KR20120108061A

KR20120108061A - 아포지단백질 ｅ의 ｃ말단 단편에 결합하는 항체

Info

Publication number: KR20120108061A
Application number: KR1020127023844A
Authority: KR
Inventors: 크리스터 노르트스테트; 톰 골드쉬미트; 마리아 헨데릭스; 레네 호에트; 헨드리쿠스 호겐봄; 시몬 후프톤; 크리스틴 브이. 안데르쏜; 요한나 린드퀴스트; 단 순네마르크; 세르기 레오노브
Original assignee: 다이엑스 코포레이션; 아스트라제네카 아베
Priority date: 2003-11-28
Filing date: 2004-11-26
Publication date: 2012-10-04
Also published as: CN1890266A; NO20063026L; AU2004293180A1; WO2005051998A2; JP2008502311A; KR20060120161A; EP2343318A2; TW200530267A; EP1687336A2; GB0426043D0; US20100061993A1; RU2006122946A; EP2343318A3; UY28641A1; IL175608A0; GB2408508A; AR047729A1; JP4869074B2; CA2547675A1; BRPI0417023A

Abstract

본 발명은 (i) 아포지단백질 E의 C-말단 도메인 (ApoE-CTD)의 서열 1에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 일부의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 결합하고; (ii) 인간 플라크와 결합하는 인간 항체 또는 항체 단편을 제공한다.

Description

아포지단백질 Ｅ의 Ｃ말단 단편에 결합하는 항체 {ANTIBODIES BINDING TO A C-TERMINAL FRAGMENT OF APOLIPOPROTEIN E}

본 발명은 아포지단백질 E (ApoE)의 C-말단 단편과 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이러한 폴리펩티드를 수득하는 방법; 및 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 전신성 아밀로이드증 (systemic amyloidosis) 및 기타 아밀로이드 질환을 진단 및 치료하는데 있어서의 상기 폴리펩티드의 용도를 제공한다.

아밀로이드증은 하나 이상의 기관 (장기) 또는 신체계 내에 단백질이 비정상적으로 침착되는 것을 특징으로 하는 원인 불명의 진행성인 불치의 대사성 질환이다. 아밀로이드 단백질은 예를 들어, 골수 기능장애에 의해 제조된다. 축적된 아밀로이드 침착물이 정상적인 신체 기능에 손상을 주는 경우에 발병하는 아밀로이드증은 기관 기능상실 또는 사망을 유발시킬 수 있다. 이는 인구 1,000,000명당 약 8명에게서 발병하는 희귀병이다. 이 질환은 남성과 여성에게서 동등한 수준으로 발생하고 통상 40세 이상에게서 나타난다. 지금까지 15가지 이상 유형의 아밀로이드증이 확인되었다. 각각은 상이한 종류의 단백질 침착과 연관이 있다.

아밀로이드증의 주요 형태들은 원발성 전신성, 이차, 및 가족성 또는 유전성 아밀로이드증이다. 또한, 알츠하이머병과 연관된 또 다른 형태의 아밀로이드증이 있다. 원발성 전신성 아밀로이드증은 통상적으로, 50세와 60세 사이 연령에게서 발생한다. 매년 대략 2,000개의 새로운 증례가 진단되긴 하지만, 현재 미국에서는 원발성 전신성 아밀로이드증이 이러한 질환의 가장 흔한 형태이다. 또한 경쇄 관련 아밀로이드증으로서 공지된 질환이 다발성 골수종 (골수암)과 연관해서 발생할 수도 있다. 이차 아밀로이드증은 만성 감염 또는 염증 질환에 따른 결과이다. 이는 종종, 가족성 지중해열 (오한, 쇠약, 두통 및 재발성 발열을 특징적으로 나타내는 세균성 감염증), 육아종성 회장염 (소장의 염증), 호지킨병 (Hodgkin's disease), 나병 (Leprosy), 골수염 및 류마티스성 관절염과 연관이 있다.

가족성 또는 유전성 아밀로이드증는 이러한 질환의 유일한 유전적 형태이다. 이는 대부분의 인종 집단 구성원에게서 발생하고, 각 가족은 독특한 패턴의 증상과 기관 병발 (involvement)을 나타낸다. 유전성 아밀로이드증은 상염색체 우성 질환인 것으로 여겨지는데, 이는 결함있는 유전자 중의 1개 카피 (copy) 만이 상기 질환을 유발시키는데 필요하다는 것을 의미한다. 가족성 아밀로이드증 환자의 자식에게서 이러한 질환이 발병할 확률은 50 대 50이다.

아밀로이드증은 신체 내의 모든 기관이나 계에서 발병할 수 있다. 심장, 신장, 위장계 및 신경계가 대부분 감염된다. 아밀로이드가 축적되는 기타 통상적인 부위로는 뇌, 관절, 간, 비장, 췌장, 호흡기계 및 피부가 있다.

알츠하이머병 (AD)은 정상적인 일상 생활 활동을 방해하기에 충분히 심각한 수준의 정신 능력 상실이 6개월 이상 지속되고 출생시부터 존재하지는 않는 것을 특징으로 하는 신경계 질환인 치매의 가장 흔한 형태이다. AD는 대개 노인에게서 발병하며, 기억력, 사고력 및 기획력과 같은 인지 기능 저하를 특징적으로 나타낸다.

2백만 내지 4백만 미국인이 AD를 앓고 있는데, 21세기 중반까지는 전 연령층에 있어 그 수가 천4백만까지 증가할 것으로 예상된다. 이들 중 40대와 50대 연령층 수가 작긴 하지만, AD는 중장년층에게서 주로 발병한다. AD는 65세 내지 74세 연령층의 약 3%, 75세 내지 84세 연령층의 약 20%, 및 85세 이상 연령층의 약 50%에게서 발병한다. 여성이 남성 보다 더 오래 산다는 것을 고려한다고 해도, 남성 보다는 여성에게서 AD 발병률이 약간 더 높으므로, 대부분의 발병 연령층에서 여성이 차지하는 비율이 더 높다.

아밀로이드 생성에 책임이 있는, 아밀로이드 전구체 단백질 또는 APP에 대한 유전자를 포함한 몇 가지 유전자가 AD에 밀접한 영향을 끼쳐 왔다. 이러한 유전자 상의 돌연변이가, 비교적 보기 드문 조기-발증 (early-onset) 형태 AD의 몇몇 증례와 연관이 있다. 기타 AD 조기 발증례는 프레세닐린 유전자, PS-1 및 PS-2 상의 돌연변이에 의해 유발된다. AD와 유사한 치매는 궁극적으로, 염색체 21번의 규정 외 카피로 인해 유발된 다운 증후군 (Downs syndrome)에 걸린 거의 모두에게서 발병한다. 기타 염색체 상의 기타 돌연변이는 다른 조기 발증례와 관련이 있어 왔다.

잠재적으로 가장 중요한 유전적 연관성이 1990년대 초 염색체 19번 상에서 발견되었다. 이러한 염색체 상의 유전자인 apoE는 지질을 신경원으로 수송하는 데에 관여한 단백질을 암호화한다.

아포지단백질 E (ApoE)는 34 kDa 당화 단백질이다. 주요 ApoE 생성 부위는 간과 뇌이다. ApoE는 초저밀도 지단백질 (VLDL), 고밀도 지단백질의 아부류 및 킬로미크론 (chylomicron)의 구성분이다. 지질 복합체의 세포성 흡수는 ApoE를 저밀도 지단백질 (LDL) 수용체 및 기타 관련 수용체에 결합시킴으로써 매개된다.

인간에게는 3가지 주요 ApoE 이소형, 즉 apoE2, apoE3 및 apoE4가 있는데, 이는 3가지 대립유전자 ε2, ε3 및 ε4의 생성물이다. 전반적 집단에서는 ε3 대립유전자가 가장 흔한 것인데, 이는 모든 apoE 대립유전자의 78%를 차지한다. ε4 대립유전자의 빈도는 말기 발증 산발성 및 가족성 알츠하이머병 (AD) 환자 집단에게서 상당히 증가한다.

ApoE는 무작위-코일 영역에 의해 연결된 C-말단 도메인 (ApoE-CTD)과 N-말단 도메인 (ApoE-NTD)을 함유한다. 이러한 C-말단 도메인은 지질 결합 부위를 포함하고, N-말단 도메인은 지단백질 수용체와 결합된다. CTD 아미노산 서열은 ApoE의 3가지 이소형 모두에게서 동일하다. CTD와 NTD는 트롬빈으로의 절단에 의해 격리시킬 수 있다.

ApoE와 아밀로이드 β (Aβ) 간의 직접적인 상호 작용이 시험관 내에서 입증되었다. ApoE는 AD 플라크에 존재하기도 한다. ApoE의 N-말단 도메인 (ApoE-NTD)이 ApoE가 Aβ에 결합하는 것을 매개한다고 보고되었다 [참고: Golabek et al., (2000) Biophysical Journal 79: 1008-1015]. 그러나, ApoE를 함유하는 AD 플라크는 이러한 플라크의 중앙에 완전한 길이의 ApoE를 포함하고, 플라크의 주변부 (말초)에는 ApoE의 C-말단 도메인 단편 (ApoE-CTD)을 포함하는 것으로 밝혀졌다 [참고: Cho et al., (2001) J. Neuropathology and Expt. Neurology 60: 342-349]. 플라크 내에서의 Aβ_1-42 침착은 ApoE 침착 보다 먼저 일어나는 반면, Aβ_1-40 침착은 플라크 돌연변이에 있어 ApoE 침착 다음에 일어나는 것으로 밝혀졌다 [참고: Terai et al., (2001), Brain Research 900: 48-56].

뇌에서의 ApoE의 기능이 AD에 대해 특이적인 것으로 여겨지지 않는다. ApoE는 급성 뇌 손상으로부터의 회복을 조절하는데 있어 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 특히, 임상 연구와 동물 연구 모두로부터, ApoE4 이소형의 존재가 각종 급성 뇌 손상으로부터의 불충분한 수준의 신경계 회복과 연관이 있다는 것을 제안하는 명백한 증거가 있다.

본 발명자들은 혈액내 지단백질 입자 중의 아포지단백질 E (ApoE)와 같은 기타 형태의 ApoE에서는 접근 가능하지 않거나 제한된 수준으로만 접근 가능한, 알츠하이머 플라크를 포함한 아밀로이드 침착물에서 발견된 단백질 응집물에 노출되는 ApoE 영역에 대해 지시된 치료적 항체를 개발하였다.

따라서, 본 발명은

- (i) 아포지단백질 E의 C-말단 도메인 (ApoE-CTD)의 서열 1에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 일부의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 결합하고;

(ii) 인간 플라크와 결합하는

인간 항체 또는 항체 단편;

- (i) ApoE-CTD의 서열 1에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 일부의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 결합하고;

(ii) 서열 20, 서열 512, 서열 513, 서열 514, 서열 515, 서열 516 또는 서열 517에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 영역을 포함하는

인간 항체 또는 항체 단편;

(ii) 서열 29, 서열 47, 서열 50, 서열 53, 서열 56, 서열 59, 서열 62, 서열 65, 서열 68, 서열 71, 서열 74, 서열 77, 서열 80, 서열 83, 서열 86 및 서열 89에 나타낸 서열들 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 영역을 포함하는

인간 항체 또는 항체 단편;

- VLDL의 존재 하에, 서열 1에 나타낸 ApoE-CTD 아미노산 서열 또는 그의 일부의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 결합하는 인간 항체 또는 항체 단편;

- (i) 인간 플라크와 결합하고,

인간 항체 또는 항체 단편;

- (i) 인간 플라크와 결합하고,

인간 항체 또는 항체 단편;

- 서열 136에 나타낸 중쇄 서열과 서열 521 및 522에 나타낸 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편;

- 서열 142에 나타낸 중쇄 서열과 서열 523에 나타낸 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편;

- 서열 40에 나타낸 중쇄 서열과 서열 517 및(또는) 518에 나타낸 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편;

- 서열 40에 나타낸 중쇄 서열과 서열 519 및(또는) 520에 나타낸 경쇄 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편;

- 서열 24에 나타낸 중쇄 CDR1 서열, 서열 25에 나타낸 중쇄 CDR2 서열, 및 서열 207, 209 및 210 중의 어느 하나에 나타낸 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편;

- 서열 48에 나타낸 중쇄 CDR1 서열, 서열 49에 나타낸 중쇄 CDR2 서열, 및 서열 320, 322 및 323 중의 어느 하나에 나타낸 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편;

- 서열 66에 나타낸 중쇄 CDR1 서열, 서열 67에 나타낸 중쇄 CDR2 서열, 및 서열 373에 나타낸 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편;

- 모노클로날 항체인, 전술된 것들 중의 어느 하나에 따르는 항체 또는 항체 단편;

- 인간 또는 동물 신체를 치료하는 방법, 또는 인간 또는 동물 신체 상에서 실시한 진단 방법에 사용하기 위한, 본 발명에 따르는 항체 또는 항체 단편;

- 아밀로이드 질환의 치료 또는 예방용 약물을 제조하는데 있어서의, 본 발명에 따르는 항체 또는 항체 단편의 용도;

- 본 발명에 따르는 항체 또는 항체 단편과, 제약상 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물;

- 본 발명에 따르는 항체 또는 항체 단편의 치료적 유효량을, 아밀로이드 질환으로 고통받고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 대상체에게서 아밀로이드 질환을 치료하는 방법;

- (i) 특정 대상체에게 본 발명에 따르는 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계;

(ii) 상기 항체 또는 항체 단편이 상기 대상체 내의 플라크와 결합하는지를 결정함으로써 (이러한 항체 또는 항체 단편이 플라크와 결합하는 것이 아밀로이드 질환의 지표이다) 대상체에게 아밀로이드 질환이 있는지를 결정하는 단계

를 포함하여, 상기 대상체에게서 아밀로이드 질환을 진단하는 방법;

- 본 발명에 따르는 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

- 본 발명에 따르는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;

- 본 발명에 따르는 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포;

- 본 발명에 따르는 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 바이러스;

- 본 발명에 따르는 항체 또는 항체 단편과, 이러한 항체 또는 항체 단편을 탐지하기 위한 수단을 포함하는, ApoE-CTD 탐지용 키트;

- (i) 특정 대상체로부터 취한 샘플을, 본 발명에 따르는 항체 또는 항체 단편이 ApoE-CTD와 결합할 수 있도록 하는 조건 하에 상기 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계; 및

(ii) 상기 항체 또는 항체 단편이 상기 샘플과 결합하는지를 결정함으로써 샘플 내에 ApoE-CTD가 존재하는지를 탐지하는 단계

를 포함하여, 상기 대상체로부터의 샘플 중에 ApoE-CTD가 존재하는지를 탐지하는 방법을 제공한다.

본 발명의 항체를 이용하여 알츠하이머병, 전신성 아밀로이드증 및 기타 아밀로이드 질환을 진단 및 치료할 수 있다.

도 1은 ELISA에서 바이오티닐화 CTD (bCTD) 및 VLDL에 대한 공지된 모노클로날 항체의 결합을 도시한 것이다.
도 2는 bCTD (배경 = 0.05) 및 VLDL (배경 = 0.1)에 대한 파아지의 결합을 도시한 것이다.
도 3은 203 파아지 클론 상의 bCTD (A) 및 VLDL (B) ELISA의 한 예를 도시한 것이다.
도 4는 bCTD 피복된 sFab 항체 M27E11 (A), M28B02 (B) 및 M26F05 (C)에 대한 비아코어 (Biacore) 친화성 분석 결과와, 칩 상에 피복된 Fab M27E11을 이용한 비아코어 친화성 분석 결과 (D)를 도시한 것이다.
도 5는 Fab를 pBhl로 전이시키는 전략을 나타낸 도식적 다이아그램이다.
도 6은 인간 CTD, 뮤린 CTD 및 영장류 CTD에 대한 항체 807A-M0028-B02 (M28BO2) (A), 807A-M0026-FO5 (M26F05) (B) 및 807A-M0027-E11 (M27E11) (C)의 결합을 도시한 것이다.
도 7은 bCTD 및 bNTD에 대한 대조군 항체 PH1 (A) 및 807A-M0028-B02 (M28B02) (B)의 결합을 도시한 것이다.
도 8은 피복된 VLDL에 대한 대조군 항체 PH1 (A) 및 807A-M0028-B02 (M28B02) (B)의 결합을 도시한 것이다.
도 9는 경쟁적 ELISA에서, 피복된 bCTD (0.05 ㎍/ml)와 용액 중의 과량의 VLDL 또는 CTD 간의 항체 결합 결과를 도시한 것이다.
도 10은 CTD-대조군 칩 상에서 가용성 Fab (상부) 및 IgG (하부)로서의 807A-M0026-F05 (M26F05)의 비아코어 분석을 도시한 것이다.
도 11은 CTD-피복된 칩 상에서 가용성 Fab (상부) 및 IgG (하부)로서의 807A-M0027-E11 (A) 및 807A-M0028-B02 (B)의 비아코어 분석을 도시한 것이다.
도 12 및 13은 비아코어 칩과 간접적으로 커플링된 Fab 807A-M0027-E11 (M27E11)에 대한 용액 중의 bCTD의 결합을 도시한 것이다.
도 14는 V-영역을 pBhl로부터 pRmk2a로 전이시키는데 사용된 전략을 나타내는 도식적 다이아그램이다.
도 15는 CTD 펩티드의 서열을 도시한 것이다.
도 16은 실시예 21의 선별 캠페인을 도시한 것이다.
도 17은 실시예 22의 선별 캠페인을 도시한 것이다.
도 18은 실시예 23의 선별 캠페인을 도시한 것이다.
도 19는 '컷 앤드 페이스트 (cut and paste)' 항체 재편성 전략을 도시한 것이다.
도 20은 인간 AD 뇌 절편에서의 807A-M0028-B02 플라크 결합이 VLDL의 존재 하에서 차단되지 않는다는 것을 도시한 것이다. 시험관 내에서 인간 아밀로이드 플라크에 대한 807A-M0028-B02의 결합이 VLDL의 존재에 의해 영향을 받지 않았는데, 이는 상기 항체가 플라크 중의 CTD에 비해 VLDL 중의 CTD에 대한 친화도가 극히 낮다는 것을 지시해준다.
도 21은 인간 AD 뇌 박편 상에서의 sFab 항체 클론의 시험관내 면역조직화학 (IHC) 스크린 결과를 도시한 것이다. 면역조직화학에 의해 AD 플라크와 결합하는, 상이한 선별물로부터의 몇 가지 항체 (Fab 클론)를 확인하였다. 개개의 클론이 동일한 간략 명칭을 가질 수 있다는 것을 인지해야 하는데, 즉 E11은 상이한 선별물로부터의 것이고, 동일하지도 않다 [Cl1 = 807B-M0004-H03; (선별물 A) El1 = 807A-M0027-E11; B2 = 807A-M0028-B02; (선별물 B) El1 = 807B-M0083-E11; D10 = 807B-M0079D10; A3 = 807B-M0004-A03; A12 = 807B-M0013-A12].
도 22는 인간, 영장류 및 뮤린 ApoE-CTD에 대한 807A-M0028-B02, 807A-M0028-B02.1 및 807A-M0028-B02.2의 농도 의존성 결합에 관한 대표적 결과 (이중 샘플)를 도시한 것이다.
도 23은 인간 VLDL에 대한 807A-M0028-B02, 807A-M0028-B02.1, 807A-M0028-B02.2, 807B-M0004-H03, 807B-M0004-H03.1, 807B-M0004-A03 및 807B-M0004-A03.1의 농도 의존성 결합에 관한 대표적 결과 (이중 샘플)를 도시한 것이다.
도 24는 APP/PS1 마우스로부터의 뇌 조직 박편 중에서 807A-M0028-B02 플라크 결합에 대한 탐지를 도시한 것이다:
a) 주사한지 4일 후 807A-M0028-B02의 생체내 결합;
b) 주사한지 7일 후 807A-M0028-B02의 생체내 결합.
도 25는 807B M0004H03, 807B-M0004-A03, 807B-M0079-D10 및 807B-M0009-F06의 생체내 플라크 결합 능력에 관한 스크린 결과를 도시한 것이다. 생체내 투여 후 APP/PS1 마우스 뇌 박편에서의 항-CTD hIgG 클론 B807B-M0004H03, 807B-M0004-A03, 807B-M0079-D10 및 807B-M0009-F06의 면역조직화학 발현 패턴이 도시되어 있다.
도 26은 인간 AD 뇌 박편에서의 친화성 성숙된 Fab-클론의 플라크 결합 능력에 관한 시험관내 스크린 결과를 도시한 것이다. 야생형 클론 807B-M0004-A03 (wt A03)을 친화성 성숙된 클론 807B-M0118-B09 (B09), 807B-M0117-F05 (F05), 807B-M0117-G01 (G01) 및 807B-M0118-F03 (F03)과 비교하였다. 인간 AD 뇌 박편 상에서의 항-CTD 결합 항체 (Fab 클론)에 의해 아밀로이드 플라크가 가시화되었다.
도 27은 807A-M0028-B02, 807B-M0004-H03, 807B-M004-A03, 807B-M0079-D10 및 807B-M0009-F06의 친화성 성숙에 사용된 전략을 도시한 것이다.
서열의 간단한 설명
서열 1은 ApoE-CTD의 아미노산 서열이다.
서열 2는 펩티드 1의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 1 내지 16)이다.
서열 3은 펩티드 2의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 17 내지 32)이다.
서열 4는 펩티드 3의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 33 내지 48)이다.
서열 5는 펩티드 4의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 49 내지 64)이다.
서열 6은 펩티드 5의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 65 내지 80)이다.
서열 7은 펩티드 6의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 9 내지 24)이다.
서열 8은 펩티드 7의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 25 내지 40)이다.
서열 9는 펩티드 8의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 41 내지 56)이다.
서열 10은 펩티드 9의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 57 내지 72)이다.
서열 11은 펩티드 10의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 73 내지 84)이다.
서열 12는 펩티드 4 내의 에피토프의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 53 내지 60)이다.
서열 13은 펩티드 4 및 9 내의 에피토프의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 57 내지 64)이다.
서열 14는 펩티드 9 내의 에피토프의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 61 내지 68)이다.
서열 15는 펩티드 1 및 6 내의 에피토프의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 9 내지 16)이다.
서열 16은 펩티드 4 및 8 내의 에피토프의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 49 내지 56)이다.
서열 17은 펩티드 3 및 8 내의 에피토프의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 41 내지 48)이다.
서열 18은 펩티드 1 및 6의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 1 내지 24)이다.
서열 19는 펩티드 8 및 9의 아미노산 서열 (ApoE-CTD의 아미노산 41 내지 72)이다.
서열 20은 항체 807A-M0027-Ell 및 807A-M0028-B02로부터의 컨센서스 (consensus) CDR3 서열의 아미노산 서열이다.
서열 21 내지 164는 표 8에 기재되어 있다.
서열 165는 인간 ApoE4의 아미노산 서열이다.
서열 166은 인간 ApoE3의 아미노산 서열이다.
서열 167은 인간 ApoE2의 아미노산 서열이다.
서열 168은 인간 ApoE4의 성숙한 형태의 아미노산 서열이다.
서열 169는 인간 ApoE3의 성숙한 형태의 아미노산 서열이다.
서열 170은 인간 ApoE2의 성숙한 형태의 아미노산 서열이다.
서열 171 내지 206은 표 8에 기재되어 있다.
서열 207 내지 511은 표 38 내지 42에 기재되어 있다.
서열 512는 807A-M0028-B02의 친화성 성숙된 클론의 CDR3 영역의 컨센서스 아미노산 서열이다.
서열 513은 807B-M0004-A03의 친화성 성숙된 클론의 CDR3 영역의 컨센서스 아미노산 서열이다.
서열 514는 807B-M0004-H03의 친화성 성숙된 클론의 CDR3 영역의 컨센서스 아미노산 서열이다.
서열 515는 807B-M0009-F06의 친화성 성숙된 클론의 CDR3 영역의 컨센서스 아미노산 서열이다.
서열 516은 807A-M0028-B02의 선별된 친화성 성숙된 클론의 CDR3 영역의 컨센서스 아미노산 서열이다.
서열 517은 807B-M0004-A03의 선별된 친화성 성숙된 클론의 CDR3 영역의 컨센서스 아미노산 서열이다.
서열 518 내지 527은 표 21에 규정되어 있다.

A. 폴리펩티드

본 발명은 혈액내 지단백질 입자 중의 아포지단백질 E (ApoE)와 같은 기타 형태의 ApoE에는 존재하지 않거나 접근 가능하지 않는, 알츠하이머 플라크와 같은 아밀로이드 침착물에서 발견된 단백질 응집물에 노출되는 ApoE 상의 특정 영역과 결합하는 항체를 제공한다.

본 발명의 목적상, 용어 "항체"에는 달리 규정하지 않는 한 항체 단편이 포함된다.

전형적으로, 본 발명의 항체는 아포지단백질 E의 C-말단 도메인 (ApoE-CTD)과 결합하는데, 즉 ApoE-CTD와 반응성이다. 본 발명의 항체는 아포지단백질 E의 N-말단 도메인 (ApoE-NTD)과는 결합하지 않는다. 본 발명의 항체는 전형적으로, VLDL에 존재하는 ApoE 형태 보다는 오히려 인간 플라크 내에 존재하는 ApoE 형태와 결합한다. 일반적으로, 인간 플라크 내에 존재하는 ApoE 형태는 ApoE-CTD이다. 본 발명의 항체는 바람직하게는, 초저밀도 지단백질 (VLDL)의 존재 하에 ApoE-CTD와 결합한다. 본 발명의 항체는 ApoE-CTD 내의 에피토프와 결합하는 것일 수 있는데, 이러한 에피토프는 VLDL과 연관된 ApoE에는 존재하지 않는다. 예를 들어, 상기 에피토프는 ApoE가 VLDL와 연관된 경우에는 항체에 노출되지 않거나 접근 가능하지 않은 것일 수 있다. 항체와 결합하는 에피토프는 전형적으로, VLDL에 존재하는 완전한 길이의 ApoE 내에 숨겨질 수 있으므로, ApoE에 대한 항체의 친화성은 ApoE-CTD에 대한 그의 친화성 보다 실질적으로 덜하다. 항체와 결합하는 에피토프는 ApoE-CTD에서만 존재하고 ApoE-NTD에는 존재하지 않으므로, 항체는 전형적으로 ApoE-NTD와의 결합이 없다. ApoE-NTD에 대한 항체의 어떠한 결합도 일반적으로, ApoE-CTD에 대한 항체의 특이적 결합 보다 친화도가 실질적으로 저하된 비-특이적 결합이다. 실질적으로 저하된 친화도는 일반적으로, 2배, 3배, 5배, 10배, 50배 또는 100배 이상 저하된 친화도이다.

따라서, 본 발명의 항체는 ApoE-CTD에 우선적으로 결합하거나 이와 특이적으로 결합한다. 항체가 ApoE-CTD에 우선적으로 또는 이와 고 친화도로 결합하지만, 다른 폴리펩티드와는 실질적으로 결합하지 않거나, 전혀 결합하지 않거나 또는 단지 저 친화도로 결합하는 경우에, 이러한 항체가 ApoE-CTD에 "우선적으로 결합"하거나 이와 "특이적으로 결합"한다. 항체의 특이적 결합 능력을 결정하기 위한, 결합, 경쟁적 결합 또는 면역방사측정 검정에 대한 각종의 프로토콜이 당해 분야에 널리 공지되어 있다 [참고: Maddox et al, J. Exp. Med. 158, 1211-1226, 1993]. 이러한 면역검정은 전형적으로, 특이적 단백질과 그의 항체 간에 복합체를 형성하고, 이러한 복합체 형성을 측정하는 것을 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 항체는 서열 1에 나타낸 서열을 갖는 ApoE-CTD와 10⁷M^-1 이상의 친화도 상수, 바람직하게는 10⁸M^-1, 10⁹M^-1 또는 10¹⁰M^-1 이상의 친화도 상수로 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는 바람직하게는, 비-특이적 폴리펩티드, 예를 들어 BSA, 카세인, VLDL, ApoE-NTD 또는 VLDL에 존재하는 ApoE와의 결합에 대한 그의 친화도 보다 적어도 2배, 10배, 50배, 100배 이상의 친화도로 ApoE-CTD에 우선적으로 결합할 수 있다.

ApoE-CTD와 특이적으로 결합하는 항체는 전형적으로, 고정화 ApoE-CTD 상에서는 ELISA에서 2x 이상 배경 결합을 디스플레이하지만, 대조군 단백질, 예를 들어 ApoE- NTD 또는 스트렙타비딘에 대해서는 2x 미만 배경, 전형적으로는 1x 배경을 디스플레이한다.

본 발명의 항체는 일반적으로, 인간 플라크와 결합한다. 용어 "인간 플라크"는 인간 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 단백질을 포함하는 모든 아밀로이드 침착물을 포괄한다. 바람직하게는, 인간 플라크가 인간 조직 내에 존재하거나 이로부터 유래한다. 보다 바람직하게는, 인간 플라크가 인간 대상체로부터 수득한 샘플 내에 존재한다. 이러한 인간 대상체는 아밀로이드 질환, 예를 들어 전신성 아밀로이드증 또는 알츠하이머병이 있을 수도 있다. 상기 샘플은 아밀로이드 플라크를 함유하는 어떠한 조직이나 기관으로부터도 취할 수 있다. 적합한 조직 및 기관에는 뇌, 혀, 장, 골격근, 평활근, 신경, 피부, 인대, 심장, 간, 비장 및 신장이 포함된다. 대상체가 알츠하이머병에 걸린 경우에는, 상기 샘플이 일반적으로 뇌 박편이다. 이러한 뇌 박편은 전형적으로, 사후에 수득한다. 이러한 샘플로부터 제조된 원섬유 역시 용어 "인간 플라크" 내에 포함된다.

인간 플라크는 1개 이상, 예를 들어 2개 또는 3개의 인간 단백질 (이러한 인간 단백질(들)은 아밀로이드 침착물 내에서 발견된다)에 대해 트랜스제닉 (transgenic)인 비-인간 동물 내에 존재하거나 이로부터 유래된다. 인간 단백질은 바람직하게는 ApoE이지만, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) [전형적으로, 스웨덴식 (Swedish) 돌연변이를 포함함] 또는 프레세닐린 (presenilin)일 수 있다.

인간 플라크에 대한 결합은 적합한 어떠한 방법에 의해서도 결정할 수 있다. 예를 들어 IHC 검정에서는, 일차적으로 시험된 2개의 아밀로이드 침착물 샘플 중의 <20 ㎍/ml 항체로 염색시킨 후에 양성 블라인드 스코어링 IHC 신호가 수득되면, 또는 1개 샘플이 일차 시험에서 음성인 경우에 후속 시험된 3개 샘플 중에서 적어도 2개가 인간 플라크에 대한 항체 결합을 지시하게 되면, 인간 플라크에 대한 항체 결합이 이루어 진다고 간주할 수 있다. 상기 샘플은 바람직하게는, 상이한 개개인으로부터 유래된 것이며, 아밀로이드 마커 (예: Aβ)에 대해 IHC 양성인 조직학적으로 확인된 아밀로이드 침착물을 수반한 조직 샘플로부터 절단된 것이다.

인간 플라크와 결합할 수 있는 항체의 능력은 알츠하이머병 또는 전신성 아밀로이드증에 걸린 마우스 또는 기타 비-인간 동물 모델, 예를 들어 설치류 또는 영장류를 사용하여 생체 내에서 결정할 수 있다.

이러한 검정에서는, IHC를 사용하여 플라크에 대한 항체의 결합을 결정할 수 있다. 항체를 시험하기에 앞서 표지시킬 수 있다. 플라크에 대한 결합은 시험된 3마리 마우스 중의 적어도 2마리에게서, ≤ 1 mg 항체를 1회분 용량 또는 수 회분 용량으로 나누어 주사한 후 아밀로이드의 양성 블라인드 스코어링 IHC 염색으로서 규정될 수 있다. 이 신호를 일반적으로, 음성 이소형 부합된 대조군 항체 주사된 마우스로부터의, 해부학적으로 염색된 성별 및 연령 적합 조직으로부터의 신호와 비교한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "에피토프"는 특별한 결합성 폴리펩티드와 접촉하게 하는 특정 분자의 부분을 지칭한다. 에피토프는 해당 항원으로부터의 거의 선형인 아미노산 서열을 포함하는 선형이거나, 또는 다른 서열들에 의해 격리되긴 하지만, 서로 함께 구조적으로, 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 형성하는 서열을 포함하는 입체 형태적일 수 있다.

항체와 결합하는 ApoE-CTD 내의 에피토프는 완전한 길이의 ApoE로부터 절단한 후 ApoE-CTD 상에 출현할 수 있다. 또 다른 한편, 에피토프는 ApoE-CTD와 아밀로이드 플라크와의 상호 작용 후에 출현할 수 있는데, 예를 들어 Aβ에 대한 ApoE-CTD의 결합에 따른 결과로서 출현할 수 있다. ApoE의 절단 및(또는) 아밀로이드 플라크에 대한 ApoE-CTD의 결합으로 인해, 새로운 선형 (펩티드) 에피토프가 노출될 수 있고/있거나 새로운 입체 형태적 에피토프가 노출 또는 형성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 에피토프는 ApoE와 VLDL의 기타 성분들 간의 상호 작용으로 인해, VLDL-관련 ApoE 내에 숨을 수도 있다. 이러한 폴리펩티드는 ApoE-CTD와 Aβ 간에 형성된 복합체와 특이적으로 결합할 수 있다.

ApoE-CTD의 아미노산 서열이 서열 1에 나타나 있다. 따라서, ApoE-CTD 에피토프는 서열 1에 나타낸 바와 같은 ApoE-CTD의 서열 내의 선형 또는 입체 형태적 서열에 의해 형성될 수 있다. ApoE-CTD와 결합하는 항체는 전형적으로, 서열 1에 나타낸 완전한 서열을 갖는 ApoE-CTD 폴리펩티드와 결합하지만, 서열 1의 아미노산 서열의 일부, 예를 들어 서열 2 내지 19 중의 어느 하나에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 결합할 수도 있다. 바람직하게는, 상기 항체가 서열 2, 서열 5, 서열 7, 서열 9, 서열 10, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 또는 서열 17에 나타낸 펩티드들 중의 하나 이상과 결합한다. 항체와 결합하는 ApoE-CTD의 일부는 서열 1의 3개 이상의 아미노산 단편, 바람직하게는 5개, 6개, 7개 또는 8개 이상 아미노산 단편, 보다 바람직하게는 10개, 12개 또는 16개 아미노산 단편이다.

항체와 결합하는 폴리펩티드 (또는 펩티드)는 재조합 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 용액 중에 있거나, 보다 바람직하게는 고형 표면에 부착될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드가 비드, 예를 들면, 자기 비드에 부착될 수 있다.

폴리펩티드를 바이오티닐화할 수도 있다. 펩티드와 접합된 바이오틴 분자를 사용하여, 바이오틴을 고형 표면 상의 스트렙타비딘과 커플링시킴으로써 폴리펩티드를 고형 표면 상에 고정화시킬 수 있다.

알츠하이머병 및(또는) 전신성 아밀로이드증을 치료 또는 예방하는데 사용하기 적합한 본 발명의 항체는 전형적으로, 생체외 포식세포 검정에서 양성으로 시험된다. 양성 포식세포 검정은 시험된 3개의 배양물 중의 적어도 2개에서, 항체 ≤ 20 ㎍/ml를 적용한 후 아밀로이드 조직 상에서 동시 배양한 후 아밀로이드를 함유하는 포식세포를 양성 블라인드 스코어링 공초점 현미경 탐지한 것으로서 규정된다. 신호를 일반적으로, 동일한 농도의 음성 대조군 항체를 함유하는 동일한 동시-배양물로부터의 신호와 비교한다. 양성 포식세포 검정은 일반적으로, 예를 들어 웨스턴 블롯에 의해 나타낸 바와 같이, 동일한 농도의 음성-대조군 항체를 함유하는 동일한 동시-배양물로부터의 블롯과 비교해서 3일 정도 동시 배양한 후 잔존하는 Aβ계 밀도의 1/3 미만이 되도록 아밀로이드를 분해시켜 준다.

치료적으로 사용하기 위한 항체 및 기타 펩티드는 이들이 뇌 중의 저 농도 하에서도 (이러한 농도는 전신 주사 후에 증가하게 될 것이다) 최적으로 기능할 수 있도록 하기 위해 ApoE-CTD에 대한 친화도가 높은데, 바람직하게는 친화도가 < 1 nM이다.

용어 "항체"는 1개 이상, 바람직하게는 2개의 중쇄 가변 영역 (VH) 및(또는) 1개 이상, 바람직하게는 2개의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단백질을 지칭한다. VH 영역과 VL 영역은 "상보성 결정 영역 (CDR)"으로 지칭되는 초가변성 영역으로 추가로 세분되는데, 이러한 영역은 "골격 영역 (FR)"으로 지칭되는, 보다 보존된 영역에 산재되어 있다. FR 및 CDRs의 정도는 정확히 규정되었다 [참고: Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest , Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chothia et al. (1987) J. Mol . Biol . 196: 901-917; 이들 전문이 본원에 참고로 도입된다]. 각 VH 및 VL은 다음 순서로 N-말단에서부터 C-말단으로 배열된 3개의 CDRs과 4개의 FRs로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

항체의 VH 또는 VL 쇄는 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 전부 또는 일부를 추가로 포함함으로써, 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린을 각각 형성할 수 있다. 한 양태에서는, 항체가 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 사량체인데, 이러한 중쇄와 경쇄는 예를 들어, 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, 즉 CL로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합성 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 전형적으로, 면역계의 각종 세포 및 보체계의 제1 성분을 포함한 숙주 조직 및 인자에 대한 항체의 결합을 매개한다. 용어 "항체"에는 유형 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM 및 이들의 아유형의 본래의 면역글로불린이 포함된다. 바람직한 면역글로불린은 IgG이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역글로불린"은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 암호화된 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 지칭한다. 인식된 인간 면역글로불린 유전자에는 카파, 람다, 알파 (IgAl 및 IgA2), 감마 (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자 뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자가 포함된다. 완전한 길이의 면역글로불린 경쇄 (약 25 kD 또는 214개 아미노산)는 N-말단에서 가변 영역 유전자 (약 110개 아미노산)에 의해 암호화되고 C-말단에서 카파 또는 람다 불변 영역 유전자에 의해 암호화된다. 완전한 길이의 면역글로불린 중쇄 (약 50 kD 또는 446개 아미노산)는 N-말단에서 가변 영역 유전자 (약 116개 아미노산)에 의해 암호화되고 C-말단에서 기타 전술된 불변 영역 유전자 중의 하나, 예를 들면 감마 (약 330개 아미노산을 암호화함)에 의해 암호화된다.

본 발명의 항체 단편은 전형적으로, 항원-결합성 단편이다. 용어 "항원-결합성 단편"은 ApoE-CTD와 특이적으로 결합할 수 있는, 완전한 길이의 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 결합성 단편의 예에는 (i) Fab 단편 (VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편); (ii) F(ab')₂ 단편 [힌지 (hinge) 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편]; (iii) Fd 단편 (VH 및 CH1 도메인으로 이루어짐); (iv) Fv 단편 [항체의 단일 암 (arm)의 VH 및 VL 도메인으로 이루어짐); (v) dAb 단편 (VH 도메인으로 이루어짐); (vi) 분리된 CDR; (vii) 단일 쇄 Fv (scFv) (VH 및 VL 도메인이 1가 분자를 형성하도록 쌍을 이루게 하는 재조합 수단을 사용하여 합성 링커에 의해 연결된 항체의 단일 암의 VH 및 VL 도메인으로 이루어짐); (viii) 디아보디 (diabody) (VH 및 VL 도메인이 1가 분자를 형성하도록 쌍을 이루지 않는 방식으로 VH 및 VL 도메인을 연결시킨 2개의 scFvs로 이루어지는데; 이러한 scFv 각각의 VH 도메인은 다른 scFv의 VL 도메인과 쌍을 이루어 2가 분자를 형성한다); (ix) 이중-특이적 항체 (2개 이상의 항원 결합성 영역으로 이루어지는데, 각 영역은 상이한 에피토프와 결합한다)가 포함된다. 바람직하게는, 항체 단편이 Fab 단편 또는 단일 쇄 항체 (scFv)이다.

바람직한 CDR1 도메인의 서열은 서열 21, 24, 27, 30, 33, 36, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 93, 111, 117 및 123에 나타나 있다. 기타 바람직한 CDR1 도메인은 해당 서열 내의 하나 이상의 아미노산이 결실되었거나, 보다 바람직하게는 치환된 상기 서열의 변이체이다. 기타 바람직한 CDR1 도메인은 서열 21, 24, 27, 30, 33, 36, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 93, 111, 117 및 123 중의 어느 하나에 나타낸 서열의 변이체인데, 여기서는 하나 이상의 아미노산이 삽입되었다. 바람직하게는, 변이체 CDR1 도메인이 1개 이상, 예를 들어 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환물, 바람직하게는 보존적 치환물을 포함한다. 이러한 CDR1 변이체 서열의 예는 표 38, 39, 40, 41 및 42에서 확인된 LV-CDR1 서열이다. 바람직한 CDR1 서열에는 서열 33, 219, 226, 218, 326, 93, 325, 391 및 394가 포함된다.

바람직한 CDR2 도메인의 서열은 서열 22, 25, 28, 31, 34, 37, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 94, 112, 118 및 124에 나타나 있다. 기타 바람직한 CDR2 도메인은 해당 서열 내의 하나 이상의 아미노산이 결실되었거나, 보다 바람직하게는 치환된 상기 서열의 변이체이다. 기타 바람직한 CDR2 도메인은 서열 22, 25, 28, 31, 34, 37, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 94, 112, 118 및 124 중의 어느 하나에 나타낸 서열의 변이체인데, 여기서는 하나 이상의 아미노산이 삽입되었다. 바람직하게는, 변이체 CDR2 도메인이 1개 이상, 예를 들어 2개, 3개, 4개 또는 5개의 치환물, 바람직하게는 보존적 치환물을 포함한다. 이러한 CDR2 변이체 서열 예는 표 38, 39, 40, 41 및 42에서 확인된 LV-CDR2 서열이다. 바람직한 CDR2 서열에는 서열 382, 386, 333, 334, 34, 247 및 252가 포함된다.

바람직한 CDR3 도메인의 서열은 서열 23, 26, 29, 32, 35, 38, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 95, 113, 119 및 125에 나타나 있다. 기타 바람직한 CDR3 도메인은 해당 서열 내의 하나 이상의 아미노산이 결실되었거나, 보다 바람직하게는 치환된 상기 서열의 변이체이다. 기타 바람직한 CDR3 도메인은 서열 23, 26, 29, 32, 35, 38, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 95, 113, 119 및 125 중의 어느 하나에 나타낸 서열의 변이체인데, 여기서는 하나 이상의 아미노산이 삽입되었다. 바람직하게는, 변이체 CDR3 도메인이 1개 이상, 예를 들어 2개 또는 3개의 보존적 치환물을 포함한다.

보존적 치환물이 다음 표에 나타나 있다. 두 번째 칼럼의 동일한 블록 내의 아미노산, 및 바람직하게는 세 번째 칼럼의 동일 선상의 아미노산을 서로 치환할 수 있다.

변이체 CDR3 서열의 예는 표 38, 39, 40, 41 및 42에서 확인된 HV-CDR3 및 LV-CDR3 서열이다. 바람직한 변이체 CDR3 서열은 서열 207, 209, 210, 35, 269, 252, 34, 322, 323, 320, 341, 373 및 378에 나타나 있다.

바람직한 항체는 (i) 서열 39에 나타낸 VH 서열, 또는 그의 변이체, 및 서열 42에 나타낸 VL 서열, 또는 그의 변이체; (ii) 서열 40에 나타낸 VH 서열, 또는 그의 변이체, 및 서열 43에 나타낸 VL 서열, 또는 그의 변이체; (iii) 서열 41에 나타낸 VH 서열, 또는 그의 변이체, 및 서열 44에 나타낸 VL 서열, 또는 그의 변이체를 포함한다.

기타 바람직한 항체는 서열 317, 318, 319, 369, 370, 371, 372 및 397에 나타낸 서열들 중에서 선택된 중쇄 서열과, 임의로 서열 43, 295, 294, 304, 347, 348, 357, 362, 406 및 418 중에서 선택된 경쇄 서열을 포함한다. 보다 바람직한 항체에는 다음과 같은 중쇄 서열과 경쇄 서열의 조합을 나타내는 항체가 포함된다: 서열 319와 43, 서열 318과 295, 서열 318과 294, 서열 317과 304, 서열 370과 347, 서열 370과 348, 서열 371과 348, 서열 372와 348, 서열 369와 357, 서열 370과 362, 서열 397과 406, 서열 397과 418.

변이체 항체는 적합한 어떠한 방법에 의해서도 수득할 수 있다. 전형적으로, 결합 특징이 개선된 변이체는 친화성 성숙에 의해 선별된다.

바람직한 양태에서는, 항체가 재조합 또는 변형된 항-ApoE-CTD 항체, 예를 들어 키메라, 인간화, 탈면역화 또는 시험관 내에서 발생된 항체이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합", 또는 "변형된" 항체에는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 창출 또는 분리되는 모든 항체가 포함되는데, 예를 들면, (i) 숙주 세포 내로 형질감염시킨 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현시킨 항체; (ii) 재조합의 조합적 항체 라이브러리로부터 분리된 항체; (iii) 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 동물 (예: 마우스)로부터 분리된 항체; 또는 (iv) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 기타 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 기타 모든 수단에 의해 제조, 발현, 창출 또는 분리된 항체가 있다. 이러한 재조합 항체에는 인간화, CDR 그래프트화, 키메라, 탈면역화, 시험관 내에서 발생된 항체가 포함되고, 이는 인간 생식세포계 면역글로불린 서열로부터 유래된 불변 영역을 임의로 포함할 수 있다.

본 발명에 따르는 항체는 인간 항체이다. 이러한 항체는 키메라 항체, 재조합 항체, 인간화 항체, 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 바람직하게는, 항체가 모노클로날이다.

항체를 기능적 잔기, 예를 들어 약물, 탐지가능한 잔기 또는 고형 지지체와 접합시킬 수 있다.

또한 본 발명의 범위 내에 포함되는 것은 ApoE-CTD의 상이한 에피토프와 결합하는 2개 이상의 항체를 포함하는 조성물이다. 이러한 조성물 중의 항체는 중복 에피토프와 결합할 수 있다. 중복 에피토프와 결합하는 항체는 서로 ApoE-CTD와 결합하는 것을 경쟁적으로 억제시킨다.

항체는 바람직하게는 단일-특이적, 예를 들어 모노클로날 항체이거나, 그의 항원 결합성 단편이다. 이중-특이적 및 다가 항체 또한 제공되는데, 이중-특이적 또는 다가 항체는 ApoE-CTD의 2개 이상의 상이한 에피토프와 결합한다.

*본 발명의 항체는 결합성 잔기, 예를 들어 바이오틴에 연결시킬 수 있다. 예를 들어, 항체, 바람직하게는 IgG를 설포석신이미딜-2-(바이오틴아미도) 에틸-1,3-디티오프로피오네이트와 함께 항온 배양함으로써, 이러한 항체를 바이오티닐화시킬 수 있다. 바이오티닐화 IgG는 바람직하게는, 1 내지 5개, 예를 들면, 2, 3 또는 4개의 바이오틴기를 포함한다.

본 발명의 항체는 실질적으로 분리된 형태일 수 있다. 이들 항체를, 이들의 의도한 용도를 방해하지 않는 담체 또는 희석제와 혼합할 수 있는데, 이는 여전히 실질적으로 분리된 것으로 간주된다. 본 발명의 항체는 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수도 있는데, 이러한 경우 이들 항체는 일반적으로, 제제의 건조 중량 또는 폴리펩티드의 90% 이상, 예를 들어 95%, 98% 또는 99% 이상을 차지할 것이다.

B. 항체의 확인 방법

본 발명은 또한, 본 발명에 따르는 항체를 확인하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 전형적으로, 서열 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 또는 그의 일부의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 결합하고 인간 플라크와 결합하는 항체를 확인하는 것을 포함한다. 어느 하나의 결합 검정 또는 양 결합 검정을 VLDL의 존재 하에 수행할 수 있다. 상기 방법은 일반적으로, 디스플레이 라이브러리를 제공하고; 바람직하게는 VLDL의 존재 하에, ApoE-CTD 또는 그의 단편과 결합하고/하거나 인간 플라크와 결합하는 항체를 암호화하는 구성원을 확인하기 위해 상기 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 디스플레이 라이브러리는 실재물의 집합인데, 각 실재물에는 접근 가능한 항체 성분, 및 이러한 항체 성분을 암호화 또는 확인하는 회수 가능한 성분이 포함된다. 항체 성분은 어떠한 길이로도 존재할 수 있는데, 예를 들면 3개 아미노산 내지 300개 이상 아미노산, 예를 들어 30, 100 또는 200개 아미노산일 수 있으며, 이는 전형적으로 항체 단편, 바람직하게는 Fab 단편이다. 선별에서는, 라이브러리의 각 구성원의 항체 성분을 ApoE-CTD로 프로빙하고, 항체 성분이 ApoE-CTD 또는 그의 단편과 결합하는 경우에는, 전형적으로 지지체 상의 체류에 의해 디스플레이 라이브러리 구성원을 확인한다. ApoE-CTD와 결합하는 디스플레이 라이브러리 구성원을 대상으로 하여, 전형적으로 ApoE-NTD에 대한 결합을 알아보기 위해 시험할 수 있다 (음성 선별).

유지된 디스플레이 라이브러리 구성원을 상기 지지체로부터 회수한 다음 분석한다. 이러한 분석에는 증폭, 및 유사하거나 유사하지 않은 조건 하에서의 후속 선별이 포함될 수 있다. 예를 들어, 양성 선별과 음성 선별을 교대로 수행할 수 있다. 분석에는 또한, 항체 성분의 아미노산 서열을 결정하는 것과, 상세한 성상 확인을 위해 항체 성분을 정제하는 것이 포함될 수 있다.

각종 포맷을 디스플레이 라이브러리에 사용할 수 있다. 적합한 모든 포맷을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 바람직한 포맷은 파아지 디스플레이 및 세포-이용 디스플레이, 예를 들어 효모 디스플레이이다.

파아지 디스플레이에서는, 후보 항체를 전형적으로 박테리오파아지 외피 단백질에 공유적으로 연결시킨다. 이러한 연쇄는 상기 외피 단백질에 융합된 후보 항체를 암호화하는 핵산의 해독으로부터 비롯된다. 이 연쇄에는 가요성 펩티드 링커, 프로테아제 부위, 또는 중지 코돈 저해에 따른 결과로서 혼입된 아미노산이 포함될 수 있다. 파아지 디스플레이는, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Ladner et al., U.S. Patent No. 5,223,409; Smith (1985) Science 228: 1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/02809; WO 90/09690; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4: 1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol. Today 2:371-8; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Rebar et al. (1996) Methods Enzymol. 267: 129-49; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acids Res. 19: 4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982; and Lee et al. (2003) Trends In Biotechnology 21: 45-52].

파아지 디스플레이 시스템은 필라멘트상 파아지 (파아지 fl, fd 및 M13) 뿐만 아니라 기타 박테리오파아지 [예: T7 박테리오파아지 및 람다 파아지; 예를 들어, 문헌 (Santini (1998) J. Mol. Biol. 282: 125-135; Rosenberg et al. (1996) Innovations 6: 1-6; Houshmet et al. (1999) Anal. Biochem. 268: 363-370) 참고]에 대해 개발되었다. 필라멘트상 파아지 디스플레이 시스템은 전형적으로, 소수 외피 단백질, 예를 들면 유전자 III 단백질과, 주요 외피 단백질인 유전자 VIII 단백질과의 융합을 이용하지만, 기타 외피 단백질, 예를 들어 유전자 VI 단백질, 유전자 VII 단백질, 유전자 IX 단백질, 또는 그들의 도메인과의 융합을 이용할 수도 있다 [참고: WO 00/71694]. 바람직한 양태에서는, 상기 융합이 유전자 III 단백질의 도메인, 예를 들어, 고정 (anchor) 도메인 또는 "절단부 (stump)"와의 융합이다 [예를 들어, 유전자 III 단백질 고정 도메인에 관한 설명은 미국 특허 제5,658,727호를 참고할 수 있다].

후보 폴리펩티드의 원자가를 제어할 수도 있다. 폴리펩티드 성분을 암호화하는 서열을 완전한 파아지 게놈 내로 클로닝시키면 다변이체 디스플레이가 이루어지는데, 이는 유전자 III 단백질의 모든 복제물이 상기 폴리펩티드 성분과 융합되기 때문이다. 원자가를 감소시키기 위해서는, 파아지미드 (phagemid) 시스템을 활용할 수 있다. 이러한 시스템에서는, 유전자 III과 융합된 폴리펩티드 성분을 암호화하는, 전형적으로 700개 미만 뉴클레오티드 길이의 핵산이 플라스미드 상에 제공된다. 이러한 플라스미드는 파아지 복제 기점을 포함하므로, 플라스미드를 보유하고 있는 세균성 세포가 헬퍼 (helper) 파아지, 예를 들어 M13K07에 감염되는 경우에는 상기 플라스미드가 박테리오파아지 입자 내로 혼입된다. 헬퍼 파아지는 유전자 III의 본래의 카피를 제공하고, 기타 파아지 유전자가 파아지 복제와 어셈블리에 요구되었다. 헬퍼 파아지는 결함있는 기점을 지니고 있으므로, 헬퍼 파아지 게놈이 야생형 기점을 갖는 플라스미드와 비교해서 파아지 입자 내로 효율적으로 혼입되지 못한다.

후보 항체를 디스플레이하는 박테리오파아지는 표준 파아지 제조 방법, 예를 들어 성장 배지로부터의 PEG 침전을 이용하여 성장 및 수거할 수 있다.

개개의 디스플레이 파아지를 선별한 후, 이와 같이 선별된 파아지를 사용하여 세포를 감염시킴으로써 상기 선별된 후보 항체를 암호화하는 핵산을 수득할 수 있다. 개개의 집락 또는 플라크를 골라낼 수 있고, 핵산을 분리한 다음 서열 분석할 수 있다.

본 발명에 따르는 ApoE-CTD 결합제를 수득하기 위한 스크리닝 과정에서는, 디스플레이 라이브러리를 통상적으로 고형 지지체 상에 고정화시킨 표적 ApoE-CTD 분자와 접촉시켜 이와 결합하도록 한다. 비-결합제는 결합제로부터 격리시킨다. 다양한 방식으로, 결합된 파아지를 ApoE-CTD로부터 방출시키고, 수집한 다음 증폭시킨다. 파아지는 세균성 세포의 감염을 통하여 증폭될 수 있기 때문에, 결합성 실재물을 암호화하는 유전자 서열을 밝히는 데에는 소수의 결합성 파아지 만으로도 충분하다. 이들 기술을 사용하여, 특정 집단 내에서 2천만개 중의 대략 1개인 결합성 파아지를 회수하는 것이 가능하다. 1천만개 내지 2천만개 이상의 잠재적 결합성 폴리펩티드 각각을 디스플레이하는 하나 이상의 라이브러리를 신속하게 스크리닝하여, 고 친화성 ApoE-CTD 결합제를 발견할 수 있다. 이러한 선별 과정을 작동하게 되면, 단지 우수한 결합제 만이 잔존할 때까지 다양한 집단이 매회 탈락한다 [즉, 이러한 과정이 수렴된다]. 전형적으로, 파아지 디스플레이 라이브러리는 밀접하게 관련된 여러 개의 결합제를 함유할 것이다 (1천만개 중에서 10 내지 50개 결합제). 수렴의 징후에는 밀접하게 관련된 서열의 결합 (파아지 역가에 의해 측정함) 및 회수 증가가 포함된다.

세포-디스플레이 라이브러리에서는, 후보 항체가 특정 세포, 예를 들어 진핵성 또는 원핵성 세포의 표면 상에 디스플레이된다. 원색성 세포의 예에는 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 세포 및 포자가 포함된다 [참고: Lu et al. (1995) Biotechnology 13: 366]. 진핵성 세포의 예에는 효모 [예: 삭카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조삭카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 한세울라 (Hanseulla), 또는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)]가 포함된다. 효모 표면 디스플레이는, 예를 들어 문헌 [참고: Boder and Wittrup (1997) Nature Biotech . 15: 553-557]에 기재되어 있다. 효모 디스플레이 시스템을 사용하여 면역글로불린 단백질, 예를 들어 Fab 단편을 디스플레이할 수 있고, 효모 교배를 이용하여 중쇄와 경쇄의 조합물을 생성시킬 수 있다.

효모 디스플레이는 항-ApoE-CTD 항체의 친화성 성숙을 적용하는데 있어서 파아지 디스플레이에 비해 명백한 이점을 지니고 있다. 가장 중요한 이점은 FACS 선별을 사용하여 각 효모 세포의 항원 결합성을 알아보기 위해 이러한 효모 세포를 정량적으로 분류할 수 있다는 것이다. 디스플레이 수준 상의 변이가 교정될 수 있도록 함으로써 결합 활성도 (avidity)에 근거한 선별을 피하도록 표준화 선별을 수행하는 것이 또한 가능하다. 이는 다가 표적 항원을 사용하는 경우에 특히 중요하다.

디스플레이 라이브러리는 리보솜 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 리보솜 디스플레이 라이브러리에서는 mRNA와 이러한 RNA에 의해 암호화된 후보 항체를, mRNA를 해독하고 있고 여전히 부착되어 있는 신생 폴리펩티드를 갖고 있는 리보솜을 안정화시킴으로써 물리적으로 연합시킬 수 있다. 전형적으로, 2가 Mg² ⁺ 고농도와 저온을 사용한다 [참고: 예를 들어, Mattheakis at al. (1994) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 91: 9022 and Hanes at al. (2000) Nature Biotech . 18:1287-92; Hans at al. (2000) Methods Enzymol . 328-404-30 and Schaffitzel et al. (1999) J. Immunol . Methods 231: 119-35].

또 다른 디스플레이 라이브러리 포맷은 펩티드-핵산 융합물을 활용한다. 폴리펩티드-핵산 융합물은, 예를 들어 문헌 [참고: Roberts and Szostak (1997) Proc. Acad . Sci . USA 94: 12297-12302, 및 미국 특허 제6,207,446호]에 기재된 바와 같이, 공유적으로 부착된 푸로마이신기를 포함하는 mRNA의 시험관내 해독에 의해 생성시킬 수 있다. 이어서, mRNA를 DNA로 역전사시키고 폴리펩티드에 가교결합시킬 수 있다.

사용될 수 있는 또 다른 디스플레이 포맷은 항체를 확인시켜 주는 비-핵산 태그에 항체 성분을 부착시키는 비-생물학적 디스플레이이다. 예를 들어, 태그는 항체를 디스플레이하는 비드에 부착된 화학적 태그, 또는 고주파 태그일 수 있다 [참고: 미국 특허 제5,874,214호].

후보 항체에 대한 구조적 주형으로서 제공되는 모 결합성 도메인을 선별한다. 이러한 결합성 도메인은 천연 발생적 또는 합성 단백질이거나, 또는 면역글로불린과 같은 단백질의 특정 영역 또는 도메인일 수 있다. 모 결합성 도메인은 이러한 모 결합성 도메인과 ApoE-CTD 간의 공지된 상호 작용에 관한 지식을 근거로 하여 선별할 수 있지만, 이것이 결정적이진 않다. 사실상, 모 결합성 도메인이 ApoE-CTD에 대한 어떠한 친화성도 지니고 있다는 사실이 가장 중요한 것은 아니며; 그의 목적은 특정 라이브러리 (이러한 라이브러리는 ApoE-CTD와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 후보 항체를 포함할 것이다)를 발생시킬 수 있는 구조를 제공하는 것이다.

후보 항체는 Fab 단편, 단일 쇄 Fv 분자 (scFV), 단일 도메인 항체, 카멜리드 (camelid) 항체, 및 카멜리드화 항체일 수 있다.

바람직한 양태에서는, 모 결합성 도메인이 항원 결합 활성을 지니고 있는 면역글로불린 도메인, 예를 들어 scFv, Fab 또는 IgG를 포함한다. 전형적인 디스플레이 라이브러리는 VH 도메인과 VL 도메인을 포함하는 후보 폴리펩티드를 디스플레이한다. Fab 및 기타 포맷의 경우에서와 같이, 이와 같이 디스플레이된 항체는 경쇄 또는 중쇄의 일부로서 불변 영역을 포함할 수 있다. 한 양태에서는, 각 쇄가 예를 들어, Fab의 경우에서와 같이 하나의 불변 영역을 포함한다. 기타 양태에서는, 부가의 불변 영역이 디스플레이된다.

디스플레이 라이브러리는, 예를 들어 인간 항원을 인식하는 인간 또는 "인간화" 항체를 확인하는데 있어 특히 유용하다. 시험관내 디스플레이 선별 과정은 자기 항원에 대항하여 항체를 생성시킬 수 없는 정상적인 인간 면역계의 한계를 극복해준다.

항체 라이브러리는 수 많은 과정에 의해 구축할 수 있다 [참고: 예를 들어, de Haard et al (1999) J. Biol . Chem . 274: 18218-30; Hoogenboom et al (1998) Immunotechnology 4: 1-20, and Hoogenboom et al (2000) Immunol . Today 21: 371-8]. 추가로, 각 과정 요소들을 다른 과정 요소들과 조합할 수 있다. 이러한 과정들은, 변이가 단일 면역글로불린 도메인 (예: VH 또는 VL) 내로 도입되거나 또는 다중 면역글로불린 도메인 (예: VH 및 VL) 내로 도입되는 방식으로 사용할 수 있다. 이러한 변이는 예를 들어, CDRl, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 및 FR4 중의 하나 이상의 영역 (이는 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인 중의 어느 하나 및(또는) 둘 다의 영역을 지칭한다) 내의 면역글로불린 가변 도메인 내로 도입할 수 있다. 한 양태에서는, 변이를 소정의 가변 도메인의 3개 CDRs 모두에 도입한다. 또 다른 바람직한 양태에서는, 변이를 예를 들어, 중쇄 가변 도메인의 CDR1 및 CDR2 내로 도입한다. 어떠한 조합도 실행 가능하다.

바람직한 양태에서는, 모 도메인이 서열 23, 26, 29, 32, 35, 38, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 95, 113, 119 및 125 중의 어느 하나에 나타낸 CDR3 서열을 포함한다. 서열 23 또는 26의 위치 2 및 3 중의 어느 하나 또는 둘 다에서의 아미노산 치환이 후보 항체에 바람직한 변이이다. 항체 스파이킹에 의해 생성된 변이체 VH-CDR3 서열의 예가 표 38, 39, 40, 41 및 42에서 확인된다. 바람직한 CDR3 서열은 서열 207, 209, 210, 320, 322, 323 및 373에 나타나 있다. 바람직한 CDR3 서열에 대한 컨센서스 서열이 서열 512, 513, 514, 515, 516, 517 및 20에 나타나 있다.

경쇄 셔플링 (shuffling)에 의해 생성된 변이체 VL-CDR3의 예가 또한, 표 38, 39, 40, 41 및 42에 제시되어 있다. 바람직한 VL-CDR3 서열이 서열 35, 269, 275, 268, 341 및 378에 나타나 있다.

모 도메인은 바람직하게는, VH 쇄의 기타 성분들과 임의의 VL 쇄를 포함하거나, 또는 VL 쇄의 기타 성분들과 임의의 VH 쇄를 포함하기도 한다.

제2의 바람직한 모 도메인은 서열 21, 24, 27, 30, 33, 36, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 93, 111, 117 및 123 중의 어느 하나에 나타낸 서열, 또는 서열 22, 25, 28, 31, 34, 37, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85, 88, 94, 112, 118 및 124에 나타낸 서열을 수반한 CDR1 및(또는) CDR2 도메인을 포함한다. 후보 폴리펩티드는 CDR1 및(또는) CDR2 도메인을 DNA 셔플링함으로써 생성시킬 수 있다. 변이체 VL-CDR1 및 VL-CDR2 서열의 예가 표 38, 39, 40, 41 및 42에서 확인된다. 바람직한 CDR1 서열이 서열 33, 219, 226, 218, 93, 325, 326, 391 및 394에 나타나 있다. 바람직한 CDR2 서열은 서열 34, 247, 252, 333, 334, 382 및 386에 나타나 있다.

제3의 바람직한 모 도메인은 서열 42, 43, 44, 151, 157, 159 및 161 중의 어느 하나에 나타낸 VL 서열을 포함한다. 후보 폴리펩티드는 전형적으로, 완전한 VL 서열을 DNA 셔플링함으로써 생성된다. 셔플링된 경쇄 서열의 예가 표 38, 39, 40, 41 및 42에서 확인된다. 바람직한 셔플링된 경쇄 서열이 서열 43, 295, 294, 304, 347, 348, 357, 362, 406 및 418에 나타나 있다.

한 가지 과정에서는, CDRs를 암호화하는 다양한 올리고뉴클레오티드를 핵산의 상응하는 영역 내로 삽입함으로써 항체 라이브러리를 구축한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 단량체성 뉴클레오티드 또는 트리뉴클레오티드를 사용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [참고: Knappik et al (2000) J. Mol . Biol . 296: 57-86]에는 트리뉴클레오티드 합성을 이용하여 CDR 암호화 올리고뉴클레오티드를 구축하는 방법과, 이러한 올리고뉴클레오티드를 수용하기 위하여 공학적으로 처리시킨 제한 부위를 수반한 주형이 기재되어 있다.

또 다른 과정에서는, 동물 (예: 설치류)을 ApoE-CTD로 면역시킨다. 이 동물을 상기 항원으로 임의로 추가 면역시켜 반응을 추가로 자극시킨다. 이어서, 비장 세포를 동물로부터 분리하고, VH 및(또는) VL 도메인을 암호화하는 핵산을 증폭시킨 다음, 디스플레이 라이브러리에서의 발현을 위해 클로닝시킨다.

또 다른 과정에서는, 타고난 본래의 (naive) 생식세포계 면역글로불린 유전자로부터 증폭시킨 핵산으로부터 항체 라이브러리를 구축한다. 이와 같이 증폭된 핵산에는 VH 및(또는) VL 도메인을 암호화하는 핵산이 포함된다. 면역글로불린-암호화 핵산의 공급원이 다음에 기재되어 있다. 증폭에는, 예를 들어 보존된 불변 영역에 어닐링시키는 프라이머를 이용한 PCR, 또는 또 다른 증폭 방법이 포함될 수 있다.

면역글로불린 도메인을 암호화하는 핵산은, 예를 들어, 인간, 영장류, 마우스, 토끼, 카멜 또는 설치류의 면역 세포로부터 수득할 수 있다. 한 예에서는, 상기 세포를 특정한 성질에 대해 선별한다. 각종 성숙 단계 하의 B 세포를 선별할 수 있다. 또 다른 예에서는 B 세포가 타고난 본래의 것이다.

한 양태에서는, 형광성-활성화 세포 분류 (FACS)를 이용하여, 표면 결합된 IgM, IgD 또는 IgG 분자를 발현하는 B 세포를 분류한다. 추가로, 상이한 이소형의 IgG를 발현하는 B 세포를 분리할 수 있다. 또 다른 바람직한 양태에서는, B 또는 T 세포를 시험관 내에서 배양한다. 이들 세포는, 예를 들어 공급자 세포와 함께 배양하거나 분열촉진 물질 또는 기타 조정 시약, 예를 들면, CD40, CD40 리간드 또는 CD20에 대한 항체, 포르볼 미리스테이트 아세테이트, 세균성 지다당류, 콘카나발린 (concanavalin) A, 식물적혈구 응집소 또는 억새풀 분열촉진 물질 (pokeweed mitogen)을 가함으로써, 시험관 내에서 자극할 수 있다.

또 다른 양태에서는, 면역학적 질환, 예를 들어 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 류마티스성 관절염, 혈관염, 쇼그렌 증후군 (Sjogren syndrome), 전신성 경화증 또는 항-인지질 증후군이 있는 대상체로부터 세포를 분리시킨다. 이러한 대상체는 인간 또는 동물, 예를 들어 인간 질환에 대한 동물 모델 또는 유사한 질환이 있는 동물일 수 있다. 또 다른 양태에서는, 인간 면역글로불린 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물로부터 세포를 분리시킨다.

한 가지 바람직한 양태에서는, 세포가 체세포 초변이 프로그램을 활성화시켰다. 예를 들어, 세포를 항-면역글로불린, 항-CD40 및 항-CD38 항체로 처리함으로써, 이러한 세포를 자극하여 면역글로불린 유전자의 체세포 돌연변이 유발을 진행시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Bergthorsdottir et al (2001) J. Immunol . 166: 2228]. 또 다른 양태에서는, 상기 세포가 타고난 본래의 것이다.

면역글로불린 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 다음 예시 방법에 의해 천연 레퍼토리 (repertoire)로부터 분리할 수 있다. 먼저, RNA를 면역 세포로부터 분리한다. 완전한 길이 (즉, 캡핑됨)의 mRNAs를 격리시킨다 (예를 들어, 캡핑되지 않은 RNAs를 송아지 장 포스파타제로 분해시킴으로써 수행함). 이어서, 담배 산 피로포스파타제를 이용하여 캡을 제거하고, 역전사를 이용하여 cDNAs를 생성시킨다.

제1 (안티센스) 가닥의 역전사는 적합한 모든 프라이머를 이용하여 어떠한 방식으로든 수행할 수 있다 [참고: 예를 들어, de Haard et al (1999) J. Biol . Chem. 274: 18218-30]. 예를 들어, 상이한 이소형의 면역글로불린을 역전사시키기 위해서는, 프라이머 결합 영역이 상이한 면역글로불린들 중에서도 불변 (일정)일 수 있다. 프라이머 결합 영역은 또한, 특별한 이소형의 면역글로불린에 대해 특이적일 수 있다. 전형적으로, 프라이머는 하나 이상의 CDR을 암호화하는 서열에 대해 3'인 영역에 대해 특이적이다. 또 다른 양태에서는, 폴리-dT 프라이머를 사용할 수 있다 (이는 중쇄 유전자에 대해 바람직할 수 있다).

합성 서열을 역전사된 가닥의 3' 말단에 연결시킬 수 있다. 이 합성 서열은 역전사 후 PCR 증폭 동안 정배향 프라이머의 결합을 위한 프라이머 결합 부위로서 사용할 수 있다. 이러한 합성 서열을 사용함으로 인해, 이용 가능한 다양성을 완전히 포획하기 위해 상이한 정배향 프라이머 풀을 사용해야 할 필요성을 미연에 방지할 수 있다.

이어서, 가변 도메인 암호화 유전자를 예를 들어, 1회전 이상 이용하여 증폭시킨다. 수 회전을 사용하는 경우에는, 신뢰도를 증가시키기 위해 축소 (nested) 프라이머를 사용할 수 있다. 이어서, 이와 같이 증폭시킨 핵산을 디스플레이 라이브러리 벡터 내로 클로닝시킨다.

핵산 서열을 증폭시키기 위한 모든 방법을 증폭에 사용할 수 있다. 다양성을 최대화시키고 치우침이 없는 방법이 바람직하다. 핵산 증폭을 위해 바람직한 기술에는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR); RNA 폴리머라제에 의한 RNA 합성을 활용하여 핵산을 증폭시키는, 전사에 의거한 방법 [참고: Sarker et al (1989) Science 244: 331-34]; 전사, 역전사 및 RnaseH에 의거한 분해 주기를 활용하여 DNA 샘플을 증폭시키는 NASBA [참고: 미국 특허 제5,130,238호; 제5,409,818호 및 제5,554,517], 롤링 서클 증폭 [RCA; 미국 특허 제6,143,495호 참고] 및 가닥 치환 증폭 방법 [SDA; 미국 특허 제5,624,825호 참고]이 포함된다.

제1 세트의 결합성 항체를 확인한 후, 서열 정보를 이용하여 부가의 목적 특성, 예를 들어 ApoE-CTD와 완전한 길이의 ApoE, 바람직하게는 VLDL-관련 ApoE를 식별해 주는 특성을 지닌 구성원들에 대해 편재된 기타 라이브러리를 고안할 수 있다. 이러한 기술로 인해, 다수의 잠재적 결합성 항체를 스크리닝할 수 있을 뿐만 아니라 결합/용출 주기를 반복 실시할 수 있고 초기 기준을 충족시키는 유사체-디스플레이성 패키지를 스크리닝하기 위하여 편재된 이차 라이브러리를 형성할 수 있다. 이들 기술을 사용하여 편재된 라이브러리를 스크리닝함으로써, 이러한 스크리닝 조건 하에 단단히 결합하는 (즉, 고 친화성으로 결합하는) 구성원을 밝혀낼 수 있다.

따라서, 한 가지 바람직한 양태에서는 디스플레이 라이브러리 기술을 반복적 모드로 사용할 수 있다. 제1 디스플레이 라이브러리를 사용하여, ApoE-CTD 및(또는) 인간 플라크와 결합하는 하나 이상의 항체를 확인한다. 이어서, 이로써 확인된 이들 항체를 돌연변이 유발 방법으로 다양하게 하여 제2의 디스플레이 라이브러리를 형성시킨다. 이어서, 예를 들어 보다 더 엄격하거나 보다 경쟁적인 결합 및 세척 조건을 이용함으로써, 제2 라이브러리로부터 보다 고 친화성의 폴리펩티드를 선별한다.

친화성 성숙 프로토콜에서는, 아미노산 치환에 의해 변이를 발생시키는 것이 바람직하지만, 아미노산을 결실 또는 부가함으로써 변이를 발생시킬 수도 있다.

아미노산 치환은 적어도 대부분의 치환에 대해서 그의 구조를 상당히 변경시키지 않으면서 도메인의 결합 특성을 변경시키는 것으로 예상되는 변이일 수 있다. 변이를 위해 선별되는 아미노산 위치 (가변 아미노산 위치)가 표면 아미노산 위치, 즉 도메인이 그의 가장 안정한 입체 형태로 존재하는 경우에 이러한 도메인의 외부 표면 (즉, 용액에 노출된 표면) 상에 보여지는, 상기 도메인의 아미노산 서열 내의 위치인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 변화될 아미노산 위치가 치환 효과를 최대화하도록 서로 인접해 있거나 가까이 있을 것이다. 또한, 여분의 아미노산을 모 결합성 도메인 구조물 내에 부가할 수 있다.

몇몇 이행에서는, 돌연변이 유발이 공지된 영역 또는 결합 계면에 존재할 것으로 예상되는 영역을 표적으로 한다. 돌연변이 유발은 본원에 기재된 바와 같은 중쇄 또는 경쇄의 CDR 영역에 대해 지시될 수 있다. 추가로, 돌연변이 유발은 CDRs 근처 또는 이에 인접한 골격 영역에 대해 지시될 수 있다. 돌연변이 유발은 또한, 예를 들어 정확히 단계별로 향상시키기 위해 CDRs 중의 1개 또는 몇 개로 제한될 수 있다.

유효한 친화성 성숙을 위해서는 다음 4가지 구성 요소가 요구된다: (i) 선도 항체 유전자의 재다양화; (ii) 파아지 또는 효모 상에서의 디스플레이; (iii) 친화성 선별; 및 (iv) 친화성 개선을 알아보기 위한 클론의 스크리닝.

예를 들어, BLAST 알고리듬 [참고: 예를 들어, Karlin and Altschul (1993) PNAS USA 90: 5873-5787]을 사용하여 요구된 결합 특성을 나타내는 Fabs를 정렬함으로써, CDR 도메인 내에 보존된 잔기를 확인할 수 있다. CDR 루프들 간의 서열 유사성은 항체 친화성 또는 특이성에 있어서의 특정 아미노산의 직접적인 관련성을 예측할 수 있게 해준다.

예를 들어, 항체 807A-M0028-B02 및 807A-M0027-E11 (서열 23 및 26)의 VH-CDR3 루프는 현저한 유사성을 나타내며, 6개 아미노산 중의 4개에 걸쳐 컨센서스를 나타낸다 (서열 20). 이는 VH-CDR3이 항체 친화성과 특이성에 있어 일정 역할을 한다는 사실을 제안하고 있다.

최적의 항체 돌연변이 유발 전략은 최소 수의 돌연변이를 기능적으로 관계가 있는 위치에 도입하는 것이다. 이는 표적화 및 비-표적화 돌연변이 유발 과정 둘 다에 의해 달성된다. 비-표적화 돌연변이 유발 과정에는 전체 VL 유전자 또는 VH CDR1-2 단편을 재다양화함으로써 항체 내에 큰 블록 변화를 도입해 주는 쇄 셔플링이 포함된다. 전형적으로, VH-CDR3 루프는 건드리지 않은 채로 두는데, 이는 이러한 루프가 결합 친화성과 특이성에 상당한 기여를 하기 때문이다. 쇄 셔플링의 예가 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Marks et al., (1992) Nature Biotech 10: 779-783, Schier et al., (1996) J. Mol Biol. 255, 28-43, Park et al., (2000) BBRC. 275. 553-557 and Chames et al., (2002) J. Immunol. 1110-1118]. 쇄 셔플링이 (특히 출발 친화도가 낮은 항체에 대해) 널리 입증된 기술이긴 하지만, 이러한 큰 블록 변화가 항체 분자 내에서 이루어짐으로써 유리한 다중 접촉들의 붕괴 기회가 증가될 수 있다는 단점이 있을 수 있다. 그러나, 이는 불리한 접촉들이 상실되거나 새로운 접촉이 발생함으로써 상쇄될 수 있었다.

비-표적화 돌연변이 유발 기술의 기타 예에는 다음이 포함된다: 변이성 (error-prone) PCR [참고: Leung et al. (1989) Technique 1: 11-15], 재조합, 무작위 절단을 이용한 DNA 셔플링 [참고: Stemmer (1994) Nature 389-391; "핵산 셔플링"으로 지칭됨], RACHITT™ [참고: Coco at al. (2001) Nature Biotech. 19:354], 부위-지시된 돌연변이 유발 [참고: Zooler et al. (1987) Nucl. Acids Res. 10: 6487-6504], 카세트 돌연변이 유발 [참고: Reidhaar-Olson (1991) Methods Enzymol. 208:564-586] 및 축중 올리고뉴클레오티드의 혼입 [참고: Griffiths at al. (1994) EMBO J. 13: 3245].

표적화 돌연변이 유발 과정에는 열점 돌연변이 유발, 인색한 돌연변이 유발, 포화 돌연변이 유발, 도메인 무작위화, 및 도메인 이동 (walking)이 포함된다. CDR 돌연변이 유발은 CDR1을 표적으로 하고, 최적화 루프를 선별한 다음, CDR2 등을 후속 표적으로 하는 단계별 방식으로 수행할 수 있다. 대부분 천연상 다양한 단일 루프는 VH-CDR3인데, 이러한 루프가 항체 결합 부위의 가운데에 위치하고 있기 때문에, 이것이 항체 특이성과 친화성에 있어 중요한 결정기라는 사실이 일반적으로 받아들여지고 있다. 이는 상기 루프를 특이적으로 표적화하기 위한 강력한 사건이 존재한다는 것을 의미한다.

반복적 선별의 한 가지 예에서는, 본원에 기재된 방법을 사용하여 먼저, 특정 표적에 대한 적어도 최소 결합 특이성으로, 또는 최소 활성, 예를 들어 1 nM, 10 nM, 또는 100 nM 초과의 평형 결합 상수로 ApoE-CTD와 결합하고, 인간 플라크와 결합하며/하거나 VLDL-관련 ApoE의 존재 하에 결합 활성을 보유하고 있는 항체를 디스플레이 라이브러리로부터 확인한다. 이와 같이 초기에 확인된 항체를 암호화하는 핵산 서열을, 예를 들어 초기 항체에 비해 증강된 특성 (예: 결합 친화성, 역학 또는 안정성)을 지닌 제2의 폴리펩티드를 확인하기 위해, 변이를 도입하기 위한 주형 핵산으로서 사용한다.

특별히 예비선별된 결합 및 방출 특성을 나타내는 ApoE-CTD 결합성 항체를 확인하는 방식으로 디스플레이 기술을 이용하여, 본 발명에 따르는 항체를 분리할 수 있다. 이러한 방법론에 따라서, 2가지 용액 조건, 즉 결합 조건과 방출 조건을 예비선별할 수 있다. 결합 조건은 밝혀진 항체가 표적 ApoE-CTD와 결합하는 것이 요망되는 특정 세트의 용액 조건이고; 방출 조건은 밝혀진 항체가 ApoE-CTD와 결합하지 않는 것이 (즉, ApoE-CTD로부터 해리됨) 요망되는 특정 세트의 용액 조건이다. 두 조건을 선별하여 실행자의 모든 기준, 예를 들어 조건 획득의 용이성, 기타 정제 단계들과의 화합성, 기타 친화성 매질과 비교해서 조건들 간의 전환 비용이 낮음 등을 충족시킬 수 있다. 바람직하게는, 표적 단백질 ApoE-CTD의 안정성 또는 활성에 불리한 영향을 끼치지 않도록 하고, 또한 한 가지 이상의 용액 파라미터에 관해 상당히 상이하도록 두 용액 조건을 선별한다. 예를 들어, 본원에 기재된 적합한 결합성 펩티드에 대한 스크리닝을 수행하는데 있어서, 에틸렌 글리콜 함유 완충액의 존재 하에 표적으로부터 해리된 결합제, 또는 보다 낮은 pH (즉, pH 2) 조건, 또는 결합을 위해 이용된 조건과는 상이한 조건들의 조합을 선별한다. 유리하게 변화시킬 수 있는 또 다른 파라미터는 결합 및 용출 완충액 중의 염 (예: NaCl) 농도이다.

ApoE-CTD와 결합하는 항체는 전형적으로, ApoE-CTD에 대한 최소 결합 특이성을 지니고 있는데, 예를 들어 평형 결합 상수가 1 nM, 10 nM 또는 100 nM 초과이다.

느린 해리 속도가, 특히 항체와 그들의 표적 간의 상호 작용 측면에서 높은 친화성을 예보할 수 있기 때문에, 이탈 속도 선별 방법을 사용하여 ApoE-CTD에 대한 결합 상호 작용을 위해 목적하는 역학적 해리 속도 (즉, 감속)를 나타내는 항체를 분리시킬 수 있다.

디스플레이 라이브러리로부터 느리게 해리하는 항체를 선별하기 위해, 라이브러리를 고정화 표적, 바람직하게는 ApoE-CTD와 접촉시킨다. 이어서, 이러한 고정화 표적을 제1 용액으로 세척하여 비-특이적으로 결합되거나 약하게 결합된 항체를 제거시킨다. 이어서, 고정화 표적을 포화 량의 자유 표적 (즉, 입자에 부착되지 않은 표적 복제물)을 포함하는 제2 용액으로 용출시킨다. 이러한 자유 표적은 표적으로부터 해리되는 항체와 결합한다. 훨씬 더 낮은 농도의 고정화 표적에 비해 포화 량의 자유 표적에 의해 재결합을 효과적으로 방지시킨다.

제2 용액은 실질적으로 생리적이거나 엄격한 용액 조건을 가질 수 있다. 전형적으로, 제2 용액의 용액 조건은 제1 용액의 용액 조건과 동일하다. 제2 용액의 분획을 시간적 순서로 수집하여 초기 분획과 후기 분획을 구별한다. 후기 분획에는 초기 분획 중의 생체분자 보다는 더 느린 속도로 표적으로부터 해리되는 생체분자가 포함된다.

추가로, 심지어 항온 배양을 연장한 후에도 표적과 결합된 채로 유지되는 디스플레이 라이브러리 구성원을 회수하는 것이 또한 가능하다. 이들은 카오트로픽 조건을 이용하여 해리시킬 수 있거나, 또는 표적에 부착된 채로 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, 표적에 결합된 파아지를 세균성 세포와 접촉시킬 수 있다.

본 발명의 방법에 사용된 ApoE-CTD는 적합한 어떠한 형태일 수도 있다. ApoE-CTD는 전형적으로, 서열 1에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편의 아미노산 서열을 갖는다. ApoE-CTD의 단편은 길이가 전형적으로 3개 이상 아미노산, 바람직하게는 5개, 6개, 7개 또는 8개 이상 아미노산, 보다 바람직하게는 10개, 12개 또는 16개 이상 아미노산이다. 적합한 단편의 예가 서열 2 내지 19에 나타나 있다. 바람직한 단편은 서열 2, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16 및 17 중의 어느 하나에 나타낸 서열을 갖는 것이다. 하나 이상의 ApoE-CTD 펩티드를 본 발명의 스크리닝 검정에 사용할 수 있다.

ApoE-CTD 폴리펩티드는 일반적으로, 재조합 수단에 의해 생성된다. 재조합적으로 생성시켰거나 천연적으로 생성된 우레아-변성 ApoE-CTD를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 중합체성 형태의 CTD에 대한 결합 (ApoE-CTD가 원섬유와 결합된다)을 알아보기 위해, 후보 폴리펩티드를 부가적으로 또는 또 다른 방법으로 스크리닝할 수 있다. ApoE-CTD와 Aβ의 복합체에 대한 결합을 모니터링할 수도 있다.

ApoE-CTD는, 예를 들어 트롬빈의 작용에 의해 재조합 또는 천연 발생적 ApoE로부터 절단시킬 수 있다.

ApoE-CTD 폴리펩티드 또는 펩티드를 지지체 상에 고정화시킬 수 있다. 전형적으로, 고정화는 상기 폴리펩티드를 특정 표면 상에 포획하기 위해 이를 태그화하거나 바이오티닐화함으로써 달성된다. 예를 들어, ApoE-CTD는 (예를 들면, 스트렙타비딘 피복된 자기 비드 상에서) 스트렙타비딘에 부착시키기 위한 S-S 바이오틴기를 포함할 수 있다. 또 다른 한편, ApoE-CTD는 (예를 들어, 플라스틱 상에서의) 고정화를 위해 BSA 담체에 커플링시키기 위한 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로 "CTD-피복된 칩"을 생성시킬 수 있다. CTD-피복된 칩에 대한 후보 폴리펩티드의 결합은 BIACORE 분석에 의해 분석할 수 있다.

디스플레이 라이브러리 구성원을 대상으로 하여, 인간 플라크에 대한 결합을 알아보기 위해 스크리닝할 수도 있다.

본원에 기재된 디스플레이 라이브러리 스크리닝 방법에는 바람직하게는, 비-표적 분자와 결합하는 디스플레이 라이브러리 구성원은 폐기시키는 선별 또는 스크리닝 과정이 포함된다. 비-표적 분자의 예에는 스트렙타비딘 및 ApoE-NTD가 포함된다.

*한 가지 이행에서는, 소위 "음성 선별" 단계를 사용하여 표적 및 관계된 비-표적 분자와, 관계되긴 하지만 별개의 비-표적 분자 간을 식별한다. 디스플레이 라이브러리 또는 그의 풀을 비-표적 분자와 접촉시킨다. 비-표적과 결합하지 않는 샘플 구성원을 수집하고, 이를 표적 분자와의 결합을 알아보기 위한 후속 선별에 사용하거나 심지어 후속 음성 선별에 사용한다. 음성 선별 단계는 표적 분자와 결합하는 라이브러리 구성원을 선별하기에 앞서 또는 선별한 후에 이루어질 수 있다.

또 다른 이행에서는, 스크리닝 단계를 사용한다. 표적 분자에 대한 결합을 알아보기 위해 디스플레이 라이브러리 구성원을 분리한 후, 분리된 각각의 라이브러리 구성원을 대상으로 하여 비-표적 분자 (예를 들면, 상기 열거된 비-표적)와 결합할 수 있는 그의 능력에 대해 시험한다. 예를 들어, 고-처리능력 ELISA 스크린을 사용하여 상기 데이터를 수득할 수 있다. 이러한 ELISA 스크린을 또한 사용하여, 표적에 대한 각 라이브러리 구성원 결합에 대한 정량적 데이터를 수득할 수 있다. 비-표적 결합 데이터와 표적 결합 데이터를 비교하여 (예를 들어, 컴퓨터 및 소프트웨어를 이용함) 표적 MHC-펩티드 복합체와 특이적으로 결합하는 라이브러리 구성원을 확인한다.

본 발명의 항체 또는 항체 단편은 VLDL 또는 기타 지단백질 입자의 존재 하에 ApoE와 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는 전형적으로, ApoE-CTD에 대한 최소 결합 특이성으로, 예를 들어 VLDL의 존재 하에 1 nM 또는 100 nM 초과의 평형 결합 상수로 ApoE와 결합한다. VLDL은 적합한 어떠한 형태로든 존재할 수 있다. 예를 들어, 인간 혈장을 결합 검정에 가할 수 있다. 인간 혈장의 50% 이하를 상기 검정에 가할 수 있는데, 예를 들어 10% 이하, 20% 이하, 30% 이하 또는 40% 이하 인간 혈장이 포함될 수 있다.

ApoE-NTD에 대한 결합을 알아보기 위해 후보 폴리펩티드를 스크리닝할 수도 있다. ApoE-NTD는 재조합적으로 생성될 수 있거나, 또는 예를 들어 트롬빈의 작용에 의해 재조합 또는 천연 발생적 ApoE로부터 절단시킬 수 있다.

한 양태에서는, 성상세포 (astrocyte)에 대한 결합을 알아보기 위해 후보 폴리펩티드를 스크리닝할 수 있다. 선별된 폴리펩티드가 성상세포와 결합하지 않거나 또는 ApoE-CTD 보다는 훨씬 더 낮은 친화도로, 예를 들면 2배, 5배, 10배, 20배 또는 50배 더 낮은 친화도로 성상세포와 결합하는 것이 바람직하지만, 필수적이진 않다.

ApoE-CTD와 결합하는 후보 디스플레이 라이브러리 구성원을 선별한 후, 각 후보 디스플레이 라이브러리 구성원을 추가로 분석하여, 예를 들어 표적에 대한 그의 결합 특성을 추가로 성상 확인할 수 있다. 각 후보 디스플레이 라이브러리 구성원을 대상으로 하여, 한 가지 이상의 이차 스크리닝 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은 결합 특성, 촉매적 특성, 생리적 특성 (예: 세포독성, 신 제거, 면역원성), 구조적 특성 (예: 안정성, 입체 형태, 올리고머화 상태), 또는 또 다른 기능적 특성에 대한 것일 수 있다. 동일한 검정을 다양한 조건을 이용하여 반복적으로 사용하여, 예를 들어 pH, 이온성 또는 열 민감도를 결정할 수 있다.

경우에 따라, 검정은 디스플레이 라이브러리 구성원을 직접적으로 이용하거나, 디스플레이된 항체를 암호화하는 핵산으로부터 생성된 재조합 항체를 이용하거나, 또는 디스플레이된 항체의 서열을 기준으로 하여 합성된 합성 항체를 이용할 수 있다. 검정은 바람직하게는, ApoE-CTD와 결합하는 항체가 인간 플라크와도 결합하는지의 여부 또는 VLDL의 존재 하에서 ApoE-CTD와 결합하는지의 여부를 결정하는 것을 포함한다. 결합 특성에 대한 검정의 예에는 ELISA, 균질 결합 검정, 예를 들어 형광 공명 에너지 전이 (FRET) 및 알파-스크린, 표면 플라스몬 공명 (SPR), 단백질 검정 및 세포성 검정이 포함된다.

디스플레이 라이브러리에 의해 암호화된 항체를 대상으로 하여, ELISA를 이용하여 결합 특성에 대해 스크리닝할 수도 있다. 예를 들어, ApoE-CTD와 결합하는 각 후보 항체를 미세역가 판과 접촉시키는데, 이러한 판의 바닥 표면은 ApoE-CTD, VLDL 또는 ApoE-NTD로 피복시켰다. 상기 판을 완충액으로 세척하여 비-특이적으로 결합된 폴리펩티드를 제거한다. 이어서, 폴리펩티드 (예: 폴리펩티드의 태그 또는 불변 부분)를 인식할 수 있는 항체로 판을 프로빙함으로써, 이러한 판에 결합된 폴리펩티드의 양을 결정한다. 적당한 기질이 제공되는 경우에 비색 생성물을 생성시키는 효소, 예를 들어 알칼리성 포스파타제에 항체를 연결시킨다. 폴리펩티드를 세포로부터 정제할 수 있거나, 또는 예를 들어 필라멘트상 박테리오파아지 외피와의 융합물로서 디스플레이 라이브러리 포맷으로 검정할 수 있다. ELISA의 또 다른 버젼에서는, 다양성 가닥 라이브러리의 각 폴리펩티드를 사용하여 상이한 웰의 미세역가 판을 피복시킨다. 이어서, 불변 표적 분자를 사용하여 ELISA를 진행하여 각 웰을 조회한다. 폴리펩티드가 ApoE-CTD 상에서는 2x 이상의 배경을 디스플레이하지만, 음성 대조군 단백질 (예: Apo-NTD 또는 스트렙타비딘) 상에서는 1x 미만 배경을 디스플레이하는 경우에는, 이러한 폴리펩티드가 ELISA에서 ApoE-CTD와 특이적으로 결합한다.

균질 결합 검정은, 부가의 유체 조작이 전혀 요구되지 않으면서 검정의 모든 성분을 가한 후에 후보 항체와 표적 간의 결합 상호 작용을 분석할 수 있는 검정이다. 예를 들어, 형광 공명 에너지 전이 (FRET)를 균질 검정으로서 사용할 수 있다 [참고: 예를 들어, Lakowicz et al, US Patent No. 5,631,169]. 균질 검정의 또 다른 예는 알파 스크린 (공급처: Packard Bioscience, Meriden, Connecticut, USA)이다.

후보 폴리펩티드를 디스플레이 라이브러리 비히클 (예: 박테리오파아지)에 부착시킨 채로 균질 검정을 수행할 수 있다.

디스플레이 라이브러리로부터 분리된 분자와 표적 간의 결합 상호 작용은 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 이용하여 분석할 수 있다. SPR 또는 생체분자 상호 작용 분석 (BIA)은 상호작용물을 전혀 표지하지 않고서도 생체특이적 상호 작용을 실시간으로 탐지한다. BIA 칩의 결합 표면에서의 질량 변화 (이는 결합 사건의 지표이다)로 인해, 표면 근처 빛의 굴절률이 변경된다 [표면 플라스몬 공명 (SPR)의 광학 현상]. 굴절률 상의 변화로 인해 검출 가능한 신호가 생성되는데, 이는 생물학적 분자들 간의 실시간 반응 지표로서 측정된다. SPR을 사용하는 방법은, 예를 들어 문헌 [참고: Szabo et al (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705]에 기재되어 있고, 온 라인 방책은 다음 공급처 [BIAcore International AB (Uppsala, Sweden)]에 의해 제공된다.

SPR로부터의 정보를 이용하여 평형 해리 상수 (K_D), 및 역학적 파라미터 [K_on 및 K_off 포함]의 정확하고도 정량적 측정치를 제공함으로써, 표적에 대한 생체분자의 결합을 알아볼 수 있다. 이러한 데이터를 사용하여 상이한 생체분자를 비교할 수 있다. 예를 들어, 다양성 가닥 라이브러리 중에서 선별된 핵산에 의해 암호화된 단백질들을 비교하여, 표적에 대한 친화도가 높거나 느린 K_off를 갖는 개체를 확인할 수 있다. 이러한 정보를 또한 이용하여, 구조-활성 상관 (SAR)을 개발할 수 있다. 예를 들어, 모 단백질의 성숙된 버젼의 역학적 및 평형 결합 파라미터를 모 단백질의 파라미터와 비교할 수 있다. 특별한 결합 파라미터, 예를 들면 고 친화성 및 느린 K_off와 상관이 있는, 소정의 위치에서의 변이체 아미노산을 확인할 수 있다. 이러한 정보를 구조적 모델링과 합할 수 있다 (예를 들어, 상동성 모델링, 에너지 최소화, 또는 결정학 또는 NMR에 의한 구조 결정을 이용함). 그 결과, 단백질과 그의 표적 간의 물리적 상호 작용에 관한 이해를 표준화한 다음, 이를 사용하여 다른 고안 과정을 선도할 수 있다.

디스플레이 라이브러리로부터 확인된 항체를 고체 지지체, 예를 들어 비드 또는 어레이 상에 고정화시킬 수 있다. 단백질 어레이의 경우에는, 각 폴리펩티드를 지지체 상의 독특한 번지에서 고정화시킨다. 전형적으로, 이러한 번지는 2차원적 번지이다. 단백질 어레이는 다음에 기재되어 있다 ("진단" 참고).

ApoE-CTD와 결합하는 것으로 확인된 후보 항체는, 이러한 항체를 암호화하는 벡터 핵산 서열을 숙주 세포 내로 형질전환시켜 이 항체가 상기 세포 내에서 생성되거나, 세포로부터 분비되거나 또는 세포 표면에 부착되도록 함으로써 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 세포성 표현형 또는 세포 매개성 활성 상의 변화를 탐지함으로써, ApoE-CTD와 결합하는 항체를 알아보기 위해 세포를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 상기 활성은 세포 또는 보체 매개성 세포독성일 수 있다.

또 다른 양태에서는, 세포 라이브러리가 세포성 어레이의 형태이다. 이러한 세포성 어레이를 또한 대상으로 하여, 탐지 가능한 적당한 모든 활성에 대해 스크리닝할 수 있다.

C. 항체 생성

표준 재조합 핵산 방법을 사용하여 본 발명의 항체를 발현시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 항체를 암호화하는 핵산 서열을 핵산 발현 벡터 내로 클로닝시킨다. 물론, 항체가 다중 폴리펩티드 쇄를 포함하는 경우에는, 각 쇄를 발현 벡터, 예를 들어 동일하거나 상이한 세포에서 발현되는 동일하거나 상이한 벡터 내로 클로닝시켜야만 한다. 항체 단편이 충분히 작은 경우, 즉 50개 미만 아미노산인 경우에는, 자동화 유기 합성 방법을 사용하여 이를 합성할 수 있다. 항체 생성 방법이 다음에 또한 제공된다.

항체 리간드를 발현하기 위한 발현 벡터는 폴리펩티드 리간드 또는 그의 단편을 암호화하는 절편 이외에도, 조절성 서열 (이에는 관심있는 핵산(들)에 작동적으로 연결된 프로모터가 포함된다)을 포함할 수 있다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당업자에게 공지되어 있고, 본 발명의 재조합 구조물을 생성시키기 위해 시판되고 있다. 다음 벡터들이 그 예로써 제공된다. 세균성: pBs, 파아지스크립트 (phagescript), PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (공급처: Stratagene, La Jolla, California, USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 및 pRIT5 (공급처: Pharmacia, Uppsala, Sweden). 진핵성: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXTI, pSG (공급처: Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL (공급처: Pharmacia). 바람직한 라이브러리의 한 가지 바람직한 부류는 다음에 기재되는 디스플레이 라이브러리이다.

당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여, 본 발명의 항체와 적당한 전사/해독 제어 신호를 함유하는 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법에는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 재조합/유전적 재조합 기술이 포함된다 [참고: 예를 들어, Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (2001) and Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1989)]. CAT (클로람페니콜 트랜스퍼라제) 벡터 또는 선별성 마커를 수반한 기타 벡터를 이용하여, 목적하는 모든 유전자로부터 프로모터 영역을 선별할 수 있다. 2가지 적당한 벡터는 pKK232-8 및 pCM7이다. 특별히 명칭된 세균성 프로모터에는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 P 및 trc가 포함된다. 진핵성 프로모터에는 CMV 즉발형 (immediate early), HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTRs, 마우스 메탈로티오네인-I 및 당해 분야에 공지된 각종의 조직 특이적 프로모터가 포함된다.

일반적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포의 형질전환을 허용해 주는 복제 기점과 선별성 마커, 예를 들어 이. 콜라이 및 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae) 영양요구성 마커의 앰피실린 내성 유전자 (예를 들면, URA3 , LE12 , HIS3 및 TRPI 유전자), 및 하단 구조 서열의 전사를 지시하기 위해 고도로 발현된 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함할 것이다. 이러한 프로모터는 당분해 효소, 특히 예를 들면, 3-포스포글리세레이트 키나제 (PGK), a-인자, 산 포스파타제 또는 열 쇽 단백질을 암호화하는 오페론 (operon)으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 적당한 상에서, 해독 개시 및 종결 서열, 및 바람직하게는 해독된 단백질이 원형질막 주위공간 또는 세포외 매질 내로 분비되도록 지시할 수 있는 리더 서열과 어셈블리한다. 임의로, 본 발명의 핵산은 목적하는 특징, 예를 들어 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 간단한 정제를 제공해주는 N-말단 확인 펩티드를 포함한 융합 단백질을 암호화할 수 있다. 세균에 대해 유용한 발현 벡터는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 적합한 해독 개시 및 종결 서열과 함께, 임의로 작동 가능한 판독 상에서 기능적 프로모터와 함께 삽입함으로써 구축한다. 이러한 벡터는 하나 이상의 표현형 선별성 마커와, 벡터의 유지 보존을 보장해주고 경우에 따라 숙주 내에서의 증폭을 제공해주기 위한 복제 기점을 포함할 것이다. 형질전환을 위해 적합한 원핵성 숙주에는 이. 콜라이, 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 및 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 및 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 속에 속하는 각종 종이 포함되지만, 기타 숙주가 선택 사항으로서 이용될 수도 있다.

대표적이긴 하지만 비-제한적 예로서, 세균에 대해 유용한 발현 벡터는 널리 공지된 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017)의 유전적 요소를 포함하는 시판용 플라스미드로부터 유래된 세균성 복제 기점과 선별성 마커를 포함할 수 있다. 이러한 시판용 벡터에는, 예를 들어 pKK223-3 (공급처: Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 및 pGEMI (공급처: Promega, Madison, Wisconsin, USA)이 포함된다.

본 발명은 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 추가로 제공하는데, 여기서는 공지된 형질전환, 형질감염 또는 감염 방법을 이용하여, 핵산을 숙주 세포 내로 도입하였다. 예를 들어, 숙주 세포에는 다양성 가닥으로부터 구축된 라이브러리 구성원이 포함될 수 있다. 숙주 세포는 진핵성 숙주 세포, 예를 들어 포유류 세포, 하등 진핵성 숙주 세포, 예를 들어 효모 세포이거나, 또는 숙주 세포가 원핵성 세포, 예를 들어 세균성 세포일 수 있다. 재조합 구성물을 숙주 세포 내로 도입하는 것은 예를 들어, 인산칼슘 형질감염, DEAE, 덱스트란 매개성 형질감염 또는 전기천공에 의해 수행할 수 있다 [참고: Davis, L. et al, Basic Methods in Molecular Biology (1986)].

모든 숙주/벡터 시스템을 사용하여 본 발명의 하나 이상의 표적 요소를 확인할 수 있다. 이들에는 진핵성 숙주, 예를 들어 HeLa 세포, CV-1 세포, COS 세포, Sf9 세포 및 HEK293T 세포 뿐만 아니라 원핵성 숙주, 예를 들어 이. 콜라이 및 비. 서브틸리스가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 가장 바람직한 세포는 특정한 리포터 (reporter) 폴리펩티드 또는 단백질은 정상적으로 발현하지 않거나 또는 리포터 폴리펩티드 또는 단백질을 낮은 천연 수준으로 발현하는 것이다.

본 발명의 숙주는 효모 또는 기타 진균일 수 있다. 효모에서는 구성성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 수 많은 벡터를 사용할 수 있다. 이에 대한 고찰은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [Current Protocols in Molecular Biology, Vol, 2, Ed. Ausubel et al, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13 (1988); Grant et al (1987) "Expression and Secretion Vectors for Yeast", Methods Enzymol. 153: 516-544 (1987); and The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al, Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II (1982)].

본 발명의 숙주는 원핵성 세포, 예를 들어 이. 콜라이, 기타 엔테로박테리아세애 (enterobacteriaceae), 예를 들어 세라티아 마레스칸스 (Serratia marescans), 바실루스, 각종 슈도모나스, 또는 형질전환, 형질감염 및(또는) 감염시킬 수 있는 기타 원핵생물일 수도 있다.

본 발명은 본 발명의 항체를 함유하도록 유전 공학적으로 처리시킨 숙주 세포를 추가로 제공해준다. 예를 들어, 이러한 숙주 세포는 공지된 형질전환, 형질감염 또는 감염 방법을 사용하여 숙주 세포 내로 도입시킨 본 발명의 핵산을 함유할 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 유전 공학적으로 처리시킨 숙주 세포를 추가로 제공하는데, 이러한 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서의 상기 항체 발현을 구동시키는 숙주 세포에 대해 이종인 조절성 서열과 작동적으로 연합되어 있다.

숙주 세포는 고등 진핵성 숙주 세포, 예를 들어 포유류 세포, 하등 진핵성 숙주 세포, 예를 들어 효모 세포이거나, 또는 숙주 세포가 원핵성 세포, 예를 들어 세균성 세포일 수 있다.

재조합 구성물을 숙주 세포 내로 도입하는 것은 인산칼슘 형질감염, DEAE, 덱스트란 매개성 형질감염 또는 전기천공에 의해 수행할 수 있다 [참고: Davis, L. et al, Basic Methods in Molecular Biology (1986)]. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중의 하나를 함유하는 숙주 세포를 통상적인 방식으로 사용하여, 분리된 단편에 의해 암호화된 유전자 생성물을 생성시킬 수 있다 (ORF의 경우).

적합한 모든 숙주/벡터 시스템을 사용하여 본 발명의 하나 이상의 여러 가지 항체를 발현시킬 수 있다. 각종 포유류 세포 배양 시스템을 또한 이용하여 재조합 항체를 발현시킬 수 있다.

항체 (예: Fabs)를 세균성 세포 (예: 이. 콜라이 세포)에서 생성시킬 수 있다. 예를 들어, Fab가 디스플레이 실재물과 박테리오파아지 단백질 (또는 그의 단편) 사이에 억제 가능한 중지 코돈을 포함하는 파아지 디스플레이 벡터에서의 서열에 의해 암호화되는 경우에는, 중지 코돈을 억제할 수 없는 세균성 세포 내로 상기 벡터 핵산을 셔플링할 수 있다. 이러한 경우에는, Fab가 유전자 III 단백질에 융합되지 않으며, 매질 내로 분비된다.

항체를 진핵성 세포에서 생성시킬 수도 있다. 한 양태에서는, 항체 (예: scFvs)를 효모 세포, 예를 들어 피치아 (Pichia) [참고: 예를 들어, Powers et al (2001) J. Immuraol. Methods. 251: 123-35], 한세울라 또는 삭카로마이세스에서 발현시킨다.

한 가지 바람직한 양태에서는, 항체를 포유류 세포에서 생성시킨다. 클론 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 발현하는데 바람직한 포유류 숙주 세포에는, 예를 들어 문헌 [참고: Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621]에 기재된 바와 같이 DHFR 선별성 마커와 함께 사용된 중국산 햄스터 난소 (CHO 세포) [문헌 (참고: Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220)에 기재된 dhfr-CHO 세포 포함], 림프구성 세포주, 예를 들어 NSO 골수종 세포 및 SP2 세포, COS 세포, 및 트랜스제닉 동물 (예: 트랜스제닉 포유류)로부터의 세포가 포함된다. 예를 들어, 상기 세포가 포유류 상피 세포이다.

다양화된 면역글로불린 도메인을 암호화하는 핵산 서열 이외에도, 재조합 발현 벡터는 부가의 서열, 예를 들어 숙주 세포에서의 상기 벡터의 복제를 조절해 주는 서열 (예: 복제 기점) 및 선별성 마커 유전자를 수반할 수 있다. 이러한 선별성 마커 유전자는 벡터를 도입시킨 숙주 세포의 선별을 촉진시켜 준다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호]. 예를 들어, 전형적으로 선별성 마커 유전자는 벡터를 도입시킨 숙주 세포 상에서 약물 (예: G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트)에 대한 내성을 부여해준다. 바람직한 선별성 마커 유전자에는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭을 수반한 dhfr-숙주 세포에 사용하기 위함) 및 neo 유전자 (G418 선별을 위함)가 포함된다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합성 부분을 재조합 발현하기 위한 예시 시스템에서는, 항체 중쇄와 항체 경쇄 둘 다를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 인산칼슘 매개성 형질감염에 의해 dhfr ^- CHO 세포 내로 도입한다. 재조합 발현 벡터내에서는, 항체 중쇄 유전자와 경쇄 유전자가 각각 증강인자 (enhancer)/프로모터 조절 요소 (예를 들어, SV40, CMV, 아데노바이러스 등으로부터 유래되는데, 예를 들면, CMV 증강인자/AdMLP 프로모터 조절 요소 또는 SV40 증강인자/AdMLP 프로모터 조절 요소이다)에 작동적으로 연결되어 고 수준의 유전자 전사를 구동시킨다. 재조합 발현 벡터는 또한, 메토트렉세이트 선별/증폭을 이용하여 벡터로 형질감염시킨 CHO 세포의 선별을 허용해 주는 DHFR 유전자를 수반하였다. 이와 같이 선별된 형질전환체 숙주 세포를 배양하여 항체 중쇄와 경쇄를 발현시킬 수 있고, 이러한 배양 배지로부터 본래의 항체를 회수한다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키며, 형질전환체를 선별하고, 숙주 세포를 배양한 다음, 배양 배지로부터 항체를 회수한다. 예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G를 이용한 친화 크로마토그래피에 의해 몇몇 항체를 분리시킬 수 있다.

Fc 도메인을 포함하는 항체에 대해서는, 항체 생성 시스템이 바람직하게는, Fc 영역을 당화시킨 항체를 합성한다. 예를 들어, IgG 분자의 Fc 도메인은 CH2 도메인 내의 아스파라긴 297에서 당화시킨다. 이러한 아스파라긴은 이분지-유형 (biantennary-type) 올리고당류을 이용한 변형 부위이다. 이러한 당화가 Fc 수용체와 보체 Clq에 의해 매개된 효과기 기능에 요구된다는 사실이 입증되었다 [참고: Burton and Woof (1992) Adv. Immunol. 51: 1-84; Jefferis et al (1998) Immunol. Rev. 163: 59-76]. 한 가지 바람직한 양태에서는, 아스파라긴 297에 상응하는 잔기를 적당히 당화시키는 포유류 발현 시스템에서 Fc 도메인이 생성된다. Fc 도메인은 또한, 기타 진핵성 해독 후 변형을 포함할 수 있다.

항체는 트랜스제닉 동물에 의해서도 생성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,849,992호에는 항체를 트랜스제닉 포유류의 유선에서 발현시키는 방법이 기재되어 있다. 유액 (milk)-특이적 프로모터와, 관심있는 항체 및 분비를 위한 신호 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 트랜스유전자 (transgene)를 구축한다. 이러한 트랜스제닉 암컷 포유류에 의해 생성된 유액에는 그 내부에서 분비된 관심있는 항체가 포함된다. 이 항체를 유액으로부터 정제하거나, 또는 몇몇 적용을 위해서는 이를 직접적으로 사용할 수 있다.

본 발명의 ApoE-CTD 항체를 디스플레이 라이브러리로부터 분리한 다음, 그의 서열 및(또는) 구조를 분석할 수 있다. 이러한 항체는 공지된 방법을 사용하여 목적하는 어떠한 양으로든 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 항체는 화학적 합성에 이어 타고난 본래의 입체 형태, 즉 정확한 디설파이드 결합 연쇄를 수득하기에 적당한 산화성 조건 하에 처리함으로써 유리하게 생성시킬 수 있다. 합성은 당업자에게 널리 공지된 방법론에 의해 수행할 수 있다 [참고: Kelley et al., in Genetic Engineering Principles and Methods, (Setlow, J.K.,ed.), Plenum Press, NY., (1990) vol. 12, pp. 1-19; Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989), W.H.Freeman Co., San Francisco]. 본 발명에 따르는 폴리펩티드는 서비스로서 폴리펩티드 합성을 제공해주는 공급처 [예: BACHEM Bioscience,Inc., King of Prussia, Pa.; Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, Mass]에 의해 상업적으로 제조할 수도 있다.

D. 진단적 방법

ApoE-CTD와 결합하고 본원에 기재되고/되거나 본원에 상세된 방법에 의해 확인된 항체는 시험관내 및 생체내 진단적, 치료적 및 예방적 용도를 지니고 있다.

한 국면에서는, 본 발명이 시험관 내에서 (예: 생물학적 샘플, 예를 들면 생검) 또는 생체 내에서 (예: 대상체에게서의 생체내 영상) ApoE-CTD의 존재를 탐지하기 위한 진단 방법을 제공한다.

이러한 방법은 (i) 특정 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계; (ii) 항체와 샘플 간의 복합체 형성을 탐지하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한, 기준 샘플 (예: 대조군 샘플)을 항체와 접촉시키는 단계; 및 이러한 항체와 특정 샘플 간의 복합체 형성 정도를, 항체와 기준 샘플 간의 복합체 형성과 비교해서 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 대조군 샘플 또는 대상체에 비해 상기 샘플 또는 대상체 내에서의 복합체 형성에 있어서의 변화, 예를 들면 통계상 유의적 변화가 이러한 샘플 내에 ApoE-CTD가 존재한다는 지표일 수 있다.

또 다른 방법은 (i) 본 발명의 항체를 특정 대상체에게 투여하는 단계; 및 (ii) 이러한 항체와 대상체 간의 복합체 형성을 탐지하는 단계를 포함한다. 이러한 탐지 단계는 복합체 형성 위치 또는 형성 시간을 결정하는 것을 포함할 수 있다.

항체 리간드는 탐지 가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지시켜 결합되거나 결합되지 않은 항체의 탐지를 촉진시킬 수 있다. 적합한 탐지 가능한 물질에는 각종 효소, 보결 분자단, 형광성 물질, 발광성 물질 및 방사성 물질이 포함된다.

본 발명의 항체와 ApoE-CTD 간의 복합체 형성은 ApoE-CTD와 결합된 항체 또는 결합되지 않은 항체를 측정하거나 가시화함으로써 탐지할 수 있다. 통상적인 탐지 검정, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역 검정 (RIA) 또는 조직 면역조직화학을 사용할 수 있다. 항체를 표지시키는 것에 추가로, ApoE-CTD의 존재는 탐지 가능한 물질로 표지시킨 표준물과 표지되지 않은 항체를 활용하는 경쟁 면역검정에 의해 샘플 중에서 검정할 수 있다. 이러한 검정의 한 예에서는, 생물학적 샘플, 표지된 표준물 및 항체를 합하고, 표지되지 않은 리간드에 결합된 표지된 표준물의 양을 결정한다. 샘플 중에서의 ApoE-CTD의 양은 항체와 결합된 표지된 표준물의 양에 반비례한다.

형광단 및 발색단 표지시킨 항체를 제조할 수 있다. 항체는 약 310 nm 이하의 파장을 갖는 빛을 흡수하기 때문에, 310 nm 이상, 바람직하게는 400 nm 이상 파장에서 상당한 흡수를 나타내는 형광성 잔기를 선별해야 한다. 적합한 각종의 형광단 및 발색단이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Stryer (1968) Science 162: 526 and Brand, L. at al. (1972) Annual Review of Biochemistry 41: 843-868]. 항체는 통상적인 과정, 예를 들어 미국 특허 제3,940,475호, 제4,289,747호 및 제4,376,110호에 기재된 과정에 의해 형광성 발색단기로 표지시킬 수 있다. 상기 언급된 수 많은 바람직한 특성을 지닌 형광제 중의 한 군이 크산텐 염료인데, 이에는 플루오레세인 및 로다민이 포함된다. 형광성 화합물의 또 다른 군은 나필라민이다. 형광단 또는 발색단으로 일단 표지시키면, 이러한 항체를 사용하여 예를 들어 형광 현미경 [예: 공초점 또는 디컨볼루션 (deconvolution) 현미경]으로 샘플 중에서의 ApoE-CTD의 존재 또는 위치를 탐지할 수 있다.

본원에 기재된 항체를 사용하여 면역조직화학을 수행할 수 있다. 예를 들어, 표지 (예: 정제 또는 에피토프 태그)를 수반하는 항체를 합성할 수 있거나, 또는 표지 또는 표지-결합성 기를 접합시킴으로써 항체를 탐지 가능한 수준으로 표지시킬 수 있다. 예를 들어, 킬레이트제를 항체에 부착시킬 수 있다. 그 다음, 항체를 조직학적 제제, 예를 들면, 현미경 슬라이드 상에 놓여져 있는 고정된 조직 박편에 접촉시킨다. 결합을 위해 항온 배양한 후, 상기 제제를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거한다. 그 다음, 예를 들어 현미경을 사용하여 제제를 분석하여, 항체가 이 제제에 결합되었는지를 확인한다.

물론, 항체를 결합 시점에 표지시키지 않을 수도 있다. 결합 및 세척 후, 항체를 표지시켜 이를 탐지 가능하게 만든다.

항체를 단백질 어레이 상에 고정화시킬 수도 있다. 단백질 어레이는 예를 들어, 의료 샘플 (예: 분리된 세포, 혈액, 혈청, 생검 등)을 스크리닝하기 위한 진단 도구로서 사용될 수 있다. 물론, 단백질 어레이에, 예를 들어 ApoE-CTD와 결합하는 기타 리간드가 포함될 수도 있다.

폴리펩티드 어레이를 생성시키는 방법이, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: De Wildt et al. (2000) Nature Biotech. 18: 989-994; Lueking et al. (1999) Anal. Biochem. 270: 103-111; Ge (2000) Nuc. Acids Res. 28: e3; MacBeath and Schreiber (2000) Science 289: 1760-1763; WO 01/40803 and WO 99/51773A1]. 어레이에 대한 폴리펩티드는, 예를 들어 시판되고 있는 로봇을 이용한 장치 [공급처: Genetic MicroSystems and Affymetrix (Santa Clara, California, USA) 또는 BioRobotics (Cambridge, UK)]를 사용하여 고속으로 스폿팅할 수 있다. 어레이 기판은 예를 들어, 니트로셀룰로스, 플라스틱, 유리 (예: 표면 변형 유리)일 수 있다. 어레이에는 다공성 매트릭스, 예를 들어 아크릴아미드, 아가로스 또는 또 다른 중합체가 포함될 수도 있다.

예를 들어, 어레이는 드 윌트 (De Wildt) 등의 문헌 (상기 참고)에 기재된 바와 같이 항체의 어레일 수 있다. 폴리펩티드 리간드를 생성시키는 세포를 필터 상에서 어레이 포맷으로 성장시킬 수 있다. 폴리펩티드 생성을 유도시키고, 발현된 폴리펩티드를 세포 위치에서 필터에 고정화시킨다.

항체 어레이를 표지된 표적과 접촉시켜, 다양성 가닥 라이브러리로부터의 각 고정화 항체에 대한 표적의 결합 정도를 결정할 수 있다. 표적을 표지시키지 않은 경우에는, 예를 들어 표지시킨 프로브를 이용하는 샌드위치 방법을 사용하여, 표지되지 않은 표적의 결합을 탐지할 수 있다.

각 어레이 번지에서의 결합 정도에 관한 정보를 프로파일로서, 예를 들어 컴퓨터 데이터베이스에 저장할 수 있다. 항체 어레이를 반복해서 생성시킬 수 있고, 이를 사용하여 표적의 결합 프로파일과 비-표적의 결합 프로파일을 비교할 수 있다. 따라서, 항체 어레이를 사용하여, 하나 이상의 분자에 관해 목적하는 결합 특성을 지니고 있는 다양성 가닥 라이브러리의 개개 구성원을 확인할 수 있다.

또 다른 양태에서는, 본 발명이 생체 내에서 ApoE-CTD 함유 플라크의 존재를 탐지하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (i) 특정 대상체 (예: 알츠하이머병 또는 전신성 아밀로이드증에 걸린 환자)에게, 탐지 가능한 마커와 접합된 본 발명의 항체를 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 탐지 가능한 마커가 ApoE-CTD 함유 플라크에 결합되었는지를 탐지하기 위한 수단에 상기 대상체를 노출시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 대상체를, 예를 들면 NMR 또는 기타 단층촬용 수단에 의해 영상화한다.

본 발명에 따르는 진단 영상화에 유용한 표지의 예에는 방사성표지, 예를 들어 ^l3lI, ¹¹¹In, ¹²³I, ⁹⁹ ^mTc, ³²P, ¹²⁵I, ³H, ¹⁴C, 및 ¹⁸⁸Rh, 형광성 표지, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민, 핵자기 공명 활성 표지, 양전자 방출 단층촬영술 ("PET") 스캐너에 의해 탐지 가능한 양전자 방출 동위원소, 화학발광제, 예를 들어 루시페린 및 효소적 마커, 예를 들어 퍼옥시다제 또는 포스파타제가 포함된다. 단거리 방사선 방출기, 예를 들어 단거리 탐지기 프로브에 의해 탐지 가능한 동위원소를 이용할 수도 있다. 공지된 기술을 이용하여 폴리펩티드 리간드를 상기 시약으로 표지시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Wensel and Meares (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York for techniques relating to the radiolabel of antibodies and D. Colcher et al. (1986) Methods Enzymol. 121: 802-816].

본 발명의 방사성 표지 리간드를 시험관내 진단 시험에 사용할 수도 있다. 동위원소-표지시킨 리간드의 고유 (특이) 활성은 반감기, 방사성 표지의 동위원소 순도, 및 표지를 항체에 혼입시키는 방식에 의해 좌우된다.

폴리펩티드를 방사성 동위원소 (예: ¹⁴C, ³H, ³⁵S, ^l25I, ³²p, ^l3lI)로 표지시키는 과정은 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 삼중 수소 표지화 과정이 미국 특허 제4,302,438호에 기재되어 있다. 예를 들어, 뮤린 모노클로날 항체에 대해 적응시킨 바와 같은, 요오드화, 삼중 수소 표지화 및 ³⁵S 표지화 과정이, 예를 들어 문헌 [참고: Goding, J.W. (Monoclonal Antibodies: Principles And Practice: Production And Application Of Monoclonal Antibodies In Cell Biology, Biochemistry, And Immunology 2nd ed., London, Orlando, Academic Press (1986) polypeptide. 124-126) 및 이에 인용된 참고 문헌]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 (예: 항체)를 요오드화하기 위한 기타 과정이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Hunter and Greenwood (1962) Nature 144: 945, David et al. (1974) Biochemistry 13: 1014-1021, 및 미국 특허 제3,867,517호 및 제4,376,110호]. 영상화하는데 유용한 방사성표지화 요소에는, 예를 들어 ¹²³I, ¹³¹I, ^ll1In, 및 ⁹⁹ ^mTc가 포함된다. 항체를 요오드화하기 위한 과정이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Greenwood, F. et al. (1963) Biochem. J. 89: 114-123; Marchalonis, J. (1969) Biochem. J. 113: 299-305; and Morrison, M. et al. (1971) Immunochemistry 8: 289-297]. ^99mTc-표지화 과정이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Rhodes, B. et al. in Burchiel, S. et al. (eds.), Tumor Imaging: The Radioimmunichemical Detection of Cancer, New York: Masson 111-123 (1982) 및 이에 인용된 참고 문헌]. 항체를 ^ll1In-표지화하는데 적합한 과정이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Hnatowich, D. J. et al. (1983) J. Immun. Methods 65: 147-157, Hnatowich, D. et al. (1984) J. Applied Radiation 35: 554-557 and Buckley, R. G. et al. (1984) F.E.B.S. Lett. 66: 202-204].

방사성 표지시킨 항체의 경우에는, 이러한 항체를 환자에게 투여하고, 항체와 반응하는 플라크에 국한시키며, 공지된 기술, 예를 들어 감마 카메라 또는 방출 단층촬영술을 이용하는 방사성핵 스캐닝을 사용하여 생체 내에서 탐지하거나 "영상화"한다. 또 다른 한편, 양전자 방출 횡축 단층촬영 스캐너, 예를 들면 브룩해븐 (Brookhaven) 국립 실험실에 위치한 지정된 Pet VI를 사용할 수 있는데, 여기서는 방사성 표지가 양전자 (예: ¹¹C, ¹⁸F, ¹⁵O, 및 ¹³N)를 방출한다.

자기 공명 영상 (MRI)은 NMR을 이용하여 살아 있는 대상체의 내부 특징들을 가시화하는데, 이는 예후, 진단, 치료 및 수술하는데 있어 유용하다. MRI는 명백한 이점을 얻기 위해 방사성 추적자 화합물 없이도 사용할 수 있다. 몇몇 MRI 기술이 유럽 공개특허공보 EP-A-0 502 814에 요약되어 있다. 일반적으로, 상이한 환경 하에서 수 프로톤 (water proton)의 이완 시간 상수 Tl 및 T2와 관계된 차이점을 이용하여 영상을 발생시킨다. 그러나, 이러한 차이점은 급격히 높은 해상도의 영상을 제공하기에 불충분할 수 있다.

이들 이완 시간 상수 상의 차이는 조영제에 의해 증강시킬 수 있다. 이러한 조영제의 예에는 수 많은 자기 작용제, 상자성 작용제 (이는 주로 T1을 변경시킨다), 및 강자성 또는 초상자성 작용제 (이는 주로 T2 반응을 변경시킨다)가 포함된다. 킬레이트제 (예: EDTA, DTPA 및 NTS 킬레이트제)를 사용하여 몇몇 상자성 물질 (예: Fe⁺³, Mn⁺², Gd⁺³)을 부착 (및 독성 저하)시킬 수 있다. 기타 작용제는, 예를 들어 직경이 10 ㎛ 미만 내지 약 10 nM인 입자 형태일 수 있다. 입자가 강자성, 항강자성 또는 초상자성 특성을 지닐 수 있다. 입자에는, 예를 들어 자기 (Fe₃0₄), -Fe₂0₃, 페라이트, 및 전이 원소의 기타 자기 광물 화합물이 포함될 수 있다. 자기 입자는 비-자기 물질을 수반하거나 수반하지 않는 하나 이상의 자기 결정을 포함할 수 있다. 비-자기 물질에는 합성 또는 천연 중합체, 예를 들어 세파로스, 덱스트란, 덱스트린, 전분 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 항체는 NMR-활성 ¹⁹F 원자 또는 이러한 원자 복수 개를 함유하는 지시기로 표지시킬 수도 있는데, 이는 (i) 천연상 풍부한 실질적으로 모든 불소 원자가 ¹⁹F 동위원소이므로, 실질적으로 모든 불소 함유 화합물이 NMR-활성이고; (ii) 화학적으로 활성인 모든 폴리불소화 화합물 (예: 트리플루오르아세트산 무수물)이 비교적 저렴하게 시판되고 있으며; (iii) 많은 불소화 화합물 (예를 들어, 헤모글로빈 대체물로서 산소를 운반하도록 활용된 과불소화 폴리에테르)이 인간에 사용하도록 의료적으로 허용 가능한 것으로 밝혀졌기 때문이다. 항온 배양한 후, 문헌 [참고: Pykett (1982) Scientific American 246: 78-88]에 기재된 것들 중의 하나와 같은 장치를 사용하여, MRI 스캔을 수행한다.

본 발명의 항체와, 진단 용도에 대한 지시 사항, 예를 들어, ApoE-CTD를 시험관 내에서, 예를 들어 특정 샘플 (예: 전신성 아밀로이드증에 걸린 환자로부터의 생검) 중에서, 또는 생체 내에서, 예를 들어 대상체를 영상화함으로써 탐지하기 위해 항체를 사용하는 지시 사항을 포함하는 키트가 또한 본 발명의 범위 내에 속한다. 이러한 키트는 하나 이상의 부가 시약, 예를 들어 표지 또는 부가의 진단제를 추가로 함유할 수 있다. 생체내 사용하기 위해서는, 항체를 제약 조성물로서 제형화할 수 있다.

E. 치료적 방법

ApoE-CTD와 결합하고 본원에 기재되고/되거나 본원에 상세된 방법에 의해 확인된 폴리펩티드는 치료적 및 예방적 용도를 지니고 있다. 예를 들어, 이들 리간드를 배양 중인 세포, 예를 들면 시험관내 또는 생체 외에서, 또는 특정 대상체에게, 예를 들면 생체 내에서 투여하여 각종 질환, 예를 들면 알츠하이머병 또는 전신성 아밀로이드증을 치료, 예방 및(또는) 진단할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 특정 질환 (예: 본원에 기재된 바와 같은 질환), 특정 질환 증상 또는 이러한 질환에 대한 소인을 치료, 치유, 완화, 구제, 변경, 경감, 개선 또는 영향을 미칠 목적으로, 상기 질환, 이러한 질환 증상 또는 이 질환에 대한 소인이 있는 대상체 (예: 환자)에게 항-ApoE-CTD 항체를 단독으로 적용 또는 투여하거나, 이 항체를 제2의 작용제와 병용 투여하는 것으로서 규정된다.

본원에 사용된 바와 같은, 특정 질환을 치료하는데 유효한 항-ApoE-CTD 폴리펩티드의 양, 또는 "치료적 유효량"은 특정 대상체에게 1회분 또는 수 회분 용량 투여시, 본원에 기재된 바와 같은 질환이 있는 대상체가 해당 치료 부재 하에서 예상된 것 보다 대상체의 치유, 완화, 경감 또는 개선을 연장시키는데 있어서 유효한 리간드의 양을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은, 특정 질환을 예방하는데 유효한 항-ApoE-CTD 폴리펩티드의 양, 또는 이러한 폴리펩티드의 "예방적 유효량"은 특정 대상체에게 1회분 또는 수 회분 용량 투여시, 특정 질환, 예를 들어 알츠하이머병의 발병 또는 재발을 예방 또는 지연시키는데 있어서 유효한 항-ApoE-CTD 폴리펩티드, 예를 들면 본원에 기재된 항-ApoE-CTD 항체의 양을 지칭한다.

두 상태 간의 정량적 차이를 의미하는 용어 "유도", "억제", "증강", "상승", "증가", "저하 (감소)" 등은 두 상태 간의 차이, 예를 들면 통계상 유의적 차이를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"에는 인간 및 비-인간 동물이 포함된다. 바람직한 인간 동물에는 비정상적인 세포 증식 또는 세포 분화를 특징적으로 나타내는 질환이 있는 인간 환자가 포함된다. 용어 본 발명의 "비-인간 동물"에는 모든 척추동물, 예를 들어 비-포유류 (예: 치킨, 양서류, 파충류) 및 포유류, 예를 들어 비-인간 영장류, 양, 개, 축우, 돼지 등이 포함된다.

용어 "아밀로이드 질환"에는 알츠하이머병, 원발성 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 노인성 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병증 I, 가족성 아밀로이드 다발신경병증 III, 가족성 비-신경병증 아밀로이드증, 유전성 뇌 아밀로이드 혈관병증, 가족성 영국 치매 (FBD), 혈액투석 관련 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드증 (핀란드 유형), 가족성 상피하 각막 아밀로이드, 유형 II 당뇨병, 유전성 신 아밀로이드증, 뇌하수체 아밀로이드증, 주사제 국소 아밀로이드증, 갑상선의 수질성 암종, 심방 아밀로이드증, 가족성 덴마크 치매 (FDD), 및 다운 증후군이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 아밀로이드 원섬유가 탐지되는 아밀로이드 질환과 관련된 질환에는 해면상 뇌병증, 산발성 크로이츠펠트-야코브병, 가족성 크로이츠펠트-야코브병, 의인성 프리온 질환, 변이 크로이츠펠트-야코브병, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병 (GSS), 쿠루병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 가족성 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 및 만성 폐색성 폐 질환이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

더우기, 아밀로이드 질환은 아밀로이드가 뇌, 수질 또는 기타 기관에 침착되는 질환으로서 규정될 수 있다. 이러한 질환의 예는 알츠하이머병이다. 아밀로이드 침착을 특징적으로 나타내는 기타 치매 질환은 해면상 뇌병증, 산발성 크로이츠펠트-야코브병, 가족성 크로이츠펠트-야코브병, 의인성 프리온 질환, 변이 크로이츠펠트-야코브병, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병 (GSS), 쿠루병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 가족성 영국 치매, 가족성 덴마크 치매, 다운 증후군, 원발성 전신성 아밀로이드증 (예: 면역글로불린 경쇄-관련 아밀로이드증), 이차 전신성 아밀로이드증 (예: 아밀로이드 A 단백질과 관련된 아밀로이드증), 가족성 전신성 아밀로이드증, 예를 들어 가족성 트랜스티레틴 관련 아밀로이드증, 가족성 아포지단백질 A-I 관련 아밀로이드증, 가족성 겔솔린 관련 아밀로이드증, 가족성 피브리노겐 Aα 관련 아밀로이드증, 가족성 리조솜 아밀로이드증, 노인성 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병증 I, 가족성 아밀로이드 다발신경병증 III, 가족성 비-신경병증 아밀로이드증, 유전성 뇌 아밀로이드 혈관병증, 혈액투석 관련 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드증 (핀란드 유형), 가족성 상피하 각막 아밀로이드, 유형 II 당뇨병, 유전성 신 아밀로이드증, 뇌하수체 아밀로이드증, 주사제 국소 아밀로이드증, 갑상선의 수질성 암종, 심방 아밀로이드증, 만성 폐색성 폐 질환 및 가족성 근위축성 측삭 경화증 (ALS)이다. 이에 대한 상세한 내역은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [James C. Sacchettini and Jeffery W. Kelly: Nature Reviews, Drug Discovery, Vol. 1 April 2002, 267-275].

한 양태에서는, 대상체가 인간 대상체이다. 또 다른 한편, 대상체가 본 발명의 폴리펩티드와 교차 반응하는 ApoE-CTD-유사 항원을 발현하는 포유류일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 치료 목적 (다음에 추가로 논의됨)으로 인간 대상체에게 투여할 수 있다. 더우기, 수의용으로 또는 인간 질환의 동물 모델로서, 항-ApoE-CTD 폴리펩티드와 결합하는 ApoE-CTD-유사 항원을 발현하는 비-인간 포유류 (예: 영장류, 돼지 또는 마우스)에게 상기 항-ApoE-CTD 폴리펩티드를 투여할 수 있다. 후자에 관해서는, 이러한 동물 모델이 상기 폴리펩티드의 치료적 효능을 평가하는데 유용할 수 있다 (예를 들어, 투여량과 투여 시간 과정을 시험함).

생체내 양태에서는, 접촉 단계를 대상체에게서 수행하는데, 이러한 단계는 리간드가 플라크와 결합하여 이를 처리할 수 (예를 들어, 플라크를 파괴시킬 수) 있게 해주는데 유효한 조건 하에, 항-ApoE-CTD 폴리펩티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

항-ApoE-CTD 폴리펩티드의 투여 방법은 "제약 조성물"에 기재되어 있다. 사용된 분자의 적합한 투여량은 대상체의 연령과 체중, 및 사용된 특정 약물에 따라서 결정될 것이다.

항-ApoE-CTD 리간드를 생체 내에서 직접 사용하여, 천연 보체-의존성 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 통하여 ApoE-CTD 함유 플라크를 제거할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 보체 결합성 효과기 도메인, 예를 들어 IgG1, -2, 또는 -3로부터의 Fc 부위, 또는 보체와 결합하는 IgM의 상응하는 부위를 포함할 수 있다. 상기 처리는 보체 또는 보체 함유 혈청을 부가함으로써 보충할 수 있다. 추가로, 본 발명의 폴리펩티드로 피복시킨 플라크의 포식작용은 보체 단백질의 결합에 의해 향상될 수 있다.

항체-표적화 아밀로이드 플라크는 유형 A 스캐빈저 수용체를 통하여 미세아교세포에 의해 내재화시킬 수 있다 [참고: Melanie I. Brazil, Haeyong Chung, and Frederick R. Maxfield. Effects of Incorporation of Immunoglobulin G and Complement Component Clq on Uptake and Degradation of Alzheimer's Disease Amyloid Fibrils by Microglia J. Biol. Chem., May 2000; 275: 16941-16947]. 또 다른 한편, 미세아교세포성 Fc 수용체-비의존성 기타 기전은 확산성, 3D6-면역반응성, 티오-S-음성 플라크 및 가용성 Aβ 잔기를 제거하는데 있어서 일정 역할을 할 수도 있다 [참고: Wilcock DM, DiCarlo G, Henderson D, Jackson J, Clarke K, Ugen KE, Gordon MN, Morgan D: Intracranially administered anti - Abeta antibodies reduce beta - amyloid deposition by mechanismus both independent of and associated with microglial activation . J Neurosci 2003, 23: 3745-3751]. 이러한 가설과 일치되게, Fc-녹아웃 (knockout) 마우스 또한, Aβ 면역요법 후에 플라크 부하 감소를 나타내었다 [참고: Das P, Howard V, Loosbrock N, Dickson D, Murphy MP, Golde TE: Amyloid - beta immunization effectively reduces amyloid deposition in FcRgamma -/- knock - out mice . J Neurosci 2003, 23: 8532-8].

예방을 위해 항-ApoE-CTD 리간드를 사용하는 것을 포함하는 사멸 또는 절제 방법이 본 발명에 의해 포괄된다. 예를 들어, 이들 물질을 사용하여 알츠하이머병, 전신성 아밀로이드증 또는 기타 아밀로이드 질환의 발병 또는 진행을 예방 또는 지연시킬 수 있다.

알츠하이머병 또는 전신성 아밀로이드증을 치료하기 위해 본 발명의 치료적 방법을 사용하는 것은 수 많은 이점이 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 ApoE-CTD를 특이적으로 인식하기 때문에, 기타 조직이 피해 당하지 않고, 요법이 요구되는 부위로 고 수준의 작용제가 직접 전달된다. 본 발명에 따르는 치료는 임상 파라미터를 이용하여 효과적으로 모니터링할 수 있다. 또 다른 한편, 이들 파라미터를 이용하여 상기 치료를 이용해야하는 시기를 지시할 수 있다.

F. 제약 조성물

또 다른 국면에서, 본 발명은 제약상 허용 가능한 담체와 함께 제형화시킨 본 발명의 항체를 포함하는 조성물, 예를 들어 제약상 허용 가능한 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약 조성물"은 생체내 영상화를 위하여 표지시킨 리간드 뿐만 아니라 치료적 조성물을 포괄한다.

본원에 사용된 바와 같은 "제약상 허용 가능한 담체"에는 생리적으로 화합성인 모든 용매, 분산 매질, 피복제 등이 포함된다. 바람직하게는, 상기 담체가 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여용으로 적합하다 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함). 투여 경로에 따라서, 활성 화합물, 즉 폴리펩티드를 특정 물질 내에 피복시켜, 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 기타 천연 조건으로부터 상기 화합물을 보호시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 각종 형태로 존재할 수 있다. 이들에는, 예를 들어 액상, 반-고형 및 고형 투여 형태, 예를 들면, 액상 용제 (예: 주사제 및 주입용 용제), 분산제 또는 현탁제, 정제, 환제, 산제, 리포솜 및 좌제가 포함된다. 바람직한 형태는 의도한 투여 방식과 치료적 적용에 의해 좌우된다. 전형적인 바람직한 조성물은 항체를 인간에게 투여하기 위해 사용된 바와 유사한 조성물과 같은, 주사 또는 주입용 용제 형태이다. 바람직한 투여 방식은 비경구 (예: 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 바람직한 양태에서는, 항-ApoE-CTD 폴리펩티드를 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여한다. 또 다른 바람직한 양태에서는, 항-ApoE-CTD 리간드를 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여한다.

본원에 사용된 바와 같은 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"이란 장 및 국소 투여 이외의, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하는데, 이에는 정맥내, 근육내, 동맥내, 수막강내, 포막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 포막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

제약 조성물은 전형적으로, 제조 및 저장 조건 하에 멸균성이고 안정해야만 한다.

조성물은 용제, 마이크로에멀션, 분산제, 리포솜, 또는 고농도 약물에 적합한 기타 배열 구조물로서 제형화할 수 있다. 멸균성 주사 용제는 활성 화합물 (즉, 폴리펩티드)을 필요한 양으로 적당한 용매 중에, 상기 열거된 성분들 중의 하나 또는 조합물과 함께 혼입시킨 다음, 경우에 따라 여과 멸균시킴으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산제는 활성 화합물을, 상기 열거된 것으로부터의 기타 요구 성분과 기본 분산 매질을 함유하는 멸균성 비히클 내로 혼입함으로써 제조한다. 멸균성 주사 용제를 제조하기 위한 멸균성 산제의 경우에 바람직한 제조 방법은 진공 및 동결 건조 방법인데, 이는 활성 성분에 전술된 그의 멸균성 여과 용액으로부터의 부가의 목적 성분을 부가시킨 분말을 산출시킨다. 적당한 용액 유동성은, 예를 들어 레시틴과 피복제를 사용하고; 분산제의 경우에는, 요구되는 입자 크기를 유지시키며; 계면활성제를 사용함으로써 유지시킬 수 있다. 주사용 조성물의 흡수 연장은 조성물 내에, 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 혼입시킴으로써 이루어질 수 있다.

본 발명의 항체를 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 투여할 수 있지만, 많은 적용에 있어 바람직한 투여 경로/방식은 정맥내 주사 또는 주입이다. 예를 들어, 치료적으로 적용하는 경우에는, 약 1 내지 100 mg/㎡, 예를 들어 7 내지 25 mg/㎡의 용량이 도달하도록 분당 30, 20, 10, 5 또는 1 mg 미만의 속도로 정맥내 주입함으로써 항체를 투여할 수 있다. 투여 경로 및(또는) 방식은 목적하는 결과에 따라서 다양할 것이다.

제약 조성물은 당해 분야에 공지된 의료 기구를 사용하여 투여할 수 있다. 예를 들어 바람직한 양태에서는, 본 발명의 제약 조성물을 무침상 피하 주사기, 예를 들어, 미국 특허 제5,399,163호, 제5,383,851호, 제5,312,335호, 제5,064,413호, 제4,941,880호, 제4,790,824호 또는 제4,596,556호에 기재된 주사기를 사용하여 투여할 수 있다. 본 발명에 유용한 널리 공지된 이식물 및 모듈의 예에는 다음이 포함된다: 미국 특허 제4,487,603호에는 약물을 정확한 주입 속도로 투약하기 위한 이식 가능한 미소주입용 펌프가 기재되어 있고; 미국 특허 제4,447,224호에는 지속적인 약물 전달을 위한 변유량 이식 가능한 주입용 장치가 기재되어 있으며; 미국 특허 제4,439,196호에는 다중 챔버 구획을 갖는 삼투압 약물 전달 시스템이 기재되어 있고; 미국 특허 제4,475,196에는 삼투압 약물 전달 시스템이 기재되어 있다. 물론, 기타 많은 이식물, 전달 시스템 및 모듈 또한 공지되어 있다.

특정 양태에서는, 생체 내에서의 적당한 분포를 보장하도록 본 발명의 화합물을 제형화할 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료적 화합물이 BBB를 가로질러 갈 수 있도록 하기 위해서는, 이들 화합물을 예를 들어, 리포솜에서 제형화할 수 있다. 리포솜의 제조 방법에 대해서는, 미국 특허 제4,522,811호, 제5,374,548호 및 제5,399,331호를 참고할 수 있다. 리포솜은 특이적 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되므로, 표적화 약물 전달을 증강시키는 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있다 [참고: 예를 들어, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685].

최적의 목적 반응 (예: 치료적 반응)을 제공하도록 투여량 섭생을 조정한다. 예를 들어, 단일 거환을 투여할 수 있거나, 수 회분으로 나눈 용량을 일정 시간에 걸쳐 투여할 수 있거나, 또는 치료적 상황의 위급성에 의해 지시된 바와 같이 용량을 그에 비례하여 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여 용이성과 투여량 균일성을 위해 모 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료하고자 하는 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합하게 만든 물리적으로 별개의 단위를 지칭하는데; 각 단위는 요구되는 제약 담체와 연합해서 목적하는 치료 효과를 가져다 주는 것으로 산정된 예정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 관한 명세는 (a) 활성 화합물의 독특한 특징들과, 달성하고자 하는 특정한 치료 효과; 및 (b) 개개인에게서 민감도 처리를 위해 활성 화합물 화합과 관련하여 당해 분야에 내재된 제한 사항에 의해 지시되고 이들에 직접적으로 의존한다.

본 발명의 항체의 치료적 또는 예방적 유효량의 비-제한적 예시 범위는 0.1 내지 20 mg/kg, 보다 바람직하게는 1 내지 10 mg/kg이다. 약 1 내지 100 mg/㎡, 또는 약 5 내지 30 mg/㎡의 용량이 도달하도록 분당 30, 20, 10, 5 또는 1 mg 미만의 속도로 정맥내 주입함으로써 항체를 투여할 수 있다. IgG 보다 분자량이 더 낮은 항체 단편의 경우에 적당한 양은 그에 비례해서 더 적을 수 있다. 투여량 값은 완화시키고자 하는 질환의 유형과 중증도에 따라 다양할 수 있다는 것을 인지해야 한다. 특정 대상체에 대해서는, 개개인의 요구와 조성물을 투여하는 사람 또는 조성물 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라서 특이적 투여량 섭생을 일정 시간에 걸쳐 조정해야만 하고, 본원에 기재된 투여량은 단지 예시적이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하지 않아야 한다는 것을 추가로 인지해야 한다.

본 발명의 제약 조성물은 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"의 본 발명의 항체를 포함할 수 있다. 목적하는 치료적 결과는 전형적으로, 치료하고자 하는 개개인에게 고통을 주는 질환 또는 장애의 한 가지 이상 증상을 경감 또는 완화시키는 것이다. 본 발명의 항체의 치료적 양은 아밀로이드 침착물 생성을 느리게 하거나 중단시키고, 기존의 아밀로이드 침착물을 제거시키며, 진행되고 있는 질환 (이는 이차 아밀로이드증을 유발시킨다)을 완화시키고, 심장 또는 신장 손상으로 인해 유발된 증상들을 구제시키기 위해 제공되는 양일 수 있다. "치료적 유효량"은 필요한 기간 및 투여량에서 목적하는 치료적 결과를 가져다 주기에 유효한 양을 지칭한다. 본 발명의 조성물의 치료적 유효량은 질병 상태, 개개인의 연령, 성별 및 체중과 같은 요인들과, 개개인에게서 목적하는 반응을 유도시킬 수 있는 폴리펩티드 리간드의 능력에 따라서 다양할 수 있다. 치료적 유효량은 치료적으로 유리한 효과가 조성물의 어떠한 독성 또는 해로운 효과도 능가하는 양이다. "치료적 유효량"은 바람직하게는, 처리되지 않은 대상체에 비해, 측정 가능한 파라미터, 예를 들면 플라크 형성 또는 성장 속도를 약 20% 이상, 보다 바람직하게는 약 40% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 80% 이상 억제시킨다. 측정 가능한 파라미터를 억제할 수 있는 특정 화합물의 능력은 인간에게서의 효능을 예보해주는 동물 모델 시스템에서 평가할 수 있다. 또 다른 한편, 이러한 조성물 특성은, 전공의에게 공지된 검정에 의해 시험관 내에서 상기 억제를 억제시킬 수 있는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가할 수 있다.

"예방적 유효량"은 필요한 기간 및 투여량에서 목적하는 예방적 결과를 가져다 주는데 유효한 양을 지칭한다. 목적하는 예방적 결과는 처리하고자 하는 개개인에게서 예방시키고자 하는 질환과 연관된 증상들의 발병 또는 진행을 억제 또는 지연시키는 것이다. 전형적으로, 예방적 용량은 질환이 발병하기에 앞서, 또는 질환의 초기 단계에서 대상체에게 사용하기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량 보다 적을 것이다.

본 발명의 항체와, 예를 들어 치료, 예방 또는 진단 용도에 대한 지시사항을 포함하는 키트가 또한 본 발명의 범위 내에 속한다. 한 양태에서는, 진단 적용을 위한 지시 사항에는 플라크와 연관된 ApoE-CTD가 시험관 내에서, 예를 들어 특정 샘플 (예: 알츠하이머병 또는 전신성 아밀로이드증 환자로부터의 생검 또는 세포) 중에서, 또는 생체 내에서 형성하는 것을 탐지하기 위해 본 발명의 항체를 사용하는 것이 포함된다. 또 다른 양태에서, 치료적 적용을 위한 지시 사항에는 알츠하이머병 또는 전신성 아밀로이드증에 걸린 환자에게 제공되는 투여량 및(또는) 투여 방식이 포함되어 있다. 상기 키트는 하나 이상의 부가 시약, 예를 들어 진단제 또는 치료제를 추가로 함유한다.

다음 발명은 다음 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 이로써 제한되지 말아야 한다. 본원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고 문헌, 계류중인 특허원 및 공개된 특허는 그들의 전문이 본원에 참고로 도입된다.

본 발명이 그의 바람직한 양태를 참고로 하여 특정하게 제시 및 기재되긴 하였지만, 당업자는 첨부된 청구의 범위에 의해 포괄된 본 발명의 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 상세 내역에 있어 다양한 변화가 이루어질 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다.

<실시예>

실시예 1: 항체 라이브러리 조성

VLDL과 결합하지 않는 아밀로이드 질환 플라크에서 발견된 ApoE와 결합하는 항체를, 디악스 (Dyax) 파아지미드 라이브러리 Fab300 중의 인간 파아지 항체로부터 선별하였다. CTD 상에서의 선별을 위해 사용된 상기 라이브러리에 항체 다양성이 존재하는데, 경쇄 및 중쇄에 있어서의 다양성은 다음과 같이 구성되었다:

중쇄

중쇄는 1개의 중쇄 유전자 절편 (V3-23, 또는 DP-47)으로 이루어지는데, 여기서는 HCDR1 및 HCDR2 내의 특정 위치에서의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 다양성을 창출시켰다. 분포 패턴은 천연 서열의 다양성 분석에 기초한 것이다. 첨부된 HCDR3 다양성은 일련의 자가면역 공여자로부터의 B-세포의 IgM-풀의 천연 발생적 서열로부터 유래되었다.

경쇄

경쇄 레퍼토리는 H-CDR3 다양성과 동일한 공급원으로부터의, 천연적으로 재배열된 경쇄 서열 풀로부터 유래되었다. 이는 본 발명자들이 다양한 범위의 생식세포계 절편을 기준으로 하여, CDRs 내에 또는 외부에 체세포 돌연변이를 수반한 V카파 및 V람다 유전자를 예상할 수 있다는 것을 의미한다.

대조군 항체

다음 항-ApoE 항체를 대조군으로서 사용하였다:

3D12: CTD, VLDL, LDL, ApoE2, ApoE3 및 ApoE4와 결합하는 마우스 항체 [참고: Colabek et al. Biophysical J., 79: 1008-1015];

E19: CTD에 대해 지시된 염소 항체 [참고: Weisgraber (1986), J. Biol. Chem., 261: 2068-2076]; 및

*6C5: NTD에 대해 지시된 마우스 항체 [참고: Castano (1995) J. Biol. Chem., 270: 17610-17615].

실시예 2: 원섬유의 제조 및 예비시험

원섬유를 비장과 신장으로부터 추출하였다. 찬 0.15M NaCl, 0.1% NaN3에서 여러번 반복해서 기계적으로 균질화시킨 다음, 펠릿 중의 아밀로이드를 구조하기 위해 후속 원심분리시킴으로써, 인간 조직으로부터 불용성 아밀로이드 원섬유를 추출하였다. 최종적으로 아밀로이드를 물에 용해/현탁시키고 저장하였다. 현탁물 도말 표본을 콩고 (Congo) 레드 염색함으로써 아밀로이드 함량을 확인하였다. 이러한 원섬유 추출 방법은 당해 분야에 공지되어 있다 [참고: Skinner et al. Prep. Biochem. 1982; 12(5): 461-476]. 마르벨 (Marvel)-PBS-트윈 (Tween) (0.1%)로 5회 세척하고, PBS-트윈으로 2회 세척한 다음 PBS로 1회 세척함으로써, 결합된 파아지와 결합되지 않은 파아지를 격리시킬 수 있었던 것으로 결정되었다.

실시예 3: 바이오티닐화 CTD ( bCTD )의 제조 및 예비시험

서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 CTD를 사용하였다. CTD/바이오틴 몰비 1/2 내지 1/10을 사용하여 피어스 (Pierce)에 의해 기재된 방법에 따라서 설포-NHS-SS-바이오틴을 이용하여 바이오티닐화를 수행하였다. SDS PAGE 분석 결과, 상기 물질의 100%를 표지시킨 것으로 밝혀졌다. 1/10의 비율로 질량 분광측정하는 경우에는, 5개의 가능한 바이오티닐화 부위 중의 3개 내지 5개를 바이오틴으로 표지시켰다. 1/2 비율에서는 bCTD가 분자당 1개 또는 2개의 바이오틴을 나타내었는데, 이는 분자의 구조를 유지시키는데 있어 바람직하다. 사용된 모든 CTD와 NTD를 1/2 비율에서 동일한 프로토콜로 표지시키고 SDS-page에서 시험하였다.

BSA를 바이오틴으로 피복시키고, 세척하며, 스트렙타비딘을 가하고, 다시 한번 세척한 후, b-CTD를 가함으로써 피복된 bCTD를 제조하였다.

변성 bCTD를 생성시키기 위해, bCTD를 우레아로 처리하고, 세척한 후, 바이오티닐화 BSA 상에서 스트렙타비딘에 결합시켰다. 우레아 처리 동안 bCTD가 비드와 결합하여 이러한 비드 상에 머무르게 하기 위해서, 본 발명자들은 우레아 처리 및 비드와의 결합 전 및 후의 bCTD의 양을 측정하였다. 어떠한 bCTD 손실도 관찰되지 않았다.

실시예 4: 원섬유 및 ur - bCTD 상에서의 선별

선별 전략에 있어서의 목표는 아밀로이드 원섬유 중에서 복합체 형태의 CTD와 결합하는 항체에 대해 선별하는 것이었다. 선별 제1 회전은 신장으로부터의 원섬유 상에서 수행하고, 선별 제2 회전은 비장으로부터의 원섬유 상에서 수행하며, 선별 제3 회전과 제4 회전은 ur-bCTD 상에서 수행하였다. 제2 회전과 제3 회전에서는 증강이 전혀 발견되지 않았지만, 제4 회전에서는 1379배의 증강이 발견되었다. 제2 전략에서는, bCTD 상에서 선별 3 회전을 수행하였다.

이어서, 예비-스크리닝을 수행하여, 고 처리능력 스크린을 위해 선별 몇 회전이 선택되고 어느 항원을 사용해야만 하는지를 결정하였다. bCTD 상에서의 스크리닝과 ur-bCTD 상에서의 스크리닝 간에는 상당한 차이가 없었다. 따라서, 스트렙타비딘 피복된 bCTD의 경우에는 ur-bCTD 선별 상에서의 고 처리능력 스크린을 수행하기로 결정하였다. 음성 대조군 bBSA로서, 스트렙타비딘 피복된 판을 사용하였다.

실시예 5: 서열 및 결합 분석

피복된 bCTD 상에서 2000개 초과 클론의 스크리닝을 수행하였다. ELISA를 자동화 시스템에서 수행하였다. 동일한 방법을 사용하여 NTD 결합제에 대해 스크리닝하였다. bCTD와는 결합하지만 bNTD와는 결합하지 않는 클론을 추가로 분석하였다.

고 처리능력 bCTD 파아지 ELISA에서 양성인 클론에 대한 중쇄 및 경쇄 유전자에 대하여 서열 분석을 수행하였다. 디악스 소유의 '웹파아지 (Webphage)' 소프트웨어를 사용하여 클론 서열을 분석하였다.

원섬유 및 ur-bCTD 상에서의 선별 제3 회전 후에 752개 클론을 스크리닝하고 (23개 양성), 제4 회전 후에 216개 클론을 스크리닝하였다 (216개 양성). bCTD 상에서의 선별 제2 회전 후에 940개 클론을 스크리닝하였다. bCTD을 사용한 ELISA에서 양성인 클론 수는 463개였다. 수득된 정확한 서열 수는 163개였다.

서열 데이터를 분석하기 위해, 상이한 수준의 서열들을 비교하였는데, 이에는 다음이 포함된다:

(1) 전반적인 다양성 = 1개의 아미노산 차이가 발견된 경우에 (VH + VL 다양성)특정 클론이 상이한 것으로서 확인될 상이한 서열 수 = 163

(2) 중쇄 다양성 = 경쇄 서열을 무시한, 상이한 중쇄를 수반한 클론의 수 = 152

(3) HCDR3 다양성 = 상이한 중쇄 CDR3을 수반한 클론의 수 = 54 (앰버 HCDR3을 수반한 2개 클론이 부가됨).

이러한 3가지 수준 분석은 다음 2가지 이유로 인해 수행하였다:

첫째, 중쇄와, 해당 도메인 내의 그의 HCDR3 영역은 항체의 에피토프 인식을 위해 상당히 중요하다는 사실이 일반적으로 용인되고 있다. 동일한 H-CDR3 서열을 수반한 모든 항체를 집단화하였다.

두 번째, 중쇄 및 종종 동일하고, 종종 상이한 경쇄의 기타 CDRs 내에서의 돌연변이를 수반한 동일한 HCDR3을 갖는 항체 변이체가 예상되도록 다양한 라이브러리를 고안하였다.

실시예 6: bCTD 및 VLDL 에 대한 항체 결합

VLDL에 대한 결합을 모니터링하기 위해, VLDL을 미세역가 판 상에 피복시키고, 시험 항체와 함께 항온 배양하였다. 이차 항체-HRP 탐지 방법을 사용하여 결합된 항체를 탐지하였다. 테트라메틸벤지딘 (TMB) 및 H₂0₂를 사용하여 염색을 수행하였다. 결합되지 않은 항체 만을 세척 제거하였다. VLDL에 대한 결합은 ELISA에서 높은 신호를 제공할 것이다.

양성 대조군으로서, 본 발명자들은 ApoE에 대항한 모노클로날 항체를 사용하였다. CTD 및 VLDL과 결합하는 2개의 항체 (3D12, E19)는 bCTD ELISA (도 1A) 및 VLDL ELISA (도 1B)에서 양성이었다. NTD와 결합하는 또 다른 항체 (6C5)는 bCTD와 결합하지 않지만, VLDL와는 잘 결합하였다. 이러한 NTD 부위는 VLDL에 의해 피복되지 않았으며, 이는 ApoE 그 자체의 피복 양의 측정치를 제공해줄 수 있다. 이 항체 신호가 높기 때문에, 본 발명자들은 VLDL ELISA를 있는 그대로 수행하기에 충분한 ApoE를 피복시켰다고 결론지을 수 있다.

파아지 항체에 대해서는 (도 2), 본 발명자들이 이를 3가지 군으로 분류하였다: 항상 양성인 (음성 파아지 결합 보다 3배 이상) 항체, 간혹 양성이고 간혹 음성인 (간혹 음성 파아지 결합의 2배) 항체, 및 음성 항체. 의심스러운 항체에 대해서는, ELISA가 충분히 민감하지 않은 것으로 예상되거나, 항체가 결합되지 않거나, 또는 친화도가 고 신호를 관찰할 수 있기에 충분히 높지 않거나 VLDL (부분적으로는 VLDL 상의, 부분적으로는 피복된 CTD 상의 에피토프)과 교차-반응할 수 있기에 충분히 높지 않은 것으로 예상된다.

실시예 7: VLDL 검정 개발 및 자동화

203개 bCTD 양성 파아지 클론 모두에 대해 VLDL ELISA를 수행하였다. 항상 양성인 (배경의 3배 초과) 6개 클론을 발견하였다. 기타 클론은 배경 보다 2배 이상 더 높은 신호를 생성시켰다 (도 3). 이들 클론을 본 단계의 추가 시험으로부터 배제시키지 않았다. 6개 클론 만이 VLDL에 대해 높은 신호를 나타내는 양성이었다. 시험을 3회 수행하고, 동일한 결과를 수득하였다. 이와 병행해서, bNTD에 대한 항체 결합을 시험하였다. bNTD와 결합된 항체는 전혀 없었다. VLDL과 결합된 클론을 추가로 시험하지는 않았다.

실시예 8: Fab 에 대한 파아지의 재클로닝 , 특이성 시험

피복된 VLDL ELISA에서의 VLDL 결합제 양이 적기 때문에, 그리고 VLDL 경쟁 ELISA의 가변적 결과 때문에, 본 발명자들은 파이지 상의 Fab로부터의 상이한 모든 157개 클론을 가용성 Fab 내로 동시에 배치식 (일괄) 재클로닝하였다. 많은 Fabs가 bCTD와 결합하지 않을 것으로 예상되었는데, 이는 다가 파아지에 대한 그들의 1가 성질 때문이며, 이로 인해 bCTD 상의 Fab ELISA 신호를 통하여 저 친화성 결합제가 제거될 수 있다.

재클로닝 후, 85개 항체가 bCTD와 특이적으로 결합하였다. 새로운 VLDL이나 NTD 결합제는 전혀 발견되지 않았다. 이들 항체의 VH 및 VL 쇄의 CDR 영역의 아미노산 서열이 표 9 및 10에 제시되었다.

실시예 9: 에피토프 지도화

동일한 에피토프에 대한 결합은 Fab와 파아지 항체 간의 경쟁을 모니터링함으로써 시험하였다. 제한된 양의 파아지와 최대량의 Fab를, bCTD로 잘 피복시킨 ELISA에 가하였다. 결합 단계 후, 파아지를 항-M13 HRP 항체와 함께 항온 배양한 후 퍼옥시다제 반응에 의해 탐지하였다. 고농도의 Fab가 부가되었기 때문에, Fab와 동일한 에피토프에 대해 지시된 파아지는 경쟁하여 떨어져나갈 것이고, Fab 신호는 감소될 것이다.

동일한 VH-CDR3 군으로부터의 항체는 중복 에피토프를 인식한다. 이러한 기준을 사용하여 면역조직화학 (IHC)용 클론을 배제시켰다: 가장 높고/가장 느린 이탈 속도를 나타내는 클론 만을 시험하였다. 대규모 VH-CDR3 군에 속하지 않는 클론 모두를 IHC에서 시험하였다.

항체 807A-M0026-F05와 807A-M0027-E11은 서로 교차 반응하지 않았다. 그러나, 이들 항체 둘 다는 항체 807A-M0028-A07과 교차 반응하였는데, 이는 양 항체가 유사하긴 하지만, 동일하지 않은 에피토프를 인식하고 있다는 것을 지시해준다.

항체 807A-M0028-B02는 항체 807A-M0026-F05 및 항체 807A-M0027-E11와는 다른 에피토프를 인식하는 것으로 예상된다.

실시예 10: 이탈 속도 측정

비아코어 (Biacore) 측정을 최적화하기 위해, 본 발명자들은 스트렙타비딘으로 피복시킨 비아코어 칩을 사용하여 bCTD를 결합시켰다. 먼저, 본 발명자들은 이러한 칩에 대한 결합을 알아보기 위해 항체 3D12 및 E19를 분석하였다. 본 발명자들은 또한, 예비-스크리닝으로부터 회수한 Fab (VLDL와 결합하지 않음; Fab ELISA에서 양성임)를 재클로닝하였다. Mab 3D12는 비아코어에서 결합되지 않았는데, 이는 저 친화성 때문인 것으로 추정된다. Ab E19 및 정제되지 않은 Fab 1F7 (투석된 원형질막 주위분획)은 bCTD 칩과 결합하지 않았다. 대조군으로서, 본 발명자들은 bBSA로 피복시킨 채널을 사용하였는데, 이 표면에 어떠한 항체가 결합되지 않았다.

원형질막 주위 추출물을 사용하여 상기 bCTD 칩으로, 선별된 Fabs의 이탈 속도 등급을 결정하였다 (이는 본 발명 및 친화성 성숙 연구 동안 클론의 등급을 매기는데 있어 중요하다). 표 1은 대표적인 이탈 속도 목록을 나타낸다.

정제된 Fab 단편을 사용하여 칩 상에서 저밀도의 bCTD에 대한 친화성 결정을 수행하였다.

실시예 11: 면역조직화학

동일한 VH-CDR3 군의 가장 느린 이탈 속도를 나타내는 항체와, 상이한 VH-CDR3을 갖는 모든 항체 (단일 클론)에 대한 면역조직화학 (IHC)을 동결된 조직 슬라이드 상에서 수행된 IHC로 시험하였다.

IHC 및 친화성 측정을 위해, 정제된 Fabs을 사용하였다. 항체 단편 (Fabs)을 세균에서 발현시켰고 (전형적으로 400-ml 배양물 중에서, 4시간 IPTG 유도시킴), 고정화 금속 친화 크로마토그래피 (IMAC)함으로써 원형질막 주위 추출물로부터 정제하였다. 원형질막 주위 추출물은 상기 세균을 "삼투압 쇽" 처리함으로써 제조하였다. 샘플을 l ml Co-IDA 칼럼 상에 부하하고, 이미다졸의 0-150 mM 선형 구배로 용출시켰다. 단백질 제제를 PBS에 대항하여 투석시키고, 비-환원성 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.

3개의 항체 만이 AD 플라크 상에서 Fab로서 결합되었다: 807A-M0027-E11, 807A-M0028-B02 및 807A-M0026-FO5.

항체 807A-M0027-E11은 IHC에서 알츠하이머병 (AD) 플라크를 탐지한다. 항체가 조직 내의 플라크는 특이적으로 인식하지만, 혈청에 노출된 아포지단백질 E는 인식하지 않는 것이 중요하다. 전형적으로, 본 발명의 항체는 2명 이상의 AD 환자의 플라크와 결합하고, 잠재적으로 전신성 아밀로이드증을 나타내는 환자의 플라크와도 결합한다. 따라서, IHC를 신선한 혈장의 존재 하에 수행하였다. 심지어 50% 혈장의 존재 하에서 파아지로서 및 Fab로서, 807A-M0027-E11로의 IHC 염색에서는, 신호가 켄칭되지 않았다. 용액 중의 VLDL 부가 역시 상기 염색을 변화시키지 않았다. 이는 NTD에 대해 지시된 6C5 대조군 항체 (그의 신호는 신선한 혈장 또는 VLDL 용액에 의해 켄칭되었다)와는 대조적이다. SFab 항체 807A-M0028-B02는 AD 플라크 및 또한 성상세포 상에서 양성으로 염색되었다. SFab 항체 807A-M0026-F05는 AD 플라크 상에서 약하게 염색되었다. 이러한 항체에 대한 염색 패턴은 극히 강력하지 않는데, 이는 상기 항체의 친화도가 낮기 때문이다. 이들 항체는 1명 이상의 환자 조직에서 양성이었다.

기타 sFab 항체 807A-M0039-C10, 807A-M0037-D01, 807A-M0046-A06 및 807A-M0039-C10는 AD 뇌 조직 상의 성상세포 만을 탐지하였다.

실시예 12: IHC 에서 플라크에 대한 sFabs 결합의 친화성 측정

3개의 Fabs 807A-M0027-Ell, 807A-M0028-B02 및 807A-M0026-FO5를 비아코어 분석 하에 광범위하게 연구하였다. 먼저, bCTD를 스트렙타비딘 칩 상에 피복시킨 다음, sFabs를 상이한 농도로 상기 칩 전반에 걸쳐 수행하고, 결합 공명 단위 (RU)를 측정하였다. 음성 대조군으로서, 상기 칩의 1개 채널을 바이오틴-BSA로 포화시켰다. 도 4A는 친화도 47.8 nM을 가져다 주는, bCTD 상에서의 sFab 항체 807A-M0027-E11의 분석 결과를 도시한 것이다. sFab 항체 807A-M0028-B02의 친화도는 179 nM의 친화도를 지닌 유사한 패턴을 나타내었다 (도 4B). 항체 807A-M0026-F05는 훨씬 더 낮은 친화도 (μM 범위)를 나타내었는데, 이는 측정하기가 곤란하였다 (도 4C).

이와는 달리, sFabs를 항-Fc 항체를 통하여 CM5 칩과 커플링시킨 경우에는, 항체 807A-M0027-El1에 대한 결합이 전혀 관찰되지 않았을 뿐만 아니라 (도 4D 참고), 항체 807A-M0028-B02에 대한 결합도 전혀 관찰되지 않았다.

상이한 2가지 비아코어 측정에서 피복물 및 분석물을 역전시키는 상이한 결과들은, 항체 807A-M0027-E11과 807A-M0028-B02 둘 다가 피복된 bCTD와만 결합하고 용액 중의 bCTD와는 결합하지 않는다는 사실을 제안해준다.

실시에 13: IgGs 로의 항체 재편성, IgGs 의 발현 및 정제

IgG1 로의 항체 ( 배치식 ) 재편성

85개 클론은 가용성 Fab로서 CTD와의 특이적 결합을 나타내었다. 이들 중에서, IHC 연구를 위해 선택된 30개 후보를 재편성시켜 인간 IgGl 항체를 완성하였다.

85개 모든 "가용성 Fab 결합제"를 함유한, 157개의 CTD-특이적 Fabs 풀을, 인간 IgGl 발현 벡터 pBhl 내로의 제한 분해에 의거한 동시의 배치식-재편성에 사용하였다.

배치식-재편성 전략은 2가지 클로닝 단계를 포함하고 있는데, 이는 도 5에 예시되어 있다. 첫 번째 단계에서는, 완전한 Fab 단편을 pBhl 내로 삽입하였다. 두 번째 단계에서는 내부/조절 서열을 교환하였다.

초기 Fabs를 "재확인"하기 위해, 약 300개 개개 클론을 DNA-서열 분석함으로써 분석하였다. 85개 "가용성 Fab 결합제" 중의 72개가 다시 발견되었다. 특히, IHC에 대해 우선적으로 선택된 (파아지 및 가용성 Fab로서의) 후보 30개 중에서 29개가 배치식-재편성에 의해 IgGl 구조물로서 수득되었다.

13개 나머지 "가용성 Fab 결합제" 중의 11개를 인간 IgGl 발현 벡터 pRhl 내로 개별적으로 재편성시킬 수 있었다. 그들의 Fab 대응물로 재편성시킨 항체의 실체는 서열 분석함으로써 확인하였다. 완전한 Fab-삽입물의 초기 PCR-증폭 이외에도, 클로닝 접근법은 도 5에 도시된 배치식-재편성 전략과 동일하였다.

IgG1 항체의 발현 및 정제

재편성시킨 IgGl-항체를 일시적으로 형질감염시킨 HEK293T 세포에 발현시켰다. 항체를 (플라스크당) 대략 5 X 10⁶개 형질감염된 세포의 배양 상등액으로부터 정제하고, 약 1주 동안 배양 하에 유지시켰다. 단백질-A-이용 친화 크로마토그래피함으로써 정제를 수행하였다. 정제된 클론을 PBS에 대항하여 투석시키고, 환원성 및 비-환원성 조건 하에 SDS-겔 상에서 분석하였다.

IgG 항체의 바이오티닐화

항체의 바이오티닐화를 PBS에서 수행하였는데, 이때 정제된 항체를 15배 몰 과량의 설포석신이미딜-2-(바이오틴아미도) 에틸-1,3-디티오프로피오네이트와 함께 2시간 동안 항온 배양하였다. HABA [2-(4'-히드록시아조벤젠) 벤조산] 방법 (공급처: Pierce)을 사용하여, 바이오틴-혼입 수준 (즉, 항체 분자당 바이오틴기의 평균 수)를 결정하였다. 이러한 접근법을 이용하여, 본 발명자들은 모든 바이오티닐화 항체가 분자당 3 내지 4개의 바이오틴기를 함유하고 있다는 사실을 밝혀내었다.

실시예 14: IgG1 항체와의 특이성 시험

기타 종에 대한 IgGl 항체의 결합

기타 종의 bCTD 상에서 인간 항체의 교차 반응성을 시험하여, 마우스 및 영장류 모델에서 연구할 수 있는 항체를 확인하고자 하였다.

sFab로서 AD 조직 내의 플라크와 결합된 항체 (S07A-M0028-B02, 807A-M0027-E11, 807A-M0026-F05)를 hIgGl로 재편성시키고, 이를 대상으로 하여 바이오티닐화시킨 재조합 마우스 CTD (mbCTD), 재조합 영장류 CTD (pbCTD) 및 재조합 인간 CTD (hbCTD) 상에서의 그들의 결합 능력을 알아보기 위해 시험하였다.

항체 807A-M0028-B02 및 807A-M0027-E11 (도 6A 및 6C)은 상기 3가지 상이한 종의 CTD와 결합하였다. 양 항체는 동일한 정도로 결합되었는데, 이는 이들 항체에 의해 인식된 에피토프가 이들 종에서 동일하다는 사실을 제안해준다.

항체 807A-M0026-FO5 (도 6B)는 pCTD 및 hCTD과는 결합하지만, 마우스 CTD와는 결합하지 않았는데, 이는 상기 항체가 마우스에 존재하지 않는 에피토프에 대항하여 지시되거나 사용된 농도가 충분히 높지 않다는 것을 제안해준다. 이러한 ELISA에서의 낮은 O.D.는 상기 항체의 저 친화성에 의해 설명될 수 있다.

bNTD 에 대한 IgG1 항체의 결합

807A-M0027-Ell과 807A-M0026-F05는 bNTD와 결합하지 않았다. 항체 807A-M0028-B02는 극히 고농도에서 결합하였다 (10 및 5 ㎍/ml). 이것이 특이적 결합과 관계가 있었는지를 검사하기 위해, 본 발명자들은 1000배 이상의 용액 중의 bNTD (용액 중 540 ㎍/ml, 피복된 0.5 ㎍/ml)와 경쟁시키고자 하였다 (도 7). 비-특이적 신호가 경쟁에서 감소되지 않았다. 이 신호는 대부분이 다량의 항체 부가로 인해 야기된 것으로 추정되는데, 이는 항-MUCl 항체 PH1에 대해 관찰된 바와 같다 (도 7).

VLDL 에 대한 IgG1 항체의 결합

피복된 VLDL에 대한 항체 결합을 ELISA에서 시험하였다. 플라크 결합제의 Fabs 및 파아지와는 달리, 항체 807A-M0028-B02 (도 8) 및 807A-M0027-E11은 VLDL와 동일한 정도로 결합하였다. 비-CTD 결합제 (MUC1 결합제인 PH1)의 결합과 비교해 보면, 상기 결합은 특이적인 것으로 여겨진다.

VLDL은 ApoE와 지질로 구성되기 때문에, 피복된 VLDL은 ELISA에서의 처리 동안 그의 입체 형태가 변화될 수 있었으며, CTD가 상기 지질에 의해 더 이상 피복되지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 용액 중의 항체, 판과 결합된 bCTD 및 과량의 CTD 또는 용액 중의 VLDL와의 경쟁 시험을 수행하였다 (도 9). 이러한 검정에서, 본 발명자들은 인간 항체의 경우에는 VLDL에 의한 억제를 전혀 관찰할 수 없었고 (도 9A 및 B), 항체 807A-M0028-B02의 경우에는 CTD에 의한 억제를 거의 관찰할 수 없었다 (도 9B). 이와는 대조적으로, CTD에 대해 지시된 시판용 항체 3D12 및 El9는 VLDL에 의해서 뿐만 아니라 CTD에 의해서도 명백하게 억제되었다. NTD에 대해 지시된 6C5 모노클로날 항체는 상기 검정에서 결합되지 않았다.

이들 결과는 인간 항체 (807A-M0028-B02, 807A-M0027-El1)가 용액 중의 VLDL와 결합하지 않으며, 피복된 bCTD 보다는 덜한 정도로 용액 중의 CTD를 인식하고 있다는 사실을 제안하고 있다.

결론

AD 중의 플라크와 결합하는 3개 항체 중의 2개 (807A-M0028-B02, 807A-M0027-E11)는 pCTD 및 mCTD와 교차 반응성이었다. 세 번째 항체 (807A-M0026-F05)는 mCTD와 교차 반응하지 않았고 pCTD와 결합하였다. 관심있는 항체는 NTD와 결합하지 않았다. 고 농도의 항체를 사용한 경우에는, 2개의 항체 (807A-M0028-B02, 807A-M0027-El1)가 피복된 VLDL와 결합하였다. 항체 807A-M0026-F05는 이들 특성을 나타내지 않았지만, 이는 항체 친화성과 관계가 있을 수 있다.

실시예 15: 비아코어 분석

Fab 결합과 IgG1 결합을 비교하고 용액 중의 CTD 상에서의 인간 항체의 결합 특성을 연구하기 위해, 비아코어를 광범위하게 사용하였다.

비아코어에서 Fabs 와 IgGs 의 비교

도 10, 11, 12 및 13은 CTD-특이적 클론 807A-M0026-F05, 807A-M0027-E11 및 807A-M0028-B02의 비아코어 분석 결과를 요약한 것이다. 예상된 바와 같이 3개의 플라크 결합제 모두는, 그들의 본래의 Fab 포맷과 비교해서 IgG1로서 칩 상의 bCTD와 보다 우수하게 결합하였다. IgGl 항체 807A-M0027-E11는 항체 807A-M0028-B02 보다 3배 이상 더 우수하게 결합하는 반면, 항체 807A-M0026-F05는 극히 낮은 마이크로몰 결합 활성도로 상기 칩과 결합하였다.

측정된 결합 활성도 (표 2)는 항체 주사를 중지시킨 직후에 측정된 결합 활성도와 비교해서, 항체 주사를 중지시킨지 50초 후에 측정한 경우에 더 높았다. 이러한 차이는 자유 bCTD가 칩 상에 이용 가능하게 되면 항체가 칩에 재결합되기 때문인 것으로 추정된다.

포획된 CTD 에 대한 항체의 결합

인간 IgGl 항체가 피복된 bCTD/VLDL과는 결합하지만, 용액 중의 CTD/VLDL과는 결합하지 않는 VLDL ELISA의 모순 때문에, 부가의 비아코어 실험을 수행하였다 (또한, Fabs에 대한 비아코어 참고). 이들 실험에서는 bCTD 또는 ApoE를 포획하였다. 먼저, 항-hFc 항체를 칩에 커플링시킨 다음, 특이적 항체들을 결합시키고, bCTD 또는 ApoE를 주사하였다.

도 12는 칩과 간접적으로 커플링시킨 Fab 항체 807A-M0027-Ell이 bCTD (280 nM)와 결합하지 않는다는 것을 보여준다. Fab 항체 807A-M0028-B02를 사용하고, 양 항체의 IgGl을 사용한 경우에도 동일한 곡선 (데이터는 나타내지 않음)이 수득되었다. 인간 혈청으로부터 유래한 ApoE를 사용하여 본 시험을 수행하였다. 극소량의 ApoE (17 RU, < 1%) 만이 상기 항체와 결합하였다 (도 13).

결론

비아코어에서는, IgGl 항체 807A-M0027-E11 및 807A-M0028-B02가 피복된 bCTD와 nM 결합 활성도로 결합한 반면, IgGl 항체 807A-M0026-F05는 μM 결합 활성도로 결합하였다. 용액 중의 항원에 대한 친화성 측정 결과, 항체 807A-M0027-E11과 807A-M0028-B02 둘 다는 bCTD 뿐만 아니라 ApoE도 효율적으로 포획하지 못한 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 VLDL/CTD 경쟁 ELISA에 의해 관찰된 결과를 확인시켜 주었는데: 항체 807A-M0027-E11과 807A-M0028-B02는 용액 중의 CTD 보다 더 우수한 수준으로, 피복된 bCTD와 결합하였다.

실시예 16: 천연 CTD , 펩티드에 대한 항체 결합을 연구하기 위한 부가의 시 험

정제된 hApoE 의 SDS - PAGE 분석

SDS-PAGE를 환원시킨 다음 쿠마시 (Coomassie) 염색함으로써, 정제된 hApoE를 분석하였다. 예상된 바와 같이, 단백질은 대략 35 kDa의 1개 주요 밴드로서 이동하였지만, 약 70 kDa의 넓은 밴드가 존재하며 70 kDa 내지 약 200 kDa의 희미한 도말 표본이 존재하였다. 35 kDa 밴드와 고분자량 종 모두는 웨스턴 블롯에 의해 분석한 결과, hApoE을 함유하고 있는 것으로 나타났다.

정제된 hApoE 의 면역침전

정제된 hApoE를 807A-M0028-B02, 807A-M0027-E11 및 807A-M0026-FO5로 면역침전시켰다. 양성 대조군으로서, 본 발명자들은 염소 항-hApoE 항체인 E19를 사용하였다. 음성 대조군으로서, 본 발명자들은 PH1 항체를 사용하였다. 처리되지 않은 채로 정제된 hApoE가 또한 기준물로서 포함되었다. 샘플을 SDS-겔에 의해 분석하고, 단백질을 니트로셀룰로스 막에 옮긴 다음, hApoE을 웨스턴 블롯에 의해 탐지하였다.

예상된 바와 같이, E19, 807A-M0028-B02 및 807A-M0027-E11 항체는 hApoE를 특이적으로 면역침전시킬 수 있었는데, 극히 효율적이진 않았다. 흥미롭게도, E19 항체는 35 kDa 밴드에 대해 특이적인 것으로 여겨지는 반면, 807A-M0028-B02 및 807A-M0027-E11 항체는 고분자량 종에 대해 더 특이적이었다. 이와는 달리, 807A-M0026-F05는 hApoE를 면역침전시킬 수 없었는데, 이는 상기 항체의 저 친화성 때문인 것으로 추정된다.

세포 용해물의 면역침전

807A-M0028-B02, 807A-M0027-E11 및 807A-M0026-F05 뿐만 아니라 E19 (양성 대조군) 및 M43G5, M43F8, PH1, A2, 헤르셉틴 및 인간 IgGl 카파 골수종 항체 (음성 대조군)을 사용하여, PBMC의 세포 용해물을 면역침전시켰다. 샘플을 환원성 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 분석한 다음, 은 염색 또는 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.

E19 만이 예상된 크기의 밴드 (즉, 약 35 kDa)를 면역침전시켰다. E19로 면역침전시킨 물질은 또한, 웨스턴 블롯에서 극히 희미한 신호를 제공하였다. 이는 몇몇 hApoE가 세포 용해질 중의 E19에 의해 포획되었다는 사실을 제안해주긴 하지만, 이러한 발견 사항은 조심스럽게 간주되어야만 하는데, 이는 (1) 807A-M0028-B02 및 807A-M0027-E11가 세포 용해물로부터 어떠한 hApoE도 면역침전시키지 않았고, (2) hApoE를 면역침전시킬 수 없는 것으로 밝혀진 807A-M0026-F05가 또한, 웨스턴 블롯에서 약한 신호를 제공해주며, (3) 2가지 무관한 항체인 A2와 807A-M0043-F08이 웨스턴 블롯에서 강력한 신호를 제공해주기 때문이다.

중요하게는, 본 실시예에서 연구 조사된 3개의 항체 (807A-M0028-B02, 807A-M0027-E11 및 807A-M0026-F05)는 세포 용해물의 어떠한 주요 성분도 면역침전시키는 것으로 여겨지지 않았다. 807A-M0027-E11에 대한 배경은 약간 더 높았지만, 예를 들어 PH1 보다 더 높지는 않았다. 이들 결과는 항체 807A-M0028-B02, 807A-M0026-F05 및 807A-M0027-E11의 전반적인 특이성이 CTD에 대한 결합에 기인되었다는 사실을 지시해준다.

VLDL 의 면역침전

VLDL에 대한 항체 결합을 면역침전에 의해 또한 시험하였다. 10% VLDL을 이들 시험에 사용하였다. 탐지용 항체로서 6C5를 사용하였다. ECL 방법을 이용하여 웨스턴 블롯을 5분간 전개시킨 후, 관심있는 인간 항체에 대해서는 ApoE가 전혀 탐지되지 않았다. 밤새 전개시킨 후, 항체 807A-M0027-El1 및 807A-M0028-B02는 VLDL 대조군 (비-면역침전된 VLDL, 면역침전을 위해 사용된 양의 10%)과 비교해서 희미한 밴드로서 탐지되었다. 6C5 항체를 이용한 면역침전 결과, 인간 항체를 이용한 경우 보다 더 광범위한 밴드가 나타났다.

결론

807A-M0028-B02와 807A-M0027-E11은 혈장으로부터 정제된 고분자량 형태의 hApoE를 우선적으로 면역침전시켰지만, 807A-M0026-F05는 그렇치 못하였다. 이들 종의 특성은 여전히 명확하지 않지만, 이들이 hApoE를 함유하고 극히 안정한 복합체를 형성해야만 한다는 것은 명백하다. 이들 항체는 주요 세포성 성분들과 상당한 수준으로 상호 작용하지 않는다. 이들 항체를 이용하여 VLDL을 면역침전시키는 것이 가능하긴 하지만, 그 양은 극히 적을 수 있다.

실시예 17: 생체내 연구

햄스터 프리온 프로모터 [참고: Hsia et al Science 1996, 274: 99-102]에 의해 구동된, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP):스웨덴식 돌연변이 K670N, M671L, APP 계통 2576 대한 인간 유전자를, 단독으로 또는 혈소판 유래 성장 인자 [참고: Duff et al, Nature 1996, 383 (6602): 710-3, Holcomb et al, Nature Med 1998, 4: 97-100]에 의해 구동된 돌연변이된 인간 프레세닐린 1 (PS1):M146L과 병용해서, 뇌에서 발현하도록 마우스를 번식시켰다.

인간 ApoE의 발현을 요구하는 연구를 수행하기 위해, humAPP:Swe 및 humPSl:M146L 또는 humAPP:Swe 만을 병용해서 녹아웃시킨 마우스 ApoE 유전자 [참고: Sun et al, J Neurosci, 1998, 18: 3261-3272]를 수반하거나 수반하지 않는 아교 섬유성 산성 단백질 (GFAP) 프로모터에 의해 구동된 인간 ApoE4를 발현한 마우스를 번식시켰다.

아포지단백질 E (ApoE)의 C-말단 도메인 (CTD)에 대한 인간 면역글로불린 Gl (hIgGl) 이소형의 모노클로날 항체 (mAb)를 비-트랜스제닉 또는 트랜스제닉 마우스에서 예를 들어, 10 mg/kg의 농도로 복강내 주사하였다. 몇몇 마우스에게는 1회 주사하고, 주사한지 2일 후에 희생시켰으며, 몇몇 마우스에게는 2회 주사하고, 2일 후에 반복 용량을 주사한 다음, 2일이 더 지난 후, 즉 초기 주사한지 4일 후에 희생시켰다. 주사된 항체의 농도는 CTD 결합성 hIgG에 대하여 ELISA함으로써 모니터링하였다. 스트렙타비딘 특이적 모노클로날 항체를 주사한 마우스로부터의 뇌가 음성 대조군으로 제공되었다. 이와 같이 샘플링된 뇌를 즉시 -70℃로 동결시킨 다음, 이를 대상으로 하여 동결 절편화하였다.

뇌 절편에 인간 IgG가 존재하는지를 알아보기 위해 염색한 결과, 균질하게 염색된 플라크가 피질과 해마 전반에 걸쳐 균일하게 확산된 것으로 나타났다. 기타 뇌 구조물은 생체내 노출 후 염색을 전혀 나타내지 않았다. 이와는 달리, 몇 가지 구조물은 아밀로이드 플라크를 따라 생체외 노출 후에 염색되었다. 항-ApoE CTD 항체에 의해 또는 mAb 내지 Ab를 사용하여 생체외 염색하기 위해 접근 가능하였던 플라크의 70%가, 항-ApoE CTD 항체를 수반한 2-일 (n=3) 또는 4-일 (n=3) 생체내 노출 후에 염색되었다. 소정의 용량에서의 2일 또는 4일 동안의 생체내 노출은 이용 가능한 결합 부위를 포화시키지 못하였는데, 이는 더 많은 항-CTD 항체를 생체외 부가한 후 수득된 부가의 염색 세기에 의해 지시된 바와 같다.

일반적으로 거대분자로서의 항체는 혈액 뇌 장벽 (BBB) 상으로 자유롭게 통과하지 못한다. IgG의 계대접종은 극히 제한되는 것으로 간주되며, 0.5% 혈장 농도 하에서의 CSF 중의 농도가 보고된 바 있다 [참고: Elovaara et al, 1987 Eur Neurol 26: 229-34, Ganrot & Laurell 1974, Clinical Chemistry 20: 571-3]. 뇌 절편 내에 복강내 주사한 인간 IgG가 존재하는지를 알아보기 위한 염색 결과, ApoE CTD 특이적 항체가 이들 트랜스제닉 마우스 내의 상이한 뇌 영역 전반에 걸쳐 균일하게 뇌 플라크에 도달하였다는 사실이 밝혀졌는데, 이는 면역조직화학 (IHC) 기술에 의한 염색에 충분한 수준의 BBB 계대접종이 이루어졌다는 것을 지시해준다. 알츠하이머병 (AD) 플라크는 크기와 밀도가 다양한 복합 구조물이다. 이들 트랜스제닉 마우스에서 발견된 뇌 아밀로이드 플라크는 AD에서 발견된 작고 산재성인 중간 크기 플라크를 나타내는 것으로 간주된다. 이들 플라크는 균질하게 염색되었는데, 이는 mAb가 플라크의 바깥 층에 도달했을 뿐만 아니라 전체 플라크 구조물을 관통하였다는 사실을 지시해준다. 생체외 염색을 위해 접근 가능한 플라크의 70%가 생체내 노출 후에 염색되었다. 복강내 투여된 10 mg/kg 용량이 이용 가능한 플라크-결합 부위를 포화시키지 못하였다는 것을 고려하면, 항체의 비-포화 수준으로 인해, FcR 보유 포식세포에 의한 항체 매개성 플라크 붕괴가 여전히 일어날 수 있다.

실시예 18: 마우스 IgG2a 로의 항체 재편성

생체내 시험을 위해, 항체 807A-M0028-B02, 807A-M0027-Ell, 807A-M0026-F05 및 대조군 항체 (항-스트렙타비딘 클론 A2)의 가변 영역을, 중쇄의 마우스 IgG2a 불변 영역 및 마우스 카파, 및 항체의 가변 영역을 함유하고 있는 벡터 내로 재클로닝하였다.

이들 클론은 인간 IgGl 발현 벡터 (pBhl)로부터, 불변 중쇄 영역 이외에도 마우스 불변 카파 경쇄 유전자를 함유하기도 하는 마우스 IgG2a 항체를 발현하기 위한 구조물 (pRmk2a) 내로 전이시켰다. VL 및 VH 영역을 PCR을 통하여 인간 IgG1 발현 플라스미드로부터 옮긴 다음, 연속해서 pRmk2a 내로 클로닝하였다. VL을 항체 리더의 3' 및 불변 카파 유전자의 5'에 ApaLl/BsiWl 단편으로서 삽입하였다. VH 영역의 경우에는, 5' 인접한 IRES 모티프를 또한 PCR 증폭 생성물에 포함시켰는데; AscI/NheI 단편을 pRmk2a에 삽입하였다. 구조물의 원형 보존은 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다. 이러한 클로닝 전략이 도 14에 도시되어 있다.

실시예 19: 펩티드의 제조

완전한 ApoE CTD를 덮고 있는 10개 펩티드 (16개 아미노산 길이)를 합성하였다.

이들 펩티드는 도 15에 도시된 바와 같이 서로들 간에 중복된 8개 아미노산을 함유하였다. 펩티드는 스트렙타비딘에 결합할 수 있게 해주는 S-S 바이오틴기를 함유하였다 (자기 비드 선별). 또한, 각 펩티드는 캐리어 단백질 (BSA)과 커플링할 수 있는 시스테인을 함유하였다.

펩티드를 디메틸포름아미드 (DMF)에 가용화시킨 다음, 연속해서 물에 희석시켰다. 펩티드 4를 제외한 모든 펩티드는 10% 미만 농도에서 DMF에 가용성이었다. 모든 펩티드에 대한 커플링을 10% DMF에서 수행하였는데, 단 펩티드 4는 30% DMF에서 커플링시켰다. 과량의 말레이미드-활성화 BSA를 사용하여 펩티드에 결합시켰다. 항온 배양 후, 과량의 시스테인을 사용하여 가능한 자유 시스테인을 점유하였다. BSA 커플링된 펩티드 (b-펩티드-BSA)를 선별에 사용하였다.

실시예 20: 중복 펩티드에 대한 항체 결합

실시예 5에서 확인된 항체 807A-M0026-F05, 807A-M0028-B02 및 807A-M0027-E11을 대상으로 하여, 중복 펩티드에 대한 그들의 결합에 대해 시험하였다. 이는 먼저, 펩티드가 추가 선별: b-펩티드-BSA 또는 b-펩티드에 우선적으로 사용될 수 있었는지를 시험하고, 두 번째로는 실시예 5에서 선별된 항체가 중복 펩티드와 결합하였는지, 만약 그렇다면 그들이 인식한 에피토프가 상이하였는지를 알아보기 위해 수행하였는데, 이는 실시예 9에서 수행된 바아 같은 경쟁 결과에 의한 에피토프 지도화에 의해 뒷받침되었다. 인간 항체와 마우스 항체 둘 다를 이러한 방식으로 비교하였다.

인간 항체의 경우에는, IgGl 뿐만 아니라 파아지 디스플레이된 Fab를 사용하여 펩티드 지도화를 수행하였다. 예를 들어, 클론 807A-M0026-F05는 b-펩티드-BSA 4 및 8을 파아지 Fab 단편으로서 뿐만 아니라 완전한 IgGl로서 인식하였다. ELISA는 상기 항체에 대하여 b-펩티드 4 및 8에 대한 결합을 나타내기에 충분히 민감하지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 대다수의 펩티드 결합제를 포획하기 위해 b-펩티드-BSA 상에서의 선별을 개시한 다음, 필요한 경우 후기 선별 회전에서 b-펩티드를 사용하는 것이 최상일 수 있다고 결론지었다. 두드러지게는, 항체 807A-M0026-F05가 뮤린 모노클로날 항체와 비교해서 펩티드 보다는 CTD와 더 잘 결합되었다. 항체 807A-M0028-B02는 펩티드 4와 결합하였다. 항체 807A-M0027-E11은 중복 펩티드들 중의 어느 것과도 상당한 수준으로 결합하지 않았다.

실시예 9에서 본 발명자들은 항체 807A-M0026-F05 및 항체 807A-M0027-Ell에 의해 인식된 에피토프가 다수 항체군에 포함되어 있다는 사실을 밝혀내었다. 양 항체는 서로 경쟁하지 않았다. 항체 807A-M0026-F05의 경우 CTD에 대한 친화성이 항체 807A-M0027-E11와 비교해서 극히 낮기 때문에, 그들이 동일한 에피토프를 인식하는 경우에는 항체 807A-M0027-E11이 항체 807A-M0026-FO5 보다 더 강력하게 펩티드 4 및 8과 결합할 수 있을 것으로 예상되었다. 따라서, 양 항체가 관련 에피토프는 인식하지만, 동일한 에피토프를 인식하지는 않는다고 결론지을 수 있다. 항체 807A-M0028-B02는 펩티드 4와 결합하였으며, 이는 경쟁 에피토드 지도화에 있어 2가지 기타 항체의 항체군과는 상이하였으므로, 상이한 에피토프를 인식할 수 있었다.

본 발명자들은 또한, 중복 펩티드 상에서 대조군 마우스 항체를 시험하였다. 항체 3H1, 12D10 및 E19는 펩티드 3, 10 및 5+10과 각각 결합하였다. 인간 항체와는 대조적으로, 모든 대조군 항체는 펩티드 및 bCTD와 대략 동일한 정도로 결합하였다.

실시예 21: 펩티드 상에서의 선별 및 스크리닝

BSA와 접합시킨 10개의 중복 바이오티닐화 펩티드 (b-펩티드-BSA) 상에서 선별 3 회전을 수행하고, 상응하는 바이오티닐화 펩티드 (b-펩티드) 상에서 선별 제1 회전을 수행하였다. 스트렙타비딘-자기 비드를 사용하여 10개의 개개 펩티드 상에서 선별을 수행하였다. 선별 회전들 사이에 이와 같이 다수의 선별을 조작하기 위해, 투입/산출에 대한 어떠한 적정도 수행하지 않았다 (액체 증폭).

사용된 과정이 도 16에 도시되었다. 먼저, 자동화 킹피셔 (Kingfisher) 시스템을 사용하여, b-펩티드-BSA에 대한 결합을 알아보기 위한 선별 3 회전을 수행하였다. 파아지 상에 디스플레이된 Fab를 사용하여 제2 및 제3 회전을 예비스크리닝한 결과, 양성 클론 빈도는 제2 회전에서 낮았고, BSA 상에서의 광범위한 고갈과 감산에도 불구하고 많은 클론이 제3 회전에서 BSA에 결합되었다는 사실이 밝혀졌다. 아마도, 결합제들은 BSA 상의 링커 분자에 대해 지시되었기 때문에, 본 발명자들은 이를 펩티드 커플링에 사용하였다. 따라서, b-펩티드 상에서의 또 다른 제3 회전 선별을 수행하였다. 이러한 선별의 경우에는 배경 결합이 무시할 만한 수준이었다.

서열 분석 노력을 경감시키기 위해, 파아지-Fab 클론을 배치식으로 (일괄) 재편성하여 sFabs를 생성시키고, 상기 클론의 광범위한 스크리닝 (ELISA 및 서열 분석)을 sFab 수준으로 수행하였다. 307개 항체가 ELISA에서 양성인 것으로 밝혀졌는데, 이들 중의 46개가 표 11 및 12에 나타낸 바와 같은 서열 분석에 의해 결정된 바와 같이 독특하였다.

실시예 22: 원섬유 및 펩티드 상에서의 선별 및 스크리닝

아밀로이드 플라크를 수반한 기관으로부터 유래한 원섬유 상에서 선별 2 회전을 수행하고, 10개의 상응하는 b-BSA-펩티드 상에서 선별 2 회전을 수행한 다음, 상응하는 b-펩티드 상에서 선별 1 회전을 수행하였다.

사용된 과정이 도 17에 요약되어 있다. 제3 회전과 제4 회전은 개개의 b-펩티드-BSA 상에서 수행하였다. 예비스크리닝 후, 양성 클론은 거의 발견되지 않았다. 따라서, b-펩티드를 사용하여, 선별 제5 회전을 수행하였다. 예비스크린에서는, 펩티드 4 및 8에 대한 양성 클론이 발견되었다. 이들 2가지 선별에 대해서는, 본 발명자들이 배치식 재편성 후에 sFab를 스크리닝하였다. 총 390개 sFabs를 스크리닝하였고, 109개가 ELISA에서 양성이고 4개 클론이 독특하였다. 이들 독특한 클론의 VH 및 VL 쇄의 아미노산 서열이 표 11 및 12에 제시되었다. 이들 전략에서는, 대부분의 클론이 독특한 VH-CDR3s을 나타내었으며 (표 12), 높은 증강이 발견되었는데; 1개의 클론이 148배 증강되었으며 이는 전략 B1에서 뿐만 아니라 전략 B2에서도 발견되었다. 이는 실시예 5의 선별과 대조적이다.

bCTD와 결합된 클론은 거의 없었는데 (표 13), 이로써 이들은, bCTD 결합제가 펩티드와 약하게 결합되었거나 전혀 결합되지 않았던 실시예 20에서의 결과와 비교해 볼때 독특한 것이 되었다.

실시예 21 및 22의 선별 캠페인에서는 Fabs가 VLDL과 결합되지 않았을 뿐만 아니라 NTD와도 결합되지 않았다.

11개 Fabs가 IHC에서 양성인 것으로 밝혀졌는데, 이들 Fabs 중의 10개가 실시예 11의 선별 캠페인으로부터 유래된 것이며, 나머지 1개는 실시예 21 및 22 둘 다의 선별 캠페인으로부터 유래된 것이다.

실시예 23: ur - bCTD 및 펩티드 상에서의 선별 및 스크리닝

우레아 처리된 바이오티닐화 CTD (ur-bTD) 상에서 선별 2 회전을 수행한 다음, 아밀로이드 플라크를 수반한 기관으로부터 유래한 원섬유 상에서 선별 2 회전을 수행하였다. 사용된 과정이 도 18에 요약되어 있다.

우레아-CTD 항원 상에서 선별 2 회전을 수행한 다음, AD 환자로부터의 원섬유 1 상에서 선별 2 회전을 수행하였다. 이러한 전략에서는 선별 제3 및 제4 회전 후에 예비스크리닝을 수행하였다. 빈도는 각각 82/95 및 83/95이었다. 예비스크리닝 동안, 본 발명자들은 ur-bCTD과 bCTD를 사용하였는데, 양 유형의 항원 간에는 차이가 전혀 없었다. 선별 제3 회전을 수행한 후, 많은 클론이 bCTD와 결합된 채로 유지되었지만 원섬유와는 결합되지 않은 반면, 원섬유 상에서의 선별 2 회전 (선별 제4 회전) 후에는, 이들 결합제가 유지되는 기회가 보다 적어졌다. 따라서, 선별 제4 회전 시에는 대규모 스크리닝을 수행하였다. 950개 sFabs를 ur-bCTD 상에서 스크리닝하였다. 233개 클론이 ELISA에서 가용성 Fab로서 양성이었고, 83개가 독특하였다. 이들 독특한 Fabs의 VH 및 VL 쇄의 아미노산 서열이 표 14 및 15에 제시되었다. VLDL ELISA에서는, 결합된 5개 Fabs가 양성이었거나 미심쩍은 결합을 지녔다.

bNTD와 결합된 Fabs는 없었다.

많은 Fabs가 광범위한 계열의 동일한 VH-CDR3 군에 속하였는데; 1개의 개개 클론이 247배 증강되었다. IHC에서의 시험은 개개 클론 (광범위한 VH-CDR3 군에 속하지 않음), 및 느린 이탈 속도를 위해 선별한 광범위한 VH-CDR3 군에 속하는 클론 상에서 수행하였다.

제1 IHC 스크린에서는, 6개 Fabs가 AD 환자의 플라크와 결합하였다. bCTD 결합제의 특징이 표 17에 요약되었다.

실시예 24: IHC 에 대한 가용성 Fabs 로서의 후보 클론의 생성

추가 분석을 위해 Fabs를 생성시켰다. 100 ㎕ 배양물의 원형질막 주위분획 상에서 ELISAs를 수행하였다. 모든 클론의 50 ml 배양물의 원형질막 주위분획 상에서의 비아코어 이탈 속도 측정 결과가, 비아코어 결과를 수반한 표에 나타나있다.

IHC에서 시험하기 위해 약 90개 가용성 Fab 단백질을 생성시켰다. 적어도 10 ㎍이 초기 분석에 요구되었다. 가용성 Fab 발현 수준 상의 광범위한 변이로 인해, 96-웰 필터 판과 다양한 진공을 이용하여 IMAC 크로마토그래피함으로써, 50 ml 세균성 배양물의 말초 추출물로부터, 또는 400 ml 배양물의 말초 추출물로부터 상기 단백질을 정제시켜야 한다. 수득량 범위는 주로 10 내지 100 ㎍이었다.

IHC 양성 가용성 Fabs 의 대규모 생성

후보 Fabs 중의 15개가 플라크 조직 상의 IHC에서 양성/잠재적 양성인 것으로 밝혀졌다. 이들 클론 중에서 보다 가용성인 Fab 단백질이 부가의 시험을 위해 제조되었다.

가용성 Fab 단백질을 400 ml 세균성 배양물의 원형질막 주위 추출물로부터 제조하였다.

실시예 25: 에피토프 지도화, 예비 IHC 결과와의 비교

고 처리능력 Fab 스크리닝을, 그들을 선별한 펩티드 상에서 수행하였고, 또한 대조군으로서의 비-중복 펩티드 상에서 수행하였다. 에피토프 지도화에서는 모든 펩티드 양성 항체를 대상으로 하여, 기타 모든 펩티드에 대한 그들의 결합 반응성을 알아보기 위해 스크리닝하였다. 이에 대한 상세한 결과가 표 13에 제시되었다.

2개의 Fabs가 모든 펩티드 (아마도 BSA-링커)와 결합하였으며 비-특이적인 것으로 간주되었다.

펩티드 5 및 10에 대해 특이적인 것으로 확인된 Fabs는 없었다 (그러나, 파아지 상에서 Fab를 예비스크리닝한 결과, 몇몇 양성 결합제가 나타나긴 하였다).

49개의 상이한 Fabs가 펩티드와 특이적으로 결합하였다. 특이적 Fabs 중의 39개 만이 그들을 선별한 펩티드와 결합하였다. 펩티드 1 상에서 선별된 1개의 Fab는 펩티드 6을 인식하기도 하였다. 펩티드 4 선별로부터 유래된 3개의 Fabs는 또한, 펩티드 9와 결합하였으며, 펩티드 9 선별로부터 유래된 3개의 Fabs는 펩티드 4를 인식하였다. 추가로, 펩티드 8 상에서 선별된 3개의 Fabs는 또한 펩티드 4와 결합하였다. 9개의 Fabs 만이 bCTD와 결합하였다. 이는 이들 Fabs의 대부분이, 재조합 bCTD에는 존재하지 않는 에피토프와 결합하고, 플라크에서 잠재적으로 발견될 수 있었던 또 다른 (가능하게는 연장된) 구조물을 인식한다는 사실을 제안하고 있다. 펩티드 3과 펩티드 4를 포함하는 영역은 모든 49개 특이적 Fabs 중의 39개와 9개 bCTD 결합제 중의 8개를 함유하는 '선별 우세 에피토프'로서 인식되었다. 흥미롭게도, 이러한 ApoE 부위는 VLDL 입자에 대한 결합에 관여하는 것으로 여겨진다.

IHC 스크린을 참작한 가설

49개 특이적 Fabs 중의 39개가 펩티드와 결합하였지만, bCTD와는 결합하지 않았다. 이는 이들 Fabs가 예를 들어, VLDL 입자에 함유된 천연의 Apo-E를 인식하지 않는 것으로 추정된다고 제안하고 있다. 이러한 Fab가 IHC에서 결합된다면, 이는 상기 에피토프가 독특하고 플라크 상에서만 발견되며, 이들 Fabs가 추가의 연구 조사를 위해 중요한 선도물이 될 수 있을 것이란 사실을 지시할 수 있다.

실제로, 예비 IHC 데이터는 이들 Fabs 중의 4개가 AD 환자 조직과 결합하는 것이 가능하다는 것을 보여준다. 이들 4개의 Fabs 모두는 펩티드 4와 결합하였지만, 중복 펩티드와는 결합하지 않았는데, 이는 이들이 유사한 (중복) 에피토프 (군 1), 아마도 LVEDMQRQ의 아미노산을 함유하는 에피토프, 또는 펩티드 4와 플라크에만 존재하는 이차 구조물을 인식하고 있다는 사실을 제안해준다.

IHC에서 양성이고 펩티드 4 상에서 선별된 기타 2개의 Fabs는 펩티드 4 및 9와 결합하였고, bCTD에 존재하지 않을 뿐만 아니라 bCTD에 우세하지도 않은 입체 형태와 결합하였다. 가능하게는, 이들 2개의 항체에 대한 에피토프는 서열 MQRQWAGL을 포함하고 있다 (군 2).

가능하게는 IHC에서 양성이고 펩티드 9 상에서 선별된 또 다른 Fab는 펩티드 9 만을 인식하였고, 중복 펩티드 뿐만 아니라 bCTD는 인식하지 않았으며, 에피토프 WAGLVEKV를 인식하거나 또는 펩티드 9에만 존재하는 입체 형태 (군 3) 및 플라크를 인식할 수 있었다.

49개 특이적 Fabs 중의 10개가 펩티드 및 bCTD와 결합하였으며, 이는 이들 항체가 보다 입체 형태적 에피토프를 인식한다는 사실을 제안하고 있다.

1개의 Fab가 펩티드 1, 6 및 bCTD와 결합하였다. 이러한 에피토프 (RTRDRLDE)가 VLDL의 결합 부위 내부인 것으로 예측되지는 않는다 (군 4).

펩티드 4 및 9 상에서의 선별로부터 수득된 2개의 항체는 양 펩티드 (에피토프 MQRQWAGL) 및 CTD를 인식하므로, 군 2의 Fabs와는 상이하다 (군 5).

펩티드 8에 대해 선별된 1개의 항체는 펩티드 4, 8 (에피토프 WFEPLVED) 및bCTD와 결합하였다 (군 6).

따라서, 이러한 가설에 따르면, 실시예 21 및 22에서 확인된 Fabs를 6가지 상이한 Fabs 군 (각각은 별개의 에피토프를 인식한다)으로 나눌 수 있다.

실시예 26: 실시예 21 및 22의 전략에서 확인된 Fabs 의 비아코어 이탈 속도 분석

가용성 Fabs의 이탈 속도 분석을 10개 펩티드 모두에서 수행하였다. 실시예 21 및 22의 독특한 모든 Fab로부터 원형질막 주위분획을 만들고 이를 시험하였다. 그 결과는 ELISA에 의한 에피토프 지도화를 확인시켜 주었다.

더 많은 펩티드와 결합하고/하거나 bCTD와 결합하는 Fabs는 대부분이, 이들 분자에 대해 대략 동일한 이탈 속도를 나타내었다. 이와는 달리, RU's (결합된 항체 양에 대한 측정치)는 종종, Fabs를 선별한 펩티드에 대해 가장 높았다.

실시예 21 및 22의 전략이 광범위한 계열의 동일한 VH-CDR3s에 속하는 항체를 확인시켜 주지는 못하였다. 따라서, 이탈 속도 측정치가 IHC에 대한 기준으로서 사용되지 못하였다.

실시예 27: 실시예 23 항체의 에피토프 지도화, 및 예비 IHC 결과와의 비교

자동화 스크리닝에서는, Fabs를 대상으로 하여 ur-bCTD 및 음성 대조군으로서의 스트렙타비딘 BSA에 대한 그들의 결합 반응을 알아보기 위해 스크리닝하였다. NTD와 결합된 항체는 없었다. 이에 대한 상세한 결과가 표 16에 제시되었다.

ur-bCTD 및 CTD와 결합하는 총 81개의 상이한 항체가 발견되었다. 이들 항체 중의 5개가 피복된 VLDL와 결합하였다. bNTD와 결합된 것은 전혀 없었다. 20개 항체가 또한 펩티드와 결합하였다. 실시예 21 및 22의 전략에서와 같이, 본 발명자들은 펩티드 3 및 4 주변에 선별 우세 에피토프를 발견하였다.

81개 중의 5개 항체가 IHC에서 결합되었다. 이들 항체 중의 1개 만이 펩티드와 결합하였다. 이 항체는 펩티드 4와 낮은 RU (비아코어)로 결합하였고 높은 RU로 결합하였다. 흥미롭게도, 상기 항체는 실시예 21 및 22의 전략을 이용해서도 밝혀내었다. 기타 4개의 항체를 실시예 5의 항체 807A-M0028-B02 및 807A-M0027-E11과 비교할 수 있었다.

실시예 28: 인간 IG1 로의 후보 Fabs 의 재편성

상기 언급된 IHC 양성 클론 대부분을 2가지 제한 엔도뉴클레아제 이용 ("컷 앤드 페이스트") 클로닝 단계에서, 디악스 hIgG1 발현 구조물 pBhl로 개별적으로 재편성시킬 수 있다 (도 5 참고).

앰버-중지 함유 클론 807B-M0079-D10 (807B-M0027-D08) 및 807B-M0081-A11 (807B-M0081-F12), 및 클론 807B-M0009-C03을 제외하고는, Fab를 IgG로 재편성시키는 것을 수행하고, 이러한 IgGs가 Hek293T 세포에서 일시적으로 발현되었다.

상기 요약된 과정을 사용하여 클론을 재편성시키기 전에, 807B-M0079-D10의 CDR2 내의 앰버-중지 돌연변이를 "파아지미드 수준"에 기초하여 교정시켰다.

807B-M0081-All의 VL의 5'-말단에서의 앰버-돌연변이는 상이한 재편성 전략/"hIgGl 발현 구조물 pRhl로의 PCR-이용 재편성"을 사용하여 복구시켰다. 앰버-중지 돌연변이가 본 발명자들의 "CJ-카파-리프팅 프라이머" 서열 내에 있다는 사실로 인해, 중지 돌연변이는 Fab 단편의 PCR 증폭 동안에 교정하였다. PCR/Fab 단편을 pRhl에 클로닝시키는 전략은 pBhl에 대한 "컷 앤드 페이스트" 접근법과 동일하다.

실시예 29: 결론

CTD와 결합하는 229개 후보 Fabs는, 디악스 인간 Fab300 라이브러리를 사용하여 각종의 선별 과정으로부터 분리하였다. 이러한 과정들 중의 2가지가 펩티드 상에서의 선별을 포함하였다 (실시예 21 및 22). 실시예 23의 선별 과정에서는 먼저 ur-bCTD 상에서 선별한 다음 원섬유 상에서 선별함으로써, 실시예 5의 성공적인 선별을 역전시켰다. 또한 실시예 5와는 대조적으로, 본 발명자들은 파아지 스크리닝을 수행하지 않고, 대신 파아지 Fab로부터 Fab으로의 배치식 재클로닝을 제일 먼저 수행하였다.

극히 소수 (5개) 만이 Fab 항체로서, 피복된 VLDL과 반응성이었다. bNTD에 대해 양성인 Fab는 전혀 없었다.

실시예 21 및 22의 전략에서는 몇몇 클론이 증강되었고, 본 발명자들은 소수의 개개 클론 만을 갖는 VH-CDR3 군을 관찰하였다.

실시예 21 및 22의 전략으로부터의 Fab 항체는 펩티드 3 및 4 주변의 선별 우세 에피토프를 인식하였다. 실시예 23의 전략에서도 동일한 우세 에피토프가 밝혀졌다.

IHC 스크리닝에서는, 15개 항체가 제1 스크린 내의 IHC에서 플라크 결합에 대해 양성인 것으로 밝혀졌다. 제1 IHC 스크린에서 양성인 Fab 클론의 특징들에 관한 개요가 표 17에 제시되어 있다.

실시예 30: IHC 에서 양성인 15개 Fabs 의 IgG1 특성

Fab-IHC에서 양성인 15개 Fabs를 IgGl로 재편성시켰다. 이들 항체 중에서 9개가 IgGl-IHC에서 양성인 것으로 밝혀졌다.

거의 모든 IgG 항체가 펩티드 에피토프 지도화에서 펩티드와 결합하였다. 이는 IgGl의 결합 활성도가 Fab와 비교해서 보다 높기 때문인 것으로 추정된다. Fab로서 펩티드 4에만 결합된, 펩티드 4 상에서 선별된 항체의 경우에는, 몇몇 항체가 IgG로서 펩티드 9와 결합하기도 하였다. 실시예 23에 기재된 스크린으로부터 본래 유래된 항체의 경우에는, IgG 항체가 펩티드 4 및 8, 펩티드 9 또는 펩티드 7과 결합하였고, 단지 1개의 항체 807B-M0083E11 만이 어떠한 펩티드와도 결합하지 않았다.

인간 CTD, 마우스 CTD 및 영장류 CTD를 서로 비교하였다. 몇 가지 IgG 항체가 이들 3가지 종 각각의 bCTD와 결합하였다.

Fab ELISA에서는 피복된 VLDL에 대한 결합이 전혀 없었지만, IgGl ELISA에서는 전부는 아니지만 여러 개의 항체가 VLDL와 결합하였다.

bCTD를 칩 상에 피복시킨 경우에는, 모든 IgG 항체가 비아코어 분석에서 Fabs와 비교하여 개선된 결합을 나타내었다.

IgGl 결과가 표 18에 요약되었다.

실시예 31: 807A- M0028 -B02가 아밀로이드 침착물 내의 CTD 과 결합하는 것에 대한 VLDL의 효과

지단백질 입자의 존재 하에 아밀로이드 침착물 내의 CTD에 대한 807A-M0028-B02의 결합을 분석하기 위해, VLDL의 존재 또는 부재 하에 면역조직화학을 수행하여, VLDL의 존재가 플라크의 염색 세기 저하를 선도할 수 있는지를 알아 보았다.

807A-M0028-B02 항체를 일련으로 희석시키고 VLDL와 혼합한 후에, APP/PS1와 인간 AD 뇌 절편 둘 다를 항온 배양하였다. 가장 낮은 항체 농도 (0.04 ㎍/ml) 하에서도 신호 켄칭이 관찰되지 않았다. 이와는 달리, CTD에 대한 시판용 항체 (3H1)는 고농도의 항체 (5 ㎍/ml) 하에서 이미 완전히 켄칭되었다 (도 20).

실시예 32: 미세아교세포/대식세포의 포식세포 활성에 대한 807A- M0028 -B02 항체의 효과

포식작용 활성에 대한 807A-M0028-B02의 효과를 평가하기 위해, 아비딘-피복된 플루오스피어 (FluoSphere) 형광성 미소구 (공급처: Molecular Probes) 상에 고정화시킨 CTD의 포식작용 검정을 전개하였다.

1.2 ㎛ 황녹색 라텍스 플루오스피어^® 뉴트리아비딘 (NeutrAvidin™) 표지된 미소구 (공급처: Molecular Probes Europe BV, Leiden, The Netherlands) 상에 고정화시킨 바이오티닐화 CTD를, 1% BSA (시험된 조직 배양물; 공급처: Invitrogen AB, Sweden) 및 2% ITS-X (공급처: Gibco, Invitrogen AB, Sweden) 혈청 보체 (CM)를 보충시킨 OPTI-MEM 배지에 희석된 IgG 전환 클론 807A-M0028-B02의 상이한 농도와 함께 재현탁시키고, 이를 포식작용 억제제인 2.0% NaN₃를 1:100 (세포:비드)의 비율로 부가하거나 부가하지 않은 CM 중의 THP-1 세포 (10⁶개 세포/ml)와 함께 +4℃ 하에 30분 동안 항온 배양하였다. Fc-수용체와 결합되도록 하기 위해, 세포를 +4℃ 하에 20분 동안 동조시키고, 세포-무함유 비드를 저속 원심분리 (200 g, 10 분, +4℃)함으로써 제거하였다. 세포 펠릿을 CM에 재현탁시키고, C0₂-항온 배양기에서 40분 동안 37℃ 하에 항온 배양하였다. 트립신 처리한 후, 세포 현탁물을 멸균성 조건 하에 둔 다음, 7.5% 소 혈청 알부민 (BSA) 쿠션 전반에 걸쳐 층 형성시키고 +4℃ 하에 10분 동안 150 Xg로 원심분리시켜 비-내재화 비드를 제거하였다. 세포 펠릿을 PBS 중의 2% PFA 0.3 ml에 재현탁시켰다. 그 결과를 대조군의 비율로서 표현하였는데, 즉 유동 세포계수법에 의해 측정된 바와 같이 항체의 존재 대 부재 하에 2개 이상의 비드를 함유하는 포식 세포의 양으로서 표현하였다. 488 nm에서 여기를 제공하는 공기 냉각 아르곤 레이저가 장착된 FACScan™ (공급처: Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하였다. 각 샘플에 대해 총 10,000개 사건을 획득하였으며, 이를 리스트 모드 데이터 포맷에 저장하였다. 포식작용을 알아보기 위해 형광 방사를 520 nm (FL1)에서 수집하였다. 콘소르트 (Consort) 30 시스템과 LYSIS-II 프로그램을 사용하여 데이터 수집과 분석을 수행하였다. 진입 과정에서 2개의 파라미터 복잡성과 세포 크기로서 표시되고, 포식작용을 분석하기 위한 형광 (FL1) 주파수 분포 히스토그램으로서 표시되면, 데이터를 분석하였다. 포식세포 활성의 50% 증가를 유도시키는 농도인 EC50을, 일정 범위의 농도 (0.01 내지 5 ㎍/ml)에 대한 포식세포 활성 비율을 이용하여 구축한 용량-반응 곡선을 사용하여 시험한 각 항체에 대해 결정하였다. 그 다음, 이들 곡선으로부터 EC50을 외삽하여 추정하고, 이를 사용하여 항체의 포식세포성 자극의 상대적 효율을 비교하였다. IgG 전환 클론 807A-M0028-B02는 THP-1 세포를 자극하는데 있어 높은 효율 (EC50 = 34±15 ng/ml)을 나타내었다. 따라서, 상기 결과는 807A-M0028-B02가 농도-의존적 방식으로 인간 대식세포/미세아교세포-유사 세포에 의한 CTD-보유 비드의 시험관내 포식세포성 흡수를 특이적으로 지시하였다는 것을 지시해 준다.

실시예 33: 실시예 4, 실시예 21 및 실시예 22에 기재된 선별에서 밝혀진 클 론의 생식세포계 교정

표 18에 기재된 항체들 중에서, 5개 (807A-M0028-B02, 807B-M0004-H03, 807B-M0009-F06, 807B-M0004-A03 및 807B-M0079-D10)를 추가로 연구 조사하였다. 이들 항체의 경쇄의 가변부 내의 체세포 돌연변이가 모든 클론에서 발견되었다. 이들 클론 중의 몇몇은 경쇄의 불변부에서의 돌연변이를 또한 함유하였다 (표 21). 게놈성 및 공지된 생식세포계 서열과의 서열 정렬을 수행하고, 정확한 아미노산을 확인하였다 (표 19 및 20에 진하게 표시함). 교정된 클론의 VL 쇄가 표 19에 기재되어 있고, IgG의 불변부가 표 20에 기재되어 있다.

IgG 분자가 생식세포계라는 것을 보장하기 위해, 체세포 돌연변이를 5개 항체에서 DNA 수준으로 교정하고, 5개 생식세포계 교정된 모든 IgGls를 발현시켰다 (HEK 293T 세포에서 일시적으로 발현시킴). 비교 결합 분석을 비아코어 (실시예 34), CTD-ELISA 및 IHC에서 수행하여, 생식세포계-교정된 항체가 여전히 기능적이란 사실을 보장하였다. 그 결과가 표 23에 요약되어 있다.

실시예 34: 생식세포계 교정된 IgGs 의 비아코어 분석

표 19 및 20에 기재된 생식세포계 교정된 클론을 비아코어에서 분석하였다. 이 분석은 피복된 bCTD를 수반한 표면 전반에 걸쳐 상이한 농도의 IgGs를 가동시킴으로써 수행하였다. 바이오티닐화 대조군 IgG를 수반한 표면을 음성 표면으로서 사용하였다.

클론 807A-M0028-B02, 807A-M0028-B02.1 및 807A-M0028-B02.2를 비아코어 분석한 결과, 3개의 IgG 분자가 유사한 역학 (유사한 작동 속도 및 이탈 속도)으로 bCTD와 결합한 것으로 나타났다. IgG의 친화성은 상당히 변경되지 않았다. 807B-M0004-A03을 807B-M0004-A03.1과 비교한 경우에도 동일한 결과가 수득되었다.

807B-M0004-H03 및 807B-M0004-H03.1의 비아코어 분석은 807B-M0004-H03.1이 상이한 역학으로 모 클론과 결합한다는 것을 지시해주었다. 그러나, 이는 친화성 값에 상당한 영향을 미치지 않았다. 클론 807B-M0009-F06.1은 CTD-ELISA 및 비아코어 분석과 CTD-ELISA에서 나타난 바와 같이, bCTD에 대한 그의 결합 능력이 상실되었다.

실시예 35: ELISA 에 의한 ApoE - CTD 에 대한 항체 결합

항체를 대상으로 하여, 피복된 ApoE-CTD ELISA를 사용하여 ApoE-CTD 결합 능력에 대해 스크리닝하였다. 인간, 명주원숭이 (marmoset) 또는 뮤린 ApoE-CTD를 미세역가 판 상에 피복시킨 다음, 시험 항체와 함께 항온 배양하였다. 이 후, 이차 HRP-항체 및 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질을 이용하여 탐지함으로써, 상기 결합된 항체 양을 결정하였다. ApoE-CTD 결합은, ELISA에서 광밀도 (OD)로서 측정된 높은 신호를 제공해 주었다. 807A-M0028-B02, 807A-M0028-B02.1 및 807A-M0028-B02.2의 결합이 도 22에 예시되었다. 그 결과는 표 22에 기재되었다.

실시예 36: 인간 지단백질에 대한 항체 결합

항체를 대상으로 하여, 피복된 VLDL ELISA를 사용하여 지단백질 결합 능력에 대해 스크리닝하였다. 인간 VLDL를 미세역가 판 상에 피복시킨 다음, 시험 항체와 함께 항온 배양하였다. 이 후, 이차 HRP-항체 및 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질을 이용하여 탐지함으로써, 상기 결합된 항체 양을 결정하였다. VLDL 결합은, ELISA에서 광밀도 (OD)로서 측정된 높은 신호를 제공해 주었다. 807A-M0028-B02, 807A-M0028-B02.1, 807A-M0028-B02.2, 807B-M0004-H03.0, 807B-M0004-H03.1, 807B-M0004-A03 및 807B-M0004-A03.1의 결합이 도 23에 예시되었다. 그 결과는 표 22에 기재되었다.

실시예 37: 마우스 뇌 플라크에 대한 807A- M0028 -B02, 807B- M0004H03 , 807B- M0004-A03, 807B-M0079-D10, 807B-M0009-F06의 생체내 결합, 및 인간 AD 뇌 플라크에 대한 Fab 클론의 시험관내 결합

뇌 플라크에 대한 807A-M0028-B02, B807B-M0004H03, 807B-M0004-A03, 807B-M0079-D10 및 807B-M0009-F06의 생체내 결합 (면역장식: immunodecoration)은 APP/PS1 트랜스제닉 마우스에 대한 복강내 또는 정맥내 주사에 의해 입증되었다 (도 24 및 25). 10 mg/kg의 807A-M0028-B02를 단일 용량 투여한지 2일 후에 이미 면역장식이 관찰되었다. 807A-M0028-B02, B807B-M0004H03, 807B-M0004-A03, 807B-M0079-D10 및 807B-M0009-F06의 결합은, 성상세포 또는 기타 모든 뇌 구조물의 염색이 전혀 탐지되지 않으면서 플라크 상에서만 관찰되었다 (도 24 및 25). 염색에 의해 결정된 각 마우스에 부하된 총 플라크를, 인접한 절편 상의 Aβ에 대한 모노클로날 항체 (6E10)와 비교함으로써, 상당 수의 플라크가 각각의 클론에 의해 면역장식되었다는 사실이 입증되었다.

인간 AD 뇌 절편 내의 아미로이드 플라크에 대한 친화성 성숙된 클론의 시험관내 결합 또한, 면역조직화학에 의해 입증되었다 (도 25).

인간 AD 플라크에서 상이한 야생형 클론의 시험관내 결합이 도 26에 가시화되었다.

실시예 38: VH - CDR3 스파이킹에 의한 807A- M0028 -B02, 807B- M0004H03 , 807B- M0004-A03, 807B-M0079-D10, 807B-M0009-F06의 친화성 성숙

스파이킹 돌연변이 유발을 이용하여, 본래의 야생형 잔기의 맥락에서 807A-M0028-B02, 807B-M0004H03, 807B-M0004-A03, 807B-M0079-D10 및 807B-M0009-F06 각각의 완전한 길이의 VH-CDR3에 걸쳐 저수준 돌연변이를 도입하였다 (도 27 참고). 표적 V 유전자의 5' 말단에 어닐링시킬 수 있는 FR1 영역과 상동성인 특이적 프라이머와 함께, FR3 및 FR4 영역 중의 표적 V 유전자와 상동성인 영역에 의해 괄호로 묶여진 각 항체의 일정 길이의 VH-CDR3 서열 전반에 걸쳐 스파이킹된 다양성 영역을 수반하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 수행하였다.

항체 807A-M0028-B02, 807B-M0009-F06 및 807B-M0004-H03에 대해서는, 1 단계 PCR 증폭을 통하여 VH-CDR3의 다양화를 실현시켰다. 이러한 PCR은 경쇄 불변 영역에 상보적인 5' 프라이머와, 3' 특이적 스파이킹된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행하였다. 그 다음, 유리한 2 PCR 효소 시스템 (공급처: Clontech) 및 10 pmole의 각 프라이머를 25 주기 (95℃ 하에서 1분, 60℃ 하에서 1분 및 68℃ 하에서 2분) 동안 사용하여 50 ㎕ 용적에서 PCRs를 수행하였다. 스파이킹된 올리고뉴클레오티드에 의해 수반된 다양성 전체를 포괄하도록 하기 위해, 100 nM의 프라이머 농도를 선택하였다. 대략 6 ㎍의 PCR 생성물을 수득하기 위해서는 100 내지 200개 반응이 필요하였다. GFX 정제용 키트 (공급처: Amersham)를 사용하여 모든 생성물을 정제하였다.

이로써 생성된 730 bp의 PCR 생성물은 올리고뉴클레오티드에 혼입된 BstEII 부위와 내부 XbaI 부위를 함유하였다. 이들 부위를 사용하여 상기 생성물을 표시 벡터 내로 클로닝하였다.

807B-M0004-A03 및 807B-M0079-D10의 VH CDR3의 다양화는 2 단계로 실현시켰는데, 상기 언급된 바와 같이 일차 증폭시킨 후, 이로써 생성된 730 bp의 PCR 생성물을, SfiI 부위가 첨부된 5' 말단 축소 정배향 프라이머와 3' 말단 MheI-태그된 CH1 역배향 프라이머의 조합을 이용하여 재증폭시켰다. 그 다음, 유리한 2 PCR 효소 시스템 (공급처: Clontech) 및 10 pmole의 각 프라이머를 20 주기 (95℃ 하에서 1분 및 68℃ 하에서 3분) 동안 사용하여 50 ㎕ 용적에서 PCRs를 수행하였는데, 대략 6 ㎍의 PCR 생성물을 수득하기 위해서는 100 내지 200개 반응이 필요하였다. 제1 PCR 단계에 도입된 최대 다양성을 유지하기 위해, 주기 수를 다소 낮게 (20 주기) 유지시켰다. 최대 다양성을 다시 보장하기 위해서는, 각 반응에 대해 제1 PCR 생성물 50 ng을 주형으로서 사용하여 제2 PCR 반응을 개시시켰다. GFX 정제용 키트 (공급처: Amersham)를 사용하여 모든 생성물을 정제하였다.

XbaI와 BstEII 중의 어느 하나 (807A-M0028-B02, 807B-M0009-F06 및 807B-M0004-H03의 경우) 또는 SfiI와 NheI 중의 어느 하나 (807B-M0004-A03 및 807B-M0079-D10의 경우)의 50 U/㎍ DNA을 사용하여, PCR 생성물 및 벡터 주쇄를 분해시켰다.

이로써 생성된 절단 생성물 (양 벡터와 PCR 단편)을 겔 정제하고, 1.6 ㎍의 각 DNA 단편을, T₄ DNA 리가제 (NEB)를 사용하여 유사하게 절단시킨 파아지미드 벡터 주쇄 10 ㎍에 연결시킨 다음, 각 스파이킹된 라이브러리에 대한 연결 혼합물을 전기천공에 의해 이. 콜라이 TG1 세포 내로 도입하였다.

각 클론을 적어도 한번씩 나타내기 위한 접종에 충분한 수준으로 각 라이브러리로부터의 세균을 이용하고, 헬퍼 파아지 M13-K07 [참고: Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)]를 사용하여 라이브러리로부터 파아지미드 입자를 구제하였다.

각 라이브러리의 VH-CDR3에서의 다양성은 서열 분석함으로써 평가하였다. 96개 분리물을 각 라이브러리에 대해 무작위로 골라내고 VH-CDR3 영역을 서열 분석 한 다음, 기준 야생형 VH-CDR3 서열과 비교하였다.

807B-M0079-D10 및 807B-M0004-A03 클론에 대해서는, 완전한 VH 서열을 결정하고 이를 VH-CDR3 외부의 VH 기준 영역과 비교하였다.

선별 2 회전으로 이루어진 선별 과정을 사용하여, 라이브러리 내의 보다 높은 친화성 클론을 보다 낮은 친화성 클론에 비해 우선적으로 증강시켰다. 친화성 선별 제1 회전은 야생형 항체를 선별하기 위해 사용된 농도에 비해 감소된 항원 농도를 사용하여 수행하였다. 최적으로 감소된 항체 농도는 야생형 항체와 대조군 항체를 사용하여 실험적으로 결정하였다. 제2 회전은 경쟁하는 가용성 Fab 또는 IgG의 존재 하에 추가로 감소된 항원 농도에서 수행하였다. 사용된 선별 조건이 표 3에 상세히 기재되었다.

항원 양성 클론의 증강이 이루어졌는지를 결정하기 위해, 성숙시키고자 하는 각 항체에 대한 선별 제1 회전을 수행하기 전 및 후로부터의 무작위로 골라낸 46개 클론을 항원 ELISA에서 시험하였다. 모든 경우에 있어, 선별 제1 회전 직후에 항원 양성 클론 증강이 관찰되었다.

선별 후, 유전자III 절단부를 상기 벡터로부터 제거하여 가용성 Fab 발현을 허용하였다. 200개 클론을 무작위로 골라내고, ELISA에 의해 스크리닝한 다음, 그들의 중쇄 서열을 분석하였다. 디악스 WEBPHAGE 데이터베이스를 사용하여 ELISA 데이터를 각각의 서열에 연계시켰다. 스크리닝 검정에서 양성인 것으로 밝혀진 (OD 신호 = 3x 배경) 클론의 VH-CDR3 서열을 추가로 분석하였다.

클론 807B-M0079-D10 및 807B-M0004-A03에 대해서는, 완전한 VH 영역을 증폭시키고 클로닝하였으므로, 완전한 VH 서열을 수득하고, 이를 VH 기준 서열과 비교하여 VH CDR3 외부의 모든 돌연변이에 대해 검사하였다. 골격 영역 내에서의 돌연변이를 함유하는 클론은 폐기하였지만, VH-CDR1-CDR2 내에서의 돌연변이를 수반한 클론은 유지시켰다.

선별된 클론에 관한 아미노산 빈도 분석 결과가 표 24 내지 30에 제시되었다. VH-CDR3에서는 몇몇 아미노산 위치가 극히 보존된 반면, 다른 위치는 빈번히 돌연변이되었다.

*비아코어 스크리닝을 사용하여, 이탈 속도 또는 K_D에 근거하여 5개의 CDR3-돌연변이된 Fabs를 선별하였다. CDR3-돌연변이된 Fabs를 세균에서 발현시켰다. 원형질막 주위 추출물을 제조하고 비아코어에서 스크리닝하였다. 표 4에 나타낸 바와 같은 펩티드 또는 hCTD과의 결합에 대한 K_D 또는 이탈 속도를 근거로 하여 가장 우수한 클론을 선별하였다.

바이오티닐화 펩티드 또는 인간 CTD를 스트렙타비딘 칩 상에 피복시켰다. 10 ml 배양물로부터의 원형질막 주위 추출물을 HBS + 0.1% BSA에서 1/2로 희석시켰다. 킨젝트 (kinject) 프로그램을 사용하여 샘플을 3분 동안 분당 30 ㎕으로 주사하였다. 3분 동안 해리시킨 후, 나머지 샘플 모두를 칩 표면으로부터 스트립핑하였다. 이탈 속도는 1분 시간 창 (10초 내지 70초)에서 측정하였다. 이들 데이터가 표 31 내지 35에 제시되었다.

k_off와 Fab 농도 둘 다가 공지된 경우에는 비아코어 곡선으로부터 작동 속도를 산정할 수 있다. 초고밀도 칩과 저 유속을 이용하여 작동하는 경우에 직면하게 되는 경우와 같은 완전한 물질 이동 제한 (MLT) 조건 하에서는, 비아코어 신호가 칩 표면 전반에 걸쳐 가동된 분석물의 농도에만 좌우된다. 조 샘플 중에서의 Fab 농도는, 상이한 농도의 정제된 Fab를 고밀도 단백질 A 칩 상에서 가동시킴으로써 수득된 표준 곡선으로부터 결정할 수 있다. 이러한 방식으로 수득된 Fab 농도와 k_off 값을 이용하여, 본 발명자들은 비아코어 곡선으로부터 k_on 데이터를 산정하였다. k_off/k_on으로부터 평형 해리 상수 K_D를 수득하였다. 이들 데이터가 표 31 내지 35에 제시되었다. 807B-M0079-D10는 단백질 A와 결합하지 않는다는 것을 인지해야 한다. 따라서, 이 클론에 대해서는 k_off 값 만이 제시되었다.

807B-M0004-A03, 807B-M0004-H03, 807B-M0009-F06 및 807A-M0028-B02에 대한 5개 변이체를 성공적으로 선별하였다. 이와 같이 선별된 변이체가 표 36에 확인되었다. 807B-M0079-D10의 경우에는, 상당히 개선된 k_off을 나타내는 클론이 전혀 밝혀지지 않았다 (이 클론에 대해 입수 가능한 K_D 데이터가 없음).

선별된 Fabs를 이. 콜라이에서 생성시키고, 고정화 금속 친화 크로마토그래피함으로써 원형질막 주위 추출물로부터 정제하였다. 환원성 및 비-환원성 SDS-PAGE 상에서 상기 제제의 질을 검사하였다.

이와 같이 정제된 Fabs를 사용하여 평형 해리 상수 K_D를 정확하게 결정하였다.

바이오티닐화 펩티드 또는 인간 CTD를 스트렙타비딘 칩 상에 피복시켰다. 실험을 HBS 가동 완충액 중에서 수행하였다. 정제된 Fabs를 200 nM이 되도록 희석시키고, 12.5 nM가 되도록 일련의 1/2 희석물을 만들어 두 번 되풀이하였다. 연합시키기 위해, 킨젝트 프로그램을 사용하여 샘플을 분당 30 내지 40 ㎕로 주사하였다. 3분간 해리시킨 후, 나머지 모든 샘플을 칩 표면으로부터 스트립핑하였다. BIA평가 소프트웨어 3.1에서 동시 ka/kd 피팅 프로그램을 사용하여 센서그램을 분석하였다. 그 데이터가 표 36에 요약되었다. 비아코어 스크리닝으로부터 선별된 가장 우수한 클론은 807B-M0004-A03, 807B-M0009-F06 및 807A-M0028-B02에 대한 본래의 클론 보다 2 내지 3배 더 높은 친화성을 나타내었다. 807B-M0004-H03의 경우에는, 비아코어 신호가 상이한 클론의 정확한 비교를 허용하지 않았다.

정제된 Fabs을 면역조직화학에 의해 또한 시험하였다. 표 37에는 야생형 클론과 함께, 선택된 클론의 명칭이 나타나 있고, 이는 이들이 면역조직화학에서 플라크를 염색하였는지를 지시해준다.

실시예 39: 실시예 38로부터 선별된 항체 변이체의 경쇄 셔플링

경쇄 셔플링에 대한 출발점으로서 (도 27의 주기 2), 실시예 38로부터의 VH-CDR3 개선된 변이체에 상응하는 중쇄 (도 27의 주기 1)를 야생형 (WT) 클론과 함께 사용하였다.

WT 클론 807B-M0009-F06은 포함되지 않았는데, 이는 이러한 클론의 친화성이 주기 1로부터 선별된 변이체와 비교해서 상당히 더 낮기 때문이다. 항체 807B-M0079-D10에 대해서는, 주기 1에서 개선된 친화성 변이체가 전혀 밝혀지지 않았기 때문에는, WT 클론 단독에 대해서만 LC 셔플링을 수행하였다.

본 실시예에서는, 비-친화성 성숙된 항체를 야생형 (WT) 클론으로서 명명하였고, 주기 1로부터 선별된 변이체를 모 클론으로서 명명하였다.

주기 1로부터 선별된 중쇄 변이체를, 대략 10⁸개 경쇄 (LC)와 셔플링된 5 내지 6개 중쇄 (HC) 레퍼토리를 함유하는 FAB310 벡터 주쇄 내로 클로닝하여 조합적 다양성을 창출시켰다.

모든 클론에 대해, 퀴아젠 (Qiagen) DNA 제제를 TG1 배양물 상에서 수행하였다. 이어서, SfiI 및 NotI 제한 효소를 사용하여 10 ㎍의 DNA를 절단시켜, 크기가 650 bp인 중쇄 단편을 생성시켰다. 이러한 FAB310 벡터 주쇄를 유사하게 절단시켰다.

이로써 생성된 절단 생성물 (양 벡터와 단편)을 겔 정제하고, 각 라이브러리에 대해, 상이한 중쇄 변이체 단편을 등량으로 풀링한 다음, 이와 같이 풀링된 단편 3 ㎍을, T₄ DNA 리가제 (NEB)를 사용하여 절단시킨 파아지미드 벡터 주쇄 6 ㎍에 연결시켰다. 각 라이브러리에 대한 탈염 연결 혼합물을 전기천공에 의해 이. 콜라이 TG1 세포 내로 도입하였다.

각 중쇄 변이체가 경쇄 레퍼토리 각 구성원의 하나 이상의 카피와 조합되도록 하는 라이브러리 크기를 달성하였다.

각 라이브러리로부터 무작위로 골라낸 50개 분리물에 대한 중쇄 서열을 결정하였다.

807A-M0028-B02-유래된 선별되지 않은 라이브러리로부터 무작위로 골라낸 48개 분리물의 경쇄 서열과, 807B-M0009-F06-유래된 선별되지 않은 라이브러리로부터 무작위로 골라낸 48개 분리물의 경쇄 서열을 결정하였다. 63개의 독특한 기능적 경쇄가 수득되었다.

각 클론을 적어도 한번씩 나타내기 위한 접종에 충분한 수준으로 각 라이브러리로부터의 세균을 이용하고, 헬퍼 파아지 M13-K07 [참고: Marks et al., J. Mol. Biol. 222,581 (1991)]를 사용하여 파아지미드 입자를 구제하였다.

5개의 경쇄 셔플링된 라이브러리를 대상으로 하여, 개선된 친화성 변이체에 대해 선별하였다. 선별에 앞서, 라이브러리를 l ml 2% MPBS 중의 100 ㎕ 스트렙타비딘 상자성 비드와 함께 예비항온 배양함으로써, 이러한 라이브러리로부터 스트렙타비딘 결합성 항체를 고갈시켰다. 각 라이브러리에 대해, 3가지 농도의 항원을 사용하여 선별 제2 회전을 위한 최적의 농도를 결정하였다 (표 5). 파아지와 비드-표적 복합체의 항온 배양 시간을 0.5시간으로 단축시키고, 프로그램된 세척 11 주기를 킹피셔 장치에서 사용하였다. 선별 후, 결합된 파아지를 용출시키고, 이. 콜라이로 감염시키며 (TG1 OD 0.5), 액체를 25 ml 2x TY/앰피실린 (100 ㎍/ml) 글루코스 (2% w/v) 중에서 250 rpm으로 진탕시키면서 30℃ 하에 밤새 증폭시켰다. 세포를 농축시키고 글리세롤 원액을 만들어 선별 제2 회전을 수행하였다.

선별되지 않은 라이브러리와 산출물을 적정시켜, 골라내어 스크리닝하기 위한 단일 집락을 수득하였다. 선별되지 않은 라이브러리와 산출 라이브러리로부터 47개 집락을 골라내고 파아지 ELISA에서 스크리닝하였다 (b-BSA 플러스 스트렙타비딘을 통하여 모든 항원에 대한 피복 항원 0.5 ㎍/ml).

모든 선별 목표는 항원 결합성 클론의 증강을 가져다 주는 것이었다. 이들 결과에 기초하여, 선별 제2 회전을 위한 항원 농도를 선택하였다.

선별 제2 회전에 대한 조건은 보다 엄격하게 선택하고, 개선된 (보다 신속한) k_on과 개선된 (보다 느린) k_off 에 대해 선별하도록 계획하였다. 표 6에 요약된 바와 같은 3가지 전략을 사용하였다: 전략 I - 항원 농도를 추가로 저하시킨다; 전략 II - 항원 농도를 추가로 저하시키고 항원과의 항온 배양 시간을 단축시킨다 (k_on 선별); 전략 III - 항원 농도를 추가로 저하시키고 엄격한 세척을 증가시킨다 (k_off 선별). 선별은 킹피셔 자동화 장치에서 수행하고, 대략 10¹²개 파아지의 투입을 이용하였다. 선별하기에 앞서, 상기 언급된 바와 같이 라이브러리로부터 스트렙타비딘 결합성 항체를 고갈시켰다. 선별 후, 결합된 파아지를 용출시키고 이를 사용하여, 전술된 바와 같이 이. 콜라이를 감염시켰다. 세포를 농축시키고, 글리세롤 원액을 만들었다.

제2 회전의 산출물을 ELISA에서 예비스크리닝하여 항원 결합성 클론의 비율(%)을 결정하였다. 제한된 수의 클론에 대한 서열 분석을 수행하여, 특정한 어떠한 클론이 우세하게 선별되었는지, 그리고 선별된 클론 내에 어떠한 우세한 경쇄 계열이 존재하는지를 결정하였다.

제2 회전 파아지 산출물 (총 15개) 각각을 배치식으로 재클로닝하여 가용성 Fabs를 생성시켰다. 이는 벡터로부터 유전자III 절단부를 제거함으로써 달성되었다.

200개 클론을 무작위로 골라내고, 이들을 대상으로 하여 그들 각각의 항원에 대한 결합을 알아보기 위해 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 양성 표적물에 대해서만 항체 서열을 결정하였다. 저장과 초기 서열 분석은 디악스 WEBPHAGE 데이터베이스를 통하여 수행하였다.

라이브러리 807B-M0004-A03, 807B-M079-D10 및 807A-M0004-H03에 대해서는, 2 내지 8배 증강된 항체를 선별하였다. 라이브러리 807A-M0028-B02 및 807B-M009-F06에 대해서는, 모든 클론을 취하였는데, 이는 독특한 클론 수가 적었기 때문이다. 모든 ELISA 양성으로부터의 경쇄 및 중쇄 서열과, 독특한 표적물이 표 38 내지 42에 나타나 있다.

잠재적 친화성 성숙된 결합제를 비아코어 분석한 후, 몇 개가 보다 높은 친화성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 라이브러리 807B-M0004-A03, 807A-M0028-B02 및 807B-M004-H03 만이 WT 및 모 클론 보다 더 높은 친화성을 나타내는 친화성 성숙된 항체를 제공해주었다. 이들 선별된 클론의 경쇄 서열을 생식세포계에 정렬시켰다. 흥미롭게도, 동일한 아미노산 위치가 동일한 생식세포계에 속하는 선별된 모든 클론들 간에 다양한 것으로 여겨진다. 동일한 아미노산 위치는 동일한 생식세포계에 속하는 선별된 모든 클론들 간에 다양한 것으로 여겨진다.

라이브러리 807B-M0004-A03에 대해서는, 클론 M148E08과 M150E03이 2개의 아미노산을 제외하고는 정확하게 동일한 중쇄 서열과 경쇄 서열을 지니고 있긴 하지만, 클론 M150E03이 M148E08에 비해 3.2배 개선된 친화성을 나타내었는데, 이는 FR1에 위치한 단지 2개의 아미노산이 상기 개선에 책임이 있다는 사실을 제안해준다.

라이브러리 807B-M0028-B02 및 807B-M0004-A03에 대해서는, CDR 및 FR에서 관찰된 대부분의 다양화가 야생형과 비교해서 생식세포계 서열로 복귀되었다.

807A-M0028 B02 라이브러리-유래된 클론의 FR3에서는 단지 소수의 보존적 변이 만이 관찰되었다.

비아코어 분석의 경우에는, 모든 클론 변이체를 작은 배양물 (전형적으로 10 ml)에서 성장시키고, 원형질막 주위 추출물 (PE)을 제조한 다음, 샘플을 단백질 A/G 칩 상에서 가동시킴으로써, PEs 중의 Fab 농도를 결정하였다. 이어서, PEs을 희석시켜 동일한 Fab 농도 (25 내지 50 nM)로 만들고, 이를 표적-피복된 칩 (펩티드 4, 8, 9 또는 CTD) 전반에 걸쳐 가동시켰다. 가장 우수한 클론은 연합 및 해리 상의 진폭을 근거으로 하여 확인하거나 (807A-M0028-B02, 807B-M0004-A03, 807B-M0009-F06) 또는 평형에서의 비아코어 신호 값을 근거으로 하여 확인하였다 (807B-M0004-H03). 807B-M0079-D10로부터 유래된 클론은 단백질 A/G 칩과 결합하지 않았으므로, 그들의 이탈 속도 만을 근거으로 하여 등급을 매겼다.

807B-M0004-H03으로부터 유래된 클론은 평형 해리 상수 K_D를 반영해 주는 평형에서의 비아코어 신호 값을 근거으로 하여 등급을 매겼는데; 평형에서의 비아코어 신호 값이 더 클수록, 친화성은 더 우수해진다.

807B-M0079-D10으로부터 유래된 클론은 k_off 만을 근거로 하여 등급을 매겼다.

4개 및 5개 변이체를 807A-M0028-B02 및 807B-M0004-A03에 대해 각각 선별하였다. 분리된 807B-M0009-F06 변이체 어느 것도, CDR3 스파이킹으로부터 수득된 가장 우수한 변이체 보다 더 높은 친화성을 나타내지 못한 것으로 여겨진다. 807B-M0004-H03의 경우에는, 평형에서의 비아코어 신호 값을 근거로 하여 2개의 변이체를 선별하였다. 807B-M0079-D10 변이체 어느 것도 이탈 속도 분석을 근거로 하여 선별될 수 없었다.

이와 같이 선별된 클론을 이. 콜라이에서 생성시키고 원형질막 주위 추출물로부터 정제하였다. 이 물질을 사용하여 비아코어에서 평형 해리 상수 K_D를 정확하게 측정하였다. 그 데이터가 표 7에 요약되었다. 경쇄 셔플링으로부터 분리된 가장 우수한 클론은 상응하는 본래의 야생형 클론 또는 CDR3 스파이킹으로부터 분리된 가장 우수한 클론 보다 대략 5배 더 높은 친화성을 나타내었다.

경쇄 셔플링을 수반하여 선별된 클론이 표 43 및 44에 나타나 있다.

<표 1>

<표 2>

<표 3>

<표 4>

<표 5>

<표 6>

<표 7>

<표 8>

<표 9>

<표 10>

<표 11>

<표 12>

<표 13>

<표 14>

<표 15>

<표 16>

<표 17>

<표 18>

<표 19>

<표 20>

<표 21>

<표 22>

<표 23>

<표 24>

<표 25>

<표 26>

<표 27>

<표 28>

<표 29>

<표 30>

<표 31>

<표 32>

<표 33>

<표 34>

<표 35>

<표 36>

<표 37>

<표 38>

<표 39>

<표 40>

<표 41>

<표 42>

<표 43>

<표 44>

<110> ASTRAZENCA AB DYAX CORP. <120> ANTIBODIES <130> N.90271E GCW/PT <140> PCT/EP2004/013426 <141> 2004-11-26 <150> US 60/525,174 <151> 2003-11-28 <160> 527 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 84 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu 1 5 10 15 Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala 20 25 30 Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser 35 40 45 Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu 50 55 60 Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro 65 70 75 80 Ser Asp Asn His <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val 1 5 10 15 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val 1 5 10 15 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His 1 5 10 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Leu Val Glu Asp Met Gln Arg Gln 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser 1 5 <210> 18 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu 1 5 10 15 Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val 20 <210> 19 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp 1 5 10 15 Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val 20 25 30 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> X = any amino acid <400> 20 Ser Xaa Xaa Leu Asp Tyr 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Lys Tyr Ser Met His 1 5 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Lys Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ser Leu Asp Leu Asp Tyr 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Tyr Met Met Asp 1 5 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ser Ile Trp Pro Ser Gly Gly Gln Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ser Val Leu Leu Asp Tyr 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Tyr Tyr Ala Met Gln 1 5 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Ser Leu Tyr Pro Ser Gly Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 29 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Gly Arg Gly Asn Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Met Asp Val <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Arg Ala Ser Gln Arg Ile Arg Lys Asn Leu His 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Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Gly Lys Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 40 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr 20 25 30 Met Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Trp Pro Ser Gly Gly Gln Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Val Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 41 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30 Ala Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Leu Tyr Pro Ser Gly Gly Asn Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Arg Gly Asn Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Gly Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 42 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Ile Arg Lys 20 25 30 Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Asn Glu Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Arg Gly Ser Gly Thr Glu Phe 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Homo sapiens <400> 61 Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Val Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Gly Thr His Leu Pro Gly Val Asp Tyr 1 5 <210> 63 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Gly Tyr Ile Met Ala 1 5 <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Gly Ile Gly Ser Ser Gly Gly Leu Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 65 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Glu Ala Gly Tyr 1 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Ser Tyr Pro Met Val 1 5 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Gly Ile Trp Ser Ser Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Glu Gly Ser Ala Gly Val Val Lys Gly Pro Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Tyr Met Asp Val 20 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Lys Tyr Gln Met Thr 1 5 <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Val Ile Ser Ser Ser 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tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct ctctatcctt ctggtggcaa tacttcttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagaggtcgc 300 gggaattacg atttttggag tgcgggctac tactactact acatggacgt ctggggcaaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc aagc 384 <210> 173 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 173 caagacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 60 accatcactt gccgggcaag tcagcgcata agaaagaatt tacattggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag cccctaacct cctgatctat gatgcatcca gtaacgaacg tggggtccca 180 tcaaggttca gtggcagagg atctgggaca gagttcactc tcaccatcag cagtctacaa 240 cctgaagatc ttgcaactta ctactgtcaa cagagtttca gtagcccctg gacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaa 324 <210> 174 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 174 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aagtactcta tgcattgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atctattctt ctggtggcaa gactatttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca accctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagatcgctt 300 gatcttgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct caagc 345 <210> 175 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 175 caagacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 60 accatcactt gccggacaag tcaggacatt agaaatcatt taggctggtt tcagcagaaa 120 ccagggaaag cccctcagcg cctgattcgt gaagcatcca ttttacaaag tggggtccca 180 tcaacatttt acggcagtgg atatgggaga gaattcactc tcacaatcag cagcctgcag 240 cctgaggatt ttgcaaccta ttattgtcta caatatgatt ctttcccata cacctttggc 300 caggggacca agctggagat caaa 324 <210> 176 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 176 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct atgtacatga tggattgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctggcctt ctggtggcca gacttggtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa 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agacggcccc actatggttc ggggaggtgg gcctactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctcaagc 369 <210> 179 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 179 cagagcgaat tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaatactg taaactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aataataatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240 tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatggcatg acggcctgaa tggtccggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 180 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 180 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cgttacctta tgatgtgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctgtt atctctcctt ctggtggccg tacttggtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgt gaggagtata 300 gcagcagctg gaactgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc aagc 354 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gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 192 <211> 387 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 192 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tcttacccta tggtttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atctggtctt ctggtggcct tacttattat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagtct actattgtgc gagagagggc 300 tcggccggag tggttaaagg gccggcccgg tactactact actacatgga cgtctggggc 360 aaagggacca cggtcaccgt ctcaagc 387 <210> 193 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 193 cagagcgaat tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaattatg tatactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat aggaataatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240 tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tgcctgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 194 <211> 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cttccggatt cactttctct cattacggta tgtcttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atccgttctt ctggtggccg tacttggtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac actgcagttt actattgtgc gaaaggctcc 300 cttagcagtg gctgggacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc aagc 354 <210> 199 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 199 cagagcgctt tgactcagcc accctcagtg tccgtgtccc ctggacagac agccagcatc 60 acctgcgctg gagatgaatt gggtaataaa tatgcttcct ggtatcagca gaagccaggc 120 cagtcccctg tgctggtcat ctatcaagat aggaagcggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct cccactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctctc 240 gatgaggctg actattactg tcagtcgtgg gacagcagct ctgtgatatt cggcggcggg 300 accaaggtga ccgtccta 318 <210> 200 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 200 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aattaccgta tggagtgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct 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497 Met Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 498 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 498 Leu Gly Ser His Arg Ala Ser 1 5 <210> 499 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 499 Phe Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 500 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 500 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr 20 25 30 Trp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Met Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Ile Ser Thr Tyr Gly Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro 130 <210> 501 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 501 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Thr Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 502 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 502 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 503 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 503 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 504 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 504 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Ser Gly Tyr His Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 505 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 505 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ile Asp Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 506 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 506 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg Asn Gly Tyr Asn Phe Leu Asp 1 5 10 15 <210> 507 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 507 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Arg His Asn Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp 1 5 10 15 <210> 508 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 508 Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 1 5 10 15 Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His 20 25 30 Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln 85 90 95 Ala Leu Gln Thr Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 509 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 509 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr 20 25 30 Trp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Met Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Met Ser Thr Tyr Gly Phe Asp Lys Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro 130 <210> 510 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 510 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr 20 25 30 Trp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Met Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Met Tyr Asn Tyr Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro 130 <210> 511 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 511 Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 1 5 10 15 Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His 20 25 30 Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln 85 90 95 Ala Leu Gln Thr Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 512 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Consensus amino acid sequence of the CDR3 regions of affinity matured clones of 807A-M0028-B02 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = S or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X = V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X = L, H or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = Y, N or K <400> 512 Xaa Xaa Leu Xaa Asp Xaa 1 5 <210> 513 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Consensus amino acid sequence of the CDR3 regions of affinity matured clones of 807B-M0004-A03 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X = A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X = D, S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = R or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X = Y, H or S <400> 513 Ser Ile Ala Xaa Xaa Xaa Thr Asp Xaa 1 5 <210> 514 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Consensus amino acid sequence of the CDR3 regions of affinity matured clones of 807B-M0004-H03 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = E or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X = G or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X = A, S or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X = G, R or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = V or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X = G or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X = P or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X = A, P or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X = Y or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X = Y or F <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> X = V, L or A <400> 514 Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Val Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Tyr Tyr 1 5 10 15 Tyr Xaa Asp Xaa 20 <210> 515 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Consensus amino acid sequence of the CDR3 regions of affinity matured clones of 807B-M0009-F06 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X = M or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X = S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X = T or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = A or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X = I, L, F or K <400> 515 Val Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Phe Asp Xaa 1 5 10 <210> 516 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Consensus amino acid sequence of the CDR3 regions of affinity matured clones of 807B-M0009-F06 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X = V or I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X = L, H or F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = K, Y or N <400> 516 Gly Xaa Leu Xaa Asp Xaa 1 5 <210> 517 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Consensus amino acid sequence of the CDR3 regions of affinity matured clones of 807A-M0004-A03 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X = S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X = S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = R or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X = H or Y <400> 517 Ser Ile Ala Xaa Xaa Xaa Thr Asp Xaa 1 5 <210> 518 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the VL chains of the Germline-corrected antibodies <400> 518 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 519 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the CL chains of the Germline-corrected antibodies <400> 519 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 520 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the VL chains of the Germline-corrected antibodies <400> 520 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 521 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the CL chains of the Germline-corrected antibodies <400> 521 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 522 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the VL chains of the Germline-corrected antibodies <400> 522 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 523 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the CL chains of the Germline-corrected antibodies <400> 523 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 524 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the VL chains of the Germline-corrected antibodies <400> 524 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 525 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the VL chains of the Germline-corrected antibodies <400> 525 Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 526 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the VL chains of the Germline-corrected antibodies <400> 526 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 527 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence of the CL chains of the Germline-corrected antibodies <400> 527 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 1

Claims

아밀로이드 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 있어서,
(i) 아포지단백질 E의 C-말단 도메인 (ApoE-CTD)의 서열 1에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 일부의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 결합하고;
(ii) 인간 아밀로이드 플라크와 결합하는,
인간 항체 또는 항체 단편의 용도.