CN105403649A - 一种检测ad的方法及尿液多肽组ad生物标记物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测AD的方法及尿液多肽组AD生物标记物，其所述尿液多肽组AD生物标记物为组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物、能量代谢蛋白降解产物中的一种或多种。本发明的组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物或能量代谢蛋白降解产物可用作AD的生物标记物，所述组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物或能量代谢蛋白降解产物均是一种简单和无创的尿液多肽组AD生物标记物，对AD的特异性和敏感性都可达到80%以上，利用上述尿液多肽组AD生物标记物可检测是否患有AD症，以对AD进行预防和延缓。
Description
技术领域
本发明涉及AD生物标记物技术领域，尤其涉及一种检测AD的方法及尿液多肽组AD生物标记物。
背景技术
作为老年痴呆症的最常见类型，阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）是一种由于大脑神经细胞死亡而导致的神经退行性疾病，因由德国精神病学家和神经病理学家AloisAlzheimer于1907年首先报道而命名。AD症的临床表现为认知功能衰退、记忆力下降、智力恶化和日常生活能力不断减退，并伴随有各种神经精神异常和行为障碍。因此，与绝大多数其它疾病不同，AD症所丧失的是情感和尊严等人类的本质特征。美国阿尔茨海默病协会（Alzhermer’sAssociation）统计，到2000年，美国65岁以上人口占总人口的比例约为4.5%，当年美国新增AD症患者为41.1万。十年后的2010年，以上两个数字分别增至5.1%和45.4万。截至2012年，全世界大约有3560万名AD患者，占世界总人口的0.5%。根据《2010年世界阿尔茨海默病》报告的数据，全世界老年痴呆症的人数每20年将增加1倍。流行病学研究表明，在发达国家老年痴呆症患者的人数呈线性增加，但是，在低收入国家老年痴呆症患者的人数呈现的却是指数增加的态势。我国老年人口基数众多，老龄化速度加快的同时AD的发病率逐年增长，预计在未来50年内我国AD的发病率将会增加3倍。2011～2015年，全国60岁以上老年人将由1.78亿增加到2.21亿，平均每年增加老年人860万；老年人口比重将由13.3%增加到16%。《中国老龄事业发展“十二五”规划》指出:未来20年，我国人口老龄化日益加重，到2030年全国老年人口规模将会翻一番。但是，AD症尚未引起中国社会的足够重视，例如，病人的就诊率偏低，很多人没有将其作为一种疾病，也没有意识到AD带来的社会、经济、医疗护理的负担将日益严峻。
AD主要的病理特征为老年斑（senileplaque，SP）、神经纤维缠结（neurofibrillarytangles，NFTs）及神经元和神经突触的丢失。老年斑的主要成分是β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ），主要存在于大脑皮质、神经节、白质、脑干和小脑中，老年斑的周围缠绕退化的神经元和神经轴突。但总体上AD是由多种病发因素引起的综合性疾病，这也可以解释为什么十年来以单一靶点为目标的包括抗体、疫苗和小分子在内的药物都失败在III期临床，无一成功。目前临床上使用的安理申等西药对治疗AD症有一定作用，但也只限于早期患者，并且不能停药，一旦停药之后患者病情急剧恶化。目前AD尚无法治愈，预防和延缓AD的发生是控制AD的最可行的有效途径。AD按照病情发展程度可分为临床前阶段、轻度认知障碍、早期痴呆、中期痴呆和重度痴呆。但是，AD的病理学改变有可能在出现认知功能障碍的5-10年就已经发生，因此，发现有效的AD早期诊断标志物对AD的预防和延缓至关重要。
AD最显著的病理学特征是脑内的淀粉样蛋白沉积和神经纤维缠结，其产生原因分别是β-淀粉样蛋白和微管相关蛋白Tau的过度磷酸化，因此，脑脊液中β-淀粉样蛋白、总Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的水平以及它们的组合被认为是AD生物标志物的最主要标志。但是，脑脊液检测的创伤性限制了该标志物的应用，特别是在无明显认知功能障碍时，对脑脊液检测的抵触甚至大于对AD症的关切。另外，在不同实验室之间甚至同一实验室之内这些检测结果的变动很大。
多肽组学是以机体内源性多肽和低分子量蛋白质为研究对象，研究多肽组的成分、功能、变化规律及其相关关系。蛋白质是生命功能的执行者和体现者，蛋白质代谢的异常也会通过其在体内的降解在多肽组学的水平反映出来。对于AD症等慢性疾病，蛋白质分子水平的变化往往早于临床症状的改变。但是，现有技术中不存在应用多肽组以寻找简单和无创的AD生物标志物。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测AD的方法及尿液多肽组AD生物标记物，旨在解决现有AD生物标记物应用受到限制和检测结果变动很大的问题。
本发明的技术方案如下：
一种AD的尿液多肽组AD生物标记物，其中，所述尿液多肽组AD生物标记物为组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物、能量代谢蛋白降解产物中的一种或多种。
所述的AD的尿液多肽组AD生物标记物，其中，所述组蛋白降解产物为HistoneH2B，HistoneH2A，HistoneH3.2，HistoneH4，HistoneH2Btype1-J，HistoneH1.2，HistoneH3.1t，HistoneH1.4，HistoneH2A.Z和HistoneH1.5中的一种或多种。
所述的AD的尿液多肽组AD生物标记物，其中，所述炎症蛋白降解产物为Alpha-1-antichymotrypsin，Osteopontin，ProteinS100-A8，ProteinS100-A12和Ceruloplasmin中的一种或多种。
所述的AD的尿液多肽组AD生物标记物，其中，所述能量代谢蛋白降解产物为Transketolase降解产物，PyruvatekinaseisozymesM1/M2降解产物，Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase降解产物，Phosphoglyceratekinase1降解产物和CathepsinG的降解产物中的一种或多种。
所述的AD的尿液多肽组AD生物标记物，其中，所述尿液多肽组AD生物标记物还包括Haptoglobin，ApolipoproteinA-I，Vimentin，Iglambda-2chainCregions，Thymosinbeta-4，Actin，Beta-2-microglobulin，Plasmaserineproteaseinhibitor，Inter-alpha-trypsininhibitorheavychainH4，CarboxypeptidaseB2和Fibrinogenbetachain中的一种或多种。
一种基于如上任一所述AD的尿液多肽组AD生物标记物检测AD的方法，其中，包括步骤：
A、取1.0~2.0mLAD患者的尿液样品，离心10~15min后取上清，按照上清尿液30mg/mL与LaGM复合材料=(40~60)：1的重量比例加入该复合材料，充分涡旋后室温振荡10~15min；
B、离心5~10min，磁分离，去掉上清，在去上清后的沉淀中加入450~500uL水，充分涡旋后室温振荡5~10min，离心，磁分离，去掉上清，重复2次；
C、在步骤B去上清后的沉淀中加入20uL80%+1%TFA的洗脱液，磁分离，收集上清，重复1次，冷冻干燥，得到检测尿液；
D、检测步骤C得到的检测尿液中是否存在组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物、能量代谢蛋白降解产物中的一种或多种。
所述的检测AD的方法，其中，包括步骤：
A'、取1.5mLAD患者的尿液样品，10000rpm离心10min后取上清，按照上清尿液30mg/mL与LaGM复合材料=50：1的重量比例加入该复合材料，充分涡旋2min后1000r室温振荡10min；
B'、10000r离心5min，磁分离，去掉上清，在去上清后的沉淀中加入500uL水，充分涡旋1min，室温振荡5min，10000r离心5min磁分离，去掉上清，重复2次；
C'、在步骤B'去上清后的沉淀中加入20uL80%+1%TFA的洗脱液，磁分离，收集上清，重复1次，冷冻干燥，得到检测尿液；
D'、检测步骤C'得到的检测尿液中是否存在组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物、能量代谢蛋白降解产物中的一种或多种。
所述的检测AD的方法，其中，所述步骤D或D'中，还包括检测步骤C或C'得到的检测尿液中是否存在Haptoglobin，ApolipoproteinA-I，Vimentin，Iglambda-2chainCregions，Thymosinbeta-4，Actin，Beta-2-microglobulin，Plasmaserineproteaseinhibitor，Inter-alpha-trypsininhibitorheavychainH4，CarboxypeptidaseB2和Fibrinogenbetachain中的一种或多种。
所述的检测AD的方法，其中，所述步骤D或D'中，通过液相色谱-TripleTOF质谱分析对检测尿液进行检测。
所述的检测AD的方法，其中，所述液相色谱-TripleTOF质谱分析具体包括步骤：将得到的检测尿液重新溶解于Nano-RPLCBufferA中，在线Nano-RPLC液相色谱在EksigentnanoLC‐Ultra?2D系统进行，溶解后的检测尿液以2μL/min的流速上样到C18预柱上，然后保持流速冲洗脱盐10min；分析柱是C18反相色谱柱，所用梯度为70min内流动相B由5%升高至80%；质谱采用TripleTOF560系统结合纳升喷雾III离子源，喷雾电压为2.4kV，气帘气压为30Psi，雾化气压为5Psi，加热温度为150℃，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式。
有益效果：本发明的组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物或能量代谢蛋白降解产物可用作AD的生物标记物，所述组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物或能量代谢蛋白降解产物均是一种简单和无创的尿液多肽组AD生物标记物，对AD的特异性和敏感性都可达到80%以上，利用上述尿液多肽组AD生物标记物可检测是否患有AD症，以对AD进行预防和延缓。
具体实施方式
本发明提供一种检测AD的方法及尿液多肽组AD生物标记物，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种AD的尿液多肽组AD生物标记物，其中，所述尿液多肽组AD生物标记物为组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物、能量代谢蛋白降解产物中的一种或多种。
具体地，所述组蛋白降解产物可以为HistoneH2B，HistoneH2A，HistoneH3.2，HistoneH4，HistoneH2Btype1-J，HistoneH1.2，HistoneH3.1t，HistoneH1.4，HistoneH2A.Z和HistoneH1.5中的一种或多种。组蛋白不仅是疾病损伤的模式分子，也是AD老年斑和染色质的组成成分。在AD患者的尿液中可观察到大量HistoneH2B，HistoneH2A，HistoneH3.2，HistoneH4，HistoneH2Btype1-J，HistoneH1.2，HistoneH3.1t，HistoneH1.4，HistoneH2A.Z和HistoneH1.5中的一种或多种组蛋白降解产物。
具体地，所述炎症蛋白降解产物可以为Alpha-1-antichymotrypsin，Osteopontin，ProteinS100-A8，ProteinS100-A12和Ceruloplasmin中的一种或多种。越来越多的研究表明炎症在AD和其它神经退行性疾病中扮演着重要作用，在神经退行性疾病的早期可观察到慢性神经炎症，体内免疫系统的激活正在成为神经退行性疾病的关键构成。本发明的Alpha-1-antichymotrypsin，Osteopontin，ProteinS100-A8，ProteinS100-A12和Ceruloplasmin等5种中的一种或多种与炎症相关的炎症蛋白降解产物在AD患者尿液中显著高于正常人的尿液中，因此，上述炎症蛋白降解产物可作为潜在的AD生物标记物。
具体地，所述能量代谢蛋白降解产物可以为Transketolase降解产物，PyruvatekinaseisozymesM1/M2降解产物，Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase降解产物，Phosphoglyceratekinase1降解产物和CathepsinG降解产物中的一种或多种。减少的葡萄糖代谢和线粒体功能失调是AD症的另一个特征，本发明的Transketolase降解产物，PyruvatekinaseisozymesM1/M2降解产物，Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase降解产物，Phosphoglyceratekinase1降解产物和CathepsinG降解产物中的一种或多种的能量代谢蛋白降解产物在AD患者的尿液中特有或高表达，因此，上述能量代谢蛋白降解产物可作为AD生物标记物。
具体地，所述尿液多肽组AD生物标记物还包括Haptoglobin，ApolipoproteinA-I，Vimentin，Iglambda-2chainCregions，Thymosinbeta-4，Actin，Beta-2-microglobulin，Plasmaserineproteaseinhibitor，Inter-alpha-trypsininhibitorheavychainH4，CarboxypeptidaseB2和Fibrinogenbetachain中的一种或多种。上述与AD相关的蛋白质也可以作为AD生物标记物。
基于上述尿液多肽组AD生物标记物，本发明还提供一种基于如上任一所述AD的尿液多肽组AD生物标记物检测AD的方法，其包括步骤：
A、取1.0~2.0mLAD患者的尿液样品，离心10~15min后取上清，按照上清尿液30mg/mL与LaGM复合材料=(40~60)：1的重量比例加入该复合材料，充分涡旋后室温振荡10~15min；
B、离心5~10min，磁分离，去掉上清，在去上清后的沉淀中加入450~500uL水，充分涡旋后室温振荡5~10min，离心，磁分离，去掉上清，重复2次；
C、在步骤B去上清后的沉淀中加入20uL80%+1%TFA的洗脱液，磁分离，收集上清，重复1次，冷冻干燥，得到检测尿液；
D、检测步骤C得到的检测尿液中是否存在组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物、能量代谢蛋白降解产物中的一种或多种。
所述的检测AD的方法，其中，所述步骤D中，还包括检测步骤C得到的检测尿液中是否存在Haptoglobin，ApolipoproteinA-I，Vimentin，Iglambda-2chainCregions，Thymosinbeta-4，Actin，Beta-2-microglobulin，Plasmaserineproteaseinhibitor，Inter-alpha-trypsininhibitorheavychainH4，CarboxypeptidaseB2和Fibrinogenbetachain中的一种或多种。
下面以具体的实施例对本发明的检测AD的方法进行详细说明。其中，氧化石墨烯-磷酸镧纳米磁性复合材料（LaGM）、纳升反向色谱流动相A：0.1%甲酸，2%乙腈、纳升反向色谱流动相B：0.1%甲酸，98%乙腈、C18反相色谱捕集柱、C18反相色谱分析柱。
实施例
本发明的检测AD的方法，其中，包括步骤：
A'、取1.5mLAD的尿液样品，10000rpm离心10min后取上清，按照上清尿液30mg/mL与LaGM复合材料=50：1的重量比例加入该复合材料，充分涡旋2min后1000r室温振荡10min；
B'、10000r离心5min，磁分离，去掉上清，在去上清后的沉淀中加入500uL水，充分涡旋1min，室温振荡5min，10000r离心5min磁分离，去掉上清，重复2次；
C'、在步骤B'去上清后的沉淀中加入20uL80%+1%TFA的洗脱液，磁分离，收集上清，重复1次，冷冻干燥，得到检测尿液；
D'、检测步骤C'得到的检测尿液中是否存在组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物、能量代谢蛋白降解产物中的一种或多种。
所述步骤D'中，通过液相色谱-TripleTOF质谱分析对检测尿液进行检测。所述液相色谱-TripleTOF质谱分析具体包括步骤：将得到的检测尿液重新溶解于Nano-RPLCBufferA中，在线Nano-RPLC液相色谱在EksigentnanoLC‐Ultra?2D系统进行，溶解后的检测尿液以2μL/min的流速上样到C18预柱上，然后保持流速冲洗脱盐10min；分析柱是C18反相色谱柱，所用梯度为70min内流动相B由5%升高至80%；质谱采用TripleTOF560系统结合纳升喷雾III离子源，喷雾电压为2.4kV，气帘气压为30Psi，雾化气压为5Psi，加热温度为150℃，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式。
上述检测AD的方法，设置两组实验，步骤A'中，实验组中尿液样品为15例AD患者老人尿液混合液，对照组中尿液样品为15例年龄匹配的正常对照组老人尿液混合液，然后分别进行多肽组学分析，发现在AD组中存在23种特异性蛋白质和9种相对含量超过对照组3倍以上的9种蛋白质，按照它们的生理作用和与AD的关系，可分为以下四组：
（1）、组蛋白
AD患者的尿液中包含大量的HistoneH2B，HistoneH2A，HistoneH3.2，HistoneH4，HistoneH2Btype1-J，HistoneH1.2，HistoneH3.1t，HistoneH1.4，HistoneH2A.Z和HistoneH1.5在内的组蛋白降解产物。
（2）、炎症因子
AD患者的尿液中包含大量的Alpha-1-antichymotrypsin，Osteopontin，ProteinS100-A8，ProteinS100-A12和Ceruloplasmin等5种与炎症相关的炎症蛋白降解产物。AD患者尿液中上述的炎症蛋白降解产物的量显著高于对照组正常人的尿液。
（3）、能量代谢蛋白
AD患者的尿液中包含ransketolase降解产物，PyruvatekinaseisozymesM1/M2降解产物，Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase降解产物，Phosphoglyceratekinase1降解产物和CathepsinG的降解产物中的一种或多种的能量代谢蛋白降解产物在AD患者的尿液中特有或高表达。
（4）、其它相关蛋白
AD患者的尿液中还包含Haptoglobin，ApolipoproteinA-I，Vimentin，Iglambda-2chainCregions，Thymosinbeta-4，Actin，Beta-2-microglobulin，Plasmaserineproteaseinhibitor，Inter-alpha-trypsininhibitorheavychainH4，CarboxypeptidaseB2和Fibrinogenbetachain等与AD相关的蛋白质。
随后，本发明还将上述标记物进行了个体验证，发现利用这些标记物的组合，对AD的特异性和敏感性都可达到80%以上。
综上所述，本发明提供一种检测AD的方法及尿液多肽组AD生物标记物，本发明的组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物或能量代谢蛋白降解产物可用作AD的生物标记物，所述组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物、能量代谢蛋白降解产物和肌动蛋白actin等蛋白质的降解产物均是一种简单和无创的尿液多肽组AD生物标记物，对AD的特异性和敏感性都可达到80%以上，利用上述尿液多肽组AD生物标记物可检测是否患有AD症，以对AD进行预防和延缓。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种AD的尿液多肽组AD生物标记物，其特征在于，所述尿液多肽组AD生物标记物为组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物、能量代谢蛋白降解产物中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的AD的尿液多肽组AD生物标记物，其特征在于，所述组蛋白降解产物为HistoneH2B，HistoneH2A，HistoneH3.2，HistoneH4，HistoneH2Btype1-J，HistoneH1.2，HistoneH3.1t，HistoneH1.4，HistoneH2A.Z和HistoneH1.5中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的AD的尿液多肽组AD生物标记物，其特征在于，所述炎症蛋白降解产物为Alpha-1-antichymotrypsin，Osteopontin，ProteinS100-A8，ProteinS100-A12和Ceruloplasmin中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的AD的尿液多肽组AD生物标记物，其特征在于，所述能量代谢蛋白降解产物为Transketolase降解产物，PyruvatekinaseisozymesM1/M2降解产物，Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase降解产物，Phosphoglyceratekinase1降解产物和CathepsinG降解产物中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的AD的尿液多肽组AD生物标记物，其特征在于，所述尿液多肽组AD生物标记物还包括Haptoglobin，ApolipoproteinA-I，Vimentin，Iglambda-2chainCregions，Thymosinbeta-4，Actin，Beta-2-microglobulin，Plasmaserineproteaseinhibitor，Inter-alpha-trypsininhibitorheavychainH4，CarboxypeptidaseB2和Fibrinogenbetachain中的一种或多种。
6.一种基于如权利要求1~5任一所述AD的尿液多肽组AD生物标记物检测AD的方法，其特征在于，包括步骤：
A、取1.0~2.0mLAD患者的尿液样品，离心10~15min后取上清，按照上清尿液30mg/mL与LaGM复合材料=(40~60)：1的重量比例加入该复合材料，充分涡旋后室温振荡10~15min；
B、离心5~10min，磁分离，去掉上清，在去上清后的沉淀中加入450~500uL水，充分涡旋后室温振荡5~10min，离心，磁分离，去掉上清，重复2次；
C、在步骤B去上清后的沉淀中加入20uL80%+1%TFA的洗脱液，磁分离，收集上清，重复1次，冷冻干燥，得到检测尿液；
D、检测步骤C得到的检测尿液中是否存在组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物、能量代谢蛋白降解产物中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的检测AD的方法，其特征在于，包括步骤：
A'、取1.5mLAD患者的尿液样品，10000rpm离心10min后取上清，按照上清尿液30mg/mL与LaGM复合材料=50：1的重量比例加入该复合材料，充分涡旋2min后1000r室温振荡10min；
B'、10000r离心5min，磁分离，去掉上清，在去上清后的沉淀中加入500uL水，充分涡旋1min，室温振荡5min，10000r离心5min磁分离，去掉上清，重复2次；
C'、在步骤B'去上清后的沉淀中加入20uL80%+1%TFA的洗脱液，磁分离，收集上清，重复1次，冷冻干燥，得到检测尿液；
D'、检测步骤C'得到的检测尿液中是否存在组蛋白降解产物、炎症蛋白降解产物、能量代谢蛋白降解产物中的一种或多种。
8.根据权利要求6或7所述的检测AD的方法，其特征在于，所述步骤D或D'中，还包括检测步骤C或C'得到的检测尿液中是否存在Haptoglobin，ApolipoproteinA-I，Vimentin，Iglambda-2chainCregions，Thymosinbeta-4，Actin，Beta-2-microglobulin，Plasmaserineproteaseinhibitor，Inter-alpha-trypsininhibitorheavychainH4，CarboxypeptidaseB2和Fibrinogenbetachain中的一种或多种。
9.根据权利要求6或7所述的检测AD的方法，其特征在于，所述步骤D或D'中，通过液相色谱-TripleTOF质谱分析对检测尿液进行检测。
10.根据权利要求9所述的检测AD的方法，其特征在于，所述液相色谱-TripleTOF质谱分析具体包括步骤：将得到的检测尿液重新溶解于Nano-RPLCBufferA中，在线Nano-RPLC液相色谱在EksigentnanoLC‐Ultra?2D系统进行，溶解后的检测尿液以2μL/min的流速上样到C18预柱上，然后保持流速冲洗脱盐10min；分析柱是C18反相色谱柱，所用梯度为70min内流动相B由5%升高至80%；质谱采用TripleTOF560系统结合纳升喷雾III离子源，喷雾电压为2.4kV，气帘气压为30Psi，雾化气压为5Psi，加热温度为150℃，质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式。
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