CN103228799A - 用于检测神经变性疾病或病症的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了鉴定、诊断和预后神经变性疾病或病症的方法。还提供了用于确定神经元是否处于神经变性风险中或者正在发生神经变性的方法。所述方法包括确定基因tbx6和dleu2中的至少一个是否过量表达。

Description

用于检测神经变性疾病或病症的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年11月29日提交的临时美国申请号61/417,701的优先权权益，其特此通过引用整体并入。
技术领域
提供了鉴定、诊断、监测和预后神经变性疾病或病症(例如，阿尔茨海默病)的方法。
背景技术
本发明涉及用于诊断和治疗诸如阿尔茨海默病等神经变性疾病或病症的方法和组合物。
阿尔茨海默病(AD)是一种导致认知功能损失和痴呆的神经变性疾病。Ray等人，Nat.Med.13：1359-1362(2007)。AD的物理标志是，由神经原纤维缠结(NFT)和老年斑构成的病变在脑中的存在，所述老年斑通过异常的tau丝和β-淀粉样蛋白(Aβ)纤丝的积累而形成。Shaw等人，Nat.Rev.6：295-303(2007)。主要造成斑块聚集的蛋白质包括淀粉样蛋白前体蛋白(APP)和两种早老蛋白(早老蛋白I和早老蛋白II)。酶β和γ分泌酶对淀粉样蛋白前体蛋白(APP)(它们在大多数细胞中组成性地表达和分解代谢)的连续裂解导致39至43个氨基酸的Aβ肽的释放。APP的降解可能会增加它们在斑块中聚集的倾向。由于在其C端的两个极疏水的氨基酸残基，Aβ(1-42)片段尤其具有构建聚集体的高倾向。因此认为Aβ(1-42)片段主要参与并造成AD中神经炎斑块形成的起始，并因此具有高病理学潜力。科学证据表明，Aβ蛋白在斑块中的产生和累积的增加导致神经细胞死亡，这促进AD的发生和进程。
AD的症状出现缓慢，第一个症状可能仅仅是轻度健忘。在该阶段，个体可能忘记新近的事件、活动、熟悉的人或东西的名称，并且不能解决简单的数学问题。随着疾病进展，症状可更容易地被注意到，并且变得足够严重从而导致患有AD的人们或他们的家人寻求医学帮助。AD的中期症状包括忘记如何做诸如整理清洁等简单任务，以及说话、理解、阅读或书写的问题逐渐显现。后期的AD患者可能变得焦虑或具攻击性，可能从家里走失并最终需要全面护理。
目前，唯一的明确诊断AD的方法是，在个体死后的尸体剖检中鉴定脑组织中的斑块和缠结。因此，当人仍活着的时候，医生只能作出“可能”或“很可能”患有AD的诊断。应用目前的方法，医师利用数种诊断“可能”AD的工具可以诊断AD。医师询问人的一般健康、过去的医疗问题和此人完成日常活动的任何困难的历史。记忆、问题求解、注意力、计算和语言的行为测试提供关于认知退化的信息，医学试验诸如血液、尿或脊髓液的试验和脑部扫描可以提供一些其它信息。
据信，在患者已经被诊断出AD的时间之前，该疾病已经进展了数年。实际上，理解诸如AD等神经变性疾病的起始和进展、以及阐明神经元变性的基础性或易感性机理，将会辅助生物标志的鉴定，以帮助预测神经变性疾病和病症的发生、进展和诊断。因而，仍然需要这样的生物标志：其准确地诊断神经变性疾病和病症、以及监测疾病的进展和检测处于发生神经变性疾病和病症的风险中的那些人。
在本文中引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，都通过引用整体并入。
发明内容
本发明提供用于鉴定、诊断、监测和预后神经变性疾病和/或病症的方法，所述方法至少部分地基于基因的鉴定，所述基因的表达与神经变性和神经变性疾病或病症(诸如阿尔茨海默病(AD))的存在和/或程度有关。
在一个方面，本发明提供了一种用于诊断受试者的神经变性疾病的方法，所述方法包括：确定所述受试者是否包含这样的细胞，所述细胞以大于相应基因在参照样品中的表达水平表达基因tbx6和dleu2中的至少一个，其中所述细胞的存在指示所述受试者患有所述的神经变性疾病。
在一个方面，本发明提供了一种用于监测接受神经变性疾病治疗的受试者的疾病的方法，所述方法包括：确定所述受试者是否包含这样的细胞，所述细胞以大于相应基因在参照样品中的表达水平表达基因tbx6和dleu2中的至少一个，其中所述细胞的存在指示所述受试者需要对所述神经变性疾病的继续治疗。
在一个方面，本发明提供了一种用于评估受试者的发生神经变性疾病的素质的方法，所述方法包括：确定所述受试者是否包含这样的细胞，所述细胞以大于相应基因在参照样品中的表达水平表达基因tbx6和dleu2中的至少一个，其中所述细胞的存在指示受试者的发生神经变性疾病的素质。
在一个方面，本发明提供了一种确定神经元是否处于神经元变性风险中和/或确定神经元是否正在发生神经元变性的方法，所述方法包括：确定所述神经元是否以大于相应基因在没有发生神经元变性的神经元中的表达水平表达基因tbx6和dleu2中的至少一个，其中基因tbx6和dleu2中的至少一个的表达增加指示所述神经元处于神经元变性风险中和/或正在发生神经元变性。
本领域技术人员会明白，在本发明的任意方法中，尽管基因表达增加的检出会确定地指示神经变性疾病的特征(例如存在、阶段或程度)，基因表达增加的未检出也会通过提供疾病的相反表征而提供信息。
在本发明的一个方面，所述神经变性疾病或病症是阿尔茨海默病(AD)、雷维小体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆复征；以及基于淀粉样蛋白或与淀粉样蛋白相关的其它疾病，诸如进行性核上性麻痹、多发性硬化、克-雅病、帕金森病、HIV相关的痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化)、成年型糖尿病、老年心脏淀粉样变性、内分泌肿瘤、青光眼、亚历山大病、阿尔珀斯病、共济失调毛细血管扩张症、巴腾病(也被称作Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、牛海绵状脑病(BSE)、卡纳范病、科凯恩综合征、皮质基底节变性、亨廷顿病、肯尼迪病、克拉伯病、神经系统亚速尔病(脊髓小脑性共济失调3型)、多系统萎缩、神经疏螺旋体病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、皮克病、原发性侧索硬化、朊病毒病、雷夫叙姆病、桑德霍夫病、希尔德病、继发于恶性贫血的脊髓亚急性联合变性、精神分裂症、脊髓小脑性共济失调(具有不同特征的多种类型)、脊髓性肌萎缩、斯-理-奥病、脊髓痨、进行性神经性腓肠肌萎缩症、地中海热、默-韦综合征、自发性骨髓瘤、淀粉样多神经病、淀粉样心肌病、系统性老年淀粉样变性、淀粉样多神经病、遗传性脑出血伴淀粉样变性、唐氏综合征、格-施-沙综合征、甲状腺髓样癌、孤立性心房淀粉样变性、透析患者中的β2-微球蛋白淀粉样变性、包涵体肌炎、肌肉萎缩疾病中的β2-淀粉样蛋白沉积、胰岛II型糖尿病胰岛素瘤和其它淀粉样变性相关的疾病。
在一个方面，本发明提供了一种方法，其中确定所述受试者是否包含这样的细胞，所述细胞以大于相应基因在参照样品中的表达水平表达基因tbx6和dleu2中的至少一个，所述方法包括：确定基因tbx6和dleu2中的至少一个的RNA和/或蛋白表达水平。在本发明的某些实施例中，基于蛋白表达或RNA表达水平来确定tbx6表达，并基于RNA表达水平来确定dleu2表达。在本发明的其它实施例中，确定tbx6和dleu2两者的表达水平。
在一个方面，本发明提供了一种方法，其中确定所述受试者是否包含这样的细胞，所述细胞以大于相应基因在参照样品中的表达水平表达基因tbx6和dleu2中的至少一个，所述方法还包括：从所述受试者获得生物样品。在本发明的某些实施例中，所述生物样品选自：血液(包括全血、血浆或血清)、尿、脑脊液、脑组织(例如，活组织检查)、眼泪和唾液。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，其中确定所述受试者是否包含这样的细胞，所述细胞以大于相应基因在参照样品中的表达水平表达基因tbx6和dleu2中的至少一个，所述方法在体内进行，且不需要从所述受试者获得生物样品。例如，所述方法可以包括：给所述受试者施用可检测量或有效量的标记的探针，和检测基因tbx6和dleu2中的至少一个的表达。
在本发明的方法中，用于确定所述受试者是否包含以大于相应基因在参照样品中的表达水平表达基因tbx6和dleu2中的至少一个的细胞的步骤可以以多种体外测定形式进行，包括、但不限于，检测RNA表达的测定或免疫组织化学测定。在本发明的某些实施例中，使用PCR方法、微阵列芯片或免疫测定法(例如ELISA)或所述方法的组合，确定基因tbx6和dleu2中的至少一个的表达。
在本发明的方法中，用于在不获得生物样品的情况下在体内确定所述受试者是否包含以大于相应基因在参照样品中的表达水平表达基因tbx6和dleu2中的至少一个的细胞的步骤，可以使用多种成像方法来确定，所述方法包括、但不限于γ成像、磁共振成像(MRI)、磁共振分光术、荧光分光术、正电子发射体层摄影术(PET)、单光子发射体层摄影术(SPECT)、x-射线计算机体层摄影术(CT)、荧光介导的分子体层摄影术(FMT)、荧光反射成像(FRI)、生物发光成像(BLI)。
在本发明的方法中，用于确定所述受试者是否包含以大于相应基因在参照样品中的表达水平表达基因tbx6和dleu2中的至少一个的细胞的步骤，可以使用标记的探针来确定。用于本发明的方法中的探针包括，但不限于：多核苷酸、抗体或其组合。在本发明的某些方面，所述多核苷酸探针是反义多核苷酸和/或肽核酸(PNA)探针。用于本发明的方法中的抗体探针包括，但不限于：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fv片段、Fab片段、Fab’片段和F(ab’)2片段。
在本发明的方法的其它方面，用于本发明的方法中的探针与脑靶向肽缀合。在某些方面，所述脑靶向肽允许经由载体介导的转运或受体介导的胞吞转运而穿过血脑屏障(BBB)转运。这样的脑靶向肽的例子包括、但不限于：胰岛素、转铁蛋白或受体特异性的肽模拟物抗体，它们结合在血脑屏障(BBB)上的转运受体，诸如胰岛素受体、转铁蛋白受体、瘦蛋白受体、GLUT1葡萄糖转运蛋白、MCT1乳酸盐转运蛋白、LAT1大中性氨基酸转运蛋白和CNT2腺苷转运蛋白。
用于本发明的方法中的探针可以包含标记，例如，本文所述的放射性核素、放射性同位素或同位素和荧光染料。所述标记可以与探针整合、连接或缀合。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，其包括：用于检测基因tbx6和dleu2中的至少一个的表达的标记的探针，和关于使用所述探针来确定受试者是否包含表达基因tbx6和dleu2中的至少一个的细胞且所述表达的水平大于相应基因在正常参照样品中的表达水平的说明书。在某些实施方案中，所述试剂盒是用于诊断、监测、和/或评估受试者的发生神经变性疾病和/或障碍的素质。在其它实施方案中，所述试剂盒是用于确定神经元是否处于神经变性的风险中和/或正在发生神经变性。
在其它实施方案中，所述试剂盒包括标记的探针，所述探针选自多核苷酸、抗体或其组合。在某些方面，所述抗体探针选自：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fv片段、Fab片段、Fab’片段和F(ab’)2片段。在其它方面，所述探针是反义多核苷酸或肽核酸(PNA)。在其它方面，所述探针被本文所述的脑靶向肽标记和/或与其缀合。
附图说明
图1是如在实施例1中所述进行的实验的示意图，所述实验使用Campenot室，其中将神经元的体(细胞体)环境和轴突环境分离。
图2的图显示了如在实施例1中所述的实验的结果。具体地，在有或没有抑制剂存在下，在Campenot室中培养神经元，其中细胞体部分含有NGF，并且在有或没有抑制剂存在下，使轴突部分遭受NGF撤除。使用下述抑制剂：表皮生长因子受体激酶抑制剂AG555(ErbBAG555)；p38MAP激酶抑制剂SB239(p38MAPKSB239)；转录抑制剂放线菌素D(转录ActD)；和GSK3抑制剂SB415(GSK3SB415)。如图2所示，放线菌素D和SB415当应用于神经元的细胞体部分时都阻止轴突变性(细胞体抑制)，但是当直接应用于轴突时不提供相同的保护作用(轴突抑制)。另外，AG555和SB239当直接应用于轴突时阻止轴突降解，但是当直接应用于细胞体时不提供相同的保护作用。
图3显示了在选择性地发生轴突损失的神经元上的时程微阵列实验的结果。上图是如实施例2所述的实验的示意图。dleu2和tbx6都在12小时在发生轴突变性的神经元中被增量调节。在有GSK3抑制剂GSK3.ARA存在下培养的神经元中，没有观察到dleu2和tbx6的表达的增加。
图4描绘了如在实施例3中所述的dleu2和tbx6敲降(knockdown)实验的结果。神经元中的两种基因的敲降都导致在NGF撤除以后减轻的轴突变性。
图5描绘了在实施例3中所述的dleu2和tbx6敲降实验的结果。神经元中的两种基因的敲降都导致在有组成活性的GSK3突变体GSK3S9A存在下减轻的轴突变性。
图6的图是，与正常的人患者相比，得自已经诊断为患有阿尔茨海默病(AD)的人受试者的脑的海马部分中的tbx6和dleu2表达。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology2nd ed.，J.Wiley & Sons(New York，N.Y.1994)，和March，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure第4版，John Wiley & Sons(New York，N.Y.1992)为本领域技术人员提供了在本申请中使用的许多术语的一般指导。
发明人已经发现了可用于诊断神经变性疾病或病症、预后神经变性疾病或病症和监测受试者中的神经变性疾病或病症(例如，跟踪AD患者的疾病进展，其可用于跟踪医学治疗在AD患者中的作用)的生化标志。另外，所述生化标志可用于鉴定处于发生神经变性风险中的神经元。用于本发明的方法中的生物标志存在于患者生物样品中，例如，血液、脑脊液和/或脑组织。
某些定义
本文可互换使用的术语“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物、或可以由DNA或RNA聚合酶掺入聚合物内的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物装配前和后赋予。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以，例如通过与标记组分缀合，在聚合后进一步修饰。其它类型的修饰包括，例如“帽”、一个或多个天然存在的核苷酸由类似物置换、核苷酸间修饰，例如具有不带电荷的连接(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物(phosphoamidates)、氨基甲酸酯等)和带电荷的连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有悬垂部分(pendant moieties)例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)、含有烷化剂、具有修饰的连接(例如α异头核酸等)、以及未修饰形式的多核苷酸(一种或多种)。此外，通常存在于糖中的任何羟基可以例如替换为膦酸酯基团、磷酸酯基团，由标准保护基团保护，或活化以制备与另外核苷酸的另外连接，或可以与固体载体缀合。5′和3′末端OH可以是磷酸化的，或由胺或1-20个碳原子的有机加帽基团部分取代。其它羟基也可以衍生化为标准保护基团。多核苷酸还可以含有本领域一般已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括例如2′-O-甲基-2′-O-烯丙基，2′-氟-或2′-叠氮基-核糖，碳环糖类似物，α-异头糖，差向异构糖例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，无环类似物，和无碱基核苷类似物例如甲基核苷。一个或多个磷酸二酯连接可以由替代性连接基团替换。这些替代性连接基团包括、但不限于：其中磷酸被P(O)S(“硫代酯(thioate)”)、P(S)S(“二硫代酯(dithioate)”)、“(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“formacetal”)替换的实施方案，其中每个R或R′独立地是H或被取代的或未被取代的烷基(1-20C)，所述烷基任选含有醚(--O--)连接、芳基、链烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。多核苷酸中的所有连接无需是相同的。先前描述适用于在此提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
本文使用的“寡核苷酸”指单链合成多核苷酸，其长度通常、但是不一定小于约250个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是相互排斥的。关于多核苷酸的上文描述同等地和完全地适用于寡核苷酸。
术语“引物”通常是短的单链多核苷酸，其能够与核酸杂交，并且一般通过提供游离3’-OH基团而允许互补核酸聚合。
术语“阵列”或“微阵列”指可杂交阵列元件、优选多核苷酸探针(例如寡核苷酸)在基质上的有序排列。所述基质可以是固体基质例如玻璃载玻片或半固体基质例如硝酸纤维素膜。
术语“扩增”指产生参考核酸序列或其补体的一个或多个拷贝的过程。扩增可以是线性或指数的(例如PCR)。“拷贝”不一定是指相对于模板序列的完全序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包括核苷酸类似物例如脱氧肌苷、有意的序列改变(例如通过引物引入的序列改变，所述引物包括与模板可杂交但并非完全互补的序列)、和/或在扩增过程中出现的序列错误。
术语“检测”包括任何方式的检测，包括直接和间接检测。
“升高的表达”或“升高的水平”指，相对于对照(例如未患有神经变性疾病的一个或多个个体)和/或预定的阈值水平，在患者中增加的mRNA或蛋白质表达。
如果基因或生物标志在受试者或第一样品(例如得自受试者的生物样品)中的表达水平/量是基因或生物标志在第二样品(例如对照样品或参照样品)中的表达水平/量的至少约1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍，那么基因或生物标志在受试者中或在第一样品中的表达/量的水平“大于”在第二样品中的水平。
杂交反应的“严谨性”可容易地由本领域普通技术人员确定，并且一般是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。一般而言，更长的探针需要更高的温度用于恰当的退火，而更短的探针需要更低的温度。当互补链存在于低于其解链温度的环境中时，杂交一般取决于变性DNA再退火的能力。在探针和可杂交序列之间的所需同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。由此，较高的相对温度将趋于使得反应条件更严谨，而较低的温度趋于使得反应条件较不严谨。关于杂交反应的严谨性的另外细节和说明，参见Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience Pubhshers，(1995)。
本文定义的“严谨条件”或“高严谨条件”可以通过下述进行定义：(1)采用低离子强度和高温用于洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠在50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂，例如甲酰胺，例如，50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％菲可(Ficoll)/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液在pH6.5与750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠在42℃；或(3)在采用50％甲酰胺、5x SSC(0.75M NaC1、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt溶液、超声处理过的鲑鱼精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖的溶液中在42℃杂交过夜，在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中在42℃洗涤10分钟，随后用含有EDTA的0.1x SSC在55℃高严谨洗涤10分钟。
可以如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，NewYork：Cold Spring Harbor Press，1989所述鉴定“中等严谨条件”，并且包括使用比上述那些严谨性更低的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严谨条件的一个例子是，在包含下述物质的溶液中在37℃温育过夜：20％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性的剪切的鲑鱼精DNA，随后在约37-50℃在1xSSC中洗涤滤膜。技术人员明了如何根据需要调节温度、离子强度等，以适应例如探针长度等因素。
本文使用的术语“生物标志”或“生化标志”一般是指这样的分子，包括基因、蛋白、碳水化合物结构或糖脂：其在哺乳动物组织或细胞中或上的表达可以通过标准方法(或本文公开的方法)检测出，且可预测、诊断和/或预后哺乳动物细胞或组织对神经变性的敏感性。另外，本文使用的“生物标志”是指例如患者的病理学状态的指示物：其可以在受试者中或在得自受试者的生物样品中在体外或在体内检测出。
术语“神经变性疾病”和“神经变性病症”以最广泛的含义使用，以包括其病理学涉及神经元变性和/或功能障碍的所有疾病，包括、但不限于，周围神经病，运动神经元障碍，诸如肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis，ALS，Lou Gehrig病)、贝尔麻痹(Bell′s palsy)和涉及脊髓性肌萎缩或麻痹的各种病症；和其它人神经变性疾病，诸如阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)、雷维小体痴呆(Lewy body dementia)、唐氏综合征(Down′s syndrome)、遗传性脑出血伴淀粉样变性(荷兰型)(hereditarycerebral hemorrhage with amyloidosis(Dutch type))；关岛帕金森-痴呆复征(Guam Parkinson-Dementia complex)、进行性核上性麻痹(progressivesupranuclear palsy)、多发性硬化(multiple sclerosis)、癫痫(epilepsy)、克-雅病(Creutzfeld Jacob disease)、神经性耳聋(nerve deafness)、梅尼埃病(Meniere′s disease)、帕金森病(Parkinson′s disease)、HIV相关的痴呆(HIV-related dementia)、成年型糖尿病(Adult Onset Diabetes)、老年心脏淀粉样变性(senile cardiac amyloidosis)、内分泌肿瘤(endocrine tumors)、青光眼(glaucoma)、亚历山大病(Alexander disease)、阿尔珀斯病(Alper′s disease)、共济失调毛细血管扩张症(Ataxia telangiectasia)、巴腾病(Batten disease)(也被称作Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病(Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Battendisease))、牛海绵状脑病(Bovine spongiform encephalopathy，BSE)、卡纳范病(Canavan disease)、科凯恩综合征(Cockayne syndrome)、皮质基底节变性(Corticobasal degeneration)、亨廷顿病(Huntington disease)、肯尼迪病(Kennedy′s disease)、克拉伯病(Krabbe disease)、神经系统亚速尔病(Machado-Joseph disease)(脊髓小脑性共济失调3型(Spinocerebellar ataxiatype3))、多系统萎缩(Multiple System Atrophy)、神经疏螺旋体病(Neuroborreliosis)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher Disease)、皮克病(Pick′s disease)、原发性侧索硬化(Primary lateral sclerosis)、朊病毒病(Prion diseases)、雷夫叙姆病(Refsum′s disease)、桑德霍夫病(Sandhoffdisease)、希尔德病(Schilder′s disease)、继发于恶性贫血的脊髓亚急性联合变性(Sub-Acute Combined Degeneration of the Cord Secondary to PerniciousAnaemia)、精神分裂症(Schizophrenia)、脊髓小脑性共济失调(Spinocerebellar ataxia)(具有不同特征的多种类型)、脊髓性肌萎缩(Spinalmuscular atrophy)、斯-理-奥病(Steele-Richardson-Olszewski disease)、脊髓痨(Tabes dorsalis)、进行性神经性腓肠肌萎缩症(Charcot-Marie-Toothdisease)、地中海热(Mediterranean fever)、默-韦综合征(Muckle-Wellssyndrome)、自发性骨髓瘤(idiopathic myeloma)、淀粉样多神经病(amyloidpolyneuropathy)、淀粉样心肌病(amyloid cardiomyopathy)、系统性老年淀粉样变性(systemic senile amyloidosis)、淀粉样多神经病(amyloidpolyneuropathy)、遗传性脑出血伴淀粉样变性(hereditary cerebralhemorrhage with amyloidosis)、格-施-沙综合征(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome)、甲状腺髓样癌(medullarycarcinoma of the thyroid)、孤立性心房淀粉样变性(isolated atrial amyloid)、透析患者中的β2-微球蛋白淀粉样变性(β2-microglobulin amyloid in dialysispatients)、包涵体肌炎(inclusion body myositis)、肌肉萎缩疾病中的β2-淀粉样蛋白沉积(β2-amyloid deposits in muscle wasting disease)、胰岛II型糖尿病胰岛素瘤(Islets of Langerhans diabetes Type II insulinoma)和其它淀粉样变性相关的疾病。
“周围神经病”是影响周围神经的神经变性疾病，最常表现为运动、感觉、感觉运动、或自主功能障碍中的一种或组合。周围神经病可以是例如遗传获得性的，可以源自全身性疾病，或者可以由毒剂(诸如神经毒性药物，例如抗肿瘤剂)或者工业或环境污染物导致。“周围感觉神经病”的特征为周围感觉神经元的变性，这可以是自发性的，可以作为例如下述各项的后果而发生：糖尿病(糖尿病性神经病)、癌症的细胞抑制药疗法(例如使用化疗剂的治疗，所述化疗剂诸如长春新碱、顺铂、甲氨蝶呤、3′-叠氮基-3′-脱氧胸苷或紫杉烷例如紫杉醇[
Figure BDA00003259813000121
Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，N.J.]和多西紫杉醇
Figure BDA00003259813000122
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Rorer，Antony，法国])、酒精中毒、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)或遗传素质。遗传获得性周围神经病包括例如：雷夫叙姆病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良(Metachromatic leukodystrophy)、法布里病(Fabry′s disease)、德热里纳-索塔斯综合征(Dejerine-Sottas syndrome)、无β脂蛋白血症(Abetalipoproteinemia)和进行性神经性腓肠肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth，CMT)(也被称作Proneal肌萎缩(Proneal Muscular Atrophy)或遗传性运动感觉神经病(Hereditary Motor Sensory Neuropathy，HMSN))。大多数类型的周围神经病在数月或数年的病程中缓慢发生。在临床实践中，此类神经病被称作慢性的。有时，周围神经病在数天的病程中快速发生，并且被称作急性的。周围神经病常常一起影响感觉和运动神经，从而引起混合型感觉和运动神经病，但是也已知纯感觉的和纯运动的神经病。
术语“诊断”在本文中用于指分子或病理学状态、疾病或病症的鉴定或分类，例如，诸如AD等神经变性疾病的鉴定。
术语“预后”在本文中用于指，预测可归因于神经变性疾病的疾病症状的可能性。术语“预测”在本文中用于指，患者将有利地或不利地对药物或药物组做出应答的可能性。在一个实施方案中，预测涉及那些应答的程度。在一个实施方案中，预测涉及：患者是否和/或可能将在治疗(例如用特定治疗剂治疗)后存活或改善，和持续无疾病复发特定的时间段。本发明的预测方法可以在临床上用于通过选择对于任何特定患者而言最合适的治疗模式而作出治疗决定。在预测患者是否可能有利地对治疗方案做出应答或者患者是否可能在治疗方案后长期存活时，本发明的预测方法是一个有价值工具，所述治疗方案例如给定的治疗方案，包括例如施用给定的治疗剂或组合、外科手术介入、类固醇治疗等。
本文使用的“治疗”指，试图改变被治疗的个体或细胞的天然过程的临床干预，并且可以在临床病理学过程之前或期间执行。治疗的期望效果包括：阻止疾病症状的出现或复发，减少疾病的任何直接或间接病理学后果，降低疾病进展速率，改善或缓和疾病状态，以及实现减轻或改善的预后。在某些实施方案中，本发明的方法在延迟疾病或病症的发生的尝试中是有用的。
“有效量”指，以所需剂量和持续时间有效地达到期望的治疗、诊断或预防结果的量。
“个体”、“受试者”或“患者”是脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括、但不限于：灵长类动物(包括人和非人灵长类动物)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，哺乳动物是人。
“对照受试者”是指这样的健康受试者：其尚未被诊断为患有神经变性疾病(例如，AD)，并且其没有罹患与神经变性疾病(例如，AD)有关的任何体征或症状。对照受试者还可以包括不具有神经变性疾病(例如，AD)家族史的健康受试者。
本文使用的术语“样品”指得自或源自目标受试者的组合物，其含有待表征和/或鉴定(例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征)的细胞实体和/或其它分子实体。例如，短语“疾病样品”及其变体指得自目标受试者的任何样品，其被预期含有或已知含有待表征的细胞实体和/或分子实体。
“组织”或“细胞样品”是指得自受试者或患者的组织的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，如来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品、或活组织检查或抽吸物；血液或任何血液组成成分；体液例如脑脊液、羊水、腹膜液或间隙液；来自受试者的妊娠或发育中的任何时间的细胞。组织样品还可以是原代的或培养的细胞或细胞系(例如，神经元)。任选地，组织或细胞样品得自疾病组织/器官。组织样品可以含有在自然界中不与所述组织天然地混合的化合物，例如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等。
本文使用的“参照样品”、“参照细胞”、“参照组织”、“对照样品”、“对照细胞”或“对照组织”是指，得自己知或被认为未患有待用本发明的方法鉴定的疾病或病症的来源的样品、细胞或组织。参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织可以得自待使用本发明的组合物或方法鉴定疾病或病症的相同受试者或患者的身体的健康部分。参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织可以可替换地得自如下个体的身体的健康部分：所述个体并非待用本发明的组合物或方法鉴定疾病或病症的受试者或患者。还可以将得自“参照样品”、“参照细胞”、“参照组织”、“对照样品”、“对照细胞”或“对照组织”的基因表达水平预定为从没有罹患神经变性疾病或病症的群体得到的水平的平均值，但是在某些情况下，所述参照水平可以是得自个体组的平均值或中值水平，所述个体组包括患有神经变性疾病或病症的患者。
为了本文的目的，组织样品的“切片”是指组织样品的单个部分或小片，例如由组织样品切出的组织或细胞的薄片。应当理解，可以取组织样品的多个切片，并对其实施根据本发明的分析，前提条件是，应当理解，本发明包括这样的方法：其中对相同的组织样品切片在形态学和分子水平上进行分析，或关于蛋白质和核酸两者进行分析。
“关联”或“联系”是指，以任何方式将第一分析或方案的性能和/或结果与第二分析或方案的性能和/或结果进行对比。例如，可以将第一分析或方案的结果用于执行第二方案，和/或可以使用第一分析或方案的结果来确定是否应执行第二分析或方案。就基因表达分析或方案的实施方案而言，可以使用基因表达分析或方案的结果来确定是否应执行特定的治疗方案。
当根据本发明使用时，术语对特定治疗剂或治疗选项“增加的抗性”是指对标准剂量的药物或标准治疗方案减少的应答。
当根据本发明使用时，术语对特定治疗剂或治疗选项“减少的敏感性”是指对标准剂量的药物或标准治疗方案减少的应答，其中减少的应答可以通过增加治疗剂的剂量或治疗的强度而(至少部分地)补偿。
可以使用指示对患者的益处的任何终点来评估“患者应答”或“应答”，所述益处包括、但不限于：(1)疾病进展在一定程度上的抑制，包括减慢和完全停止；(2)疾病发作次数和/或症状的减少；(3)损伤尺寸的缩小；(4)对疾病细胞浸润到邻近周围器官和/或组织内的抑制(即减少、减慢或完全停止)；(5)疾病传播的抑制(即减少、减慢或完全停止)；(6)自身免疫应答的降低，这可以但不一定导致疾病病变的消退或消除；(7)与病症相关的一种或多种症状在一定程度上的缓解；(8)在治疗后无疾病表现的时间增加；和/或(9)在治疗后在给定时间点上降低的死亡率。
术语“基因签名(gene signature)”与“基因表达签名(gene expressionsignature)”可互换使用，并且指其表达指示神经变性疾病(例如AD)的基因之一或其组合，所述神经变性疾病的特征在于特定的分子、病理学、组织学和/或临床特征。在某些实施方案中，构成基因签名的一种或多种基因的表达与对照受试者中的表达相比升高。
术语“蛋白签名(protein signature)”与“蛋白表达签名(protein expressionsignature)”可互换使用，并且指其表达指示神经变性疾病(例如AD)的蛋白之一或其组合，所述神经变性疾病的特征在于特定的分子、病理学、组织学和/或临床特征。在某些实施方案中，构成蛋白签名的一种或多种蛋白的表达与对照受试者中的表达相比升高。
“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)指具有相似结构特征的糖蛋白。抗体显示出与特定抗原的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和一般缺乏抗原特异性的其它抗体样分子。后一类多肽可以例如由淋巴系统以低水平以及由骨髓瘤以增加的水平产生。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用，具有最广泛含义，包括单克隆抗体(例如全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要它们显示出所需生物学活性即可)，并且还可以包括一些抗体片段(如本文更详细地描述的)。抗体可以是嵌合、人、人源化和/或亲和力成熟的。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体，而不是如下定义的抗体片段。该术语特别指具有含Fc区的重链的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生各自具有单个抗原结合位点的2个等同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残留“Fc”片段(其名称反映其容易结晶的能力)。胃蛋白酶处理获得F(ab’)2片段，其具有2个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原结合位点最低限度抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类为紧密非共价结合的一个重可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体。共同地，Fv的6个CDR对抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含对于抗原特异的3个CDR的Fv的一半)，也具有识别且结合抗原的能力，尽管以低于完整结合位点的亲和力。
Fab片段含有重和轻链可变结构域，并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同在于在重链CH1结构域的羧基末端上少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文用于如下Fab’的名称，在该Fab’中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基具有游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初作为成对Fab’片段产生，在该对片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
本文使用的术语“单克隆抗体”指得自基本上同质的抗体群体的抗体，即，除了可能以微量存在的可能突变例如天然突变外，该群体包含的个体抗体是相同的。因此，修饰词“单克隆”指抗体不是不同抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，单克隆抗体一般包括包含结合靶的多肽序列的抗体，其中靶结合多肽序列通过如下过程获得：所述过程包括从多个多肽序列中选择单个靶结合多肽序列。例如，选择过程可以是从多个克隆(例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的库)中选择独特克隆。应当理解，所选的靶结合序列可以进一步改变，例如以改善对于靶的亲和力，人源化靶结合序列，改善其在细胞培养物中的生产，减少其在体内的免疫原性，制备多特异性抗体等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比，单克隆抗体制剂中的每个单克隆抗体都针对抗原上的单一决定簇。除其特异性外，单克隆抗体制剂也是有利的，因为它们一般不受其它免疫球蛋白污染。
修饰词“单克隆”指抗体得自基本上同质的抗体群体的特征，不应解释为需要通过任何特定方法生产该抗体。例如，待根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括例如杂交瘤法(例如，Kohler等人，Nature，256：495(1975)；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling等人.，见：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681(Elsevier，N.Y.，1981))、重组DNA法(参见例如，美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见，例如，Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods284(1-2)：119-132(2004)、和用于在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中产生人或人样抗体的技术(参见，例如，WO98/24893；WO96/34096；WO96/33735；WO91/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature362：255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.7：33(1993)；美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016；Marks等人，Bio.Technology10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature368：856-859(1994)；Morrison，Nature368：812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.14：826(1996)和Lonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。
单克隆抗体在本文中特别包括“嵌合”抗体，其中重和/或轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列等同或同源，而该链(一条或多条)的其余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列等同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们显示出所需生物学活性即可(美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6855-9855(1984))。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最低限度序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区的残基由具有所需特异性、亲和力和/或能力的来自非人物种(供体抗体)的高变区的残基替换，所述非人物种例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。在某些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基由相应非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中不存在的残基。可以做出这些修饰以进一步精化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个和一般2个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有高变环都对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的。人源化抗体任选地还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般是人免疫球蛋白的恒定区。关于其它细节，参见Jones等人，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还参见下述综述文章和其中引用的参考文献：Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions23：1035-1038(1995)；Hurle和Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)。
“人抗体”是包含对应于人产生的抗体的氨基酸序列的抗体，和/或已使用如本文公开的用于制备人抗体的任何技术制备的抗体。此类技术包括筛选源自人的组合文库，例如噬菌体展示文库(参见，例如，Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)和Hoogenboom等人，Nucl.AcidsRes.，19：4133-4137(1991))；使用人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系产生人单克隆抗体(参见，例如，Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第55-93页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boerner等人，J.Immunol.，147：86(1991))；和在转基因动物(例如，小鼠)中生成单克隆抗体，所述转基因动物能够在不存在内源免疫球蛋白产生的情况下产生完全的人抗体库(参见，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255(1993)；Bruggermann等人，Year inImmunol.，7：33(1993))。人抗体的这个定义特别地排除包含来自非人动物的抗原结合残基的人源化抗体。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，与不具有这些改变的亲本抗体比较，所述改变导致所述抗体对于抗原的亲和力的改善。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体对于靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的操作产生。Marks等人.Bio/Technology10：779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。下述文献描述了HVR和/或框架残基的随机诱变：Barbas等人.Proc Nat.Acad.Sci.USA91：3809-3813(1994)；Schier等人.Gene169：147-155(1995)；Yelton等人.J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；和Hawkins等人，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
抗体“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性，并且随着抗体同种型而改变。抗体效应子功能的例子包括、但不限于：C1q结合和补体依赖性的细胞毒性(CDC)；Fc-受体结合；抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的减量调节；和B细胞激活。
“Fc受体”或“FcR”描述了结合抗体的Fc区的受体。在某些实施方案中，FcR是天然人FcR。在某些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有主要在其细胞质结构域中存在不同的相似氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见，例如，Daёron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。例如，在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods4：25-34(1994)；和de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中综述了FcR。本文的术语“FcR”涵盖其它FcR，包括未来鉴定的那些。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体FcRn，其负责母源IgG至胎儿的转移(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))和免疫球蛋白的体内稳态的调节。测量与FcRn的结合的方法是已知的(参见，例如，Ghetie和Ward.，Immunol.Today18(12)：592-598(1997)；Ghetie等人，Nature Biotechnology，15(7)：637-640(1997)；Hinton等人，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216(2004)；WO2004/92219(Hinton等人.)。
可以测定人FeRn高亲和力结合多肽在体内与人FcRn的结合及其血清半衰期，例如在表达人FeRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中或在施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中。WO2000/42072(Presta)描述了对于FcR具有改善或减少的结合的抗体变体。还参见例如，Shields等人.J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
术语“含Fc区的抗体”指包含Fc区的抗体。Fc区的C-端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可以被除去，例如在纯化多肽的过程中或者通过编码所述抗体的核酸的重组改造。因此，根据本发明包含具有Fc区的抗体的组合物可以包含具有K447的抗体、除去了所有K447的抗体、或具有与没有K447残基的抗体的混合物。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR且执行效应子功能的白细胞。在某些实施方案中，所述细胞至少表达FcγRIII且执行一种或多种ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以分离自天然来源例如血液。
“结合亲和力”一般指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，本文使用的“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对于其配偶体Y的亲和力一般可以通过解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常见方法进行测量，包括本文描述的那些。低亲和力抗体一般缓慢结合抗原且倾向于容易解离，而高亲和力抗体一般更快速结合抗原且趋于保持结合更长时间。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的。
当在本文中使用时，单词“标记”指可检测化合物或组合物。标记一般与试剂例如核酸探针或抗体直接或间接缀合或融合，并且促进与之缀合或融合的试剂的检测。标记可以自身是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶促标记的情况下，可以催化底物化合物或组合物发生化学改变，导致可检测的产物。
“分离的”生物分子例如核酸、多肽或抗体是已鉴定且与其天然环境中的至少一种组分分离和/或回收的生物分子。
在本文中提及“约”值或参数包括(且描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，述及“约X”的描述包括“X”的描述。
术语“药物制剂”指无菌的制剂，其形式允许药物的生物学活性是有效的，并且不含有对于制剂将施用于的受试者而言具有无法接受的毒性的额外组分。
“无菌”制剂是无菌的或不含所有活微生物及其孢子。
“包装说明书”用于指通常包括在治疗或诊断产品或药物的商业包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌、要与包装产品组合的其它治疗或诊断产品、和/或与此治疗或诊断产品或药物的使用相关的注意事项等信息。
“试剂盒”是包含至少一种试剂的任何制造品(例如包装或容器)，所述试剂例如用于特异性地检测本发明的生物标记基因或蛋白质的探针。在某些实施方案中，该制造品作为用于执行本发明方法的单位被推广、分发或销售。
当涉及受试者或患者对于先前已经施用给他们的一种或多种药物的反应时，表述“不应答”描述了这样的受试者或患者：在施用这样的一种或多种药物后，其没有显示出对于进行治疗的病症而言任何的或足够的治疗迹象，或者他们显示出对于该一种或多种药物在临床上无法接受的高度毒性，或者他们没有维持在第一次施用该一种或多种药物后的治疗征象，其中单词治疗在该背景下如本文定义的使用。短语“不应答”包括对于先前施用的一种或多种药物具有抗性和/或顽抗的那些受试者的描述，并且包括下述情况：其中受试者或患者在接受一种或多种药物施用时已进展，并且其中受试者或患者在完成方案后的12个月内(例如6个月内)已进展，所述方案涉及他或她不再应答的一种或多种药物。因此，对于一种或多种药物的不应答性包括在先前或当前的治疗后继续具有活动性疾病的受试者。例如，在用患者不应答的一种或多种药物治疗约1-3个月后，患者可以具有活动性疾病活动性。此应答性可以由在所讨论的病症的治疗领域的临床医生进行评估。
在本发明的方法中使用的生物标志的“量”或“水平”是在生物样品中可检测的水平。这些可以通过本领域技术人员已知的以及本文公开的方法进行测量。
术语“表达的水平”或“表达水平”一般而言可互换使用，并且一般指生物样品中多核苷酸或氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”一般指基因编码的信息被转换成在细胞中存在和运作的结构的过程。因此，本文使用的基因的“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成蛋白质、或甚至蛋白质的翻译后修饰。转录的多核苷酸、翻译的蛋白质或翻译后修饰的蛋白质的片段也应视为表达的，无论它们是源于通过可变剪接生成的转录物或降解的转录物，还是源于蛋白质的翻译后加工例如蛋白酶解。“表达的基因”包括转录成多核苷酸如mRNA并且随后翻译成蛋白质的那些，以及转录成RNA但不翻译成蛋白质的那些(例如，转移、非编码RNA(ncRNA)和核糖体RNA(rRNA))。
用于本发明的方法中的生物标志
用于本发明的方法中的生物标志包括，例如基因tbx6和dleu2的表达产物(例如蛋白、mRNA、ncRNA或其它多核苷酸)。
Tbx6(也被称作T-框转录因子6或T-框蛋白6)是一种参与发育过程的转录调节剂。参见UnitProtKB/Swiss Prot Entry Number095947，它通过引用整体并入本文。Tbx6是T-框基因家族的一个成员，且在人类中具有16p12-q12的染色体定位。参见Yi等人，Genomics55：10-20(1999)，它通过引用整体并入本文。
T-框6蛋白的长度是436个氨基酸，且含有一个T-框DNA结合域。参见UnitProtKB/Swiss Prot Entry Number095947。已知存在Tbx6的天然变体，诸如在氨基酸162处的GLY至SER置换、在氨基酸178处的SER至PHE置换和在氨基酸179处的PRO至SER置换。出处同上。tbx6的几个序列已经保存在GenBank中，且具有下述登录号：AJ007989(mRNA)和CAA07812.1(翻译)；BC026031(mRNA)和AAH26031.1(翻译)；AJ010279(基因组DNA)和CAB37938.1(翻译)，并且都通过引用整体并入本文。
Dleu2编码长度在1.0-1.8kb之间的长非编码RNA(ncRNA)，并且被聚腺苷酸化和剪接。参见Klein等人，Cancer Cell17：28-40(2010年1月)，它通过引用整体并入本文。ncRNA也被称作LEU2。UnitProtKB/Swiss ProtEntry Number O43262。dleu2的功能不明，但是该类ncRNA的其它成员具有X染色体灭活或活化、印记(imprinting)和基因表达的转录活化/调节等功能。Klein等人，Cancer Cell17：28-40(2010年1月)。Dleu2位于具有dleul和微RNA miR-15a/16-1的基因簇中的人染色体区域13q14处。出处同上。已经证实，dleu2/miR-15a/16-1基因座在成熟B细胞的繁殖中起作用。出处同上。此外，所述基因座在B细胞中具有肿瘤抑制剂作用，并且小鼠中的该基因座的缺失造成B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)有关的表型。出处同上。
ncRNA可以编码假定的55个氨基酸的蛋白。参见UnitProtKB/SwissProt Entry Number O43262。delu2的几种序列已经保存在GenBank中，且具有下述登录号：Y15228(mRNA)和CAA75516.1(翻译)；CH471075(基因组DNA)和EAX08851.1(翻译)；BC017819(mRNA)和AAHl7819.1(翻译)；BC022282(mRNA)和AAH22282.1(翻译)；BC030971(mRNA)和AAH30971.1(翻译)，并且都通过引用整体并入。出处同上。
本领域已知的其它神经变性生物标志也可以与tbx6和/或dleu2联合地用于本发明的方法中。其它神经变性生物标志包括，例如，淀粉样蛋白-β(Aβ)、淀粉样蛋白前体蛋白(APP)、tau、早老蛋白1(PS1)、早老蛋白2(PS2)、载脂蛋白E(apoE)、神经元网线蛋白(neuronal thread protein，NTP)、α-抗胰凝乳蛋白酶(antichymotripsin)、β-分泌酶、CD59、C-反应蛋白、Clq、8-羟基-脱氧鸟嘌呤、谷氨酰胺合酶、神经胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein，GFAP)、IL-6受体复合物、激肽释放酶(kallikrein)、黑素转铁蛋白(melanotransferin)、神经丝蛋白(neurofiliment proteins)、硝基酪氨酸(nitrotyrosine)、氧固醇(oxysterols)、sulphatides、突触标志(synaptic markers)、S100β和在下述文献中提及的其它神经变性生物标志：美国公开的申请号2010/0255485、2010/0167947、2010/0159486、2010/0124756、2009/0239241、2008/0261226、2008/0220449、2008/0026405、2005/0244890、2005/0221348；美国专利号4,728,605、5,874,312、6,027,896、6,114,133、6,130,048、6,210,895、6,358,681、6,451,547、6,461,831、6,465,195、6,475,161和6,495,335。其它神经变性生物标志包括在下述文献中提及的那些：Fahnestock等人，J.Neural.Transm.Suppl.62：241-52(2002)；Masliah等人，Neurobiol.Aging16(4)：549-56(1995)；Power等人，Dement.Geriatr.Cogn.Disord.12(2)：167-70(2001)；和Burbach等人，J.Neurosci.24(10)：2421-30(2004)。
基于本文提供的信息以及本领域中的信息，本领域技术人员知晓如何构建用于本发明的方法中的靶向神经变性生物标志的探针。
一般技术
除非另有说明，本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，它们属于本领域的技术内。此类技术在文献中充分解释，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(Sambrook等人，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel等人编，1987，和定期更新)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等人编，1994)。
使用本领域已知的标准技术，可以制备在本发明中采用的引物、寡核苷酸和多核苷酸。
通过本领域已知的多种操作可以获得样品，所述操作包括、但不限于外科手术切除、抽吸或活组织检查。所述组织可以是新鲜的或冷冻的。在一个实施方案中，将所述样品固定和包埋在石蜡等中。通过常规方法，可以固定(即保存)组织样品。本领域普通技术人员会明白，固定剂的选择取决于要在组织学上染色或以其它方式分析的样品的目的。本领域普通技术人员还明白，固定的持续时间取决于组织样品的大小和使用的固定剂。
基因表达水平的检测
如下面所讨论的，样品中生物标志的表达可通过多种方法来分析，其中许多是本领域已知的和熟练技术人员了解的，包括但不限于免疫组织化学和/或蛋白质印迹分析、定量测定诸如ELISA、ELIFA、原位杂交、免疫沉淀、分子结合测定、微阵列分析、荧光活化细胞分选(FACS)、RNA分析和/或RNA(诸如mRNA和ncRNA)的PCR分析、以及可通过基因和/或组织阵列分析来实施的多种测定中的任一种。用于评价基因和基因产物的状态的典型方案参见，例如Ausubel，等人，编，1995，Currem Protocols in Molecular Biology，单元2(RNA印迹法)、单元4(DNA印迹法)、单元15(免疫印迹法)和单元18(PCR分析)。
检测哺乳动物组织或细胞样品中的生物标志的表达的其它方法包括：使所述样品接触结合所述生物标志的抗体、其反应片段或含有生物标志蛋白的抗原结合区的重组蛋白，然后检测样品中的所述抗体、其片段或重组蛋白的结合。
在本发明的具体实施方案中，使用免疫组织化学和染色规程来检查样品中的生物标志的表达。组织切片的免疫组织化学染色已被证明是评估或检测样品中蛋白质的存在的可靠方法。免疫组织化学(“IHC”)技术使用抗体来原位探测并显现细胞抗原，通常利用生色或荧光方法。
就样品制备而言，可以使用来自哺乳动物的组织或细胞样品(例如，人脑组织样品)。样品的例子包括但不限于组织活组织检查、脑组织活组织检查、血液、肺抽吸物、痰、淋巴液等。从疾病组织或从其它身体样品(例如，脑组织(活组织检查)、脑脊液、血液包括全血、血浆或血清、尿、唾液、眼泪等)可以检测基因或基因产物。在某些情况下，可以分离出单个细胞或细胞类型，例如但不限于神经元。所述样品可以通过本领域已知的多种操作来得到，包括但不限于手术切除、抽吸或活组织检查。所述组织可以是新鲜的或冷冻的。在一个实施方案中，该样品被固定并包埋在石蜡等中。通过本领域众所周知的方法，可以得到来自受试者的生物样品。组织活组织检查经常被用于获得患病组织的代表性小片。或者，可以以已知或被认为含有目标疾病细胞的组织/流体的形式间接获得细胞。就样品制备而言，可以使用得自哺乳动物(通常是人患者)的组织或细胞样品。
组织样品可以用常规方法固定(及保存)(参见例如，Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology，第3版(1960)Lee G.Luna，H T(ASCP)编，The Blakston Division McGraw-HillBook Company，New York；The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Patholo gy(1994)Ulreka V.Mikel编，Armed Forces Institute of Pathology，American Registry ofPathology，Washington，D.C.)。本领域的技术人员将理解，固定剂的选择取决于对该样品作组织染色或其它分析的目的。本领域的技术人员还将理解，固定的时间长短依赖于组织样品的大小和所用的固定剂。举例而言，中性缓冲的福尔马林、布安固定液(Bouin’s)或多聚甲醛都可以用来固定样品。
一般而言，首先将样品固定，然后通过递增系列浓度的醇脱水，用石蜡或其它切片介质浸润并包埋，使组织样品可切片。作为选择，可以将组织切片，并固定所得的切片。举例而言，可以根据常规的方法将组织样品包埋在石蜡中并处理(参见例如，Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology，出处同上)。可使用的石蜡的例子包括但不限于Paraplast、Broloid和Tissuemay。一旦组织样品被包埋，则可用切片机等将组织切片(参见例如，Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology，出处同上)。举例而言，该方法切片的厚度可为约3微米到约5微米。切片后，即可使用多种标准方法将切片附着在载玻片上。载玻片的粘合剂的例子包括但不限于硅烷、明胶、聚-L-赖氨酸等。例如，石蜡包埋的切片可以附着于带正电的载玻片和/或聚L-赖氨酸包被的载玻片。
如果使用石蜡作为包埋材料，通常将组织切片脱石蜡(deparaffinize)并用水再水合。组织切片可以用数种常规标准方法脱石蜡。例如，可以使用二甲苯和逐渐降低的系列浓度的醇(参见例如，Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology，出处同上)。或者，可使用商购可得的非有机脱石蜡剂诸如Hemo-De7(CMS，Houston，Tex.)。
任选地，制备样品以后，可使用IHC分析组织切片。IHC可与其它的技术例如形态学染色和/或荧光原位杂交组合使用。可用两种一般的IHC方法：直接和间接测定。根据第一种测定法，直接确定抗体对靶抗原(例如，生物标志)的结合。该直接测定使用无需进一步抗体相互作用即可显现的标记试剂，例如荧光标签或酶标记的第一抗体。在典型的间接测定中，未缀合的第一抗体结合抗原，然后标记的第二抗体结合该第一抗体。在第二抗体与酶标记物缀合的情况下，加入生色或荧光底物以显现抗原。由于数个第二抗体可与第一抗体的不同表位反应，产生信号的放大。
免疫组织化学所用的第一和/或第二抗体通常用可检测的部分标记。可用的标记物很多，通常可以分为下面几类：
(a)放射性同位素，诸如35S、14C、125I、3H和131I。例如，可以使用在Current Protocols in Immunology，第1和2卷，Coligen等人编.Wiley-Interscience，New York，N.Y.，Pubs.(1991)中描述的技术，用放射性同位素标记抗体，并可以用闪烁计数法测量放射性。
(b)胶体金颗粒。
(c)荧光标记，包括但不限于稀土螯合物(铕螯合物)，德克萨斯红、罗丹明、荧光素、丹磺酰基、丽丝胺(Lissamine)、伞形酮、藻红蛋白(phycocrytherin)、藻蓝蛋白或商购可得的荧光团，例如SPECTRUMORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述一种或多种的衍生物。例如，用Current Protocols in Immunology(出处同上)公开的技术，可以使荧光标记物与抗体缀合，并可以用荧光计定量荧光。
(d)可用的酶底物标记有很多，美国专利号4,275,149提供了其中的一些的综述。酶一般催化可使用多种技术测量的生色底物的化学改变。例如，酶可以催化可通过分光光度法测量的底物的颜色改变。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。化学发光底物通过化学反应变成电子激发态，然后可发射可测量(例如使用化学发光计)的光或给荧光受体提供能量的光。酶标记物的例子包括荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利号4,737,456)、荧光素、2，3-二氢酞嗪二酮类、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于使酶与抗体缀合的技术描述于O′Sullivan等人，“Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use inEnzyme Immunoassay”，Methods in Enzym.(J.Langone和H.Van Vunakis编)，Academic press，New York，73：147-166(1981)。
酶-底物组合的例子包括，例如：(i)辣根过氧化物酶(HRPO)与作为底物的过氧化氢酶，其中所述过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为生色底物的对硝基苯基磷酸酯；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如，对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物(例如4-methylumbelliferyl-β-D-半乳糖苷酶)。
本领域技术人员可利用许多其它酶-底物组合。有关它们的一般性综述参见美国专利号4,275,149和4,318,980。有时，将标记物与抗体间接缀合。熟练技术人员了解实现这一目的的多种技术。例如，可将抗体与生物素缀合，而且可以将上述四大类标记物中的任一种与抗生物素蛋白缀合，或反之亦然。生物素选择性地结合抗生物素蛋白，由此标记物可与抗体以这种间接方式缀合。或者，为了实现标记物与抗体的间接缀合，将抗体与小型半抗原缀合，并将上述不同类型的标记物之一与抗-半抗原抗体缀合。由此，可实现标记物与抗体的间接缀合。
在上文讨论的样品制备规程外，可能需要在IHC之前、期间或之后对组织切片进一步处理。例如，可以实施表位修复法，诸如在柠檬酸盐缓冲液中加热组织样品(参见，例如，Leong等人.Appl.Immunohistochem.4(3)：201(1996))。
在任选的封闭步骤后，组织切片在合适条件下暴露于第一抗体足够时间段，使得第一抗体结合至组织样品中的靶蛋白抗原。实现这一目的的适宜条件可以通过常规实验来确定。通过使用上文讨论的任一种可检测标记物来测定抗体与样品的结合程度。优选的是，标记物是酶标记物(例如HRPO)，其催化生色底物诸如3，3′-二氨基联苯胺色原体的化学变化。优选的是，将酶标记物缀合至特异性地结合第一抗体的抗体(例如第一抗体是兔多克隆抗体，第二抗体是山羊抗-兔抗体)。
任选地，在IHC分析中用于检测生物标志的表达的抗体是产生的主要结合目标生物标志的抗体。任选地，抗-生物标志抗体是单克隆抗体。抗-生物标志抗体是在本领域中可容易地得到的，包括从各种商业来源得到，且也可以使用本领域已知的常规技能制备。
可以将如此制备的标本封固并盖上盖玻片。然后测定载玻片，例如利用显微镜，并且可以采用本领域常规使用的染色强度标准。作为一个例子，可以如下评价染色强度标准：
表1
Figure BDA00003259813000291
在替代方法中，可以在足以使抗体-生物标志复合物形成的条件下使样品接触对生物标志特异性的抗体，然后检测所述复合物。可以以多种方式来检测生物标志的存在，诸如通过蛋白质印迹和ELISA规程，其用于测定多种组织和样品，包括血浆或血清。可利用多种使用这样测定法的免疫测定技术，参见，例如，美国专利号4,016,043、4,424,279和4,018,653。这些包括非竞争性类型的单位点和双位点或“夹心”测定法，以及传统的竞争性结合测定法。这些测定法也包括经标记的抗体对靶生物标志的直接结合。
夹心测定法是最有用且常用的测定法之一。夹心测定技术有许多变化形式，本发明意图涵盖所有这些变化形式。简言之，在一种典型的正向测定法(forward assay)中，将未标记的抗体固定化在固体基质上，使待测试的样品接触所结合的分子。温育足以容许抗体-抗原复合物形成的合适长度的一段时间后，然后添加对抗原特异性的、用能够生成可检测信号的报道分子标记的第二抗体，并温育足以使另一抗体-抗原-标记抗体复合物形成的时间。洗去任何未反应的物质，并通过由报道分子生成的信号的观察结果来确定抗原的存在。结果可以是定性的，即通过可见信号的简单观察，或者可以通过与包含已知量的生物标志的对照样品比较来量化。
正向测定法的变化形式包括同时测定法，其中将样品和经标记抗体二者同时添加至所结合的抗体。这些技术是本领域技术人员所熟知的，包括任何显而易见的微小变化。在一种典型的正向夹心测定法中，具有针对生物标志的特异性的第一抗体或共价地或被动地结合至固体表面。所述固体表面通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。所述固体支持物可以是管、珠、微量培养板的盘、或适于实施免疫测定法的任何其它表面的形式。结合过程是本领域众所周知的，一般由交联、共价结合或物理吸附组成，清洗聚合物-抗体复合物，为试验样品做好准备。然后将待测样品的等分试样添加至固相复合物，并在合适条件(例如室温至40℃，诸如25℃和32℃之间，含两端值)下温育足够时间段(例如2-40分钟或过夜，如果更方便的话)，以容许抗体中存在的任何亚基结合。温育期后，将抗体亚基固相清洗，并干燥，并与对生物标志的一部分特异性的第二抗体一起温育。所述第二抗体与报道分子连接，所述报道分子用于指示第二抗体对分子标志的结合。
一种替代方法包括：将样品中的靶生物标志固定化，然后将固定化的靶物暴露于未标记的或用报道分子标记的特异性抗体。根据靶物的量和报道分子信号的强度，所结合的靶物可以是通过用抗体直接标记而可检测的。或者，将经标记的、对第一抗体特异性的第二抗体暴露于靶物-第一抗体复合物，以形成靶物-第一抗体-第二抗体三元复合物。通过报道分子发射的信号来检测该复合物。在本说明书中使用的“报道分子”指这样的分子：其通过它的化学性质而提供分析上可鉴定的信号，所述信号容许检测抗原所结合的抗体。这类测定法中最常用的报道分子是酶、荧光团或含放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。
在酶免疫测定法的情况中，将酶缀合至第二抗体，一般借助于戊二醛或高碘酸盐。然而，正如易于领会的，存在多种不同的缀合技术，它们可被技术人员容易地得到。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶和碱性磷酸酶和其它酶。与特定酶一起使用的底物一般选择成在被相应的酶水解后生成可检测的颜色变化。合适的酶的例子包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。也可能采用荧光底物，其生成荧光产物而非上文所述生色底物。在所有情况中，将酶标记的抗体添加至第一抗体-分子标志复合物，容许结合，然后洗去过量的试剂。然后将含有适宜底物的溶液添加至抗体-抗原-抗体复合物。底物与第二抗体所连接的酶反应，产生定性的可视信号，其可以进一步量化，通常通过分光光度法，以给出样品中存在的生物标志的量的指示。或者，可以将荧光化合物(诸如荧光素和罗丹明)化学偶联至抗体而不改变它们的结合能力。在被特定波长的光照射而激活时，荧光染料标记的抗体吸收光能，从而在分子中诱导激发状态，接着以用光学显微镜在视觉上可检测的特征性颜色发光。象在酶免疫测定法(EIA)中一样，容许荧光标记的抗体结合至第一抗体-分子标志复合物。在洗去未结合的试剂后，然后将剩余的三元复合物暴露于适宜波长的光，所观察到的荧光指示目标分子标志的存在。免疫荧光和EIA技术都是本领域已完善建立的。然而，也可以采用其它报道分子，诸如放射性同位素、化学发光分子或生物发光分子。
预见到，上文所述的技术也可用于检测生物标志(诸如tbx6或dleu2)的表达。
本发明的方法还包括检查ncRNA和/或mRNA(诸如tbx6 mRNA或dleu2 ncRNA)在组织或细胞样品中的存在和/或表达的方案。评价细胞中的ncRNA和/或mRNA的方法是熟知的，包括，例如，使用互补DNA探针的杂交测定(例如使用标记的生物标志核糖核酸探针的原位杂交、RNA印迹和有关的技术)和多种核酸扩增测定(例如使用对生物标志特异性的互补引物的RT-PCR，和其它扩增型检测方法，例如分支DNA、SISBA、TMA等)。
使用RNA印迹、斑点印迹或PCR分析，可以方便地测定来自哺乳动物的组织或细胞样品，例如，针对生物标志mRNA和/或ncRNA。例如，RT-PCR测定，诸如定量PCR测定，是本领域众所周知的。在本发明的一个示例性的实施方案中，一种用于检测生物样品中的生物标志mRNA和/或ncRNA的方法包括：使用至少一种引物进行反转录，从样品产生cDNA；使用生物标志多核苷酸作为有义和反义引物扩增如此产生的cDNA，以扩增其中的生物标志cDNA；并检测被扩增的生物标志cDNA的存在。另外，这样的方法可包括一个或多个可确定生物样品中的生物标志mRNA和/或ncRNA的水平的步骤(例如通过同时检测“持家”基因(例如肌动蛋白家族成员)的比较性对照mRNA序列水平)。任选地，可以确定被扩增的生物标志cDNA的序列。
生物标志引物和引物对，其允许特异性扩增用于本发明的方法中的多核苷酸或其任意特定的部分；以及选择性地或特异性地与用于本发明的方法中的核酸分子或其任意部分杂交的探针。探针可以用可检测的标志标记，所述标志例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光性化合物、化学发光性化合物、金属螯合物或酶。这样的探针和引物可以用来检测样品中生物标志多核苷酸的存在，或作为检测表达生物标志蛋白的细胞的手段。技术人员会理解，基于本文提供的序列可以制备很多种不同的引物和探针，并有效地用于扩增、克隆和/或确定生物标志mRNA和/或ncRNA的存在和/或水平。
本发明的任选方法包括，通过微阵列技术检验或检测组织或细胞样品中的mRNA和/或ncRNA(诸如tbx6和dleu2 mRNA和ncRNA)的方案。使用核酸微阵列，将来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA和/或ncRNA样品逆转录并标记，以生成cDNA探针。然后将所述探针与固定在固体支持物上的核酸阵列杂交。所述阵列被构造成，使得所述阵列的每个成员的序列和位置是已知的。例如，可以将基因选集在固体支持物上形成阵列，所述基因具有在某些疾病状态中表达的潜力。经标记的探针与特定阵列成员的杂交指示，该探针源自的样品表达该基因。疾病组织的差别基因表达分析可提供有价值的信息。微阵列技术利用核酸杂交技术和计算技术在单一实验中评估数以千计基因的mRNA表达模式(关于阵列制作的讨论，参见，例如，2001年10月11日公布的WO01/75166；参见，例如，美国专利号5,700,637、美国专利号5,445,934和美国专利号5,807,522；Lockart，Nature Biotechnology，14：1675-1680(1996)；Cheung，V.G.等人，Nature Genetics21(Suppl)：15-19(1999))。DNA微阵列是包含基因片段的微型阵列，所述基因片段要么在玻璃或其它基质上直接合成，要么点到玻璃或其它基质上。单一阵列中通常呈现数以千计的基因。一个典型的微阵列实验包括以下步骤：1)从分离自样品的RNA制备荧光标记的靶物；2)将经标记的靶物杂交至微阵列；3)清洗、染色和扫描阵列；4)分析扫描的图像；和5)生成基因表达模式。当前使用两种主要类型的DNA微阵列：寡核苷酸(通常为25-70聚体)阵列和包含从cDNA制备的PCR产物的基因表达阵列。在形成阵列时，可以预制寡核苷酸并点到表面上，或者直接合成在表面上(原位)。Affymetrix GeneChipTM系统是一种商购可得的微阵列系统的一个例子，其包含通过在玻璃表面上直接合成寡核苷酸而制作的阵列。
通过检查基因缺失或基因扩增，也可以评估选择的生物标志的表达。通过本领域已知的多种方案中的任一种，可以测量基因缺失或扩增，例如，通过常规DNA印迹法、RNA印迹法定量mRNA和/或ncRNA的转录(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980))、斑点印迹法(DNA分析)或使用适当地标记的探针的原位杂交(例如，FISH)、细胞遗传方法或使用适当地标记的探针的比较基因组杂交(CGH)。作为例子，这些方法可以用于检测生物标记基因的缺失或扩增。
体内检测
在一个方面，用于本发明的方法中的探针以适合体内成像的量或剂量施用给患者。通常，用于本发明的方法中所需的探针的量将随患者因素而变化。这样的因素包括，例如，年龄、方案、状况、性别、疾病的严重程度、体重、禁忌、伴随的治疗等。基于这些因素，本领域的熟练医师可以确定、调节或修改用于成像的探针的示例性量。例如，患者的包含用于本发明的方法中的探针的单位剂量可以在1x10-15g/kg至10g/kg之间、优选1x10-15g/kg至1.0g/kg之间变化。此外，包含用于本发明的方法中的探针的单位剂量也可以是1μCi/kg至10mCi/kg，且优选0.1mCi/kg。用于本发明的方法中的探针的剂量也可以在0.001μg/kg至10μg/kg之间、或优选0.01μg/kg至1.01μ/kg之间变化。本领域技术人员还可以调节或修改作为滴眼剂施用给受试者的用于本发明的方法中的有效量的探针。
在本发明的方法中探针向受试者的施用可以是局部的或全身性的，并通过静脉内、动脉内、鞘内(经由脊髓液)、眼内等方式完成。施用也可以是真皮内的或腔内的。
在一个方面，在用于本发明的方法中的探针与靶标结合足够的时间以后，通过常规成像技术或形式诸如磁共振分光术(MRS)、磁共振分光术成像(MRI)、正电子发射体层摄影术(PET)、单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)、平面闪烁成像或其组合以及任何新出现的成像形式或本文描述的其它形式，检查要研究的受试者的区域。确切方案必然地随患者特异性的因素和给药方法以及使用的探针或可检测标志的类型而变化，尽管特定操作的确定对于技术人员而言是常规的。
用于本发明的方法中的探针也可以以可注射的组合物的形式施用，但是也可以配制成众所周知的药物递送系统，例如，口服的、直肠的、肠胃外的(静脉内的、肌肉内的或皮下的)、脑池内的、阴道内的、腹膜内的、局部的(粉剂、软膏剂或滴剂)，或作为含服剂或鼻喷雾剂以及滴眼剂。典型的给药组合物可以包含用于本发明的方法中的探针的药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括诸如下述的载体：例如，水溶液、无毒的赋形剂包括盐、防腐剂、缓冲剂等，它们参见：Remington′s Pharmaceutical Sciences，第15版.Easton：Mack Publishing Co.，第1405-1412页和1461-1487(1975)和The National Formulary XIV.，第14版.Washington：American Pharmaceutical Association(1975)。
在一个方面，用于本发明的方法中的探针是这样的探针：其除了在体内结合(例如，优先地或特异性地)本文所述的生物标志以外，还能够穿过血脑屏障(BBB)，并且在适当的剂量水平是无毒的，且具有令人满意的效应持续时间。
存在几种本领域已知的转运分子穿过血脑屏障的方案，包括但不限于：物理方法、基于脂质的方法、基于干细胞的方法以及基于受体和通道的方法。
转运探针穿过血脑屏障的物理方法包括但不限于：完全地绕过血脑屏障，或通过在血脑屏障中产生开口。绕过方法包括但不限于：直接注射进脑中(参见，例如，Papanastassiou等人，Gene Therapy9：398-406(2002))、间质输注/对流增强的递送(参见，例如，Bobo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：2076-2080(1994))和在脑中植入递送装置(参见，例如，Gill等人，Nature Med.9：589-595(2003)；和Gliadel WafersTM，GuildfordPharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括但不限于：超声(参见，例如，美国专利公开号2002/0038086)、渗透压(例如，通过施用高张的甘露醇(Neuwelt，E.A.，Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation，卷1和2，Plenum Press，N.Y.(1989))例如通过缓激肽或透化剂A-7的透化作用(参见，例如，美国专利号5,112、596、5,268,164、5,506,206和5,686,416)、以及用含有编码探针的基因的载体转染跨越血脑屏障的神经元(参见，例如，美国专利公开号2003/0083299)。
转运探针穿过血脑屏障的基于脂质的方法包括但不限于：将探针包囊进与抗体结合片段偶联的脂质体内部，所述抗体结合片段结合血脑屏障的血管内皮上的受体(参见，例如，美国专利申请公开号2002/0025313)、以及将探针包被在低密度脂蛋白颗粒中(参见，例如，美国专利申请公开号2004/0204354)或载脂蛋白E中(参见，例如，美国专利申请公开号2004/0131692)。
转运探针穿过血脑屏障的基于干细胞的方法需要遗传工程改造的神经祖细胞(NPC)来表达目标探针，然后将所述干细胞植入要治疗的个体的脑中。参见参见Behrstock等人.Gene Ther.，2005年12月15日，提前在线公开(其报道称，当植入啮齿动物和灵长类动物模型的脑中时，遗传工程改造成表达神经营养因子GDNF的NPC减轻帕金森病的症状)。
转运探针穿过血脑屏障的基于受体和通道的方法包括但不限于：使用糖皮质激素阻断剂增加血脑屏障的渗透性(参见，例如，美国专利申请公开号2002/0065259、2003/0162695和2005/0124533)；激活钾通道(参见，例如，美国专利申请公开号2005/0089473)、抑制ABC药物转运蛋白(参见，例如，美国专利申请公开号2003/0073713)；用转铁蛋白包被抗体和调节一种或多种转铁蛋白受体的活性(参见，例如，美国专利申请公开号2003/0129186)、以及将抗体阳离子化(参见，例如，美国专利号5,004,697)。
另外，用于本发明的方法中的探针可以与脑靶向肽缀合或结合。本文使用的“脑靶向肽”是通常被转运(例如，经由载体介导的转运或受体介导的转运)穿过BBB的蛋白(例如，配体或肽模拟物抗体)。这样的脑靶向肽的非限制性例子包括胰岛素或转铁蛋白。其它脑靶向肽包括受体特异性的肽模拟物抗体或其片段，它们结合转运受体诸如胰岛素受体、转铁蛋白受体、瘦蛋白受体、GLUT1葡萄糖转运蛋白、MCT1乳酸盐转运蛋白、LAT1大中性氨基酸转运蛋白和CNT2腺苷转运蛋白，以促进跨BBB的转运。
在某些方面，用于本发明的方法中的探针是肽核酸(PNA)，其中将多核苷酸与脑靶向多肽缀合或结合。
在探针的制备及施用中可以考虑用于本发明的方法中的生物标志的位置。当结合靶为细胞内分子时，本发明的某些实施方案提供了要被导入结合靶标所处的细胞中的探针。在一个实施方案中，本发明的探针可以作为细胞内抗体在细胞内表达。本文使用的术语“细胞内抗体(intrabody)”指这样的抗体或其抗原结合部分：它们在细胞内表达，且能够与靶分子选择性结合，参见，例如：Marasco，Gene Therapy4：11-15(1997)；Kontermann，Methods34：163-170(2004)；美国专利号6,004,940和6,329,173；美国专利申请公开号2003/0104402，和PCT公开号WO2003/077945。也参见，例如，1996年3月14日公布的WO96/07321，其涉及使用基因疗法来产生细胞内抗体。
通过将编码期望的探针的核酸引入靶细胞中，可以实现探针的细胞内表达。可将编码探针的全部或部分的一种或多种核酸递送给靶细胞，使得一种或多种能与细胞内靶生物标志结合的探针得以表达。可使用任何将核酸导入细胞中的标准方法，包括、但不限于：显微注射，弹道式注射(ballisticinjection)，电穿孔，磷酸钙沉淀，脂质体以及使用携带目标核酸的逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和痘苗病毒载体进行转染。
在某些实施方案中，可以通过体内方法将核酸(任选包含在载体中)引入患者的细胞。在体内递送的一个例子中，例如在神经变性疾病或病症的部位，将核酸直接注射到患者体内。在体内递送的又一个例子中，使用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒、或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(对于脂质介导的基因转移有用的脂质是例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)的转染，将核酸引入细胞中。关于某些基因标记和基因疗法方案的综述，参见Anderson等人，Science256：808-813(1992)和WO93/25673及其中引用的参考文献。
本发明采用这样的探针：其与非侵袭性的神经成像技术或形式诸如MRS、MRI、PET或SPECT相结合，用于在体内定量基因表达。本发明的方法也涉及对患者成像以建立生物标志基因表达的基线。本发明的一种示例性方法包括：在施用治疗以后，对患者成像至少一段时间。在一个方面，本发明的方法可以包括，在用至少一种治疗剂治疗之前和之后，对患者成像。体内成像也可以在治疗过程中的任何时间执行。
可以为成像或检测标记(即，加标志或加标签)用于本发明的方法中的探针。任意合适的标记物(放射性标记物或标签)可以用于生物标志探针的检测。
用于检测生物标志探针的示例性技术包括闪烁描记术、放射性闪烁描记术、磁共振成像(MRI)、化学发光、近红外发光、荧光、SPECT、计算机体层摄影术(CT扫描)、正电子发射体层摄影术(PET)或其组合。本领域普通技术人员会理解检测和有关的技术。
为了体内成像目的，检测仪器的类型是选择给定的可检测标志的一种因素。例如，放射性同位素和18F或123I适用于在本发明的方法中的体内成像。使用的仪器的类型也将引导放射性核素或稳定的同位素的选择。在一个方面，选择的放射性核素必须具有通过给定的仪器类型可检测的衰变类型。此外，在选择用于体内成像的可检测标志时，考虑其它因素诸如放射性核素的半衰期。成像技术是本领域已知的，本领域普通技术人员能够选择用于本发明的方法中的适当的可检测标志。
可检测标志的半衰期应当足够长，使得所述标志在被靶标摄入的最大时间时仍然是可检测的，但是足够短，使得受试者不经受有害辐射。用于本发明的方法中的探针可以使用γ成像来检测，其中检测发射的适当波长的γ辐照。常规的γ成像方法包括但不限于SPECT和PET。优选地，就SPECT检测而言，选择的可检测标志缺少微粒发射，但是产生大量在140-300keV范围内的光子。就PET检测而言，可检测标志是发射正电子的放射性核素诸如18F，其将衰减以形成2个511 keVγ射线，后者然后可以被PET照相机检测出。
在一个方面，将可用于体内成像的用于本发明的方法中的探针施用给受试者。所述探针与非侵袭性的神经成像技术诸如MRS、MRI、PET、SPECT和/或其组合结合使用。使用本领域已知的一般有机化学技术，可以用19F或13C标记用于本发明的方法中的探针，以产生用于MRS/MRI的探针。March，J.，Advanced Organic Chemistry：I Reactions，Mechanisms， and Structure(第3版，1985)；Morrison和Boyd，Organic Chemistry(第6版，1992)。通过本领域众所周知的技术和Fowler，J.和Wolf，A.在Positron Emission Tomography and Autoradiography(Phelps，M.，Mazziota，J.，和Schelbert，H.编)第391-450页(Raven Press，NY1986)中描述的技术，也可以用18F、11C、75Br或76Br放射性地标记在本发明的方法中使用的探针用于PET。通过本领域已知的几种技术中的任一种，也可以用123I放射性地标记在本发明的方法中使用的探针用于SPECT。Kulkarni，Int.J.Rad.Appl.& Inst.，(Part B)18：647(1991)。
标记、可检测的标记、放射性标记、标签、标志、可检测标志、示踪剂、放射性示踪剂或本领域普通技术人员通常理解的等效术语可以代表适用于成像和/或测定(例如，鉴定、诊断、评价、检测和/或定量)的任何取代基(基团、部分、位置)。例如，用于本发明的方法中的探针可以包含适用于体内或体外检测的标记、放射性标记、标签、标志、可检测标志、示踪剂、放射性示踪剂或等效术语，所述检测是通过放射性闪烁描记术、磁共振成像(MRI)、测定、化学发光、近红外发光、荧光、分光术、γ成像、磁共振成像、磁共振分光术、荧光分光术、SPECT、计算机体层摄影术(CT扫描)、正电子发射体层摄影术(PET)。合适的标记、放射性标记、标签、标志、可检测标志、示踪剂、放射性示踪剂或等效术语是本领域技术人员已知的，且可以包括，例如，放射性同位素、放射性核素、同位素、荧光基团、生物素(与抗生蛋白链菌素络合作用相结合)或光亲和性基团。用于本发明的方法中的探针的标记、可检测的标记、放射性标记、标签、标志、可检测标志、示踪剂、放射性示踪剂可以包含131I、124I、125I、3H、123I、18F、19F、11C、75Br、13C、13N、15O、76Br。“光亲和性基团”或“光亲和性标记的”可以指在用于本发明的方法中的探针上的取代基，其可以通过在适当波长处的光解而活化，以发生与其相连的大分子的交联光化学反应。光亲和性基团的一个例子是二苯甲酮取代基。
合适的放射性同位素是本领域技术人员已知的，且包括，例如，卤素(诸如氯、氟、溴和碘)和金属(包括锝和铟)的同位素。示例性的标记、放射性标记、标签、标志、可检测标志、示踪剂、放射性示踪剂还可以包括3H、11C、14C、18F、32F、35S、123I、125I、131I、124I、19F、75Br、13C、13N、15O、76Br。可以直接地(也就是说，通过将标记物直接掺入本发明的化合物中)或间接地(也就是说，通过螯合剂将标记物掺入本发明的化合物中，其中所述螯合剂已经掺入所述化合物中)标记(放射性地标记、标签、标志、可检测地标志、示踪或放射性地示踪)用于本发明的方法中的探针。此外，用于探针中的标记物可以作为本发明的化合物的额外取代基(基团、部分、位置)被包括，或作为存在的任何取代基的替代取代基。标记、可检测的标记、放射性标记、标签、标志、可检测标志、示踪剂或放射性示踪剂可以出现在用于本发明的方法中的探针上的任何取代基(基团、部分、位置)处。
在一个方面，标记可以是同位的或非同位的。对于同位标记，可以将已经存在于用于本发明的方法中的探针中的一个取代基(基团、部分、位置)替换为(交换为)放射性同位素或同位素。对于非同位标记，可以将放射性同位素或同位素添加至用于本发明的方法中的探针上，无需替换(交换)已经存在的基团。
另外，可以用任意合适的放射性碘同位素(例如，但不限于，131I、125I或123I)如下标记用于本发明的方法中的探针：通过经由重氮碘化物直接碘化重氮化的氨基衍生物(Greenbaum，F.，Am.J.Pharm.，108：17(1936))，通过将不稳定的重氮化胺转化成稳定的三氮烯，或通过将非放射性的卤化前体转化成稳定的三烷基锡衍生物，然后通过本领域众所周知的几种方法将其转化成碘代化合物。Satyamurthy和Barrio，J.Org.Chem.，48：4394(1983)，Goodman等人，J.Org.Chem.，49：2322(1984)，Mathis等人，J.Labell.Comp.和Radiopharm.，1994：905；Chumpradit等人，J.Med.Chem.，34：877(1991)；Zhuang等人，J.Med.Chem.，37：1406(1994)；Chumpradit等人，J.Med.Chem.，37：4245(1994)。例如，可以使本发明化合物的稳定形式或衍生物与含有131I、125I、123I、75Br、76Br或18F的卤化剂反应。
还可以用已知的金属可检测标志诸如锝-99m(99mTc)放射性地标记用于本发明的方法中的探针。本领域普通技术人员无需过多实验即可实现用于本发明的方法中的探针的取代基的修饰，以便引入结合这样的金属离子的配体。制备包含可检测标志诸如99mTc的探针是本领域众所周知的。Zhuang等人，Nuclear Medicine & Biology，26(2)：217(1999)；Oya等人，Nuclear Medicine & Biology，25(2)：135(1998)；Hom等人，NuclearMedicine & Biology，24(6)：485(1997)。
在一个方面，本发明的方法可以使用用同位素(其用于体内成像和分光术目的)标记的探针，所述同位素可通过核磁共振(NMR)分光术检测出。特别适用于磁共振分光术的元素包括1H、19F和13C。适用于制备用于本发明的方法中的探针的可检测标志也包括β-发射体、γ-发射体、正电子-发射体和x-射线发射体。此外，示例性的可检测标志包括131I、123I、124I、125I、3H、123I、18F、19F、13C、14C、75Br、11C、13N、15O和76Br。可以使用用于使本发明的方法中使用的探针显影的任何常规方法或可检测标志，且是本领域普通技术人员所理解的。
参照样品中的生物标志表达水平
用于与测得的基因tbx6和dleu2中的至少一个的水平进行对比的参照样品表达水平取决于要实践的本发明的方法。就神经变性疾病或病症诊断方法而言，得自“参照样品”的表达水平通常是预定的参照水平，诸如从没有罹患神经变性疾病或病症的群体得到的水平的平均值，但是在某些情况下，所述参照水平可以是得自个体组的平均值或中值水平，所述个体组包括患有神经变性疾病或病症的患者。在某些情况下，所述预定的参照水平源自从年龄匹配的群体得到的水平(例如，是所述水平的平均值或中值)。
就神经变性疾病或病症监测方法(例如，诊断或辅助诊断患有神经变性疾病或病症的患者中的神经变性疾病或病症进展的方法)而言，所述参照水平可以是预定的水平，诸如从没有罹患神经变性疾病或病症的群体，已经被诊断出神经变性疾病或病症的群体得到的水平的平均值，并且在某些情况下，所述参照水平可以是得自个体组的平均值或中值水平，所述个体组包括患有神经变性疾病或病症的患者。或者，所述参照水平可以是特定患者的历史参照水平(例如，在更早的时间点从相同个体获得的样品得到的tbx6水平)。在某些情况下，所述预定的参照水平源自从年龄匹配的群体得到的水平(例如，是所述水平的平均值或中值)。
年龄匹配的群体(可以从其得到参照值)理想地是与待检个体相同的年龄，但是大致年龄匹配的群体也是可接受的。大致年龄匹配的群体可以是在待检个体年龄的1岁、2岁、3岁、4岁或5岁内，或者可以是包括待检个体的年龄的不同年龄组。大致年龄匹配的群体可以具有2岁、3岁、4岁、5岁、6岁、7岁、8岁、9岁或更多岁的增量(例如用作62岁个体的参照值来源的“5岁增量”组可以包括58-62岁个体、59-63岁个体、60-64岁个体、61-65岁个体或62-66岁个体)。
但是，本领域技术人员应当理解，通过本文所述的任意方法，同样可以确定参照样品中的生物标志的表达水平。
对比tbx6和/或dleu2的水平
以适合目标生物标志的测量值和参照值的类型的任何方便方式，可以进行对比测量值和参照值的过程。使用定量或定性测量技术，可以测量或测定tbx6和/或dleu2的表达水平，并且对比测量值和参照值的模式可以随采用的测量技术而变化。例如，当使用定性比色测量测定来测量基因表达水平时，可以如下对比所述水平：视觉地对比有色反应产物的强度，或者对比得自有色反应产物的密度测定或光谱测定测量的数据(例如，对比源自测量装置的数字数据或图形数据，诸如条形图)。在所述方法中使用的测量的或测定的值还可以是定量值，且取决于使用的检测方法。
试剂盒
为了用于在本文描述或提议的用途，还提供了试剂盒或产品。此类试剂盒可以包含区室化的载体装置，以在封闭界限中容纳一个或多个容器装置例如小瓶、管等，每一个容器装置包含要在所述方法中使用的分开元件之一。例如，容器装置之一可以包含探针，所述探针是或可以是可检测标记的。此类探针可以是对包含基因表达签名的一种或多种基因的多核苷酸特异性的多核苷酸。当试剂盒利用核酸杂交来检测靶核酸时，试剂盒还可以具有含有用于扩增靶核酸序列的一种或多种核苷酸的容器和/或包含与报道分子(例如酶标记、荧光标记或放射性同位素标记)结合的报道工具的容器，所述报道工具例如生物素结合蛋白质，诸如抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。
试剂盒通常包含上文描述的容器、和一个或多个包含从商业和用户观点上期望的材料(包括缓冲液、稀释剂、滤器、针、注射器)的其它容器、以及具有使用说明的包装说明书。标签可以存在于容器上，以指示组合物用于特定治疗或非治疗应用，并且还可以指示关于体内或体外使用的指导，例如上文描述的那些。试剂盒中的其它任选组分包括一种或多种缓冲液(例如，封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)、其它试剂例如被酶标记物化学改变的底物(例如，色原)、表位修复(epitope retrieval)溶液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、一个或多个对照载玻片等。
实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，考虑到上文提供的一般描述，可以实施多种其它实施方案。
实施例1-关于局部化变性的抑制剂的表征
轴突变性是在神经系统发育和神经变性疾病中剪枝(pruning)的标志。刚刚开始理解调节该活动进程的分子机制。为了鉴定调节轴突变性的额外途径，进行了无偏小分子筛选来鉴定在神经生长因子(NGF)撤除以后阻断轴突变性的不同途径的调节剂。
许多激酶在该筛选中被鉴定为轴突变性的介质，并且如下所述的进一步机制研究将不同激酶的功能定位在轴突隔室或细胞体隔室。
使用Campenot室进行下述实验，所述实验允许分离体环境和轴突环境，并允许诱导局部化变性(参见图1，和，例如，Zweifel等人，Nat.Rev.Neurosci.6(8)：615-625，2005)。在这样的室中，轴突变性被局部化，且在没有细胞凋亡存在下继续进行。
材料和方法
如下清洁特氟隆分配器(Tetlon dividers)(Tyler Research)：在水中清洗，并擦掉它们的任何残余油脂。然后将分配器浸泡在Nochromix(GodaxLaboratories)/硫酸中过夜，在蒸馏的且高压灭菌的水(SQ水)中冲洗5次，煮沸30分钟，然后风干备用。
将小鼠层粘连蛋白(5μg/ml，在无菌的过滤水中；Invitrogen)加入PDL包被的35mm平皿(BD Biosciences)中，并将它们在37℃温育1小时，然后在SQ水中冲洗2次。将平皿真空干燥，然后在层流洁净工作台中风干15分钟。然后用针耙(Tyler Research)将制备的平皿刻痕。将50微升NBM+MC溶液(含有NGF)施加于得到的刻痕轨迹。如下制备所述NBM+MC溶液：将1750mg甲基纤维素与480ml Neurobasal(Invitrogen)混合，向其中加入4.5ml青霉素/链霉素、7.5ml L-谷氨酰胺和10ml B-27无血清补充物(Invitrogen)。将所述溶液在室温混合1小时，在4℃混合过夜，并在室温混合另外1小时。然后将溶液过滤除菌，并在使用前加入50ng/ml NGF(Roche)。在解剖观察仪器下将高真空油脂(VWR)加入每个特氟隆分配器。将层粘连蛋白包被的PDL平皿倒置，并滴落在特氟隆分配器上，通过在不含有轨迹的区域中使用牙签，添加额外的压力。将平皿在37℃温育1小时。将500微升NBM+MC(50ng/ml NGF)溶液加入每个侧室中，并在中央格槽的前面加入油脂屏障。
从小鼠胚胎切离游离的E13.5脊髓，并置于NBM+MC(25ng/ml NGF)溶液中。用钨针使DRG脱离脊髓。使用NBM+MC-润滑的P200移液器将DRG移入1.5ml试管中。用台式离心机沉淀DRG30秒。抛弃上清液，并加入0.05％胰蛋白酶/EDTA(冷的)。用移液器重溶解沉淀物，并在恒定搅拌(650RPM)下在37℃温育15分钟。将样品再次离心，抛弃上清液。将沉淀物再悬浮于温热的NBM+MC(50ng/ml NGF)溶液中，并用火烧过的玻璃移液器(flamed glass pipette)研磨20次，随后用经火玻璃移液器(fire-bored glass pipette)研磨另外20次。将样品再次离心，并将得到的沉淀物再悬浮于0.5ml NBM+MC(50ng/ml NGF)溶液中。将细胞稀释至2.5x106细胞/ml的终浓度。将细胞混悬液加载进带有22号针的1ml注射器中。使用注射器填充Campenot分配器的中心槽(至至少50μl的体积)。将Campenot室在37℃温育过夜。将2.5ml NGF+MC(50ng/ml NGF)溶液加入中央隔室，并除去油脂门。在3天后，用2.5ml NBM+MC培养基(含有25ng/ml NGF)替换外部培养基(细胞体隔室)。
培养5天后，用温热的NBM+MC(不含NGF)溶液洗涤轴突隔室3次。在第3次洗涤以后，将500μtl NBM+MC(不含NGF)溶液与0.5％DMSO或抑制剂组合地加给轴突隔室。用2.5ml含有0.5％DMSO或抑制剂的NBM+MC培养基(含有25ng/ml NGF)替换细胞体隔室。将50μg/ml抗-NGF抗体加给轴突隔室。另一个轴突隔室维持在NGF中作为对照。
在给轴突剥夺NGF28小时和给细胞体剥夺NGF25小时后，将8％PFA/30％蔗糖溶液以1∶1稀释度直接加入培养基中，并温育30分钟。在加入的前15分钟以后，取出特氟隆分配器。在免疫染色之前，用2.5mlPBS洗涤系统1次。将神经元在5％BSA/0.2％triton的PBS溶液中封闭30分钟。将第一抗体Tuj1(Covance)以1∶1000的最终稀释度在含2％BSA的PBS中加入，并在4℃温育过夜。用PBS洗涤平皿1次。将第二抗体(Alexa488山羊抗-小鼠抗体(Invitrogen))以1∶200的最终稀释度在含2％BSA的PBS中加入，并在室温温育1小时。用PBS洗涤平皿2次，并给22x22mm盖玻片(VWR)添加350μl fluoromount G(Electron Microscopy Sciences)。用荧光显微镜观察神经元。
当轴突暴露于表皮生长因子受体(EGFR)激酶抑制剂AG555(ErbBAG5555)(EMB Biosciences)或p38MAP激酶抑制剂SB239(p38MAPKSB239)(EMB Biosciences)时，被剥夺NGF的轴突表现出更少的变性。相比而言，在细胞体隔室中的AG555和SB239处理没有阻止变性。当用转录抑制剂Act D(TranscriptionActD)(Sigma)或糖原合酶激酶-3(GSK-3)抑制剂SB415(SK3SB415)(Sigma)处理细胞体时，轴突中由NGF剥夺引起的轴突降解减少。但是，当直接应用于轴突时，相同的抑制剂没有阻止由NGF剥夺引起的轴突降解。这些结果提示，在局部轴突变性中的信号传递不限于损失的轴突节段；有些抑制剂在应用于细胞体时最有效，而其它抑制剂在应用于轴突时最有效。这些结果的定量显示在图2中。
实施例2-用于鉴定GSK-3调节的参与轴突变性的基因的微阵列分析
基于上述的实验，将糖原合酶激酶-3(GSK-3)鉴定为遗传轴突变性程序的调节剂，其特异性地作用于细胞体以调节远端轴突变性。为了鉴定GSK3调节的轴突变性基因，对在有或没有GSK-3抑制下选择性地发生神经元损失的神经元进行时程微阵列分析。
简而言之，如前所述分离神经元并在Campenot室中培养。建立Campenot室，向培养基中加入50μM的5-氟-2’-脱氧尿苷/尿苷(都得自Sigma)，以减少非神经元细胞的污染。在第5天，用不含NGF的培养基洗涤2个轴突隔室3次，在第4次洗涤时，替换为含有NGF(对照)或NGF抗体(50μg/m1)(911，Genetech)的培养基。给外隔室替换为含有30μMGSK3抑制剂ARA(EMD Biosciences)或0.3％DMSO的培养基。从神经元提取RNA，所述神经元在有或没有GSK3ARA处理下已经用NGF培养或剥夺了NGF6和12小时。用
Figure BDA00003259813000441
(Invitrogen)制备RNA，随后如在
Figure BDA00003259813000442
Kit手册的附录C中所述，用
Figure BDA00003259813000443
Micro Kit进行DNA酶I处理(Qiagen)。对于每种条件，将5个Agilent Whole Mouse Genome微阵列芯片用于单次扩增。
在所述微阵列分析中，将2个基因tbx6和dleu2鉴定为在发生轴突变性的神经元中过表达。如前所述，Tbx6编码转录因子，dleu2编码长非编码RNA。如图3所示，dleu2和tbx6都在剥夺NGF12小时以后的神经元中过表达。但是，在加入GSK3ARA抑制剂的情况下，在任何时间点没有观察到这些基因的过表达。
实施例3-Tbx6和Dleu2敲降减少轴突变性
为了进一步评估dleu2和tbx6在轴突变性中的作用，进行了敲降实验，其中使用siRNA来减少dleu2和tbx6在发生NGF剥夺的神经元中的表达。
简而言之，在胰蛋白酶消化以后，离解E13.5小鼠DRG。单独试验了dleu2和tbx6的3种不同的siRNA。使用下述siRNA：
sidleu2.1：有义(5’-GAUAGGCGAUUAAGGUUUATT-3’)(SEQ ID NO：1)
           反义(5’-UUCAGCUGUGUGAUCCUAGGG-3’)(SEQ IDNO：2)
sidleu2.2：有义(5’-CGGGAAUCAAACAAGUCUATT-3’)(SEQ ID NO：3)
           反义(5’-UAGACUUGUUUGAUUCCCGTT-3’)(SEQ ID NO：4)
sidleu2.3：有义(5’-GAAACACGAUACUUCUUGATT-3’)(SEQ ID NO：5)
           反义(5’-UCAAGAAGUAUCGUGUUUCTG-3’)(SEQ ID NO：6)
sitbx6.1：有义(5’-GAAGAAACUACAACAUGUATT-3’)(SEQ ID NO：7)
           反义(5’-UACAUGUUGUAGUUUCUUCTG-3’)(SEQ ID NO：8)
sitbx6.2：有义(5’-CCUGAUUUGGAUACUUCUATT-3’)(SEQ ID NO：9)
           反义(5’-UAGAAGUAUCCAAAUCAGGGT-3’)(SEQ IDNO：10)
sitbx6.3：有义(5’-CUAGGAUCACACAGCUGAATT-3’)(SEQ ID NO：11)
        反义(5’-UUCAGCUGUGUGAUCCUAGGG-3’)(SEQ IDNO：12)。
使用96孔Amaxa nucleofector系统(Lonza)，将SiRNA递送给细胞。用小鼠基础神经元试剂盒(Lonza)，用600ng siRNA核染(nucleofect)大约200,000个细胞。以25,000个细胞/孔的密度，将细胞铺板在96孔PDL-预包被的用层粘连蛋白(5μg/ml；Invitrogen)包被的BD Biocoat板(BDBiosciences)中。在含有25ng/ml NGF的N3/F12中培养细胞过夜，然后，通过加入NGF抗体(25μg/m1)进行NGF剥夺20小时。细胞用PFA/蔗糖固定，并针对微管蛋白进行标记。
如下进行自动化的连续轴突长度测量。用具有4X物镜的
Figure BDA00003259813000451
(Molecular Devices)，使用具有2X像素混合模式(binning)的基于激光的和基于图像的聚焦，拍摄黑壁96孔BD Biocoat平板的图像。曝光时间为200毫秒。在MetaExpress中，将由9个图像组成的单个孔连到一起。用“血管生成管长(Angiogenesis tube length)”插件分析每个孔。在3-24个孔之间取“每组的管长”或“连续轴突长度”的等效指标的平均值。
在NGF撤除后，轴突通常在20小时内变性。如图4所示，用siRNA减少dleu2和tbx6的表达减少NGF撤除以后的轴突变性。这些数据表明，dleu2和tbx6在NGF-撤除中诱导轴突变性。
还在有组成活性形式的GSK3(GSK3S9A)存在下，进行了类似的实验。GSK3S9A的过表达导致轴突变性。由于tbx6和dleu2增量调节依赖于GSK3，进行了tbx6和dleu2敲降以试验所述敲降是否阻断在GSK3活化下游的轴突变性。
简而言之，从E19Sprague Dawley大鼠胚胎(Charles River)取出海马/皮质组织，并在胰蛋白酶消化后离解。将在
Figure BDA00003259813000461
培养基(Brainbits)中的20,000个活细胞铺板在96孔PDL-预包被的Biocoat平板(BDBiosciences)的每个孔中。在培养5天以后，用组成活性形式的GSK3(S9A)或空载体、合并的siRNA(上面关于tbx6或dleu2描述的3种siRNA)和GFP(作为标志)转染细胞。在表达(6-8DIV)1和3天后，细胞用PFA/蔗糖固定，并用GFP第一抗体(Invitrogen)标记，随后用Alexa fluor-488第二抗体(Invitrogen)标记。
如图5所示，dleu2和tbx6的敲降提供针对GSK活化造成的轴突降解的保护。这些数据支持，GSK3调节轴突变性的包括dleu2和tbx6的增量调节的转录程序。实际上，当在有p38MAP激酶抑制剂存在下给轴突局部地剥夺NGF12小时时，dleu2和tbx6的表达都降低至与在有NGF存在下观察到的值类似的水平。这些数据表明，p38MAP激酶在包括delu2和tbx6的轴突变性转录程序中可能是在GSK的上游。
实施例4-在AD和PD患者中的Tbx6和Dleu2基因表达的分析
在时程微阵列分析中，将2个基因tbx6和dleu2鉴定为在发生轴突变性的神经元中过表达。为了确定这些基因的产物是否在神经变性疾病中起作用，检查了得自患病患者的脑样品，以测量tbx6和dleu2的表达。
使用含有基因表达信息的专有数据库(
Figure BDA00003259813000462
Gene Logic Inc.，Gaithersburg，MD)，分析了人tbx6和dleu2基因表达。使用微阵列特性查看器，进行
Figure BDA00003259813000463
数据库的图形分析。图6是，与正常的未患病的患者相比，得自具有AD的人患者的脑的海马部分中的tbx6和dleu2基因表达的图形表示。在该图的y-轴上的比例尺指示基于杂交信号强度的基因表达水平。图6显示了患病的脑组织中的txb6和dleu2基因表达与它们的正常对应物相比的增加，这指示，这些基因参与AD和PD人疾病，并且因而是AD的生物标志。
Figure IDA00003259813500011
Figure IDA00003259813500021

Claims (32)

1.诊断受试者的神经变性疾病的方法，所述方法包括：确定所述受试者是否包含这样的细胞，所述细胞以大于相应基因在参照样品中的表达水平表达基因tbx6和dleu2中的至少一个，其中所述细胞的存在指示所述受试者患有神经变性疾病。
2.监测接受神经变性疾病治疗的受试者的疾病的方法，所述方法包括：确定所述受试者是否包含这样的细胞，所述细胞以大于相应基因在参照样品中的表达水平表达基因tbx6和dleu2中的至少一个，其中所述细胞的存在指示所述受试者需要对所述神经变性疾病的继续治疗。
3.评估受试者的发生神经变性疾病的素质的方法，所述方法包括：确定所述受试者是否包含这样的细胞，所述细胞以大于相应基因在参照样品中的表达水平表达基因tbx6和dleu2中的至少一个，其中所述细胞的存在指示所述受试者发生神经变性疾病的素质。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其中所述细胞是神经元。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述方法还包括：从所述受试者获得生物样品。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物样品选自由下列各项组成的组：脑脊液、脑组织、全血、血浆和血清。
7.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中确定所述受试者是否包含表达基因tbx6和dleu2中的至少一个的细胞在体内进行。
8.确定神经元是否处于神经元变性风险中和/或神经元是否正在发生神经元变性的方法，所述方法包括：确定所述神经元是否以大于相应基因在没有发生神经元变性的神经元中的表达水平表达基因tbx6和dleu2中的至少一个，其中基因tbx6和dleu2中至少一个的增加的表达指示所述神经元处于神经元变性风险中和/或正在发生神经元变性。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的方法，其中基于RNA表达或蛋白表达或其组合，确定基因tbx6和dleu2中的至少一个的表达水平。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中使用PCR方法、微阵列芯片或其组合，确定基因tbx6和dleu2中的至少一个的表达。
11.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中使用免疫测定法确定基因tbx6和dleu2基因中的至少一个的表达。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述免疫测定法是ELISA。
13.根据权利要求1-12中的任一项所述的方法，其中使用PCR方法、微阵列芯片或其组合测量dleu2的表达，并使用免疫测定法测量tbx6的表达。
14.根据权利要求1-4和7-9中的任一项所述的方法，其中使用选自由下列各项组成的组的成像方法确定基因tbx6和dleu2中的至少一个的表达：磁共振成像(MRI)、正电子发射体层摄影术(PET)、单光子发射体层摄影术(SPECT)、x-射线计算机体层摄影术(CT)、荧光介导的分子体层摄影术(FMT)、荧光反射成像(FRI)、生物发光成像(BLI)、γ成像和磁共振分光术。
15.根据权利要求1-14中的任一项所述的方法，其中确定tbx6和dleu2二者的表达。
16.根据权利要求1-15中的任一项所述的方法，其中所述神经变性疾病选自由下列各项组成的组：阿尔茨海默病(AD)、雷维小体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆复征；以及基于淀粉样蛋白或与淀粉样蛋白相关的其它疾病，诸如进行性核上性麻痹、多发性硬化、克-雅病、帕金森病、HIV相关的痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化)、成年型糖尿病、老年心脏淀粉样变性、内分泌肿瘤、青光眼、亚历山大病、阿尔珀斯病、共济失调毛细血管扩张症、巴腾病(也被称作Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、牛海绵状脑病(BSE)、卡纳范病、科凯恩综合征、皮质基底节变性、亨廷顿病、肯尼迪病、克拉伯病、神经系统亚速尔病(脊髓小脑性共济失调3型)、多系统萎缩、神经疏螺旋体病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、皮克病、原发性侧索硬化、朊病毒病、雷夫叙姆病、桑德霍夫病、希尔德病、继发于恶性贫血的脊髓亚急性联合变性、精神分裂症、脊髓小脑性共济失调(具有不同特征的多种类型)、脊髓性肌萎缩、斯-理-奥病、脊髓痨、进行性神经性腓肠肌萎缩症、地中海热、默-韦综合征、自发性骨髓瘤、淀粉样多神经病、淀粉样心肌病、系统性老年淀粉样变性、淀粉样多神经病、遗传性脑出血伴淀粉样变性、唐氏综合征、格-施-沙综合征、甲状腺髓样癌、孤立性心房淀粉样变性、透析患者中β2-微球蛋白淀粉样变性、包涵体肌炎、肌肉萎缩疾病中的β2-淀粉样蛋白沉积、胰岛Ⅱ型糖尿病胰岛素瘤和其它淀粉样变性相关的疾病。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默病(AD)。
18.试剂盒，其包括：用于检测基因tbx6和dleu2中的至少一个的表达的探针和说明书，所述说明书关于使用所述探针来确定受试者是否包含这样的细胞，所述细胞以大于相应基因在正常参照样品中的表达水平表达基因tbx6和dleu2中的至少一个。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述细胞的存在指示所述受试者患有神经变性疾病。
20.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述细胞的存在指示所述受试者需要对所述神经变性疾病的继续治疗。
21.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述细胞的存在指示受试者的发生神经变性疾病的素质。
22.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述细胞的存在指示所述细胞正在发生或易感神经变性。
23.根据权利要求18-22中的任一项所述的试剂盒，其中所述细胞是神经元。
24.根据权利要求18-23中的任一项所述的试剂盒，其中所述探针被标记。
25.根据权利要求18-24中的任一项所述的试剂盒，其中所述探针选自由下列各项组成的组：多核苷酸、抗体或其组合。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述抗体选自由下列各项组成的组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fv片段、Fab片段、Fab’片段和F(ab’)2片段。
27.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述多核苷酸是反义多核苷酸。
28.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述多核苷酸是肽核酸(PNA)。
29.根据权利要求18-28中的任一项所述的试剂盒，其中所述探针与脑靶向肽缀合。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述脑靶向肽选自由下列各项组成的组：胰岛素、转铁蛋白、抗-转铁蛋白受体的抗体或其片段。
31.根据权利要求18-30中的任一项所述的试剂盒，其中所述神经变性疾病选自由下列各项组成的组：阿尔茨海默病(AD)、雷维小体痴呆、唐氏综合征、遗传性脑出血伴淀粉样变性(荷兰型)；关岛帕金森-痴呆复征；以及基于淀粉样蛋白或与淀粉样蛋白相关的其它疾病，诸如进行性核上性麻痹、多发性硬化、克-雅病、帕金森病、HIV相关的痴呆、ALS(肌萎缩性侧索硬化)、成年型糖尿病、老年心脏淀粉样变性、内分泌肿瘤、青光眼、亚历山大病、阿尔珀斯病、共济失调毛细血管扩张症、巴腾病(也被称作Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、牛海绵状脑病(BSE)、卡纳范病、科凯恩综合征、皮质基底节变性、亨廷顿病、肯尼迪病、克拉伯病、神经系统亚速尔病(脊髓小脑性共济失调3型)、多系统萎缩、神经疏螺旋体病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、皮克病、原发性侧索硬化、朊病毒病、雷夫叙姆病、桑德霍夫病、希尔德病、继发于恶性贫血的脊髓亚急性联合变性、精神分裂症、脊髓小脑性共济失调(具有不同特征的多种类型)、脊髓性肌萎缩、斯-理-奥病、脊髓痨、进行性神经性腓肠肌萎缩症、地中海热、默-韦综合征、自发性骨髓瘤、淀粉样多神经病、淀粉样心肌病、系统性老年淀粉样变性、淀粉样多神经病、遗传性脑出血伴淀粉样变性、唐氏综合征、格-施-沙综合征、甲状腺髓样癌、孤立性心房淀粉样变性、透析患者中的β2-微球蛋白淀粉样变性、包涵体肌炎、肌肉萎缩疾病中的β2-淀粉样蛋白沉积、胰岛II型糖尿病胰岛素瘤和其它淀粉样变性相关的疾病。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默病。
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