KR20130142144A - 신경변성 질환 또는 장애의 검출 방법 - Google Patents

신경변성 질환 또는 장애의 검출 방법 Download PDF

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마크 첸
라이언 제이. 왓츠
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 신경변성 질환 또는 장애의 확인, 진단 및 예후 방법을 제공한다. 뉴런이 신경변성의 위험에 있거나 신경변성을 겪고 있는지의 여부를 결정하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나가 과다발현되는지의 여부를 결정하는 것을 포함한다.

Description

신경변성 질환 또는 장애의 검출 방법 {METHODS FOR DETECTING NEURODEGENERATIVE DISEASES OR DISORDERS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2010년 11월 29일 출원된 미국 가출원 번호 61/417,701 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 우선권 주장한다.
분야
신경변성 질환 또는 장애 (예를 들어, 알츠하이머병)의 확인, 진단, 모니터링 및 예후 방법이 제공된다.
본 발명은 신경변성 질환 또는 장애, 예컨대 알츠하이머병의 진단 및 치료를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
알츠하이머병 (AD)은 인지 기능 상실 및 치매를 유발하는 신경변성 장애이다. 문헌 [Ray et al., Nat. Med. 13:1359-1362 (2007)]. AD의 물리적 특징은 신경원섬유 엉킴 (NFT), 및 비정상적 타우 필라멘트 및 β-아밀로이드 (Aβ) 피브릴의 축적에 의해 형성된 노인성 플라크로 구성된 뇌내 병변의 존재이다. 문헌 [Shaw et al., Nat. Rev. 6:295-303 (2007)]. 플라크 축적의 주 원인이 되는 단백질은 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 및 2종의 프레세닐린 (프레세닐린 I 및 프레세닐린 II)을 포함한다. 구성적으로 발현되며 대부분의 세포에서 이화되는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 효소 β 및 γ 세크레타제에 의한 순차적 절단은 39 내지 43개 아미노산의 Aβ 펩티드 방출로 이어진다. APP의 분해는 플라크에서 응집되는 그의 경향을 증가시킬 가능성이 있다. 특히, C-말단에 있는 2개의 매우 소수성인 아미노산 잔기로 인해 고도의 응집체 구축 경향을 갖는 Aβ (1-42) 단편이 있다. 따라서, Aβ (1-42) 단편은 주로 AD에서의 신경염성 플라크 형성의 개시에 연루되어 그의 원인이 되며 이에 따라 고도의 병리학적 가능성을 갖는 것으로 여겨진다. 과학적인 증거들은 플라크 중 Aβ 단백질의 생성 및 축적 증가가 신경 세포 사멸로 이어지며, 이는 AD의 발병 및 진행에 기여한다는 것을 입증한다.
AD의 증상은 서서히 나타나며, 첫번째 증상은 단지 가벼운 건망증일 수 있다. 이 단계에서, 개체는 최근의 사건, 활동, 친숙한 사람 또는 물건의 이름을 잊어버릴 수 있고, 단순한 수학 문제를 풀 수 없을 수 있다. 질환이 진행됨에 따라, 증상은 보다 쉽게 알아차릴 수 있게 되고, 매우 심각해져, AD를 앓는 사람 또는 그의 가족 구성원이 의학적 도움을 모색하게 된다. AD의 중간-단계 증상은 단순 작업, 예컨대 몸단장의 방법을 잊어버리는 것을 포함하고, 문제는 말하기, 이해하기, 읽기 또는 쓰기로 발달한다. 후기 단계 AD 환자는 불안해하거나 공격적으로 될 수 있고, 집을 잃을 수 있고, 궁극적으로는 총체적 관리를 필요로 하게 된다.
현재, AD를 진단하는 유일한 명확한 방법은 개체의 사망 후에 부검으로 뇌 조직 내의 플라크 및 엉킴을 확인하는 것이다. 따라서, 의사는 사람이 살아있는 동안에는 단지 "가능성있는" 또는 "개연성있는" AD인 것으로만 진단할 수 있다. 현행 방법을 이용하여, 의사는 "개연성있는" AD인 것으로 진단하기 위한 여러 도구를 이용하여 AD를 진단할 수 있다. 의사는 사람의 전반적 건강, 과거의 의학적 문제, 및 사람이 일상적 활동을 수행하는데 있어서의 임의의 어려움에 관한 병력에 대해 질문을 한다. 기억, 문제 풀기, 주의력, 계산 및 언어의 행동 시험은 인지 변성에 대한 정보를 제공하고, 의학적 시험, 예컨대 혈액, 소변 또는 척수액의 시험, 및 뇌 스캔은 약간의 추가 정보를 제공할 수 있다.
환자가 AD로 진단될 때쯤에 질환은 이미 수 년 동안 진행되어 온 것으로 여겨진다. 사실상, 신경변성 질환, 예컨대 AD의 개시 및 진행을 이해하는 것, 뿐만 아니라 뉴런의 변성에 대한 근거가 되거나 뉴런이 변성되기 쉽게 만드는 메카니즘을 밝혀내는 것은 신경변성 질환 및 장애의 발병, 진행 및 진단을 예후하는데 도움이 되는 바이오마커의 확인에 조력할 것이다. 따라서, 신경변성 질환 및 장애를 정확하게 진단할 뿐만 아니라 질환의 진행을 모니터링하고 신경변성 질환 및 장애의 발병 위험에 있는 것을 검출하기 위한 바이오마커의 필요성이 여전히 존재한다.
특허 출원 및 공보를 비롯한 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
본 발명은 신경변성 장애 및/또는 발현이 신경변성, 및 신경변성 질환 또는 장애, 예컨대 알츠하이머병 (AD)의 존재 및/또는 정도와 연관되어 있는 유전자의 확인을 적어도 부분적으로 기반으로 하는 장애의 확인, 진단, 모니터링 및 예후 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은, 대상체가 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 참조 샘플에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는 세포를 포함하는지의 여부를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 상기 세포의 존재는 대상체가 신경변성 장애를 갖는 것을 나타내는 것인, 대상체에서 상기 신경변성 장애를 진단하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은, 대상체가 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 참조 샘플에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는 세포를 포함하는지의 여부를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 상기 세포의 존재는 대상체가 신경변성 장애에 대한 지속적 치료를 필요로 하는 것을 나타내는 것인, 신경변성 장애에 대해 치료된 대상체에서 질환을 모니터링하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은, 대상체가 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 참조 샘플에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는 세포를 포함하는지의 여부를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 상기 세포의 존재는 신경변성 장애가 발병할 대상체에 대한 소인을 나타내는 것인, 신경변성 장애가 발병할 대상체의 소인을 평가하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은, 뉴런이 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 뉴런 변성을 겪지 않은 뉴런에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는지의 여부를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나의 증가된 발현은 뉴런이 뉴런 변성의 위험에 있고/거나 뉴런 변성을 겪고 있는 것을 나타내는 것인, 뉴런이 뉴런 변성의 위험에 있고/거나 뉴런 변성을 겪고 있는지의 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
당업자에게 명백할 바와 같이, 본 발명의 임의의 방법에서, 유전자의 증가된 발현의 검출은 신경변성 장애의 특성 (예를 들어, 존재, 단계 또는 정도)을 명확하게 나타낼 것인 반면, 유전자의 증가된 발현의 비-검출은 또한 질환의 상반하는 특성화를 제공함으로써 정보를 제공할 것이다.
본 발명의 한 측면에서, 신경변성 질환 또는 장애는 알츠하이머병 (AD), 루이 소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증을 수반하는 유전성 뇌출혈 (네덜란드 유형); 괌 파킨슨-치매 복합증; 뿐만 아니라 아밀로이드-유사 단백질을 기반으로 하거나 또는 이와 연관된 다른 질환, 예컨대 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증, 크로이츠펠트 야콥병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, ALS (근위축성 측삭 경화증), 성인 발병 당뇨병, 노인성 심장 아밀로이드증, 내분비 종양, 녹내장, 알렉산더병, 알퍼병, 모세혈관확장성 운동실조, 배튼병 (또한 스필마이어-보그트-쇼그렌-배튼병으로도 공지됨), 소 해면상 뇌병증 (BSE), 카나반병, 코케인 증후군, 피질기저 변성, 헌팅톤병, 케네디병, 크라베병, 마차도-요셉병 (제3형 척수소뇌성 운동실조), 다계통 위축, 신경보렐리아증, 펠리제우스-메르츠바허병, 픽병, 원발성 측삭 경화증, 프리온 질환, 레프숨병, 샌드호프병, 쉴더병, 악성 빈혈에 속발성인 척수의 아급성 연합 변성, 정신분열증, 척수소뇌성 운동실조 (다양한 특성을 갖는 다중 유형), 척수성 근육 위축, 스틸-리차드슨-올스제위스키병, 척수로, 샤르코-마리-투스병, 지중해열, 머클-웰스 증후군, 특발성 골수종, 아밀로이드 다발신경병증, 아밀로이드 심근병증, 노인성 전신 아밀로이드증, 아밀로이드 다발신경병증, 아밀로이드증을 수반하는 유전성 뇌출혈, 다운 증후군, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군, 갑상선의 수질 암종, 고립성 심방 아밀로이드, 투석 환자에서의 β2-마이크로글로불린 아밀로이드, 봉입체 근염, 근육 소모 질환에서의 β2-아밀로이드 침착물, 랑게르한스섬 제II형 당뇨병 인슐린종 및 다른 아밀로이드증-관련 질환이다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체가 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 참조 샘플에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는 세포를 포함하는지의 여부를 결정하는 것이 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나에 대한 RNA 및/또는 단백질 발현 수준을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 예에서, tbx6 발현은 단백질 발현 또는 RNA 발현 수준에 기반하여 결정되고, dleu2 발현은 RNA 발현 수준에 기반하여 결정된다. 본 발명의 다른 예에서, tbx6 및 dleu2 둘 모두의 발현 수준이 결정된다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체가 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 참조 샘플에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는 세포를 포함하는지의 여부를 결정하는 것이 대상체로부터 생물학적 샘플을 채취하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 예에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청을 비롯한 혈액, 소변, 뇌척수액, 뇌 조직 (예를 들어, 생검), 눈물 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체가 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 참조 샘플에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는 세포를 포함하는지의 여부를 결정하는 것이 생체내에서 수행되며 대상체로부터 생물학적 샘플을 채취하는 것을 필요로 하지 않는 것인 방법을 제공한다. 예를 들어, 방법은 검출가능한 양 또는 유효량의 표지된 프로브를 대상체에게 투여하는 것, 및 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나의 발현을 검출하는 것을 포함할 수 있다.
대상체가 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 참조 샘플에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는 세포를 포함하는지의 여부를 결정하기 위한 본 발명의 방법에서의 단계는 RNA 발현을 검출하는 검정 또는 면역조직화학 검정을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 시험관내 검정 포맷으로 수행될 수 있다. 본 발명의 특정 예에서, 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나의 발현은 PCR 방법, 마이크로어레이 칩 또는 면역검정 (예를 들어, ELISA) 또는 상기 방법의 조합을 이용하여 결정된다.
생물학적 샘플을 채취하지 않고 생체내에서 대상체가 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 참조 샘플에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는 세포를 포함하는지의 여부를 결정하기 위한 본 발명의 방법에서의 단계는 감마 영상화, 자기 공명 영상화 (MRI), 자기 공명 분광분석법, 형광 분광분석법, 양전자 방출 단층촬영 (PET), 단일 광자 방출 단층촬영 (SPECT), X선 컴퓨터 단층촬영 (CT), 형광-매개 분자 단층촬영 (FMT), 형광 반사 영상화 (FRI), 생물발광 영상화 (BLI)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 영상화 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
대상체가 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 참조 샘플에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는 세포를 포함하는지의 여부를 결정하기 위한 본 발명의 방법에서의 단계는 표지된 프로브를 사용하여 결정될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 폴리뉴클레오티드, 항체 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드 프로브는 안티센스 폴리뉴클레오티드 및/또는 펩티드 핵산 (PNA) 프로브이다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항체 프로브는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab')2 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법의 다른 측면에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 뇌 표적화 펩티드에 접합된다. 특정 측면에서, 뇌 표적화 펩티드는 운반체-매개 수송 또는 수용체-매개 세포투과를 통해 혈뇌 장벽 (BBB)을 가로지르는 수송을 가능하게 한다. 이러한 뇌 표적화 펩티드의 예는 인슐린, 트랜스페린, 또는 혈뇌 장벽 (BBB) 상의 수송 수용체, 예컨대 인슐린 수용체, 트랜스페린 수용체, 렙틴 수용체, GLUT1 글루코스 수송체, MCT1 락테이트 수송체, LAT1 대형 중성 아미노산 수송체 및 CNT2 아데노신 수송체에 결합하는 수용체 특이적 펩티드모방체 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 본원에 기재된 바와 같은 표지, 예를 들어 방사성핵종, 방사성동위원소 또는 동위원소 및 형광 염료를 포함할 수 있다. 표지는 프로브에 혼입, 부착 또는 접합될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나의 발현을 검출하기 위한 표지된 프로브, 및 대상체가 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 정상의 참조 샘플에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는 세포를 포함하는지의 여부를 결정하기 위한 프로브의 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 키트는 신경변성 질환 및/또는 장애가 발병할 대상체에 대한 소인을 진단, 모니터링 및/또는 평가하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 키트는 뉴런이 신경변성의 위험에 있고/거나 신경변성을 겪고 있는지의 여부를 결정하기 위한 것이다.
다른 실시양태에서, 키트는 폴리뉴클레오티드, 항체 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 표지된 프로브를 포함한다. 특정 측면에서, 항체 프로브는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 측면에서, 프로브는 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드 핵산 (PNA)이다. 다른 측면에서, 프로브는 표지되고/거나 본원에 기재된 바와 같은 뇌 표적화 펩티드에 접합된다.
도 1은 캄페노트(Campenot) 챔버를 이용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행된 실험의 개략 다이어그램이며, 여기서 뉴런의 몸체 (세포체) 및 축삭 환경은 분리되어 있다.
도 2는 실시예 1에 기재된 바와 같은 실험의 결과를 보여주는 그래프이다. 구체적으로, 뉴런을 캄페노트 챔버에서 배양하였고, 여기서 세포체 부분은 억제제의 존재 또는 부재 하에 NGF를 함유하였고, 축삭 부분은 억제제의 존재 또는 부재 하에 NGF 회수 대상이 되었다. 하기 억제제를 사용하였다: 표피 성장 인자 수용체 키나제 억제제 AG555 (ErbBAG555); p38 MAP 키나제 억제제 SB239 (p38MAPKSB239); 전사 억제제 악티노마이신 D (전사ActD); 및 GSK3 억제제 SB415 (GSK3SB415). 도 2에서 확인할 수 있듯이, 악티노마이신 D 및 SB415는 둘 다 뉴런의 세포체 부분에 적용할 경우 (세포체 억제)에는 축삭 변성을 방지하였지만, 축삭에 직접적으로 적용할 경우 (축삭 억제)에는 동일한 보호 효과를 제공하지 않았다. 추가로, 직접적으로 축삭에 적용할 경우에 AG555 및 SB239는 축삭 변성을 방지하였지만, 직접적으로 세포체에 적용할 경우에는 동일한 보호 효과를 제공하지 않았다.
도 3은 축삭 손실을 선택적으로 겪은 뉴런에 대한 경시적 마이크로어레이 실험의 결과를 보여준다. 상부 패널은 실시예 2에 기재된 바와 같은 실험의 개략 다이어그램이다. dleu2 및 tbx6은 둘 다 12시간까지 축삭 변성을 경험하는 뉴런에서 상향조절된다. dleu2 및 tbx6의 증가된 발현은 GSK3 억제제 GSK3.ARA의 존재 하에 배양된 뉴런에서 관찰되지 않는다.
도 4는 실시예 3에 기재된 바와 같은 dleu2 및 tbx6 녹다운 실험의 결과를 도시한다. 뉴런에서의 두 유전자 모두의 녹다운은 NGF 회수 후에 감소된 축삭 변성을 일으킨다.
도 5는 실시예 3에 기재된 바와 같은 dleu2 및 tbx6 녹다운 실험의 결과를 도시한다. 뉴런에서의 두 유전자 모두의 녹다운은 구성적으로 활성인 GSK3 돌연변이체, GSK3S9A의 존재 하에 감소된 축삭 변성을 일으킨다.
도 6은 정상 인간 환자와 비교한, 알츠하이머병 (AD)으로 진단된 인간 대상체로부터의 뇌의 해마 부분에서의 tbx6 및 dleu2 발현의 플롯이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 전문 학술 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley ＆ Sons (New York, N.Y. 1994), 및 March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley ＆ Sons (New York, N.Y. 1992)]은 당업자에게 본 출원에 사용된 수많은 용어에 대한 일반적인 지침을 제공한다.
본 발명자들은 대상체에서 신경변성 질환 또는 장애를 진단하고 신경변성 질환 또는 장애를 예후하고 신경변성 질환 또는 장애를 모니터링하는데 (예를 들어, AD 환자에서 질환 진행을 추적하는데 (이는 AD 환자에서 의학적 요법의 효과를 추적하는데 유용할 수 있음)) 유용한 생화학적 마커를 발견하였다. 추가로, 생화학적 마커는 신경변성을 겪을 위험에 있는 뉴런을 확인하는데 유용하다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 바이오마커는 환자 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액, 뇌척수액 및/또는 뇌 조직에 존재한다.
특정 정의
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 존재하는 경우에 중합체의 어셈블리 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해, 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어 "캡(cap)", 1개 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 예를 들어 비하전된 연결을 갖는 것 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결을 갖는 것 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 모이어티, 예컨대 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 인터칼레이터 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 것, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 연결을 갖는 것 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등), 뿐만 아니라 비변형된 형태의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 추가로, 당에 본래 존재하는 임의의 히드록실 기는 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기에 의해 대체되거나, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 또는 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결을 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 또는 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사한 형태, 예컨대 예를 들어 2'-O-메틸-2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비-시클릭 유사체 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결이 대안적 연결기로 대체될 수 있다. 이들 대안적 연결기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈")로 대체된 실시양태를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H, 또는 에테르(-O-) 연결을 임의로 함유하는 치환 또는 비치환된 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알딜이다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기 기재는 RNA 및 DNA를 비롯하여 본원에 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드"는, 반드시는 아니지만 일반적으로 길이가 약 250개 뉴클레오티드 미만인 단일-가닥 합성 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 동일하고 완전하게 적용가능하다.
용어 "프라이머"는 일반적으로, 핵산에 혼성화되고 일반적으로 유리 3'-OH 기를 제공함으로써 상보적 핵산의 중합을 가능하게 할 수 있는 짧은 단일 가닥 폴리뉴클레오티드이다.
용어 "어레이" 또는 "마이크로어레이"는 기판 상의 혼성화가능 어레이 요소, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 프로브 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 정렬된 배열을 지칭한다. 상기 기판은 고체 기판, 예를 들어 유리 슬라이드, 또는 반-고체 기판, 예컨대 니트로셀룰로스 막일 수 있다.
용어 "증폭"은 하나 이상의 카피의 참조 핵산 서열 또는 그의 상보체의 생산 과정을 지칭한다. 증폭은 선형 증폭 또는 지수 증폭 (예를 들어, PCR)일 수 있다. "카피"가 반드시 주형 서열에 대해 완벽한 서열 상보성 또는 동일성을 의미하는 것은 아니다. 예를 들어, 카피는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 데옥시이노신, 인위적인 서열 변경 (예컨대, 주형에 혼성화가능하지만 완전히 상보성이지는 않은 서열을 포함하는 프라이머를 통해 도입된 서열 변경), 및/또는 증폭 동안 발생하는 서열 오류를 포함할 수 있다.
용어 "검출"은 직접 및 간접 검출을 비롯한 임의의 검출 수단을 포함한다.
"상승된 발현" 또는 "상승된 수준"은 대조군, 예컨대 신경변성 장애를 앓고 있지 않은 개체 또는 개체들 및/또는 미리 결정된 역치 수준에 비하여, 환자에서의 mRNA 또는 단백질의 증가된 발현을 지칭한다.
대상체 또는 제1 샘플 (예를 들어, 대상체로부터 채취한 생물학적 샘플)에서의 유전자 또는 바이오마커의 발현 수준/양이 제2 샘플 (예를 들어, 대조 샘플 또는 참조 샘플)에서의 유전자 또는 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 1.5배, 1.75배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배인 경우에, 대상체에서의 또는 제1 샘플에서의 유전자 또는 바이오마커의 발현/양은 제2 샘플에서의 수준보다 "더 높은" 수준에 있다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 실험적으로 계산된다. 일반적으로, 프로브가 길수록 적절한 어닐링을 위해 더 높은 온도가 필요하고, 프로브가 짧으면 보다 낮은 온도가 필요하다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 그의 용융 온도 미만의 환경에 존재할 때 변성 DNA가 재어닐링되는 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능 서열 사이의 바람직한 상동성 정도가 높을수록 사용될 수 있는 상대적 온도가 더 높다. 그 결과, 보다 높은 상대적 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 만들고, 보다 낮은 온도는 덜 엄격하게 만드는 경향이 있다. 혼성화 반응의 엄격도에 대한 추가의 상세한 내용 및 설명에 대해서는 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)]을 참조한다.
본원에 정의된 바와 같은 "엄격한 조건" 또는 "고 엄격도 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도를 이용하는 것 (예를 들어, 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 나트륨 도데실 술페이트); (2) 혼성화 동안 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 50% (v/v) 포름아미드 + 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5) + 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨 (42℃)을 사용하는 것; 또는 (3) 42℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨)로 10분 세척, 이어서 0.1 x SSC (EDTA 함유) (55℃)로 이루어진 10분 고-엄격도 세척과 함께 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트(Denhardt) 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA (50 μg/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 술페이트 (42℃)를 사용하는 용액 중에서 밤새 혼성화하는 것에 의해 확인될 수 있다.
"중간 정도의 엄격한 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인될 수 있고, 상기 기재된 것보다 낮은 엄격도의 세척 용액 및 혼성화 조건 (예를 들어, 온도, 이온 강도 및 %SDS)을 포함한다. 중간 정도의 엄격한 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 변성 전단 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 필터를 약 37-50℃에서 1 x SSC로 세척하는 것이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자에 적합화하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등의 조정 방법을 인지할 것이다.
본원에 사용된 용어 "바이오마커" 또는 "생화학적 마커"는 일반적으로, 포유동물 조직 또는 세포 내에서의 또는 포유동물 조직 또는 세포 상에서의 발현이 표준 방법 (또는 본원에 개시된 방법)에 의해 검출될 수 있으며 신경변성에 대한 포유동물 세포 또는 조직의 감수성을 예측, 진단 및/또는 예후하는 것인, 유전자, 단백질, 탄수화물 구조체, 또는 당지질을 비롯한 분자를 지칭한다. 추가로, 본원에 사용된 "바이오마커"는, 예를 들어 대상체에서 또는 대상체로부터 채취한 생물학적 샘플에서 시험관내 또는 생체내 검출될 수 있는 환자의 병리학적 상태의 지표를 지칭한다.
용어 "신경변성 질환" 및 "신경변성 장애"는, 병리상태가 뉴런 변성 및/또는 기능장애를 수반하는 것인 모든 장애, 예컨대 비제한적으로 말초 신경병증, 운동뉴런 장애, 예컨대 근위축성 측삭 경화증 (ALS, 루게릭병), 벨 마비, 및 척수성 근육 위축 또는 마비를 수반하는 다양한 상태; 다른 인간 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머병 (AD), 루이 소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증을 수반하는 유전성 뇌출혈 (네덜란드 유형); 괌 파킨슨-치매 복합증; 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증, 간질, 크로이츠펠트 야콥병, 신경 난청, 메니에르병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, 성인 발병 당뇨병, 노인성 심장 아밀로이드증, 내분비 종양, 녹내장, 알렉산더병, 알퍼병, 모세혈관확장성 운동실조, 배튼병 (또한 스필마이어-보그트-쇼그렌-배튼병으로도 공지됨), 소 해면상 뇌병증 (BSE), 카나반병, 코케인 증후군, 피질기저 변성, 헌팅톤병, 케네디병, 크라베병, 마차도-요셉병 (제3형 척수소뇌성 운동실조), 다계통 위축, 신경보렐리아증, 펠리제우스-메르츠바허병, 픽병, 원발성 측삭 경화증, 프리온 질환, 레프숨병, 샌드호프병, 쉴더병, 악성 빈혈에 속발성인 척수의 아급성 연합 변성, 정신분열증, 척수소뇌성 운동실조 (다양한 특성을 갖는 다중 유형), 척수성 근육 위축, 스틸-리차드슨-올스제위스키병, 척수로, 샤르코-마리-투스병, 지중해열, 머클-웰스 증후군, 특발성 골수종, 아밀로이드 다발신경병증, 아밀로이드 심근병증, 노인성 전신 아밀로이드증, 아밀로이드 다발신경병증, 아밀로이드증을 수반하는 유전성 뇌출혈, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군, 갑상선의 수질 암종, 고립성 심방 아밀로이드, 투석 환자에서의 β2-마이크로글로불린 아밀로이드, 봉입체 근염, 근육 소모 질환에서의 β2-아밀로이드 침착물, 랑게르한스섬 제II형 당뇨병 인슐린종 및 다른 아밀로이드증-관련 질환을 포함하도록 가장 넓은 의미로 사용된다.
"말초 신경병증"은 말초 신경에 영향을 주는 신경변성 장애로, 가장 흔하게는 운동, 감각, 감각운동 또는 자율 기능장애 중 하나 또는 이들의 조합으로 나타난다. 말초 신경병증은, 예를 들어 유전적으로 획득될 수 있거나, 전신 질환으로 인한 것일 수 있거나, 또는 독성 작용제, 예컨대 신경독성 약물, 예를 들어 항신생물제, 또는 산업적 또는 환경적 오염물질에 의해 유도될 수 있다. "말초 감각 신경병증"은 말초 감각 뉴런의 변성을 특징으로 하고, 특발성일 수 있으며, 예를 들어 당뇨병 (당뇨병성 신경병증), 암에서의 세포증식억제 약물 요법 (예를 들어, 빈크리스틴, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 3'-아지도-3'-데옥시티미딘 또는 탁산, 예를 들어 파클리탁셀 [탁솔(TAXOL)®, 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 뉴저지주 프린스톤] 및 도세탁셀 [탁소테레(TAXOTERE)®, 롱-프랑 로라(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니]과 같은 화학요법제로의 치료), 알콜중독, 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS) 또는 유전적 소인으로 인해 발생할 수 있다. 유전적으로 획득된 말초 신경병증은, 예를 들어 레프숨병, 크라베병, 이염성 백질이영양증, 파브리병, 데제린-소타스 증후군, 무베타지단백혈증 및 샤르코-마리-투스병 (CMT) (또한 비골 근육 위축 또는 유전성 운동 감각 신경병증 (HMSN)으로도 공지되어 있음)을 포함한다. 말초 신경병증의 대부분의 유형은 수개월 또는 수년의 기간에 걸쳐서 서서히 발병한다. 임상적 관행에서는 이러한 신경병증을 만성이라 일컫는다. 때때로, 말초 신경병증은 수일의 기간에 걸쳐 신속하게 발병하며, 급성으로 지칭된다. 말초 신경병증은 통상적으로 감각 신경과 운동 신경에 함께 영향을 주어서 혼합 감각 및 운동 신경병증을 유발하지만, 순수한 감각 및 순수한 운동 신경병증도 또한 공지되어 있다.
용어 "진단"은 분자 또는 병리학적 상태, 질환 또는 상태의 확인 또는 분류, 예컨대 신경변성 장애, 예를 들어 AD의 확인을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "예후"는 신경변성 장애-그로 인한 질환 증상의 가능성의 예측을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 용어 "예측"은 환자가 약물 또는 약물 세트에 대해 유리하게 또는 불리하게 반응할 가능성을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 한 실시양태에서, 예측은 이러한 반응의 정도에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 예측은 환자가 치료, 예를 들어 특정한 치료제를 사용한 치료 이후에 질환의 재발 없이 특정 기간 동안 생존하거나 개선되는지의 여부 및/또는 그러할 확률에 관한 것이다. 본 발명의 예측 방법은 임의의 특정한 환자에 대한 가장 적절한 치료 양식을 선택하여 치료를 결정하는데 임상적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 예측 방법은 환자가 치료 요법, 예컨대 주어진 치료 요법, 예컨대 예를 들어 주어진 치료제 또는 조합물의 투여, 수술적 개입, 스테로이드 치료 등에 유리하게 반응할 것인지의 여부 또는 치료 요법 후에 환자의 장기간 생존이 가능한지의 여부를 예측할 때 가치있는 도구이다.
본원에 사용된 "치료"는 치료되는 개체 또는 세포의 자연적인 과정을 변경시키기 위한 시도의 임상적 개입을 나타내고, 임상 병리학의 진행 전에 또는 진행 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환 증상의 발생 또는 재발의 예방, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병적 결과의 경감, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 고식, 및 예후의 차도 또는 개선을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 질환 또는 장애의 발병을 지연시키기 위한 시도에서 유용하다.
"유효량"은 목적하는 치료, 진단 또는 예방 결과 달성에 필요한 투여량에서 이러한 기간 동안 유효한 양을 지칭한다.
"개체", "대상체" 또는 "환자"는 척추동물이다. 특정 실시양태에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물은 영장류 (인간 및 비-인간 영장류 포함) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
"대조 대상체"는 신경변성 장애 (예를 들어, AD)를 갖는 것으로 진단되지 않고 신경변성 장애 (예를 들어, AD)와 연관된 어떠한 징후 또는 증상도 겪지 않는 건강한 대상체를 지칭한다. 대조 대상체는 또한 신경변성 장애, 예컨대 AD의 어떠한 가족력도 갖지 않는 건강한 대상체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "샘플"은 예를 들어 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리학적 특징을 기초로 하여 특성화 및/또는 확인되는 세포성 및/또는 다른 분자 엔티티를 함유하는 관심 있는 대상으로부터 얻거나 상기 대상으로부터 유도된 조성물을 의미한다. 예를 들어, 어구 "질환 샘플" 및 그의 변형은 특성화되는 세포성 및/또는 분자 엔티티를 함유하는 것으로 예상되거나 공지된 관심 있는 대상으로부터 얻은 임의의 샘플을 지칭한다.
"조직" 또는 "세포 샘플"은 대상체 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합을 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결 및/또는 보존된 기관 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성성분; 체액, 예컨대 뇌척수액, 양수, 복수 또는 간질액; 대상체의 임신 또는 발생 중의 임의의 시점으로부터의 세포일 수 있다. 또한, 조직 샘플은 1차 또는 배양된 세포 또는 세포주 (예를 들어, 뉴런)일 수 있다. 임의로, 조직 또는 세포 샘플은 질환 조직/장기로부터 수득하였다. 조직 샘플은 자연에서 조직과 자연적으로 서로 혼합되지 않는 화합물, 예컨대 보존제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양소, 항생제 등을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 "참조 샘플", "참조 세포", "참조 조직", "대조 샘플", "대조 세포", 또는 "대조 조직"은, 그를 확인하기 위해 본 발명의 방법이 이용되는 질환 또는 상태를 앓지 않는 것으로 알려지거나 생각되는 공급원으로부터 얻은 샘플, 세포 또는 조직을 지칭한다. 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직은 질환 또는 상태가 본 발명의 조성물 또는 방법을 사용하여 확인되는 동일한 대상체 또는 환자의 신체의 건강한 부분으로부터 수득할 수 있다. 참조 샘플, 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포, 또는 대조 조직은 다르게는 질환 또는 상태가 본 발명의 조성물 또는 방법을 사용하여 확인되는 대상체 또는 환자가 아닌 개체의 신체의 건강한 부분으로부터 수득할 수 있다. "참조 샘플", "참조 세포", "참조 조직", "대조 샘플", "대조 세포" 또는 "대조 조직"으로부터의 유전자 발현 수준은 또한 신경변성 질환 또는 장애를 앓지 않는 집단으로부터 얻은 수준의 평균으로서 미리 결정된 것일 수 있지만, 일부 경우에 참조 수준은 신경변성 질환 또는 장애를 갖는 환자를 비롯한 개체의 군으로부터의 평균 또는 중앙값 수준일 수 있다.
본원의 목적상, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단한 조직의 박편 또는 세포를 의미한다. 조직 샘플의 다수의 절편을 채취하여 본 발명에 따른 분석에 적용할 수 있음이 이해되며, 단, 조직 샘플의 동일한 절편이 형태 및 분자 수준 둘 다에서 분석되거나, 또는 단백질 및 핵산 둘 다에 대해 분석되는 방법을 본 발명이 포함함이 이해된다.
"상호관련시키다" 또는 "상호관련시키는"은 제1 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과를 제2 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과와 임의의 방식으로 비교하는 것을 의미한다. 예를 들어, 제2 프로토콜의 수행시에 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용할 수 있고/거나 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 제2 분석 또는 프로토콜을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다. 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 실시양태와 관련하여, 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 특정 치료 요법을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다.
특정한 치료제 또는 치료 옵션에 대한 용어 "증가된 내성"이 본 발명에 따라 사용되는 경우에, 이는 표준 용량의 약물 또는 표준 치료 프로토콜에 대한 감소된 반응을 의미한다.
특정한 치료제 또는 치료 옵션에 대한 용어 "감소된 감수성"이 본 발명에 따라 사용되는 경우에, 이는 표준 용량의 작용제 또는 표준 치료 프로토콜에 대한 감소된 반응을 의미하고, 여기서 감소된 반응은 작용제의 용량을 증가시키거나 치료 강도를 증가시켜서 (적어도 부분적으로) 보상될 수 있다.
"환자 반응" 또는 "반응"은 (1) 질환 진행의 어느 정도까지의 억제, 예컨대 지연 및 완전한 정지, (2) 질환 에피소드 및/또는 증상의 수의 감소, (3) 병변 크기의 감소, (4) 인접한 말초 기관 및/또는 조직으로의 질환 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지), (5) 질환 확산의 억제 (즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지), (6) 질환 병변의 퇴행 또는 제거를 일으킬 수 있으나 그래야 하는 것은 아닌, 자가면역 반응의 감소, (7) 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 경감, (8) 치료 후 질환이 없는 표출 기간의 증가, 및/또는 (9) 치료 후 주어진 시점에서의 사망률 감소를 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 환자에 대한 이익을 나타내는 임의의 종점을 이용하여 평가할 수 있다.
용어 "유전자 서명"은 "유전자 발현 서명"과 상호교환가능하게 사용되고, 특정 분자적, 병리학적, 조직학적 및/또는 임상적 특성을 특징으로 하며 그의 발현이 신경변성 장애, 예를 들어 AD의 지표가 되는 유전자들 중 하나 또는 그의 조합을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 유전자 서명을 포함하는 하나 이상의 유전자의 발현이 대조군 대상체에서의 발현과 비교하여 상승된다.
용어 "단백질 서명"은 "단백질 발현 서명"과 상호교환가능하게 사용되고, 특정 분자적, 병리학적, 조직학적 및/또는 임상적 특성을 특징으로 하며 그의 발현이 신경변성 장애, 예를 들어 AD의 지표가 되는 단백질들 중 하나 또는 그의 조합을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 단백질 서명을 포함하는 하나 이상의 단백질의 발현이 대조군 대상체에서의 발현과 비교하여 상승된다.
"항체" (Ab) 및 "이뮤노글로불린" (Ig)은 유사한 구조적 특징을 갖는 당단백질을 지칭한다. 항체는 특정 항원에 대해 결합 특이성을 나타내지만, 이뮤노글로불린은 항체, 및 일반적으로 항원 특이성이 결여된 다른 항체-유사 분자 둘 다를 포함한다. 후자의 폴리펩티드는 예를 들어 림프계에 의해 낮은 수준으로, 골수종에 의해 증가된 수준으로 생산된다.
용어 "항체" 및 "이뮤노글로불린"은 가장 넓은 의미에서 상호교환가능하게 사용되고, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 1가 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이중특이적 항체)를 포함하고, 또한 특정 항체 단편 (본원에서 보다 상세히 기재된 바와 같이)을 포함할 수 있다. 항체는 키메라, 인간, 인간화 및/또는 친화도 성숙 항체일 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 하기 정의된 항체 단편이 아닌, 그의 실질적으로 무손상 형태의 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"항체 단편"은 바람직하게는 항원 결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편이라고 불리는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편과, 나머지 "Fc" 단편이 생성되며, 그의 명칭은 그의 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신 처리에 의해, 2개의 항원-결합 부위를 갖고 여전히 항원에 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 2-쇄 Fv 종은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유 회합된 이량체로 이루어진다. 종합적으로, Fv의 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'를 나타낸다. F(ab')2 항체 단편은 본래 가운데에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생산된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 이 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 개별적인 항체들의 혼합물이 아닌 것으로서의 항체의 특징을 가리킨다. 특정 실시양태에서, 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수개의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 과정에 의해 수득하였다. 예를 들어, 선택 과정은 복수개의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 독특한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은 예를 들어 표적에 대한 친화도 개선, 표적 결합 서열의 인간화, 세포 배양물 중 그의 생산 개선, 생체내에서의 그의 면역원성 감소, 다중특이적 항체의 생성 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임을 이해해야 한다. 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지정된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원상의 단결정자에 대해 지정된다. 모노클로날 항체 제제는 이것의 특이성에 더하여 전형적으로 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않았다는 점에서 유리하다.
수식어 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득하였음을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는, 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)] 참조), 및 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 로커스 또는 유전자의 일부 또는 모두를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 문헌 [Marks et al., Bio.Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)] 참조)을 비롯한 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
구체적으로, 본원의 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위뷰류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 반면에 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능이 추가로 개선되도록 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 그것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 그것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세한 내용을 위해서는 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 하기 종설 논문 및 그에 인용된 참고문헌을 참조한다: [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].
"인간 항체"는 인간에 의해 생산되고/거나 본원에 개시된 바와 같은 임의의 인간 항체 제조 기술을 이용하여 제조된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 이러한 기술은 인간-유래 조합 라이브러리, 예컨대 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 것 (예를 들어, 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) 및 Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)] 참조); 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주를 사용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 55-93 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조); 및 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)에서 모노클로날 항체를 생성하는 것 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)] 참조)을 포함한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 동물로부터의 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 제외한다.
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 보유하지 않는 모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도에서의 개선을 일으키는, 그의 하나 이상의 CDR 내에서의 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생산된다. 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙이 기재되어 있다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발이 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연-서열 Fc 영역 또는 아미노산-서열-변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하며, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체-의존성 세포독성 (CDC); Fc-수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포-표면 수용체 (예를 들어, B-세포 수용체)의 하향-조절; 및 B-세포 활성화를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체에 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함하며, 이들은 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 다르게는 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하는데, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 차이가 나는 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. (예를 들어, 문헌 [Daeeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 예를 들어 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후로 확인될 것을 포함하여 다른 FcR이 본원에서 용어 "FcR"에 포함된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG에서 태아로의 전달 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) 및 이뮤노글로불린의 항상성 조절을 담당하는 신생아의 수용체인 FcRn을 포함한다. FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)]; WO 2004/92219 (Hinton et al.) 참조).
인간 FcRn 고친화도 결합 폴리펩티드의 인간 FcRn에 대한 생체내 결합 및 혈청 반감기는, 예를 들어 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드를 투여한 영장류에서 검정할 수 있다. WO 2000/42072 (Presta)에는 FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체가 기재되어 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)]을 참조한다.
용어 "Fc 영역-포함 항체"는 Fc 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 정제 동안, 또는 항체를 코딩하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역을 갖는 항체를 포함하는 조성물은 K447을 갖는 항체, 모든 K447이 제거된 항체, 또는 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체들의 혼합물을 포함할 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 천연-킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"결합 친화도"는 일반적으로, 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유결합적 상호작용의 전체 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 비롯한 당업계에 공지된 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원과 서서히 결합하고 용이하게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원과 보다 신속하게 결합하고 보다 오랫동안 결합된 상태를 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있다.
단어 "표지"가 본원에서 사용되는 경우에, 이것은 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 전형적으로 시약, 예컨대 핵산 프로브 또는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되거나 융합되고, 그와 접합되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 한다. 표지는 그 자체로 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에는 검출가능한 생성물을 생성하는 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매화할 수 있다.
"단리된" 생물학적 분자, 예컨대 핵산, 폴리펩티드 또는 항체는 그의 천연 환경의 적어도 1종의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다.
본원에서 "약" 수치 또는 파라미터의 언급은 상기 수치 또는 파라미터 자체를 지향하는 실시양태를 포함(하고 이를 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 설명은 "X"의 설명을 포함한다.
용어 "제약 제제"는 의약의 생물학적 활성이 유효하게 할 수 있는 형태로 존재하고, 해당 제제가 투여되는 대상체에 대해 허용가능하지 않게 독성인 추가의 성분을 전혀 함유하지 않는 멸균 제제를 지칭한다.
"멸균" 제제는 무균이거나 또는 모든 살아있는 미생물 및 그의 포자가 없다.
"포장 삽입물"은 치료 또는 진단 제품 또는 의약의 시판되는 포장물 내에 통상적으로 포함되어 있으며 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기, 이러한 포장 제품과 조합될 다른 치료 또는 진단 제품 및/또는 이러한 치료 또는 진단 제품 또는 의약의 사용에 관한 경고 등에 대한 정보를 함유하는 설명서를 지칭하기 위해 사용된다.
"키트"는 적어도 1종의 시약, 예를 들어 본 발명의 바이오마커 유전자 또는 단백질을 특이적으로 검출하기 위한 프로브를 포함하는 임의의 제조품 (예를 들어, 패키지 또는 용기)이다. 특정 실시양태에서, 제조품은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 단위로서 판촉되거나, 배급되거나 또는 판매된다.
표현 "~에 반응성이 아닌"은 이전에 투여된 하나 이상의 의약에 대한 대상체 또는 환자의 반응과 관련이 있으며, 이러한 의약(들)의 투여시에 치료를 받은 장애의 치료에 대한 임의의 또는 적절한 징후를 나타내지 않거나 의약(들)에 대해 임상적으로 허용되지 않는 높은 정도의 독성을 나타내거나 이러한 의약(들)의 최초 투여 후에 치료 징후를 유지하지 않는 대상체 또는 환자를 나타내며, 여기서 단어 치료는 본원에 정의된 바와 같이 사용된다. 어구 "반응성이 아닌"은 이전에 투여된 의약(들)에 대해 내성이 있고/거나 불응성인 대상체에 관한 기재를 포함하고, 의약(들)이 투여되는 동안에도 대상체 또는 환자가 진행된 상황 및 대상체 또는 환자가 더이상 반응성이 아니어서 이러한 의약(들)을 수반하는 요법을 완료한 후 이들이 12개월 이내 (예를 들어, 6개월 이내)에 진행된 상황을 포함한다. 따라서, 하나 이상의 의약에 대한 비-반응성은, 이것을 사용한 이전 또는 현행 치료 후에도 계속해서 활동성 질환을 앓는 대상체를 포함한다. 예를 들어, 환자는 그가 비-반응성인 의약(들)을 사용한 약 1 내지 3개월의 요법 후에도 활동성인 질환 활동성을 가질 수 있다. 이러한 반응성은 해당 장애 치료에 숙련된 임상의가 평가할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 바와 같은 바이오마커의 "양" 또는 "수준"은 생물학적 샘플에서의 검출가능한 수준이다. 이것은 당업자에게 공지되고 또한 본원에 개시된 방법으로 측정될 수 있다.
용어 "발현의 수준" 또는 "발현 수준"은 일반적으로 상호교환가능하게 사용되고, 일반적으로 생물학적 샘플에서 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 생성물 또는 단백질의 양을 지칭한다. "발현"은 일반적으로 유전자-코딩 정보가 세포 내에 존재하고 작동하는 구조로 전환되는 과정을 지칭한다. 따라서, 본원에 사용된 유전자의 "발현"은 폴리뉴클레오티드로의 전사, 단백질로의 번역 또는 심지어 단백질의 번역후 변형을 지칭할 수 있다. 전사된 폴리뉴클레오티드, 번역된 단백질 또는 번역후 변형된 단백질의 단편은 또한 이들이 대안적 스플라이싱에 의해 생성된 전사체 또는 분해된 전사체로부터 유래하든지 또는 예를 들어 단백질분해에 의한 단백질의 번역후 프로세싱으로부터 유래하든지 발현되는 것으로 여겨질 것이다. "발현된 유전자"는 mRNA로서 폴리뉴클레오티드로 전사되고, 이어서 단백질로 번역되는 것, 또한 RNA로 전사되지만 단백질로 번역되지 않는 것 (예를 들어, 전달, 비-코딩 RNA (ncRNA) 및 리보솜 RNA (rRNA))을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 바이오마커
본 발명의 방법에 사용하기 위한 바이오마커는, 예를 들어 유전자 tbx6 및 dleu2의 발현 생성물 (예를 들어, 단백질, mRNA, ncRNA 또는 다른 폴리뉴클레오티드)을 포함한다.
T-박스 전사 인자 6 또는 T-박스 단백질 6으로도 공지되어 있는 tbx6은 발달 프로세스에 관여하는 전사 조절제이다. UnitProtKB/Swiss Prot 등록 번호 095947 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. tbx6은 T-박스 유전자 패밀리의 구성원이고, 인간에서 16p12-q12의 염색체 위치를 갖는다. 문헌 [Yi et al., Genomics 55:10-20 (1999)] (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
T-박스 6 단백질은 436개 아미노산 길이이고, 1개의 T-박스 DNA 결합 도메인을 함유한다. UnitProtKB/Swiss Prot 등록 번호 095947을 참조한다. tbx6의 천연 변이체는, 예컨대 아미노산 162에서의 GLY → SER 치환, 아미노산 178에서의 SER → PHE 치환 및 아미노산 179에서의 PRO → SER 치환이 존재하는 것으로 공지되어 있다. 동일 문헌. tbx6에 대한 여러 서열이 진뱅크(GenBank)에 기탁되었고, 하기 등록 번호: AJ007989 (mRNA) 및 CAA07812.1 (번역); BC026031 (mRNA) 및 AAH26031.1 (번역); AJ010279 (게놈 DNA) 및 CAB37938.1 (번역)을 가지며, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다.
dleu2는 1.0-1.8 kb 사이의 길이이며 폴리아데닐화되고 스플라이싱된 긴 비코딩 RNA (ncRNA)를 코딩한다. 문헌 [Klein et al., Cancer Cell 17: 28-40 (January 2010)] (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. ncRNA는 또한 LEU2로도 공지되어 있다. UnitProtKB/Swiss Prot 등록 번호 O43262. dleu2의 기능은 공지되어 있지 않지만, ncRNA의 이 부류의 다른 구성원은 X 염색체 불활성화 또는 활성화, 임프린팅, 및 유전자 발현의 전사 활성화/조절에 걸친 기능을 갖는다. 문헌 [Klein et al., Cancer Cell 17: 28-40 (January 2010)]. dleu2는 dleu1 및 마이크로 RNA miR-15a/16-1을 갖는 유전자 클러스터에서 인간 염색체 영역 13q14에 위치한다. 동일 문헌. dleu2/miR-15a/16-1 로커스가 성숙 B 세포의 확장에 있어서 역할을 하는 것으로 나타났다. 동일 문헌. 추가로, 상기 로커스는 B 세포에서의 종양-저해 역할을 가지며, 마우스에서의 상기 로커스의 결실은 B 세포 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 연관 표현형을 유발한다. 동일 문헌.
55개 아미노산의 가설 단백질은 ncRNA에 의해 코딩될 수 있다. UnitProtKB/Swiss Prot 등록 번호 O43262를 참조한다. delu2에 대한 여러 서열이 진뱅크에 기탁되었고, 하기 등록 번호: Y15228 (mRNA) 및 CAA75516.1 (번역); CH471075 (게놈 DNA) 및 EAX08851.1 (번역); BC017819 (mRNA) 및 AAH17819.1 (번역); BC022282 (mRNA) 및 AAH22282.1 (번역); BC030971 (mRNA) 및 AAH30971.1 (번역)을 가지며, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다. 동일 문헌.
당업계에 공지되어 있는 다른 신경변성 바이오마커는 또한 본 발명의 방법에서 tbx6 및/또는 dleu2와 함께 사용될 수 있다. 추가의 신경변성 바이오마커는, 예를 들어 아밀로이드-β (Aβ), 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), 타우, 프레세닐린 1 (PS1), 프레세닐린 2 (PS2), 아포지단백질 E (apoE), 뉴런 스레드 단백질 (NTP), α-항키모트립신, β-세크레타제, CD59, C-반응성 단백질, C1q, 8-히드록시-데옥시구아닌, 글루타민 신타제, 신경교원섬유 산성 단백질 (GFAP), IL-6 수용체 복합체, 칼리크레인, 멜라노트랜스페린, 신경미세섬유 단백질, 니트로티로신, 옥시스테롤, 술파티드, 시냅스 마커, S100β, 및 미국 공개 출원 번호 2010/0255485; 2010/0167947; 2010/0159486; 2010/0124756; 2009/0239241; 2008/0261226; 2008/0220449; 2008/0026405; 2005/0244890; 2005/0221348; 미국 특허 번호 4,728,605, 5,874,312, 6,027,896, 6,114,133, 6,130,048, 6,210,895, 6,358,681, 6,451,547, 6,461,831, 6,465,195, 6,475,161, 및 6,495,335에 언급된 다른 신경변성 바이오마커를 포함한다. 추가의 신경변성 바이오마커는 문헌 [Fahnestock et al., J. Neural. Transm. Suppl. 62:241-52 (2002); Masliah et al., Neurobiol. Aging 16(4):549-56 (1995); Power et al., Dement. Geriatr. Cogn. Disord. 12(2):167-70 (2001); 및 Burbach et al., J. Neurosci. 24(10):2421-30 (2004)]에 언급된 것들을 포함한다.
표적 신경변성 바이오마커가 본원에 제공된 정보 뿐만 아니라 당업계의 정보를 기반으로 하는 것인 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브를 구축하는 방법이 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
일반적 기술
달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 실시는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상의 기술을 이용할 것이며, 이들은 당업계의 기술범위 내에 있다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, 및 주기적 최신판); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]에 충분히 설명되어 있다.
본 발명에서 사용되는 프라이머, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 표준 기술을 이용하여 생성될 수 있다.
샘플은 외과적 절제물, 흡인물 또는 생검을 포함하나 이에 제한되지는 않는 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선하거나 냉동될 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 고정되고 파라핀 등에 포매된다. 조직 샘플은 통상의 방법에 의해 고정 (즉, 보존)될 수 있다. 당업자라면, 샘플이 조직학적으로 염색되거나 달리 분석되는 목적에 따라 고정제의 선택이 결정됨을 인지할 것이다. 당업자라면 또한 고정 기간이 조직 샘플의 크기 및 사용된 고정제에 따라 달라짐을 인지할 것이다.
유전자 발현 수준의 검출
하기 논의된 바와 같이, 샘플 중 바이오마커의 발현을 다수의 방법에 의해 분석할 수 있는데, 이들 중 다수는 당업계에 공지되어 있으며, 이는 당업자가 이해하고 있는 것이고, 면역조직화학 및/또는 웨스턴 분석, 정량적 검정, 예컨대 ELISA, ELIFA, 계내 혼성화, 면역침전, 분자 결합 검정, 마이크로어레이 분석, 형광 활성 세포 분류 (FACS), mRNA 및 ncRNA와 같은 RNA의 노던 분석 및/또는 PCR 분석, 뿐만 아니라 유전자 및/또는 조직 어레이 분석에 의해 실시될 수 있는 매우 다양한 검정들 중 임의의 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 유전자 및 유전자 생성물의 상태를 평가하기 위한 전형적인 프로토콜은 예를 들어 문헌 [Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology] (유닛 2 (노던 블롯팅), 4 (서던 블롯팅), 15 (이뮤노블롯팅) 및 18 (PCR 분석))에서 찾아볼 수 있다.
포유동물 조직 또는 세포 샘플에서 바이오마커의 발현을 검출하는 추가의 방법은 샘플을 바이오마커, 그의 반응성 단편 또는 바이오마커 단백질의 항원 결합 영역을 함유하는 재조합 단백질에 결합하는 항체와 접촉시키고, 이어서 샘플에서 항체, 그의 단편 또는 재조합 단백질의 결합을 검출하는 것을 포함한다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 샘플에서 바이오마커의 발현은 면역조직화학 및 염색 프로토콜을 이용하여 조사한다. 조직 절편의 면역조직화학 염색은 샘플 내 단백질의 존재를 평가 또는 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법인 것으로 나타났다. 면역조직화학 ("IHC") 기술은 프로브에 대한 항체를 이용하고, 일반적으로 발색 또는 형광 방법에 의해 계내에서 세포 항원을 가시화시킨다.
샘플 제조를 위해, 포유동물로부터의 조직 또는 세포 샘플 (예를 들어, 인간 뇌 조직 샘플)을 사용할 수 있다. 샘플의 예는 조직 생검, 뇌 조직 생검, 혈액, 폐 흡인물, 객담, 림프액 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 유전자 또는 유전자 산물은 질환 조직 또는 다른 신체 샘플, 예를 들어 뇌 조직 (생검), 뇌척수액, 혈액 (전혈 포함), 혈장 또는 혈청, 소변, 타액, 눈물 등으로부터 검출될 수 있다. 특정 경우에서, 개별 세포 또는 세포 유형은, 예컨대 (이에 제한되지는 않음) 뉴런으로 단리될 수 있다. 샘플은 외과적 절제물, 흡인물 또는 생검을 포함하나 이에 제한되지는 않는 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선하거나 냉동될 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 고정되고 파라핀 등에 포매된다. 대상체로부터의 생물학적 샘플은 당업계에 널리 공지되어 있는 방법에 의해 채취될 수 있다. 조직 생검은 종종 질환 조직의 대표적인 조각을 수득하기 위해 사용된다. 다르게는, 세포는 관심 대상 질환 세포를 함유하는 것으로 공지되거나 사료되는 조직/체액의 형태로 간접적으로 수득될 수 있다. 샘플 제조를 위해, 포유동물 (전형적으로 인간 환자)로부터의 조직 또는 세포 샘플을 사용할 수 있다.
조직 샘플은 통상의 방법으로 고정 (즉, 보존)될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology, 3rd edition (1960) Lee G. Luna, H T (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.] 참조). 당업자는 샘플이 조직학적으로 염색되거나 달리 분석되는 목적에 따라 고정제의 선택이 결정됨을 인지할 것이다. 당업자라면 또한 고정 기간이 조직 샘플의 크기 및 사용된 고정제에 따라 달라짐을 인지할 것이다. 예를 들어, 중성 완충된 포르말린, 보우인(Bouin) 또는 파라포름알데히드를 사용하여 샘플을 고정시킬 수 있다.
일반적으로, 샘플을 먼저 고정시킨 후에 농도가 상승하는 일련의 알콜을 통해 탈수시켜서 조직 샘플이 절편화될 수 있도록 파라핀 또는 다른 절편화 매질로 침윤 및 포매시킨다. 다르게는, 조직을 절편화하여 수득된 절편을 고정시킬 수 있다. 예를 들어, 조직 샘플을 통상의 방법으로 파라핀에 포매시키고 처리할 수 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology] 참조). 사용될 수 있는 파라핀의 예는 파라플라스트(Paraplast), 브롤로이드(Broloid) 및 티슈메이(Tissuemay)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 조직 샘플이 포매되면, 샘플을 마이크로톰 등으로 절편화시킬 수 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology] 참조). 이러한 절차의 예로서, 절편의 두께는 약 3 마이크로미터 내지 약 5 마이크로미터의 범위일 수 있다. 절편화되면, 절편을 여러 표준 방법에 의해 슬라이드에 부착시킬 수 있다. 슬라이드 접착제의 예는 실란, 젤라틴, 폴리-L-리신 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 파라핀 포매된 절편은 양으로 하전된 슬라이드 및/또는 폴리-L-리신으로 코팅된 슬라이드에 부착될 수 있다.
파라핀이 포매 물질로서 사용된 경우에, 조직 절편을 일반적으로 탈파라핀화하고 물에 재수화시킨다. 조직 절편은 통상적인 여러 표준 방법에 의해 탈파라핀화될 수 있다. 예를 들어, 크실렌 및 점차적으로 농도가 감소하는 일련의 알콜을 사용할 수 있다 (예를 들어, 상기 문헌 [Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology] 참조). 다르게는, 시판되는 탈파라핀화 비-유기 작용제, 예컨대 Hemo-De7 (CMS, 텍사스주 휴스톤)을 사용할 수 있다.
임의로, 샘플 제조에 이어서 조직 절편을 IHC를 이용하여 분석할 수 있다. IHC는 형태학적 염색 및/또는 형광 계내 혼성화와 같은 추가의 기술과 함께 수행될 수 있다. 2가지 일반적인 IHC 방법; 즉 직접 및 간접 검정을 이용할 수 있다. 제1 검정에 따르면, 표적 항원 (예를 들어, 바이오마커)에 대한 항체의 결합은 직접적으로 결정된다. 이러한 직접 검정은 추가의 항체 상호작용 없이도 가시화될 수 있는 표지된 시약, 예컨대 형광 태그 또는 효소-표지된 1차 항체를 사용한다. 전형적인 간접 검정에서는, 미접합 1차 항체가 항원에 결합한 후, 표지된 2차 항체가 상기 1차 항체에 결합한다. 2차 항체가 효소 표지에 접합된 경우에, 발색 또는 형광 기질을 첨가하여 항원을 가시화한다. 여러 2차 항체가 1차 항체 상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생한다.
면역조직화학에 사용되는 1차 및/또는 2차 항체는 전형적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 것이다. 다수의 표지가 이용가능하고, 이들은 일반적으로 하기 카테고리로 분류될 수 있다:
(a) 방사성동위원소, 예컨대 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I. 항체는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 방사성동위원소로 표지될 수 있고, 방사능은 섬광 계수를 이용하여 측정될 수 있다.
(b) 콜로이드성 금 입자.
(c) 형광 표지, 예컨대 (이에 제한되지는 않음) 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), 텍사스 레드, 로다민, 플루오레세인, 단실, 리사민, 움벨리페론, 피코크리테린, 피코시아닌, 또는 상업적으로 입수가능한 형광단, 예컨대 스펙트럼 오렌지7(SPECTRUM ORANGE7) 및 스펙트럼 그린7(SPECTRUM GREEN7) 및/또는 상기한 것 중 임의의 하나 이상의 유도체. 형광 표지는 예를 들어 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology]에 개시된 기술을 이용하여 항체에 접합될 수 있고, 형광은 형광계를 이용하여 정량화될 수 있다.
(d) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하고, 미국 특허 번호 4,275,149는 이들 중 일부에 대한 검토를 제공한다. 효소는 일반적으로 발색 기질의 화학적 변경을 촉매화하며, 이는 다양한 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 효소는 기질에서의 색 변화를 촉매화할 수 있고, 이는 분광학적으로 측정할 수 있다. 다르게는, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 화학발광 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기된 후에, 측정 (예를 들어, 화학발광측정기 사용)할 수 있는 광을 방출하거나 또는 에너지를 형광 수용자에게 제공할 수 있다. 효소 표지의 예는 루시페라제 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제; 미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예컨대, 우리카제 및 크산틴 옥시타제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키는 기술은 문헌 [O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", in Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기재되어 있다.
효소-기질 조합의 예는, 예를 들어 (i) 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)와 기질로서의 수소 퍼옥시다제 (여기서, 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB)를 산화시킴); (ii) 알칼리성 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트; 및 (iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광 기질 (예를 들어, 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제)을 포함한다.
다수의 다른 효소-기질 조합이 당업자에게 이용가능하다. 이들의 일반적 검토를 위해서는, 미국 특허 번호 4,275,149 및 4,318,980을 참조한다. 때때로, 표지는 항체와 간접적으로 접합된다. 당업자는 이를 달성하기 위한 다양한 기술을 알 것이다. 예를 들어, 항체는 비오틴과 접합될 수 있고, 상기 언급된 4가지 넓은 카테고리의 표지 중 임의의 것이 아비딘과 접합될 수 있거나, 또는 그 반대의 경우도 가능하다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하며, 이에 따라 표지는 이러한 간접 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 다르게는, 표지와 항체의 간접 접합을 달성하기 위해, 항체는 작은 합텐과 접합되고, 상기 언급된 표지의 다양한 유형 중 하나가 항-합텐 항체와 접합된다. 이에 따라, 표지와 항체의 간접 접합이 달성될 수 있다.
상기 논의된 샘플 제조 절차 외에, IHC 이전에, IHC 동안 또는 IHC 이후에 조직 절편을 추가로 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 조직 샘플을 시트레이트 완충제 중에서 가열하는 것과 같은 에피토프 복구 방법이 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)] 참조).
임의적 차단 단계 후에, 1차 항체가 조직 샘플 중의 표적 단백질 항원에 결합하기에 충분한 기간 동안 및 적합한 조건 하에, 조직 절편을 1차 항체에 노출시킨다. 이를 달성하기에 적절한 조건은 일상적인 실험으로 결정될 수 있다. 샘플에 대한 항체의 결합 정도는 상기 논의된 검출가능한 표지 중 임의의 하나를 사용하여 결정된다. 바람직하게는, 표지는 발색 기질, 예컨대 3,3'-디아미노벤지딘 발색체의 화학적 변경을 촉매화하는 효소 표지 (예를 들어, HRPO)이다. 바람직하게는, 효소 표지는 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 접합된다 (예를 들어, 1차 항체는 토끼 폴리클로날 항체이고, 2차 항체는 염소 항-토끼 항체임).
임의로, 바이오마커의 발현을 검출하기 위한 IHC 분석에 사용되는 항체는 관심 대상 바이오마커에 주로 결합하도록 생성된 항체이다. 임의로, 항-바이오마커 항체는 모노클로날 항체이다. 항-바이오마커 항체는 상이한 공급처로부터 입수하는 것을 포함하여 당업계에서 용이하게 이용가능하고, 당업계에 공지된 일상적인 기술을 이용하여 생성할 수 있다.
이에 따라 제조된 시료를 탑재하고 커버 글라스를 덮을 수 있다. 이어서, 예를 들어 현미경을 사용하여 슬라이드 평가를 수행하고, 당업계에서 일상적으로 이용되는 염색 강도 기준을 사용할 수 있다. 한 예로서, 염색 강도 기준은 하기와 같이 평가될 수 있다:
<표 1>
Figure pct00001
대안적 방법에서, 샘플을 항체-바이오마커 복합체를 형성하기에 충분한 조건하에서 바이오마커에 특이적인 항체와 접촉시킨 후에 상기 복합체를 검출할 수 있다. 바이오마커의 존재는 수많은 방법, 예컨대 혈장 및 혈청을 포함하는 다양한 조직 및 샘플을 검정하기 위한 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 절차로 검출할 수 있다. 이러한 검정 포맷을 이용한 광범위한 면역검정 기술이 이용가능하고, 예를 들어 미국 특허 번호 4,016,043, 4,424,279 및 4,018,653을 참조한다. 이들은 비-경쟁 유형의 단일-부위 및 2-부위 또는 "샌드위치" 검정 뿐만 아니라, 통상적인 경쟁적 결합 검정을 둘 다 포함한다. 또한, 상기 검정은 표지된 항체의 표적 바이오마커에 대한 직접 결합을 포함한다.
샌드위치 검정은 가장 유용하고 통상적으로 이용되는 검정 중 하나이다. 샌드위치 검정 기술의 수많은 변형이 존재하고, 모두가 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 간략하게, 전형적인 정방향 검정에서, 표지되지 않은 항체를 고체 기판에 고정시키고, 시험할 샘플을 결합된 분자와 접촉시킨다. 적합한 기간의 인큐베이션 후에, 항체-항원 복합체의 형성을 허용하기에 충분한 기간 동안, 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 리포터 분자로 표지된, 항원에 특이적인 2차 항체를 첨가하고, 항체-항원-표지된 항체의 또 다른 복합체의 형성에 충분한 시간을 허용하면서 인큐베이션한다. 임의의 미반응 물질을 세척하고, 항원의 존재를 리포터 분자에 의해 생성된 신호를 관찰하여 결정한다. 결과는 가시적인 신호의 단순 관찰에 의해 정성적일 수 있거나, 또는 공지된 양의 바이오마커를 함유하는 대조군 샘플과의 비교로 정량할 수 있다.
정방향 검정에 대한 변형은 동시 검정을 포함하며, 여기서 샘플 및 표지된 항체는 둘 다 결합된 항체에 동시에 첨가된다. 이들 기술은 용이하게 명백해질 임의의 근소한 변형을 포함하여 당업자에게 널리 공지되어 있다. 전형적인 정방향 샌드위치 검정에서, 바이오마커에 특이성을 갖는 1차 항체는 고체 표면에 공유적으로 또는 수동적으로 결합된다. 고체 표면은 전형적으로 유리 또는 중합체이고, 가장 통상적으로 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 튜브, 비드, 마이크로플레이트의 디스크의 형태, 또는 면역검정 수행에 적합한 임의의 다른 표면일 수 있다. 결합 과정은 당업계에 널리 공지되어 있고, 일반적으로 가교 공유 결합 또는 물리적 흡착으로 이루어지고, 중합체-항체 복합체는 시험 샘플 제조시에 세척하였다. 이어서, 시험할 샘플의 분취액을 고체 상 복합체에 첨가하고, 항체에 존재하는 임의의 서브유닛의 결합을 허용하기에 적합한 조건 (예를 들어, 실온 내지 40℃, 예를 들어 25℃ 내지 32℃ 포함) 하에 충분한 기간 동안 (예를 들어, 2-40분 또는 보다 편리하게는 밤새) 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 후, 항체 서브유닛 고체 상을 세척하여 건조시키고, 바이오마커의 일부에 특이적인 2차 항체와 함께 인큐베이션한다. 2차 항체는 분자 마커에 대한 2차 항체의 결합을 표시하는데 사용되는 리포터 분자에 연결된다.
대안적 방법은 샘플 중의 표적 바이오마커를 고정화시킨 후, 리포터 분자로 표지되어 있거나 그렇지 않을 수 있는 특이적 항체에 고정화된 표적을 노출시키는 것을 포함한다. 표적의 양 및 리포터 분자 신호의 강도에 따라, 결합된 표적은 항체로 직접 표지함으로써 검출할 수 있다. 다르게는, 1차 항체에 특이적인 2차 표지된 항체를 표적-1차 항체 복합체에 노출시켜 표적-1차 항체-2차 항체 3원 복합체를 형성한다. 상기 복합체는 리포터 분자에 의해 방출되는 신호에 의해 검출된다. 본 명세서에서 사용된 "리포터 분자"는 그의 화학적 성질에 의해 항원-결합된 항체의 검출을 허용하는 분석적으로 확인가능한 신호를 제공하는 분자를 의미한다. 이 유형의 검정에서 가장 통상적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단 또는 방사선핵종 함유 분자 (즉, 방사성동위원소) 및 화학발광 분자이다.
효소 면역검정의 경우에, 효소는 일반적으로 글루타르알데히드 또는 퍼아이오데이트에 의해 2차 항체에 접합된다. 그러나, 용이하게 인지될 바와 같이, 당업자가 용이하게 이용가능한 다양한 여러 접합 기술이 존재한다. 통상적으로 사용되는 효소는 특히 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, -갈락토시다제 및 알칼리성 포스파타제를 포함한다. 특이적 효소와 함께 사용될 기질은 일반적으로 상응하는 효소에 의한 가수분해시에 검출가능한 색상 변화가 일어나는 것으로서 선택된다. 적합한 효소의 예는 알칼리성 포스파타제 및 퍼옥시다제를 포함한다. 상기 언급된 발색 기질보다는 형광 생성물을 생성하는 형광 기질을 사용하는 것이 또한 가능하다. 모든 경우에, 효소-표지된 항체가 1차 항체-분자 마커 복합체에 첨가되어 결합한 후, 과량의 시약을 세척하였다. 이어서, 적절한 기질을 함유하는 용액을 항체-항원-항체의 복합체에 첨가한다. 기질은 2차 항체에 연결된 효소와 반응하여 정성적인 가시적 신호를 생성할 것이고, 이를 통상적으로 분광학적으로 추가로 정량하여 샘플 내에 존재하는 바이오마커의 양을 표시할 수 있다. 다르게는, 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광 화합물이 이들의 결합 능력을 변경시키지 않으면서 항체에 화학적으로 커플링될 수 있다. 특정한 파장의 광을 사용한 조명에 의해 활성화될 때, 형광색소-표지된 항체는 광 에너지를 흡수하여 분자를 여기가능 상태로 유도한 후, 광학 현미경으로 가시적으로 검출가능한 특징적인 색상에서 광을 방출한다. 효소 면역검정 (EIA)에서와 같이, 형광 표지된 항체는 1차 항체-분자 마커 복합체에 결합하도록 허용된다. 결합되지 않은 시약을 세척한 후, 이어서 남아있는 3원 복합체를 적절한 파장의 광에 노출시키고, 관찰된 형광은 관심 분자 마커의 존재를 나타낸다. 면역형광 및 EIA 기술은 둘 다 당업계에 널리 확립되어 있다. 그러나, 다른 리포터 분자, 예컨대 방사성동위원소, 화학발광 또는 생체발광 분자를 사용할 수도 있다.
상기 기재된 기술이 또한 바이오마커, 예컨대 tbx6 또는 dleu2의 발현을 검출하는데 사용될 수 있음이 고려된다.
본 발명의 방법은 조직 또는 세포 샘플에서 ncRNA 및/또는 mRNA, 예컨대 tbx6 mRNA 또는 dleu2 ncRNA의 존재 및/또는 발현을 조사하는 프로토콜을 추가로 포함한다. 세포 내의 ncRNA 및/또는 mRNA의 평가 방법은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 상보성 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 검정 (예컨대, 표지된 바이오마커 리보프로브를 사용하는 계내 혼성화, 노던 블롯 및 관련 기술) 및 다양한 핵산 증폭 검정 (예를 들어, 바이오마커에 특이적인 상보성 프라이머를 사용하는 RT-PCR, 및 다른 증폭 유형의 검출 방법, 예컨대 예를 들어 분지형 DNA, SISBA, TMA 등)을 포함한다.
포유동물로부터의 조직 또는 세포 샘플은 노던, 도트 블롯 또는 PCR 분석을 이용하여, 예를 들어 바이오마커 mRNA 및/또는 ncRNA에 대해 편리하게 검정할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 검정, 예컨대 정량적 PCR 검정은 당업계에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 예시적인 실시양태에서, 생물학적 샘플 중의 바이오마커 mRNA 및/또는 ncRNA를 검출하는 방법은 1종 이상의 프라이머를 사용한 역전사에 의해 샘플로부터 cDNA를 생산하는 단계; 이와 같이 생산된 cDNA를 바이오마커 폴리뉴클레오티드를 센스 및 안티센스 프라이머로서 사용하여 증폭시켜서 그 안의 바이오마커 cDNA를 증폭시키는 단계; 및 증폭된 바이오마커 cDNA의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 또한, 이러한 방법은 생물학적 샘플에서 바이오마커 mRNA 및/또는 ncRNA의 수준을 결정할 수 있도록 하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다 (예를 들어, 상기 수준을 "하우스키핑" 유전자, 예컨대 액틴 패밀리 구성원의 비교가능한 대조군 mRNA 서열과 동시에 조사함으로써). 임의로, 증폭된 바이오마커 cDNA의 서열을 결정할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드 또는 그의 임의의 특이적 부분의 특이적 증폭을 허용하는 바이오마커 프라이머 및 프라이머 쌍, 및 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 핵산 분자 또는 그의 임의의 일부에 선택적으로 또는 특이적으로 혼성화하는 프로브가 있다. 프로브는 검출가능한 마커, 예컨대 예를 들어 방사성동위원소, 형광 화합물, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소로 표지될 수 있다. 이러한 프로브 및 프라이머를 사용하여 샘플 중의 바이오마커 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출할 수 있고, 바이오마커 단백질을 발현하는 세포를 검출하는 수단으로서 사용할 수 있다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 매우 많은 상이한 프라이머 및 프로브가 본원에 제공된 서열을 기반으로 제조될 수 있고, 바이오마커 mRNA 및/또는 ncRNA를 증폭 및/또는 클로닝하고/거나 그의 존재 및/또는 수준을 결정하기 위해 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 임의적 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플에서 mRNA 및/또는 ncRNA, 예컨대 tbx6 및 dleu2 mRNA 및 ncRNA를 조사 또는 검출하는 프로토콜을 포함한다. 핵산 마이크로어레이를 이용하여, 시험 및 대조 조직 샘플로부터의 시험 및 대조 mRNA 및/또는 ncRNA 샘플을 역전사시키고, 표지하여 cDNA 프로브를 생성한다. 이어서, 프로브를 고체 지지체에 고정된 핵산의 어레이에 혼성화한다. 어레이는 어레이의 각각의 구성원의 서열 및 위치를 알 수 있도록 구성된다. 예를 들어, 특정 질환 상태에서 발현될 잠재력을 갖는 유전자의 선택물을 고체 지지체 상에 배열할 수 있다. 특정한 어레이 구성원을 갖는 표지된 프로브의 혼성화는 프로브가 유래된 샘플이 그 유전자를 발현한다는 것을 나타낸다. 질환 조직의 차등적 유전자 발현 분석은 가치있는 정보를 제공할 수 있다. 마이크로어레이 기술에서는 단일 실험 내에서 수천개 유전자의 mRNA 발현 프로파일을 평가하기 위해 핵산 혼성화 기술 및 전산화 기술을 이용한다. (예를 들어, 2001년 10월 11일 공개된 WO 01/75166 참조); (어레이 제작의 논의에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,700,637, 미국 특허 번호 5,445,934, 및 미국 특허 번호 5,807,522, 문헌 [Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheung, V. G. et al., Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999)] 참조). DNA 마이크로어레이는, 유리 또는 다른 기판에서 직접 합성되거나 이것으로 스팟팅되는 유전자 단편을 함유하는 미니어처 어레이이다. 수천개의 유전자는 통상적으로 단일 어레이로 나타낸다. 전형적인 마이크로어레이 실험은 하기 단계를 포함한다: 1) 샘플로부터 단리된 RNA로부터의 형광 표지된 표적의 제조, 2) 표지된 표적의 마이크로어레이로의 혼성화, 3) 어레이의 세척, 염색 및 스캐닝, 4) 스캐닝된 영상의 분석, 및 5) 유전자 발현 프로파일의 생성. 현재 DNA 마이크로어레이의 2개의 주요 유형이 이용되고 있다: 올리고뉴클레오티드 (통상적으로 25 내지 70량체) 어레이 및 cDNA로부터 제조된 PCR 생성물을 함유하는 유전자 발현 어레이. 어레이를 형성함에 있어, 올리고뉴클레오티드는 미리 제작되어 표면에 스팟팅되거나, 또는 표면에서 직접 합성될 수 있다 (계내). 아피메트릭스 진칩(Affymetrix GeneChip)™ 시스템은, 유리 표면 상에서 올리고뉴클레오티드를 직접 합성하여 제작되는 어레이를 포함하는 상업적으로 입수가능한 마이크로어레이 시스템이다.
선택된 바이오마커의 발현은 또한 유전자 결실 또는 유전자 증폭을 조사하여 평가할 수 있다. 유전자 결실 또는 증폭은 당업계에 공지된 매우 다양한 프로토콜 중 임의의 하나, 예를 들어 통상적인 서던 블롯팅, mRNA 및/또는 ncRNA의 전사를 정량화하는 노던 블롯팅 (문헌 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)]), 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 계내 혼성화 (예를 들어, FISH), 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 세포유전학 방법 또는 비교 게놈 혼성화 (CGH)에 의해 측정할 수 있다. 예로서, 이들 방법은 바이오마커 유전자의 결실 또는 증폭을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
생체내 검출
한 측면에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 생체내 영상화에 적합한 양 또는 투여량으로 환자에게 투여된다. 일반적으로, 본 발명의 방법에 사용하기 위해 필요한 프로브의 양은 환자 고려사항에 따라 달라질 것이다. 이러한 고려사항은, 예를 들어 연령, 프로토콜, 상태, 성별, 질환의 정도, 체중, 금기, 동반 요법 등을 포함한다. 영상화를 위한 프로브의 예시적인 양은 이러한 고려사항에 기반하여 당업계의 숙련된 의사에 의해 결정되거나, 조정되거나 또는 변경될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브를 포함하는 환자에 대한 단위 투여량은 1x10-15 g/kg 내지 10 g/kg, 바람직하게는 1x10-15g/kg 내지 1.0 g/kg에서 달라질 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브를 포함하는 단위 투여량은 또한 1 μCi/kg 내지 10 mCi/kg, 바람직하게는 0.1 mCi/kg일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브의 투여량은 또한 0.001 μg/kg 내지 10 μg/kg, 또는 바람직하게는 0.01 μg/kg 내지 1.01 μ/kg에서 달라질 수 있다. 대상체에게 점안제로서 투여되는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브의 유효량은 또한 당업자에 의해 조정되거나 또는 변경될 수 있다.
본 발명의 방법에서의 대상체로의 프로브의 투여는 국부 또는 전신 투여일 수 있고, 정맥내, 동맥내, 경막내 (척수액을 통해), 안구내 등으로 이루어질 수 있다. 투여는 또한 피내 또는 강내 투여일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브가 표적과 결합하도록 충분한 시간이 경과한 후, 조사 하에 있는 대상 영역을 일상적 영상화 기술 또는 양식, 예컨대 자기 공명 분광분석법 (MRS), 자기 공명 분광분석법 영상화 (MRI), 양전자 방출 단층촬영 (PET), 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT), 평면 섬광 영상화 또는 그의 조합, 뿐만 아니라 임의의 최신 영상화 양식 또는 본원에 기재된 다른 것들에 의해 검사한다. 특정 절차의 결정은 당업자에 일상적일 것이지만, 정확한 프로토콜은 환자에 특이적인 요인, 및 투여 방법 및 사용된 프로브 또는 검출가능한 마커의 유형에 따라 필연적으로 달라질 것이다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 또한 주사가능한 조성물의 형태로 투여될 수 있지만, 또한 널리 공지되어 있는 약물 전달 시스템, 예컨대 예를 들어 경구, 직장, 비경구 (정맥내, 근육내 또는 피하), 수조내, 질내, 복강내, 국부 (분말, 연고 또는 점액제), 또는 협측 또는 비강 스프레이, 뿐만 아니라 점안제로 제제화될 수 있다. 투여를 위한 전형적인 조성물은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브에 대한 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 담체는, 예를 들어 수용액, 비독성 부형제 (염 포함), 보존제, 완충제 등과 같은 담체를 포함하며, 이는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed. Easton: Mack Publishing Co., pp. 1405-1412 and 1461-1487 (1975) 및 The National Formulary XIV., 14th Ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1975)]에 기재되어 있다.
한 측면에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 본원에 기재된 바이오마커에 대한 생체내 (예를 들어, 우선적 또는 특이적) 결합 이외에도, 혈뇌 장벽 (BBB)을 가로지를 수 있고 적절한 투여량 수준에서 비독성이고 효과의 만족스러운 지속시간을 갖는 것이다.
물리적 방법, 지질-기반 방법, 줄기 세포-기반 방법, 및 수용체 및 채널-기반 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 혈뇌 장벽을 가로질러 분자를 수송하는 당업계에 공지된 여러 접근법이 존재한다.
혈뇌 장벽을 가로질러 프로브를 수송하는 물리적 방법은 혈뇌 장벽을 완전히 우회하는 것, 또는 혈뇌 장벽에 개구를 생성하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 우회 방법은 뇌로의 직접 주사 (예를 들어, 문헌 [Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)] 참조), 간질 주입/대류-증강 전달 (예를 들어, 문헌 [Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)] 참조), 및 뇌 내에 전달 장치를 이식하는 것 (예를 들어, 문헌 [Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003)]; 및 글리아델 웨이퍼스(Gliadel Wafers)™, 길드포드 파마슈티칼(Guildford Pharmaceutical) 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 장벽 내 개구의 생성 방법은 초음파 (예를 들어, 미국 특허 공보 번호 2002/0038086 참조), 삼투압 (예를 들어, 고장성 만니톨의 투여에 의함 (문헌 [Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)])), 예를 들어 브라디키닌 또는 투과화제 A-7에 의한 투과화 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206, 및 5,686,416 참조), 및 프로브를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터에 의한, 혈뇌 장벽을 가로지르는 뉴런의 형질감염 (예를 들어, 미국 특허 공보 번호 2003/0083299 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
혈뇌 장벽을 가로질러 프로브를 수송하는 지질-기반 방법은, 프로브를 혈뇌 장벽의 혈관 내피 상의 수용체에 결합하는 항체 결합 단편에 커플링된 리포솜에 캡슐화하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0025313 참조), 및 프로브를 저-밀도 지단백질 입자 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0204354 참조) 또는 아포지단백질 E (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0131692 참조)에 코팅하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
혈뇌 장벽을 가로질러 프로브를 수송하는 줄기-세포 기반 방법은 신경 전구 세포 (NPC)가 관심 프로브를 발현하도록 유전자 조작한 다음, 치료할 개체의 뇌에 줄기 세포를 이식하는 것을 수반한다. 문헌 [Behrstock et al. Gene Ther. 15 Dec. 2005 advanced online publication] (신경영양 인자 GDNF를 발현하도록 유전자 조작된 NPC를 설치류 및 영장류 모델의 뇌에 이식한 경우에 파킨슨병의 증상이 감소됨을 보고함)을 참조한다.
혈뇌 장벽을 가로질러 프로브를 수송하는 수용체 및 채널-기반 방법은 혈뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위한 글루코코르티코이드 차단제의 사용 (예를 들어, 미국 특허 출원 공보 번호 2002/0065259, 2003/0162695, 및 2005/0124533 참조); 칼륨 채널의 활성화 (예를 들어, 미국 특허 출원 공보 번호 2005/0089473 참조); ABC 약물 수송체의 억제 (예를 들어, 미국 특허 출원 공보 번호 2003/0073713 참조); 트랜스페린에 의한 항체 코팅 및 하나 이상의 트랜스페린 수용체의 활성 조절 (예를 들어, 미국 특허 출원 공보 번호 2003/0129186 참조), 및 항체의 양이온화 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,004,697 참조)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
추가로, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 뇌-표적화 펩티드와 접합 또는 회합될 수 있다. 본원에 사용된 "뇌-표적화 펩티드"는 BBB를 통해 (예를 들어, 담체-매개 수송 또는 수용체-매개 수송을 통해) 정상적으로 수송되는 단백질 (예를 들어, 리간드 또는 펩티드모방체 항체)이다. 이러한 뇌-표적화 펩티드의 비제한적 예는 인슐린 또는 트랜스페린을 포함한다. 추가의 뇌 표적화 펩티드는 수송 수용체, 예컨대 인슐린 수용체, 트랜스페린 수용체, 렙틴 수용체, GLUT1 글루코스 수송체, MCT1 락테이트 수송체, LAT1 대형 중성 아미노산 수송체 및 CNT2 아데노신 수송체에 결합하여 BBB를 가로지르는 수송을 용이하게 하는 수용체 특이적 펩티드모방체 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 펩티드 핵산 (PNA)이며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 뇌 표적화 폴리펩티드에 접합되거나 또는 그와 회합된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 바이오마커의 위치가 프로브의 제조 및 투여에 있어서 고려될 수 있다. 결합 표적이 세포내 분자일 경우에, 본 발명의 특정 실시양태는 결합 표적이 위치하는 세포에 도입되는 프로브를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 프로브는, 예를 들어 인트라바디로서 세포내에서 발현될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "인트라바디"는, 예를 들어 문헌 [Marasco, Gene Therapy 4: 11-15 (1997); Kontermann, Methods 34: 163-170 (2004)]; 미국 특허 번호 6,004,940 및 6,329,173; 미국 특허 출원 공보 번호 2003/0104402, 및 PCT 공보 번호 WO2003/077945에 기재된 바와 같은, 세포내 발현되고 표적 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 지칭한다. 또한, 예를 들어 세포내 항체를 생성하기 위한 유전자 요법의 사용에 관한, 1996년 3월 14일에 공개된 WO96/07321을 참조한다.
프로브의 세포내 발현은 표적 세포 내로 목적 프로브를 코딩하는 핵산을 도입함으로써 달성할 수 있다. 프로브의 전부 또는 일부를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 세포내 표적 바이오마커에 결합할 수 있는 하나 이상의 프로브가 발현되도록 표적 세포에 전달될 수 있다. 핵산을 세포에 도입하는 임의의 표준 방법을 사용할 수 있고, 이는 미세주사, 탄도 주사, 전기천공, 인산칼슘 침전, 리포솜, 및 관심 핵산을 운반하는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 및 백시니아 벡터로의 형질감염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 핵산 (임의로 벡터에 함유된 것)을 환자의 세포에 생체내 방법에 의해 도입할 수 있다. 생체내 전달의 한 예에서, 핵산을 환자에, 예를 들어 신경변성 질환 또는 장애의 부위에 직접 주사한다. 생체내 전달의 추가의 예에서, 바이러스성 벡터 (예컨대, 아데노바이러스, 제I형 단순 헤르페스 바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스)로의 형질감염 및 지질-기반 시스템 (유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)을 이용하여 핵산을 세포에 도입한다. 특정 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜의 검토를 위해서는, 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)], 및 WO 93/25673 및 그에 인용된 참고문헌을 참조한다.
본 발명은, 비침습적 뇌영상 기술 또는 양식, 예컨대 MRS, MRI, PET 또는 SPECT와 함께 생체내 유전자 발현을 정량화하는데 사용되는 프로브를 사용한다. 본 발명의 방법은 또한 바이오마커 유전자 발현의 기준선을 확립하기 위한 환자의 영상화를 포함한다. 본 발명의 예시적인 방법은 요법의 투여 후의 환자의 하나 이상의 영상화 세션을 포함한다. 한 측면에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 치료제로의 치료 전 및 후에 환자를 영상화하는 것을 포함할 수 있다. 생체내 영상화는 또한 치료 동안 임의의 시점에 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 영상화 또는 검출을 위해 표지 (즉, 마킹 또는 태그부착)될 수 있다. 임의의 적합한 표지 (방사성표지 또는 태그)는 바이오마커 프로브의 검출에 사용될 수 있다.
바이오마커 프로브의 검출을 위한 예시적인 기술은 섬광조영, 라디오신티그래피, 자기 공명 영상화 (MRI), 화학발광, 근적외선 발광, 형광, SPECT, 컴퓨터 단층촬영 (CT 스캔), 양전자 방출 단층촬영 (PET) 또는 그의 조합을 포함한다. 검출 및 관련 기술은 당업자에 의해 이해된다.
생체내 영상화의 목적상, 검출 기기의 유형은 주어진 검출가능한 마커의 선택에서의 인자이다. 예를 들어, 방사성동위원소 및 18F 또는 123I는 본 발명의 방법에서의 생체내 영상화에 적합하다. 사용되는 기기의 유형은 방사성핵종 또는 안정한 동위원소의 선택에 영향을 미칠 것이다. 한 측면에서, 선택된 방사성핵종은 주어진 유형의 기기에 의해 검출가능한 붕괴 유형을 가져야 한다. 추가로, 방사성핵종의 반감기와 같은 다른 고려사항이 생체내 영상화를 위해 검출가능한 마커를 선택할 경우에 고려된다. 영상화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 당업자는 본 발명의 방법에 사용하기에 적절한 검출가능한 마커를 선택할 수 있을 것이다.
검출가능한 마커의 반감기는, 표적에 의해 최대한으로 흡수되었을 때에도 마커가 여전히 검출가능하도록 충분히 길어야 하며, 대상체에서 유해한 방사선이 지속되지 않도록 충분히 짧아야 한다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 감마 영상화를 이용하여 검출할 수 있다 (적절한 파장의 방출된 감마선 조사를 검출함). 감마 영상화 방법은 SPECT 및 PET를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, SPECT 검출의 경우에, 선택된 검출가능한 마커는 미립자를 방출하지 않을 것이나 140-300 keV 범위에서 수많은 광자를 생산할 것이다. PET 검출의 경우에, 검출가능한 마커는 양전자-방출 방사성핵종, 예컨대 18F일 것이며, 이는 소멸되어 2종의 511 keV 감마선을 형성하고, 이어서 PET 카메라에 의해 검출될 것이다.
한 측면에서, 생체내 영상화에 유용한 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 대상체에게 투여된다. 프로브는 비-침습성 뇌영상 기술, 예컨대 MRS, MRI, PET, SPECT 및/또는 그의 조합과 함께 사용된다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 당업계에 공지된 일반적 유기 화학 기술을 이용하여 19F 또는 13C로 표지되어 MRS/MRI를 위한 프로브를 생성할 수 있다. 문헌 [March, J., Advanced Organic Chemistry: I Reactions, Mechanisms, and Structure (3rd Ed., 1985); Morrison and Boyd, Organic Chemistry (6th Ed., 1992)]. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 또한 당업계에 널리 공지되어 있고 문헌 [Fowler, J. and Wolf, A. in Positron Emission Tomography and Autoradiography (Phelps, M., Mazziota, J., and Schelbert, H., eds.) pp. 391-450 (Raven Press, NY 1986)]에 기재되어 있는 기술에 의해 PET를 위해 18F, 11C, 75Br 또는 76Br로 방사성표지될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 또한 당업계에 공지되어 있는 여러 기술 중 임의의 것에 의해 SPECT를 위해 123I로 방사성표지될 수 있다. 문헌 [Kulkarni, Int. J. Rad. Appl. & Inst., (Part B) 18: 647 (1991)].
표지, 검출가능한 표지, 방사성표지, 태그, 마커, 검출가능한 마커, 추적자, 방사성추적자 또는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 동의어는 영상화 및/또는 검정 (예를 들어, 확인, 진단, 평가, 검출 및/또는 정량화)에 적합한 임의의 치환기 (기, 모이어티, 위치)를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 라디오신티그래피, 자기 공명 영상화 (MRI), 검정, 화학발광, 근적외선 발광, 형광, 분광분석법, 감마 영상화, 자기 공명 영상화, 자기 공명 분광분석법, 형광 분광분석법, SPECT, 컴퓨터 단층촬영 (CT 스캔), 양전자 방출 단층촬영 (PET)을 통한 생체내 또는 시험관내 검출에 적합한 표지, 방사성표지, 태그, 마커, 검출가능한 마커, 추적자, 방사성추적자 또는 동의어를 포함할 수 있다. 적합한 표지, 방사성표지, 태그, 마커, 검출가능한 마커, 추적자, 방사성추적자 또는 동의어는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 방사성동위원소, 방사성핵종, 동위원소, 형광 기, 비오틴 (스트렙타비딘 복합체형성과 함께) 또는 광친화성 기를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브의 표지, 검출가능한 표지, 방사성표지, 태그, 마커, 검출가능한 마커, 추적자, 방사성추적자는 131I, 124I, 125I, 3H, 123I, 18F, 19F, 11C, 75Br, 13C, 13N, 15O, 76Br을 포함할 수 있다. "광친화성 기" 또는 "광친화성 표지된"은 적절한 파장에서 광분해에 의해 활성화되어 그와 회합된 거대분자와 가교 광화학 반응을 할 수 있는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브의 치환기를 지칭할 수 있다. 광친화성 기의 예는 벤조페논 치환기이다.
적합한 방사성동위원소는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 할로겐 (예컨대, 염소, 플루오린, 브로민 및 아이오딘)의 동위원소, 및 테크네튬 및 인듐을 비롯한 금속을 포함한다. 예시적인 표지, 방사성표지, 태그, 마커, 검출가능한 마커, 추적자, 방사성추적자는 또한 3H, 11C, 14C, 18F, 32F, 35S, 123I, 125I, 131I, 124I, 19F, 75Br, 13C, 13N, 15O, 76Br을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 프로브는 직접적으로 (즉, 본 발명의 화합물 내로 표지를 직접 혼입시킴으로써) 또는 간접적으로 (즉, 본 발명의 화합물 내로 혼입된 킬레이트화제를 통해 본 발명의 화합물 내로 표지를 혼입시킴으로써) 표지 (방사성표지, 태그부착, 마킹, 검출가능하게 마킹, 추적 또는 방사성추적)될 수 있다. 추가로, 프로브에 대한 표지는 본 발명의 화합물에 대한 추가의 치환기 (기, 모이어티, 위치)로서, 또는 존재하는 임의의 치환기에 대한 대안적 치환기로서 포함될 수 있다. 표지, 검출가능한 표지, 방사성표지, 태그, 마커, 검출가능한 마커, 추적자 또는 방사성추적자는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브 상의 임의의 치환기 (기, 모이어티, 위치)에서 나타날 수 있다.
한 측면에서, 표지는 동위원소 표지 또는 비동위원소 표지일 수 있다. 동위원소 표지를 이용하여, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브에 이미 존재하는 1개의 치환기 (기, 모이어티, 위치)를 방사성동위원소 또는 동위원소로 치환 (교환)할 수 있다. 비동위원소 표지를 이용하여, 이미 존재하는 기를 치환 (교환)하지 않으면서 방사성동위원소 또는 동위원소를 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브에 부가할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 디아조늄 아이오다이드를 통한 디아조화 아미노 유도체의 직접적 아이오딘화 (문헌 [Greenbaum, F., Am. J. Pharm., 108: 17 (1936)]), 불안정한 디아조화 아민의 안정한 트리아젠으로의 전환, 또는 비-방사성 할로겐화 전구체의 안정한 트리-알킬 주석 유도체로의 전환에 의해 임의의 적합한 방사성 아이오딘 동위원소, 예컨대 (이에 제한되지는 않음) 131I, 125I 또는 123I로 표지될 수 있고, 이는 이어서 당업계에 널리 공지된 여러 방법에 의해 아이오도 화합물로 전환될 수 있다. 문헌 [Satyamurthy and Barrio, J. Org. Chem., 48: 4394 (1983), Goodman et al., J. Org. Chem., 49: 2322 (1984), Mathis et al., J. Labell. Comp. and Radiopharm., 1994: 905; Chumpradit et al., J. Med. Chem., 34: 877 (1991); Zhuang et al., J. Med. Chem., 37: 1406 (1994); Chumpradit et al., J. Med. Chem., 37: 4245 (1994)]. 예를 들어, 본 발명의 화합물의 안정한 형태 또는 유도체는 131I, 125I, 123I, 75Br, 76Br 또는 18F를 함유하는 할로겐화제와 반응할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브는 또한 공지된 금속 검출가능한 마커, 예컨대 테크네튬-99m (99mTc)으로 방사성표지될 수 있다. 이러한 금속 이온에 결합하는 리간드를 도입하기 위한, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브의 치환기의 변형은 당업자에 의해 과도한 실험 없이 달성될 수 있다. 검출가능한 마커, 예컨대 99mTc를 포함하는 프로브의 제조는 당업계에 널리 공지되어 있다. 문헌 [Zhuang et al., Nuclear Medicine & Biology, 26(2): 217 (1999); Oya et al., Nuclear Medicine & Biology, 25(2): 135 (1998); Hom et al., Nuclear Medicine & Biology, 24(6): 485 (1997)].
한 측면에서, 본 발명의 방법은 생체내 영상화 및 분광분석법의 목적을 위해 핵 자기 공명 (NMR) 분광분석법에 의해 검출가능한 동위원소로 표지된 프로브를 사용할 수 있다. 자기 공명 분광분석법에 특히 유용한 원소는 1H, 19F 및 13C를 포함한다. 또한, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브를 제조하는데 적합한 검출가능한 마커는 베타-방출제, 감마-방출제, 양전자-방출제 및 X선 방출제를 포함한다. 추가로, 예시적인 검출가능한 마커는 131I, 123I, 124I, 125I, 3H, 123I, 18F, 19F , 13C, 14C , 75Br, 11C, 13N, 15O 및 76Br을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로브를 가시화하기 위한 임의의 통상적인 방법 또는 검출가능한 마커를 이용할 수 있고, 이는 당업자에 의해 인지될 것이다.
참조 샘플의 바이오마커 발현 수준
유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나에 대한 측정 수준을 비교하는데 사용되는 참조 샘플로부터의 발현 수준은 수행되는 본 발명의 방법에 따라 달라진다. 신경변성 질환 또는 장애 진단 방법의 경우에, "참조 샘플"로부터의 발현 수준은 전형적으로 미리 결정된 참조 수준, 예컨대 신경변성 질환 또는 장애를 앓지 않는 집단으로부터 얻은 수준의 평균일 수 있으나, 일부 경우에 참조 수준은 신경변성 질환 또는 장애를 앓는 환자를 포함하는 개체의 군으로부터의 평균 또는 중앙값 수준일 수 있다. 일부 경우에서, 미리 결정된 참조 수준은 유사 연령 집단으로부터 얻은 수준으로부터 유도된다 (예를 들어, 그의 평균 또는 중앙값임).
신경변성 질환 또는 장애 모니터링 방법 (예를 들어, 신경변성 질환 또는 장애를 앓는 환자에서 신경변성 질환 또는 장애의 진행을 진단하거나 또는 그의 진단을 보조하는 방법)의 경우에, 참조 수준은 미리 결정된 수준, 예컨대 신경변성 질환 또는 장애를 앓지 않는 집단, 신경변성 질환 또는 장애로 진단된 집단으로부터 얻은 수준의 평균일 수 있고, 일부 경우에 참조 수준은 신경변성 질환 또는 장애를 앓는 환자를 포함하는 개체의 군으로부터의 평균 또는 중앙값 수준일 수 있다. 다르게는, 참조 수준은 특정한 환자에 대한 병력적 참조 수준 (예를 들어, 동일한 개체로부터 보다 이른 시점에 유래된 샘플로부터 얻은 tbx6 수준)일 수 있다. 일부 경우에, 미리 결정된 참조 수준은 유사 연령 집단으로부터 얻은 수준으로부터 유도된다 (예를 들어, 그의 평균 또는 중앙값임).
유사 연령 집단 (이로부터 참조 값을 얻을 수 있음)은 이상적으로는 시험되는 개체와 동일한 연령이지만, 대략적 유사 연령 집단도 또한 허용가능하다. 대략적 유사 연령 집단은 시험되는 개체 연령의 1, 2, 3, 4 또는 5세 이내일 수 있거나, 또는 시험되는 개체의 연령을 포함하는 다양한 연령의 군일 수 있다. 대략적 유사 연령 집단은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 년 증분으로 있을 수 있다 (예를 들어, 62세 개체에 대한 참조 값의 공급원의 역할을 하는 "5년 증분" 군은 58-62세 개체, 59-63세 개체, 60-64세 개체, 61-65세 개체 또는 62-66세 개체를 포함할 수 있음).
그러나, 참조 샘플에서의 바이오마커의 발현 수준이 또한 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인지될 것이다.
tbx6 및/또는 dleu2의 수준 비교
측정 값과 참조 값을 비교하는 과정은 관심 대상 바이오마커에 대한 측정 값과 참조 값의 유형에 적절한 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. tbx6 및/또는 dleu2의 발현 수준을 측정 또는 결정하는 것은 정량적 또는 정성적 측정 기술을 이용하여 수행될 수 있고, 측정 값과 참조 값을 비교하는 방식은 이용된 측정 기술에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 정성적 비색 검정을 이용하여 유전자 발현 수준을 측정하는 경우에, 유색 반응 생성물의 강도를 가시적으로 비교하거나, 또는 유색 반응 생성물의 농도측정 또는 분광측정으로부터의 데이터를 비교함으로써 (예를 들어, 측정 장치로부터 유도된 수치 데이터 또는 그래프 데이터, 예컨대 막대 차트를 비교함으로써) 수준을 비교할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 측정 또는 결정된 값은 또한 정량적 값일 수 있고, 이용된 검출 방법에 따라 달라질 수 있다.
키트
본원에 기재되거나 제안된 용도에서 사용하기 위해, 키트 또는 제조품이 또한 제공된다. 상기 키트는 긴밀하게 닫힌 하나 이상의 용기 수단, 예컨대 바이알, 튜브 등을 수용하도록 구획화되는 운반체 수단을 포함할 수 있고, 여기서 각각의 용기 수단은 방법에서 사용될 별개의 요소 중 하나를 포함한다. 예를 들어, 용기 수단 중 하나는 검출가능하게 표지된 것이거나 검출가능하게 표지될 수 있는 프로브를 포함할 수 있다. 이러한 프로브는 유전자 발현 서명의 하나 이상의 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 특이적인 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 키트가 표적 핵산을 검출하기 위해 핵산 혼성화를 이용하는 경우에, 키트는 또한 표적 핵산 서열의 증폭을 위한 뉴클레오티드(들)를 함유하는 용기, 및/또는 효소, 형광 또는 방사성동위원소 표지와 같은 리포터 분자에 결합된, 아비딘 또는 스트렙타비딘과 같은 비오틴-결합 단백질과 같은 리포터 수단을 포함하는 용기를 가질 수 있다.
키트는 전형적으로 상기 기재된 용기, 및 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 및 사용 지침서를 갖는 포장 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 물질을 포함하는 1개 이상의 다른 용기를 포함할 것이다. 조성물이 특정 요법을 위해 또는 비-치료 용도로 사용되는지 나타내도록 라벨이 용기 상에 존재할 수 있고, 또한 상기 기재된 것과 같은 생체내 또는 시험관내 용도를 위한 지시를 나타낼 것이다. 키트 중의 다른 임의의 성분은 하나 이상의 완충제 (예를 들어, 차단 완충제, 세척 완충제, 기질 완충제 등), 다른 시약, 예를 들어 효소 표지에 의해 화학적으로 변경되는 기질 (예를 들어, 발색체), 에피토프 복구 용액, 대조군 샘플 (양성 및/또는 음성 대조군), 대조군 슬라이드(들) 등을 포함한다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적 설명에 기초하여 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있음이 이해된다.
실시예 1 - 국부 변성에 관한 억제제의 특성화
축삭 변성은 신경계 발달 및 신경변성 질환 둘 모두 동안의 가지치기의 특징이다. 이 활성 과정을 조절하는 분자 메카니즘은 이제야 이해되기 시작하고 있다. 축삭 변성을 조절하는 추가의 경로를 확인하기 위해, 비편견 소분자 스크린을 수행하여 신경 성장 인자 (NGF) 회수 후의 축삭 변성을 차단하는 다양한 경로의 조절제를 확인하였다.
다수의 키나제가 스크린에서 축삭 변성의 매개자로서 확인되었고, 추가의 메카니즘 연구는 하기 기재된 바와 같이 별개의 키나제들의 기능을 축삭 구획 또는 세포체 구획으로 국부화하였다.
캄페노트 챔버를 이용하여, 몸체 환경 및 축삭 환경이 분리되도록 하고 국부 변성의 도입을 허용하는 하기 실험을 수행하였다 (도 1 및, 예를 들어 문헌 [Zweifel et al., Nat. Rev. Neurosci. 6(8):615-625, 2005] 참조). 이러한 챔버에서, 축삭 변성은 국부화되고, 아폽토시스 없이 진행된다.
물질 및 방법
테플론 분할기 (타일러 리서치(Tyler Research))를 물 중에서 세척하고, 이를 어떠한 그리스도 남아있지 않게 닦음으로써 깨끗이 하였다. 이어서, 분할기를 노크로믹스(Nochromix) (고닥스 래보러토리즈(Godax Laboratories))/황산 중에 밤새 침지시키고, 오토클레이빙된 증류수 (SQ 물)로 5회 헹구고, 30분 동안 끓이고, 이어서 공기-건조시킨 후 사용하였다.
마우스 라미닌 (멸균 여과수 중 5 μg/ml; 인비트로젠(Invitrogen))을 PDL 코팅된 35 mm 접시 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, SQ 물 중에서 2회 헹궜다. 접시를 진공-건조시킨 후, 층류 후드에서 15분 동안 공기-건조시켰다. 이어서, 제조된 접시에 핀 레이크 (타일러 리서치)로 스코어링하였다. NGF를 함유하는 NBM + MC 용액 50 마이크로리터를 생성된 스코어 트랙에 걸쳐 적용하였다. NBM + MC 용액은 하기와 같이 제조하였다: 메틸셀룰로스 1750 mg을 뉴로베이살(Neurobasal) (인비트로젠) 480 ml와 합하고, 여기에 4.5 ml 페니실린/스트렙토마이신, 7.5 ml L-글루타민 및 10 ml B-27 혈청-무함유 보충물 (인비트로젠)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 1시간 동안, 4℃에서 밤새, 그리고 실온에서 추가로 1시간 동안 혼합하였다. 이어서, 용액을 멸균 여과하고, 50 ng/ml NGF (로슈(Roche))를 사용 전에 첨가하였다. 고진공 그리스 (VWR)를 절개 범위 하에 각각의 테플론 분할기에 첨가하였다. 라미닌 코팅된 PDL 접시를 뒤집고, 테플론 분할기 상에 투하하였고, 이때 트랙을 함유하지 않는 영역 내에 이쑤시개를 사용하여 추가의 압력을 부가하였다. 접시를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 500 마이크로리터의 NBM + MC (50 ng/ml NGF) 용액을 각각의 측면 구획에 첨가하였고, 중앙 세포 슬롯 전방에 그리스 장벽을 부가하였다.
유리 E13.5 척수를 마우스 배아로부터 절개하고, NBM + MC (25 ng/ml NGF) 용액 중에 위치시켰다. DRG를 텅스텐 바늘로 척수로부터 분리하였다. NBM + MC-윤활 P200 피펫을 사용하여, DRG를 1.5 ml 튜브 내로 이동시켰다. DRG를 탁상용 원심분리로 30초 동안 펠릿화시켰다. 상청액을 폐기하고, 0.05% 트립신/EDTA (저온)를 첨가하였다. 피펫으로 펠릿을 재용해시키고, 일정하게 진탕 (650 RPM)시키면서 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 다시 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 펠릿을 따뜻한 NBM + MC (50 ng/ml NGF) 용액에 재용해시키고, 플레임드 유리 피펫으로 20회 연화처리한 후, 파이어-보어드 유리 피펫으로 또 다시 20회 연화처리하였다. 샘플을 다시 원심분리하고, 생성된 펠릿을 0.5 ml NBM + MC (50 ng/ml NGF) 용액에 재현탁시켰다. 세포를 2.5 x 106개 세포/ml의 최종 농도로 희석하였다. 세포 현탁액을 22 게이지 바늘이 있는 1 ml 주사기 내로 로딩하였다. 주사기를 사용하여 캄페노트 분할기의 중앙 슬롯을 (적어도 50 μl의 부피로) 채웠다. 캄페노트 챔버를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 2.5 ml NGF + MC (50 ng/ml NGF) 용액을 중앙 구획에 첨가하고, 그리스 게이트를 제거하였다. 3일 후, 외부 배지 (세포체 구획)를 2.5 ml NBM + MC 배지 (25 ng/ml NGF 있음)로 교체하였다.
배양물에서 5일 후, 축삭 구획을 가온된 NBM + MC (NGF 없음) 용액으로 3회 세척하였다. 세번째 세척 후, 500 μl NBM + MC (NGF 없음) 용액을 0.5% DMSO 또는 억제제와 조합하여 축삭 구획에 첨가하였다. 세포체 구획을 0.5% DMSO 또는 억제제를 함유하는 2.5 ml NBM + MC 배지 (25 ng/ml NGF 있음)로 교체하였다. 50 μg/ml 항-NGF 항체를 축삭 구획에 첨가하였다. 대조군으로서 또 다른 축삭 구획을 NGF 중에서 유지하였다.
28시간의 축삭에 대한 NGF 박탈 및 25시간의 세포체에 대한 NGF 박탈 후, 8% PFA/30% 수크로스 용액을 1:1 희석으로 배양 배지에 직접 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션하였다. 첨가로부터 초반의 15분 후 테플론 분할기를 제거하였다. 시스템을 2.5 ml PBS로 1회 세척한 후, 면역염색하였다. PBS 중 5% BSA/0.2% 트리톤 중에서 30분 동안 뉴런을 차단하였다. 1차 항체 Tuj1 (코밴스(Covance))을 2% BSA를 함유하는 PBS 중에 1:1000의 최종 희석도로 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 접시를 PBS로 1회 세척하였다. 2차 항체 (알렉사 488 염소 항-마우스 항체 (인비트로젠))를 PBS 중 2% BSA 중에 1:200의 최종 희석도로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 접시를 PBS로 2회 세척하고, 350 μl의 플루오로마운트 G (일렉트론 마이크로스코피 사이언시스(Electron Microscopy Sciences)와 함께 22 x 22 mm 커버슬립 (VWR)을 첨가하였다. 형광 현미경을 사용하여 뉴런을 시각화하였다.
축삭을 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 키나제 억제제 AG555 (ErbBAG5555) (EMB 바이오사이언시스(EMB Biosciences)) 또는 p38 MAP 키나제 억제제 SB239 (p38MAPKSB239) (EMB 바이오사이언시스)에 노출시킨 경우에, NGF 박탈 축삭은 더 적은 변성을 나타내었다. 대조적으로, 세포체 구획에서의 AG555 및 SB239 처리는 변성을 방지하는데 실패하였다. 세포체를 전사 억제제 Act D (전사ActD) (시그마(Sigma)) 또는 글리코겐 신타제 키나제-3 (GSK-3) 억제제 SB415 (SK3SB415) (시그마)로 처리한 경우에, NGF 박탈로 인한 축삭 변성이 축삭에서 감소하였다. 그러나, 동일한 억제제는 축삭에 직접 적용된 경우에는 NGF 박탈로 인한 축삭 변성을 방지하지 않았다. 이들 결과는, 국부 축삭 변성에서의 신호전달이 손실된 축삭 절편에 제한되지 않으며; 일부 억제제는 세포체에 적용될 때, 그리고 다른 것은 축삭에 적용될 때 가장 효과적이라는 것을 시사한다. 이들 결과의 정량화를 도 2에 나타내었다.
실시예 2 - 축삭 변성에 관여하는 GSK-3 조절 유전자를 확인하기 위한 마이크로어레이 분석
상기 기재된 실험에 기반하여, 글리코겐 신타제 키나제-3 (GSK-3)을 말단 축삭 변성을 조절하기 위한, 세포체에서 특이적으로 작용하는 유전적 축삭 변성 프로그램의 조절제인 것으로서 확인하였다. GSK3 조절 축삭 변성 유전자를 확인하기 위해, 경시적 마이크로어레이 분석을 GSK-3 억제 하에 또는 억제 없이, 뉴런 손실을 선택적으로 겪는 뉴런 상에서 수행하였다.
간략하게, 상기 기재된 바와 같이 뉴런을 단리하고 캄페노트 챔버에서 배양하였다. 캄페노트 챔버를 비-뉴런 세포에 의한 오염을 감소시키기 위해 배양 배지에 첨가된 50 μM 5-플루오로-2'-데옥시우리딘/우리딘 (둘 다 시그마)으로 설정하였다. 제5일에, 축삭 구획 둘 모두를 NGF-무함유 배지로 3회 세척하고, 제4 세척시에는 NGF (대조군) 또는 NGF 항체 (50 μg/ml) 함유 배지 (911, 진테크(Genetech))로 교체하였다. 외부 구획을 30 μM의 GSK3 억제제 ARA (EMD 바이오사이언시스) 또는 0.3% DMSO를 함유하는 배지로 교체하였다. RNA를 6 및 12시간 동안 NGF와 함께 배양된 또는 NGF 박탈된 GSK3 ARA 처리 하에 또는 처리 없이 뉴런으로부터 추출하였다. 트리졸(Trizol)® (인비트로젠)에 이어서, RNeasy® 마이크로 키트 매뉴얼의 부록 C에 기재된 바와 같이 DNAse I 처리와 함께 진행되는 RNeasy® 마이크로 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 RNA를 제조하였다. 각각의 조건에 대해, 5개의 애질런트(Agilent) 전체 마우스 게놈 마이크로어레이 칩을 단일 증폭과 함께 이용하였다.
2개의 유전자, tbx6 및 dleu2는 마이크로어레이 분석에서 축삭 변성을 겪은 뉴런에서 과다발현되는 것으로 확인되었다. 상기 기재된 바와 같이, tbx6은 전사 인자를 코딩하고 dleu2는 긴 비코딩 RNA를 코딩한다. 도 3에서 확인할 수 있듯이, dleu2 및 tbx6은 둘 다 NGF 박탈 12시간 후에 뉴런에서 과다발현되었다. 그러나, 이들 유전자의 과다발현은 GSK3 ARA 억제제의 첨가시에 어떠한 시점에서도 관찰되지 않았다.
실시예 3 - tbx6 및 dleu2 녹다운은 축삭 변성을 감소시킨다
축삭 변성에서의 dleu2 및 tbx6의 역할을 추가로 평가하기 위해, siRNA를 사용하여 NGF 박탈을 겪고 있는 뉴런에서의 dleu2 및 tbx6의 발현을 감소시키는 녹다운 실험을 수행하였다.
간략하게, E13.5 마우스 DRG를 트립신 소화 후에 해리시켰다. dleu2 및 tbx6에 대한 3개의 상이한 siRNA를 개별적으로 시험하였다. 하기 siRNA를 사용하였다:
Figure pct00002
96 웰 아막사(Amaxa) 뉴클레오펙터 시스템 (론자(Lonza))을 이용하여 siRNA를 세포로 전달하였다. 마우스 기반 뉴런 키트 (론자)를 이용하여 대략 200,000개의 세포를 siRNA 600 ng으로 뉴클레오펙션하였다. 세포를 라미닌 (5 μg/ml; 인비트로젠)으로 코팅된 96 웰 PDL-사전 코팅된 BD 바이오코트 플레이트 (BD 바이오사이언시스)에서 웰당 25,000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 25 ng/ml NGF를 함유하는 N3/F12 중에서 밤새 성장시킨 후, NGF 항체 (25 μg/ml)를 첨가하여 20시간의 NGF 박탈을 수행하였다. 세포를 PFA/수크로스로 고정하고, 튜불린에 대해 표지하였다.
자동화 연속적 축삭 길이 측정을 하기와 같이 수행하였다. 흑색 벽 96 웰 BD 바이오코트 플레이트를 2X 바이닝으로 레이저 기반 및 이미지 기반 포커싱을 이용하여 4X 대물렌즈가 장착된 이미지엑스프레스(ImageXpress)® 마이크로 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))에 의해 영상화하였다. 노출 시간은 200 밀리초였다. 단일 웰은 메타익스프레스(MetaExpress)에서 함께 철해진 9개의 영상으로 구성되었다. 각 웰을 "혈관신생 튜브 길이" 플러그-인으로 분석하였다. "세트당 튜브 길이" 또는 "연속적 축삭 길이"의 등가물을 3-24 웰 사이에서 평균내었다.
NGF 회수 후에, 축삭은 통상적으로 20시간 내에 변성되었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, siRNA에 의한 dleu2 및 tbx6 발현의 감소는 NGF 회수 후에 축삭 변성을 감소시켰다. 이들 데이터는 NGF-회수 유발된 축삭 변성에 dleu2 및 tbx6이 관련되었음을 나타낸다.
유사한 실험을 또한 GSK3 (GSK3S9A)의 구성적 활성 버전의 존재 하에 수행하였다. GSK3S9A의 과다발현은 축삭 변성을 유발한다. tbx6 및 dleu2 상향조절이 GSK3에 의존하기 때문에, tbx6 및 dleu2 녹다운이 GSK3 활성화의 축삭 변성 하류를 차단할 수 있는지의 여부를 시험하기 위해 상기 녹다운을 수행하였다.
간략하게, 해마/피질 조직을 E19 스프라그 돌리 래트 배아 (찰스 리버(Charles River))로부터 제거하고, 트립신 소화 후에 해리시켰다. Nbactiv4® 배지 (브레인비츠(Brainbits)) 중 20,000개의 살아있는 세포를 96 웰 PDL-사전 코팅된 바이오코트 플레이트 (BD 바이오사이언시스)의 각 웰에 플레이팅하였다. 배양물에서 5일 후, 세포를 구성적 활성 버전의 GSK3 (S9A) 또는 공벡터; 풀링한 siRNA (tbx6 또는 dleu2에 대해 상기 기재된 3개의 siRNA); 및 마커로서의 GFP로 형질감염시켰다. 발현 1 및 3일 후에 (6-8 DIV) 세포를 PFA/수크로스로 고정하고, GFP 1차 항체 (인비트로젠)에 이어서 알렉사 플루오르-488 2차 (인비트로젠)로 표지하였다.
도 5에서 확인할 수 있듯이, dleu2 및 tbx6의 녹다운은 GSK 활성화에 의해 유발된 축삭 변성에 대항하여 보호를 제공하였다. 이들 데이터는 GSK3이 축삭 변성을 위한 dleu2 및 tbx6의 상향조절을 포함하는 전사 프로그램을 조절한다는 것을 뒷받침한다. 사실상, 축삭이 국부적으로 p38MAP 키나제 억제제의 존재 하에 12시간 동안 NGF 박탈된 경우에, dleu2 및 tbx6 둘 모두의 발현은 NGF의 존재 하에 관찰된 것과 유사한 수준으로 감소하였다. 이들 데이터는 p38MAP 키나제가 delu2 및 tbx6을 포함하는 축삭 변성 전사 프로그램에서 GSK의 상류일 수 있음을 시사한다.
실시예 4 - AD 및 PD 환자에서의 tbx6 및 dleu2 유전자 발현의 분석.
2개의 유전자, tbx6 및 dleu2는 경시적 마이크로어레이 분석에서 축삭 변성을 겪은 뉴런에서 과다발현되는 것으로 확인되었다. 이들 유전자의 생성물이 신경변성 질환에서 역할을 하는지의 여부를 결정하기 위해, 질환에 걸린 환자로부터의 뇌 샘플을 검사하여 tbx6 및 dleu2의 발현을 측정하였다.
인간 tbx6 및 dleu2 유전자 발현을 유전자 발현 정보 (진익스프레스(GeneExpress)®, 진 로직 인크.(Gene Logic Inc.), 메릴랜드주 게이더스버그)를 함유하는 전매 데이터베이스를 이용하여 분석하였다. 진익스프레스® 데이터베이스의 그래프 분석을 마이크로어레이 프로파일 뷰어를 이용하여 수행하였다. 도 6은 정상의 비-질환 환자와 비교한, AD를 앓는 인간 환자로부터 뇌의 해마 부분에서의 tbx6 및 dleu2 유전자 발현의 그래프 표시이다. 그래프의 y-축 눈금은 혼성화 신호 강도에 기반한 유전자 발현 수준을 나타낸다. 도 6은 정상 대응물과 비교하여 질환이 있는 뇌 조직에서의 상승된 txb6 및 dleu2 유전자 발현을 보여주며, 이는 이들 유전자가 AD 및 PD 인간 질환에 연루되고 따라서 AD에 대한 바이오마커가 된다는 것을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc.; et al. <120> METHODS FOR DETECTING NEURODEGENERATIVE DISEASES OR DISORDERS <130> P4531R1WO <150> US 61/417,701 <151> 2010-11-29 <160> 12 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 1 gauaggcgau uaagguuuat t 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 2 uucagcugug ugauccuagg g 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is snythesized <400> 3 cgggaaucaa acaagucuat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 4 uagacuuguu ugauucccgt t 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 5 gaaacacgau acuucuugat t 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 6 ucaagaagua ucguguuuct g 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 7 gaagaaacua caacauguat t 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 8 uacauguugu aguuucuuct g 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 9 ccugauuugg auacuucuat t 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 10 uagaaguauc caaaucaggg t 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 11 cuaggaucac acagcugaat t 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <400> 12 uucagcugug ugauccuagg g 21

Claims (32)

  1. 대상체가 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 참조 샘플에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는 세포를 포함하는지의 여부를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 상기 세포의 존재는 대상체가 신경변성 장애를 갖는 것을 나타내는 것인, 대상체에서 신경변성 장애를 진단하는 방법.
  2. 대상체가 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 참조 샘플에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는 세포를 포함하는지의 여부를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 상기 세포의 존재는 대상체가 신경변성 장애에 대한 지속적 치료를 필요로 하는 것을 나타내는 것인, 신경변성 장애에 대해 치료된 대상체에서 질환을 모니터링하는 방법.
  3. 대상체가 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 참조 샘플에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는 세포를 포함하는지의 여부를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 상기 세포의 존재는 신경변성 장애가 발병할 대상체에 대한 소인을 나타내는 것인, 신경변성 장애가 발병할 대상체의 소인을 평가하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 뉴런인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터 생물학적 샘플을 채취하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 생물학적 샘플이 뇌척수액, 뇌 조직, 전혈, 혈장 및 혈청으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 포함하는지의 여부를 결정하는 것이 생체내에서 수행되는 것인 방법.
  8. 뉴런이 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 뉴런 변성을 겪지 않은 뉴런에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는지의 여부를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나의 증가된 발현은 뉴런이 뉴런 변성의 위험에 있고/거나 뉴런 변성을 겪고 있는 것을 나타내는 것인, 뉴런이 뉴런 변성의 위험에 있고/거나 뉴런 변성을 겪고 있는지의 여부를 결정하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나의 발현 수준이 RNA 발현 또는 단백질 발현, 또는 그의 조합에 기반하여 결정되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나의 발현이 PCR 방법, 마이크로어레이 칩 또는 그의 조합을 이용하여 결정되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 tbx6 및 dleu2 유전자 중 적어도 하나의 발현이 면역검정을 이용하여 결정되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 면역검정이 ELISA인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, dleu2의 발현이 PCR 방법, 마이크로어레이 칩 또는 그의 조합을 이용하여 측정되고, tbx6의 발현이 면역검정을 이용하여 측정되는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제4항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나의 발현이 자기 공명 영상화 (MRI), 양전자 방출 단층촬영 (PET), 단일 광자 방출 단층촬영 (SPECT), X선 컴퓨터 단층촬영 (CT), 형광-매개 분자 단층촬영 (FMT), 형광 반사 영상화 (FRI), 생물발광 영상화 (BLI), 감마 영상화 및 자기 공명 분광분석법으로 이루어진 군으로부터 선택된 영상화 방법을 이용하여 결정되는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, tbx6 및 dleu2 둘 다의 발현이 결정되는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 신경변성 장애가 알츠하이머병 (AD), 루이 소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증을 수반하는 유전성 뇌출혈 (네덜란드 유형); 괌 파킨슨-치매 복합증; 뿐만 아니라 아밀로이드-유사 단백질을 기반으로 하거나 또는 이와 연관된 다른 질환, 예컨대 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증, 크로이츠펠트 야콥병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, ALS (근위축성 측삭 경화증), 성인 발병 당뇨병, 노인성 심장 아밀로이드증, 내분비 종양, 녹내장, 알렉산더병, 알퍼병, 모세혈관확장성 운동실조, 배튼병 (또한 스필마이어-보그트-쇼그렌-배튼병으로도 공지됨), 소 해면상 뇌병증 (BSE), 카나반병, 코케인 증후군, 피질기저 변성, 헌팅톤병, 케네디병, 크라베병, 마차도-요셉병 (제3형 척수소뇌성 운동실조), 다계통 위축, 신경보렐리아증, 펠리제우스-메르츠바허병, 픽병, 원발성 측삭 경화증, 프리온 질환, 레프숨병, 샌드호프병, 쉴더병, 악성 빈혈에 속발성인 척수의 아급성 연합 변성, 정신분열증, 척수소뇌성 운동실조 (다양한 특성을 갖는 다중 유형), 척수성 근육 위축, 스틸-리차드슨-올스제위스키병, 척수로, 샤르코-마리-투스병, 지중해열, 머클-웰스 증후군, 특발성 골수종, 아밀로이드 다발신경병증, 아밀로이드 심근병증, 노인성 전신 아밀로이드증, 아밀로이드 다발신경병증, 아밀로이드증을 수반하는 유전성 뇌출혈, 다운 증후군, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군, 갑상선의 수질 암종, 고립성 심방 아밀로이드, 투석 환자에서의 β2-마이크로글로불린 아밀로이드, 봉입체 근염, 근육 소모 질환에서의 β2-아밀로이드 침착물, 랑게르한스섬 제II형 당뇨병 인슐린종 및 다른 아밀로이드증-관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 신경변성 장애가 알츠하이머병 (AD)인 방법.
  18. 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나의 발현을 검출하기 위한 프로브, 및 대상체가 유전자 tbx6 및 dleu2 중 적어도 하나를 정상의 참조 샘플에서의 각각의 유전자의 발현 수준보다 더 높은 수준으로 발현하는 세포를 포함하는지의 여부를 결정하기 위한 프로브의 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 세포의 존재가, 대상체가 신경변성 장애를 갖는 것을 나타내는 것인 키트.
  20. 제18항에 있어서, 상기 세포의 존재가, 대상체가 신경변성 장애에 대한 지속적 치료를 필요로 하는 것을 나타내는 것인 키트.
  21. 제18항에 있어서, 상기 세포의 존재가, 신경변성 장애가 발병할 대상체에 대한 소인을 나타내는 것인 키트.
  22. 제18항에 있어서, 상기 세포의 존재가, 세포가 신경변성을 겪고 있거나 또는 신경변성에 대한 소인이 있는 것을 나타내는 것인 키트.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 뉴런인 키트.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 프로브가 표지된 것인 키트.
  25. 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 프로브가 폴리뉴클레오티드, 항체 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 키트.
  26. 제25항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 키트.
  27. 제25항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 안티센스 폴리뉴클레오티드인 키트.
  28. 제25항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 펩티드 핵산 (PNA)인 키트.
  29. 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 프로브가 뇌 표적화 펩티드에 접합된 것인 키트.
  30. 제29항에 있어서, 뇌 표적화 펩티드가 인슐린, 트랜스페린, 항-트랜스페린 수용체 항체 또는 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 키트.
  31. 제18항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 신경변성 장애가 알츠하이머병 (AD), 루이 소체 치매, 다운 증후군, 아밀로이드증을 수반하는 유전성 뇌출혈 (네덜란드 유형); 괌 파킨슨-치매 복합증; 뿐만 아니라 아밀로이드-유사 단백질을 기반으로 하거나 또는 이와 연관된 다른 질환, 예컨대 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증, 크로이츠펠트 야콥병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, ALS (근위축성 측삭 경화증), 성인 발병 당뇨병, 노인성 심장 아밀로이드증, 내분비 종양, 녹내장, 알렉산더병, 알퍼병, 모세혈관확장성 운동실조, 배튼병 (또한 스필마이어-보그트-쇼그렌-배튼병으로도 공지됨), 소 해면상 뇌병증 (BSE), 카나반병, 코케인 증후군, 피질기저 변성, 헌팅톤병, 케네디병, 크라베병, 마차도-요셉병 (제3형 척수소뇌성 운동실조), 다계통 위축, 신경보렐리아증, 펠리제우스-메르츠바허병, 픽병, 원발성 측삭 경화증, 프리온 질환, 레프숨병, 샌드호프병, 쉴더병, 악성 빈혈에 속발성인 척수의 아급성 연합 변성, 정신분열증, 척수소뇌성 운동실조 (다양한 특성을 갖는 다중 유형), 척수성 근육 위축, 스틸-리차드슨-올스제위스키병, 척수로, 샤르코-마리-투스병, 지중해열, 머클-웰스 증후군, 특발성 골수종, 아밀로이드 다발신경병증, 아밀로이드 심근병증, 노인성 전신 아밀로이드증, 아밀로이드 다발신경병증, 아밀로이드증을 수반하는 유전성 뇌출혈, 다운 증후군, 게르스트만-스트라우슬러-샤잉커 증후군, 갑상선의 수질 암종, 고립성 심방 아밀로이드, 투석 환자에서의 β2-마이크로글로불린 아밀로이드, 봉입체 근염, 근육 소모 질환에서의 β2-아밀로이드 침착물, 랑게르한스섬 제II형 당뇨병 인슐린종 및 다른 아밀로이드증-관련 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 키트.
  32. 제31항에 있어서, 신경변성 장애가 알츠하이머병인 키트.



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