JP2008502311A - 抗体 - Google Patents

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Abstract

抗体または断片が以下である、ヒト抗体断片：(i)アポリポタンパク質EのC末端ドメイン(ApoE-CTD)のSEQ ID NO:1に示されたアミノ酸配列またはその一部のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する；および(ii)ヒトプラークに結合する。

Description

発明の分野
本発明は、アポリポタンパク質E(ApoE)のC末端断片に特異的に結合する抗体に関する。本発明はまた、そのようなポリペプチドを得るための方法、ならびにアルツハイマー病、全身性アミロイドーシスおよび他のアミロイド疾患の診断および処置におけるそのようなポリペプチドの使用を提供する。
発明の背景
アミロイドーシスは、1つもしくは複数の器官または身体系におけるタンパク質の異常な沈着物を特徴とする原因不明の進行性、不治の代謝疾患である。アミロイドタンパク質は、例えば、うまく機能していない骨髄により生産される。アミロイドーシスは、蓄積されたアミロイド沈着物が正常な身体機能を損なう場合に起こるのだが、器官機能不全または死をもたらしうる。1,000,000人につき約8人で起こる、まれな疾患である。それは男性および女性に等しく冒し、通常には、年齢40歳後に発症する。アミロイドーシスの少なくとも15個の型が同定されている。それぞれは、異なる種類のタンパク質の沈着物に関連している。
アミロイドーシスの主要な型は、原発性全身性、続発性、および家族性または遺伝性アミロイドーシスである。アルツハイマー病に関連したアミロイドーシスのもう一つの型もある。原発性全身性アミロイドーシスは、通常、年齢50歳と60歳の間に発症する。毎年、約2,000人の新しい患者が診断され、原発性全身性アミロイドーシスは、米国において、この疾患の最も多く見られる型である。軽鎖関連アミロイドーシスとしても知られているが、それはまた、多発性骨髄腫(骨髄癌)に関連して起こりうる。続発性アミロイドーシスは、慢性感染症または炎症性疾患の結果である。それは、しばしば、家族性地中海熱(悪寒、虚弱、頭痛および反復性熱を特徴とする細菌感染症)、肉芽腫性回腸炎(小腸の炎症)、ホジキン病、ハンセン病、骨髄炎および関節リウマチと関連している。
家族性または遺伝性アミロイドーシスは、その疾患の唯一の遺伝した型である。それは、たいていの民族群のメンバーに起こり、各家族は、症状および器官障害の特有のパターンを有する。遺伝性アミロイドーシスは、常染色体優性であると考えられ、それは、欠陥のある遺伝子のたった1コピーのみが疾患を引き起こすのに必要であるという意味である。家族性アミロイドーシスをもつ親の子どもは、疾患を発症する五分五分の可能性をもつ。
アミロイドーシスは、身体における任意の器官または系を冒しうる。心臓、腎臓、胃腸系および神経系が、最もしばしば、冒される。アミロイド蓄積の他のよくある部位は、脳、関節、肝臓、脾臓、膵臓、呼吸器系、および皮膚を含む。
アルツハイマー病(AD)は、認知症の最も一般的な型、日常生活の通常の活動を妨げるほど深刻な知能の喪失、少なくとも6ヶ月間継続すること、および生まれた時から存在することはないことを特徴とする神経系疾患である。ADは、通常、老齢において起こり、想起、推論および計画のような認知機能における衰退により特徴付けられる。
2百万〜4百万人の米国人がADに罹っている；その数は、全体が加齢する場合の集団として、21世紀の半ばまでには1千4百万人ほどまで増加することが予想される。40代および50代における少数の人々がその疾患を発症するが、ADは、主に、高齢者を冒す。ADは、年齢65歳〜74歳のすべての人々の約3%、75歳〜84歳の人々の約20%、および85歳を超える人々の約50%を冒している。女性がより長く生きる傾向にあることを考慮した場合でさえも、男性よりわずかに多い女性がADに冒されており、だから、最も多く罹患した年齢群において女性のより高い割合がある。
数個の遺伝子がADに結びつけられ、アミロイドを生成する原因である、アミロイド前駆体タンパク質、すなわちAPP、についての遺伝子を含む。この遺伝子における突然変異は、ADの比較的珍しい早期発症型のいくつかの症例に関連づけられる。早期発症ADの他の症例は、プレセニリン遺伝子、PS-1およびPS-2、における突然変異により引き起こされる。ADに類似した認知症は、最終的には、第21染色体の余分のコピーにより引き起こされるダウン症候群をもつほとんどみんなを冒す。他の染色体における他の突然変異は、他の早期発症の症例に関連づけられている。
もしかすると最も重要であるかもしれない遺伝的関連が、第19染色体上に1990年代初期に発見された。この染色体における遺伝子、apoE、は脂質をニューロンへ輸送することに関与するタンパク質をコードする。
アポリポタンパク質E(ApoE)は、34 kDaのグリコシル化タンパク質である。ApoE産生の主要部位は、肝臓および脳である。ApoEは、超低密度リポタンパク質(VLDL)、高密度リポタンパク質のサブクラス、およびカイロミクロンの成分である。脂質複合体の細胞取り込みは、ApoEの低密度リポタンパク質(LDL)受容体および他の関連した受容体への結合により媒介される。
ヒトにおいて3つの主要なApoEアイソフォーム、apoE2、apoE3およびapoE4、があり、3つの対立遺伝子、ε2、ε3およびε4、の産物である。一般的な集団において、ε3対立遺伝子は、最も多くあり、すべてのapoE対立遺伝子の78%を占める。ε4対立遺伝子の頻度は、晩期発症型散発性および家族性アルツハイマー病(AD)患者の集団において有意に増加している。
ApoEは、ランダムコイル領域により連結されたC末端ドメイン(ApoE-CTD)およびN末端ドメイン(ApoE-NTD)を含む。C末端ドメインは、脂質結合部位を含み、N末端ドメインは、リポタンパク質受容体に結合する。CTDアミノ酸配列は、ApoEのすべての3つのアイソフォームにおいて同一である。CTDおよびNTDは、トロンビンでの切断により分離されうる。
ApoEとアミロイドβ(Aβ)の間の直接的相互作用は、インビトロで実証されている。ApoEはまた、ADプラークに存在する。ApoEのN末端ドメイン(ApoE-NTD)が、apoEのAβへの結合を媒介することが報告されている(Golabek et al., (2000) Biophysical Journal 79:1008-1015)。しかしながら、ApoEを含むADプラークは、プラークの中央に完全長ApoEを、プラークの周辺にApoEのC末端ドメイン(ApoE-CTD)を含むことが示されている(Cho et al., (2001) J. Neuropathology and Expt. Neurology 60:342-349)。プラークにおけるAβ1-42沈着は、ApoE沈着より先に起こるが、Aβ1-40沈着は、プラーク成熟におけるApoE沈着の後に続く(Terai et al., (2001), Brain Research 900:48-56)。
脳におけるApoEの機能は、ADに特異的であるとは考えられない。ApoEは、急性脳損傷からの回復を変更するにおいて重要な役割を果たしているように思われる。特に、ApoE4アイソフォームの存在が様々な急性脳損傷からの乏しい神経学的回復に関連していることを示唆する臨床および動物の研究の両方からの証拠がある。
発明の概要
本発明者らは、アルツハイマープラークを含むアミロイド沈着物に見出されるタンパク質凝集体に露出されているが、血液中のリポタンパク質粒子におけるApoEのようなApoEの他の型において接近できない、または制限された接近可能性のみをもつ、アポリポタンパク質E(ApoE)の領域に方向づけられた治療用抗体を開発した。
従って、本発明は以下のものを提供する：
- 抗体または断片が以下である、ヒト抗体または抗体断片：
(i)アポリポタンパク質EのC末端ドメイン(ApoE-CTD)のSEQ ID NO:1、またはその部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する；および
(ii)ヒトプラークに結合する；
- 抗体または断片が以下である、ヒト抗体または抗体断片：
(i)ApoE-CTDのSEQ ID NO:1に示されたアミノ酸配列またはその部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する；および
(ii)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:512、SEQ ID NO:513、SEQ ID NO:514、SEQ ID NO:515、SEQ ID NO:516またはSEQ ID NO:517に示された配列を含む重鎖CDR3領域を含む；
- 抗体または断片が以下である、ヒト抗体または抗体断片：
(i)ApoE-CTDのSEQ ID NO:1に示されたアミノ酸配列またはその部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する；ならびに
(ii)SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86およびSEQ ID NO:89に示された配列から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖CDR3領域を含む；
- 抗体または断片が、VLDLの存在下において、SEQ ID NO:1に示されたApoE-CTDアミノ酸配列またはその部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する、ヒト抗体または抗体断片；
- 抗体または断片が以下である、ヒト抗体または抗体断片：
(i)ヒトプラークに結合する；および
(ii)SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:512、SEQ ID NO:513、SEQ ID NO:514、SEQ ID NO:515、SEQ ID NO:516またはSEQ ID NO:517に示された配列を含む重鎖CDR3領域を含む；
- 抗体または断片が以下である、ヒト抗体または抗体断片：
(i)ヒトプラークに結合する；ならびに
(ii)SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86およびSEQ ID NO:89に示された配列から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖CDR3領域を含む；
- SEQ ID NO:136に示された重鎖配列ならびにSEQ ID NO:521および522に示された軽鎖配列を含む抗体または抗体断片；
- SEQ ID NO:142に示された重鎖配列およびSEQ ID NO:523に示された軽鎖配列を含む抗体または抗体断片；
- SEQ ID NO:40に示された重鎖配列ならびにSEQ ID NO:517および/または518に示された軽鎖配列を含む抗体または抗体断片；
- SEQ ID NO:40に示された重鎖配列ならびにSEQ ID NO:519および/または520に示された軽鎖配列を含む抗体または抗体断片；
- SEQ ID NO:24に示された重鎖CDR1配列、SEQ ID NO:25に示された重鎖CDR2配列、ならびにSEQ ID NO:207、209および210のいずれか一つに示された重鎖CDR3配列を含む抗体または抗体断片；
- SEQ ID NO:48に示された重鎖CDR1配列、SEQ ID NO:49に示された重鎖CDR2配列、ならびにSEQ ID NO:320、322および323のいずれか一つに示された重鎖CDR3配列を含む抗体または抗体断片；
- SEQ ID NO:66に示された重鎖CDR1配列、SEQ ID NO:67に示された重鎖CDR2配列、およびSEQ ID NO:373に示された重鎖CDR3配列を含む抗体または抗体断片；
- モノクローナル抗体である、前記請求項のいずれか一つによる抗体または抗体断片；
- 治療によるヒトもしくは動物身体の処置の方法に、またはヒトもしくは動物身体に実施される診断方法に用いる、本発明による抗体または抗体断片；
- アミロイド疾患の処置または予防のための薬物の製造における、本発明による抗体または抗体断片の使用；
- 本発明による抗体または抗体断片および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物；
- アミロイド疾患を患っている対象を処置する方法であって、本発明による抗体または抗体断片の治療的有効量をその対象に投与する段階を含む、方法；
- 以下の段階を含む、対象においてアミロイド疾患を診断する方法：
(i)本発明による抗体または抗体断片をその対象に投与する段階；および
(ii)その抗体または抗体断片がその対象においてプラークに結合するかどうかを測定する段階であって、その抗体または抗体断片のプラークへの結合がアミロイド疾患を示しており、それにより対象がアミロイド疾患をもつかどうかを決定する、段階；
- 本発明による抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチド；
- 本発明によるポリヌクレオチドを含むベクター；
- 本発明によるポリペプチドを発現させる宿主細胞；
- 本発明によるポリヌクレオチドをコードするウイルス；
- 本発明による抗体または抗体断片、ならびにその抗体または抗体断片を検出するための手段を含む、ApoE-CTDを検出するためのキット；ならびに
- 以下の段階を含む、対象由来の試料においてApoE-CTDの存在を検出するための方法：
(i)対象から採取された試料を、本発明による抗体または抗体断片に、抗体または抗体断片のApoE-CTDへの結合を可能にする条件下で接触させる段階；および
(ii)抗体または抗体断片が試料に結合しているかどうかを測定し、それにより試料に存在する任意のApoE-CTDを検出する段階。
発明の詳細な説明
A. ポリペプチド
本発明は、アルツハイマープラークのようなアミロイド沈着物に見出されるタンパク質凝集体に露出されているが、血液中のリポタンパク質粒子におけるようなApoEの他の型において存在しない、または接近できない、アポリポタンパク質E(ApoE)上の領域に結合する抗体を提供する。
本発明の目的のために、用語「抗体」とは、それとは反対に指定されない限り、抗体断片を含む。
典型的には、本発明の抗体は、アポリポタンパク質EのC末端ドメイン(ApoE-CTD)を結合する、すなわち、ApoE-CTDと反応性である。本発明の抗体は、アポリポタンパク質EのN末端ドメイン(ApoE-NTD)に結合しない。抗体は、典型的には、VLDLに存在するApoEの型に優先して、ヒトプラークに存在するApoEの型に結合する。一般的に、ヒトプラークに存在するApoEの型は、ApoE-CTDである。本発明の抗体は、超低密度リポタンパク質(VLDL)の存在下において好んでApoE-CTDを結合する。本発明の抗体は、ApoE-CTDにおけるエピトープに結合するものでありうり、そのエピトープは、VLDLと付随したApoEに存在しない。例えば、ApoEがVLDLと付随している場合、エピトープは、抗体に接近できない、または抗体に曝露されないものでありうる。抗体が結合するエピトープは、典型的には、VLDLに存在する完全長ApoEにおいて隠されうり、それゆえに、抗体のApoEに対する親和性は、実質的に、ApoE-CTDに対するそれの親和性より低い。抗体が結合するエピトープは、ApoE-CTDにおいてのみ存在し、ApoE-NTDにおいて存在せず、それゆえに、抗体は、典型的には、ApoE-NTDに結合することがない。抗体のApoE-NTDへの任意の結合は、一般的に、その抗体のApoE-CTDへの特異的結合より実質的に低い親和性の非特異的結合である。実質的により低い親和性は、一般的に、少なくとも2分の1、3分の1、5分の1、10分の1、50分の1、または100分の1低い親和性である。
本発明の抗体は、このように、ApoE-CTDに優先的に結合する、または特異的に結合する。抗体は、それがApoE-CTDに優先的なまたは高い親和性を以て結合するが、他のポリペプチドには結合しない、または低親和性のみを以て結合する場合、ApoE-CTDに「優先的に結合する」または「特異的に結合する」。抗体の特異的結合能力を測定する結合、競合的結合または免疫放射定量アッセイ法についての様々なプロトコールは、当技術分野において周知である(例えば、Maddox et al., J. Exp. Med. 158, 1211-1226, 1993)。そのような免疫測定法は、典型的には、特定のタンパク質とそれの抗体の間の複合体形成および複合体形成の測定を含む。典型的には、本発明の抗体は、SEQ ID NO:1に示された配列を有するApoE-CTDに少なくとも107 M-1、好ましくは少なくとも、108 M-1、109 M-1、1010 M-1の親和性定数で結合する能力がある。本発明の抗体は、好ましくは、ApoE-CTDに、BSA、カゼイン、VLDL、ApoE-NTDまたはVLDLに存在するApoEのような非特異的ポリペプチドに結合することについてのそれの親和性より少なくとも2倍、10倍、50倍、100倍またはそれ以上である親和性を以て、優先的に結合する能力がある。
ApoE-CTDに特異的に結合する抗体は、典型的には、固定化ApoE-CTD上におけるELISAにおいて、少なくとも2xバックグラウンド結合を示すが、ApoE-NTDまたはストレプトアビジンのような対照タンパク質に対して2xバックグラウンド未満、典型的には1xバックグラウンド、を示す。
本発明の抗体は、一般的に、ヒトプラークに結合する。用語「ヒトプラーク」は、ヒト遺伝子によりコードされたアミノ酸配列を有する少なくとも1つのタンパク質を含む任意のアミロイド沈着物を網羅することが意図される。好ましくは、ヒトプラークは、ヒト組織に存在する、または由来する。より好ましくは、ヒトプラークは、ヒト対象から得られた試料に存在する。ヒト対象は、全身性アミロイドーシスまたはアルツハイマー病のようなアミロイド疾患をもちうる。試料は、アミロイドプラークを含む任意の組織または器官から採取されうる。適した組織および器官は、脳、舌、腸、骨格筋、平滑筋、神経、皮膚、靱帯、心臓、肝臓、脾臓および腎臓を含む。対象がアルツハイマー病をもつ場合、試料は、一般的に、脳切片である。脳切片は、典型的には、死後に得られる。任意のそのような試料から調製された原繊維もまた、用語「ヒトプラーク」内に含まれる。
ヒトプラークは、ヒトタンパク質がアミロイド沈着物に見出される1つ以上、例えば2つまたは3つ、のヒトタンパク質についてトランスジェニックである非ヒト動物に存在しうる、または由来しうる。ヒトタンパク質は、好ましくは、ApoEであるが、アミロイド前駆体タンパク質(APP)(典型的には、スウェーデン型突然変異を含む)またはプレセニリンでありうる。
ヒトプラークへの結合は、任意の適した方法により測定されうる。例えば、IHCアッセイ法において、抗体のヒトプラークへの結合は、IHCシグナルを得た陽性ブラインドが、最初に試験された2つのアミロイド沈着物試料において<20 μg/ml抗体で染色された後に得られている、または1つの試料が最初の試験において陰性である場合には、その後に試験された3つの試料のうちの少なくとも2つが、抗体がヒトプラークに結合していることを示している場合、生じていると言える。試料は、好ましくは、異なる個体に由来し、かつAβのようなアミロイドマーカーについてIHC陽性である組織学的に検証されたアミロイド沈着物をもつ組織試料から切片にされる。
ヒトプラークに結合する抗体の能力は、アルツハイマー病または全身性アミロイドーシスの、齧歯類もしくは霊長類のようなマウスまたは他の非ヒト動物モデルを用いて、インビボで測定されうる。
そのようなアッセイ法において、抗体のプラークへの結合は、IHCを用いて測定されうる。抗体は、試験される前に標識されうる。プラークに結合することは、試験された3匹のマウスのうち少なくとも2匹において、単一または複数回用量での≦1 mg 抗体の注入後のアミロイドの陽性ブラインド得点化IHC染色として定義されうる。シグナルは、一般的に、陰性アイソタイプ適合対照抗体を注入されたマウス由来の解剖学的に染色された、性別および年齢の一致した組織からのシグナルと比較される。
本明細書に用いられる場合の用語「エピトープ」は、特定の結合性ポリペプチドに接触する分子のその部分を指す。エピトープは、抗原からの本質的に線状のアミノ酸配列を含む線状でありうる、または他の配列によって分けられているが、構造的にいっしょになって、ポリペプチドに対する結合部位を形成する配列を含む高次構造的でありうる。
抗体が結合するApoE-CTDにおけるエピトープは、完全長ApoEからの切断後、ApoE-CTD上に現れうる。または、エピトープは、ApoE-CTDのアミロイドプラークとの相互作用後、例えば、ApoE-CTDのAβへの結合の結果として、現れうる。ApoEの切断および/またはApoE-CTDのアミロイドプラークへの結合は、結果として、新しい線状(ペプチド)エピトープの露出および/または新しい高次構造的エピトープの露出もしくは形成を生じうる。本発明のポリペプチドが結合するエピトープは、ApoEの、VLDLの他の成分との相互作用のせいで、VLDL付随型ApoEにおいて隠されうる。そのポリペプチドは、ApoE-CTDとAβの間に形成された複合体に特異的に結合しうる。
ApoE-CTDのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:1に示されている。ApoE-CTDエピトープは、このように、SEQ ID NO:1に示されているようなApoE-CTDの配列内の線状または高次構造的配列により形成されうる。ApoE-CTDに結合する抗体は、典型的には、SEQ ID NO:1に示された全配列を有するApoE-CTDポリペプチドに結合するが、SEQ ID NO:2〜19のいずれか一つに示されているようなアミノ酸配列を有するペプチドへのような、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列の一部に結合する場合もある。好ましくは、抗体は、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、またはSEQ ID NO:17に示されたペプチドの1つまたは複数に結合する。抗体が結合するApoE-CTDの部分は、SEQ ID NO:1の少なくとも3個のアミノ酸断片、好ましくは、少なくとも5個、6個、7個または8個のアミノ酸断片、より好ましくは、10個、12個または16個のアミノ酸断片である。
抗体が結合するポリペプチド(またはペプチド)は、組換えポリペプチドでありうる。ポリペプチドは、溶液中にありうる、またはより好ましくは、固体表面に付着しうる。例えば、ポリペプチドは、磁気ビーズのようなビーズに付着しうる。
ポリペプチドはビオチン化されうる。ペプチドに結合したビオチン分子は、固体表面上のストレプトアビジンにビオチンを結合させることにより、ポリペプチドを固体表面上に固定化するために用いられうる。
アルツハイマー病および/または全身性アミロイドーシスを処置または予防するにおいて用いるのに適した本発明の抗体は、典型的には、エクスビボの食細胞アッセイ法において陽性を示す。陽性食細胞アッセイは、試験された3つの培養物のうち少なくとも2つにおいて、≦20 μg/mlの抗体を加えた後のアミロイド組織上での共培養後にアミロイドを含む食細胞の陽性ブラインド得点化共焦点顕微鏡法検出として定義される。シグナルは、一般的に、陰性対照抗体の同じ濃度を含む同一の共培養からのシグナルと比較される。陽性食細胞アッセイ法はまた、一般的に、結果として、例えば、陰性対照抗体の同じ濃度を含む同一の共培養物からのブロットと比較して、最高3日間までの共培養後に残っているAβに基づいたものの密度の3分の1未満であることがウェスタンブロット法により示されているように、アミロイドの分解を生じる。
治療的使用のための抗体を始めとするペプチドは、典型的には、ApoE-CTDに対して高親和性である、好ましくは、＜1 nMの親和性をもち、それらが、全身注入後に蓄積するであろう脳における低濃度においてさえも最適に機能することを可能にする。
用語「抗体」とは、少なくとも1つの、好ましくは2つの、重鎖可変領域(VH)および/または、少なくとも1つの、好ましくは2つの、軽鎖可変領域(VL)を含むタンパク質を指す。VHおよびVL領域は、「フレームワーク領域(FR)」と呼ばれるより保存されている領域と共に散在する、「相補性決定領域(CDR)」と呼ばれる超可変性の領域へさらに細区画されうる。FRおよびCDRの範囲は、正確に定義されている(全体として参照により本明細書に組み入れられている、Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No., 91-3242; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917参照)。各VHおよびVLは、以下の順序でN末端からC末端まで配列された3つのCDRおよび4つのFRから構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗体のVHまたはVL鎖はさらに、重鎖または軽鎖の定常領域の全部または部分を含みうり、それにより、それぞれ、重または軽免疫グロブリン鎖を形成する。一つの態様において、抗体は、2つの重鎖および2つの軽鎖の四量体であり、重鎖および軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合により相互接続されている。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3、から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CL、から構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には、宿主組織、ならびに免疫系の様々な細胞および補体系の第1成分を含む因子への抗体の結合を媒介する。用語「抗体」は、IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型およびそれらのサブタイプの無傷免疫グロブリンを含む。好ましい免疫グロブリンはIgGである。
本明細書に用いられる場合、用語「免疫グロブリン」は、実質的に免疫グロブリン遺伝子によりコードされた1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識されているヒト免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α(IgA1およびIgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε、およびμの定常領域遺伝子、加えて無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。完全長免疫グロブリン軽鎖(約25 kDまたは214個のアミノ酸)は、N末端における可変領域遺伝子(約110個のアミノ酸)およびC末端におけるκまたはλ定常領域によりコードされる。完全長免疫グロブリン重鎖(約50 kDまたは446個のアミノ酸)は、N末端における可変領域遺伝子(約116個のアミノ酸)およびC末端における他の前記の定常領域遺伝子の1つ、例えば、γ(約330個のアミノ酸をコードする)、によりコードされる。
本発明の抗体断片は、典型的には、抗原結合断片である。用語「抗原結合断片」とは、ApoE-CTDに特異的に結合する能力がある完全長抗体の1つまたは複数の断片を指す。結合断片の例は、(i)Fab断片(VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価の断片)；(ii)F(ab')2断片(ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結された2つのFab断片を含む二価の断片)；(iii)Fd断片(VHおよびCH1ドメインからなる)；(iv)Fv断片(抗体の単一アームのVHおよびVLドメインからなる)；(v)dAb断片(VHドメインからなる)；(vi)単離されたCDR；(vii)一本鎖Fv(scFv)(VHおよびVLドメインが対になって一価分子を形成するように、組換え手段を用いて合成リンカーにより連結された抗体の単一アームのVHおよびVLドメインからなる)；(viii)ダイアボディ(VHおよびVLドメインが、対になって一価分子を形成しない；それぞれ1つのscFvのVHが他方のscFvのVLドメインと対になって二価分子を形成する、ように連結されている2つのscFvからなる)；(ix)二特異性抗体(各領域が異なるエピトープを結合する、少なくとも2つの抗原結合領域からなる)を含む。好ましくは、抗体断片は、Fab断片または一本鎖抗体(scFv)である。
好ましいCDR1ドメインの配列は、SEQ ID NO:21、24、27、30、33、36、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、93、111、117および123に示されている。他の好ましいCDR1ドメインは、配列内の1つ以上のアミノ酸が欠失している、またはより好ましくは、置換されている、これらの配列の変異体である。他の好ましいCDR1ドメインは、1つ以上のアミノ酸が挿入されている、SEQ ID NO:21、24、27、30、33、36、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、93、111、117および123のいずれか一つに示された配列の変異体である。好ましくは、変異体CDR1ドメインは、1つ以上の、例えば、2つ、3つ、4つまたは5つの置換、好ましくは保存的置換、を含む。そのようなCDR1変異体配列の例は、表38、39、40、41および42に同定されたLV-CDR1配列である。好ましいCDR1配列は、SEQ ID NO:33、219、226、218、326、93、325、391および394を含む。
好ましいCDR2ドメインの配列は、SEQ ID NO:22、25、28、31、34、37、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、94、112、118、および124に示されている。他の好ましいCDR2ドメインは、配列内の1つ以上のアミノ酸が欠失している、またはより好ましくは、置換されている、これらの配列の変異体である。他の好ましいCDR2ドメインは、1つ以上のアミノ酸が挿入されている、SEQ ID NO:22、25、28、31、34、37、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、94、112、118、および124の一つに示された配列の変異体である。好ましくは、変異体CDR2ドメインは、1つ以上の、例えば、2つ、3つ、4つまたは5つの置換、好ましくは保存的置換、を含む。そのようなCDR2変異体配列の例は、表38、39、40、41および42に同定されたLV-CDR2配列である。好ましいCDR2配列は、SEQ ID NO:382、386、333、334、34、247および252を含む。
好ましいCDR3ドメインの配列は、SEQ ID NO:23、26、29、32、35、38、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、95、113、119および125に示されている。他の好ましいCDR3ドメインは、配列内の1つ以上のアミノ酸が欠失している、またはより好ましくは、置換されている、これらの配列の変異体である。他の好ましいCDR3ドメインは、1つ以上のアミノ酸が挿入されている、SEQ ID NO:23、26、29、32、35、38、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、95、113、119および125の一つに示された配列の変異体である。好ましくは、変異体CDR3ドメインは、1つ以上の、例えば、2つまたは3つ、の保存的置換を含む。
保存的置換は以下の表に示されている。第二列で同じブロックにおける、および好ましくは第三列で同じ行における、アミノ酸はお互いと置換されうる。
（表）
Figure 2008502311
変異体CDR3配列の例は、表38、39、40、41および42に同定されたHV-CDR3およびLV-CDR3配列である。好ましい変異体CDR3配列は、SEQ ID NO:207、209、210、35、269、252、34、322、323、320、341、373および378に示されている。
好ましい抗体は、(i)SEQ ID NO:39に示されたVH配列またはその変異体、およびSEQ ID NO:42に示されたVL配列またはその変異体；(ii)SEQ ID NO:40に示されたVH配列またはその変異体、およびSEQ ID NO:43に示されたVL配列またはその変異体；(iii)SEQ ID NO:41に示されたVH配列またはその変異体、およびSEQ ID NO:44に示されたVL配列またはその変異体を含む。
他の好ましい抗体は、SEQ ID NO:317、318、319、369、370、371、372および397に示された配列から選択される重鎖配列、および任意で、SEQ ID NO:43、295、294、304、347、348、357、362、406および418から選択される軽鎖配列を含む。より好ましい抗体は、重鎖および軽鎖配列の以下の組み合わせをもつ抗体を含む：SEQ ID NO:319および43、SEQ ID NO:318および295、SEQ ID NO:318および294、SEQ ID NO:317および304、SEQ ID NO:370および347、SEQ ID NO:370および348、SEQ ID NO:371および348、SEQ ID NO:372および348、SEQ ID NO:369および357、SEQ ID NO:370および362、SEQ ID NO:397および406、SEQ ID NO:397および418。
変異体抗体は、任意の適した方法により得られうる。典型的には、改善された結合特性をもつ変異体は、親和性成熟により選択される。
好ましい態様において、抗体は、組換えまたは改変された抗ApoE-CTD抗体、例えば、キメラ、ヒト化、脱免疫化、またはインビトロ作製抗体、である。本明細書に用いられる場合の用語「組換えの」または「改変された」抗体は、(i)宿主細胞へトランスフェクションされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体；(ii)組換えの、組み合わせの抗体ライブラリーから単離された抗体；(iii)ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物(例えば、マウス)から単離された抗体；または(iv)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、作製もしくは単離された抗体のような、組換え手段により調製、発現、作製または単離されるすべての抗体を含むことを意図される。そのような組換え抗体は、ヒト化、CDRグラフト化、キメラ、脱免疫化、インビトロ作製された抗体を含み、任意で、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の定常領域を含みうる。
本発明による抗体は、ヒト抗体である。抗体は、キメラ抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でありうる。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。
抗体は、薬物のような機能的部分、検出可能な部分、または固体支持体に結合されうる。
また本発明の範囲内に、ApoE-CTDの異なるエピトープを結合する2つまたはそれ以上の抗体を含む組成物がある。組成物における抗体は、重複しているエピトープを結合してもよい。重複しているエピトープを結合する抗体は、ApoE-CTDへのお互いの結合を競合的に阻害する。
抗体は、好ましくは、単一特異性であり、例えば、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。二特異性および多価抗体もまた提供され、二特異性または多価抗体は、ApoE-CTDの2つまたはそれ以上の異なるエピトープんい結合する。
本発明の抗体は、ビオチンのような結合性部分に連結されうる。例えば、抗体、好ましくはIgG、はスルホスクシンイミジル-2-(ビオチンアミド)エチル-1,3-ジチロプロピオネートとのインキュベーションによりビオチン化されうる。ビオチン化されたIgGは、好ましくは、2つ、3つまたは4つのような1つから5つまでのビオチン基を含む。
本発明の抗体は、実質的に単離された形でありうる。それらは、それらの意図された使用に干渉しない担体または希釈剤と混合され、かつなお、実質的に単離されているとみなされうる。それらはまた、実質的に精製された形でありうり、その場合、それらは、一般的に、そのポリペプチドまたは調製物の乾燥重量の、少なくとも90%、例えば、少なくとも95%、98%または99%、を含む。
B. 抗体を同定するための方法
本発明はまた、本発明による抗体を同定するための方法を提供する。方法は、典型的には、SEQ ID NO:1に示されているようなアミノ酸配列またはその一部のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する、およびヒトプラークに結合する、抗体を同定する段階を含む。結合アッセイの一方または両方は、VLDLの存在下において行われうる。方法は、一般的に、ディスプレイライブラリーを提供する段階、ならびに、ApoE-CTDまたはその断片に、および/またはヒトプラークに、好ましくはVLDLの存在下において、結合する抗体をコードするメンバーを同定するようにライブラリーをスクリーニングする段階を含む。ディスプレイライブラリーは、実体の収集物である；各実体は、接近可能な抗体成分およびその抗体成分をコードするまたは同定する回復可能な成分を含む。抗体成分は、任意の長さ、例えば、3個のアミノ酸から300個を超えるアミノ酸まで、例えば、30個、100個または200個のアミノ酸、でありうり、典型的には、抗体断片、好ましくは、Fab断片、である。選択において、ライブラリーの各メンバーの抗体成分は、ApoE-CTDで探索され、抗体成分がApoE-CTDまたはその断片に結合する場合には、ディスプレイライブラリーメンバーが、典型的には支持体上での保持により、同定される。ApoE-CTDを結合するディスプレイライブラリーメンバーはまた、典型的には、ApoE-NTDに結合することについて試験されうる(ネガティブ選択)。
保持されたディスプレイライブラリーメンバーは、支持体から回収され、分析される。分析は、増幅および類似したまたは類似していない条件下でのその後の選択を含みうる。例えば、ポジティブおよびネガティブ選択は交替されうる。分析はまた、抗体成分のアミノ酸配列を決定する段階、および詳細な特徴付けのための抗体成分の精製を含みうる。
様々な形式が、ディスプレイライブラリーのために用いられうり、任意の適した形式が、本発明の方法において用いられうる。好ましい形式は、ファージディスプレイおよび酵母ディスプレイのような細胞に基づいたディスプレイである。
ファージディスプレイにおいて、候補抗体は、典型的には、バクテリオファージコートタンパク質に共有結合性に結合される。結合は、コートタンパク質に融合した候補抗体をコードする核酸の翻訳の結果として生じる。結合は、可動性のペプチドリンカー、プロテアーゼ部位、または終止コドンの抑制の結果として組み入れられたアミノ酸を含みうる。ファージディスプレイは、例えば、Ladner et al., 米国特許第5,223,409号; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/02809; WO 90/09690; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol. Today 2:371-8; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Rebar et al. (1996) Methods Enzymol. 267:129-49; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acids Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; およびLee et al. (2003) Trends In Biotechnology 21:45-52に記載されている。
ファージディスプレイ系は、繊維状ファージ(ファージfl、fdおよびM13)および他のバクテリオファージ(例えば、T7バクテリオファージおよびラムダ形ファージ；例えば、Santini (1998) J. Mol. Biol. 282:125-135; Rosenberg et al. (1996) Innovations 6:1-6; Houshmet et al. (1999) Anal. Biochem. 268:363-370参照)について開発された。繊維状ファージディスプレイ系は、典型的には、gene IIIタンパク質のような少数のコートタンパク質、およびgene VIIIタンパク質、多数のコートタンパク質、との融合体を用いるが、gene VIタンパク質、gene VIIタンパク質、gene IXタンパク質のような他のコートタンパク質、またはそれらのドメインとの融合体もまた用いられうる(例えば、WO 00/71694参照)。好ましい態様において、融合は、gene IIIタンパク質のドメイン、例えば、アンカードメインまたは「スタンプ」、へである(例えば、gene IIIタンパク質アンカードメインの記載について米国特許第5,658,727号を参照)。
候補ポリペプチドの結合価もまた調節されうる。ポリペプチド成分をコードする配列の完全なファージゲノムへのクローニングは、結果として、gene IIIタンパク質のすべての複製物はポリペプチド成分に融合しているため、多重変異体ディスプレイを生じる。結合価の低減について、ファージミド系が利用されうる。この系において、gene IIIに融合したポリペプチド成分をコードする核酸は、プラスミド上に提供され、典型的には、700ヌクレオチド未満の長さをもつ。プラスミドを有する細菌細胞がヘルパーファージ、例えば、M13K07、に感染した場合、プラスミドがバクテリオファージ粒子へ組み入れられるように、プラスミドは、ファージ複製起点を含む。ヘルパーファージは、gene IIIの無傷コピーならびにファージ複製および構築に必要とされる他のファージ遺伝子を供給する。ヘルパーファージは、ヘルパーファージゲノムが、野生型起点を有するプラスミドと比較して、ファージ粒子へ効率的には組み入れられないように、欠陥のある起点を有する。
候補抗体をディスプレイするバクテリオファージは、増殖され、標準的なファージ調製方法、例えば、増殖培地からのPEG沈殿、を用いて収集されうる。
個々のディスプレイファージの選択後、選択された候補抗体をコードする核酸は、選択されたファージを用いて細胞を感染させることにより得られうる。個々のコロニーまたはプラークが採取され、核酸が単離され、かつシーケンシングされうる。
本発明によるApoE-CTD結合剤を得るためのスクリーニング手順において、ディスプレイライブラリーを、通常には固体支持体に固定化された標的ApoE-CTD分子と接触させて、結合するようにさせておく。非結合剤は、結合剤から分離される。様々な方法において、結合したファージは、ApoE-CTDから遊離され、収集され、そして、増幅される。ファージは細菌細胞の感染を通して増幅されうるため、少数の結合しているファージでさえも、結合実体をコードする遺伝子配列を明らかにするのに十分である。これらの技術を用いて、集団での2千万個において約1個である結合しているファージを回収することは可能である。それぞれ、1千万〜2千万個またはそれ以上の可能性のある結合性ポリペプチドをディスプレイする、1つまたは複数のライブラリーは、高親和性ApoE-CTD結合剤を見出すように迅速にスクリーニングされうる。選択過程が働く場合、集団の多様性は、良い結合剤のみが残るまで、ラウンドごとに低下する、すなわち、過程が収束する。典型的には、ファージディスプレイライブラリーは、いくつかの密接に関連した結合剤を含む(1千万個のうち10〜50個の結合剤)。収束の表示は、結合(ファージ力価により測定される)の増加および密接に関連した配列の回収を含む。
細胞ディスプレイライブラリーにおいて、候補抗体は、細胞、例えば、真核細胞または原核細胞、の表面上にディスプレイされる。例示的な原核細胞は、大腸菌(E. coli)細胞、枯草菌(B. subtilis)細胞および胞子を含む(例えば、Lu et al. (1995) Biotechnology 13:366参照)。例示的な真核細胞は、酵母(例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharmyces pombe)、ハンゼヌラ(Hansenulla)、またはピチア・パストリス(Pichia pastoris))を含む。酵母表面ディスプレイは、例えば、Boder and Wittrup (1997) Nature Biotech. 15:553-557に記載されている。Fab断片のような免疫グロブリンタンパク質をディスプレイするために用いられうる酵母ディスプレイ系、および酵母接合は、重鎖および軽鎖の組み合わせを作製するために用いられうる。
酵母ディスプレイは、抗ApoE-CTD抗体の親和性成熟の適用においてファージディスプレイを超える明らかな利点をもつ。最も重要な利点は、FACS選択が、各酵母細胞をそれの抗原結合について定量的に分別するために用いられうることである。ディスプレイレベルにおける変動が補正されうるように標準化された選択を行い、それに従って、結合活性に基づいた選択を避けることも可能である。これは、多価の標的抗原を用いる場合、特に重要である。
ディスプレイライブラリーは、リボソームディスプレイライブラリーでありうる。リボソームディスプレイライブラリーにおいて、mRNAおよびそのRNAによりコードされた候補抗体は、mRNAを翻訳しており、発生しようとしているポリペプチドをじっと付着しておくリボソームを安定させることにより物理的に会合されうる。典型的には、高い二価Mg2＋濃度および低温が用いられる。例えば、Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022およびHanes et al. (2000) Nature Biotech. 18:1287-92; Hans et al. (2000) Methods Enzymol. 328-404-30およびSchaffitzel et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:119-35を参照されたい。
もう一つのディスプレイライブラリー形式は、ペプチド-核酸融合体を利用する。ポリペプチド-核酸融合体は、例えば、Roberts and Szostak (997) Proc. Acad. Sci. USA 94:12297-12302および米国特許第6,207,446号に記載されているように、共有結合性に付着したピューロマイシン群を含むmRNAのインビトロ翻訳により作製されうる。mRNAは、その後、DNAへ逆転写されて、ポリペプチドに架橋されうる。
用いられうるもう一つのディスプレイ形式は、抗体成分が、抗体を同定する非核酸タグに付着している非生物学的ディスプレイである。例えば、タグは、抗体をディスプレイするビーズに付着した化学的タグ、または高周波タグでありうる(例えば、米国特許第5,874,214号)。
親の結合ドメインは、候補抗体についての構造的鋳型としての役割を果たすように選択される。結合ドメインは、天然に存在するもしくは合成のタンパク質、または免疫グロブリンのようなタンパク質の領域もしくはドメインでありうる。親の結合ドメインは、親の結合ドメインとApoE-CTDの間の既知の相互作用の知識に基づいて選択されうるが、これは重要ではない。実際、親の結合ドメインが、とにかく、ApoE-CTDに対する親和性をいくらかでももっていることは必須ではない：それの目的は、ライブラリーが、ApoE-CTDに特異的に結合する1つまたは複数の候補抗体を含む、ライブラリーが作成されうる構成を提供することである。
候補抗体は、Fab断片、一本鎖Fv分子(scFV)、単一ドメイン抗体、ラクダ抗体およびラクダ化抗体でありうる。
好ましい態様において、親の結合ドメインは、scFv、FabまたはIgGのような抗原結合活性をもつ免疫グロブリンドメインを含む。典型的ディスプレイライブラリーは、VHドメインおよびVLドメインを含む候補ポリペプチドをディスプレイする。Fabおよび他の型式の場合においてのように、ディスプレイされる抗体は、軽鎖または重鎖の部分として定常領域を含みうる。一つの態様において、各鎖は、例えば、Fabの場合においてのように、1つの定常領域を含む。他の態様において、追加の定常領域がディスプレイされる。
ディスプレイライブラリーは、例えば、ヒト抗原を認識するヒトまたは「ヒト化」抗体を同定するのに特に有用である。インビトロディスプレイ選択過程は、正常なヒト免疫系が自己抗原に対して抗体を産生できないことを切り抜ける。
抗体ライブラリーは、多数の過程により構築されうる(例えば、de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20およびHoogenboom et al. (2000) Immunol. Today 21:371-8参照)。さらに、各過程の要素は、他の過程のそれらと組み合わせられうる。過程は、変異が単一免疫グロブリンドメイン(例えば、VHまたはVL)へ、または複数の免疫グロブリンドメイン(例えば、VHまたはVL)へ導入されるように用いられうる。変異は、例えば、重鎖および軽鎖の可変ドメインの一方ならびに/または両方のそのような領域を指す、CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3およびFR4の1つまたは複数の領域において、免疫グロブリン可変ドメインへ導入されうる。一つの態様において、変異は、与えられた可変ドメインのすべての3つのCDRへ導入される。もう一つの好ましい態様において、変異は、例えば重鎖可変ドメインの、CDR1およびCDR2へ導入される。任意の組み合わせが可能である。
好ましい態様において、親のドメインは、SEQ ID NO:23、26、29、32、35、38、47、50、53、56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、95、113、119および125のいずれか一つに示されたCDR3配列を含む。SEQ ID NO:23もしくは26の2位および3位の一つまたは両方におけるアミノ酸置換は、候補抗体において好ましい変異である。抗体スパイキングにより作製された変異体VH-CDR3配列の例は、表38、39、40、41および42に同定されている。好ましいCDR3配列は、SEQ ID NO:207、209、210、320、322、323および373に示されている。好ましいCDR3配列についてのコンセンサス配列は、SEQ ID NO:512、513、514、515、516、517および20に示されている。
軽鎖シャッフリングにより作製された変異体VL-CDR3配列の例もまた、表38、39、40、41および42に示されている。好ましいVL-CDR3配列は、SEQ ID NO:35、269、275、268、341および378に示されている。
親のドメインはまた、好ましくは、VH鎖の他の成分、および任意でVL鎖、またはVL鎖の他の成分、および任意でVH鎖を含む。
第二の好ましい親のドメインは、SEQ ID NO:21、24、27、30、33、36、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、93、111、117および123のいずれか一つに、またはSEQ ID NO:22、25、28、31、34、37、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、94、112、118、および124に、示された配列をもつCDR1および/またはCDR2ドメインを含む。候補ポリペプチドは、CDR1および/またはCDR2ドメインをDNAシャッフリングにより作製されうる。変異体VL-CDR1およびVL-CDR2配列の例は、表38、39、40、41および42に同定されている。好ましいCDR1配列は、SEQ ID NO:33、219、226、218、93、325、326、391および394に示されている。好ましいCDR2配列は、SEQ ID NO:34、247、252、333、334、382および386に示されている。
第三の好ましい親のドメインは、SEQ ID NO:42、43、44、151、157、159および161のいずれか一つに示されたVL配列を含む。候補ポリペプチドは、典型的には、VL配列全体のDNAシャッフリングにより作製される。シャッフルされた軽鎖配列の例は、表38、39、40、41および42に同定されている。好ましいシャッフルされた軽鎖配列は、SEQ ID NO:43、295、294、304、347、348、357、362、406および418に示されている。
一つの過程において、抗体ライブラリーは、核酸の対応する領域へ、CDRをコードする多様なオリゴヌクレオチドを挿入することにより構築される。オリゴヌクレオチドは、単量体ヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを用いて合成されうる。例えば、Knappik et al. ((2000) J. Mol. Biol. 296:57-86)は、トリヌクレオチド合成を用いるCDRをコードするオリゴヌクレオチド、およびそのオリゴヌクレオチドを受け入れるための操作された制限部位をもつ鋳型を構築するための方法を記載している。
もう一つの過程において、動物、例えば、齧歯類、はApoE-CTDで免疫される。動物は、任意で、応答をさらに刺激するために抗原でブーストされる。その後、脾臓細胞が動物から単離され、VHおよび/VLドメインをコードする核酸は、ディスプレイライブラリーにおける発現のために、増幅かつクローニングされる。
さらにもう一つの過程において、抗体ライブラリーは、ナイーブの生殖系列免疫グロブリン遺伝子から増幅された核酸から構築される。増幅された核酸は、VHおよび/またはVLドメインをコードする核酸を含む。免疫グロブリンをコードする核酸の源は下に記載されている。増幅は、例えば、保存された定常領域にアニールするプライマーでの、PCR、または別の増幅方法を含みうる。
免疫グロブリンドメインをコードする核酸は、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ウサギ、ラクダまたは齧歯類、の免疫細胞から得られうる。一つの例において、細胞は、特定の性質について選択される。成熟度の様々な段階におけるB細胞が選択されうる。もう一つの例において、B細胞はナイーブである。
一つの態様において、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)が、表面結合したIgM、IgDまたはIgG分子を発現させるB細胞を分別するために用いられる。さらに、IgGの異なるアイソタイプを発現させるB細胞が単離されうる。もう一つの好ましい態様において、B細胞またはT細胞は、インビトロで培養される。細胞は、インビトロで、例えば、支持細胞と培養することにより、または、マイトジェン、またはCD40、CD40リガンドもしくはCD20に対する抗体、酢酸ミリスチン酸ホルボール、細菌のリポ多糖、コンカナバリンA、フィトヘマグルチニンまたはヨウシュヤマゴボウのマイトジェンのような他の調節性試薬を加えることにより、刺激されうる。
さらにもう一つの態様において、細胞は、免疫学的疾患、例えば、全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ、脈管炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、または抗リン脂質症候群、をもつ対象から単離される。対象は、ヒトまたは動物、例えば、ヒト疾患についての動物モデル、もしくは類似した疾患をもつ動物、でありうる。なおもう一つの態様において、細胞は、ヒト免疫グロブリン座を含むトランスジェニック非ヒト動物から単離される。
一つの好ましい態様において、細胞は、体細胞超変異のプログラムを活性化している。免疫グロブリン遺伝子の体細胞突然変異誘発を、例えば、抗免疫グロブリン、抗CD40および抗CD38抗体えの処理により、起こすように刺激されうる(例えば、Bergthorsdottir et al. (2001) J. Immunol. 166:2228参照)。もう一つの態様において、細胞はナイーブである。
免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸は、以下の例示的な方法により天然のレパートリーから単離されうる。最初に、RNAが、免疫細胞から単離される。完全長(すなわち、キャップド)mRNAが分離される(例えば、非キャップドRNAをウシ腸内ホスファターゼで分解することにより)。キャップは、その後、タバコ酸性ピロホスファターゼで除去され、逆転写がcDNAを生成するために用いられる。
第一(アンチセンス)鎖の逆転写は、任意の適したプライマーでの任意の様式で行われうる。例えば、de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:18218-30を参照。プライマー結合領域は、例えば、免疫グロブリンの異なるアイソタイプを逆転写するために、異なる免疫グロブリン間で一定でありうる。プライマー結合領域はまた、免疫グロブリンの特定のアイソタイプに特異的でありうる。典型的には、プライマーは、少なくとも1つのCDRをコードする配列の3'側である領域に特異的である。もう一つの態様において、ポリdTプライマーが用いられうる(かつ、重鎖遺伝子について好ましい場合がある)。
合成配列は、逆転写された鎖の3'末端にライゲーションされうる。合成配列は、逆転写後のPCR増幅中のフォワードプライマーの結合のためのプライマー結合部位として用いられうる。合成配列の使用は、利用可能な多様性を完全に捕獲するために異なるフォワードプライマーのプールを用いる必要性を除去することができる。
可変ドメインをコードする遺伝子は、その後、例えば、1以上のラウンドを用いて、増幅される。複数ラウンドが用いられる場合には、入れ子状態のプライマーが、忠実度の増加のために用いられうる。増幅された核酸は、その後、ディスプレイライブラリーベクターへクローニングされる。
核酸配列を増幅するための任意の方法は、増幅のために用いられうる。多様性を最大限にし、かつ偏向させない方法が好ましい。核酸増幅についての適切な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、核酸を増幅するためにRNAポリメラーゼによるRNA合成を利用する転写に基づいた方法(Sarker et al. (1989) Science 244:331-34)、転写のサイクルを利用するNASBA(米国特許第5,130,238号；第5,409,818号；および第5,554,517号)、DNA試料を増幅するための逆転写およびリボヌクレアーゼHに基づいた分解、ローリングサークル増幅(RCA；米国特許第6,143,495号)、ならびに鎖置換増幅(SDA；米国特許第5,624,825号)を含む。
結合性抗体の第一組が同定された後に、その配列情報は、追加の所望の性質、例えば、ApoE-CTDと完全長ApoE、好ましくはVLDL付随型ApoE、の間の識別、をもつメンバーに偏向した他のライブラリーを設計するために用いられうる。そのような技術は、多数の可能性のある結合性抗体をスクリーニングすることを可能にするだけでなく、最初の基準を満たす類似体をディスプレイするパッケージをスクリーニングするために、結合/溶離サイクルを繰り返すことおよび二次的な偏向したライブラリーを構築することを実際的にする。これらの技術を用いて、偏向したライブラリーは、スクリーニング条件下で固く(すなわち、高親和性を以て)結合するメンバーを明らかにするようにスクリーニングされうる。
従って、一つの好ましい態様において、ディスプレイライブラリーテクノロジーは、反復様式で用いられうる。第一ディスプレイライブラリーは、ApoE-CTDおよび/またはヒトプラークを結合する1つ以上の抗体を同定するために用いられる。これらの同定された抗体は、その後、第二ディスプレイライブラリーを形成するために突然変異誘発方法を用いて変異される。より高い親和性ポリペプチドが、その後、第二ライブラリーから、例えば、より高いストリンジェント性またはより競合的な結合および洗浄条件を用いることにより、選択される。
親和性成熟プロトコールにおいて、変異は、好ましくは、アミノ酸置換により生じるが、アミノ酸の欠失または付加に起因してもよい。
アミノ酸置換は、少なくともたいていの置換について、構造を有意に変えることなく、ドメインの結合性質を変えることが予想されるものでありうる。変異のために選択されたアミノ酸位置(可変性アミノ酸位置)は、表面アミノ酸位置、すなわち、ドメインがそれの最も安定した高次構造にある場合、ドメインの外側表面(すなわち、溶液に曝された表面)上に現れる、ドメインのアミノ酸配列における位置、であることが好ましい。最も好ましくは、変異されうるアミノ酸位置は、置換の効果を最大限にするために、隣接または接近している。さらに、余分のアミノ酸が、親の結合ドメインの構造へ付加されうる。
いくつかの実行において、突然変異誘発は、結合界面にあることが公知の、または可能性が高い領域へターゲットされる。突然変異誘発は、本明細書に記載されているように、重鎖または軽鎖のCDR領域に向けられうる。さらに、突然変異誘発は、CDRの近くの、または隣接した、フレームワーク領域に向けられうる。突然変異誘発はまた、例えば、正確な段階的な改良を行うために、CDRの1個または2、3個に制限されうる。
効果的な親和性成熟は、4つの構成要素(i)リード抗体遺伝子の再多様化(ii)ファージまたは酵母のいずれかでのディスプレイ(iii)親和性選択(iv)向上した親和性についてのクローンのスクリーニングを必要とする。
必要とされる結合性質を示すFabの、例えば、BLASTアルゴリズム(例えば、Karlin and Altschul (1993) PNAS USA 90:5873-5787)を用いる、アラインメントは、CDRドメインにおいて保存された残基を同定するために用いられうる。CDRループ間の配列類似性は、抗体親和性または特異性における任意のアミノ酸の直接的関与の予測を可能にしうる。
例えば、抗体807A-M0028-B02および807A-M0027-E11のVH-CDR3ループ(SEQ ID NO:23および26)は、著しい類似性を示し、4/6アミノ酸(SEQ ID NO:20)に渡る一致を示す。これは、VH-CDR3が抗体親和性および特異性において役割を果たしていることを示唆している。
最適な抗体突然変異誘発ストラテジーは、機能的に関連した位置に最小限の数の突然変異を導入する。これは、ターゲット化および非ターゲット化突然変異誘発手順の両方により達成される。非ターゲット化突然変異誘発手順は、VL遺伝子全体またはVH CDR1〜2断片を再多様化させることにより抗体において大きなブロック変化を導入する鎖シャッフリングを含む。典型的には、VH-CDR3ループは、結合親和性および特異性に対して有意に寄与する可能性があるため、手をつけないままにしておかれる。鎖シャッフリングの例は、以下の文献に記載されている：Marks et al., (1992) Nature Biotech 10:779-783, Schier et al., (1996) J. Mol. Biol. 255, 28-43, Park et al., (2000) BBRC 275, 553-557およびChames et al., (2002) J. Immunol. 1110-1118。鎖シャッフリングは十分確証された技術であるが(特に、低い開始親和性をもつ抗体について)、可能性のある欠点は、抗体分子においてそのような大きなブロック変化を生じることにより、複数の好都合の接触を妨害する機会の増加がありうることである。しかしながら、これは、不都合な接触の喪失または新しい接触の発生により償われうる。
他の例示的な非ターゲット化突然変異誘発技術は以下のものを含む：変異性PCR(Leung et al. (1989) Technique 1:11-15)、組換え、ランダムな切断を用いるDNAシャッフリング(Stemmer (1994) Nature 389-391；「核酸シャッフリング」と呼ばれる)、RACHITT(商標)(Coco et al. (2001) Nature Biotech. 19:354)、部位特異的突然変異誘発(Zooler et al. (1987) Nucl. Acids Res. 10:6487-6504)、カセット突然変異誘発(Reidhaar-Olson (1991) Methods Enzymol. 208:564-586)および変性したオリゴヌクレオチドの取り込み(Griffiths et al. (1994) EMBO J. 13:3245)。
ターゲット化突然変異誘発手順は、ホットスポット突然変異誘発、節減性突然変異誘発、飽和突然変異誘発、ドメインランダム化、およびドメイン歩行。CDR突然変異誘発は、CDR1を標的にする、最適なループを選択する、およびその後、CDR2を標的にするなどである、段階的様式において行われうる。単一の最も天然で多様なループは、VH-CDR3であり、このループは抗体結合部位において中央に位置しているため、これは抗体特異性および親和性の重要な決定因子であると一般的に認められている。これは、特にこのループを標的にすることについての揺るぎない主張があることを意味する。
反復選択の一つの例において、本明細書に記載された方法は、少なくとも最小限の標的に対する結合特異性または最小限の活性、例えば、1 nM、10 nM、もしくは100 nMより大きい結合についての平衡解離定数、を以てApoE-CTDを結合する、およびヒトプラークを結合する、および/またはVLDL付随型ApoEの存在下で結合活性を保持する、ディスプレイライブラリーから抗体をまず、同定するために用いられる。最初に同定された抗体をコードする核酸配列は、例えば、増強された性質(例えば、結合親和性、反応速度、または安定性)をもつ第二のポリペプチドを同定するために、変異の導入のための鋳型核酸として用いられる。
本発明による抗体は、特にあらかじめ選択された結合および遊離の性質を示すApoE-CTD結合抗体を同定しうる様式において、ディスプレイテクノロジーを用いて単離されうる。この方法により、2つの溶液条件があらかじめ選択されうる、すなわち、結合条件および遊離条件。結合条件は、発見された抗体が標的ApoE-CTDを結合することが望まれる1組の溶液条件である；遊離条件は、発見された抗体がApoE-CTDを結合しない(すなわち、ApoE-CTDから解離する)ことが望まれる1組の溶液条件である。2つの条件は、その条件を得ることの容易さ、他の精製段階との適合性、他の親和性媒体と比較した条件間で切り換えることの費用の低減などのような実行者の任意の基準を満足させるように選択されうる。好ましくは、2つの溶液条件は、標的タンパク質ApoE-CTDの安定性または活性に悪影響を及ぼさないように、および少なくとも1つの溶液パラメーターに関して有意に異なるように、選択される。例えば、本明細書に記載された適切な結合性ペプチドについてのスクリーニングを行うにおいて、結合のために用いられた条件とは異なる、エチレングリコール含有緩衝液の存在下で、またはより低いpH(すなわち、pH 2)の条件下で、またはそれらの条件の組み合わせにおいて、標的から解離した結合剤が選択される。都合良く変化しうるもう一つのパラメーターは、結合および溶離緩衝液における塩、例えば、NaCl、の濃度である。
ApoE-CTDに結合する抗体は、典型的には、ApoE-CTDに対する最小限の結合特異性、例えば、1 nM、10 nMまたは100 nMより大きい結合についての平衡定数、をもつ。
遅い解離速度は、高親和性を、特に、抗体とそれらの標的間の相互作用に関して、予測できるため、オフ速度選択の方法が、ApoE-CTDへの結合相互作用についての所望の動力学的解離速度(すなわち、低下した)をもつ抗体を単離するために用いられうる。
ディスプレイライブラリーからゆっくり解離する抗体について選択するために、ライブラリーは、固定化された標的、好ましくはApoE-CTD、と接触させられる。固定化された標的は、その後、非特異的にまたは弱く結合した抗体を除去する第一溶液で洗浄される。その後、固定化された標的は、遊離標的、すなわち、粒子に付着していない標的の複製物、の飽和量を含む第二溶液で溶離される。遊離標的は、標的から解離する抗体に結合する。再結合は、固定化された標的のよりずっと低い濃度に対して遊離標的の飽和量によって効果的に妨げられる。
第二溶液は、実質的に生理的である、またはストリンジェントである、溶液条件をもちうる。典型的には、第二溶液の溶液条件は、第一溶液の溶液条件と同一である。第二溶液の画分は、初期画分と後期画分を区別しうる時間的順序において収集される。より後の画分は、初期画分における生体分子より遅い速度で標的から解離する生体分子を含む。
さらに、延長されたインキュベーション後でさえも、標的に結合したままであるディスプレイライブラリーメンバーを回収することも可能である。これらは、カオトロピック条件を用いて解離されうるか、または標的に付着しながらも増幅されうるかのいずれかである。例えば、標的に結合したファージは、細菌細胞と接触させられうる。
本発明の方法に用いられるApoE-CTDは、任意の適した形をとりうる。ApoE-CTDは、典型的には、SEQ ID NO:1に示されたアミノ酸配列、またはその断片のアミノ酸配列を有する。ApoE-CTDの断片は、典型的には、少なくとも3アミノ酸長、好ましくは少なくとも5、6、7または8アミノ酸長、およびより好ましくは少なくとも10、12または16アミノ酸長である。適した断片の例は、SEQ ID NO:2〜19に示されている。好ましい断片は、SEQ ID NO:2、5、7、9、10、12、13、14、15、16および17のいずれか一つに示された配列を有するものである。1つまたは複数のApoE-CTDペプチドが本発明のスクリーニングアッセイに用いられうる。
ApoE-CTDポリペプチドは、一般的に、組換え手段により産生される。組換えでまたは自然で産生された尿素変性したApoE-CTDが、本発明の方法に用いられうる。候補ポリペプチドは、重合体形におけるCTD(ApoE-CTDが原繊維に結合する)への結合について、追加的にまたは代替として、スクリーニングされうる。ApoE-CTDおよびAβの複合体への結合もまた、モニターされうる。
ApoE-CTDは、組換えまたは天然に存在するApoEから、例えば、トロンビンの作用により、切断されうる。
ApoE-CTDポリペプチドまたはペプチドは、支持体上に固定化されうる。典型的には、固定化は、表面上への捕獲のためにポリペプチドをタグ付けするまたはビオチン化することにより達成される。例えば、ApoE-CTDは、ストレプトアビジン(例えば、ストレプトアビジンコーティング化磁気ビーズ上の)への付着のためのS-Sビオチン基を含みうる。または、ApoE-CTDは、固定化のためのBSA担体(例えば、プラスチック上の)へのカップリングのためのシステイン残基を含みうる。このようにして、「CTDコーティング化チップ」が作製されうる。候補ポリペプチドのCTDコーティング化チップへの結合は、BIACORE分析により分析されうる。
ディスプレイライブラリーメンバーはまた、ヒトプラークへの結合についてスクリーニングされうる。
本明細書に記載されたディスプレイライブラリースクリーニング方法は、好ましくは、非標的分子に結合するディスプレイライブラリーメンバーを捨てる選択またはスクリーニング過程を含む。非標的分子の例は、以下のものを含む：ストレプトアビジンおよび(ii)ApoE-NTD。
一つの実行において、いわゆる「ネガティブ選択」段階は、標的および関連した非標的分子と関連しているが異なる非標的分子との間を識別するために用いられる。ディスプレイライブラリーまたはそのプールは、非標的分子に接触させられる。非標的を結合しない試料のメンバーが収集され、標的分子への結合についての次の選択に、または次のネガティブ選択についてでも、用いられる。ネガティブ選択段階は、標的分子に結合するライブラリーメンバーを選択する前または後でありうる。
もう一つの実行において、スクリーニング段階が用いられる。ディスプレイライブラリーメンバーが標的分子に結合するとして単離された後、各単離されたライブラリーメンバーは、非標的分子(例えば、上で列挙された非標的)に結合するそれの能力について試験される。例えば、ハイスループットELISAスクリーニングがこのデータを得るために用いられうる。ELISAスクリーニングはまた、各ライブラリーメンバーの標的への結合についての定量的データを得るために用いられうる。非標的および標的結合データは、標的MHCペプチド複合体に特異的に結合するライブラリーメンバーを同定するために比較される(例えば、コンピュータおよびソフトウェアを用いて)。
本発明の抗体または抗体断片は、VLDLまたは他のリポタンパク質粒子の存在下においてApoEに結合する可能性がある。本発明の抗体は、典型的には、ApoE-CTDに対する最小限の結合特異性、例えば、VLDLの存在下において1 nMまたは100 nMより大きい結合についての平衡定数、を以てApoEに結合する。VLDLは任意の適した形で存在しうる。例えば、ヒト血漿が結合アッセイに添加されうる。50%までのヒト血漿がアッセイに添加されうるが、例えば、10%まで、20%まで、30%まで、または40%までのヒト血漿が含まれうる。
候補ポリペプチドはまた、ApoE-NTDへの結合についてスクリーニングされうる。ApoE-NTDは組換えで産生されうる、または組換えもしくは天然に存在するApoEから、例えばトロンビンの作用により、切断されうる。
一つの態様において、候補ポリペプチドは、星状細胞への結合についてスクリーニングされうる。選択されたポリペプチドは星状細胞に結合しない、またはApoE-CTDへより星状細胞へのずっと低い親和性、例えば、2分の1、5分の1、10分の1、20分の1もしくは50分の1の親和性、を以て結合することが好ましいが、必須ではない。
ApoE-CTDに結合する候補ディスプレイライブラリーメンバーを選択した後、各候補ディスプレイライブラリーメンバーは、例えば、その標的に対する結合性質をさらに特徴付けるために、さらに分析されうる。各候補ディスプレイライブラリーメンバーは、1つまたは複数の二次スクリーニングアッセイにかけられうる。アッセイは、結合性質、触媒性質、生理学的性質(例えば、細胞毒性、腎クリアランス、免疫原性)、構造的性質(例えば、安定性、高次構造、オリゴマー化状態)、または別の機能的性質についてでありうる。同じアッセイが繰り返して用いられうるが、例えば、pH、イオンまたは温度の感受性を測定するために、様々な条件で用いられうる。
必要に応じて、アッセイは、直接的にディスプレイライブラリーメンバーを、ディスプレイされた抗体をコードする核酸から産生された組換え抗体、またはディスプレイされた抗体の配列に基づいて合成された合成抗体を用いることができる。アッセイは、好ましくは、ApoE-CTDを結合する抗体がまたヒトプラークに結合するかどうか、またはVLDLの存在下においてApoE-CTDに結合するかどうかを測定する段階を含む。例示的な結合性質についてのアッセイ法は、ELISA、蛍光共鳴エネルギー移転(FRET)およびアルファ-スクリーンのような均一な結合アッセイ法、表面プラズモン共鳴(SPR)、タンパク質アッセイ法および細胞アッセイ法を含む。
ディスプレイライブラリーによりコードされた抗体はまた、ELISAを用いて結合性質についてスクリーニングされうる。例えば、ApoE-CTDを結合する各候補抗体は、底表面がApoE-CTD、VLDLまたはApoE-NTDでコーティングされているマイクロタイタープレートと接触させられる。プレートは、非特異的に結合したポリペプチドを除去するために緩衝液で洗浄される。その後、プレートに結合したポリペプチドの量は、ポリペプチド、例えば、ポリペプチドのタグまたは定常部分、を認識することができる抗体でプレートを探索することにより測定される。抗体は、適当な基質が供給された場合、比色定量的生成物を生じるアルカリホスファターゼのような酵素に連結される。ポリペプチドは、細胞から精製されうる、またはディスプレイライブラリー形式において、例えば、繊維状バクテリオファージコートへの融合体として、アッセイされうる。ELISAのもう一つのバージョンにおいて、多様性鎖ライブラリーの各ポリペプチドは、マイクロタイタープレートの異なるウェルをコーティングするために用いられる。ELISAは、その後、一定の標的分子を用いて各ウェルに問い合わせを行うように進行する。ポリペプチドは、それが、ApoE-CTDにおいて少なくとも2xバックグラウンドを示すが、ApoE-NTDまたはストレプトアビジンのような陰性対照タンパク質において1xバックグラウンド未満を示す場合には、ELISAにおいてApoE-CTDを特異的に結合する。
均一な結合アッセイ法は、候補抗体の標的との結合相互作用が、必要とされることになる追加の液体操作なしに、アッセイのすべての成分が添加された後に分析されうるアッセイ法である。例えば、蛍光共鳴エネルギー移転(FRET)は、均一なアッセイ法として用いられうる(例えば、Lakowicz et al.、米国特許第5,631,169号参照)。均一なアッセイ法のもう一つの例は、アルファスクリーン(Packard Bioscience, Meriden, Connecticut, USA)である。
均一なアッセイ法は、候補ポリペプチドがディスプレイライブラリー媒体、例えば、バクテリオファージ、に付着している間、行われうる。
ディスプレイライブラリーから単離された分子と標的の結合相互作用は、表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて分析されうる。SPRまたは生体分子相互作用分析(BIA)は、反応体のいずれにも標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用を検出する。BIAチップの結合表面における質量における変化は、結果として、表面近くの光の屈折率の変化(表面プラズモン共鳴(SPR)の光学的現象)を生じる。屈折度における変化は、検出可能なシグナルを生じ、生体分子間のリアルタイム反応の指標として測定される。SPRを用いるための方法は、例えば、Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705に記載され、オンライン供給源は、BIAcore International AB(Uppsala, Sweden)により提供されている。
SPRからの情報は、生体分子の標的への結合についての、平衡解離定数(KD)、ならびにKonおよびKoffを含む動力学的パラメーターの正確かつ定量的な測定を提供するために用いられうる。そのようなデータは、異なる生体分子を比較するために用いられうる。例えば、多様性鎖のライブラリーから選択された核酸によりコードされたタンパク質は、標的に対する高親和性をもつ、または遅いKoffを有する個体を同定するために比較されうる。この情報はまた、構造活性相関(SAR)を明らかにするために用いられうる。例えば、親タンパク質の成熟型の動力学的および平衡結合パラメーターが、親タンパク質のパラメーターと比較されうる。特定の結合パラメーター、例えば、高親和性および遅いKoff、と相関する、所定の位置における異なるアミノ酸が同定されうる。この情報は、構造モデリングと組み合わせられうる(例えば、相同性モデリング、エネルギー最小化または結晶学もしくはNMRによる構造決定を用いて)。結果として、タンパク質とそれの標的の間の物理的相互作用の理解が公式化され、他の設計過程を導くために用いられうる。
ディスプレイライブラリーから同定された抗体は、固体支持体上に、例えば、ビーズまたはアレイ上に、固定化されうる。タンパク質アレイについて、ポリペプチドのそれぞれが、支持体上の固有のアドレスに固定化される。典型的には、アドレスは、二次元アドレスである。タンパク質アレイは下に記載されている(例えば、「診断法」を参照)。
ApoE-CTDに結合するとして同定される候補抗体は、抗体が細胞内に産生される、細胞から分泌される、または細胞表面に付着しているように、抗体をコードするベクター核酸配列を宿主細胞へ形質転換することによりスクリーニングされうる。細胞は、ApoE-CTDに結合する抗体について、例えば、細胞表現型または細胞媒介性活性における変化を検出することによりスクリーニングされうる。例えば、活性は、細胞または補体媒介性細胞毒性でありうる。
もう一つの態様において、細胞のライブラリーは、細胞アレイの形をとる。細胞アレイは、同様に、任意の適切な検出可能な活性についてスクリーニングされうる。
C. 抗体の産生
標準組換え核酸方法が、本発明の抗体を発現させるために用いられうる。一般的に、抗体をコードする核酸配列は、核酸発現ベクターへクローニングされる。もちろん、抗体が複数のポリペプチド鎖を含む場合には、各鎖が、同じまたは異なる細胞において発現される、発現ベクター、例えば、同じまたは異なるベクター、へクローニングされなければならない。抗体断片が十分に小さい、すなわち、50アミノ酸未満を有する、場合には、自動化有機合成方法を用いて合成されうる。抗体を産生するための方法もまた、下に提供されている。
抗体リガンドを発現させるための発現ベクターは、ポリペプチドリガンドまたはその断片をコードするセグメントに加えて、対象となる核酸に実施可能に連結された、例えば、プロモーターを含む制御配列を含みうる。本発明の組換え構築物を作製するための多数の適したベクターおよびプロモーターは、当業者に公知であり、市販されている。以下のベクターは、例として提供されている。細菌：pBs、ファージスクリプト(phagescript)、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene, La Jolla, California, USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540およびpRIT5(Pharmacia, Uppsala, Sweden)。真核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXTI、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL(Pharmacia)。好ましいライブラリーの一つの好ましいクラスは、下に記載されているディスプレイライブラリーである。
当業者に周知の方法が、本発明の抗体および適切な転写/翻訳制御シグナルを含むベクターを構築するために用いられうる。これらの方法は、インビトロ組換えDNA技術、合成技術およびインビボ組換え/遺伝的組換えを含む。例えば、Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (2001)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley interscience, NY (1989))に記載された技術を参照されたい。プロモーター領域は、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは検出可能なマーカーを含む他のベクターを用いて任意の所望の遺伝子から選択されうる。2つの適切なベクターは、pKK232-8およびpCM7である。特定の名前を付けられた細菌のプロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPおよびtrcを含む。真核生物のプロモーターは、CMV最初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、マウスメタロチオネイン-Iおよび様々な技術分野公知の組織特異的プロモーターを含む。
一般的に、組換え発現ベクターは、複製起点、および宿主細胞の形質転換を認める選択マーカー、例えば、大腸菌(E. coli)のアンピシリン耐性遺伝子およびS. セレビシエ(S. cerevisiae)栄養要求性マーカー(URA3、LEI2、HIS3およびTRPl遺伝子のような)、および下流構造配列の転写を支配する高発現性遺伝子由来のプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、とりわけ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)のような糖分解酵素、α-ファクター、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロン由来でありうる。本発明のポリヌクレオチドは、翻訳開始および終結配列、ならびに好ましくは、細胞膜周辺腔または細胞外の培地への翻訳されたタンパク質の分泌を指揮する能力があるリーダー配列と適当な相で集合させられる。任意で、本発明の核酸は、所望の特性、例えば、発現された組換え産物の安定化または単純化された精製、を与えるN末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。細菌のための有用な発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを適した翻訳開始および終結シグナルと共に、任意で実施可能な読み取り相において機能性プロモーターと、挿入することにより構築される。ベクターは、1つまたは複数の表現型選択マーカー、ならびにベクターの維持を保証しうる、および、望ましい場合には、宿主内での増幅を与えうる複製起点を含む。形質転換のための適切な原核生物宿主は、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)ならびにシュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)およびスタフィロコッカス属(Staphylococcus)内の様々な種を含むが、他もまた選択できる材料として用いられうる。
代表的ではあるが、非限定的例として、細菌のための有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝要素を含む市販されているプラスミド由来の選択マーカーおよび細菌の複製起点を含みうる。そのような商業的ベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)およびpGEM1(Promega, Madison, Wisconsin, USA)を含む。
本発明はさらに、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供し、核酸は、公知の形質転換、トランスフェクションまたは感染方法を用いて宿主細胞へ導入されている。例えば、宿主細胞は、多様性鎖から構築されたライブラリーのメンバーを含みうる。宿主細胞は、哺乳動物細胞のような真核生物の宿主細胞、酵母細胞のような下等真核生物の宿主細胞でありうる、または宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞でありうる。組換え構築物の宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE、デキストラン媒介型トランスフェクション、または電気穿孔法によりもたらされうる(Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986))。
任意の宿主/ベクター系は、本発明の標的要素の1つまたは複数を同定するために用いられうる。これらは、限定されるわけではないが、HeLa細胞、CV-1細胞、COS細胞、Sf9細胞およびHEK293T細胞のような真核生物の宿主、加えて大腸菌および枯草菌のような原核生物の宿主を含む。最も好ましい細胞は、特定のレポーターポリペプチドもしくはタンパク質を通常には発現させない、またはレポーターポリペプチドもしくはタンパク質を低い自然レベルで発現させるものである。
本発明の宿主はまた、酵母または他の真菌でありうる。酵母において、構成的または誘導性プロモーターを含む多数のベクターが用いられうる。概説として、Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13 (1988); Grant et al. (1987) "Expression and Secretion Vectors for Yeast", Methods Enzymol. 153:516-544 (1987); およびThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II (1982)を参照されたい。
本発明の宿主はまた、形質転換、トランスフェクションおよび/または感染されうる、大腸菌(E. coli)、霊菌(Serratia marescans)のような腸内細菌科、桿菌(bacilli)、様々なシュードモナス(pseudomonads)または他の原核生物のような原核細胞でありうる。
本発明はさらに、本発明の抗体を含むように遺伝子操作された宿主細胞を提供する。例えば、そのような宿主細胞は、公知の形質転換、トランスフェクションまたは感染方法を用いて宿主細胞へ導入された本発明の核酸を含みうる。本発明はなおさらに、本発明のポリヌクレオチドを発現させるように遺伝子操作された宿主細胞を提供し、そのようなポリヌクレオチドは、細胞において抗体の発現を作動させる、宿主細胞に異種性の制御配列と実施可能に結合している。
宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核生物の宿主細胞、酵母細胞のような下等真核生物の宿主細胞でありうる、または宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞でありうる。
組換え構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE、デキストラン媒介型トランスフェクション、または電気穿孔法によりもたらされうる(Davis, L. et al., (1986) Basic Methods in Molecular Biology)。本発明のポリヌクレオチドの1つを含む宿主細胞は、単離された断片(ORFの場合)によりコードされる遺伝子産物を産生する従来の方式で用いられうる。
任意の適した宿主/ベクター系が、本発明の多様性抗体の1つまたは複数を発現させるために用いられうる。様々な哺乳動物細胞培養系もまた、組換え抗体を発現させるために用いられうる。
抗体、例えば、Fab、は細菌細胞、例えば、大腸菌細胞、において産生されうる。例えば、Fabが、そのディスプレイ実体とバクテリオファージタンパク質(またはその断片)の間に抑制可能な終止コドンを含むファージディスプレイベクターにおける配列によりコードされている場合には、ベクター核酸は、終止コドンを抑制できない細菌細胞へシャッフリングされうる。この場合、Fabは、gene IIIタンパク質と融合されず、培地へ分泌される。
抗体はまた、真核細胞において産生されうる。一つの態様において、抗体(例えば、scFv)は、ピチア(Pichia)(例えば、Powers et al. (2001) J. Immunol. Methods 251:123-35)、ハンゼヌラ(Hansenula)またはサッカロマイセス(Saccharomyces)のような酵母細胞において発現される。
一つの好ましい態様において、抗体は哺乳動物細胞において産生される。クローン抗体またはその抗原結合断片を発現させるための好ましい哺乳動物の宿主細胞は、例えば、KaufmanおよびSharp((1982) Mol. Biol. 159:601-621)に記載されているようなDHFR選択マーカーと共に用いるチャイニーズハムスター卵巣(Chinese Hamster Ovary)(CHO細胞)(Urlaub and Chasin((1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220)に記載されたdhfr- CHO細胞を含む)、リンパ性細胞系、例えば、NS0骨髄腫細胞およびSP2細胞、COS細胞、ならびにトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック哺乳動物、由来の細胞を含む。例えば、細胞は、哺乳動物の上皮細胞である。
多様な免疫グロブリンドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を制御する配列(例えば、複製起点)および選択マーカー遺伝子のような追加の配列を有しうる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする(例えば、米国特許第4,399,216号、第4,634,665号、および第5,179,017号参照)。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上に、G418、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートのような薬物耐性を与える。好ましい選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子(メトトレキセート選択/増幅でのdhfr-宿主細胞に用いる)およびneo遺伝子(G418選択について)を含む。
抗体またはその抗原結合部分の組換え発現のための例示的な系において、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターは、リン酸カルシウム媒介型トランスフェクションによりdhfr- CHO細胞へ導入される。組換え発現ベクター内において、抗体重鎖および軽鎖遺伝子は、それぞれ、遺伝子の高レベルの転写を作動させうるエンハンサー/プロモーター制御エレメント(例えば、CMVエンハンサー/AdMLPプロモーター制御エレメントまたはSV40エンハンサー/AdMLPプロモーター制御エレメントのようなSV40、CMV、アデノウイルスなど由来)に実施可能に連結される。組換え発現ベクターはまた、メトトレキセート選択/増幅を用いるベクターでトランスフェクションされたCHO細胞の選択を可能にするDHFR遺伝子を有する。選択された形質転換体宿主細胞は、抗体重鎖および軽鎖の発現を可能にするように培養され、無傷の抗体が培地から回収される。標準分子生物学技術が、組換え発現ベクターを調製する、宿主細胞をトランスフェクションする、性質転換体について選択する、宿主細胞を培養する、および培地から抗体を回収するために用いられる。例えば、いくつかの抗体が、プロテインAまたはプロテインGでのアフィニティークロマトグラフィーにより単離されうる。
Fcドメインを含む抗体について、抗体産生系は、好ましくは、Fc領域がグリコシル化されている抗体を合成する。例えば、IgG分子のFcドメインは、CH2ドメインにおけるアスパラギン297位においてグリコシル化されている。このアスパラギンは、二触覚型オリゴ糖での修飾のための部位である。このグリコシル化は、Fc受容体および補体C1qにより媒介されるエフェクター機能に必要とされる(Burton and Woof (1992) Adv. Immunol. 51:1-84; Jefferis et al. (1998) Immunol. Rev. 163:59-76)。一つの好ましい態様において、Fcドメインは、アスパラギン297位に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳動物発現系において産生される。Fcドメインはまた、他の真核生物の翻訳後修飾を含みうる。
抗体は、トランスジェニック動物により産生されうる。例えば、米国特許第5,849,992号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において抗体を発現させる方法を記載する。乳特異的プロモーターおよび対象となる抗体をコードする核酸および分泌のためのシグナル配列を含む導入遺伝子が構築される。そのようなトランスジェニック哺乳動物の雌により産生される乳は、そこに分泌された、対象となる抗体を含む。抗体は、乳から精製されうる、またはいくつかの適用については、直接的に用いられうる。
本発明のApoE-CTD抗体は、ディスプレイライブラリーから単離されうり、それの配列および/または構造は分析されうる。抗体は、公知の方法を用いて任意の所望の量で産生されうる。例えば、抗体は、化学合成、続いて、天然の高次構造、すなわち、正しいジスルフィド結合、を得るのに適切な酸化条件下での処理により有利に産生されうる。合成は、当業者に周知の方法により行われうる(Kelley et al., Genetic Engineering Principles and Methods, (Setlow, J.K., ed.), Plenum Press, NY., (1990) vol. 12, pp. 1-19; Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989), W.H. Freeman Co., San Francisco)。本発明によるポリペプチドはまた、サービスとしてポリペプチド合成を提供する会社(例えば、BACHEM Bioscience, Inc., King of Prussia, Pa.; Quality Controlled Biochemicals, Inc., Hopkinton, Mass)により商業的に調製されうる。
D. 診断方法
ApoE-CTDに結合し、かつ本明細書に記載されたおよび/または本明細書に詳述された方法により同定された抗体は、インビトロおよびインビボの診断的、治療的ならびに予防的有用性をもつ。
一つの局面において、本発明は、インビトロで(例えば、生検のような生体試料)またはインビボで(例えば、対象におけるインビボ画像化)、存在ApoE-CTDを検出するための診断方法を提供する。
方法は以下の段階を含む：(i)試料を本発明の抗体と接触させる段階；および(ii)抗体と試料間の複合体の形成を検出する段階。方法はまた、参照試料(例えば、対照試料)を抗体に接触させる段階、および抗体と試料間の複合体の形成の程度を参照試料についての同じものに対して測定する段階を含みうる。対照試料または対象に対して、試料または対象における複合体の形成の変化、例えば、統計学的に有意な変化、は試料におけるApoE-CTDの存在を示しうる。
もう一つの方法は以下の段階を含む：(i)本発明の抗体を対象へ投与する段階；および(ii)抗体と対象の間の複合体の形成を検出する段階。検出段階は、複合体の形成の位置または時間を測定することを含みうる。
抗体リガンドは、結合したまたは結合していない抗体の検出を容易にするために検出可能な物質で直接的にまたは間接的に標識されうる。適した検出可能な物質は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセンス物質および放射性物質を含む。
本発明の抗体とApoE-CTDの間の複合体形成は、ApoE-CTDに結合した抗体かまたは結合していない抗体のいずれかを測定または可視化することにより検出されうる。通常の検出アッセイ法、例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)、または組織免疫組織化学法が用いられる。抗体を標識することに加えて、ApoE-CTDの存在は、検出可能な物質で標識された標準および標識されていない抗体を利用する競合免疫測定法により試料においてアッセイされうる。このアッセイの一つの例において、生体試料、標識された標準、および抗体は、混合され、非標識リガンドに結合した標識標準の量が測定される。試料におけるApoE-CTDの存在の量は、抗体に結合した標識標準の量に反比例する。
フルオロフォアおよび発色団標識された抗体が調製されうる。抗体は、約310 nmまでの波長をもつ光を吸収するため、蛍光部分は、310 nmより上、および好ましくは、400 nmより上の波長において実質的な吸収をもつように選択されるべきである。様々な適した蛍光および発色団は、Stryer (1968) Science 162:526およびBrand, L. et al. (1972) Annual Review of Biochemistry 41:843-868により記載されている。抗体は、米国特許第3,940,475号、第4,289,747号および第4,376,110号に開示されたもののような通常の手順により蛍光発色団で標識されうる。上記の多数の所望の性質をもつ蛍光剤の1つの群は、フルオレセインおよびローダミンを含むキサンテン染料である。蛍光化合物のもう一つの群は、ナフチルアミンである。いったんフルオロフォアまたは発色団で標識されたならば、抗体は、試料におけるApoE-CTDの存在または位置を、例えば、蛍光顕微鏡法(共焦点またはデコンヴォルーション顕微鏡法のような)を用いて、検出するために用いられうる。
免疫組織化学は、本明細書に記載された抗体を用いて行われうる。例えば、抗体は、標識(精製タグまたはエピトープタグのような)と共に合成されうる、または、例えば、標識もしくは標識結合群を結合させることにより、検出可能に標識されうる。例えば、キレート化剤が抗体に付着させられうる。抗体は、その後、組織学的調製物、例えば、顕微鏡スライド上にある組織の固定切片、に接触させられる。結合のためのインキュベーション後、調製物は、結合していない抗体を除去するために洗浄される。調製物は、その後、抗体が調製物へ結合したかどうかを同定するために、例えば、顕微鏡法を用いて、分析される。
もちろん、抗体は、結合時点において標識されてなくてもよい。結合および洗浄後、抗体は、それを検出可能にするために標識される。
抗体はまた、タンパク質アレイ上に固定化されうる。タンパク質アレイは、例えば、医学的試料(単離された細胞、血液、血清、生検などのような)をスクリーニングするために、診断ツールとして用いられうる。もちろん、タンパク質アレイはまた、例えば、ApoE-CTDに結合する、他のリガンドを含んでもよい。
ポリペプチドアレイを作製する方法は、例えば、De Wildt et al. (2000) Nature Biotech. 18:989-994; Lueking et al. (1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Ge (2000) Nuc. Acids Res. 28:e3; MacBeath and Schreiber (2000) Science 289:1760-1763; WO 01/40803およびWO 99/51773A1に記載されている。アレイについてのポリペプチドは、例えば、市販されている、例えば、Genetic MicroSystems and Affymetrix (Santa Clara, California, USA)またはBioRobotics(Cambridge, UK)社製の、ロボット装置を用いて、高速度でスポットされうる。アレイ基板は、例えば、ニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば、表面修飾ガラス、でありうる。アレイはまた、多孔質マトリックス、例えば、アクリルアミド、アガロースまたは別のポリマー、を含みうる。
例えば、アレイは、例えば、De Wildt, 前記に記載されているような、抗体のアレイでありうる。ポリペプチドリガンドを産生する細胞は、アレイ形式でのフィルター上で増殖されうる。ポリペプチド産生が誘導され、発現されたポリペプチドは、細胞の位置においてフィルターへ固定化される。
抗体アレイは、多様性鎖ライブラリー由来の各固定化抗体への標的の結合の程度を測定するために標識された標的と接触させられうる。標的が標識されていない場合には、標識されていない標的の結合を検出するために、例えば、標識されたプローブを用いて、サンドイッチ方法が用いられうる。
アレイの各アドレスにおける結合の程度についての情報は、例えば、コンピュータデータベースにおいて、プロファイルとして保存されうる。抗体アレイは、複製物として作製され、例えば、標的および非標的の、結合プロファイルを比較するために用いられうる。従って、抗体アレイは、1つ以上の分子に関して所望の結合性質をもつ多様性鎖ライブラリーの個々のメンバーを同定するために用いられうる。
さらにもう一つの態様において、本発明は、インビボでApoE-CTD含有プラークの存在を検出するための方法を提供する。方法は、(i)検出可能なマーカーに結合した本発明の抗体を対象(例えば、アルツハイマー病または全身性アミロイドーシスをもつ患者)に投与する段階；(ii)ApoE-CTD含有プラークに結合したその検出可能なマーカーを検出するための手段に対象を曝す段階を含む。例えば、対象は、例えば、NMRまたは他の断層撮影手段により、画像化される。
本発明に従っての画像診断法に有用な標識の例は、131I、111In、123I、99mTc、32P、125I、3H、14Cおよび188Rhのような放射標識、フルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、陽電子放出断層撮影法(「PET」)スキャナーにより検出可能な陽電子放出同位元素、ルシフェリンのような化学ルミネセンス剤、ならびにペルオキシダーゼまたはホスファターゼのような酵素マーカーを含む。短距離検出器探針により検出可能な同位元素のような短距離放射体も用いられうる。ポリペプチドリガンドは、公知の技術を用いてそのような試薬で標識されうる。例えば、抗体の放射標識に関する技術についてWensel and Meares (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York、およびD. Colcher et al. (1986) Methods Enzymol. 121:802-816を参照されたい。
本発明の放射標識リガンドもまた、インビトロの診断検査に用いられうる。同位体標識されたリガンドの特異的活性は、放射性標識の半減期、同位体純度、および標識が抗体へどのように取り込まれているか、に依存する。
ポリペプチドを放射性同位元素(14C、3H、35S、125I、32P、131Iのような)で標識するための手順は、一般的に知られている。例えば、トリチウム標識手順は、米国特許第4,302,438号に記載されている。例えば、マウスモノクローナル抗体について適応される場合の、ヨウ素化、トリチウム標識、および35S標識手順は、例えば、Goding, J.W. (Monoclonal Antibodies: Principles And Practice: Production And Application Of Monoclonal Antibodies In Cell Biology, Biochemistry, And Immunology 第2版, London, Orlando, Academic Press (1986) polypeptide 124-126)およびそこに引用された参考文献により記載されている。抗体のようなポリペプチドをヨウ素化するための他の手順は、Hunter and Greenwood (1962) Nature 144:945, David et al. (1974) Biochemistry 13:1014-1021ならびに米国特許第3,867,517号および第4,376,110号により記載されている。画像化において有用である放射性標識元素は、例えば、123I、131I、111Inおよび99mTcを含む。抗体をヨウ素化するための手順は、Greenwood, F. et al. (1963) Biochem. J. 89:114-123; Marchalonis, J. (1969) Biochem. J. 113:299-305; およびMorrison, M. et al. (1971) Immunochemistry 8:289-297により記載されている。99mTc標識についての手順は、Burchiel, S. et al. (eds.), Tumor Imaging: The Radioimmunichemical Detection of Cancer, New York: Masson 111-123 (1982)におけるRhodes, B. et al.およびそこに引用されている参考文献により記載されている。111In標識抗体に適した手順は、Hnatowich, D.J. et al. (1983) J. Immun. Methods 65:147-157, Hnatowich, D. et al. (1984) J. Applied Radiation 35:554-557およびBuckley, R.G. et al. (1984) F.E.B.S. Lett. 66:202-204により記載されている。
放射標識された抗体の場合、抗体は、患者に投与され、抗体が反応するプラークに局在し、例えば、γカメラまたは放出断層撮影法を用いる放射性核スキャニングのような公知の技術を用いて、インビボで検出または「画像化」される。または、Brookhaven National Laboratoryに設置された指定Pet VIのような陽電子放出水平断層撮影法スキャナが、放射性標識が陽電子を放出する場合(例えば、11C、18F、15Oおよび13N)に用いられうる。
磁気共鳴画像法(MRI)は、生きている対象の内部特徴を可視化するためにNMRを用い、予後、診断、処置および手術に有用である。MRIは、明らかな利点として、放射性トレーサー化合物なしに用いられうる。いくつかのMRI技術は、公開された欧州特許出願EP-A-0 502 814に要約されている。一般的に、異なる環境における水陽子の緩和時間定数T1およびT2に関する差が、画像を作成するために用いられる。しかしながら、これらの差は、鮮明な高解像度の画像を提供するには不十分でありうる。
これらの緩和時間定数における差は、造影剤により増強されうる。そのような造影剤の例は、多数の磁気性剤、常磁性剤(主にT1を変化させる)および強磁性体または超常磁性体(主にT2応答を変化させる)を含む。キレート(例えば、EDTA、DTPA、およびNTSキレート)は、いくつかの常磁性物質(例えば、Fe+3、Mn+2、Gd+3)を付着する(かつ毒性を低減させる)ために用いられうる。他の物質は、粒子、例えば、直径が10 μm未満〜約10 nMまで、の形をとりうる。粒子は、強磁性、反強磁性、または超常磁性の性質をもちうる。粒子は、例えば、磁性(Fe3O4)、-Fe2O3、フェライト、および遷移元素の他の磁性無機化合物を含みうる。磁性粒子は、非磁性物質を有するおよび有しない、1つまたは複数の磁性結晶を含みうる。非磁性物質は、セファロース、デキストラン、デキストリン、デンプンなどのような合成または天然の重合体を含みうる。
本発明の抗体はまた、NMR活性19F原子、または(i)自然で大量のフッ素原子の実質的全部が19F同位元素であり、従って、実質的に全部のフッ素含有化合物がNMR活性である；(ii)トリフルオロ無水酢酸のような任意の化学的活性のあるポリフッ素化化合物が比較的安価で市販されている、および(iii)多くのフッ素化化合物が、ヘモグロビン代替として酸素を運ぶために利用される過フッ素化ポリエーテルのような、ヒトでの使用に医学的に受け入れられることが見出されているのと同程度における複数のそのような原子を含む指示群で標識されうる。インキュベーションのためのそのような時間を可能にした後、MRIスキャンが、Pykett (1982) Scientific American 246:78-88により記載されたものの一つのような装置を用いて行われる。
また本発明の範囲内では、キットは、本発明の抗体、および診断的使用、例えば、インビトロで、例えば試料、例えば全身性アミロイドーシスをもつ患者からの生検、において、またはインビボで、例えば対象を画像化することにより、ApoE-CTDを検出するための抗体の使用、についての使用説明書を含んでいる。キットは、標識または追加の診断剤のような少なくとも1つの追加の試薬をさらに含みうる。インビボの使用について、抗体は、薬学的組成物として製剤化されうる。
E. 治療方法
ApoE-CTDに結合し、かつ本明細書に記載されたおよび/または本明細書に詳述された方法により同定されるポリペプチドは、治療的および予防的利用がある。例えば、これらのリガンドは、アルツハイマー病または全身性アミロイドーシスのような様々な疾患を処置、予防および/または診断するために、例えば、インビトロまたはエクスビボで、または対象において、例えばインビボで、培養中の細胞へ投与されうる。
本明細書に用いられる場合、用語「処置する」または「処置」は、抗ApoE-CTD抗体の、単独でまたは第二の作用物質と併用での、対象、例えば、疾患(例えば、本明細書に記載されているような疾患)、疾患の症状または疾患への素因をもつ患者への、疾患、疾患の症状または疾患への素因を治癒する、癒す、緩和する、軽減する、変化させる、治療する、改善する、好転させる、または影響を及ぼすという目的を以ての、適用または投与として定義される。
本明細書に用いられる場合、疾患を処置するのに有効な抗ApoE-CTDポリペプチドの量、すなわち「治療的有効量」とは、対象への単一または複数回用量投与により、またはそのような処置の非存在下において予想されるものを超えて、本明細書に記載されたような疾患をもつ対象を長期に治癒する、緩和する、軽減するまたは好転させるにおいて、有効であるリガンドの量を指す。
本明細書に用いられる場合、疾患を予防するのに有効な抗ApoE-CTDポリペプチドの量、すなわち、ポリペプチドの「予防的有効量」とは、対象への単一または複数回用量の投与により、疾患、例えば、アルツハイマー病、の発症または再発の出現を予防するまたは遅らせるにおいて、有効である、本明細書に記載された抗ApoE-CTDポリペプチド、例えば、抗ApoE-CTD抗体、の量を指す。
例えば、2つの状態間の定量的差を意味する、用語「誘導する」、「抑制する」、「増強する」、「上昇させる」、「増加させる」、「減少させる」などは、2つの状態間の差、例えば、統計学的有意差、を指す。
本明細書に用いられる場合、用語「対象」とは、ヒトおよび非ヒトの動物を含むことが意図される。好ましいヒトの動物は、異常な細胞増殖または細胞分化を特徴とする疾患をもつヒト患者を含む。本発明の用語「非ヒトの動物」は、すべての脊椎動物、例えば、非哺乳動物(ニワトリ、両生類、爬虫類のような)、および非ヒトの霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタなどのような哺乳動物、を含む。
用語「アミロイド疾患」とは、限定されるわけではないが、アルツハイマー病、原発性全身性アミロイドーシス、続発性全身性アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発性ニューロパシーI、家族性アミロイド多発性ニューロパシーIII、家族性非ニューロパシー性アミロイドーシス、遺伝性脳のアミロイド血管障害、家族性英国型認知症(FBD)、血液透析関連アミロイドーシス、家族性アミロイドーシス(フィンランド型)、家族性上皮下角膜アミロイド、II型糖尿病、遺伝性腎アミロイドーシス、下垂体アミロイドーシス、注入限局性アミロイドーシス（Injection localized amyloidosis)、甲状腺の髄様癌、心房性アミロイドーシス、家族性デンマーク型認知症(FDD)、およびダウン症候群を含むことが意図される。アミロイド原繊維が検出されるアミロイド疾患関連は、限定されるわけではないが、海綿状脳症、散発性クロイツフェルト・ヤコブ病、家族性クロイツフェルト・ヤコブ病、医療性プリオン疾患(iatropic prion disorderes)、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン-シュトラウスセラー-シャインケル疾患(GSS)、クールー、パーキンソン病、ハンチントン病、家族性筋萎縮性側索硬化症(ALS)、および慢性閉塞性肺疾患を含む。
さらになお、アミロイド状態は、脳、髄質または他の器官におけるアミロイド沈着物を伴う疾患として定義されうる。そのような疾患の例は、アルツハイマー病である。アミロイド沈着物を特徴とする他の認知症疾患は、海綿状脳症、散発性クロイツフェルト・ヤコブ病、家族性クロイツフェルト・ヤコブ病、医療性プリオン疾患、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン-シュトラウスセラー-シャインケル疾患(GSS)、クールー、パーキンソン病、ハンチントン病、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、ダウン症候群、免疫グロブリン軽鎖関連アミロイドーシスのような原発性全身性アミロイドーシス、アミロイドAタンパク質関連アミロイドーシスのような続発性全身性アミロイドーシス、家族性トランスサイレチン関連アミロイドーシスのような家族性全身性アミロイドーシス、家族性アポリポタンパク質A-I関連アミロイドーシス、家族性ゲルソリン関連アミロイドーシス、家族性フィブリノーゲンAα関連アミロイドーシス、家族性リソソームアミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発性ニューロパシーI、家族性アミロイド多発性ニューロパシーIII、家族性非ニューロパシー性アミロイドーシス、遺伝性脳のアミロイド血管障害、血液透析関連アミロイドーシス、家族性アミロイドーシス(フィンランド型)、家族性上皮下角膜アミロイド、II型糖尿病、遺伝性腎アミロイドーシス、下垂体アミロイドーシス、注入限局性アミロイドーシス、甲状腺の髄様癌、心房性アミロイドーシス、慢性閉塞性肺疾患、および家族性筋萎縮性側索硬化症(ALS)である。詳細な参考文献は、James C. Sacchettini and Jeffery W. Kelly: Nature Reviews, Drug Discovery, Vol. 1 April 2002, 267-275に見出されうる。
一つの態様において、対象はヒト対象である。または、対象は、本発明のポリペプチドが交差反応するApoE-CTD様抗原を発現させる哺乳動物でありうる。本発明のポリペプチドは、治療目的のためにヒト対象へ投与されうる(下でさらに考察されている)。さらに、抗ApoE-CTDポリペプチドは、獣医学的目的のために、またはヒト疾患の動物モデルとして、そのポリペプチドが結合するApoE-CTD様抗原を発現させる非ヒトの哺乳動物(例えば、霊長類、ブタまたはマウス)へ投与されうる。後者に関して、そのような動物モデルは、ポリペプチドの治療効力を評価する(例えば、用量の試験および投与の時間経過)ために有用でありうる。
インビボの態様について、接触段階は、対象において実施され、抗ApoE-CTDポリペプチドを対象へ、リガンドのプラークへの結合および処置、例えば、プラークの破壊、の両方を可能にするのに効果的な条件下で、投与することを含む。
抗ApoE-CTDポリペプチドを投与する方法は、「薬学的組成物」に記載されている。用いられる分子の適切な用量は、対象の年齢および体重ならびに用いられる特定の薬物に依存する。
抗ApoE-CTDリガンドは、天然の補体依存性細胞毒性(CDC)または抗体依存性細胞毒性活性(ADCC)によりApoE-CTD含有プラークを排除するようにインビボで直接的に用いられうる。本発明のポリペプチドは、補体を結合する、IgG1、-2もしくは-3由来のFc部分またはIgMの対応する部分のような、補体結合エフェクタードメインを含みうる。処置は、補体または補体を含む血清の添加により補われうる。さらに、本発明のポリペプチドでコーティングされたプラークの食作用は、補体タンパク質の結合により高められうる。
抗体にターゲットされたアミロイドプラークは、A型スカベンジャー受容体を通してミクログリアにより内部に取り入れられうる(Melanie I. Brazil, Haeyong Chung, and Frederick R. Maxfield. effects of Incorporation of Immunoglobulin G and complement Component C1q on Uptake and Degradation of Alzheimer's Disease Amyloid Fibrils by Microglia J. Biol. Chem., May 2000; 275:16941-16947)。または、ミクログリアのFc受容体と無関係の他の機構が、拡散した、3D6-免疫反応性の、チオ-S-陰性のプラークおよび可溶性Aβ部分を除去するにおいて役割を果たしている可能性がある(Wilcock DM, DiCarlo G. Henderson D, Jackson J, Clarke K, Ugen KE, Gordon MN, Morgan D: Intracranially administered anti-Abeta antibodies reduce beta-amyloid deposition by mechanisms both independent of and associated with microglial activation. J Neurosci 2003, 23:3745-3751)。この仮説と一致して、Fcノックアウトマウスもまた、Aβ免疫療法後、プラーク負荷量の低下を示した(Das P, Howard V, Loosbrock N, Dickson D, Murphy MP, Golde TE: Amyloid-beta immunization effectively reduces amyloid deposition in FcRgamma-/-knock-out mice. J Neurosci 2003, 23:8523-8)。
また本発明により含まれるのは、予防のために抗ApoE-CTDリガンドを用いることを含む、破壊することまたは除去することの方法である。例えば、これらの材料は、アルツハイマー病、全身性アミロイドーシスもしくは他のアミロイド疾患の発症または進行を予防するまたは遅らせるために用いられうる。
アルツハイマー病または全身性アミロイドーシスを処置するための本発明の治療方法の使用は、多数の利点を有する。ポリペプチドは、ApoE-CTDを特異的に認識するため、他の組織は残され、高レベルの作用物質は、治療が必要とされる部位へ直接的に送達される。本発明による処置は、臨床的パラメーターで効果的にモニターされうる。または、これらのパラメーターは、そのような処置がいつ用いられるべきかを示すために用いられうる。
F. 薬学的組成物
もう一つの局面において、本発明は、組成物、例えば、薬学的に許容される担体と共に製剤化された本発明の抗体を含む、薬学的に許容される組成物を提供する。本明細書に用いられる場合、用語「薬学的組成物」とは、治療的組成物に加えて、インビボの画像化のための標識されたリガンドを含む。
本明細書に用いられる場合、「薬学的に許容される担体」は、任意の生理学的に適合性のある溶媒、分散媒、コーティング剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内の、筋肉内の、皮下の、非経口の、脊髄の、または上皮の投与(例えば、注射または注入による)に適している。投与経路に依存して、活性化合物、すなわち、ポリペプチドは、酸の作用、および化合物を不活性化する可能性がある他の自然条件から化合物を保護しうる材料においてコーティングされうる。
本発明の組成物は、様々な形をとりうる。これらは、例えば、溶液、分散液または懸濁液、錠剤、ピル、粉末、リポソームおよび坐剤のような液体、半固体および固体剤形を含む。好ましい形は、投与および治療的適用の意図された様式に依存する。典型的な好ましい組成物は、抗体に関するヒトの投与のために用いられるものに類似した組成物のような、注射可能または注入可能な溶液の形をとる。好ましい投与様式は、非経口(例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内)である。好ましい態様において、抗ApoE-CTDポリペプチドは、静脈内注入または注射により投与される。もう一つの好ましい態様において、抗ApoE-CTDリガンドは、筋肉内または皮下注射により投与される。
本明細書に用いられる場合、句「非経口投与」および「非経口で投与される」とは、腸のおよび局所の投与以外の、通常には注射による、投与の様式を意味し、非限定的に、静脈内の、筋肉内の、動脈内の、髄腔内の、嚢内の、眼窩内の、心臓内の、皮内の、腹腔内の、経気管の、皮下の、表皮下の、関節内の、被膜下の、クモ膜下の、髄腔内の、硬膜外の、および胸骨内の注射ならびに注入を含む。
薬学的組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定していなければならない。
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の規則正しい構造として製剤化されうる。無菌注射用溶液は、適切な溶媒中の必要とされる量での活性化合物(すなわち、ポリペプチド)を上で列挙された成分の1つまたは組み合わせと混合し、必要に応じて、続いて濾過滅菌により調製されうる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒および上で列挙されたものからの必要とされる他の成分を含む滅菌媒体へ活性化合物を組み入れることにより調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、前に滅菌濾過されたその溶液からの活性成分プラス任意の追加の望ましい成分の粉末を生じる減圧および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用により、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持されうる。注射可能な組成物の延長した吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチン、を組成物に含むことによりもたらされうる。
本発明の抗体は、当技術分野において公知の様々な方法により投与されうるが、多くの適用について、好ましい投与経路/様式は、静脈内注射または注入である。例えば、治療的適用について、抗体は、7〜25 mg/m2のような約1〜100 mg/m2の用量に達するように、30、20、10、5または1 mg/min未満の速度での静脈内注入により投与されうる。投与の経路および/または様式は、所望の結果に依存して異なる。
薬学的組成物は、当技術分野において公知の医学的装置で投与されうる。例えば、好ましい態様において、本発明の薬学的組成物は、米国特許第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号または第4,596,556号に開示された装置のような、針のない皮下注射装置で投与されうる。本発明に有用な周知のインプラントおよびモジュールの例は、以下のものを含む：正確な注入速度で薬物を分配するための埋め込み可能な微量注入ポンプを開示する、米国特許第4,487,603号；連続的薬物送達のための可変性流量埋め込み可能な注入装置を開示する米国特許第4,447,224号；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧性薬物送達システムを開示する、米国特許第4,439,196号；および浸透圧性薬物送達システムを開示する、米国特許第4,475,196号。もちろん、多くの他のそのようなインプラント、送達システムおよびモジュールも知られている。
特定の態様において、本発明の化合物は、インビボで適切な分配を保証するように製剤化されうる。例えば、血液脳関門(BBB)は、高親水性化合物を排除する。本発明の治療的化合物がBBBを通過するのを保証するために、それらは、例えば、リポソームに製剤化されうる。リポソームを製造する方法について、例えば、米国特許第4,522,811号、第5,374,548号および第5,399,331号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または器官へ選択的に輸送される1つまたは複数の部分を含み、それに従って、標的とされた薬物送達を増強しうる(例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685)。
投与計画は、最適な所望の応答(例えば、治療的応答)を与えるように調整される。例えば、単一ボーラスが投与されうる、いくつかに分割された用量がゆっくり時間をかけて投与されうる、または用量は、治療的状況の緊急事態により示されることがあれば、比例して低減または増加されうる。投与の容易さおよび用量の均一性のために用量単位形で親の組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書に用いられる場合の用量単位形とは、処置されるべき対象に対して単位用量として適した物理的に別々の単位を指す；各単位は、必要とされる薬学的担体に付随して所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物のあらかじめ決められた量を含む。本発明の用量単位形についての特定化は、(a)活性化合物の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに(b)個体における処置の感受性についてのそのような活性化合物を配合する技術に内在する制限、により規定される、かつに直接的に依存している。
本発明の抗体の治療的または予防的有効量についての例示的な、非限定的範囲は、0.1〜20 mg/kg、より好ましくは、1〜10 mg/kgである。抗体は、約1〜100 mg/m2または約5〜30 mg/m2の用量に達するように30、20、10、5または1 mg/min未満の速度で静脈内注入により投与されうる。IgGより低い分子量をもつ抗体断片について、適切な量は、比例して少なくありうる。用量値は、緩和されるべき状態の型および重症度によって異なりうることは、留意されるべきである。任意の特定の対象について、特定の投与計画は、個体の必要性、および組成物の投与を管理または監督する人のプロとしての判断に従って長い期間をかけて調整されるべきであること、ならびに、本明細書に示された用量範囲は例示的であるのみであり、主張された組成物の範囲または実施を限定することを意図されないことは、さらに理解されるべきである。
本発明の薬学的組成物は、本発明の抗体の「治療的有効量」または「予防的有効量」を含みうる。所望の治療結果は、典型的には、処置されることになっている個体が患っている疾患の1つまたは複数の症状の軽減または改善である。本発明の抗体の治療的量は、アミロイド沈着物の生成を減速させるまたは停止する、存在するアミロイド沈着物を除去する、根元的な疾患(続発性アミロイドーシスを起こす)を緩和する、および心臓または腎臓損傷により引き起こされる症状を軽減するように働く量でありうる。「治療的有効量」とは、所望の治療結果を達成するのに、必要な用量および期間における、有効な量を指す。組成物の治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびにポリペプチドリガンドの個体において所望の応答を誘発する能力のような因子に従って異なりうる。治療的有効量はまた、組成物の任意の毒性または有害な効果を、治療的有益な効果が上回るものである。「治療的有効量」は、好ましくは、測定可能なパラメーター、例えば、プラーク形成または増殖速度を、未処理の対象に対して、少なくとも20%、より好ましくは少なくとも約40%、よりいっそう好ましくは少なくとも約60%、およびさらにより好ましくは少なくとも約80%、抑制する。測定可能なパラメーターを抑制する化合物の能力は、ヒトにおける効力を予想する動物モデル系において評価されうる。または、組成物のこの性質は、当業者に公知のアッセイ法によるインビトロでの抑制のような化合物の抑制する能力を調べることにより評価されうる。
「予防的有効量」とは、所望の予防効果を達成するのに、必要な用量および期間における、有効な量を指す。所望の予防効果は、処置されることになっている個体において予防することが意図される疾患に関連した症状の発生もしくは進行における抑制または遅延である。典型的には、予防的用量は、疾患のより初期の前に、または、において、対象に用いられるため、予防的有効量は、治療的有効量より少ない。
また本発明の範囲内において、キットは、本発明の抗体、および使用、例えば、処置、予防的または診断的使用、についての使用説明書を含んでいる。一つの態様において、診断的適用についての使用説明書は、プラークに付随した型ApoE-CTDを、インビトロで、例えば試料、例えば、アルツハイマー病もしくは全身性アミロイドーシスをもつ患者由来の生検もしくは細胞、において、またはインビボで、検出するための抗体の使用を含む。もう一つの態様において、治療的適用についての使用説明書は、アルツハイマー病または全身性アミロイドーシスをもつ患者における示唆される用量および/または投与様式を含む。キットはさらに、診断剤または治療剤のような少なくとも1つの追加の試薬を含みうる。
以下の発明は以下の実施例によりさらに例証されるが、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用された、すべての参考文献、係属中の特許出願および公開された特許の内容は、全体として参照により本明細書に明白に組み入れられている。
本発明は、特に、その好ましい態様に関して示されかつ記載されているが、形式および詳細における様々な変化が、添付された特許請求の範囲により含まれる本発明の範囲から逸脱することなくそこになされうることは、当業者により理解されているものと思われる。
実施例
実施例1：抗体ライブラリー構成
VLDLに結合しないアミロイド疾患のプラークに見出されるApoEに結合する抗体は、DyaxファージミドライブラリーFab300におけるヒトファージ抗体から選択された。抗体多様性は、CTDにおける選択に用いられたライブラリーに存在し、軽鎖および重鎖における多様性は、以下のように構成される：
重鎖
重鎖は、多様性がHCDR1およびHCDR2における特定の位置に合成オリゴヌクレオチドを用いて作製されている、1つの重鎖遺伝子セグメント(V3-23、またはDP-47)からなる。分布パターンは、天然の配列の多様性分析に基づいている。添付されたHCDR3多様性は、一連の自己免疫性ドナーからのB細胞のIgMプールの天然に存在する配列に由来している。
軽鎖
軽鎖レパートリーは、H-CDR3多様性と同じ供給源から自然に再編成された軽鎖配列のプールに由来している。これは、生殖系列セグメントの多様な範囲に基づき、かつCDRの中または外側に体細胞突然変異をもつ、VκおよびVλを予想できることを意味する。
対照抗体
以下の抗ApoE抗体は対照として用いられた：
3D12、CTD、VLDL、LDL、ApoE2、ApoE3およびApoE4に結合するマウス抗体(Colabek et al. Biophysical J., 79:1008-1015)；
E19、CTDに方向づけられたヤギ抗体(Weisgraber (1986) J. Biol. Chem., 261:2068-2076)；および
6C5、NTDに方向づけられたマウス抗体(Castano (1995) J. Biol. Chem., 270:17610-17615)。
実施例2：原繊維の調製および予備試験
原繊維は、脾臓および腎臓から抽出された。不溶性アミロイド原繊維は、冷0.15 M NaCl、0.1% NaN3における機械的ホモジナイゼーションの繰り返しラウンドによりヒト組織から抽出され、ペレットにおけるアミロイドを救出するために、その後、遠心分離を行った。最終的に、アミロイドは、水に溶解/懸濁され、保存された。アミロイド含有量は、懸濁液塗沫標本のコンゴレッド染色により検証された。原繊維を抽出するこの方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Skinner et al. Prep. Biochem. 1982;12(5):461-476を参照されたい。結合したおよび結合していないファージは、5回のMarvel-PBS-Tween(0.1%)洗浄、2回のPBS-Tween洗浄および1回のPBS洗浄で洗浄することにより分離されうることが測定された。
実施例3：ビオチン化CTD(bCTD)の調製および予備試験
SEQ ID NO:1に示されたアミノ酸配列を有するCTDが用いられた。ビオチン化は、1/2および1/10のCTD/ビオチンのモル比率を用いるPierceにより記載された方法に従ってスルホ-NHS-SS-ビオチンで行われた。SDS PAGEにより、材料の100%は標識されたことが明らかにされた。1/10の比率における質量分析法において、5つの可能なビオチン化部位のうちの3〜5つがビオチンで標識された。1/2の比率において、bCTDは、分子の構造を保持するのに好都合である分子あたり1個または2個のビオチンを示した。用いられたすべてのCTDおよびNTDは、比率1/2において同じプロトコールで標識され、SDS-pageで試験された。
コーティング型bCTDは、BSAをビオチンでコーティングし、洗浄し、ストレプトアビジンを添加し、再び洗浄後、b-CTDを添加することにより調製された。
変性bCTDを作製するために、bCTDは尿素で処理され、洗浄後、ビオチン化BSA上のストレプトアビジンに結合した。尿素処理中にbCTDが結合しかつビーズ上に留まっていることを確実にするために、尿素処理およびビーズへの結合の前ならびに後にbCTDの量を測定した。bCTDの損失は見られなかった。
実施例4：原繊維およびur-bCTDにおける選択
選択ストラテジーにおいて、目的は、アミロイド原繊維におけるCTDの複合形に結合する抗体について選択することであった。選択の第一ラウンドは、腎臓由来の原繊維において行われ、選択の第二ラウンドは、脾臓由来の原繊維において行われ、選択のラウンド3および4はur-bCTDにおいて行われた。ラウンド2および3において濃縮は見出されなかったが、ラウンド4において、1379の濃縮があった。第二ストラテジーにおいて、3ラウンドのbCTDにおける選択が行われた。
どのラウンドの選択をハイスループットスクリーニングとして選ぶべきか、およびどの抗原が用いられるべきかを決定するために、事前スクリーニングが行われた。bCTDおよびur-bCTDにおけるスクリーニング間に見られる有意差はなかった。それゆえに、ストレプトアビジンコーティング型bCTDでur-bCTD選択におけるハイスループットスクリーニングを行うことが決定された。陰性対照bBSAとして、ストレプトアビジンコーティング化プレートが用いられた。
実施例5：配列および結合分析
2000個より多いクローンのスクリーニングが、コーティング化bCTDにおいて行われた。ELISAは、自動化システムで行われた。NTD結合剤についてスクリーニングするために同じ方法が用いられた。bCTDに結合し、かつbNTDに結合しないクローンがさらに分析された。
シーケンシングは、ハイスループットbCTDファージELISAにおいて陽性のクローンについての重鎖および軽鎖遺伝子について行われた。Dyaxの専売権付き「Webphage」ソフトウェアが、クローンの配列を解析するために用いられた。
752個のクローンが、原繊維およびur-bCTDにおける選択のラウンド3後に(23個陽性)、216個のクローンがラウンド4後に(216個陽性)、スクリーニングされた。940個のクローンは、bCTDにおける選択のラウンド2後にスクリーニングされた。bCTDを用いるELISAにおける陽性クローンの数は、463個であった。得られた正しい配列の数は163個であった。
配列データを解析するために、以下を含む、異なるレベルにおける配列の比較が行われた：
(1)全体の多様性＝異なる配列の数は、1個のアミノ酸の違いが見出される場合には、クローンを異なるとして同定される(VH＋VL多様性と呼ばれる)＝163
(2)重鎖多様性＝軽鎖配列を無視する、異なる重鎖をもつクローンの数＝152
(3)HCDR3多様性＝異なる重鎖CDR3をもつクローンの数＝54(＋アンバーHCDR3をもつ2クローン)。
この3レベル解析は、以下の2つの理由で行われた：
第一に、重鎖、およびそのドメインにおけるそれのHCDR3領域は、抗体のエピトープ認識について主として重要であることが一般的に認められている。同一のH-CDR3配列をもつすべての抗体がグループ化された。
第二に、ライブラリーの多様性の設計は、抗体変異体が、同一のHCDR3を有し、重鎖の他のCDRに突然変異を含む、かつ時には同一の、時には異なる軽鎖が予想されるようにである。
実施例6：抗体のbCTDおよびVLDLへの結合
VLDLへの結合をモニターするために、VLDLは、マイクロタイタープレート上にコーティングされ、試験抗体とインキュベートされた。二次抗体-HRP検出方法は、結合した抗体を検出するために用いられる。染色は、テトラメチルベンジジン(TMB)およびH2O2で行われた。結合していない抗体のみが洗い流される。VLDLへの結合は、ELISAにおいて高シグナルを与える。
陽性対照として、ApoEに対するモノクローナル抗体を用いた。CTDおよびVLDLに結合する2つの抗体(3D12、E19)は、bCTD ELISA(図1A)およびVLDL ELISA(図1B)において陽性であった。NTDに結合するもう一つの抗体(6C5)は、bCTDに結合しないが、VLDLによく結合する。このNTD部位は、VLDLにより覆われずに、ApoE自身のコーティングの質の測定を与えうる。この抗体のシグナルは高いため、VLDL ELISAをありのままに行うために十分なApoEがコーティングされていることを結論づけうる。
ファージ抗体(図2)について、3群における分類を作成した：常に陽性である(陰性ファージ結合の3倍より高い)抗体、時には陽性、時には陰性である(時には陰性ファージ結合の2倍、時には陰性)抗体、および陰性抗体。疑わしい抗体について、ELISAがひょっとしたら十分に感度が高くないのかもしれない、または抗体が全く結合していない、またはあるいは親和性が高シグナルを見るのには十分高くないのかもしれない、またはVLDLとの交差反応がありうる(一部分はVLDL上、一部分は覆われたCTD上のエピトープ)など。
実施例7：VLDLアッセイ法の開発および自動化
VLDL ELISAは、すべての203個のbCTD陽性ファージクローンについて行われた。常に陽性である(バックグラウンドの3倍より高い)6個のクローンが見出された。他のクローンは、バックグラウンドの2倍より高いシグナルを生じた(図3)。これらのクローンは、この段階では、さらなる試験から除外されない。6個のクローンのみが、VLDLに対して、高シグナルをもつ、陽性であった。試験は3回行われ、同じ結果が得られた。並行して、抗体のbNTDへの結合が試験された。どの抗体もbNTDに結合しなかった。VLDLに結合したクローンは、さらに試験されなかった。
実施例8：ファージのFabへの再クローニング、特異性試験
コーティング型VLDL ELISAにおけるVLDL結合剤の低量のため、およびVLDL競合ELISAの変動する結果のため、並行して、ファージ上のFabからのすべての異なる157個のクローンを可溶性Fabへバッチ再クローニングした。多くのFabは、多価ファージに対するそれらの一価の性質のため、bCTDに結合しないだろうことが予想され、従って、低親和性結合剤が、bCTDにおけるFab ELISAシグナルの方法により排除されることを可能にする。
再クローニング後、85個の抗体が、bCTDへ特異的に結合した。新しいVLDLまたはNTD結合剤は見出されなかった。これらの抗体のVHおよびVL鎖のCDR領域のアミノ酸配列は、表9および10に示されている。
実施例9：エピトープマッピング
同一のエピトープへの結合は、Fabとファージ抗体の間での競合をモニターすることにより試験された。限られた量のファージおよび最大限の量のFabがbCTDで十分コーティングされたELISAへ添加される。結合段階後、ファージは、抗M13 HRP抗体とインキュベートした後、ペルオキシダーゼ反応により検出される。添加された高濃度のFabのため、Fabと同じエピトープに方向づけられたファージは、競合して離され、Fabシグナルは減少する。
同じVH-CDR3群由来の抗体は、重複しているエピトープを認識する。この基準は、免疫組織化学(IHC)のためにクローンを排除するために用いられる：最高/最も遅いオフ速度をもつクローンのみが試験された。大きなVH-CDR3群に属しないすべてのクローンはIHCにおいて試験された。
抗体807A-M0026-F05および807A-M0027-E11は、お互いに交差反応しなかった。しかしながら、両方が抗体807A-M0028-A07と交差反応したので、両方の抗体は、類似しているが同じではないエピトープを認識することを示している。
抗体807A-M0028-B02は、おそらく、抗体807A-M0026-F05および抗体807A-M0027-E11とは別のエピトープを認識するだろう。
実施例10：オフ速度測定
Biacore測定を最適化するために、bCTDを結合するためにストレプトアビジンでコーティングされたBiacoreチップを用いた。第一に、チップへの結合について抗体3D12およびE19を分析した。また、事前スクリーニング(VLDLに結合せず、Fab ELISAにおいて陽性)から回収したFabを再クローニングした。Mab 3D12は、Biacoreにおいて結合しなかったが、おそらく、低親和性によるものと思われる。Ab E19および未精製Fab 1F7(透析された周辺質画分)は、bCTDチップに結合しなかった。対照として、bBSAでコーティングされたチャネルを用いた；どちらの抗体もこの表面に結合しなかった。
選択されたFabのオフ速度順位は、周辺質抽出物を用いてこのbCTDチップで測定された(現在および親和性成熟研究中において、クローンに順位を付けるにとって重要)。表1は、オフ速度の代表的なリストを示す。
親和性測定は、精製されたFab断片を用いてチップ上の低密度のbCTDにおいて測定された。
実施例11：免疫組織化学
同一のVH-CDR3群の最も遅いオフ速度をもつ抗体および異なるVH-CDR3を有するすべての抗体(単一クローン)における免疫組織化学(IHC)は、凍結組織スライド上において行われるIHCで試験された。
IHCおよび親和性測定について、精製されたFabが用いられた。抗体断片(Fab)は、細菌において発現され(典型的には、400-ml培養において、4時間IPTG誘導)、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)により周辺質抽出物から精製された。周辺質抽出物は、細菌の「浸透圧衝撃」処理により調製された。試料は、1 ml Co-IDAカラムに添加され、イミダゾールの0〜150 mM 直線的勾配で溶出された。タンパク質調製物は、PBSに対して透析され、非還元SDS-PAGEにより分析された。
3つの抗体のみがADプラーク上でFabとして結合した：807A-M0027-E11、807A-M0028-B02および807A-M0026-F05。
抗体807A-M0027-E11は、IHCにおいてアルツハイマー病(AD)プラークを検出する。抗体は、組織におけるプラークを特異的に認識し、血清における露出されたアポリポタンパク質Eに関しては認識しないことは重要である。典型的には、本発明の抗体は、ADをもつ少なくとも2人の患者の、およびまた全身性アミロイドーシスをもつ可能性がある患者に関しての、プラークに結合する。それゆえに、IHCは、新鮮な血漿の存在下において行われた。807A-M0027-E11でのIHC染色において、ファージとしておよびFabとして、50%までもの血漿の存在下において、シグナルは消光されなかった。また、溶液中のVLDLの添加は、染色を変化させなかった。これは、シグナルが新鮮な血漿またはVLDL溶液により消光された、NTDに方向づけられた6C5対照抗体と対照的である。sFab抗体807A-M0028-B02は、ADプラークおよびまた星状細胞において陽性に染色した。sFab抗体807A-M0026-F05は、ADプラークを弱く染色した。この抗体についての染色パターンは、この抗体の低親和性に起因して、あまり強くはない。抗体は、1人より多い患者の組織において陽性であった。
他のsFab抗体：807A-M0039-C10、807A-M0037-D01、807A-M0046-A06、および807A-M0039-C10は、AD脳組織における星状細胞を検出するのみであった。
実施例12：IHCにおけるsFabのプラークへの結合の親和性測定
3つのFab807A-M0027-E11、807A-M0028-B02、および807A-M0026-F05は、Biacore分析において広範囲にわたって研究された。まず、bCTDは、ストレプトアビジンチップ上にコーティングされ、その後、sFabは、異なる濃度においてチップ上を流され、結合共鳴単位(RU)が測定された。陰性対照として、チップの1つのチャネルは、ビオチン-BSAで飽和された。図4Aは、親和性を生じるbCTD上におけるsFab抗体807A-M0027-E11の分析が47.8 nMであることを示している。SFab抗体807A-M0028-B02の親和性は類似したパターンを示し、179 nMの親和性であった(図4B)。抗体807A-M0026-F05は、測定することが困難であるほど低親和性である(μM範囲において)(図4C)。
対照的に、sFabが抗Fc抗体を介してCM5チップに結合された場合、抗体807A-M0027-E11についても(図4D参照)、また抗体807A-M0028-B02についても結合は観察されなかった。
2つの異なるBiacore測定におけるコーティング剤および分析物を逆にする異なる結果は、抗体807A-M0027-E11および807A-M0028-B02の両方は、コーティング型bCTDに結合するのみであり、溶液中のbCTDに結合しないことを示唆している。
実施例13：抗体再編成、IgGの発現および精製
抗体(バッチ)のIgG1への再編成
85個のクローンは、可溶性FabとしてCTDへの特異的結合を示した。これらのうち、IHC研究について選択された30個の候補が、完全なヒトIgG1抗体へ再編成された。
すべての85個の「可溶性Fab結合剤」を含む157個のCTD特異的Fabのプールが、ヒトIgG1発現ベクターpBh1へのバッチ再編成に基づいた同時的制限消化のために用いられた。
バッチ再編成ストラテジーは、2つのクローニング段階を含み、図5に図解されている。第一段階において、完全なFab断片は、pBh1へ挿入される。第二段階において、内部/制御配列が交換される。
最初のFabを「再同定する」ために、約300個の個々のクローンがDNAシーケンシングにより分析された。85個の「可溶性Fab結合剤」のうちの72個が再び見出された。特に、IHCについて選択された優先候補(ファージおよび可溶性Fabとして)の30個のうち29個が、バッチ再編成によりIgG1構築物として得られた。
13個の残りの「可溶性Fab結合剤」のうちの11個は、ヒトIgG1発現ベクターpRh1へ個々に再編成されうる。再編成された抗体のそれらのFab対応物との同一性は、シーケンシングにより検証された。完全なFab挿入物の最初のPCR増幅を除いて、クローニングアプローチは、図5に描かれたバッチ再編成ストラテジーと同一である。
IgG1抗体の発現および精製
再編成されたIgG1抗体は、一過性にトランスフェクションされたHEK293T細胞に発現された。抗体は、〜5X106個のトランスフェクションされた細胞(フラスコあたり)の培養上清から精製され、約1週間、培養し続けられた。精製は、プロテインAに基づくアフィニティークロマトグラフィーにより行われた。精製された抗体は、PBSに対して透析され、還元および非還元条件下のSDS-ゲルにおいて分析された。
IgG抗体のビオチン化
抗体のビオチン化は、PBSにおいて行われ、精製された抗体を2時間、スルホスクシンイジミジル-2-(ビオチンアミド)エチル-1,3-ジチオプロピオネートの15倍モル過剰とインキュベートした。ビオチン取り込みのレベル(すなわち、抗体分子あたりビオチン群の平均数)は、HABA[2-(4'-ヒドロキシアゾベンゼン)安息香酸]法(Pierce)を用いて測定された。このアプローチを用いて、本発明者らは、すべてのビオチン化抗体が分子あたり3〜4個のビオチン群を含むことを見出した。
実施例14：IgG1抗体での特異性試験
IgG1抗体の他の種への結合
これらの種のbCTDにおけるヒト抗体の交差反応性は、マウスおよび霊長類モデルにおいて研究されうる抗体を同定するように試みるために試験された。
sFabとしてAD組織におけるプラークに結合する抗体(807A-M0028-B02、807A-M0027-E11、807A-M0026-F05)は、hIgG1へ再編成され、ビオチン化された、組換えマウスCTD(mbCTD)、組換え霊長類CTD(pbCTD)および組換えヒトCTD(hbCTD)におけるそれらの結合能力について試験された。
抗体807A-M0028-B02および807A-M0027-E11(図6Aおよび6C)は、3つの異なる種のCTDに結合した。両方の抗体は、抗体により認識されたエピトープがこれらの種において同じであることを示唆する、同じ程度で結合した。
抗体807A-M0026-F05(図6B)は、pCTDおよびhCTDに結合するが、マウスCTDに結合せず、抗体がマウスに存在しないエピトープに対して方向づけられていること、または用いられた濃度が十分には高くないことを示唆している。このELISAにおける低O.D.は、この抗体の低親和性により説明されうる。
IgG1抗体のbNTDへの結合
807A-M0027-E11および807A-M0026-F05はbNTDに結合しなかった。抗体807A-M0028-B02は、非常に高い濃度(10 μg/mlおよび5 μg/ml)で結合した。これが特異的結合に関連しているかどうかを調べるために、1000倍より多い溶液中のbNTD(溶液中に540 ug/ml、0.5 ug/mlコーティングされている)と競合するように試みた(図7)。非特異的シグナルは、競合において減少しなかった。そのシグナルは、抗MUC1抗体PH1についてもまた見られたので、ほとんどおそらく、添加された多量の抗体のせいであると思われる(図7)。
IgG1抗体のVLDLへの結合
抗体のコーティング型VLDLへの結合は、ELISAにおいて試験された。プラーク結合剤のファージおよびFabとは違って、抗体807A-M0028-B02(図8)および807A-M0027-E11は、同じ程度でVLDLに結合した。非CTD結合剤(PH1、MUC1結合剤である)の結合と比較した場合、この結合は、特異的であるように思われる。
VLDLはApoEおよび脂質から構成されるため、コーティング型VLDLは、ELISAにおける処理中にそれの高次構造を変化させうり、CTDが脂質にもはや覆われていないことがありうる。それゆえに、溶液中の抗体に関する競合試験、プレートに結合したbCTDおよび溶液中の過剰量のCTDまたはVLDL、を行った(図9)。このアッセイにおいて、ヒト抗体についてVLDLでの阻害は見られず(図9AおよびB)、抗体807A-M0028-B02についてCTDでのわずかな阻害が見られた(図9B)。対照的に、CTDに対して方向づけられた市販用抗体3D12およびE19は、CTDによるだけでなく、VLDLによっても、明らかに阻害された。NTDに方向づけられた6C5モノクローナルは、このアッセイにおいて結合しなかった。
これらの結果は、ヒト抗体(807A-M0028-B02、807A-M0027-E11)が溶液中のVLDLに結合せず、コーティング型bCTDより少ない程度で溶液中のCTDを認識することを示唆している。
結論
ADにおけるプラークに結合する3つの抗体のうちの2つ(807A-M0028-B02、807A-M0027-E11)は、pCTDおよびmCTDと交差反応性である。第三の抗体(807A-M0026-F05)は、mCTDと交差反応せず、pCTDを結合する。対象となる抗体は、NTDに結合しない。2つの抗体(807A-M0028-B02、807A-M0027-E11)は、高抗体濃度が用いられた場合、コーティング型VLDLに結合する。抗体807A-M0026-F05は、これらの性質を示さないが、これは、その抗体の親和性に関連しているものと思われる。
実施例15：Biacore分析
FabおよびIgG1を比較するために、およびヒト抗体の溶液中のCTDにおける結合の性質を研究するために、Biacoreが広範囲に用いられた。
BiacoreにおけるFabおよびIgGの比較
図10、11、12および13は、CTD特異的クローン807A-M0026-F05、807A-M0027-E11および807A-M0028-B02のBiacore分析の結果を要約している。予想どおり、すべての3つのプラーク結合剤は、それらの最初のFab型式と比較して、IgG1としてチップ上のbCTDによりよく結合する。IgG1抗体807A-M0027-E11は、抗体807A-M0028-B02より3倍よく結合し、一方、抗体807A-M0026-F05は、非常に低いマイクロモルの結合活性でチップに結合する。
測定された結合活性(表2)は、抗体の注入から50秒後に測定された時、注入停止直後に測定された結合活性と比較して、より高い。この差は、おそらく、遊離bCTDがチップ上で利用できる場合の抗体のチップへの再結合によるものと思われる。
抗体の捕獲されたCTDへの結合
ヒトIgG1抗体がコーティング型bCTD/VLDLに結合するが、溶液中のCTD/VLDLに結合しないVLDL ELISAの不一致のために、追加のBiacore実験が行われた(FabにおけるBiacoreも参照)。これらの実験において、bCTDまたはApoEは捕獲された。まず、抗hFc抗体がチップに結合され、続いて、特異的な抗体の結合、続いて、bCTDまたはApoEの注入が行われた。
図12は、チップに間接的に連結したFab抗体807A-M0027-E11は、bCTD(280 nM)を結合しないことを示している。Fab抗体807A-M0028-B02を用いることにより、および両方の抗体のIgG1が用いられた場合に、同じ曲線(データ示されず)が得られた。試験は、ヒト血清から生じるApoEで行われた。非常に少量のApoE(17RU、<1%)が抗体に結合した(図13)。
結論
Biacoreにおいて、IgG1抗体807A-M0027-E11および807A-M0028-B02は、nM結合活性でコーティング型bCTDに結合し、一方、IgG1抗体807A-M0026-F05は、μM結合活性で結合する。溶液中における抗原における親和性測定は、両方の抗体807A-M0027-E11および807A-M0028-B02がbCTDもApoEも効率的には捕獲しないことを示している。これらの結果は、VLDL/CTD競合ELISAにより見られた結果：抗体807A-M0027-E11および807A-M0028-B02は、溶液中のCTDへよりもコーティング
されたbCTDへよく結合する、を確認している。
実施例16：抗体の天然のCTDへ、またはペプチドへの結合を研究するための追加の試験
精製されたhApoEのSDS-PAGE分析
精製されたhApoEは、還元性SDS-PAGE、続いてクーマシー染色により分析された。予想どおり、タンパク質は、〜35 kDaの1つの主要なバンドとして移動したが、〜70 kDaにおける広いバンドおよび70 kDaから〜200 kDaまでのかすかなスメアもあった。35 kDaバンドおよびより高い分子量種の両方は、ウェスタンブロットによりhApoEを含むことが示された。
精製hApoEの免疫沈降
精製hApoEは、807A-M0028-B02、807A-M0027-E11および807A-M0026-F05で免疫沈降した。陽性対照として、E19、ヤギ抗hApoE抗体を用いた。陰性対照として、PH1抗体を用いた。処理されていない、精製hApoEもまた参照として含まれた。試料は、SDS-ゲルにより分析され、タンパク質は、ニトロセルロース膜へ移行され、hApoEは、ウェスタンブロットにより検出された。
予想どおり、E19、807A-M0028-B02および807A-M0027-E11抗体は、hApoEを特異的に免疫沈降させることができたが、あまり効率的ではなかった。興味深いことに、E19抗体は、35 kDaバンドに対して特異的であるように思われたが、807A-M0028-B02および807A-M0027-E11抗体は高分子量種に対してより特異的であった。807A-M0026-F05は、対照的に、おそらく抗体の低親和性のせいで、hApoEを免疫沈降させることができなかった。
細胞可溶化物の免疫沈降
PBMCの細胞可溶化物は、807A-M0028-B02、807A-M0027-E11および807A-M0026-F05、加えてE19(陽性対照)およびM43G5、M43F8、PH1、A2、ハーセプチンおよびヒトIgG1κ骨髄腫抗体(陰性対照)を用いて免疫沈降した。試料は、還元性条件下でのSDS-PAGE、続いて銀染色かまたはウェスタンブロットのいずれかにより、分析された。
E19のみが、予想されたサイズ(すなわち、〜35 kDa)のバンドを免疫沈降させた。E19で免疫沈降した物質はまた、ウェスタンブロットにおいて非常にかすかなシグナルを与えた。これは、いくつかのhApoEが細胞可溶化物においてE19により捕獲されるが、この発見は、(1)807A-M0028-B02および807A-M0027-E11は細胞可溶化物由来のいずれのhApoEも免疫沈降させなかった、(2)807A-M0026-F05は、hApoEを免疫沈降させることができないことが示されたのだが、またウェスタンブロットにおいて弱いシグナルを与えた、ならびに(3)A2および807A-M0043-F08、2つの関連性のない抗体、はウェスタンブロットにおいて強いシグナルを与えたことから、慎重に考慮されなければならない。
重要なことには、ここで調べられた3つの抗体(807A-M0028-B02、807A-M0027-E11および807A-M0026-F05)は、細胞可溶化物のいずれの主要な成分も免疫沈降させないように思われた。807A-M0027-E11についてのバックグラウンドは、わずかにより高かったが、例えば、PH1より高くなかった。これらの結果は、抗体、807A-M0028-B02、807A-M0026-F05および807A-M0027-E11、の全体的な特異性は、CTDへの結合によることを示している。
VLDLの免疫沈降
抗体のVLDLへの結合もまた、免疫沈降により試験された。10%VLDLがこれらの試験に用いられた。検出抗体として、6C5が用いられた。ECL方法でのウェスタンブロットの5分間展開後、対象となるヒト抗体についてApoEは検出されなかった。一晩の展開後、807A-M0027-E11および807A-M0028-B02は、VLDL対照(免疫沈降されないVLDL、免疫沈降に用いられた量の10%)と比較した場合、かすかなバンドとして検出された。6C5抗体での免疫沈降は、ヒト抗体を用いてより広範なバンドを示した。
考察
807A-M0026-F05ではないが、807A-M0028-B02および807A-M0027-E11は、血漿から精製されたhApoEの高分子量型を優先的に免疫沈降させる。これらの種の性質ははっきりしないままであるが、それらがhApoEを含み、かつ非常に安定した複合体を形成しているにちがいないことは明らかである。これらの抗体は、主要な細胞成分と有意には相互作用しない。VLDLの抗体での免疫沈降は可能であるが、量は非常に低い可能性がある。
実施例17：インビボ研究
マウスは、ハムスタープリオンプロモーターにより作動させられるアミロイド前駆体タンパク質(APP)についてのヒト遺伝子：スウェーデン型突然変異K670N、M671L、APP系2576(Hsia et al. Science 1996, 274:99-102)を、単独でまたは血小板由来成長因子により作動させられる突然変異型ヒトプレセニリン1(PS1)と組み合わせて(Duff et al., Nature 1996, 383(6602):710-3, Holcomb et al., Nature Med 1998, 4:97-100)、脳に発現させるように繁殖された。
ヒトApoEの発現を必要とする研究のために、humAPP:SweおよびhumPS1:M146LかまたはhumAPP:Sweのみと組み合わせてのいずれかで、マウスApoE遺伝子がノックアウトされていようがされていまいが(Sun et al., Neurosci, 1998, 18:3261-3272)、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーターにより作動させられるヒトApoE4を発現させるマウスが、繁殖された。
アポリポタンパク質E(ApoE)のC末端ドメイン(CTD)へのヒト免疫グロブリンG1(hIgG1)アイソタイプのモノクローナル抗体(mAb)は、非トランスジェニックまたはトランスジェニックマウスにおいて、例えば、10 mg/kgの濃度で腹腔内に注射された。あるマウスは1回注射され、注射から2日後に屠殺される、あるものは2回注射され、繰り返される用量は2日後に注射されて、その後、さらに2日後、すなわち、最初の注射から4日後、屠殺された。注射された抗体の濃度は、CTD結合hIgGに関するELISAによりモニターされた。ストレプトアビジン特異的モノクローナル抗体を注射されたマウス由来の脳が、陰性対照としての役割を果たした。試料採取された脳は、すぐに-70℃へ凍結され、その後、凍結切片法に供せられた。
脳切片におけるヒトIgGの存在についての染色は、均一に染色されたプラークが皮質および海馬中を一様に広がっていることを示した。他の脳構造は、インビボ曝露後、染色を示さなかった。対照的に、アミロイドプラークと共のいくつかの構造は、エクスビボ曝露後、染色された。抗ApoE CTD抗体による、またはAbへのmAbでの、エクスビボでの染色について到達できるプラークの70%は、抗ApoE CTD抗体での2日間(n=3)または4日間(n=3)のインビボ曝露後、染色された。所定の用量における2日間または4日間のインビボ曝露は、より多い抗CTD抗体のエクスビボの追加後得られた追加の染色強度により示されているように、利用可能な結合部位を飽和させなかった。
抗体は、一般的に巨大分子としてだが、血液脳関門(BBB)を越えて自由に通過しない。IgGの通過は、非常に制限されていると考えられ、0.5%の血漿濃度下でのCSFにおける濃度が報告されている(Elovaara et al., 1987 Eur Neurol 26:229-34, Ganrot & Laurell 1974, Clinical Chemistry 20:571-3)。脳切片における腹腔内に注射されたヒトIgGの存在についての染色により、免疫組織化学(IHC)技術による染色について十分なBBB通過を示す、ApoE CTD特異的抗体はこれらのトランスジェニックマウスにおいて異なる脳領域に渡って一様に脳プラークに達したことが、明らかにされた。アルツハイマー病(AD)プラークは、サイズおよび密度の点で異なる複雑な構造である。これらのトランスジェニックマウスに見出された脳アミロイドプラークは、ADに見出される小さな拡散した、中位サイズのプラークを表していると考えられる。プラークは均一に染色され、mAbがプラークの外層に達しただけでなく、プラーク構造全体に浸透したことを示している。エクスビボの染色について到達できるプラークの70%は、インビボ曝露後、染色された。腹腔内に投与される10 mg/kgの用量が利用可能なプラーク結合部位を飽和させなかったことを考慮すれば、非飽和レベルの抗体は、それでもやはり、結果として、FcRを有している食細胞による抗体媒介性プラーク分解を生じうる。
実施例18：抗体のマウスIgG2aへの再編成
インビボ試験について、抗体807A-M0028-B02、807A-M0027-E11、807A-M0026-F05、および対照抗体(抗ストレプトアビジンクローンA2)の可変領域は、重鎖のマウスIgG2a定常領域およびマウスCκおよび抗体の可変領域を含むベクターへと再クローニングされた。
これらのクローンは、ヒトIgG1発現ベクター(pBh1)から、定常重鎖領域のほかにマウス定常κ軽鎖遺伝子も含むマウスIgG2a抗体の発現のための構築物(pRmk2a)へ移された。VLおよびVH領域は、PCRによりヒトIgG1発現プラスミドから拾い上げられ、順次に、pRmk2aへクローニングされた。VLは、ApaL1/BsiW1断片として、抗体リーダーの3'側および定常κ遺伝子の5'側に挿入された。VH領域の場合、5'隣接IRESモチーフもまた、PCR増幅産物に含まれた；Asc1/Nhe1断片がpRmk2aに挿入された。構築物の完全性は、DNAシーケンシングにより検証された。クローニングストラテジーは、図14に描かれている。
実施例19：ペプチドの調製
完全なApoE CTDを網羅する10個のペプチド(長さ16アミノ酸)が合成された。
ペプチドは、図15に示されているように、お互いの間に8アミノ酸の重複部分を含む。ペプチドは、ストレプトアビジンへの結合を可能にするS-Sビオチン群を含む(磁気ビーズ選択)。さらに、各ペプチドは、担体タンパク質(BSA)に連結されうるシステインを含む。
ペプチドは、ジメチルホルムアミド(DMF)に可溶化され、その後、水に希釈された。ペプチド4を除くすべてのペプチドは、10%未満の濃度でDMFに可溶性であった。連結は、30%DMFにおいて連結されたペプチド4を除いて、すべてのペプチドについて10%DMFにおいて行われた。過剰量のマレイミド活性化BSAがペプチドに結合するために用いられた。インキュベーション後、過剰量のシステインが、可能な遊離システインを占めるように用いられた。BSA連結ペプチド(bペプチド-BSA)が選択に用いられた。
実施例20：抗体の重複ペプチドへの結合
実施例5において同定された抗体807A-M0026-F05、807A-M0028-B02および807A-M0027-E11は、重複ペプチドへのそれらの結合について試験された。これは、第一に、どのペプチドがさらなる選択：bペプチド-BSAまたはbペプチド、において優先的に用いられうるかを試験するために、ならびに第二に、実施例5において選択された抗体が、重複ペプチドに結合しているかどうか、およびそうである場合には、それらが認識するエピトープは異なり、実施例9において行われたような競合結果によるエピトープマッピングを支持するかどうかを見るために、行われた。ヒト抗体およびマウス抗体の両方は、このように比較された。
ヒト抗体について、ペプチドマッピングは、IgG1に関しておよびファージディスプレイされたFabに関して行われた。例えば、クローン807A-M0026-F05は、ファージFab断片およびIgG1全体として、bペプチド-BSA4および8を認識した。ELISAは、この抗体についてのbペプチド4および8への結合を示すのに十分には感度が高くなかった。それゆえに、ペプチド結合剤の大多数を捕獲しうるbペプチド-BSAにおける選択から始め、その後、必要ならば、選択のもっと後のラウンドにおいてbペプチドを用いることが最良であるだろうと本発明者らは決定した。際立ったことには、抗体807A-M0026-F05は、マウスモノクローナル抗体と比較して、ペプチドへよりもCTDへよく結合した。抗体807A-M0028-B02は、ペプチド4に結合した。抗体807A-M0027-E11は、重複ペプチドのいずれにも有意には結合しなかった。
実施例9において、本発明者らは、抗体807A-M0026-F05および抗体807A-M0027-E11により認識されるエピトープが抗体の大きな群により網羅されていることを見出した。両方の抗体は、お互いに競合しなかった。抗体807A-M0026-F05についてのCTDに対する親和性は、抗体807A-M0027-E11と比較して非常に低いため、もしそれらが同じエピトープを認識するならば、抗体807A-M0027-E11は、抗体807A-M0026-F05よりペプチド4および8へより強く結合しただろうことを予想するであろう。それゆえに、両方の抗体は、関連しているが、同一ではないエピトープを認識すると結論づけうる。抗体807A-M0028-B02は、ペプチド4に結合し、競合エピトープマッピングにおける2つの他の抗体の抗体群とは異なり、異なるエピトープを認識することができた。
また、対照マウス抗体を重複ペプチドにおいて試験した。抗体3H1、12D10およびE19は、それぞれ、ペプチド3、10および5+10へ結合する。ヒト抗体と対照的に、すべての対照抗体は、ペプチドおよびbCTDへおよそ同じ程度で結合する。
実施例21：ペプチドにおける選択およびスクリーニング
選択の3ラウンドが、10個の重複しているBSAに連結したビオチン化ペプチド(b-ペプチド-BSA)において、および選択の1ラウンドが対応するビオチン化ペプチド(b-ペプチド)において行われた。選択は、ストレプトアビジン磁気ビーズを用いて10個の個々のペプチドにおいて行われた。選択ラウンドの間にこの多数の選択を取り扱うために、入力/出力の滴定は行われなかった(液体増幅)。
用いられる手順は、図16に示されている。第一に、bペプチド-BSAへの結合についての選択の3ラウンドが、自動化Kingfisherシステムを用いて行われた。ファージにディスプレイされたFabに関するラウンド2および3の事前スクリーニングは、陽性クローンの頻度がラウンド2において低いこと、ならびにBSAにおける広範な枯渇および減算にもかかわらず、多くのクローンがラウンド3においてBSAに結合していることを示した。おそらく、結合剤は、ペプチドを連結するために用いたBSA上のリンカー分子に向けられたと思われる。それゆえに、bペプチドにおける別のラウンド3選択が行われた。この選択について、バックグラウンド結合は無視できた。
シーケンシング努力を減らすために、ファージ-Fabクローンは、sFabを作製するようにバッチ再編成され、クローンの大量スクリーニング(ELISAおよびシーケンシング)は、sFabレベルで行われた。307個の抗体がELISAにおいて陽性であることが見出され、そのうちの46個は、表11および12に示されているように、シーケンシングにより測定された場合、固有であった。
実施例22：原繊維およびペプチドにおける選択ならびにスクリーニング
2ラウンドの選択がアミロイドプラークをもつ器官から生じた原繊維において、2ラウンドが10個の対応するbBSA-ペプチドにおいて、および1ラウンドが10個の対応するb-ペプチドにおいて、行われた。
用いられる手順は、図17に要約されている。ラウンド3およびラウンド4は、個々のbペプチド-BSAにおいて行われた。事前スクリーニング後、わずかな陽性クローンしか見出されなかった。それゆえに、選択の第5ラウンドは、bペプチドを用いて行われた。事前スクリーニングにおいて、ペプチド4および8についての陽性クローンが見出された。これらの2つの選択について、バッチ再編成後、sFabをスクリーニングした。合計390個のsFabがスクリーニングされ、109個がELISAにおいて陽性であり、4個のクローンが固有であった。これらの固有のクローンのVH鎖およびVL鎖のアミノ酸配列は、表11および12に示されている。これらのストラテジーにおいて、たいていのクローンは、固有のVH-CDR3(表12)を示し、高濃縮が見出された：一つのクローンは、148倍濃縮され、ストラテジーB1において、およびストラテジーB2において、見出された。これは、実施例5の選択と対照的である。
わずかなクローン(表13)しかbCTDに結合しなかったが、bCTD結合剤がペプチドに弱く結合したまたは少しも結合しなかった実施例20における結果と比較すると、それらを固有とみなせる。実施例21および22の選択キャンペーンにおいて、Fabは、VLDLへもNTDへも結合していなかった。
11個のFabがIHCにおいて陽性であることが見出され、これらのFabのうちの10個は、実施例11の選択キャンペーンから生じ、1個は、実施例21および22の両方の選択キャンペーンから生じる。
実施例23：ur-bCTDおよびペプチドにおける選択ならびにスクリーニング
2ラウンドの選択が尿素処理されたビオチン化CTD（ur-bCTD）において、続いて、2ラウウンドがアミロイドプラークをもつ器官から生じた原繊維において、行われた。用いられた手順は、図18に要約されている。
尿素-CTD抗原における2ラウンドの選択が行われ、続いて、2選択ラウンドがAD患者由来の原繊維において行われた。このストラテジーにおいて、事前スクリーニングは、選択の第3および第4ラウンド後に行われた。頻度は、それぞれ、82/95および83/95であった。事前スクリーニング中、ur-bCTDおよびbCTDを用いたが、抗原の両方の型の間に差は見出されなかった。第3選択ラウンド後、bCTDに結合するが、原繊維に結合しない多くのクローンが保持されたが、原繊維における2ラウンドの選択(第4ラウンドの選択)後、これらの結合剤が保持されるという確率はより小さかった。それゆえに、大量スクリーニングは、第4ラウンドの選択において行われた。950個のsFabは、ur-bCTDにおいてスクリーニングされた。233個のクローンが、可溶性Fabとして、ELISAにおいて陽性であり、83個が固有であった。これらの固有FabのVH鎖およびVL鎖のアミノ酸配列は、表14および15に示されている。VLDL ELISAにおいて、結合した5個のFabが陽性であった、または疑わしい結合をもった。
FabはbNTDに結合しなかった。
多くのFabは、同一のVH-CDR3群の大きなファミリーに属した；一つの個々の抗体は、247倍濃縮された。IHCにおける試験は、個々のクローン(大きなVH-CDR3群に属していない)、および遅いオフ速度について選択された大きなVH-CDR3群に属しているクローンにおいて行われた。
第一IHCスクリーニングにおいて、6個のFabがAD患者のプラークに結合した。bCTD結合剤の性質は、表17に要約されている。
実施例24：IHCのための可溶性Fabとしての候補クローンの作製
Fabは、さらなる分析のために作製された。ELISAが、100 μl培養物の周辺質画分において行われた。すべてのクローンの50 ml培養物の周辺質画分におけるBiacoreオフ速度測定は、Biacore結果に関する表に見出される。
約90個の可溶性Fabタンパク質がIHCにおける試験のために作製された。少なくとも10 μgが最初の分析に必要とされた。可溶性Fab発現レベルにおける幅広いバリエーションのために、タンパク質は、IMACクロマトグラフィーにより、96ウェルフィルタープレートおよび真空マニフォールドを用いて、50 ml 細菌培養物の周辺質抽出物か、または400 ml 培養物の周辺質抽出物かのいずれかから精製されなければならなかった。収量は、主に、10〜100 μgの範囲であった。
IHC陽性の可溶性Fabの大量生産
候補Fabのうちの15個は、プラーク組織上のIHCにおいて陽性/陽性の可能性あり、であることが判明した。これらのクローンのうち、より可溶性のFabタンパク質が追加の試験のために調製された。
可溶性Fabタンパク質は、400 ml 細菌培養物の周辺質抽出物から調製された。
実施例25：エピトープマッピング、予備的IHC結果との比較
ハイスループットFabスクリーニングは、それらが選択されたペプチドにおいて、およびまた、対照として非重複ペプチドにおいて行われた。エピトープマッピングにおいて、すべてのペプチド陽性抗体が、すべての他のペプチドに対するそれらの結合反応性についてスクリーニングされた。表13は詳細な結果を含む。
2つのFabがすべてのペプチドに(おそらく、BSA-リンカーに)結合し、非特異的とみなされた。
ペプチド5および10に特異的であるFabは同定されなかった(ファージにおける事前スクリーニングFabはいくつかの陽性結合剤を示したが)。
49個の異なるFabは、ペプチドへ特異的に結合した。特異的Fabのうちの39個のみが、それらが選択されたペプチドに結合した。ペプチド1において選択された1つのFabはまた、ペプチド6を認識した。ペプチド4選択から生じた3個のFabはまた、ペプチド9に結合し、ペプチド9選択から生じた3個のFabはペプチド4を認識した。さらに、ペプチド8において選択された3個のペプチドはまた、ペプチド4に結合した。9個のFabのみがbCTDにも結合した。これは、これらのFabの大部分が、組換えbCTDに存在しないエピトープに結合し、かつプラークにも見出される可能性がありうるもう一つの(おそらく、伸長した)構造を認識することを示唆している。ペプチド3およびペプチド4を網羅する領域は、「選択優位エピトープ」として認められ、すべての49個の特異的Fabのうちの39個、および9個のbCTD結合剤のうちの8個を含む。興味深いことに、ApoEのこの領域は、VLDL粒子への結合に関与していると考えられる。
IHCスクリーニングを考慮に入れた仮説
49個の特異的Fabのうちの39個は、ペプチドに結合したが、bCTDに結合しなかった。これは、これらのFabが、例えばVLDL粒子に含まれる天然のApo-Eを認識する可能性が高くないことを示唆している。もしそのようなFabがIHCにおいて結合するとしたら、そのようなエピトープは固有であり、かつプラーク上に見出されるのみであること、およびこれらのFabはさらなる研究のための重要な手掛かりとなるだろうことを示すだろう。
実際、予備的IHCデータは、これらのFabのうちの4個が、おそらく、AD患者において組織に結合するだろうことを示している。これらの4個のFabはすべて、ペプチド4に結合して、その重複しているペプチドに結合しないが、それらが類似した(重複している)エピトープ(群1)、おそらくペプチド4およびプラークに存在するのみであるLVEDMQRQのアミノ酸または二次構造を含むエピトープ、を認識することを示唆している。
IHCにおいて陽性でかつペプチド4において選択された、2つの他のFabは、ペプチド4および9に、ならびにbCTDに存在しないまたは一般的として存在しない高次構造に、結合する。おそらく、これらの2つの抗体についてのエピトープは、配列MQRQWAGLを含む(群2)。
ペプチド9において選択された、IHCにおいておそらく陽性であるもう一つのFabは、ペプチド9を認識するのみで、重複しているペプチドもbCTDも認識せず、ペプチド9およびプラークに存在するのみであるエピトープWAGLVEKVかまたは高次構造のいずれかを認識できるものと思われる(群3)。
49個の特異的Fabのうちの10個は、ペプチドおよびbCTDに結合し、これらの抗体はより高次構造的なエピトープを認識することを示唆している。
1個のFabは、ペプチド1、6およびbCTDに結合する。このエピトープ(RTRDRLDE)は、VLDLの結合部位の内部にあるとは予想されない(群4)。
ペプチド4および9における選択から得られた2つの抗体は、両方のペプチド(エピトープMQRQWAGL)およびCTDを認識し、それゆえに、群2のFabとは異なる(群5)。
ペプチド8に対して選択された1つの抗体は、ペプチド4、8(エピトープWFEPLVED)およびbCTDに結合する(群6)。
このように、この仮説に従って、実施例21および22に同定されたFabは、それぞれ、異なるエピトープを認識する、Fabの6つの異なる群へ分類されうる。
実施例26：実施例21および22のストラテジーにおいて同定されたFabのBiacoreオフ速度分析
可溶性Fabのオフ速度分析は、すべての10個のペプチドにおいて行われた。実施例21および22のすべての固有のFabからの周辺質画分が作製され、試験された。結果は、ELISAによりエピトープマッピングを確認している。
より多くのペプチドに、および/またはbCTDに結合するFabは、ほとんどの場合、それらの分子に対しておよそ同じオフ速度を示す。対照的に、RU(結合した抗体の量についての測定単位)は、Fabが選択されたペプチドについて、しばしば、最も高い。
実施例21および22のストラテジーは、結果として、同一のVH-CDR3の大きなファミリーに属する抗体の同定を生じなかった。それゆえに、オフ速度測定は、IHCのための基準として用いられなかった。
実施例27：実施例23の抗体のエピトープマッピングおよび予備的IHC結果との比較
自動化スクリーニングにおいて、Fabは、ur-bCTDおよび陰性対照としてのストレプトアビジンBSAに対するそれらの結合反応についてスクリーニングされた。どの抗体もNTDに結合しなかった。表16は詳細な結果を含む。
ur-bCTDおよびCTDに結合する、合計81個の異なる抗体が見出された。それらの抗体のうちの5個は、コーティング型VLDLに結合した。どれもbNTDに結合しなかった。20個の抗体はまた、ペプチドに結合した。実施例21および22のストラテジーにおけるように、本発明者らは、ペプチド3および4あたりの選択優位エピトープを見出した。
81個のうちの5個の抗体は、IHCにおいて結合した。これらの抗体のうちの1個のみがペプチドに結合した。この抗体は、ペプチド4に対して低RU(Biacore)および高RUで結合する。興味深いことに、この抗体はまた、実施例21および22のストラテジーを用いて見出された。その残りの4個の抗体は、実施例5の抗体807A-M0028-B02および807A-M0027-E11に匹敵しうるものと思われる。
実施例28：候補FabのヒトIgG1への再編成
上記のIHC陽性クローンの大部分は、2つの制限エンドヌクレアーゼに基づいた(「切り貼り」)クローニング段階においてDyax hIgG1発現構築物pBh1へ、個々に、再編成されうる(図5参照)。
アンバー終止含有クローン、807B-M0079-D10(807B-M0027-D08)および807B-M0081-A11(807B-M0081-F12)、ならびにクローン807B-M0009-C03を除外して、FabのIgGへの再編成が行われ、IgGは、Hek293T細胞において一過性に発現された。
807B-M0079-D10のCDR2におけるアンバー終止変異は、クローンが、上記に概略を述べられている手順を用いて再編成される前に、「ファージミドレベル」において修正される。
807B-M0081-A11のVLの5'末端におけるアンバー変異が、異なる再編成ストラテジー/「PCRに基づいたhIgG1発現構築物pRh1への再編成」を用いて修復される。アンバー終止変異は本発明者らの「CJ-κつり上げプライマー」の配列内にあるという事実のため、終止変異は、Fab断片のPCR増幅中に修正される。PCR/Fab断片のpRh1へのクローニングストラテジーは、pBh1への「切り貼り」アプローチと同じである。
実施例29：結論
CTDに結合する229個の候補Fabは、DyaxのヒトFab300ライブラリーでの様々な選択手順から単離された。手順のうちの2つは、ペプチドにおける選択を含んだ(実施例21および22)。実施例23の選択手順において、実施例5の成功した選択が、最初に、ur-bCTDにおいて、およびその後、原繊維において、選択することにより逆にされた。また、実施例5と対照的に、ファージをスクリーニングせずに、最初に、ファージFabからFabへのバッチ再クローニングを行った。
非常に少数(5個)が、Fab抗体として、コーティング型VLDLと反応性であった。どのFabもbNTDについて陽性ではなかった。
実施例21および22のストラテジーにおいて、いくつかのクローンが濃縮されており、本発明者らは、わずかな個々のクローンに関してVH-CDR3群を観察した。
実施例21および22のストラテジーからのFab抗体は、ペプチド3および4あたりの選択優位エピトープを認識する。実施例23のストラテジーにおいて、同じ優位エピトープが見出されている。
IHCスクリーニングにおいて、15個の抗体が、第一スクリーニングにおけるIHCで、プラークへの結合について陽性であることが見出された。第一のIHCスクリーニングで陽性のFabクローンの特徴の概観は、表17に示されている。
実施例30：IHCにおいて陽性の15個のFabのIgG1の性質
Fab-IHCにおいて陽性であった15個のFabは、IgG1へ再編成された。これらの抗体のうち、9個が、IgG1-IHCにおいて陽性であることが見出された。
ほとんどすべてのIgG抗体は、ペプチドエピトープマッピングにおけるペプチドに結合した。これは、おそらく、Fabと比較して、IgG1のより高い結合活性のせいである。Fabとしてペプチド4に結合したのみである、ペプチド4において選択された抗体について、あるものはまた、IgGとしてペプチド9に結合した。もともとは実施例23に記載されたスクリーニングからの抗体について、IgG抗体は、ペプチド4および8、ペプチド9、またはペプチド7に結合し、1つの抗体だけ、807B-M0083E11、はいずれのペプチドにも結合しなかった。
ヒトCTD、マウスCTDおよび霊長類CTDはお互いに比較された。いくつかのIgG抗体は、3つの種のそれぞれのbCTDに結合した。
Fab ELISAにおいてコーティング型VLDLへの結合はなかったが、IgG1 ELISAにおいて、すべてではないがいくつかの抗体がVLDLに結合した。
すべてのIgG抗体は、bCTDがチップ上にコーティングされている場合、Biacore分析において、Fabと比較して向上した結合を示した。
IgG1結果は、表18に要約されている。
実施例31：807A-M0028-B02のアミロイド沈着物におけるCTDへの結合に対するVLDLの効果
リポタンパク質粒子の存在下での807A-M0028-B02のアミロイド沈着物におけるCTDへの結合を分析するために、VLDLの存在がプラークの染色強度の減少へ導くかどうかを見るために、免疫組織化学がVLDLの存在または非存在下において行われた。
807A-M0028-B02抗体は、段階希釈され、APP/PS1およびヒトAD脳切片の両方のインキュベーション前にVLDLと混合された。最低の抗体濃度(0.04 μg/ml)においてさえもシグナルの消光は観察されなかった。対照的に、CTDに対する市販用抗体(3H1)は、抗体の高濃度(5 μg/ml)においてすでに完全に消光された(図20)。
実施例32：807A-M0028-B02抗体のミクログリア/マクロファージ細胞の食作用活性への効果
807A-M0028-B02の食作用活性への効果を評価するために、アビジンコーティング化FluoSphere蛍光ミクロスフェア(Molecular Probes)上に固定化されたCTDの食作用アッセイが開発された。
1.2 μm 黄緑色ラテックスFluoSpheres(登録商標)NeutrAvidin(商標)標識ミクロスフェア(Molecular Probes Europe BV, Leiden, The Netherlands)上に固定化されたビオチン化CTDは、1%BSA(組織培養試験済み、Invitrogen AB, Sweden)および2%ITS-X(Gibco, Invitrogen AB, Sweden)血清サプリメントを追加したOPTI-MEM培地(CM)に希釈された異なる濃度のIgG変換型クローン807A-M0028-B02で再懸濁され、+4℃で30 min、インキュベートされた。2.0% NaN3、食作用の阻害剤、を含むまたは含まないCMにおけるTHP-1細胞(106細胞ml-1)が、1:100(細胞：ビーズ)の比で添加された。Fc受容体への結合を可能にするために、細胞は、+4℃で20 min、同期化され、無細胞ビーズは低速遠心分離(200 g、10 min、+4℃)により除去された。細胞ペレットは、CMに再懸濁され、CO2インキュベーターにおいて37℃で40 min、インキュベートされた。トリプシン処理後、細胞懸濁液は、無菌状態で採取され、7.5%ウシ血清アルブミン(BSA)クッションの上に層にされ、内部に取り入れられなかったビーズを除去するために+4℃で10 min、150xgにおいて遠心分離された。細胞ペレットは、PBS中の2%PFAの0.3 mlに再懸濁された。結果は、対照のパーセントとして表された、すなわち、フローサイトメトリーにより測定される場合、抗体の非存在下に対する存在下における2個以上のビーズを含む食細胞の量。488 nmにおいて励起を与える空冷アルゴンレーザーでのFACScan(商標)(Becton Dickinson, San Jose, CA)が用いられた。合計10000事象が各試料について獲得され、リスト方式データフォーマットで保存された。蛍光放出が、食作用について520 nm(FL1)において収集された。データ収集および解析は、Consort 30システムおよびLYSIS-IIプログラムで実行された。データは、いったん、ゲーティングの過程における2つのパラメーター、複雑性および細胞サイズ、として、および食作用を分析しうる蛍光(FL1)度数分布ヒストグラムとして示されて、解析された。EC50、食作用活性の50%増加を誘導する濃度(0.01-5μg/ml)は濃度の範囲に対する食作用活性のパーセンテージで作成された用量-応答曲線を用いて、試験される各抗体について測定された。その後、EC50は、これらの曲線から外挿され、抗体の食作用刺激の相対的効率を比較するために用いられた。IgG変換型クローン807A-M0028-B02は、THP-1細胞を刺激しうる高効率(EC50＝34±15 ng/ml)を示した。従って、結果は、807A-M0028-B02が、濃度依存性様式において、ヒトマクロファージ/ミクログリア様細胞によるCTD所有ビーズのインビトロの食作用性取り込みを特異的に方向づけたことを示している。
実施例33：実施例4、実施例21、および実施例22に記載された選択に見出されるクローンの生殖系列修正
表18に記載された抗体について、それらのうちの5個(807A-M0028-B02、807B-M0004-H03、807B-M0009-F06、807B-M0004-A03および807B-M0079-D10)は、さらに調べられた。これらの抗体の軽鎖の可変部分における体細胞突然変異は、すべてのクローンにおいて見出された。クローンの一部はまた、軽鎖の定常部分において変異を含んだ(表21)。ゲノムで公知の生殖系列配列との配列アラインメントが行われ、正しいアミノ酸が同定された(表19および表20に太字で示されている)。修正されたクローンのVL鎖は表19に記載されており、IgGの定常部分は表20に記載されている。
IgG分子が生殖系列であることを保証するために、体細胞突然変異は、5個の抗体においてDNAレベルで修正され、すべての5個の生殖系列修正されたIgG1が発現された(HEK 293T細胞において一過性に)。比較結合分析が、生殖系列修正された抗体がなお機能しうることを保証するために、Biacore(実施例34)、CTD-ELISAおよびIHCにおいて行われた。結果は表23に要約されている。
実施例34：生殖系列修正されたIgGのBiacore分析
表19および20に記載されている生殖系列修正されたクローンは、Biacoreにおいて分析された。分析は、コーティング型bCTDをもつ表面の上を異なる濃度でIgGを流すことにより行われた。ビオチン化対照IgGをもつ表面は、陰性表面として用いられた。
クローン807A-M0028-B02、807A-M0028-B02.1および807A-M0028-B02.2のBiacore分析は、3つのIgG分子が類似した動力学(類似したオン速度およびオフ速度)でbCTDに結合することを示した。IgGの親和性は、有意には変化しない。807B-M0004-A03を807B-M0004-A03.1と比較した場合、同じ結果が得られた。
807B-M0004-H03および807B-M0004-H03.1のBiacore分析は、807B-M0004-H03.1が親のクローンとは異なる動力学でに結合することを示した。しかしながら、これは、親和性値を有意には影響を及ぼさなかった。クローン807B-M0009-F06.1は、CTD-ELISAおよびBiacore分析に示されているように、それのbCTDへの結合能力を失った。
実施例35：ELISAによる抗体のApoEへの結合
抗体は、コーティング型ApoE-CTD ELISAを用いてApoE-CTD結合能力についてスクリーニングされた。ヒト、マーモセットまたはマウスApoE-CTDがマイクロタイタープレート上にコーティングされ、続いて、試験抗体とインキュベーションされた。この後、結合した抗体の量は、二次HRP抗体およびテトラメチルベンジジン(TMB)基質での検出により測定された。ApoE-CTD結合は、ELISAにおいて光学濃度(OD)として測定された高シグナルを与えた。807A-M0028-B02、807A-M0028-B02.1および807A-M0028-B02.2の結合は図22に例示されている。結果は、表22に開示されている。
実施例36：抗体のヒトリポタンパク質への結合
抗体は、コーティング型VLDL ELISAを用いてリポタンパク質結合能力についてスクリーニングされた。ヒトVLDLは、マイクロタイタープレート上にコーティングされ、続いて、試験抗体とインキュベーションされた。この後、結合した抗体の量は、二次HRP抗体およびテトラメチルベンジジン(TMB)基質での検出により測定された。VLDL結合は、ELISAにおいて光学濃度(OD)として測定された高シグナルを与えた。807A-M0028-B02、807A-M0028-B02.1、807A-M0028-B02.2、807B-M0004-H03.0、807B-M0004-H03.1、807B-M0004-A03および807B-M0004-A03.1の結合は図23に例示されている。結果は、表22に開示されている。
実施例37：807A-M0028-B02、807B-M0004-H03、807B-M0004-A03、807B-M0079-D10、807B-M0009-F06のマウス脳プラークへのインビボでの結合、およびFabクローンのヒトAD脳プラークへのインビトロでの結合
807A-M0028-B02、807B-M0004-H03、807B-M0004-A03、807B-M0079-D10および807B-M0009-F06の脳プラークへのインビボでの結合(免疫装飾)は、APP/PS1トランスジェニックマウスへの腹腔内または静脈内注射により実証された(図24および25)。免疫装飾は、早くも、10 mg/kgの807A-M0028-B02の単一用量投与から2日後に観察された。807A-M0028-B02、807B-M0004-H03、807B-M0004-A03、807B-M0079-D10および807B-M0009-F06の結合は、プラーク上に観察されるのみであり、星状細胞またはいずれの他の脳構造の染色も検出されなかった(図24および25)。プラークの実質的な数は、隣接切片上においてAβへのモノクローナル抗体(6E10)で染色することにより測定された各マウスにおける総プラーク負荷量を比較することによりそれぞれのクローンで免疫修飾されたことが実証された。
親和性成熟クローンのヒトAD脳切片におけるアミロイドプラークへのインビトロでの結合はまた、免疫組織化学により実証された(図25)。
ヒトADプラークにおける異なる野生型クローンのインビトロでの結合は、図26において可視化されている。
実施例38：VH-CDR3スパイキングによる807A-M0028-B02、807B-M0004-H03、807B-M0004-A03、807B-M0079-D10、807B-M0009-F06の親和性成熟
スパイキング突然変異は、最初の野生型残基の関連において、807A-M0028-B02、807B-M0004-H03、807B-M0004-A03、807B-M0079-D10および807B-M0009-F06のそれぞれのVH-CDR3の完全長に渡って低レベルの突然変異を導入するために用いられた(図29参照)。標的V遺伝子の5'末端へアニールする能力があるFR1領域と相同である特異的プライマーと共に、FR3およびFR4領域における標的V遺伝子との相同性の領域によりひとくくりにされた各抗体のVH-CDR3配列の長さに渡るスパイクされた多様性の領域を有するオリゴヌクレオチドを用いて行われた。
抗体807A-M0028-B02、807B-M0009-F06および807B-M0004-H03について、VH-CDR3の多様化は、1段階PCR増幅を通して実現化された。このPCRは、軽鎖定常領域に相補的な5'プライマーおよび3'特異的なスパイクされたオリゴヌクレオチドを用いて行われた。PCRは、その後、アドバンテージ(advantage)2PCR酵素系(Clontech)および25サイクル(95℃で1 min、60℃で1 min、および68℃で2 min)についての10 pモルの各プライマーを用いて50 μlの容量において行われた。100 nMのプライマー濃度は、スパイクされたオリゴヌクレオチドにより実行される多様性全体を網羅するために選択された。〜6 μgのPCR産物を得るために100〜200個の反応が必要とされた。すべての産物は、GFX精製キット(Amersham)を用いて精製された。
結果として生じた730 bpのPCR産物は、オリゴヌクレオチドに組み入れられた、内部XbaI部位およびBstEII部位を含む。これらの部位は、ディスプレイベクターへ産物をクローニングするために用いられた。
807B-M0004-A03および807B-M0079-D10のVH CDR3の多様化は2段階で実現された：上記のような一次増幅後、結果として生じた730 bpのPCR産物が、SfiI部位を追加された5'末端の入れ子状態のフォワードプライマー、および3'末端のNheIタグ付きCH1リバースプライマーの組み合わせで再増幅された。PCRは、その後、有利2PCR酵素系(Clontech)および20サイクル(95℃で1 min、68℃で3 min)についての10 pモルの各プライマーを用いて50 μlの容量において行われた；〜6 μgのPCR産物を得るために100〜200個の反応が必要とされた。サイクルの数は、第一PCR段階において導入された最大限の多様性を維持するためにかなり低く(20サイクル)保たれた。再び、最大限の多様性を保証するために、第一PCR産物の50 ngが第二PCR反応を開始するための鋳型として用いられた。すべての産物は、GFX精製キット(Amersham)を用いて精製された。
PCR産物およびベクターバックボーンは、XbaIおよびBstEII(807A-M0028-B02、807B-M0009-F06および807B-M0004-H03について)、またはSfiIおよびNheI(807B-M0004-A03および807B-M0079-D10について)のいずれかの50 U/μg DNAを用いて消化された。
結果として生じた切断産物(ベクターおよびPCR断片の両方)がゲル精製され、各DNA断片の1.6 μgは、T4DNAリガーゼ(NEB)を用いて、同様に切断されたファージミドベクターバックボーンの10 μgへライゲーションされ、各スパイクされたライブラリーについてのライゲーション混合物は、電気穿孔法により大腸菌(E. coli)TG1細胞へ導入された。
ファージミド粒子は、少なくとも1回各クローンを表すために接種について各ライブラリー由来の十分な細菌を用い、ヘルパーファージM13-KO7(Marks et al., (J. Mol. Biol. 222, 581 (1991))を用いてライブラリーから救出された。
各ライブラリーのVH-CDR3における多様性は、シーケンシングにより評価された。96個の単離物が、各ライブラリーについて無作為に採取され、VH-CDR3領域はシーケンシングされ、参照野生型VH-CDR3配列と比較された。
807B-M0079-D10および807B-M0004-A03のクローンについて、完全VH配列が決定され、VH-CDR3の外側のVH参照領域と比較された。
選択の2ラウンドからなる選択手順は、低い方の親和性クローンに対してライブラリーにおける高い方の親和性クローンを優先的に濃縮するために用いられた。親和性選択の第1ラウンドは、野生型抗体を選択するために用いられる濃度と比較して減少した抗原濃度を用いて行われた。最適な減少した抗体濃度は、野生型抗体および対照抗体を用いて経験的に決定された。第2ラウンドは、競合する可溶性FabまたはIgGの存在下でさらに減少した抗原濃度において行われた。用いられる選択条件は、表3に詳述されている。
抗原陽性クローンの濃縮が起こったかどうかを測定するために、成熟されるべき各抗体についての選択の第1ラウンドの前後から46個の無作為に採取されたクローンが、抗原ELISAにおいて試験された。すべての場合において、選択のたった1ラウンド後の抗原陽性クローンの濃縮が観察された。
選択後、gene IIIスタンプが可溶性Fab発現を可能にするためにベクターから除去された。200個のクローンが無作為に採取され、ELISAによりスクリーニングされ、それらの重鎖がシーケンシングされた。Dyax WEBPHAGEデータベースが、ELISAデータをそれぞれの配列に関連づけるために用いられた。スクリーニングアッセイにおいて陽性であることが見出された(ODシグナル＝3xバックグラウンド)クローンのVH-CDR3配列がさらに分析された。
クローン807B-M0079-D10および807B-M0004-A03について、完全VH領域が増幅かつクローニングされ、それで、完全VH配列が得られ、VH CDR3の外側のいずれの突然変異についても調べるためにVH参照配列と比較された。フレームワーク領域に突然変異を含むクローンは捨てられたが、VH-CDR1-CDR2に突然変異を有するクローンは保持された。
選択されたクローンのアミノ酸頻度分析の結果は、表24〜30に示されている。VH-CDR3において、あるアミノ酸位置は非常に保存されており、一方、別のものは頻繁に突然変異されている。
Biacoreスクリーニングは、オンオフ速度またはKDに基づいて5個のCDR3突然変異型Fabを選択するために用いられた。CDR3突然変異型Fabは細菌において発現された。周辺質抽出物が調製され、Biacoreにおいてスクリーニングされた。表4に示されているように、最良のクローンが、hCTDもしくはペプチドへの結合についてのオフ速度かまたはKDのいずれかに基づいて選択された。
ビオチン化ペプチドまたはヒトCTDは、ストレプトアビジンチップ上にコーティングされた。10 ml 培養物からの周辺質抽出物は、HBS＋0.1%BSAに1/2に希釈された。試料は、kinjectプログラムを用いて3分間、30 μl/minで注入された。3分間の解離後、いずれの残りの試料もチップ表面から除去された。オフ速度は、1 minの時間窓(10〜70sの間)で測定された。これらのデータは表31〜35に示されている。
オン速度は、koffおよびFab濃度が公知の場合には、Biacore曲線から計算されうる。非常に高い密度および低い流速で働いている場合に遭遇されるもののような完全な物質移動制限(Mass Transfer Limitation)(MLT)の条件下において、Biacoreシグナルは、チップ表面上を流される分析物の濃度のみに依存する。未精製試料におけるFab濃度は、高密度プロテインAチップ上に異なる濃度の精製されたFabを流すことにより得られた標準曲線から測定されうる。そのように得られたFab濃度およびkoff値を用いて、Biacore曲線からkonデータを計算した。平衡解離定数KDは、koff/konから得られた。これらのデータは表31〜35に示されている。807B-M0079-D10はプロテインAに結合しないことに留意されたい。それゆえに、koff値のみがこのクローンについて示されている。
5個の変異体が、807B-M0004-A03、807B-M0004-H03、807B-M0009-F06、および807A-M0028-B02について成功裡に選択された。選択された変異体は、表36に同定されている。有意に向上したKoffをもつクローンは、807B-M0079-D10について見出されなかった(このクローンについて有効なKDデータはなし)。
選択されたFabは、大腸菌で産生され、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより周辺質抽出物から精製された。調製物の品質は、還元および非還元SDS-PAGE上で調べられた。
精製されたFabは、平衡解離定数KDを正確に測定するために用いられた。
ビオチン化ペプチドまたはヒトCTDは、ストレプトアビジンチップ上にコーティングされた。実験は、HBS流動緩衝液において行われた。精製されたFabは、200 nMへ希釈され、12.5 nMへの段階1/2希釈が作製され、二連で流された。会合について、試料は、kinjectプログラムを用いて30〜40 μl/minで注入された。3分間の解離後、いずれの残りの試料もチップ表面から除去された。センターグラムが、BIAevaluationソフトウェア3.1における同時ka/kdフィッティングプログラムを用いて解析された。データは表36に要約されている。Biacoreスクリーニングから選択された最良クローンは、807B-M0004-A03、807B-M0009-F06および807A-M0028-B02についての最初のクローンより2〜3倍高い親和性を示す。807B-M0004-H03の場合、Biacoreシグナルは、異なるクローンの正確な比較を可能にしなかった。
精製されたFabはまた、免疫組織化学により試験された。表37は、野生型クローンと共に選択されたクローンの名前を示し、それらが免疫組織化学においてプラークを染色するかどうかを示している。
実施例39：実施例38から選択された抗体変異体の軽鎖シャッフリング
軽鎖シャッフリング(図27におけるサイクル2)の出発点として、実施例38(図27におけるサイクル1)からのVH-CDR3改良変異体に対応する重鎖が野生型(WT)クローンと共に用いられた。
WTクローン807B-M0009-F06は、このクローンの親和性がサイクル1からの選択された変異体と比較して有意により低かったため、含まれなかった。抗体807B-M0079-D10について、改良された親和性変異体がサイクル1において見出されなかったため、LCシャッフリングはWTクローンのみにおいて行われた。
この実施例において、親和性成熟されていない抗体は野生型(WT)クローンとして指定され、サイクル1からの選択された変異体は親クローンとして指定された。
サイクル1からの選択された重鎖変異体は、組み合わせ多様性を創造するために約108個の軽鎖(LC)でシャッフリングされた5〜6個の重鎖(HC)のレパートリーを含むFAB310ベクターバックボーンへクローニングされた。
クローンごとに、Qiagen DNA調製がTG1培養において行われた。10 μgのDNAは、その後、SfiIおよびNotI制限酵素を用いて切断され、650 bpの重鎖断片サイズを生じた。FAB310ベクターバックボーンは同様に切断された。
結果として生じた切断産物(ベクターおよび断片の両方)はゲル精製され、各ライブラリーについて、異なる重鎖変異体断片が等量でプールされ、プールされた断片の3 μgは、T4 DNAリガーゼ(NEB)を用いて切断されたファージミドベクターバックボーンの6 μgとライゲーションされた。各ライブラリーについての脱塩されたライゲーション混合物は、電気穿孔法により大腸菌TG1細胞へ導入された。
達成されるライブラリーサイズは、各重鎖変異体が軽鎖レパートリーの各メンバーの少なくとも1つのコピーと結合しているようにであった。
重鎖配列は、各ライブラリーから無作為に採取された50個の単離物について決定された。
807A-M0028-B02由来の未選択ライブラリーから無作為に採取された48個の単離物、および807B-M0009-F06由来の未選択ライブラリーからの48個の軽鎖配列。63個の固有の機能しうる軽鎖が得られた。
ファージミド粒子は、少なくとも1回各クローンを表すために接種について各ライブラリー由来の十分な細菌を用いて、ヘルパーファージM13-KO7(Marks et al., (J. Mol. Biol. 222, 581 (1991))で救出された。
5個の軽鎖シャッフリング化ライブラリーが、改良親和性変異体について選択された。選択の前に、ライブラリーは、ライブラリーを1 ml 2% MPBSにおいて100 μl ストレプトアビジン常磁性ビーズと事前インキュベートすることにより、ストレプトアビジン結合抗体について枯渇させられた。各ライブラリーについて、抗原の3つの濃度が、選択の第2ラウンドについての最適な濃度を決定するために用いられた(表5)。ビーズ-標的複合体とのファージのインキュベーション時間は0.5時間へ低減され、プログラム化した洗浄の11サイクルは、Kingfisher装置において用いられた。選択後、結合したファージは、溶出され、大腸菌(0.5のTG1 OD)に感染し、その液体は、25 ml 2xTY/アンピシリン(100 ug/ml)グルコース(2% w/v)において250 rpmで振盪させながら、30℃で一晩、増幅された。細胞は濃縮され、グリセロール貯蔵物がラウンド2選択を行うために作製された。
未選択ライブラリーおよび出力は、採取およびスクリーニングについて単一コロニーを得るために滴定された。未選択ライブラリーおよび出力ライブラリーから、47個のコロニーが採取され、ファージELISA(b-BSA、加えてストレプトアビジンを介して、すべての抗原についてコーティングされた抗原0.5 μg/ml)においてスクリーニングされた。
すべての選択手段は、結果として、抗原結合クローンの濃縮を生じた。これらの結果に基づいて、抗原濃度は、選択の第2ラウンドについて選択された。
ラウンド2選択についての条件は、よりストリンジェントであるように選択され、向上した(より速い)konおよび向上した(より遅い)koffについて選択するように設計された。3つのストラテジーは、表6に概要を示しているように用いられた：ストラテジーI - 抗原濃度のさらなる低下；ストラテジーII - 抗原濃度のさらなる低下および抗原とのインキュベーション時間の低減(kon選択)；ストラテジーIII - 抗原濃度のさらなる低下および増加ストリンジェント性洗浄(koff選択)。選択は、KingFisher自動化装置において行われ、約1012個のファージの入力が用いられた。選択の前に、ライブラリーは、上記のようにストレプトアビジン結合抗体について枯渇させられた。選択後、結合したファージは溶出され、前に記載されているように、大腸菌を感染させるために用いられた。細胞は濃縮され、グリセロール貯蔵物が作製された。
ラウンド2の出力は、抗原結合クローンのパーセンテージを測定するためにELISAにおいて事前スクリーニングされた。クローンの限られた数の配列分析は、何か特定のクローンが選択に優位を占めているかどうか、および選択されたクローンに何か優位な軽鎖ファミリーがあるかどうかを決定するために行われた。
ラウンド2ファージ出力(合計15個)のそれぞれは、可溶性Fabを産生するためにバッチで再クローニングされた。これは、gene IIIスタンプのベクターからの除去を通して達成された。
200個のクローンが無作為に採取され、それらのそれぞれの抗原への結合についてELISAによりスクリーニングされた。抗体配列は、陽性ヒットについてのみ決定された。保存および最初の配列分析は、Dyax WEBPHAGEデータベースにより行われた。
ライブラリー807B-M0004-A03、807B-M0079-D10および807A-M0004-H03について、2〜8回濃縮された抗体が選択された。ライブラリー807A-M0028-B02および807B-M0009-F06について、固有のクローンの数が低かったので、すべてのクローンが取られた。すべてのELISA陽性かつ固有のヒットからの軽鎖および重鎖の配列は表38〜42に示されている。
可能性のある親和性成熟結合剤のBiacore分析後、少数が、より高い親和性をもつことが見出された。ライブラリー807B-M0004-A03、807A-M0028-B02および807B-M004-H03のみが、WTおよび親のクローンより高い親和性をもつ親和性成熟抗体を与えた。それらの選択されたクローンの軽鎖配列は、生殖系列と整列させられた。興味深いことに、同じアミノ酸位置は、同じ生殖系列に属するすべての選択されたクローンの間で多様化されているように思われる。
ライブラリー807B-M0004-A03について、クローンM148E08およびM150E03は、ぴったり同じ重鎖配列および2アミノ酸だけ異なる軽鎖を有するが、クローンM150E03は、M148E08と比較して3.2x向上した親和性をもち、FR1に位置しているたった2アミノ酸がこの向上の原因であることを示唆している。
ライブラリー807B-M0028-B02および807B-M0004-A03について、CDRおよびFRに観察された多様化の大部分は、野生型と比較して生殖系列配列への復帰突然変異であった。
わずかの保存性変異が、807A-M0028-B02ライブラリー由来クローンのFR3において観察された。
Biacore分析について、すべてのクローン変異体は、小培養(典型的には、10 ml)で増殖され、周辺質抽出物(PE)が調製され、PEにおけるFab濃度は、プロテインA/Gチップ上に試料を流すことにより測定された。PEは、その後、同じFab濃度(25〜50 nM)へ希釈され、標的コーティング化チップ(ペプチド4、8、9またはCTD)の上を流された。最良のクローンは、会合および解離相の振幅(807A-M0028-B02、807B-M0004-A03、807B-M0009-F06)かまたは平衡状態におけるBiacoreシグナルの値(807B-M0004-H03)かのいずれかに基づいて同定された。807B-M0079-D10由来のクローンは、プロテインA/Gチップに結合せず、従って、それらのオフ速度に基づいてのみランク付けされた。
807B-M0004-H03由来のクローンは、平衡解離定数KDを反映する平衡状態におけるBiacoreシグナルの値に基づいてランク付けされた：平衡状態におけるBiacoreシグナルが高ければ高いほど、親和性は良い。
807B-M0079-D10由来のクローンは、koffにのみ基づいてランク付けされた。
4個および5個の変異体が、それぞれ、807A-M0028-B02および807B-M0004-A03について選択された。単離された807B-M0009-F06変異体のいずれも、CDR3スパイキングから得られた最良変異体より高い親和性を示さないように思われた。807B-M0004-H03について、2つの変異体は、平衡状態におけるBiacoreシグナルの値に基づいて選択された。807B-M0079-D10変異体のいずれも、オフ速度分析に基づいて選択されえなかった。
選択されたクローンは、大腸菌に産生され、周辺質抽出物から精製された。この材料は、Biacoreにおいて平衡解離定数KDを正確に測定するために用いられた。データは表7に要約されている。軽鎖シャッフリングから単離された最良クローンは、対応する最初の野生型クローンまたはCDR3スパイキングから単離された最良クローンより〜5倍良い親和性を示す。
軽鎖シャッフリング後に選択されたクローンは、表43および44に示されている。
（表１）
原繊維およびur-bCTDにおける選択から生じたsFabのオフ速度測定
Figure 2008502311
（表２）
候補クローン807A-M0026-F05(26F5)、807A-M0027-E11(27E11)および807A-M0028-B02(28B2)についてのCTDコーティング化チップ上のFabおよびIgG結合の比較
Figure 2008502311
＊注入停止後にすぐに測定されたkd。
＃注入停止から〜50 sec後に測定されたkd。
n.f. 適合なし
n.d. 決定されず
（表３）
Figure 2008502311
（表４）
Figure 2008502311
（表５）
減少性抗原濃度におけるラウンド1選択から回収された抗原結合クローンのパーセンテージ
Figure 2008502311
（表６）
第2ラウンド選択ストラテジーについて用いられる条件
Figure 2008502311
（表７）
Figure 2008502311
＊動力学分析；1:1モデル
（表８）
SEQ ID NO:21〜164および171〜206の説明
Figure 2008502311
（表９）
実施例5のスクリーニングストラテジーを用いて同定された抗体のVL鎖のアミノ酸配列
Figure 2008502311
Figure 2008502311
Figure 2008502311
Figure 2008502311
（表１０）
実施例5のスクリーニングストラテジーを用いて同定された抗体のVH鎖のアミノ酸配列
Figure 2008502311
Figure 2008502311
Figure 2008502311
Figure 2008502311
（表１１）
実施例21および22のスクリーニングストラテジーを用いて同定された抗体のVL鎖のアミノ酸配列
Figure 2008502311
Figure 2008502311
Figure 2008502311
（表１２）
実施例21および22のスクリーニングストラテジーを用いて同定された抗体のVH鎖のアミノ酸配列
Figure 2008502311
Figure 2008502311
Figure 2008502311
（表１３）
Figure 2008502311
（表１４）
実施例23のスクリーニングストラテジーを用いて同定された抗体のVL鎖のアミノ酸配列
Figure 2008502311
Figure 2008502311
Figure 2008502311
Figure 2008502311
（表１５）
実施例23のスクリーニングストラテジーを用いて同定された抗体のVH鎖のアミノ酸配列
Figure 2008502311
Figure 2008502311
Figure 2008502311
Figure 2008502311
（表１６）
Figure 2008502311
Figure 2008502311
（表１７）
CTDおよびペプチドへのFab結合データ
Figure 2008502311
Figure 2008502311
＊低RU：RUが低い、親和性は測定されなかった
＊＊RUなし：結合は観察されなかった
（表１８）
CTDおよびペプチドへのIgG結合データ
Figure 2008502311
＊低RU：RUが低い、親和性は測定されなかった
＊＊RUなし：結合は観察されなかった
† VLDL ELISA:VLDLはコーティングされている、適切なhIgGの5 μg/mlが添加される、2xバックグラウンドのO.D.は0.420である
（表１９）
生殖系列修正された抗体のVL鎖のアミノ酸配列
Figure 2008502311
（表２０）
生殖系列修正された抗体のCL鎖のアミノ酸配列
Figure 2008502311
（表２１）
SEQ ID NO:539〜548の説明
Figure 2008502311
（表２２）
CTDおよびペプチドへのIgG結合データ
Figure 2008502311
Figure 2008502311
1n.d.：行われず
2IHC：ヒトAD皮質由来の組織が用いられた。適切なhIgGの1 μg/mlが添加される。
3RUなし：結合は観察されなかった
4低RU：RUが低い、親和性は測定されなかった
5VLDL ELISA：ヒトVLDLがコーティングされている、適切なhIgGの0.0003〜100 μg/mlが結合について試験される
6ELISA：ヒト、マウスまたは霊長類CTDがコーティングされている、適切なhIgGの0.0003〜100 μg/mlが結合について試験される
（表２３）
CTDおよび組織への生殖系列修正されたIgGの結合
Figure 2008502311
1n.d.：行われず
2VLDL ELISA：ヒトVLDLがコーティングされている、適切なhIgGの0.0003〜100 μg/mlが結合について試験される
3IHC：APP/PS1マウス由来の脳組織切片が用いられた。適切なhIgGの1.5〜1.8 μg/mlが添加される。
3＊hCTDへより低いmCTDへの反応性
4CTD ELISA：ヒト、マウスまたは霊長類CTDがコーティングされている、適切なhIgGの0.0003〜100 μg/mlが結合について試験される
（表２４）
807B-M0004-A03＝Fab産生について選択された39個のクローン
Figure 2008502311
（表２５）
807B-M0004-H03＝Fab産生について選択された54個のクローン：パート1
Figure 2008502311
（表２６）
807B-M0004-H03＝Fab産生について選択された54個のクローン：パート2
Figure 2008502311
（表２７）
807B-M0079-D10＝Fab産生について選択された33個のクローン
Figure 2008502311
（表２８）
807A-M0028-B02-CTD＝Fab産生について選択された60個のクローン
Figure 2008502311
（表２９）
807A-M0028-B02-原繊維＝Fab産生について選択された12個のクローン
Figure 2008502311
（表３０）
807B-M0009-F06＝Fab産生について選択された24個のクローン
Figure 2008502311
（表３１）
807B-M0004-A03、最初のクローンおよび変異体のBiacore分析
Figure 2008502311
Figure 2008502311
＊＝選択されたクローン
BC＝Biacore
（表３２）
807B-M0004-H03、最初のクローンおよび変異体のBiacore分析
Figure 2008502311
Figure 2008502311
＊＝選択されたクローン
（表３３）
807B-M0009-F06、最初のクローンおよび変異体のBiacore分析
Figure 2008502311
Figure 2008502311
＊＝選択されたクローン
（表３４）
807B-M0079-D10、最初のクローンおよび変異体のBiacore分析
Figure 2008502311
＊＝選択されたクローン
（表３５）
807A-M0028-B02、最初のクローンおよび変異体のBiacore分析
Figure 2008502311
Figure 2008502311
＊＝選択されたクローン
BC＝Biacore
（表３６）
807B-M0004-A03、807B-M0009-F06、807A-M0028-B02および変異体の詳細なBiacore分析
Figure 2008502311
（表３７）
Biacoreスクリーニングから選択されたクローンの免疫組織化学
Figure 2008502311
（表３８）
807A-M0028-B02の親和性成熟クローン
Figure 2008502311
（表３９）
807B-M0004-A03の親和性成熟クローン
Figure 2008502311
（表４０）
807B-M0004-H03の親和性成熟クローン
Figure 2008502311
（表４１）
807B-M0009-F06の親和性成熟クローン
Figure 2008502311
（表４２）
807B-M0079-D10の親和性成熟クローン
Figure 2008502311
（表４３）
VH-CDR3スパイキングおよび軽鎖シャッフリングにより選択された抗体の軽鎖配列
Figure 2008502311
（表４４）
VH-CDR3スパイキングおよび軽鎖シャッフリングにより選択された抗体の重鎖配列
Figure 2008502311
ELISAにおける公知のモノクローナル抗体のビオチン化CTD(bCTD)およびVLDLへの結合を示す。 ファージのbCTD(バックグラウンド＝0.05)およびVLDL(バックグラウンド＝0.1)への結合を示す。 203個のファージクローンにおけるbCTD(A)およびVLDL(B) ELISAの例を示す。 sFab抗体M27E11(A)、M28B02(B)およびM26F05(C)のコーティング型bCTD上におけるBiacore親和性分析、ならびにチップ上にコーティングされたFab M27E11(D)に関するBiacore親和性分析。 FabのpBh1への移入のストラテジーを示す概略図である。 抗体807A-M0028-B02(M28B02)(A)、807A-M0026-F05(M26F05)(B)および807A-M0027-E11(M27E11)(C)のヒトCTD、マウスCTDおよび霊長類CTDへの結合を示す。 対照抗体PH1(A)および807A-M0028-B02(M28B02)(B)の、bCTDおよびbNTDへの結合を示す。 対照抗体PH1(A)および807A-M0028-B02(M28B02)(B)の、コーティング型VLDLへの結合を示す。 コーティング型bCTD(0.05 μg/ml)と溶液中の過剰のVLDLまたはCTDの間での競合ELISAにおける抗体結合の結果を示す。 可溶性Fab(上端)としての807A-M0026-F05(M26F05)およびCTD-対照チップ上でのIgG(下端)のBiacore分析を示す。 可溶性Fab(上端)としての807A-M0027-E11(A)および807A-M0028-B02(B)、ならびにCTDコーティング化チップ上のIgG(下端)のBiacore分析を示す。 溶液中のbCTDの、Biacoreチップへ間接的に連結したFab 807A-M0027-E11(M27E11)への結合を示す。 溶液中のbCTDの、Biacoreチップへ間接的に連結したFab 807A-M0027-E11(M27E11)への結合を示す。 V-領域をpBh1からpRmk2aへ移動するために用いられるストラテジーを示す概略図である。 CTDペプチドの配列を示す。 実施例21の選択キャンペーンを示す。 実施例22の選択キャンペーンを示す。 実施例23の選択キャンペーンを示す。 「切り貼り」抗体再編成ストラテジーを示す。 ヒトAD脳切片における807A-M0028-B02プラーク結合がVLDLの存在下においてブロックされないことを示す。インビトロでの807A-M0028-B02のヒトアミロイドプラークへの結合は、VLDLの存在により影響を及ぼされなかったが、その抗体が、プラークにおけるCTDと比較して、VLDLにおけるCTDに対して非常に低い親和性をもつことを示している。 ヒトAD脳切片におけるsFab抗体クローンのインビトロでの免疫組織化学(IHC)スクリーニングの結果を示す。免疫組織化学によりADプラークに結合する、異なる選択からいくつかの抗体(Fabクローン)が同定された。個々のクローンは、同じ短い名前、すなわち、E11、をもちうるが、異なる選択からであり、同一ではないことを留意されたい。(C11＝807B-M0004-H03；(選択A)E11＝807A-M0027-E11；B2＝807A-M0028-B02；(選択B)E11＝807B-M0083-E11；D10＝807B-M0079-D10；A3＝807B-M0004-A03；A12＝807B-M0013-A12) 807A-M0028-B02、807A-M0028-B02.1および807A-M0028-B02.2の、ヒト、霊長類およびマウスApoE-CTDへの濃度依存性結合の代表的結果(二連の試料)を示す。 807A-M0028-B02、807A-M0028-B02.1、807A-M0028-B02.2、807B-M0004-H03、807B-M0004-H03.1、807B-M0004-A03および807B-M0004-A03.1のヒトVLDLへの濃度依存性結合の代表的結果(二連の試料)を示す。 APP/PS1マウス由来の脳組織切片における807A-M0028-B02プラーク結合の検出を示す：a)インビボでの、注入から4日後の807A-M0028-B02の結合b)インビボでの、注入から7日後の807A-M0028-B02の結合 807B-M0004-H03、807B-M0004-A03、807B-M0079-D10および807B-M0009-F06のインビボでのプラーク結合能力のスクリーニングの結果を示す。インビボの投与後のAPP/PS1マウス脳切片における抗CTD hIgGクローン807B-M0004-H03、807B-M0004-A03、807B-M0079-D10および807B-M0009-F06の免疫組織化学発現パターンが示されている。 ヒトAD脳切片における親和性成熟Fabクローンのプラーク結合能力についてのインビトロのスクリーニングの結果を示す。野生型クローン807B-M0004-A03(wt A03)は、親和性成熟クローン807B-M0118-B09(B09)、807B-M0117-F05(F05)、807B-M0117-G01(G01)および807B-M0118-F03(F03)と比較された。アミロイドプラークは、ヒトAD脳切片上において抗CTD結合抗体(Fabクローン)により可視化された。 807A-M0028-B02、807B-M0004-H03、807B-M0004-A03、807B-M0079-D10および807B-M0009-F06の親和性成熟のために用いられるストラテジーを示す。
配列の簡単な説明
SEQ ID NO:1は、ApoE-CTDのアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:2は、ペプチド1のアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸1位〜16位)。
SEQ ID NO:3は、ペプチド2のアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸17位〜32位)。
SEQ ID NO:4は、ペプチド3のアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸33位〜48位)。
SEQ ID NO:5は、ペプチド4のアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸49位〜64位)。
SEQ ID NO:6は、ペプチド5のアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸65位〜80位)。
SEQ ID NO:7は、ペプチド6のアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸9位〜24位)。
SEQ ID NO:8は、ペプチド7のアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸25位〜40位)。
SEQ ID NO:9は、ペプチド8のアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸41位〜56位)。
SEQ ID NO:10は、ペプチド9のアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸57位〜72位)。
SEQ ID NO:11は、ペプチド10のアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸73位〜84位)。
SEQ ID NO:12は、ペプチド4におけるエピトープのアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸53位〜60位)。
SEQ ID NO:13は、ペプチド4および9におけるエピトープのアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸57位〜64位)。
SEQ ID NO:14は、ペプチド9におけるエピトープのアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸61位〜68位)。
SEQ ID NO:15は、ペプチド1および6におけるエピトープのアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸9位〜16位)。
SEQ ID NO:16は、ペプチド4および8におけるエピトープのアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸49位〜56位)。
SEQ ID NO:17は、ペプチド3および8におけるエピトープのアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸41位〜48位)。
SEQ ID NO:18は、ペプチド1および6のアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸1位〜24位)。
SEQ ID NO:19は、ペプチド8および9のアミノ酸配列である(ApoE-CTDのアミノ酸41位〜72位)。
SEQ ID NO:20は、抗体807A-M0027-E11および807A-M0028-B02由来のコンセンサスCDR3配列のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:21〜164は、表8に記載されている。
SEQ ID NO:165は、ヒトApoE4のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:166は、ヒトApoE3のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:167は、ヒトApoE2のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:168は、ヒトApoE4の成熟型のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:169は、ヒトApoE3の成熟型のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:170は、ヒトApoE2の成熟型のアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:171〜206は、表8に記載されている。
SEQ ID NO:207〜511は、表38〜42に記載されている。
SEQ ID NO:512は、807A-M0028-B02の親和性成熟クローンのCDR3領域のコンセンサスアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:513は、807B-M0004-A03の親和性成熟クローンのCDR3領域のコンセンサスアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:514は、807B-M0004-H03の親和性成熟クローンのCDR3領域のコンセンサスアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:515は、807B-M0009-F06の親和性成熟クローンのCDR3領域のコンセンサスアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:516は、807A-M0028-B02の選択された親和性成熟クローンのCDR3領域のコンセンサスアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:517は、807B-M0004-A03の選択された親和性成熟クローンのCDR3領域のコンセンサスアミノ酸配列である。
SEQ ID NO:518〜527は、表21に定義されている。

Claims (69)

  1. 抗体または断片が以下である、ヒト抗体または抗体断片：
    (i)アポリポタンパク質EのC末端ドメイン(ApoE-CTD)のSEQ ID NO:1に示されたアミノ酸配列またはその一部のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する；および
    (ii)ヒトプラークに結合する。
  2. SEQ ID NO:512、SEQ ID NO:513、SEQ ID NO:514、SEQ ID NO:515、SEQ ID NO:516、またはSEQ ID NO:517に示された配列を含む重鎖CDR3領域を含む、請求項1記載の抗体または抗体断片。
  3. SEQ ID NO:20に示された配列を含む重鎖CDR3領域を含む、請求項1もしくは2記載の抗体または抗体断片。
  4. CDR3領域が、SEQ ID NO:23またはSEQ ID NO:26に示された配列を含む、請求項3記載の抗体または抗体断片。
  5. CDR3領域が、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:321、SEQ ID NO:322、SEQ ID NO:323、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:485、SEQ ID NO:486、SEQ ID NO:487、SEQ ID NO:488、またはSEQ ID NO:489に示された配列を含む、請求項1もしくは2記載の抗体または抗体断片。
  6. CDR3領域が、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:321、SEQ ID NO:322、またはSEQ ID NO:373に示された配列を含む、請求項5記載の抗体または抗体断片。
  7. SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86、およびSEQ ID NO:89に示された配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3領域を含む、請求項1記載の抗体または抗体断片。
  8. CDR3領域が、SEQ ID:50、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:74、またはSEQ ID NO:80を含む、請求項7記載の抗体または抗体断片。
  9. SEQ ID NO:1の一部のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、またはSEQ ID NO:17に示された配列を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  10. SEQ ID NO:1の一部のアミノ酸配列を有するポリペプチドが、SEQ ID NO:18またはSEQ ID NO:19に示された配列を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  11. SEQ ID NO:1に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  12. 抗体または断片が以下である、ヒト抗体または抗体断片：
    (i)ApoE-CTDのSEQ ID NO:1に示されたアミノ酸配列またはその一部のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する；および
    (ii)SEQ ID NO:512、SEQ ID NO:513、SEQ ID NO:514、SEQ ID NO:515、SEQ ID NO:516、またはSEQ ID NO:517に示された配列を含む重鎖CDR3領域を含む。
  13. CDR3領域が、SEQ ID NO:20に示された配列を含む、請求項12記載の抗体または抗体断片。
  14. CDR3領域が、SEQ ID NO:23またはSEQ ID NO:26に示された配列を含む、請求項13記載の抗体または抗体断片。
  15. CDR3領域が、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:321、SEQ ID NO:322、SEQ ID NO:323、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:485、SEQ ID NO:486、SEQ ID NO:487、SEQ ID NO:488、またはSEQ ID NO:489に示された配列を含む、請求項12記載の抗体または抗体断片。
  16. CDR3領域が、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:321、SEQ ID NO:322、またはSEQ ID NO:373に示された配列を含む、請求項15記載の抗体または抗体断片。
  17. 抗体または断片が以下である、ヒト抗体または抗体断片：
    (i)ApoE-CTDのSEQ ID NO:1に示されたアミノ酸配列またはその一部のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する；および
    (ii)SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86、およびSEQ ID NO:89に示された配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3領域を含む。
  18. 超低密度リポタンパク質(VLDL)の存在下においてポリペプチドに結合する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  19. 抗体または断片が、VLDLの存在下において、SEQ ID NO:1に示されたApoE-CTDアミノ酸配列またはその一部のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する、ヒト抗体または抗体断片。
  20. ポリペプチドが、組換えポリペプチドである、前記請求項のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  21. 組換えポリペプチドが、ビオチン化されている、請求項14記載の抗体または抗体断片。
  22. 抗体または断片が以下である、ヒト抗体または抗体断片：
    (i)ヒトプラークに結合する；および
    (ii)SEQ ID NO:512、SEQ ID NO:513、SEQ ID NO:514、SEQ ID NO:515、SEQ ID NO:516、またはSEQ ID NO:517に示された配列を含む重鎖CDR3領域を含む。
  23. CDR3領域が、SEQ ID NO:20に示された配列を含む、請求項22記載の抗体または抗体断片。
  24. CDR3領域が、SEQ ID NO:23またはSEQ ID NO:26に示された配列を含む、請求項23記載の抗体または抗体断片。
  25. CDR3領域が、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:321、SEQ ID NO:322、SEQ ID NO:323、SEQ ID NO:373、SEQ ID NO:374、SEQ ID NO:375、SEQ ID NO:376、SEQ ID NO:485、SEQ ID NO:486、SEQ ID NO:487、SEQ ID NO:488、またはSEQ ID NO:489に示された配列を含む、請求項22記載の抗体または抗体断片。
  26. CDR3領域が、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:320、SEQ ID NO:321、SEQ ID NO:322、またはSEQ ID NO:373に示された配列を含む、請求項25記載の抗体または抗体断片。
  27. 抗体または断片が以下である、ヒト抗体または抗体断片：
    (i)ヒトプラークに結合する；および
    (ii)SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:86、およびSEQ ID NO:89に示された配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3領域を含む。
  28. VLDLの存在下においてプラークに結合する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  29. VLDLが、ヒト血漿に存在する、請求項18、19および28のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  30. 25%血漿の存在下においてプラークに結合する、請求項29記載の抗体または抗体断片。
  31. 25%から50%までの血漿の存在下においてプラークに結合する、請求項30記載の抗体または抗体断片。
  32. 50%血漿の存在下においてプラークに結合する、請求項31記載の抗体または抗体断片。
  33. SEQ ID NO:136に示された重鎖配列ならびにSEQ ID NO:521および522に示された軽鎖配列を含む、抗体または抗体断片。
  34. SEQ ID NO:142に示された重鎖配列およびSEQ ID NO:523に示された軽鎖配列を含む、抗体または抗体断片。
  35. SEQ ID NO:40に示された重鎖配列ならびにSEQ ID NO:517および/または518に示された軽鎖配列を含む、抗体または抗体断片。
  36. SEQ ID NO:40に示された重鎖配列ならびにSEQ ID NO:519および/または520に示された軽鎖配列を含む、抗体または抗体断片。
  37. SEQ ID NO:24に示された重鎖CDR1配列、SEQ ID NO:25に示された重鎖CDR2配列、ならびにSEQ ID NO:207、209および210のいずれか一つに示された重鎖CDR3配列を含む、抗体または抗体断片。
  38. SEQ ID NO:33、34および35、SEQ ID NO:219、247および269、SEQ ID NO:226、252および275、またはSEQ ID NO:218、34および268に示された軽鎖CDR1、CDR2ならびにCDR3配列を含む、請求項37記載の抗体または抗体断片。
  39. 重鎖がSEQ ID NO:210に示された配列を含み、かつ軽鎖がSEQ ID NO:33、34および35に示された配列を含む、
    重鎖がSEQ ID NO:209に示された配列を含み、かつ軽鎖がSEQ ID NO:219、247および269、もしくはSEQ ID NO:218、34および268に示された配列を含む、
    または重鎖がSEQ ID NO:207に示された配列を含み、かつ軽鎖がSEQ ID NO:226、252および275に示された配列を含む、
    請求項38記載の抗体または抗体断片。
  40. 重鎖が、SEQ ID NO:317、318または319のいずれか一つに示された配列を含む、請求項37〜39のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  41. 軽鎖が、SEQ ID NO:43、295、294または304に示された配列を含む、請求項38〜40のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  42. SEQ ID NO:48に示された重鎖CDR1配列、SEQ ID NO:49に示された重鎖CDR2配列、ならびにSEQ ID NO:320、322および323のいずれか一つに示された重鎖CDR3配列を含む、抗体または抗体断片。
  43. SEQ ID NO:326、334および341、SEQ ID NO:93、333および341、またはSEQ ID NO:325および333に示された軽鎖CDR1、CDR2ならびにCDR3配列を含む、請求項42記載の抗体または抗体断片。
  44. 重鎖が、SEQ ID NO:320に示された配列を含み、かつ軽鎖がSEQ ID NO:93、333および341、もしくはSEQ ID NO:325、333および341に示された配列を含む、
    重鎖がSEQ ID NO:322に示された配列を含み、かつ軽鎖がSEQ ID NO:326、334および341、SEQ ID NO:93、333および341、もしくはSEQ ID NO:325、333および341に示された配列を含む、
    または重鎖がSEQ ID NO:323に示された配列を含み、かつ軽鎖がSEQ ID NO:93、333および341に示された配列を含む、
    請求項43記載の抗体または抗体断片。
  45. 重鎖配列が、SEQ ID NO:369、370、371または372に示された配列を含む、請求項42〜44のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  46. 軽鎖が、SEQ ID NO:347、348、357または362に示された配列を含む、請求項43〜45のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  47. SEQ ID NO:66に示された重鎖CDR1配列、SEQ ID NO:67に示された重鎖CDR2配列、ならびにSEQ ID NO:373に示された重鎖CDR3配列を含む、抗体または抗体断片。
  48. SEQ ID NO:391、382および378、またはSEQ ID NO:394、386および378に示された軽鎖CDR1、CDR2ならびにCDR3配列を含む、請求項47記載の抗体または抗体断片。
  49. 重鎖が、SEQ ID NO:397に示された配列を含む、請求項47もしくは48記載の抗体または抗体断片。
  50. 軽鎖配列が、SEQ ID NO:406または418に示されている、請求項48または49記載の抗体または抗体断片。
  51. 抗体が、IgGである、前記請求項のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  52. 抗体断片が、Fab断片またはscFvである、請求項1〜50のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  53. モノクローナル抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  54. ヒト化抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  55. キメラである、前記請求項のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  56. 治療によるヒトもしくは動物身体の処置の方法に、またはヒトもしくは動物身体において実施される診断方法に用いる、前記請求項のいずれか一項記載の抗体または抗体断片。
  57. アミロイド疾患の処置または予防のための薬物の製造における、請求項1〜55のいずれか一項記載の抗体または抗体断片の使用。
  58. アミロイド疾患が、アルツハイマー病、原発性全身性アミロイドーシス、続発性全身性アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発性ニューロパシーI、家族性アミロイド多発性ニューロパシーIII、家族性非ニューロパシー性アミロイドーシス、遺伝性脳のアミロイド血管障害、家族性英国型認知症(FBD)、血液透析関連アミロイドーシス、家族性アミロイドーシス(フィンランド型)、家族性上皮下角膜アミロイド、II型糖尿病、遺伝性腎アミロイドーシス、下垂体アミロイドーシス、注入限局性アミロイドーシス、甲状腺の髄様癌、心房性アミロイドーシス、家族性デンマーク型認知症(FDD)、ダウン症候群、海綿状脳症、散発性クロイツフェルト・ヤコブ病、家族性クロイツフェルト・ヤコブ病、医療性プリオン疾患、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン-シュトラウスセラー-シャインケル疾患(GSS)、クールー、パーキンソン病、ハンチントン病、家族性筋萎縮性側索硬化症(ALS)、および慢性閉塞性肺疾患から選択される、請求項57記載の使用。
  59. 請求項1〜55のいずれか一項記載の抗体または抗体断片、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。
  60. アミロイド疾患を患っている対象を処置する方法であって、請求項1〜55のいずれか一項記載の抗体または抗体断片の治療的有効量を該対象に投与する段階を含む、方法。
  61. 以下の段階を含む、対象においてアミロイド疾患を診断する方法：
    (i)請求項1〜55のいずれか一項記載の抗体または抗体断片を該対象に投与する段階；および
    (ii)該抗体または抗体断片が該対象においてプラークに結合しているかどうかを測定する段階であって、該抗体または抗体断片のプラークへの結合がアミロイド疾患を示しており、それにより、対象がアミロイド疾患をもつかどうかを決定する、段階。
  62. 抗体または抗体断片が、標識されている、請求項61記載の方法。
  63. アミロイド疾患が、アルツハイマー病、原発性全身性アミロイドーシス、続発性全身性アミロイドーシス、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイド多発性ニューロパシーI、家族性アミロイド多発性ニューロパシーIII、家族性非ニューロパシー性アミロイドーシス、遺伝性脳のアミロイド血管障害、家族性英国型認知症(FBD)、血液透析関連アミロイドーシス、家族性アミロイドーシス(フィンランド型)、家族性上皮下角膜アミロイド、II型糖尿病、遺伝性腎アミロイドーシス、下垂体アミロイドーシス、注入限局性アミロイドーシス、甲状腺の髄様癌、心房性アミロイドーシス、家族性デンマーク型認知症(FDD)、ダウン症候群、海綿状脳症、散発性クロイツフェルト・ヤコブ病、家族性クロイツフェルト・ヤコブ病、医療性プリオン疾患、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン-シュトラウスセラー-シャインケル疾患(GSS)、クールー、パーキンソン病、ハンチントン病、家族性筋萎縮性側索硬化症(ALS)、および慢性閉塞性肺疾患から選択される、請求項60または61記載の方法。
  64. 請求項1〜55のいずれか一項記載の抗体または抗体断片をコードするポリヌクレオチド。
  65. 請求項64記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  66. 請求項1〜55のいずれか一項記載のポリペプチドを発現させる宿主細胞。
  67. 請求項64記載のポリヌクレオチドをコードするウイルス。
  68. 請求項1〜55のいずれか一項記載の抗体または抗体断片、および該抗体または抗体断片を検出するための手段を含む、ApoE-CTDを検出するためのキット。
  69. 以下の段階を含む、対象由来の試料においてApoE-CTDの存在を検出するための方法：
    (i)対象から採取された試料を、請求項1〜55のいずれか一項記載の抗体または抗体断片と、抗体または抗体断片のApoE-CTDへの結合を可能にする条件下で、接触させる段階；および
    (ii)抗体または抗体断片が試料に結合しているかどうかを測定し、それにより、試料に存在する任意のApoE-CTDを検出する段階。
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