CN110308280B - 一种唾液外泌体蛋白生物标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种唾液外泌体蛋白生物标记物，其所述唾液外泌体蛋白生物标记物为角蛋白、肌动蛋白、组蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶‑9、炎症蛋白中的一种或多种。本发明的角蛋白、肌动蛋白、组蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶‑9、炎症蛋白可用作AD的生物标记物，所述角蛋白、肌动蛋白、组蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶‑9、炎症蛋白是一种灵敏有效且无创伤性的唾液外泌体蛋白生物标记物，利用上述唾液外泌体蛋白生物标记物可检测和预测是否患有AD症，以对AD进行预防、延缓和药物干预情况评价。

Description

一种唾液外泌体蛋白生物标记物
技术领域
本发明涉及生物标记物技术领域，尤其涉及一种唾液外泌体蛋白生物标记物。
背景技术
外泌体是一种直径为30-150 nm的纳米级脂质包裹体结构，在透射电子显微镜下呈现杯状，密度范围在1.10-1.19g/ml，存在于多种体液中，如血清，唾液，脑脊液，精液和尿液。外泌体起源于晚期内体腔内的囊泡，细胞膜内陷形成早期胞内体，然后内吞相关蛋白，在Ras超家族GTP酶Rab和脂筏复合物的调控下，早期内膜融合后，向细胞外释放而产生外泌体。外泌体的产生可以由许多因素引起，包括细胞外刺激，如微生物攻击和其他压力条件等，外泌体的释放是细胞调节其内部应激状态和对细胞外环境的压力应激的有效调节。除了外泌体在神经系统的正常发育和生理学中的功能之外，它还可以在中枢神经系统内进行交流。
阿尔兹海默症（ Alzheimer's disease，AD ）是一种中枢神经系统退行性的神经变性疾病，主要临床症状是缓慢的认知功能减退，包括记忆、逻辑推理力和语言功能的进行性丟失，最后发展为重度痴呆。AD 的发病机制十分复杂，影像学及量表检测是临床上的主要诊断方法，但尚无灵敏有效且无创伤性的生物标记物诊断方法。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种唾液外泌体蛋白生物标记物，旨在解决现有AD诊断方法无灵敏有效且无创伤性的生物标记物的问题。
本发明的技术方案如下：
一种唾液外泌体蛋白生物标记物，其中，所述唾液外泌体蛋白生物标记物为角蛋白、肌动蛋白、组蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9、炎症蛋白中的一种或多种。
所述的唾液外泌体蛋白生物标记物，其中，所述角蛋白为II型角蛋白和I型角蛋白中的一种或多种。
所述的唾液外泌体蛋白生物标记物，其中，所述II型角蛋白为Keratin4、Keratin6A、Keratin78、Keratin76、Keratin5中的一种或多种。
所述的唾液外泌体蛋白生物标记物，其中，所述I型角蛋白为Keratin19、Keratin17、Keratin13、Keratin16、Keratin14、Keratin9、Keratin10中的一种或多种。
所述的唾液外泌体蛋白生物标记物，其中，所述肌动蛋白为Alpha-actinin-1、Alpha-actinin-2、Alpha-actinin-4中的一种或多种。
所述的唾液外泌体蛋白生物标记物，其中，所述组蛋白为Histone H3.1、HistoneH3.3、Histone H3.2、Histone H4、Histone H2B中的一种或多种。
所述的唾液外泌体蛋白生物标记物，其中，所述炎症蛋白为Azurophil、ProteinS100-A8、Protein S100-A9、Protein S100-A12、 Alpha-1-acid glycoprotein 1、Pentraxin-related protein、Chitinase-3-like protein 1中的一种或多种。
所述的唾液外泌体蛋白生物标记物，其中，所述唾液外泌体蛋白生物标记物还包括Calpain-1 catalytic subunit、Annexin A3、Lactotransferrin、Ras GTPase-activating-like protein、Azurocidin、Integrin alpha-M、Integrin beta-2、Grancalcin、Neutrophil elastase\Vimentin、Thioredoxin-dependent peroxidereductase、Myosin light polypeptide 6和Alpha-1-acid glycoprotein 1中的一种或多种。
有益效果：本发明的角蛋白、肌动蛋白、组蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9、炎症蛋白可用作AD的生物标记物，该AD生物标记物是一种灵敏有效且无创伤性的唾液外泌体蛋白生物标记物，利用上述唾液外泌体蛋白生物标记物可检测是否患有AD症，也可以对AD进行早期预警和干预，评价药物的疗效。
具体实施方式
本发明提供一种唾液外泌体蛋白生物标记物，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
研究表明AD患者的脑脊液和血液中的外泌体存在含有MCI错误折叠的聚集形式的神经退行性疾病相关蛋白，而且外泌体能够将错误折叠蛋白质从不健康的神经元运送到临近的细胞，这些发现表明神经退行性疾病可能通过外泌体在大脑中传播。本发明提供一种唾液外泌体蛋白生物标记物，其中，所述唾液外泌体蛋白生物标记物可分为：与细胞骨架相关的蛋白如角蛋白、肌动蛋白、组蛋白中的一种或多种；与神经病理学相关的蛋白包括丝裂原活化蛋白激酶1（Mitogen-activated protein kinase1）、钙蛋白酶1（Calpain1）、髓过氧化物酶(Myeloperoxidase)、基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9)中的一种或多种以及炎症蛋白，即本发明所述唾液外泌体蛋白生物标记物包括角蛋白、肌动蛋白、组蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9、炎症蛋白等8类唾液外泌体蛋白中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，所述唾液外泌体蛋白生物标记物为角蛋白、肌动蛋白、组蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9、炎症蛋白，利用上述生物标记物检测AD，对AD的特异性和敏感性可达到80%以上。
在本发明的另一个实施例中，所述唾液外泌体蛋白生物标记物为角蛋白、肌动蛋白、组蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9。
在本发明的又一实施例中，所述唾液外泌体蛋白生物标记物为肌动蛋白、组蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9。
具体地，所述角蛋白包括II型角蛋白和I型角蛋白中的一种或两种。其中所述II型角蛋白包括Keratin4（KRT4，角蛋白4）、Keratin6A（KRT6A，角蛋白6A）、Keratin78（KRT78，角蛋白78）、Keratin76（KRT76，角蛋白76）、Keratin5（KRT5，角蛋白5）中的一种或多种。所述I型角蛋白包括Keratin19（KRT19，角蛋白19）、Keratin17（KRT17，角蛋白17）、Keratin13（KRT13，角蛋白13）、Keratin16（KRT16，角蛋白16）、Keratin14（KRT14，角蛋白14）、Keratin9（KRT9，角蛋白9）、Keratin10（KRT10，角蛋白10）中的一种或多种。角蛋白是中间纤维的重要组成成分，维持细胞骨架的稳定。本发明通过提取AD患者，MCI患者和正常人的唾液外泌体蛋白，并通过分析比对唾液外泌体蛋白，发现AD患者和MCI患者的唾液外泌体蛋白中Keratin4、Keratin6A、Keratin78、Keratin76、Keratin5、Keratin19、Keratin17、Keratin13、Keratin16、Keratin14、Keratin9、Keratin10的含量明显高于正常组。
在本发明的一个实施例中，所述唾液外泌体蛋白生物标记物为Keratin4、Keratin6A、Keratin78、Keratin76、Keratin5、Keratin19、Keratin17、Keratin13、Keratin16、Keratin14、Keratin9、Keratin10、肌动蛋白、组蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9、炎症蛋白，利用上述生物标记物检测AD，对AD的特异性和敏感性可达到80%以上。
在本发明的另一个实施例中，所述唾液外泌体蛋白生物标记物为所述唾液外泌体蛋白生物标记物为Keratin4、Keratin6A、Keratin78、Keratin76、Keratin5、肌动蛋白、组蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9、炎症蛋白。
在本发明的又一实施例中，所述唾液外泌体蛋白生物标记物为所述唾液外泌体蛋白生物标记物为Keratin19、Keratin17、Keratin13、Keratin16、Keratin14、Keratin9、Keratin10、肌动蛋白、组蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9、炎症蛋白。
进一步地，所述肌动蛋白包括Alpha-actinin-1（ACTN1，肌动蛋白α1）、Alpha-actinin-2（ACTN2，肌动蛋白α2）、Alpha-actinin-4（ACTN4，肌动蛋白α4）中的一种或多种。肌动蛋白（Actinin）包括α、β和γ三种亚型，属于高度保守蛋白质，在真核细胞中参与细胞分裂、运动、迁移等多种生理活动。α- Actinin是肌肉组织中，牵引装置的主要成分，β和γ两种亚型在大多数细胞肌动蛋白共存的组件内部细胞骨架和介质能动性肌动蛋白是组成细胞骨架的微丝的主要组成，细胞中肌动蛋白单体为球形，常与其结合蛋白结合，肌动蛋白单体挨个相连成为肌动蛋白链，两条肌动蛋白链相互缠绕形成微丝。AD病理特征表现为细胞外老年斑和细胞内相关神经元纤维缠结，在患者神经元中，细胞凋亡的形态学特征，例如出现起泡，凋亡小体的形成和染色质凝集，以及细胞骨架重组等都被观察到，ACTN1和ACTN2被认为锚定在各种细胞内结构，研究表明肌动蛋白在 AD等神经退行性疾病的病理学中扮演重要角色。
在本发明的一个实施例中，所述唾液外泌体蛋白生物标记物为Keratin4、Keratin6A、Keratin78、Keratin76、Keratin5、Keratin19、Keratin17、Keratin13、Keratin16、Keratin14、Keratin9、Keratin10、Alpha-actinin-1、Alpha-actinin-2、Alpha-actinin-4、组蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9、炎症蛋白，利用上述生物标记物检测AD，对AD的特异性和敏感性可达到80%以上。
在本发明的另一个实施例中，所述唾液外泌体蛋白生物标记物为所述唾液外泌体蛋白生物标记物为Keratin4、Keratin6A、Keratin78、Keratin76、Keratin5、Alpha-actinin-1、Alpha-actinin-2、Alpha-actinin-4、组蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9、炎症蛋白。
在本发明的又一实施例中，所述唾液外泌体蛋白生物标记物为所述唾液外泌体蛋白生物标记物为Keratin19、Keratin17、Keratin13、Keratin16、Keratin14、Keratin9、Keratin10、Alpha-actinin-1、Alpha-actinin-2、Alpha-actinin-4、组蛋白、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9、炎症蛋白。
进一步地，所述组蛋白包括Histone H3.1（组蛋白H3.1）、Histone H3.3（组蛋白H3.3）、Histone H3.2（组蛋白H3.2）、Histone H4（组蛋白H4）、Histone H2B（组蛋白H2B）中的一种或多种。研究表明组蛋白异常修饰会导致人类疾病，如：癌症、神经发育障碍、神经退行性疾病、病原体污染等，当组蛋白从细胞核内异位到胞外间隙，它会作为内源性危险信号或者危险信号相关模式分子，组蛋白不仅是疾病损伤的模式分子，也是AD老年斑和染色质的组成成分，因此，在AD患者的唾液外泌体中可以观察到大量的Histone H3.1、HistoneH3.3、Histone H3.2、Histone H4、Histone H2B中的一种或多种蛋白生物标记物。
在本发明的一个实施例中，所述唾液外泌体蛋白生物标记物为Keratin4、Keratin6A、Keratin78、Keratin76、Keratin5、Keratin19、Keratin17、Keratin13、Keratin16、Keratin14、Keratin9、Keratin10、Alpha-actinin-1、Alpha-actinin-2、Alpha-actinin-4、Histone H3.1、Histone H3.3、Histone H3.2、Histone H4、Histone H2B、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9、炎症蛋白。
进一步地，所述炎症蛋白包括Azurophil、Protein S100-A8、Protein S100-A9、Protein S100-A12、 Alpha-1-acid glycoprotein 1、Pentraxin-related protein、Chitinase-3-like protein 1中的一种或多种。研究表明炎症反应参与AD发病、炎症激活的小胶质细胞和星型胶质细胞产生大量的炎性细胞因子包括白细胞介素、肿瘤坏死因子以及一些急性时相反应蛋白，且随着病情加重而增加。本发明中通过对唾液外泌体蛋白进行提取并检测，发现AD和MCI患者的唾液外泌体中Azurophil、Protein S100-A8、ProteinS100-A9、Protein S100-A12、Alpha-1-acid glycoprotein 1、Pentraxin-relatedprotein、Chitinase-3-like protein 1等7种中的一种或多种与炎症相关的炎症蛋白明显高于正常人，因此，上述炎症蛋白可作为潜在的AD生物标记物。
在本发明的一个实施例中，所述唾液外泌体蛋白生物标记物为Keratin4、Keratin6A、Keratin78、Keratin76、Keratin5、Keratin19、Keratin17、Keratin13、Keratin16、Keratin14、Keratin9、Keratin10、Alpha-actinin-1、Alpha-actinin-2、Alpha-actinin-4、Histone H3.1、Histone H3.3、Histone H3.2、Histone H4、Histone H2B、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9、Azurophil，ProteinS100-A8，Protein S100-A9，Protein S100-A12， Alpha-1-acid glycoprotein 1，Pentraxin-related protein， Chitinase-3-like protein 1。
具体的，所述唾液外泌体蛋白生物标记物还包括Calpain-1 catalytic subunit、Annexin A3、Lactotransferrin、Ras GTPase-activating-like protein，Azurocidin、Integrin alpha-M、Integrin beta-2、Grancalcin、Neutrophil elastase、Vimentin、Thioredoxin-dependent peroxide reductase、Myosin light polypeptide 6和Alpha-1-acid glycoprotein 1中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，所述唾液外泌体蛋白生物标记物为Keratin4、Keratin6A、Keratin78、Keratin76、Keratin5、Keratin19、Keratin17、Keratin13、Keratin16、Keratin14、Keratin9、Keratin10、Alpha-actinin-1、Alpha-actinin-2、Alpha-actinin-4、Histone H3.1、Histone H3.3、Histone H3.2、Histone H4、Histone H2B、丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9、Azurophil，ProteinS100-A8、Protein S100-A9、Protein S100-A12、 Alpha-1-acid glycoprotein 1、Pentraxin-related protein、 Chitinase-3-like protein 1、Calpain-1 catalyticsubunit、Annexin A3、Lactotransferrin、Ras GTPase-activating-like protein、Azurocidin、Integrin alpha-M、Integrin beta-2、Grancalcin、Neutrophil elastase、Vimentin、Thioredoxin-dependent peroxide reductase、Myosin light polypeptide 6和Alpha-1-acid glycoprotein 1。
因此，本发明确定了用于诊断AD的唾液外泌体蛋白生物标记物，AD唾液外泌体蛋白生物标记物为以上44种唾液外泌体蛋白中的一种或多种蛋白的组合。本发明上述唾液外泌体蛋白的任意组合均可作为AD生物标记物，其均能能灵敏有效且无创伤性地反映AD病理发展状况，实现对AD的早期诊断。
本发明将上述唾液外泌体蛋白中的任意一种或一种以上以组合作为AD检测生物标记物，用于临床诊断，可极大提高诊断特异性和准确性。本发明中唾液外泌体蛋白提取方法简单，与影像学及量表检测相比相比创伤性小、安全性高，对患者无毒副作用，人为主观性降低，更为准确，而且具有定量检测的效果。
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
（1）唾液外泌体蛋白分离
1. 取唾液样品，在4℃以2600×g离心30分钟以除去细胞，细菌，碎片和食物残余物；
2. 取唾液上清液，室温下14000×g离心2分钟，将上清液转移到新的离心管中，加入与样品量的比例为2：1的外泌体沉淀试剂，涡旋混合均匀，将离心管在4℃孵育过夜；
3. 孵育后，4℃，10000×g离心1小时，弃去上清后，室温下14000×g 离心10秒去除附着在管壁上的液体，获得外泌体沉淀。
（2）唾液外泌体蛋白提取
将外泌体沉淀物重悬于尿素缓冲液（50mM Tris-Hcl，8M尿素，2M硫脲，1mM DTT，pH=7.5），加入蛋白酶抑制剂混合物(AEBSF、Aprotinin、Bestatin、E-64、Leupeptin、Pepstatin A)，反复抽吸混匀，超声处理5min。
（3）唾液外泌体蛋白浓度定量
1. 准备 96 孔板，0.5 mg/mL蛋白标准品，将G250染色液从4℃冰箱取出，室温放置，恢复到室温后颠倒3-5次混匀；
2. 在96孔板中加样，标准蛋白按0μL、1μL、2μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL加入，用PBS将每个孔的体积补至20μL，相应蛋白质浓度为0 mg/mL、0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1mg/mL、0.2 mg/mL、0.3mg/mL、0.4 mg/mL、0.5mg/mL；
3. 样品用PBS稀释适当的倍数（可在孔中稀释）使其浓度小于0.5 mg/mL，每个孔的体积补至20μL；
4. 每个孔加入200μL的G250染色液，3 min之后，使用酶标仪读取A590 nm吸光度；
5. 根据蛋白标准品读数绘制标准曲线，计算出唾液外泌体蛋白质浓度。
（4）唾液外泌体FASP蛋白酶切
1. 每个待测样品取用定量好的50ug蛋白，按照样品体积加入10X DTT，使DTT终浓度为10mM，37℃孵育2小时；
2. 将10 KDa超滤管放入收集管，随后将样品加入超滤管14000×g离心15min弃去滤液。向超滤管中加入100 µL 的BufferA尿素缓冲液，在14000×g下离心15min弃去滤液。向超滤管中加入100 µL含有50 mM IAA的BufferA尿素缓冲液，混匀避光孵育15 min；
3. 使用14000×g离心15min弃去滤液，向超滤管中加入100µL BufferB尿素缓冲液，使用14000×g离心15min弃去滤液，重复两次；
4. 在上述超滤管中加入100μL的50mM浓度的NH4HCO3，在 14000×g离心15min，弃去滤液，重复三次；加入H2O 将超滤管洗净；
5. 在上述超滤管中加入150μL的50mM浓度的NH4HCO3含有1µg胰酶 (胰酶蛋白比例为1:40)震荡1min，37℃孵育16小时；
6. 将超滤管在12000×g下离心15 min，酶解消化后的肽段溶液于管底部收集；在超滤管中加入50μL浓度为50mM 的NH4HCO3，12000×g再次离心15 min，重复一次，使用真空浓缩仪旋干超滤管底部酶解后的样品。
（5）纳升液相色谱—TripleTOF质谱分析
将酶切后的唾液外泌体蛋白样品用上样缓冲液（98%乙腈，0.1%甲酸）重溶，取4μL样品进行在线的纳升液相色谱质谱连用分析，纳升液相色谱为Ekspert nanoLC 415系统（SCIEX，Concord，ON），质谱为配备有Nanospray III离子源的Triple TOF 6600串联质谱仪（Sciex，Concord，Ontario，Canada）。将4μL样品首先上样到ChromXP C18（3μm，120 Å）柱中，使用100％溶剂A（2%乙腈/0.1%甲酸）以4μL/ min的流速进行脱盐5分钟。然后，在分析柱（75μm×15cm，C18-3μm 120Å，ChromXP，Eksigent）上以溶剂B（98%乙腈/0.1%甲酸）进行梯度洗脱，洗脱梯度为40分钟内溶剂B从8-38％，同时进行质谱扫描分析。质谱参数设置如下：2.4kV的离子喷射电压，35PSI的幕帘气体，12PSI的喷雾器气体和150℃的界面加热器温度，质谱扫描方式为IDA（信息依赖性采集）扫描，调查扫描在250毫秒内获得，如果超过260 cps的阈值且电荷状态为2-4，则收集多达40个产品离子扫描（50ms）。将滚动碰撞能量设定应用于所有前体离子以进行碰撞诱导的解离，动态排除设置为16秒。
（6）数据库检索鉴定分析蛋白质
使用ProteinPilot Software 5.0.1进行原始质谱图的wiff格式文件数据的蛋白质鉴定。数据库检索参数设置：数据库为Homo sapiens , May 26, 2018, 71434个条目，设定参数为：Cys烷基化：碘乙酰胺，消化：胰蛋白酶，仪器：TripleTOF 6600，磷酸化强调和生物学修饰，检索方式为彻底分析，假阳性率控制为1%FDR。检测蛋白质阈值ProtScore（Conf）>0.47（66.0％）。肽段置信度(Conf)大于95%，蛋白质检索得分（unused score）大于等于1，peptided大于等于2则被视为可信结果。
设置三组实验，实验组中唾液样品为AD患者唾液样品和MCI患者唾液样品，对照组中唾液样品为年龄匹配的正常对照组唾液样品，然后分别提取唾液中的外泌体蛋白并进行外泌体蛋白进行分析鉴定，发现在AD组和MCI组中存在含量明显高于对照组的44种唾液外泌体蛋白，按照它们的生理作用和与AD的关系，可分为以下四组：
（1）与细胞骨架相关蛋白
AD患者的唾液外泌体中包含大量的II型角蛋白包括Keratin4、Keratin6A、Keratin78、Keratin76、Keratin5；I型角蛋白包括Keratin19、Keratin17、Keratin13、Keratin16、Keratin14、Keratin9、Keratin10；肌动蛋白包括Alpha-actinin-1、Alpha-actinin-2、Alpha-actinin-4；组蛋白包括Histone H3.1、Histone H3.3、Histone H3.2、Histone H4、Histone H2B；
（2）与神经病理相关蛋白
AD患者的唾液外泌体中包含大量的丝裂原活化蛋白激酶1、钙蛋白酶1、髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶-9等4种与神经病理相关的蛋白。AD患者唾液外泌体中上述的蛋白含量显著高于对照组正常人的唾液外泌体；
（3）与炎症相关蛋白
AD患者的唾液外泌体中包含Azurophil、Protein S100-A8、Protein S100-A9、Protein S100-A12、Alpha-1-acid glycoprotein 1、Pentraxin-related protein、Chitinase-3-like protein 1等与炎症相关蛋白明显高于对照组正常人的唾液外泌体；
（4）其它相关蛋白
AD患者的唾液外泌体中还包含Calpain-1 catalytic subunit、Annexin A3、Lactotransferrin、Ras GTPase-activating-like protein、Azurocidin、Integrinalpha-M、Integrin beta-2、Grancalcin、Neutrophil elastase、Vimentin、Thioredoxin-dependent peroxide reductase、Myosin light polypeptide 6和Alpha-1-acidglycoprotein 1等与AD相关的蛋白质。
综上所述，本发明提供一种唾液外泌体蛋白生物标记物，本发明通过提取唾液外泌体蛋白，并检测唾液外泌体蛋白中是否存在上述唾液外泌体蛋白生物标记物，将上述唾液外泌体蛋白生物标记物中的任意一种或一种以上以组合作为AD检测标记物，用于临床诊断，可极大提高诊断特异性和准确性。本发明中唾液外泌体蛋白提取方法简单，与影像学及量表检测相比创伤性小、安全性高，对患者无毒副作用，人为主观性降低，更为准确，而且具有定量检测的效果。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.唾液外泌体蛋白作为阿尔兹海默症生物标记物在制备阿尔兹海默症检测试剂中的应用，所述唾液外泌体蛋白为角蛋白，所述角蛋白为II型角蛋白和I型角蛋白中的一种或两种，所述II型角蛋白为Keratin4、Keratin6A、Keratin78、Keratin76、Keratin5中的一种或多种，所述I型角蛋白为Keratin19、Keratin17、Keratin13、Keratin16、Keratin14、Keratin9、Keratin10中的一种或多种。
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