μg/ml的各抗体流过流通池2-4(流通池1用作参考)中的抗Fc抗体来捕获所述抗体。一式两份，使浓度为100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.25nM和0nM的抗生蛋白链菌素标记的经纯化可溶人类RAGE(hRAGE-SA)的溶液流过固定抗体并解离5分钟，且测定关于结合hRAGE-SA的动力学速率常数(k_a和k_d)以及缔合常数和解离常数(K_a和K_d)。有关嵌合XT-M4和人类化抗体XT-M4-V10、XT-M4-V11和XT-M4-V14结合hRAGE-SA和mRAGE-SA的结合结果分别绘示于图23和24中。

实例22

前导抗体(lead antibody)XT-H2的物种交叉反应性的优化

通过下述方法工程改造物种的交叉反应性：随机突变XT-H2抗体，产生蛋白变体文库并且选择性富集具有导致小鼠-人类RAGE交叉反应性的获得性突变的分子。使用核糖体展示技术(汉斯(Hanes)等人，2000，酶学方法(Methods Enzymol.)，328：404-30)和噬菌体展示技术(凯菲尔提(McAfferty)等人，1989，自然(Nature)，348：552-4)。

基于抗体XT-H2和HT-M4制备ScFv抗体

A.基于XT-H2的ScFv抗体

以VH/VL形式或VL/VH形式合成两个借助于柔性连接子DGGGSGGGGSGGGGSS(SEQ ID NO：50)连接的包含XT-H2V区的ScFv构筑体。成形为VL-VH和VH-VL形式的ScFv构筑体的序列分别绘示于图25(SEQ ID NO：51)和图26(SEQ ID NO：52)中。

B.基于XT-M4的ScFv抗体

以VH/VL形式或VL/VH形式合成两个借助于柔性连接子DGGGSGGGGSGGGGSS(SEQ ID NO：50)连接的包含XT-M4V区的ScFv构筑体。成形为VL-VH和VH-VL形式的ScFv构筑体的序列分别绘示于图27(SEQ ID NO：54)和图28(SEQ ID NO：53)中。

图29绘示活体外转录和翻译的M4和H2构筑体的ELISA数据。在4℃下，将ELISA板用碳酸氢盐缓冲液中的人类RAGE-Fc(5μg/ml)或BSA(200μg/ml)涂布整夜，用PBS+吐温0.05％洗涤，并且在室温下用2％奶粉PBS阻断1小时。在室温下，将所述板与活体外翻译的ScFv一起培养2小时。将所述板阻断并用抗Flag抗体(1/1000稀释液)、随后兔抗小鼠HRP(1/1000稀释液)检测。数据表明VL/VH或VH/VL构型的XT-H2和XT-M4抗RAGE抗体的可变区的ScFv构筑体可产生特异性结合人类RAGE的功能性折叠蛋白。使用如通过BIACORETM测定的两种形式的ScFV的Kd值以测定用于选择实验的最佳抗原浓度。

C.回收具有改善的小鼠/人类RAGE交叉反应性的变体的选择和筛选策略

通过易错PCR建立变体文库(格拉姆(Gram)等人，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89：3576-80)。此诱变策略在ScFv基因的全长内引入随机突变。随后，使用已确立的程序(例如，汉斯等人，2000，酶学方法，328：404-30)在活体外转录并翻译所述文库。使所述文库经历第1轮关于人类RAGE-Fc的选择，洗掉未结合的核糖体复合物，并洗脱抗原结合的核糖体复合物。回收RNA，通过RT-PCR将其转化成cDNA并使其经历第2轮关于小鼠RAGE-Fc的选择。所述交替选择策略优先富集结合人类和小鼠RAGE-Fc的克隆。随后，使此选择的产物再经历2次易错PCR。接着，使所产生的文库经历第3轮和轮分别有关人类RAGE-Fc和小鼠RAGE-Fc的选择。视需要重复此过程。将来自各选择步骤的RNA产物池转化成cDNA并将其克隆到蛋白表达载体pWRIL-1中以评估变体ScFv的物种交叉反应性。另外，对多样性池进行测序以评估多样性，从而确定选择是否接近具有物种交叉反应性的优势克隆。

实例23

前导抗体XT-M4的亲和力突变

经改善的亲和力转化为降低剂量或剂量频率和/或增加效用的潜在益处。使用与随机易错PCR诱变偶联的针对VH-CDR3的靶向诱变的组合方法，通过亲和力突变来改善对hRAGE的亲和力(格拉姆等人，1992，美国国家科学院院刊89：3576-80)。这产生能回收对人类RAGE具有改善的亲和力同时仍保持与小鼠RAGE-Fc的物种交叉反应性的分子的抗体变体文库。使用核糖体展示技术(汉斯等人，1997，同上文)和噬菌体展示技术(凯菲尔提等人，1989，同上文)。

图30绘示pWRIL-1中VL-VH形式的XT-M4和XT-H2ScFv构筑体的ELISA结合数据，所述构筑体在大肠杆菌中表达为可溶蛋白并针对关于人类RAGE-Fc和BSA的结合进行测试。ActRIIb表示由与阴性对照相同的载体表达的不结合蛋白。在4℃下，将ELISA板用碳酸氢盐缓冲液中的人类RAGE-Fc(5μg/ml)或BSA(200μg/ml)涂布整夜，用PBS+吐温0.05％洗涤，并且在室温下用2％奶粉PBS阻断1小时。使用标准程序进行20ml大肠杆菌培养物的周质制剂。未经纯化的ScFv抗体的周质制剂的最终体积为1ml，在室温下将其中50μl与利用2％奶粉PBS以1/1000稀释到100μl总体积的抗组氨酸抗体一起预培养1小时。将交联周质制剂添加到ELISA板中并在室温下再培养2小时。将板用PBS+0.05％吐温洗涤2次并用PBS洗涤2次，且将其与以1/1000稀释于2％奶粉PBS中的兔抗小鼠HRP一起培养。如先前所述洗涤所述板，并使用标准TMB试剂检测结合。数据表明，呈VL/VH构型的XT-M4和XT-H2抗体的ScFv构筑体可在大肠杆菌中产生特异性结合人类RAGE的功能性折叠可溶蛋白。使用如通过BIACORETM测定的两种形式的ScFV的起始Kd值以测定用于亲和选择的最佳抗原浓度。

实例24

用于回收具有改善的对hRAGE-Fc的亲和力同时保持物种交叉反应性的变体的选择和筛选策略

通过使用PCR进行的XT-M4的VH-CDR3的掺加示踪剂的诱变建立变体文库。图31示意性说明如何使用PCR将掺加示踪剂的突变引入XT-M4的CDR中。(1)设计在CDR环的长度内载有多样性区的掺加示踪剂的寡核苷酸并通过同源区与FR3和FR4中的标靶V基因连在一起。(2)将所述寡核苷酸用于具有特定引物的PCR反应中，所述引物退火与标靶V基因5′端黏合并与FR1区一致。图32绘示XT-M4 VL-VH ScFv构筑体的C末端的核苷酸序列(SEQ ID NO：56)。VH-CDR3加下划线。还绘示在各突变位点处具有标识用于在所述位点处突变的掺杂示踪剂的比率的数字的两个掺杂示踪剂的寡核苷酸(SEQ ID NO：57-58)。还标识出具有与所述数字对应的掺杂示踪剂的比率的核苷酸组成。

将XT-M4-VHCDR3掺杂的PCR产物作为Sfil片段克隆到核糖体展示载体pWRIL-3中以产生文库。使用核糖体展示，针对人类生物素化RAGE对此文库加以选择(汉斯(Hanes)和普拉克孙(Pluckthun)，2000)。由于生物素标记的抗原允许进行基于溶液的选择，所述选择使得能更好的对所述过程进行动力学控制并且增加优先富集较高亲和力克隆的可能性，所以使用此抗原。以平衡模式以相对于起始亲和力降低的抗原浓度或者以动力学模式(其中特定选择改善的解离速率以使用在以经验测定的时间范围与未经标记的抗原竞争)进行选择。将未结合的核糖体复合物洗去，洗脱抗原结合的核糖体复合物，回收RNA，通过RT-PCR将其转化为cDNA并且进行关于生物素化小鼠RAGE-Fc的第2轮选择以保持物种交叉反应性。随后，使来自此选择步骤的含有在VH-CDR3中具有突变的ScFv变体的产物经历2步骤的诱变循环。此诱变步骤涉及使用易错PCR产生随机突变。接着，使所产生的文库经历3轮针对低10倍的抗原浓度的生物素化人类RAGE-Fc的选择。视需要重复此过程。将来自各选择步骤的RNA产物池转化成cDNA且将其克隆到蛋白表达载体pWRIL-1中以归类变体ScFv的亲和力和物种交叉反应性。另外，对多样性池进行测序以评估多样性，从而确定选择是否接近优势克隆。

实例25

使用噬菌体展示进行的XT-M4的亲和力突变

将VH-CDR3掺杂文库克隆到图34中所示的噬菌体展示载体pWRIL-1中以供关于生物素化hRAGE进行选择。由于生物素标记的抗原与亲和力驱动的溶液中的选择较为相容，所以使用此形式。以平衡模式以相对于起始亲和力降低的抗原浓度或者以动力学模式(其中特定选择改善的解离速率以使用随经验测定的时间范围与未经标记的抗原竞争)进行选择。使用有关噬菌体展示的标准程序。

ScFv可二聚化，这使得选择和筛选程序变复杂。二聚化ScFv潜在地展示基于亲合力的结合，并且此增加的结合活性可支配选择。所述ScFv二聚化能力的改善而非亲和力的任何内在改善与最终治疗性抗体(其通常为IgG)具有极少关联。为避免由二聚化能力改变所产生的人工产物，使用Fab抗体形式，因为其通常不会二聚化。已将XT-M4重排为Fab抗体并将其克隆到新的噬菌体展示载体pWRIL-6中。此载体具有跨VH和VL区并且不会在人类生殖系V基因中进行频繁切割的限制性位点。这些限制性位点可用于VL和VH谱系的改组和组合组装。在一种策略中，将VH-CDR3和VL-CDR3掺杂文库都组合地组装到如图34所示的Fab展示载体中，并且针对亲和力的改善加以选择。

实例26

嵌合抗体XT-M4的物理表征

通过高效液相色谱(HPLC)/质谱)(MS)肽定位和利用在线MS检测的亚单元分析进行的初步表征已证实，如所预期，氨基酸序列是来自嵌合XT-M4DNA序列。这些MS数据还表明，Asn²⁹⁹SerThr处的预期N连接寡糖序列一致位点已被占据且两种主要物质为分别含有0个或1个末端半乳糖残基的复合N连接二天线核心岩藻糖基化聚糖。除位于分子Fc区的所预期的N连接寡糖外，在嵌合XT-M4重链的CDR2区中的序列一致位点(Asn⁵²AsnSer)处也观察到N连接寡糖。主要在仅一个重链上发现额外N连接寡糖，且其包含如通过CEX-HPLC分析所测定的约38％的分子(可能存在无法通过一级结构区分的其它酸性物质，其可构成酸性物质的总百分比)。主要物质为具有两个唾液酸的核心岩藻糖基化的二天线结构。使用吸收率，通过测量A₂₈₀计算浓度。经计算，嵌合XT-M4的理论吸收率为1.35mL mg^-1cm^-1。

如通过非还原SDS-PAGE所测定的嵌合XT-M4的表观分子量为约200kDa。抗体迁移比由其序列所预期的迁移慢。已在目前所分析的所有重组抗体中观察到此现象。在还原条件下，嵌合XT-M4具有以约50kDa迁移的单一重链谱带和以约25kDa迁移的单一轻链。还存在一个恰在所述重链谱带上方迁移的额外谱带。通过自动埃德曼降解(automated Edman degradation)来表征此谱带并且测定其具有与嵌合XT-M4的重链对应的NH₂末端。这些结果连同通过SDS-PAGE观察到的分子量增加表明，所述额外谱带与在CDR2区中具有额外N连接寡糖的重链相符。

基于氨基酸序列所预测的嵌合XT-M4的等电点(pI)为7.2(重链中无COOH末端Lys)。IEF将嵌合XT-M4解析为在约7.4-8.3的pI范围内迁移的约10个谱带，其中一个优势迁移谱带以约7.8的pI迁移。通过毛细管电泳等电聚焦所测定的pI为约7.7。

通过阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)进行的研发材料的分析进一步提供对具有不同分子电荷的嵌合XT-M4物质的解析。大部分所观察的电荷不均一性很可能是由在位于重链CDR2区中的额外N连接寡糖上所发现的唾液酸的作用所引起。所观察的少部分电荷不均一性可归因于COOH末端赖氨酸的不均一性。

实例27

糖基化位点的去除

如图36中所示，如通过直接结合hRAGE-Fc的ELISA分析所测定，将抗体XT-M4重链可变区中第52位(根据卡贝特编号)的天冬酰胺(N)转化为天冬氨酸(D)的突变改善XT-M4抗体与人类RAGE的结合。N52D突变是在抗体XT-M4重链可变区的CDR2中。

实例28

嵌合抗RAGE抗体功效的活体内临床前检定

A.药物动力学(PK)

针对嵌合XT-M4评估在对雄性BALB/c小鼠(n＝3)单次静脉内(IV)给与5mg/kg后嵌合抗体嵌合XT-M4的血清浓度。用IgG ELISA测量随时间的抗体的血清浓度。嵌合XT-M4的平均血清暴露为(23,235g·hr/mL)，并且半衰期为约1周(152小时)。参看图37。

实例29

记忆障碍的CFC模型

利用情境式恐惧制约(contextual fear conditioning，CFC)范例来检查投与特异性结合RAGE且抑制RAGE结合搭配物的结合的嵌合大鼠抗体XT-M4对因淀粉样蛋白沉积而引起的认知功能减弱的动物模型的认知效能的作用。

Tg2576模型小鼠发展淀粉样斑块达18个月并且在此之前，在6月大时发展海马CA1和齿状回中的LTP障碍、在经修饰水迷宫中的空间记忆障碍、突触可塑性削弱和Aβ聚集物和寡聚物增多。Aβ诱发无斑块的年轻Tg2576小鼠的情境式记忆障碍。情境式恐惧制约(一种海马依赖性学习和记忆测试)是在具有Aβ形成和淀粉样蛋白沉积的Tg2576转基因人类APP小鼠模型中进行。

情境式学习涉及将厌恶刺激(足底电击)与发生刺激的特制罐笼环境(情境)相关联。有关制约的记忆表现为在不存在电击的情况下的情境依赖性僵硬。通过将情境与简短的足底电击配对而将小鼠制约于操作室中。训练是由在操作室中进行的5分钟活动组成，在此期间，动物接收2次轻微的足底电击。当将动物再引入其先前已接受电击的环境中约24小时后，发生记忆测试。记录在记忆测试期间的活动水平并且通过对整个治疗组的ANOVA来分析处于“僵硬”状态所花费的时间，将其表示为时间总量的百分数。活动水平的降低表明关于厌恶事件的完整记忆。与非转基因的同窝仔畜相比，经测定Tg2576在14-16周龄之间发展情境式记忆障碍并且在20周龄时观察到完全障碍。

投与抗体

将对鼠科RAGE具特异性的嵌合XT-M4抗体稀释于PBS中并在第1天、第4天、第7天和第10天时将单次剂量(10mg/kg)经腹膜内(ip)投与20周龄的Tg2576和年龄相配的非转基因(野生型)同窝仔畜。投与中和(无活性)抗体作为对照。小鼠的训练是在第11天(即投与第4剂抗体后24小时)开始，并且在第12天时进行测试。

在第12天的测试期间检查记忆评分(僵硬增加)。通过相对于PBS治疗的转基因动物证实记忆障碍的逆转来测定功效。通过利用在0.1到30mg/kg范围内的剂量产生剂量-反应曲线来测定最小有效剂量(MED)。通过时程分析并且针对认知的改善评估训练前时间间隔的延长来测定在以已确立的MED单次免疫后功效的持续时间。

嵌合XT-M4抗体(κ，IgG1)呈现情境式记忆障碍的显著逆转。相比之下，投与不相关抗体和PBS对照的小鼠对Tg2576小鼠或野生型同窝仔畜的CFC未呈现作用。数据表明，投与针对鼠科RGE的嵌合单克隆XT-M4抗体对于改善阿兹海默氏病的APP转基因模型的认知有效。(参看图38)

材料与方法

小鼠

用于所述研究中的小鼠为表达人类APP蛋白的杂合雄性转基因Tg257618小鼠。通过PCR确定基因型，并排除视网膜变性(Rd)突变的所有纯合动物。背景株是由C57BI6和129SJL杂交株组成。对20周龄的小鼠(n＝8-12/基因型/年龄)进行情境式恐惧制约研究。

测试设备

在6个由铝制侧壁和树脂玻璃天花板、门和后墙构建的30×24×21cm操作室(MedAssociates公司，佛蒙特州圣艾班斯(St.Albans，VT))中进行情境式恐惧制约(CFC)。各室装备有由36个不锈钢杆组成的地板，可通过所述杆投与足底电击。此外，各室还具有2个刺激灯、一个照明灯和一个螺线管。照明、足底电击(US)和螺线管(CS)都是由PC运行的MED-PC软件控制。所述各室位于存在红光的隔音间中。

情境式恐惧制约

在第11天(即小鼠接收其第4剂嵌合XT-M4抗RAGE抗体后的一天)时，开始Tg2576小鼠或其年龄相配的野生型同窝仔畜的训练。

训练是由以下步骤组成：将小鼠放入操作室中，照亮刺激灯和照明灯，且使其探查2分钟。2分钟结束后，提供听觉暗示(经由螺线管以2Hz弹响；CS)达15秒。在CS最后2秒时投与足底电击(US；1.5mAmp)并且与CS提供一起终止。重复此程序，并在第二次足底电击后30秒，将小鼠从操作室中移出且使其回到其饲养笼中。

训练后20小时，使动物回到先前对其进行训练的室中。随后，通过使用以10秒间隔进行时间取样持续5分钟(30个样本点)的实验来记录在与动物接收电击(情境)相同的环境中的僵硬行为。僵硬是定义为缺乏除需要呼吸外的其它动作。5分钟结束时，使小鼠回到其饲养笼中。

在情境中测试所有小鼠后(在起始情境测试后约60分钟)，收集有关新颖和暗示条件下关于僵硬的资料。新颖环境是由改变操作室组成，包括从右后角到左前角的不透明树脂玻璃隔板、树脂玻璃地板以及减少的照明(仅照明灯)。将小鼠放入新颖情境中，并使用时间取样来收集僵硬得分达3分钟(18个样本点)。在3分钟结束时，提供听觉弹响刺激(CS)达3分钟，在此期间再次对僵硬评分(18个样本点)。将各动物的僵硬得分转化为测试各部分的僵硬百分比。通过用在情境中观察到的僵硬百分比减去新颖条件下(基本活动的量度)的僵硬百分比来获得各动物的情境记忆(情境式记忆)。

抗体治疗

将嵌合XT-M4抗体稀释到PBS(10mg/kg)中，并在第1天、第4天、第7天和第10天以及第11天训练和第12天测试时，对20周龄的Tg2576小鼠或其年龄相配的野生型同窝仔畜以单次剂量经腹膜内投与。

数据分析

使用两因子ANOVA和使用SAS统计软件(SAS Institute公司)进行的事后分析菲舍尔氏成对比较(post hoc Fischer′s pairwise comparison)来分析情境式记忆。所有数据都是以平均值±SEM形式来提供。

序列表

<110>惠氏公司

<120>预防和治疗淀粉样蛋白生成疾病的方法

<130>040000-0360546

<150>US 60/784,575

<151>2006-03-21

<150>US 60/895,303

<151>2007-03-16

<160>64

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>404

<212>PRT

<213>智人

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>基因库登陆号第NP_001127号

<400>1

<210>2

<211>1414

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>misc_feature

<223>基因库登陆号第NM_001136号

<400>2

<210>3

<211>403

<212>PRT

<213>鼠科

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>基因库登陆号第NP_031451号

<400>3

<210>4

<211>1348

<212>DNA

<213>鼠科

<220>

<221>misc_feature

<223>基因库登陆号第NM_007425.1号

<400>4

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>抗生蛋白链菌素标签序列

<400>5

<210>6

<211>1250

<212>DNA

<213>狒狒

<220>

<221>CDS

<222>(20)..(1231)

<400>6

<210>7

<211>403

<212>PRT

<213>狒狒

<400>7

<210>8

<211>1250

<212>DNA

<213>食蟹猴

<220>

<221>CDS

<222>(20)..(1231)

<400>8

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<211>403

<212>PRT

<213>食蟹猴

<400>9

<210>10

<211>1220

<212>DNA

<213>兔

<220>

<221>CDS

<222>(18)..(1196)

<400>10

<210>11

<211>392

<212>PRT

<213>兔

<400>11

<210>12

<211>1247

<212>DNA

<213>兔

<220>

<221>CDS

<222>(18)..(1223)

<400>12

<210>13

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<212>PRT

<213>兔

<400>13

<210>14

<211>402

<212>PRT

<213>褐家鼠

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>基因库第NP_445788号

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<211>5301

<212>DNA

<213>狒狒

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<212>PRT

<213>大鼠

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>XT-M4 VH

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>可变重链区

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<211>107

<212>PRT

<213>大鼠

<220>

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<223>XT-M4VL

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>可变轻链区

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<212>PRT

<213>鼠科

<220>

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<223>XT-H1VH

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>可变重链区

<400>18

<210>19

<211>106

<212>PRT

<213>鼠科

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>XT-H1VL

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>可变轻链区

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<210>20

<211>119

<212>PRT

<213>鼠科

<220>

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<223>XT-H5VH

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>可变重链区

<400>20

<210>21

<211>117

<212>PRT

<213>鼠科

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>XT-H2_VH

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>可变重链区

<400>21

<210>22

<211>112

<212>PRT

<213>鼠科

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>XT-H2-VL

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>可变轻链区

<400>22

<210>23

<211>111

<212>PRT

<213>鼠科

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>XT-H5VL

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>可变轻链区

<400>23

<210>24

<211>116

<212>PRT

<213>鼠科

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>XT-H3 VH

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>可变重链区

<400>24

<210>25

<211>107

<212>PRT

<213>鼠科

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>XT-H3VL

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>可变轻链区

<400>25

<210>26

<211>116

<212>PRT

<213>鼠科

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>XT-H7VH

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>可变重链区

<400>26

<210>27

<211>106

<212>PRT

<213>鼠科

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>XT-H7 VL

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>可变轻链区

<400>27

<210>28

<211>117

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-H2_hVH_V2.0

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化重链可变区的氨基酸序列

<400>28

<210>29

<211>117

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-H2_hVH_V2.7

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化重链可变区的氨基酸序列

<400>29

<210>30

<211>117

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>XT-H2_hVH_V4.0

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化重链可变区的氨基酸序列

<400>30

<210>31

<211>120

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-H2_hVH_V4.1

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化重链可变区的氨基酸序列

<400>31

<210>32

<211>112

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-H2_hVL_V2.0

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化轻链可变区的氨基酸序列

<400>32

<210>33

<211>112

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-H2_hVL_V3.0

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化轻链可变区的氨基酸序列

<400>33

<210>34

<211>112

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-H2_hVL_V4.0

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化轻链可变区的氨基酸序列

<400>34

<210>35

<211>112

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-H2_hVL_V4.1

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化轻链可变区的氨基酸序列

<400>35

<210>36

<211>119

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-M4_hVH_V1.0

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化重链可变区的氨基酸序列

<400>36

<210>37

<211>119

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-M4_hVH_V1,1

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化重链可变区的氨基酸序列

<400>37

<210>38

<211>119

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-M4_hVH_V2.0

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化重链可变区的氨基酸序列

<400>38

<210>39

<211>107

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-M4_hVL_V2.4\(G66R)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化轻链可变区的氨基酸序列

<400>39

<210>40

<211>107

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-M4_hVL_V2.5\(D70I)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化轻链可变区的氨基酸序列

<400>40

<210>41

<211>107

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-M4_hVL_V2.6\(T69S)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化轻链可变区的氨基酸序列

<400>41

<210>42

<211>107

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-M4_hVL_V2.7\(L46R)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化轻链可变区的氨基酸序列

<400>42

<210>43

<211>107

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-M4_hVL_V2.8

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化轻链可变区的氨基酸序列

<400>43

<210>44

<211>107

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-M4_hVL_V2.9\(F71Y)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化轻链可变区的氨基酸序列

<400>44

<210>45

<211>107

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-M4_hVL_V2.10

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化轻链可变区的氨基酸序列

<400>45

<210>46

<211>107

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-M4_hVL_V2.11

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化轻链可变区的氨基酸序列

<400>46

<210>47

<211>107

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-M4_hVL_V2.12

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化轻链可变区的氨基酸序列

<400>47

<210>48

<211>107

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-M4_hVL_V2.13

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化轻链可变区的氨基酸序列

<400>48

<210>49

<211>107

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>人类化XT-M4_hVL_V2.14

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>人类化轻链可变区的氨基酸序列

<400>49

<210>50

<211>16

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>连接子

<400>50

<210>51

<211>783

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>XT.H2_VL-VH(直接)ScFv序列

<400>51

<210>52

<211>783

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>XT.H2_VH-VL(直接)ScFv序列

<400>52

<210>53

<211>774

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>XT.M4_VH_VL ScFv序列

<400>53

<210>54

<211>774

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>XT.M4_VL_VH ScFv序列

<400>54

<210>55

<211>41

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>M4 ScFv的C末端-VL/VH形式

<400>55

<210>56

<211>123

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>M4 ScFv的C末端-VL/VH形式

<400>56

<210>57

<211>86

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于M4 VL/VH的VH3-CDR3诱变的掺加示踪剂的寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(61)..(70)

<223>N为A、T、C或G

<400>57

<210>58

<211>53

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>用于M4 VL/VH的VH3-CDR3诱变的掺加示踪剂的寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(28)..(37)

<223>N为A、T、C或G

<400>58

<210>59

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工序列

<400>59

<210>60

<211>27

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工序列

<400>60

<210>61

<211>41

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工序列

<400>61

<210>62

<211>48

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>人工序列

<400>62

<210>63

<211>476

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>抗RAGE scFv-Fc融合蛋白

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>具有wt人类IgG1 Fc VL-连接子-VH的huXT-M4 V2.11scFv-Fc

<400>63

<210>64

<211>1428

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>编码抗RAGE scFv-Fc融合蛋白

<220>

<221>misc_feature

<223>huXT-M4 VL V2.11-VH V2.0wt-Fc序列

<400>64

Claims (43)

1.一种治疗患有以Aβ淀粉样沉积物为特征的疾病或病症的个体的方法，其包含对所述个体投与治疗有效量的特异性结合RAGE(晚期糖基化终产物受体)且抑制RAGE结合搭配物的结合的抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述个体为人类个体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述疾病或病症是以脑中Aβ淀粉样沉积物为特征。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述疾病或病症为阿兹海默氏病(Alzheimer′sdisease)。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述疾病或病症为临床前阿兹海默氏病。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体：

(a)与选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体竞争与RAGE的结合；

(b)与结合选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体的RAGE的表位结合；

(c)包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体的轻链或重链的一个或多个互补决定区(CDR)；或

(d)为根据(a)、(b)或(c)的抗体的RAGE结合片段。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗体或RAGE结合抗体片段包含：

轻链可变区，其包含XT-M4轻链可变区(SEQ ID NO：17)的CDR；

重链可变区，其包含XT-M4重链可变区序列(SEQ ID NO：16)的CDR；

人类κ轻链恒定区；和

人类IgG1重链恒定区。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗体或其RAGE结合片段包含：

轻链可变区，其具有XT-M4轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)；

重链可变区，其具有XT-M4重链可变区序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)；

人类κ轻链恒定区；和

和人类IgG1重链恒定区。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体为嵌合抗体、人类化抗体或人类抗体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述嵌合抗体或人类化抗体包含人类恒定区或由其衍生的恒定区。

11.根据权利要求1所述的方法，其包含投与所述抗体或其RAGE结合片段与一种或多种可用于治疗阿兹海默氏病的药剂组合，以由此引起协同治疗作用。

12.一种抑制或减少个体Aβ淀粉样沉积物积累的方法，其包含对所述个体投与有效量的特异性结合RAGE且抑制RAGE结合搭配物的结合的抗体。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述个体为人类个体。

14.根据权利要求12所述的方法，其包含抑制或减少脑中Aβ淀粉样沉积物积累。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述脑中Aβ淀粉样沉积物积累与阿兹海默氏病相关。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述脑中Aβ淀粉样沉积物积累与临床前阿兹海默氏病相关。

17.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗体：

(a)与选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体竞争与RAGE的结合；

(b)与结合选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体的RAGE的表位结合；

(c)包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体的轻链或重链的一个或多个互补决定区(CDR)；或

(d)为根据(a)、(b)或(c)的抗体的RAGE结合片段。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗体或RAGE结合抗体片段包含：

轻链可变区，其包含XT-M4轻链可变区(SEQ ID NO：17)的CDR；

重链可变区，其包含XT-M4重链可变区序列(SEQ ID NO：16)的CDR；

人类κ轻链恒定区；和

人类IgG1重链恒定区。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述抗体或其RAGE结合片段包含：

轻链可变区，其具有XT-M4轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)；

重链可变区，其具有XT-M4重链可变区序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)；

人类κ轻链恒定区；和

和人类IgG1重链恒定区。

20.根据权利要求12所述的方法，其中所述抗体为嵌合抗体、人类化抗体或人类抗体。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述嵌合抗体或人类化抗体包含人类恒定区或由其衍生的恒定区。

22.根据权利要求12所述的方法，其包含投与所述抗体或其RAGE结合片段与一种或多种可用于抑制或减少Aβ淀粉样沉积物的药剂组合，以由此引起协同作用。

23.一种抑制或减少个体神经退化的方法，其包含对所述个体投与有效量的特异性结合RAGE且抑制RAGE结合搭配物的结合的抗体。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述个体为人类个体。

25.根据权利要求23所述的方法，其包含抑制或减少脑中神经退化。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述神经退化与阿兹海默氏病相关。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述神经退化与临床前阿兹海默氏病相关。

28.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗体：

(a)与选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体竞争与RAGE的结合；

(b)与结合选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体的RAGE的表位结合；

(c)包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体的轻链或重链的一个或多个互补决定区(CDR)；或

(d)为根据(a)、(b)或(c)的抗体的RAGE结合片段。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述抗体或RAGE结合抗体片段包含：

轻链可变区，其包含XT-M4轻链可变区(SEQ ID NO：17)的CDR；

重链可变区，其包含XT-M4重链可变区序列(SEQ ID NO：16)的CDR；

人类κ轻链恒定区；和

人类IgG1重链恒定区。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗体或其RAGE结合片段包含：

轻链可变区，其具有XT-M4轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)；

重链可变区，其具有XT-M4重链可变区序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)；

人类κ轻链恒定区；和

和人类IgG1重链恒定区。

31.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗体为嵌合抗体、人类化抗体或人类抗体。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述嵌合抗体或人类化抗体包含人类恒定区或由其衍生的恒定区。

33.根据权利要求23所述的方法，其包含投与所述抗体或其RAGE结合片段与一种或多种可用于抑制或减少神经退化的药剂组合，以由此引起协同作用。

34.一种抑制或减少个体认知能力下降或改善认知能力的方法，其包含对所述个体投与有效量的特异性结合RAGE且抑制RAGE结合搭配物的结合的抗体。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述个体为人类个体。

36.根据权利要求34所述的方法，其中所述认知能力下降与阿兹海默氏病相关。

37.根据权利要求34所述的方法，其中所述认知能力下降与临床前阿兹海默氏病相关。

38.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗体：

(a)与选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体竞争与RAGE的结合；

(b)与结合选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体的RAGE的表位结合；

(c)包含选自由XT-H1、XT-H2、XT-H3、XT-H5、XT-H7和XT-M4组成的群组的抗体的轻链或重链的一个或多个互补决定区(CDR)；或

(d)为根据(a)、(b)或(c)的抗体的RAGE结合片段。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述抗体或RAGE结合抗体片段包含：

轻链可变区，其包含XT-M4轻链可变区(SEQ ID NO：17)的CDR；

重链可变区，其包含XT-M4重链可变区序列(SEQ ID NO：16)的CDR；

人类κ轻链恒定区；和

人类IgG1重链恒定区。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述抗体或其RAGE结合片段包含：

轻链可变区，其具有XT-M4轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)；

重链可变区，其具有XT-M4重链可变区序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)；

人类κ轻链恒定区；和

和人类IgG1重链恒定区。

41.根据权利要求34所述的方法，其中所述抗体为嵌合抗体、人类化抗体或人类抗体。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述嵌合抗体或人类化抗体包含人类恒定区或由其衍生的恒定区。

43.根据权利要求34所述的方法，其包含投与所述抗体或其RAGE结合片段与一种或多种可用于抑制或减少认知能力下降或改善认知能力的药剂组合，以由此引起协同作用。

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