CN102863525B - 一种重组人apoE拟肽及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人apoE拟肽及制备方法和应用，一种分离的重组apoE拟肽（EpK），其序列为SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。采用原核表达体系表达并经两步亲和层析制备纯化的EpK，其优点是产率高、成本低、纯化流程简单、获得无任何标签的高纯蛋白，并且规模化表达和纯化，更易获得高量纯品肽。EpK的功能特征在于具有α螺旋结构，无论体内外均能与脂质结合，并优先与HDL结合。EpK及与其结合的HDL显著增强了介导巨噬细胞胆固醇外流及抑制巨噬细胞炎症反应的功能，同时，EpK还可增强巨噬细胞抗氧化的活性。一种重组人apoE拟肽在治疗或预防动脉粥样硬化所致冠心病、心肌梗塞、中风等心脑血管疾病药物中的应用。

Description

一种重组人apoE拟肽及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术药物及应用领域，具体涉及一种重组的人载脂蛋白E(apoE)模拟活性肽，同时涉及一种载脂蛋白E(apoE)拟肽的制备方法，还涉及一种载脂蛋白E(apoE)拟肽在治疗和/或预防动脉粥样硬化及其所致冠心病、心肌梗塞、中风等心脑血管相关疾病药物中的应用。

背景技术

动脉粥样硬化是多种复杂的病因(氧化应激、炎症、血脂紊乱、高糖等)诱发下的血管壁功能失调，其特征是动脉壁内膜下脂质聚积及炎性细胞浸润，包括巨噬细胞泡沫化、平滑肌细胞增殖、细胞外基质的大量积聚，最后形成动脉粥样硬化斑块，导致血管管腔变窄，弹性减少，影响动脉血流，严重时完全堵塞血管或斑块破裂、并发血栓栓塞，从而导致血流灌注的组织器官局部缺血，其并发症或严重后果包括冠状动脉粥样硬化引发心肌缺血造成心绞痛、心肌梗塞，脑动脉和颈动脉粥样硬化引发中枢神经系统缺血造成中风，外周循环或内脏循环的动脉粥样硬化导致的器官损伤(如肾动脉狭窄造成继发性高血压)。

动脉粥样硬化和动脉硬化在定义内涵上有不同的病理特征，本发明中所指的动脉粥样硬化是由于动脉粥样斑块使动脉硬化或失去弹性，动脉硬化是指任何一个或多个原因造成的动脉硬化或失去弹性。

动脉粥样硬化的发生发展与机体血脂代谢紊乱、氧化应激损伤及炎症状态密切相关。动脉粥样硬化发生的基本病理过程主要为：早期在氧化应激及炎症因素的刺激下，内皮功能受损，内皮细胞激活分泌黏附分子，使循环中单核细胞向受损内膜下渗入、迁移，演变成巨噬细胞后，通过细胞因子的释放、与其他细胞的相互作用参与动脉粥样硬化的进程，同时巨噬细胞自身摄取大量氧化低密度脂蛋白(LDL)转变为泡沫细胞而成为斑块中心，故巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块发生发展全过程中扮演着多方面的重要角色。

目前临床上治疗和/或预防动脉粥样硬化的推荐方案包括药物防治和手术治疗。药物常以降脂/胆固醇为目的，具体的广泛采用的是降低LDL-胆固醇(LDL-C)的药物，包括他汀类(statins)，HMGCoA还原酶抑制剂，消胆胺等降低胆固醇吸收的药物，以及丙丁酚等。其次常采用的阿司匹林用于抑制血栓形成，抗氧化抗炎作用的药物也被人们广泛接受应用。手术治疗主要适用于动脉粥样硬化已产生严重并发症或后果的情况，如球囊成形术、内膜切除术、内置支架、血管搭桥术等介入治疗手术。

当然，由于动脉粥样硬化所致的严重并发症和后果，最好还是治疗或控制危险因素，如保证合理低脂、低胆固醇、清淡饮食，积极治疗和控制高胆固醇血症、高甘油三酯血症、糖尿病、高血压等相关疾病、注意经常锻炼、降低体重、改善心功能，增强心血管保护因素等。

已证实高密度脂蛋白(HDL)是动脉粥样硬化发生发展的重要负相关因素，HDL具有抗动脉粥样硬化的作用涉及多种机制，包括促进胆固醇逆向转运、抗炎、抗氧化、抗血栓形成、促进一氧化氮产生、以及保护内皮功能等。由于针对LDL-C的降脂治疗仍存在心血管疾病发生的危险性，且急、慢性炎症状态下，HDL功能的异常较HDL-胆固醇(HDL-C)浓度的改变更为突出，因此针对HDL功能的治疗成为代谢性疾病和炎症状态下抑制动脉粥样硬化形成的重要途径。在HDL众多优点中，介导胆固醇逆向转运和抗炎两个功能尤为重要，而且可能存在本质上相互联系。近年的研究表明HDL对巨噬细胞的抗炎作用可能部分是通过ABCA1和ABCG1介导的胆固醇外流实现的。目前增强HDL功能的药物和HDL类似物的研发在动脉粥样硬化治疗上显示了巨大的应用前景。有研究证实他汀类药物治疗就能纠正HDL的功能障碍，恢复其抗炎作用；传统治疗中的贝特类药物也能有效改善代谢性疾病中HDL颗粒的功能；目前已上市的或正在研发中的一系列HDL增强剂还包括尼克酸(niacin)、胆固醇酯转运蛋白(CETP)抑制剂、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)激活剂、载脂蛋白AI(apoAI)表达刺激物、内皮脂肪酶抑制剂、PPAR/LXR激动剂以及HDL载脂蛋白或其类似物。其中尼克酸因其明显的升高HDL作用而成为最常规的一种，然而，其引起面色潮红的不良反应显然限制了它的使用，并且其抗动脉粥样硬化和减少心血管疾病发生的效果还待考证。其他的治疗剂也都在不同的改进阶段。

HDL是一种脂质和蛋白含量大致均等的异质性脂蛋白，组成包括多种载脂蛋白、甘油三酯、磷脂、胆固醇及其酯，其中载脂蛋白包括apo AI(占65-70％)，apo AII(20-25％)，apo AIV，apo AV，apo C，apo D，apo E，apo J，等。目前已证实HDL主要有益作用可归因于它主要的载脂蛋白：apoAI和apoE，这促使研究者开发apoAI、apoE或者它们的拟肽以增强HDL的功能。利用人全长apoAI或其突变体apoAI-milano，无脂或与磷脂重构的HDL，还有短的apoAI模拟肽开发增强HDL功能和抗动脉粥样硬化的药物，都聚集了人们巨大的兴趣，部分研发已在临床试验中取得可喜效果。ApoE是HDL另一种主要的载脂蛋白，同时apoE也是其他脂蛋白包括极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒的成分，在脂蛋白代谢和动脉粥样硬化的致病机制中发挥关键作用而使apoE成为一种多功能蛋白，其主要作用是介导循环中胆固醇的清除和血管壁巨噬细胞胆固醇的外流。它是apoE受体、LDL受体(LDLR)和硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)的配体，介导摄取脂蛋白残粒促成肝脏对血浆胆固醇的清除。ApoE还通过其受体介导途径下调血管壁巨噬细胞活化，进一步抑制与动脉粥样硬化形成有关的级联反应(细胞泡沫化、平滑肌细胞增殖等)。无论是游离的蛋白还是HDL颗粒的组分，apoE可促进胆固醇逆向转运、抗氧化、抗炎、抗平滑肌细胞增殖和激活HDL中LCAT活性等，从而实现HDL的部分功能，降低或减轻了动脉粥样斑块的形成，达到抗动脉粥样硬化的效果。

人血浆中apoE浓度平均为5mg/dL。apoE主要由肝脏产生，也有极少量可由血管壁局部的巨噬细胞分泌，在动物研究中发现：由血管壁巨噬细胞分泌的apoE可显著降低动脉粥样硬化的形成和发展，即使低apoE浓度改变不了血浆中高胆固醇水平。例如，apoE基因缺陷型(apoE^-/-)小鼠被认为是高胆固醇血症和动脉粥样硬化的典型动物模型，早在1995年，Linton和Fazio等就报道了利用骨髓移植技术使apoE^-/-小鼠获得野生型小鼠能分泌apoE的巨噬细胞，其结果可显著降低apoE^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的形成；而野生型小鼠的巨噬细胞如更换为apoE^-/-鼠的巨噬细胞，则加速动脉粥样硬化改变，即使不影响肝脏合成主要的apoE。申请者也曾证实，补偿性给予巨噬细胞源性的apoE，可有效改善apoE和SRBI双基因敲除鼠的高脂血症并缓解动脉粥样硬化病程，避免其早发性心衰及幼年夭折。另外apoE在体内具有再循环功能，apoE以乳糜微粒的形式被肝细胞吞噬，随后一直分离，游离的apoE在胞内与新合成的apoAI结合后，胞吐进入血循环系统成为HDL的重要组分，随着HDL的成熟，apoE从HDL中脱落再次与乳糜微粒结合而循环，该机制为apoE的靶向性治疗提供非常有益的生物特性，可延长生物半衰期，增加载脂蛋白的功能，这使得人们相信apoE是一类有前景的体内HDL功能增强剂，有望成为一种理想的防治动脉粥样硬化的药物。

研究显示人类apoE基因具有多态性，可分别表达出3种异构体apoE2、apoE3和apoE4，其中ε3为野生型基因，占总基因70％-80％，ε2和ε4则为异构体基因，分别占5％-10％和10％-15％，人群中约14％个体的血浆胆固醇升高就源于apoE的基因多态性即表达的功能异构体。野生型apoE3肽段的112位为半胱氨酸(Cys)残基、158位为精氨酸(Arg)残基，apoE2则112位和158位均为Cys，E4的112位和158位均为Arg。异构体结构的差异导致apoE2、apoE4在体内代谢速率或受体结合力与apoE3明显不同，而表现出血胆固醇水平的升高。大量研究均已证实，存在apoE基因突变型异构体的人群中，其内源性apoE功能降低或异构体是发生或易感动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s disease)等相关疾病的重要因素。

ApoE按基本功能可分为氨基端(N末端)(第1-191氨基酸残基)区域和羧基端(C末端)(第192-299氨基酸残基)区域组成，包含两个结构功能域，分别为：LDLR结合域和脂质结合域，即4个螺旋束N端的负责结合LDLR和HSPG，C端结构域负责结合脂质和Aβ肽。apoE的N端呈球形结构，其中第131-162位氨基酸肽段为LDLR结合域，尤其结构相对保守的第141-150位氨基酸肽段由一串带正电荷的精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)组成，可通过离子键与负电性的LDLR结合，被认为是LDLR结合的关键结构域肽段；C端结构域的一个双性α螺旋模序则是脂质结合的结构基础，其第220～260氨基酸残基的α螺旋首先与脂质结合后，再引发N末端结构域的构象改变。这种脂质引发的N端结构域的改变保证了对LDLR结合的能力。Mahley等报道其中第244-272氨基酸肽段为主要的脂质结合域，Dr.Fan早期曾对多种属间的apoE的C端脂质结合域(第200-299位氨基酸肽段)进行了比较，提出其螺旋结构中的保守肽段(第253-289氨基酸残基)和234-254氨基酸肽段可能是发挥脂质结合能力的主要结构，并对全长apoE进行的核磁共振光谱学分析，显示绞链区肽段(第192-215位氨基酸肽段)对于调控功能结构域间的相互作用发挥着重要作用。

鉴于apoE在脂质代谢中的重要性及多态性的异构体“失功能性”，靶向增加机体正常功能的apoE水平，有望成为防治动脉粥样硬化的重要策略。但是，apoE(34kD)含有299个氨基酸，要获得高表达产率的apoE目前并未成功，其次全长的apoE作为治疗药物应用于临床还存在一些其它问题，包括溶解度低、易于在体内被酶降解产生细胞毒性片段，作为药物开发时分子量较大且结构复杂，同时以基因工程技术手段进行apoE的基因调控也存在着种属间的免疫原性和安全性及器官特异性等问题。因此，为克服这些问题，已开始发展取代全长apoE、构建结构简单的小分子apoE功能拟肽，将有可能发展靶向apoE的As及相关重大疾病的防治新策略。

已公认apoE含LDLR结合域的片段具有抗炎抗氧化作用；而脂质结合区可促进巨噬细胞胆固醇的外流，尤其是其含有至少2个两性螺旋时。故Datta课题组巧妙设计并通过化学合成方式了得到一种小分子apoE衍生肽：Ac-hE18A-NH₂。其选择apoE中保守性的LDLR结合域序列与apoAI来源的18个氨基酸残基的两性螺旋结合而成，该肽具有介导血浆VLDL/LDL的清除及促巨噬细胞胆固醇外流的作用，并显示了抗炎和抗氧化的活性，同时该小分子拟肽具有类似于apoE的体内再循环现象，故显著延长了拟肽的体内半衰期及其生物学效应。尽管此肽还存在含异源性18个氨基酸残基，可能会潜在地引起人体的免疫反应，随时间而削减它的治疗效力，但此肽的合成和相关功能研究给我们带来了光明：小分子apoE拟肽具有发展成为动脉粥样硬化及其所致心脑血管疾病等相关疾病的治疗药物。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种重组的人apoE模拟活性肽(拟肽)，其基本结构为：NH₂-CLRKLRKRLLRKKKKKKQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE-COOH，其中包含了一段apoE的LDLR结合区(第141-150位氨基酸肽段)和一段apoE的脂质结合区(第234-254位氨基酸肽段)，apoE拟肽具有明显的结合HDL，增强巨噬细胞的胆固醇外流及抗炎抗氧化活性。

本发明的另一个目的是在于提供了一种重组人apoE拟肽的制备方法，本发明利用基因工程技术构建重组原核表达载体，于细菌中表达的重组apoE拟肽经过chitin beads及heparin Sepharose CL-6B两步亲和层析得到纯化的apoE拟肽。其优点是产率高、成本低、纯化流程简单、可获得无任何标签的高纯蛋白，其制备过程中氨基酸序列出错率明显低于化学合成法，并且易于规模化表达和纯化，更易获得高量纯品肽。

本发明的再一个目的是在于提供了一种重组人apoE拟肽在作为制备治疗或预防动脉粥样硬化所致冠心病、心肌梗塞、中风等心脑血管疾病药物中的应用。这种重组的人apoE拟肽(EpK)可增强HDL介导的巨噬细胞胆固醇外流和抑制巨噬细胞炎症反应，并增加细胞抗氧化应激的能力。本发明制备的EpK在血循环中具有与HDL结合的特征，并显著提高HDL介导细胞胆固醇外流和抑制巨噬细胞炎性因子表达，这种针对性改善HDL功能的机制在抗动脉粥样硬化的治疗上显示了重要的应用潜能，可以采用现有技术已知的合适方法，例如胃肠外施用，可以是部位特异性的或者进入全身血流的方式(包括通过静脉、肌肉或经皮注射)，施用本发明的重组apoE拟肽，用以防治机体主要动脉的粥样硬化病变，包括冠状动脉，供应中枢神经系统的颈动脉，及外周循环或内脏循环动脉的粥样硬化病变，尤其涉及动脉粥样硬化所致的冠心病、心肌梗塞、中风等严重心脑血管疾病的防治。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明设计并得到一种重组的人apoE拟肽(命名为EpK)，其包含了一个氨基端(NH₂-)的半胱氨酸(Cys，C)残基、一段apoE的LDLR结合区(第141-150位的LRKLRKRLLR肽段)、六个赖氨酸(Lys，K)的连接子区和羧基端(-COOH)的apoE的脂质结合区(第234-254位的QVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE肽段)，故其基本结构为：NH₂-CLRKLRKRLLRKKKKKKQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE-COOH。本发明得到的EpK，来源于基因工程技术制备，利用原核表达体系表达并经两步亲和层析可得到纯化的多肽。由于多肽较短(含38个氨基酸残基的肽段)，故制备中也可选择利用化学合成法合成。

一种重组人apoE拟肽的制备方法，其步骤是：

(1)重组载体的构建及EpK肽的表达：

利用人apoE的结构功能域，设计了一种含人apoE的一段N端LDLR结合区(第141-150位氨基酸肽段)和一段C端脂质结合区(第234-254位氨基酸肽段)的衍生肽(EpK)，此肽包含N端的一个半胱氨酸(Cys)，通过六个赖氨酸(Lys，K)残基连接apoE的LDLR结合区及脂质结合区。

所述的人apoE的N端LDLR结合区为第141-150位的LRKLRKRLLR肽段；所述的人apoE的C端脂质结合区为第234-254位的QVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE肽段。

首先利用BLAST软件(NCBI)设计寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应(PCR)合成编码EpK的DNA序列，DNA序列亚克隆插入到pTWIN1载体(购于New EnglandBiolabs)中与N端内含肽融合。

重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21pLysS(购于Stratagene)感受态细胞，利用LB(Luria-Bertani)培养平板筛选(含100mg/L氨苄青霉素)，证实EpK可于BL21pLysS细菌中高效表达，然后于37℃液体LB培养基培养细菌直到OD₆₀₀达到0.8～1.0，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)至终浓度0.5mM，再于25℃诱导蛋白表达8～10小时。

(2)EpK肽的纯化：

离心收集诱导表达的细菌沉淀，菌体沉淀用buffer B1(20mM Tris-HCl，pH8.5，500mM NaCl，1mM EDTA)重悬并超声裂解，然后进行EpK的两步纯化：首先，细胞提取物上样到装有Chitin beads的层析柱，用buffer B1洗去未结合的蛋白质。加入buffer B2(20mM Tris-HCl，pH7.0，500mM NaCl，1mM EDTA)于室温(20-25℃，以下相同)下平衡过夜，使Chitin beads上的intein tag剪切，然后，用足量的buffer B2洗脱目的多肽。第二步，洗脱出的多肽用10mM磷酸盐结合缓冲液(PBS，含100mM NaCl，pH7.4)按1∶10比例稀释，并上样至肝素亲和柱(Heparin Sepharose CL-6B)中，然后用15倍柱床体积的PBS(含200mM NaCl，pH7.4)，洗去微量的未结合的intein tag、chitin结合区蛋白(CBD)以及其他的杂质蛋白。目的多肽EpK最后通过增高NaCl的浓度而洗脱，即收集含500～600mM NaCl的梯度洗脱液，并在10mM NH₄HCO₃进行透析，最后冻干保存EpK粉末。

采用pTWIN1表达载体，其优点是利用其内可诱导的Intern蛋白剪切活性将靶蛋白肽链与亲和标签(tag)分离开，无需外源蛋白酶，可通过亲和层析获得N端为Cys的重组蛋白。

(3)纯化后EpK肽的鉴定：

EpK的最终产率是1L LB培养菌获得5～10mg，经15％还原型SDS-PAGE证实两步纯化后为一条蛋白带，提示为高纯的多肽(图1A)。一种分离的多肽，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。如图1B，质谱证实了其正确的分子量(4686.981对应推算的4654.69)、纯度和部分二聚体的形成(分子量9397.116对应推算的9307.364)。EpK的冻干粉溶于PBS至1mg/ml[在PBS中的最大溶解度可达10mg/ml(～2mM)]。

(4)重组人apoE拟肽(EpK)的结构功能：

A、EpK包含人apoE的一段N端LDLR结合区(LRKLRKRLLR)和一段C端脂质结合区(QVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE)，此肽N端加有一个半胱氨酸(Cys)，并通过六个正电荷的Lys连接apoE的LDLR结合区及脂质结合区。Lys可增加EpK溶解性，并通过Lys侧链与磷脂酰基尾端的疏水性相互作用，以及带正电的Lys氨基与带负电的磷脂头部基团的亲水性相互作用，增强EpK与磷脂结合的亲和力。此特点通过EpK易于与富含磷脂的HDL结合实验证实。

B、本发明采用新型原核表达载体pTWIN1(New England Biolabs)构建含EpK DNA的重组表达载体，于BL21pLysS细菌中表达的重组肽经过chitin beads及heparinSepharose CL-6B两步亲和层析得到了无任何标签的含38个氨基酸的高纯EpK肽。此法优点是产率高、成本低、纯化流程简单、制备过程中氨基酸序列出错率明显低于化学合成法，无需化学合成法的特殊精密设备，并且易于规模化表达和纯化，获得高量纯品肽。

C、本发明通过亲和层析获得了N端为Cys的重组EpK。N端Cys可促使分子间反应，形成靶分子的二聚体，在保证多肽形成特定模体、结构域而具有功能活性的基础上，二聚体的结构提供了EpK双倍的功能，即增强LDLR结合区和脂质结合区的能力。

D、EpK具有apoE的α螺旋二级结构及脂质结合活性，这与EpK涉及介导细胞胆固醇外流作用密切相关。

E、EpK优先与HDL结合，可通过DMPC结合实验证实，EpK较全长的apoE3与较大的DMPC囊泡结合动力学更慢。此特征也赋予EpK一些优势：①因为不结合VLDL和LDL，EpK不会很快通过LDLR从血浆中清除，故EpK在循环中的半衰期延长；②EpK主要与HDL结合从而明显增强HDL的功能。

F、EpK在体内外实验中显示了与脂蛋白结合的部位。利用人全长的apoE3作比较，无论EpK与体外的血清孵育，还是EpK注射入血液后，均显示EpK没有与VLDL或很少和LDL相结合，而主要存在于HDL组分中，从而也说明了EpK注射入体内并不降低血浆胆固醇水平和改变脂蛋白分布的现象。

一种重组人apoE拟肽在作为制备治疗或预防在动脉粥样硬化所致冠心病、心肌梗塞、中风等心脑血管疾病药物中的应用，其应用的机制与过程是：

apoE在脂蛋白代谢和抗动脉粥样硬化发生发展中发挥关键作用，其机制涉及促进循环中胆固醇的清除和血管壁巨噬细胞胆固醇的外流，抗氧化、抗炎等作用。其可存在于VLDL和乳糜微粒中，也作为HDL中主要载脂蛋白实现HDL的抗动脉粥样硬化功能，降低或减轻了动脉粥样斑块的形成，对防治动脉粥样硬化所致冠心病、心肌梗塞、中风等心脑血管疾病有巨大的应用前景。

(1)本发明的EpK在体外细胞实验中表明，EpK介导荷载胆固醇的巨噬细胞的胆固醇外流。此与apoE及其他apoE拟肽的报道结果一致。EpK肽C端的脂质结合区可能涉及介导胆固醇外流作用有关。

本发明的EpK易于与HDL结合，在体外实验中显示了与缺乏apoE的HDL结合后，可增强HDL作为胆固醇接受体的功能，促巨噬细胞胆固醇外流。

(2)炎症是重要的介导动脉粥样硬化过程中的一个方面。本发明的EpK在体外细胞实验中有效地抑制LPS刺激的巨噬细胞炎症反应。和来源于apoE^-/-小鼠的HDL结合后，也显示抑制LPS诱发的巨噬细胞炎症因子的表达，相比而言，含EpK的HDL较apoE缺乏的HDL具有更加有效的抗炎功能。EpK多肽N端的LDLR结合区可能与其抗炎功能有关。

本文中采用来源于apoE^-/-小鼠的腹腔巨噬细胞或THP-1源性巨噬细胞，分别经LPS刺激产生炎症因子作为炎症典型的细胞模型，此上的结果说明本发明的EpK可单独使用或与其它已知的抗炎因子组合用于治疗一些急慢性炎性相关的疾病中，包括动脉粥样硬化，急、慢性神经系统疾病如阿尔茨海默氏症等。

(3)抗氧化作用是apoE抗动脉粥样硬化的功能之一。已经证明HOX-1可通过抗氧化应激和抗炎而具有防治动脉粥样硬化的作用。一些致动脉粥样硬化的刺激因素如高血压、氧化脂质和LPS都可以诱导HOX-1的表达。我们的实验证明，无论是基础水平还是oxLDL刺激下，EpK均可增强巨噬细胞中HOX-1的表达。因此，诱导HOX-1的表达是EpK抗动脉粥样硬化的又一有益的特性。

(4)本发明中EpK的体内实验均通过静脉、肌肉或经皮注射进入全身血流的方式施用。说明可采用现有的胃肠外施用的合适技术方法部位特异性的或者直接进入全身血液循环，施用本发明的重组apoE拟肽，用以增强血液中HDL的抗动脉粥样硬化功能，防治机体主要动脉的粥样硬化病变，包括冠状动脉，供应中枢神经系统的颈动脉，及外周循环或内脏循环动脉的粥样硬化病变，尤其涉及一种重组人apoE拟肽在作为制备治疗或预防动脉粥样硬化所致的冠心病、心肌梗塞、中风等严重心脑血管疾病药物中的用途。

本发明与现有apoE拟肽相比，具有以下优点和效果：

(1)本发明中设计的EpK的重要特征之一，是同时包含了人apoE的一个LDLR结合区和一个脂质结合区，具有α螺旋结构，其中LDLR结合区提供了其抗炎作用，而脂质结合区是其与脂蛋白结合的基础；

(2)本发明中设计的EpK的重要特征之一，其N端的Cys残基介导了二聚体的形成，EpK二聚体通过脂质结合区作用可有效地结合于脂蛋白表面，双倍的LDLR结合区和脂质结合区可增强EpK的功能。

(3)本发明中的EpK结构中在LDLR结合区与脂质结合区间有6个带正电荷的Lys，可增加EpK的溶解度，并增强EpK与磷脂结合的亲和力。6个Lys连接体还可能在EpK被细胞摄取时保护其免遭内涵体-溶酶体的降解，这就使得EpK有机会重新循环至血浆。

(4)本发明中的EpK来源于重组载体在细菌表达体系中的表达与纯化的制备。与其他研究中的化学合成的apoE拟肽相比，其纯化流程简单、可获得无任何标签的高纯蛋白，产率约为5～10mg/L LB培养基，且序列出错率、所需费用也明显低于化学合成法，并且更易规模化表达和纯化，获得大量纯品肽。

(5)本发明中的EpK易于结合HDL，与EpK结合的HDL增强了介导巨噬细胞胆固醇外流和抑制LPS刺激引起的巨噬细胞炎症反应，可改善HDL的功能；

(6)本发明中的EpK还可增强巨噬细胞抗氧化的活性。

(7)本发明中的EpK选择了人apoE的脂质结合区作为EpK肽的C端，这样更好地消除了对人体潜在的免疫反应。

附图说明

图1显示了重组的人apoE拟肽(EpK)的两步纯化结果及纯化EpK的质谱特征。A.SDS-PAGE鉴定，分别显示第一步及第二步纯化的EpK产品；B.纯化EpK的质谱图证实了其正确的分子量。

图2显示了EpK肽的二级结构及脂质结合活性.A.溶液中EpK肽的远紫外圆二色谱图说明EpK易倾向于形成α螺旋结构；B.24℃下EpK与DMPC囊泡孵育，A₄₉₀的时间曲线显示EpK与脂质的结合及随时间对囊泡的显著清除效率，但较对照的完整apoE3的清除率低，其中清除1/2的时间，EpK为10分钟，apoE3仅为3分钟。

图3显示了EpK肽未介导血浆胆固醇的清除，但主要与血浆HDL结合。A.100μg溶于PBS的EpK或全长人apoE3眼眶后静脉注射入apoE^-/-小鼠体内，在所示时间点采取血样检测血浆胆固醇水平，显示对照的apoE3注射后可立即显著降低小鼠血浆胆固醇水平并持续至少4小时，而EpK并没有改变小鼠血浆胆固醇水平；B.收集apoE^-/-小鼠注射EpK后的血浆，及未注射EpK的小鼠血浆体外与EpK孵育，分别进行快速蛋白液相色谱(FPLC)，显示脂蛋白胆固醇分布无明显差异；C.Western blot检测EpK在不同FPLC组分中的分布，表明EpK主要与HDL联系，而没有与VLDL或很少和LDL相结合，解释了EpK注射入体内并不降低血浆胆固醇水平的现象。D.显示人apoE3注射入小鼠后的血浆FPLC组分Western blot作为对照，可见apoE3能与各种脂蛋白结合。

图4显示了EpK肽增强巨噬细胞胆固醇外流和抑制LPS诱导产生的巨噬细胞炎症反应。A.原代培养的apoE^-/-小鼠腹腔巨噬细胞通过3天的acLDL孵育进行胆固醇荷载，然后分别用含人apoAI，人全长apoE3或EpK的DMEM孵育，与相同量的人apoAI和apoE3比较，20μg/ml EpK显示了更高的介导巨噬细胞胆固醇外流的能力，*P＜0.01，n＝3；B-D.来源于apoE^-/-小鼠腹腔巨噬细胞经LPS(100ng/ml)和所示浓度的EpK处理6h，提取细胞总RNA进行实时定量PCR检测，显示5μg/ml和10μg/ml的EpK均显著降低LPS诱导的巨噬细胞TNFα(图4B)、IL6(图4C)和MCP1(图4D)三种致炎因子的表达。与LPS组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，n＝3。

图5显示了含EpK的HDL增强巨噬细胞的胆固醇外流并抑制LPS诱导产生的巨噬细胞炎症反应。A.apoE^-/-小鼠注射EpK后的血浆HDL作为胆固醇接受体，利用THP-1衍生的巨噬细胞进行胆固醇外流实验，可见作用4h时，含EpK的HDL介导胆固醇外流作用明显高于不含EpK的HDL(*P＜0.01)；B-D.来源于THP-1的巨噬细胞经LPS(50ng/ml)刺激和含或不含EpK的HDL(100μg胆固醇/ml)处理6h，提取细胞总RNA进行实时定量PCR检测，显示含EpK的HDL能更有效抑制LPS诱导的THP-1源性巨噬细胞IL6(图5B)、IL-1β(图5C)和CCL2(图5D)三种细胞因子的表达，表明EpK与HDL的结合使apoE^-/-小鼠的HDL更具抗炎活性。(与LPS组比较，*P＜0.05，*^#P＜0.01，n＝3)

图6显示了EpK增强小鼠原代腹腔巨噬细胞中血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HOX-1)的表达。无论有无oxLDL的刺激，5μg/ml和10μg/ml的EpK都能显著提高HOX-1的表达(*P＜0.01)，说明EpK可进一步增强巨噬细胞抗氧化和抗炎作用的HOX-1活性而有益于防治动脉粥样硬化。

具体实施方式

以下实施例仅用于举例说明本发明，而不应被视为是对本发明的限制。

实施例1：设计重组载体及EpK肽的纯化鉴定

本发明设计了一种含人apoE的一段N端LDLR结合区和一段C端脂质结合区的衍生肽(EpK)，此肽包含N端的一个半胱氨酸(Cys)，一个apoE LDLR结合区(第141-150位的LRKLRKRLLR肽段)，其后通过6个Lys残基连接一个apoE脂质结合区(第234-254位的QVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE肽段)。

EpK的38个氨基酸序列如下：

NH₂-CLRKLRKRLLRKKKKKKQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE-COOH

本发明利用基因工程技术构建重组载体，于细菌中表达的重组肽经过chitin beads及heparin Sepharose CL-6B两步亲和层析得到一种纯化的重组人apoE拟肽(EpK)，其具体步骤是：

(1)重组载体的构建及EpK肽的表达：

首先利用BLAST软件(NCBI)设计寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应(PCR)合成编码EpK的DNA序列，DNA序列亚克隆插入到pTWIN1载体(购于New EnglandBiolabs)中与N端内含肽融合。

编码EpK的DNA序列如SEQ ID N0：2所示，具体的为：

5’TGCCGCCGCAAATTACGCAAGCGTCTGCTGCGCAAGAAGAAGAAAAAGAAGCAGGTGGCCGAGGTCCGTGCCAAGTTAGAAGAACAGGCACAGCAGATCCGCCTGCAAGCGGAG 3’

重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21pLysS(购于Stratagene)感受态细胞，利用LB培养平板筛选(含100mg/L氨苄青霉素)，过夜生长出单菌落，挑取单菌落液体LB培养基培养，Western blotting证实EpK成功于BL21pLysS细菌中高效表达，然后在37℃液体LB培养基培养细菌直到OD₆₀₀达到0.8～1.0，加入终浓度0.5mM的IPTG，再于25℃诱导蛋白表达8～10小时。

(2)EpK肽的纯化：

离心收集诱导表达的细菌沉淀，菌体沉淀用buffer B1(20mM Tris-HCl，pH8.5，500mM NaCl，1mM EDTA)重悬并超声裂解，然后进行EpK的两步纯化：首先，细胞提取物上样到装有Chitin beads的层析柱，用buffer B1洗去未结合的蛋白质。加入buffer B2(20mM Tris-HCl，pH7.0，500mM NaCl，1mM EDTA)于室温(20-25℃，以下相同)下平衡过夜，使Chitin beads上的intein tag剪切，然后，用足量的buffer B2洗脱目的多肽。第二步，洗脱出的多肽用10mM磷酸盐结合缓冲液(PBS，含100mM NaCl，pH7.4)按1∶10比例稀释，并上样至肝素亲和柱(Heparin Sepharose CL-6B)中，然后用15倍柱床体积的PBS(含200mM NaCl，pH7.4)，洗去微量的未结合的intein tag、chitin结合区蛋白(CBD)以及其他的杂质蛋白。目的多肽EpK最后通过增高NaCl的浓度而洗脱，即收集含500～600mM NaCl的梯度洗脱液，并在10mM NH₄HCO₃进行透析，最后冻干保存EpK粉末。

(3)纯化后EpK肽的鉴定：

EpK的最终产率是1L LB培养菌获得5～10mg，经15％还原型SDS-PAGE证实两步纯化后为一条蛋白带，提示为高纯的多肽(图1A)。一种分离的多肽，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。如图1B，质谱证实了其正确的分子量(4686.981对应推算的4654.69)、纯度和部分二聚体的形成(分子量9397.116对应推算的9307.364)。EpK的冻干粉溶于PBS至1mg/ml[在PBS中的最大溶解度可达10mg/ml(～2mM)]。

(4)表达和纯化人apoE3

本发明的apoE拟肽(EpK)的生物活性鉴定利用了全长的人apoE3作为对照。采用慢病毒载体PWPI-apoE3转染HEK293T细胞，高表达人的apoE3和GFP。以GFP标记的细胞进行分类以获得稳定表达apoE3的HEK293T细胞系，收集培养液直接用HeparinSepharose CL-6B柱纯化apoE3，目的蛋白用含350～500mM NaCl的梯度洗脱液洗脱，并置于10mMNH₄HCO₃中透析，经15％SDS-PAGE证实为高纯的apoE3，冻干保存。实验时用PBS溶解至蛋白浓度为1mg/ml。

实施例2：纯化的EpK肽二级结构及结合脂质活性的特征检测

ApoE具有很高的α螺旋结构，根据设计的EpK肽序列包含人apoE的一部分LDLR结合区和一个脂质结合区，基于蛋白质二级结构预测软件(Network Protein SequenceAnalysis)预测，EpK可能含有89.74％的α螺旋结构，为证实EpK形成α螺旋的能力，我们采用圆二色法分析了EpK的二级结构，并用DMPC结合实验将EpK和人全长的apoE3进行对比，观察它们同脂质结合的能力。

(1)EpK肽的二级结构特征鉴定

圆二色法(Circular dichroism，CD)测量EpK肽的二级结构，即于37℃，采用0.2cm液层厚度的比色皿测量样品远紫外区(190-260nm)的光谱图，扫描过程中电脑温控变化在0.2℃以内。EpK样品浓度为0.25mg/ml，溶于10mM磷酸钾溶液中(pH7.0)，或溶于25％或50％的三氟乙醇(2，2，2-trifluoroethanol，TFE)中。二级结构检测如图2A，在10mM磷酸钾缓冲液中EpK的α螺旋含量很低，只有16.9％；然而在25％或50％TFE(一种α螺旋结构稳定剂)中，α螺旋的含量分别提高至63.1％和81.5％，这说明EpK具有易于形成α螺旋的结构。EpK在TFE溶液中易于形成两性α螺旋结构的趋势是其脂质结合活性的构象基础。

(2)EpK肽的脂质结合活性

为验证EpK的脂质结合能力，我们用完整的人apoE3作为对照，进行了DMPC结合实验，将10mg二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC，Avanti Polar Lipids Inc.，Alabaster，AL)溶于氯仿/甲醇(3∶1v/v)混合液中并用氮气干燥。预热的1ml缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.2，250mM NaCl，and 1mM EDTA)加入使脂质终浓度为10mg/mL，30秒涡旋混匀数次，监测蛋白质诱导DMPC囊泡转化为蛋白质/DMPC盘状复合物的时间。将100μg DMPC囊泡和100μg EpK或者apoE3的溶液置于24℃恒温比色杯中，混合溶液5-10秒，通过分光光度计(SpectraMax M5)监测490nm处吸光度值(A₄₉₀)，反映DMPC囊泡溶液的清除率。(注：所有的试剂实验前都于24℃预温)。如图2B，EpK浓度为0.25mg/ml时，可以明显观察到DMPC囊泡溶液从混浊变成清亮，这个结果同人全长的apoE孵育1h的结果一样。但EpK的清除率远远小于apoE3：清除1/2的时间，EpK为10分钟，apoE3仅为3分钟。即相对于apoE3而言，EpK结合DMPC囊泡的动力学较慢。总之，DMPC结合实验支持EpK能和DMPC囊泡结合并将其转化成更小的颗粒，此也进一步证实了它的脂质结合能力。

(3)EpK肽与血浆脂蛋白的结合

利用apoE^-/-小鼠进行体内外实验，检测EpK是否与血浆脂蛋白结合及结合的部位。本实验采用的apoE^-/-小鼠(来源于Jackson Laboratory)模型，饲养于武汉大学中南医院的动物实验中心(SPF级)。动物饲养过程和实验方法均获得湖北省动物饲养和使用委员会的批准。

apoE^-/-小鼠分两组，一组收集小鼠血浆，将90μl血浆与10μl EpK(终浓度为0.1mg/ml)共孵育30min后进行快速蛋白液相色谱(FPLC)分离不同脂蛋白组分。另一组小鼠预先注射100μg EpK入血液，30min后收集血浆进行FPLC分离，即分别取100μl的小鼠血浆上样于AKTApurifier(GE Healthcare)系统的Superose610/200GL凝胶层析柱，流动相(0.15mol/L NaCl、0.01mol/L Na₂HPO₄和0.1mol/LEDTA，pH 7.5)，流速0.5ml/min。样品连续收集40管，每管0.5ml。小鼠血浆胆固醇水平采用胆固醇检测试剂盒(Raichem)进行酶法比色测定。如图3B，EpK进入体内血循环，短时间对血浆脂蛋白的分布及血浆胆固醇水平不产生影响。

随后利用羊抗人apoE抗体(50A-G1b，Academy Biomedical)可识别EpK，采用Westernblot检测EpK是否与脂蛋白组分结合，即EpK在不同FPLC组分中的分布。将FPLC分离得到的样品管各取30μl进行15％SDS-PAGE，然后凝胶中蛋白被转印到NC膜(Amersham Biosciences)，采用羊抗人apoE抗体(50A-G1b，Academy Biomedical)和HRP标记的兔抗羊IgG孵育，ECL试剂盒(Amersham Bioscieces)显色，检测FPLC的不同分离组分中EpK的分布，同时采用人全长apoE3注射入小鼠血液，30min后收集血浆进行FPLC分离及Western blot检测，用于对照。图3C显示了体外孵育实验中，EpK存在于FPLC第28-40管的洗脱组分(HDL和不含脂质的部分)，而体内注射实验中EpK主要存在于FPLC第28-37管的洗脱组分(HDL部分)，仅检测到极少量EpK存在于FPLC第24-27管(LDL)和第38-40管(不含脂质)的部分中，而apoE3的体内外对照实验显示(图3D)，apoE3可结合VLDL、LDL和HDL的任何部分，尤其以结合VLDL和LDL为主。这表明EpK与apoE3不同，主要与血浆中HDL结合，而与VLDL或/和LDL很少结合，此实验可解释了EpK注射入体内并不降低血浆胆固醇水平的现象。

尽管EpK带有LDLR结合区及较强的肝素结合活性，但为什么EpK未与VLDL和LDL结合目前还不清楚，我们推测是EpK优先与较小的脂蛋白如HDL结合，可能是因为HDL有更多弯曲的富含磷脂的表面，正如DMPC结合实验显示，相对于全长的apoE3，EpK应用更慢的动力学与较大的DMPC囊泡结合，故可能EpK首先与HDL结合。

检测到EpK优先与HDL结合，这也赋予EpK一些优势：①因为不结合VLDL和LDL，EpK不会很快通过LDLR从血浆中清除，故EpK在循环中的半衰期延长；②EpK主要与HDL结合从而有利于明显增强HDL的功能，此将在下面的实施例中证实。

实施例3：EpK增强巨噬细胞胆固醇外流和抑制巨噬细胞炎症

利用小鼠腹腔原代巨噬细胞对纯化的EpK进行功能评价。检测EpK是否介导荷载胆固醇的巨噬细胞中胆固醇的外流。其次，检测EpK是否抑制原代apoE^-/-小鼠腹腔巨噬细胞经LPS诱导产生的炎症反应。apoE^-/-小鼠(来源于Jackson Laboratory)模型，饲养于武汉大学中南医院的动物实验中心(SPF级)。

(1)细胞培养：

为得到小鼠的巨噬细胞，采用3ml 3％thioglycollate小鼠腹腔内注射，3天后小鼠行安乐死，用10ml PBS灌流收集小鼠腹腔巨噬细胞。细胞接种于6孔或24孔细胞培养板，含10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)(均购于GIBCO)培养1h，然后用无FBS的DMEM洗涤2次以洗去未贴壁的细胞，贴壁的巨噬细胞以适宜的培养基培养。

(2)巨噬细胞胆固醇外流

培养于24孔板的小鼠巨噬细胞，加入100μg/ml³H-胆固醇的乙酰化LDL(acLDL)孵育3天进行胆固醇荷载，其后更换含一定量EpK的DMEM培养24小时。实验时加入100μg/ml ³H-胆固醇(购于PerkinElmer)的乙酰化LDL(acLDL，购于BiomedicalTechnologies)。培养48小时，然后分别加入含人apoAI，人全长apoE3(hapoE3)或EpK的DMEM孵育，作为引发胆固醇外流的培养基，并分别于1小时和4小时取出培养液。在4小时的时间点，完全去除培养液并用PBS洗涤细胞2次，细胞用异丙醇溶解收集，利用Beckman LS6500液闪仪进行培养基和细胞³H放射性计数。以³H外流的百分率计算胆固醇外流率。

与只有DMEM(不含外源性的胆固醇接受体)孵育相比，加10μg/ml EpK可增加细胞的胆固醇外流为1.3％～6.1％，加入20μg/ml EpK则进一步增加胆固醇外流至13.4％，而蛋白浓度为20μg/ml时，apoAI介导10％的胆固醇外流，apoE3介导胆固醇外流率为9.7％，与相同量的人apoAI和apoE3比较，EpK显示了更高的介导巨噬细胞胆固醇外流的能力(P＜0.01)(图4A)。

(3)巨噬细胞炎症因子的检测

采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)技术我们检测巨噬细胞受LPS刺激后EpK对细胞炎症因子TNFα、IL-6、MCP-1mRNA表达水平的影响。从小鼠腹腔新取出的巨噬细胞在含10％FBS的DMEM培养基中贴壁1小时，用DMEM洗涤两次后在无血清的DMEM中培养过夜，然后用含50ng/ml LPS的DMEM更换培养基，同时给予适量EpK(μg/ml级别)进行处理。培养6小时后弃去培养基并用DMEM洗涤细胞两次，采用的Trizol试剂(Invitrogen)和RNeasy试剂盒(Qiagen)提取细胞总RNA，使用iScript cDNA Synthesis试剂盒(Bio-Rad)进行逆转录合成cDNA，于EppendorfRealplex² Mastercycler(Eppendprf)进行qPCR检测目标基因mRNA的水平。

以小鼠18s rRNA为内参基因。qPCR的引物序列如下：

小鼠18s rRNA正向引物：5’CGCGGTTCTATTTTGTTGGT 3’；

反向引物：5’AGTCGGCATCGTTTATGGTC 3’；

小鼠TNFα正向引物：5’CGTCAGCCGATTTGCTATCT 3’；

反向引物：5’CGGACTCCGCAAAGTCTAAG 3’；

小鼠IL-6正向引物：5’AGTTGCCTTCTTGGGACTGA3’

反向引物：5’TCCACGATTTCCCAGAGAAC 3’

小鼠MCP-1正向引物：5’AGGTCCCTGTCATG CTTCTG 3’

反向引物：5’TCTGGACCCATTCCTTCTTG 3’

采用GraphPad PRISM软件进行统计学分析，组间平均值差异使用one-way ANOVA和student t-tests显示。P＜0.05认为有显著性差异。如图4B-4D，与仅含DMEM培养基的空白组，LPS显著增加巨噬细胞中TNFα、IL6和MCP1三种细胞因子mRNA的表达水平，与LPS组比较，加入5μg/ml和10μg/ml的EpK均显著降低LPS所致TNFα、IL6和MCP1三种因子的表达(*P＜0.05，**P＜0.01)。

实施例4：体内外实验检测含EpK的HDL的功能

通过纯化的EpK二级结构及其脂质结合活性的研究实施例中，证实EpK与apoE3不同，主要与血浆中HDL结合，而与VLDL或/和LDL很少结合。为进一步研究EpK和HDL的结合对机体脂蛋白代谢的影响，能否增强HDL抗动脉粥样硬化的相关功能。

HDL抗动脉粥样硬化的众多作用中，介导胆固醇逆向转运和抗炎两个功能尤为重要，而且可能存在本质上相互联系。我们利用体内外实验，从EpK与apoE^-/-小鼠HDL结合的角度观察对机体血浆胆固醇的清除及对巨噬细胞胆固醇外流和巨噬细胞炎症反应的影响。

(1)进入体内的EpK结合HDL，但不介导血浆胆固醇的清除

根据实施例2中体内外实验证实EpK与血浆脂蛋白的结合分布，EpK主要存在于FPLC洗脱的HDL组分，仅极少量EpK存在于FPLC洗脱的LDL和无脂部分。进一步利用100μg溶于PBS的EpK或全长人apoE3眼眶后静脉注射入4月龄的apoE^-/-小鼠体内，并于注射后1min、10min、30min、1h、2h、4h和24h采取30μl血样检测血浆胆固醇水平。结果显示，对照的apoE3注射后可立即显著降低血浆胆固醇水平，并持续至少4小时，而EpK并没有改变apoE^-/-小鼠血浆胆固醇水平(图3A)。

结合实施例2中的体内外实验，无论EpK进入小鼠体内30min后收集血清进行FPLC检测，还是EpK与血浆孵育后30min后进行FPLC检测，结果EpK注射组的脂蛋白分布无显著变化(图3B)。Western blot检测比较apoE3和EpK在FPLC不同组分中的分布，图3C-3D显示了人apoE3注射入小鼠后的血浆，可见apoE3能与各种脂蛋白结合。而EpK尽管带有LDLR结合区及较强的肝素结合活性，但注射EpK入apoE^-/-小鼠主要与HDL联系，与VLDL或很少和LDL相结合，故不介导血浆胆固醇的清除，这也合理解释了EpK注射入体内并不降低血浆胆固醇水平及改变脂蛋白分布的现象。

(2)含EpK的HDL增强巨噬细胞的胆固醇外流

本实验我们收集实施例2中注射过EpK的apoE^-/-小鼠的血浆FPLC第30-37管HDL组分，同样以注射过PBS的apoE^-/-小鼠血浆FPLC相同组分作为对照，通过centricom(Millipore)浓缩样品HDL组分，并经0.45μm滤器过滤除菌。

利用30ng/ml的PMA诱导人单核细胞系THP-1细胞3天使其分化成巨噬细胞，以HDL作为胆固醇接受体进行胆固醇外流实验，将100μg/ml ³H标记的acLDL孵育细胞48h荷载胆固醇后，洗涤、更换含有100μg胆固醇/ml HDL(胆固醇受体)的RPMI培养基继续培养细胞。分别于1h和4h时间点收集培养基进行³H放射性计数，在4h点培养基被完全除去，PBS洗涤细胞2次后，异丙醇溶解细胞，检测细胞的³H放射性计数。胆固醇外流率以计算外流³H的百分比表示。

结果如图5A显示，在1h时间点，与单纯RPMI1640培养基相比，无论是否含有EpK的HDL都显著增强了细胞胆固醇的外流(5.78％，4.86％vs 0.93％；P＜0.01)，但有无EpK结合的HDL在介导胆固醇外流的能力上并无明显不同(5.78％vs 4.86％)。而在4h时间点，含EpK的HDL介导胆固醇外流的作用明显高于不含EpK的HDL(10.58％vs 7.42％，P＜0.01)。

(3)含EpK的HDL抑制巨噬细胞炎症反应

我们继续利用THP-1源性巨噬细胞，检测是否含EpK的HDL能更有效抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。实验首先用30ng/mlPMA诱导THP-1细胞3天分化成巨噬细胞，以LPS(50ng/ml)刺激THP-1源性巨噬细胞，同时加入含有EpK的HDL(100μg胆固醇/ml)共孵育，实验设立不含EpK的HDL为对照组。LPS和HDL共孵育6h后，采用的Trizol试剂和RNeasy试剂盒提取细胞总RNA，并逆转录合成cDNA，实时定量PCR(qPCR)检测THP-1源巨噬细胞中IL6、IL-1β和CCL2三种细胞因子mRNA的表达。

以人的基因GAPDH为内参基因。qPCR的引物序列如下：

人GAPDH正向引物：5’GAGTCAACGGATTTGGTCGT 3’

反向引物：5’TTGATTTT GGAGGGATCTCG 3’

人IL-6正向引物：5’TACCCCCAGGAGAAGATTCC 3’

反向引物：5’TTTTCTGCCAGTGCCTCTTT 3’

人IL-1β正向引物：5’GGGCCTCAAGGAAAAGAATC 3’

反向引物：5’TTCTGCTTGAGAGGTGCTGA3’

人CCL₂正向引物：5’CCCCAGTCACCTGCTGTTAT 3’

反向引物：5’TGGAATCCTGAACCCACTTC 3’

结果如图5B-5D，显示LPS均明显刺激巨噬细胞中IL6、IL-1β和CCL2三种细胞因子的表达，来源于apoE^-/-小鼠的HDL无论是否含有EpK都显著抑制了IL6、IL-1β和CCL2这三种细胞因子的表达，但含EpK的HDL更加有效(P＜0.01)，表明来源于apoE^-/-小鼠体内的与EpK结合的HDL抗炎活性更高。

实施例5：EpK增强巨噬细胞中血红素加氧酶-1的表达

巨噬细胞血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HOX-1)具有抗氧化和抗炎的作用。我们检测EpK是否可以刺激小鼠原代巨噬细胞HOX-1表达。

apoE^-/-小鼠的原代腹腔巨噬细胞培养见实施例3中的方法，收集的巨噬细胞培养过夜，更换含50μg/ml氧化型LDL(oxidized LDL，oxLDL)和/或适量的EpK的新鲜DMEM培养6h后，采用的Trizol试剂和RNeasy试剂盒提取细胞总RNA，进行实时定量PCR检测HOX-1的mRNA表达水平。

仍以小鼠18s rRNA为内参基因。qPCR的引物序列如下：

小鼠18s rRNA正向引物：5’CGCGGTTCTATTTTGTTGGT 3’

反向引物：5’AGTCGGCATCGTTTATGGTC 3’

小鼠HOX-1正向引物：5’CACGCATATACCCGCTACCT 3’

反向引物：5’CCAGAGTGTTCATTCGAGCA3’

结果如图6显示oxLDL可明显增加HOX-1的mRNA表达(P＜0.01)，而无论有无oxLDL的刺激，加入5和10μg/ml的EpK都能显著提高HOX-1的表达(P＜0.01)，说明EpK可进一步增强巨噬细胞抗氧化和抗炎作用的HOX-1活性而有益于防治动脉粥样硬化。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉大学

<120>  一种重组人apoE拟肽及制备方法和应用

<130>  一种重组人apoE拟肽及制备方法和应用

<160>  2    

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  38

<212>  PRT

<213>  人工合成

<400>  1

Cys Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Lys Lys Lys Lys Lys

1               5                   10                  15     

Lys Gln Val Ala Glu Val Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln

            20                  25                  30         

Ile Arg Leu Gln Ala Glu

        35             

 

<210>  2

<211>  114

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  2

tgccgccgca aattacgcaa gcgtctgctg cgcaagaaga agaaaaagaa gcaggtggcc     60

gaggtccgtg ccaagttaga agaacaggca cagcagatcc gcctgcaagc ggag          114

Claims (5)

1.一种分离的重组人apoE拟肽EpK，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述重组人apoE拟肽EpK在制备治疗或预防动脉粥样硬化所致心脑血管疾病药物中的用途。

3.权利要求1所述的重组人apoE拟肽EpK在制备治疗或预防动脉粥样硬化所致冠心病药物中的应用。

4.权利要求1所述的重组人apoE拟肽EpK在制备治疗或预防动脉粥样硬化所致心肌梗塞疾病药物中的应用。

5.权利要求1所述的重组人apoE拟肽EpK在制备治疗或预防动脉粥样硬化所致中风疾病药物中的应用。

Images