CN102000332A - 一种用于鸭禽流感口服黏膜免疫的复合佐剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及口服灭活疫苗的一种黏膜免疫的复合佐剂，属于生物技术领域，专用于口服灭活疫苗的应用。其配方为：20～50μg CpG DNA、2～5mg黄芪多糖和70～100mg葡萄糖。本发明(复合黏膜免疫佐剂)能够有效提高黏膜局部免疫和全身体液免疫力。同时复合佐剂与禽流感灭活抗原配合，通过饮水免疫就可以激发动物机体产生有效的全身免疫应答水平，避免肌肉注射引起的鸭群应激反应，也为提高鸭肉品质提供了保证。

Description

一种用于鸭禽流感口服黏膜免疫的复合佐剂

一、技术领域

本发明涉及一种用于鸭禽流感口服黏膜免疫的复合佐剂，属于生物技术领域。专用于提高灭活疫苗的黏膜免疫效果。

二、背景技术

1消化道黏膜免疫的特点

黏膜免疫系统是指机体与外界相通的腔道(包括呼吸道、消化道及泌尿生殖道)黏膜表面的免疫。该系统在体内的覆盖面积很大(超过400m²)，形成动物体防御外界病原物的第一道屏障，因此黏膜免疫系统在机体免疫系统中占有非常重要的地位。消化道淋巴组织亦称肠相关淋巴组织(GALT)。分泌型IgA是黏膜免疫的主要效应因子，它不仅具有中和病毒、抑制微生物吸附的作用，还具有免疫排斥及促天然抗菌因子的功能。

黏膜免疫系统的传入诱导部位为派伊尔氏斑(Peyer’s Patches，PP)和淋巴滤泡，派伊尔氏斑位于回肠黏膜固有层并深入到黏膜下层，鸡的派伊尔氏斑为一粉红色椭圆形斑，位于回盲交界处上方。派伊尔氏斑分为三个区：①特化圆顶上皮区，②滤泡区或B细胞区，③滤泡旁区或T细胞区。圆顶上皮区有特殊化的抗原识别细胞或称M细胞，它吞饮肠腔内多种抗原。抗原被转运到派伊尔氏斑，在滤泡区受到加工，引起抗原特异性B和T淋巴细胞兴奋。随后它们离开派伊尔氏斑，转移到黏膜固有层和上皮内的淋巴细胞。派伊尔氏斑内的T细胞可激活B细胞，产生IgA。

黏膜免疫系统的传出效应部位为黏膜固有层和上皮内的淋巴细胞。正常情况时，肠黏膜固有层持续地含有大量浆细胞，其中70％～90％分泌IgA。固有层内浆细胞的前体来自派伊尔氏斑，通过肠系膜淋巴和胸导管而到黏膜固有层。巨噬细胞占固有层内淋巴细胞的10％。研究表明，上皮内淋巴细胞具有细胞毒活性和自然杀伤性淋巴细胞的活性，能分泌多种细胞因子，参与肠道抗感染免疫和经口免疫耐受的形成，并在调节肠黏膜上皮细胞功能方面起重要作用。微皱褶细胞(Microfold cell)简称M细胞，是一种特化的扁平上皮细胞，与肠上皮细胞紧密排列在一起。微皱褶细胞浆具有丰富的吞饮小泡和线粒体。鸡的派伊尔氏斑处也存在微皱褶细胞，并具有很强的饮液活性。微皱褶细胞主要摄取和运输颗粒性抗原，如某些病毒、细菌等抗原性物质。

黏膜免疫的效应位点也是诱导位点，消化道派伊尔氏斑中B细胞受到抗原刺激后形成致敏的淋巴细胞通过全身循环除再分布到消化道以外还可散布到其它黏膜效应位点(如乳腺、支气管黏膜、生殖道黏膜等)，B细胞在这些部位进行克隆扩增，一旦再接触到相同抗原，在Th细胞和其分泌的细胞因子的辅助下，分化为分泌IgA的浆细胞。

2黏膜免疫佐剂的研究进展

目前，黏膜免疫佐剂已成为黏膜免疫的研究热点之一，它能引起局部和全身的免疫反应。研究主要类型有细菌佐剂、核酸佐剂、细胞因子佐剂、无机成分佐剂和投递系统。

研究发现卡介苗中含有特殊的核酸序列——CpG基序(寡脱氧核苷酸)，能特异性的增加抗原的免疫原性。目前把含有未甲基化CpG基序的DNA、细菌的质粒DNA以及人工合成的寡核甘酸统称为CpG DNA，即核酸佐剂或具有免疫刺激作用的DNA序列(immunostimulatory sequences，ISS)，当将它们与蛋白质抗原的疫苗共同使用时，可诱导以细胞免疫为主的免疫反应。试验证实，CpG DNA作为黏膜佐剂能促进机体对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的系统和黏膜免疫应答。CpG DNA可改进其它佐剂诱导Th2类型应答的缺点，如把CpG DNA与霍乱毒素或氢氧化铝等佐剂联用，先诱导出混合型的Th1和Th2类应答，然后转向Th1类型的应答。

黄芪多糖(Astraglus Polysacchride，APS)是从植物黄芪中提取出的一种免疫活性物质，能够增强机体免疫功能、增强细胞代谢，还可以作为免疫佐剂，具有免疫增强的功能。此外，黄芪多糖还具有符合安全、稳定、低成本、可降解等黏膜免疫佐剂的优点。黄芪多糖与金黄色葡萄球菌灭活苗混合免疫家兔和奶牛，血清特异性抗体滴度增加快且明显提高，且抗体维持在一个较高水平。小鼠口服黄芪液能促进免疫反应早期阶段的T细胞和B细胞的前体细胞增生。目前黄芪多糖口服液也已用于提高人类的免疫力。因此黄芪多糖是一种有效的黏膜免疫佐剂。

高浓度葡萄糖可使紧密连接相关蛋白Zo-1表达减少，细胞间连接松懈，增加黏膜上皮细胞的通透性。本试验应用高浓度葡萄糖主要是增加禽流感灭活抗原的吸收。从本试验中可以看出应用CpG DNA、黄芪多糖和高浓度葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫鸭，小肠局部禽流感特异性抗体水平和IL-2和IL-6水平显著或极显著高于单独应用禽流感灭活抗原和单独应用葡萄糖的水平，表明高浓度葡萄糖可能只促进禽流感抗原或CpG DNA的吸收而没有免疫增强剂的作用，如果要提高灭活病毒抗原的黏膜免疫效果不仅需要高浓度葡萄糖促进吸收，还需要免疫佐剂的配合。

3黏膜免疫佐剂在消化道黏膜免疫中的意义

动物传染病的传播大多都以消化道和呼吸道为主要途径。口服弱毒疫苗可以直接刺激小肠黏膜内的淋巴细胞产生大量的IgA和多种细胞因子，在肠黏膜表面形成一层保护膜，防御病原微生物的入侵。研究与实践证明消化道黏膜免疫不仅在黏膜局部和其它黏膜组织产生免疫应答，还可引起全身性的体液免疫应答，因此黏膜免疫受到国内外免疫学家的关注。消化道免疫(口服免疫)方法简便，省时省力，操作时不会引起动物的应激反应，特别适用于大规模养殖的小型动物的免疫接种。但是单独应用灭活抗原和灭活疫苗不能引起有效的免疫应答。免疫佐剂是掺入疫苗制剂后能促进、延长或增强对疫苗抗原特异性免疫应答的物质。近来发现应用免疫增强剂配合灭活疫苗通过黏膜免疫动物可以取得较好的效果。本试验巧妙地运用免疫增强剂CpG DNA和中药免疫增强剂黄芪多糖，再配合黏膜促进吸收剂——高浓度葡萄糖作为鸭源禽流感抗原的复合佐剂，通过饮水免疫显著提高了鸭黏膜局部和系统的免疫水平。

4饮水免疫预防鸭禽流感的意义

目前禽流感的发生给我国乃至全球养禽业均带来了严重的经济损失。禽流感不仅在家禽中广泛传播，近几年水禽等其他动物感染禽流感病毒(AIV)发病和死亡的报道也越来越多。水禽在感染禽流感后不仅能发病死亡，而且病毒可经宿主粪便排出体外，从而污染环境，感染其他禽类和哺乳动物，因此控制水禽的禽流感对禽流感的防控具有重要的意义。

预防禽流感有效的方法是注射禽流感疫苗。我国目前采取的主要方式是肌肉注射油乳佐剂全病毒灭活苗，但此种免疫方式存在以下缺点：浪费人力物力、注射时产生的应激反应影响动物生长、油乳佐剂的残留影响肉质等，另外水禽如鸭身体的特殊构造(鸭羽毛湿滑、鸭绒茂密)也给肌肉注射带来更大的困难。消化道和呼吸道是诸多病原微生物感染的主要途径，如果通过饮水免疫直接切断病原微生物的入侵和向外界释放的途径，将有助于预防禽流感等传染性疾病。研究表明饮水免疫是预防消化道感染的有效途径。饮水免疫与传统肌肉注射相比简便安全，省时省力，减少家禽的应激反应，避免对增重和产蛋的影响，适于大规模养鸭。同时，由于饮水免疫时疫苗只作用于家禽的消化道黏膜组织(这些部位在家禽肉质品加工中均被抛弃)，不会对禽类产品的质量产生较大影响，从而有利于我国鸭肉产品的出口。能否将这一方法推广应用，有良好的免疫效果是基本前提。复合黏膜免疫佐剂的应用可以提高免疫效果，同时降低养殖业的免疫成本。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种灭活疫苗口服黏膜免疫的复合佐剂，用于增强鸭局部黏膜抵抗禽流感的免疫力和全身免疫力。

技术方案

本发明提供了一种用于鸭禽流感口服黏膜免疫的复合佐剂，其配方为：20～50μgCpGDNA、2～5mg黄芪多糖和70～100mg葡萄糖。

有益效果

1、本发明选取鸭源禽流感灭活抗原(由江苏省农科院兽医所购买，抗原标准：毒株为H9N2亚型病毒，代号为NJ01，HA为2¹⁰，ELD₅₀为10^-8.32/0.1ml)配合CpG DNA、黄芪多糖和高浓度葡萄糖饮水免疫雏鸭，检测鸭小肠局部黏膜免疫反应和全身免疫反应。结果发现鸭消化道局部黏膜免疫反应和全身免疫反应都得到显著提高。局部黏膜免疫反应包括小肠中肥大细胞、上皮内淋巴细胞、IgA分泌细胞及IgG分泌细胞数量，小肠IL-2和IL-6水平，小肠内容物中特异性SIgA及IgG抗体水平；全身免疫反应主要是血清中禽流感特异性抗体。本发明的口服黏膜免疫的复合免疫佐剂显著提高了鸭抵抗禽流感的免疫力。大肠杆菌牦牛株，为南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室保存菌种，公开文献发表。(唐泰山.新型免疫佐剂细菌核酸动物免疫增强试验[D].南京农业大学硕士论文.2001)

2、攻毒保护试验和横向传播试验证明口服黏膜免疫的复合佐剂配合禽流感灭活抗原饮水免疫可以有效保护鸭群抵抗病毒感染，阻止病毒排出污染环境，进而阻止敏感鸭群感染。

3、由于鸭是禽流感病毒的自然贮存库，禽流感病毒感染鸭后主要是在大肠复制，而且病毒能以很高的滴度通过粪便排出体外，污染环境，继续感染其他禽类和哺乳动物。本发明复合黏膜免疫佐剂的特点在于：消灭了禽流感病毒散播的来源，大大减少禽流感病毒的污染，为控制禽流感的发生具有重要的意义。

4、可将此复合佐剂试用于其它灭活疫苗的饮水免疫，减少肌肉注射带来的应激和对肉质品的影响。

5、现有技术中《用于禽流感灭活抗原的鼻腔免疫复合佐剂》(专利号：ZL 2007 10024385.5)只能用于禽流感灭活抗原鼻腔黏膜免疫。其中应用的黏膜促进吸收剂是胆酸钠，但胆酸钠在小肠中也存在，应用胆酸钠作为口服疫苗佐剂就不会发挥理想的效果。因此本发明应用的黏膜促进吸收剂是高浓度葡萄糖。《口服疫苗的复合黏膜免疫佐剂》(专利号：ZL 200610085419.7)与《一种黏膜免疫的复合佐剂》(专利号：ZL 200610085420.X)均只能用于活病毒(鸡新城疫病毒)抗原的免疫。本发明是应用于灭活抗原(禽流感)的免疫。本专利增加了黏膜促进吸收剂葡萄糖(可促进灭活抗原在小肠的吸收)。这是目前唯一的应用于禽流感灭活抗原的口服黏膜免疫佐剂。

四、附图说明

图1高浓度葡萄糖对几种荧光标记分子在Caco-2细胞单层中转运量的影响

图2复合佐剂对血清中禽流感特异性HI抗体水平的影响

图3复合佐剂对咽的IgA分泌细胞数量变化的影响

图4复合佐剂对咽的IgG分泌细胞数量变化的影响

图5复合佐剂对小肠的IgA分泌细胞数量变化的影响

图6复合佐剂对小肠的IgG分泌细胞数量变化的影响

图7复合佐剂对咽的特异性IgA水平变化的影响

图8复合佐剂对咽的特异性IgG水平变化的影响

图9复合佐剂对小肠的特异性IgA水平变化的影响

图10复合佐剂对小肠的特异性IgG水平变化的影响

图11复合佐剂对血清中特异性IgA水平变化的影响

图12复合佐剂对血清中特异性IgG水平变化的影响

图13复合佐剂对小肠的IEL细胞数量变化的影响

图14复合佐剂对咽的肥大细胞数量变化的影响

图15复合佐剂对小肠的肥大细胞数量变化的影响

图16复合佐剂对小肠IL-2水平变化的影响

图17复合佐剂对小肠IL-6水平变化的影响

五、具体实施方式

第一部分：前期试验

1高浓度葡萄糖促进荧光标记分子的转运

应用人结肠腺癌细胞单层(Caco-2细胞，购自上海中科院细胞库)和荧光渗透性标记分子(购自Sigma公司)FITC(MW 389.4)、FD20S(MW 70,000)和FD2000S(MW 2,000,000)作为细胞旁路转运试验，由于其亲水特性，只能专一的从细胞旁路转运，作为证实高浓度葡萄糖促进吸收的上的试验。加入葡萄糖(750mmol/L)2h后发现高浓度葡萄糖(750mmol/L)极显著提高了FD2000S转运量(P＜0.01)(图1)。

2高浓度葡萄糖促进胶原酶在小鼠小肠上皮的吸收

应用高浓度葡萄糖(1500mmol/L)和FITC标记的胶原酶(0.25ml)进行小鼠灌胃，发现高浓度葡萄糖可显著促进胶原酶的转运效率(P＜0.05)，在2h时，促吸收率可增加29.25±3.43％。

以上表明高浓度葡萄糖可能促进禽流感灭活抗原在小肠的吸收。

第二部分：后期工作

首先进行鸭IgA和IgG的提取及兔抗鸭IgA和IgG血清的制备

然后进行以下动物试验：

7日龄雏鸭(江南家禽育种有限公司购买)100只随机分成4组，每组25只。第1组应用生理盐水饮水免疫雏鸭；第2组应用鸭源禽流感灭活抗原(0.3ml/只)饮水免疫雏鸭；第3组应用鸭源禽流感灭活抗原(0.3ml/只)配合葡萄糖(72mg/只)饮水免疫雏鸭；第4组应用鸭源禽流感灭活抗原配合CpG DNA(20～50μg/只)、黄芪多糖(2～5mg/只)和葡萄糖(70～100mg/只)饮水免疫雏鸭。10日龄首次免疫，用注射器从口腔滴注0.30ml/只；14日龄二次免疫，20日龄时再进行一次加强免疫，方法剂量与首次免疫相同。

其中应用的材料

1)CpG DNA提取方法：参考崔义邦等文献中介绍的方法。(《细菌CpG DNA对鸡接种禽流感病毒H9亚型灭活苗的免疫增强作用》中国兽医学报，2005，25(2)：135-137)

大肠杆菌牦牛株液体培养基接种牦牛大肠杆菌，使菌液浓度至OD600＝1.5时，取50ml菌液4000g离心10min，弃去上清，收集沉淀。沉淀用19ml TE缓冲液重悬后，加入1ml的质量浓度100g/L的SDS和60μl 20mg/ml的蛋白酶K，37℃消解1h；加入3.4ml 5mol/L NaCl溶液，振荡混合；再加入2.7ml CTAB/NaCl溶液(质量浓度50g/L CTAB、5mol/LNaCl)混匀，65℃温育30min，加等体积酚/氯仿/异戊醇(质量比为25∶24∶1)抽提三次；吸取上层澄清液体，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀-20℃静置1h沉淀CpG DNA，12000g离心10min，弃去上清，用70％乙醇洗涤沉淀2次，室温晾干后-20℃保存。

检测：将提取的CpGDNA沉淀，加200μl TE溶解CpG DNA沉淀，于紫外分光光度仪上测定其A₂₆₀、A₂₈₀的吸光值，若CpG DNA溶解液A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.8-2.0之间，则提取的CpG DNA沉淀为纯品，若其A₂₆₀/A₂₈₀比值不在1.8-2.0之间，则加等体积酚/氯仿/异戊醇(质量比为25∶24∶1)继续抽提(提取方法同上)，使CpG DNA沉淀为纯品。然后加适量TE缓冲液使其终浓度为10μg/μl的CpG DNA溶解液。饮水免疫时每1只鸭需CpG DNA 50μg，即5μl CpG DNA的TE溶解液。

2)鸭源禽流感灭活抗原：江苏省农科院兽医所购买，毒株标准为H9N2亚型病毒，代号为NJ01，红细胞凝集价(HA)为2¹⁰，鸡胚半数致死量(ELD₅₀)为10^-8.32/0.1ml。

3)葡萄糖：购自南京生兴生物技术有限公司，为分析纯。

二次免疫后28小时每组随机选5只，断头剖杀后均取相同部位小肠。首次免疫后第2、3、4、5、6、7周每组随机选取6只雏鸭翅静脉采血，3000rpm离心15分钟制备血清，用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)以l∶8稀释后-20℃保存；首次免疫后第3、5、7周每组随机选取6只试验鸭，进行宰杀取材，取相同部位咽、小肠各两段，一段于-20℃保存，样品于液氮磨碎，称重，然后用PBS按8④l/mg组织的比例溶解，充分混匀，3000rpm离心10min取上清，-20℃保存，另一段于Bounis液固定。用SPA-HRP方法显示咽和小肠中IgA和IgG分泌细胞、用间接ELISA方法检测咽、小肠和血清中禽流感特异性IgA和IgG抗体水平；用苏木精-伊红(HE)方法显示小肠中上皮内淋巴细胞；用甲苯胺蓝染色法显示咽和小肠中肥大细胞；用放免方法检测小肠中IL-2和IL-6水平；用血凝抑制试验(HI)检测血清中禽流感特异性HI抗体水平。最后，通过攻毒试验来验证禽流感灭活抗原配合佐饮水免疫后，鸭群对H9N2病毒攻击的抵抗力及免疫对鸭从粪便中排出病毒的影响；通过同居感染试验来探讨禽流感灭活抗原配合佐剂饮水免疫对病毒扩散的影响。

1局部消化道细胞免疫水平检测

1)咽和小肠中肥大细胞数量的变化

用甲苯胺蓝法显示肥大细胞：常规制备石蜡切片，梯度酒精脱水，染色用中性红染液(中性红0.5g，500ml/L酒精100ml)染30min，甲苯胺蓝染液(0.5mol/L HCl配置5g/L的甲苯胺蓝，调pH为0.5)染30min，丙酮脱色，中性树胶封片，Olympus显微镜观察、拍照。

从图14和15可以看出，在整个免疫期中各组肥大细胞数量呈上升趋势。首免后第3、5、7周，应用禽流感灭活抗原配合CpG DNA(20～50μg/只)、黄芪多糖(2～5mg/只)和葡萄糖(70～100mg/只)饮水免疫雏鸭后咽和小肠中肥大细胞数量比单独应用禽流感灭活抗原显著或极显著增加(P＜0.05；P＜0.01)。特别是咽中肥大细胞数量在首免后第5周增幅达200％。在整个免疫期，单独应用灭活禽流感抗原或用葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫后肥大细胞数量与口腔滴注生理盐水相比均无明显变化(P＞0.05)。

2)小肠中上皮内淋巴细胞的变化

常规制备石蜡切片，常规HE染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。Olympus显微镜观察、拍照。

从图13可以看出。在整个免疫期，各组小肠中上皮内淋巴细胞的数量均呈上升趋势，首免后第3、5、7周，应用禽流感灭活抗原配合CpG DNA(20～50μg/只)、黄芪多糖(2～5mg/只)和葡萄糖(70～100mg/只)饮水免疫雏鸭后小肠中上皮内淋巴细胞数量比单独应用禽流感灭活抗原显著增加(P＜0.05)，数量增加幅度约为25％。在整个免疫期，单独应用灭活禽流感抗原或用葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫后上皮内淋巴细胞数量与口腔滴注生理盐水相比均无明显变化(P＞0.05)。

3)小肠中细胞因子IL-2和IL-6水平变化

应用放免法检测IL-2和IL-6水平：将加强免疫后28h采得样品在液氮中匀浆，用NP-40裂解液(碧云天生物公司)处理，3000rpm离心15min取上清，进行放免检测，试剂盒购自北京华英生物技术研究所。

从图16和17可以看出，应用生理盐水、单独应用禽流感灭活抗原和应用葡萄糖配合禽流感灭活抗原饮水免疫的鸭IL-2和IL-6水平均较低，而应用禽流感灭活抗原配合CpG DNA(20～50μg/只)、黄芪多糖(2～5mg/只)和葡萄糖(70～100mg/只)饮水免疫的鸭在免疫后IL-2和IL-6水平均极显著高于单独应用禽流感灭活抗原的水平(P＜0.01)。IL-2和IL-6水平分别增加132％和52％。

4)咽和小肠中IgA和IgG分泌细胞数量的变化

用SPA-HRP间接染色法检测IgA和IgG分泌细胞：Bouins液固定，常规石蜡切片，切片厚8μm。石蜡切片脱蜡后，放入0.8％H₂O₂处理30min，用含0.4％Triton-100的PBS(pH7.6)洗涤3次，每次5min；滴加5％正常山羊血清封闭30min；弃羊血清后分别滴加适当稀释比例的兔抗鸭IgA或兔抗鸭IgG高免血清，4℃过夜，0.4％Triton-100PBS(pH 7.6)洗涤3次，每次5min；滴加适当稀释的SPA-HRP(Sigma公司)，37℃作用60min；Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH 7.6)洗涤15min；DAB显色，晾干，中性树胶封片。对照组用PBS分别替代兔抗鸭IgA和兔抗鸭IgG。

从图3、4、5和6中可以看出，应用禽流感灭活抗原配合CpG DNA(20～50μg/只)、黄芪多糖(2～5mg/只)和葡萄糖(70～100mg/只)饮水免疫后雏鸭的咽和小肠中IgA和IgG分泌细胞面积比单独应用禽流感灭活抗原显著或极显著增加(P＜0.05；P＜0.01)，特别是小肠中IgA分泌细胞的面积在首免后第3和5周均成倍增加。

2消化道黏膜局部抗原特异性IgA和IgG抗体的检测

用ELISA试验检测血清中消化道黏膜局部抗原特异性IgA和IgG抗体：禽流感抗原包被过夜，脱脂乳37℃封闭2h，洗涤后加待检内容物上清37℃作用1h，洗涤加兔抗鸭IgA和IgG抗体，37℃1h，洗涤后加酶标羊抗兔IgG 37℃作用1h，OPD显色后酶标仪检测。

从图7、8、9和10中可以看出，应用禽流感灭活抗原配合CpG DNA(20～50μg/只)、黄芪多糖(2～5mg/只)和葡萄糖(70～100mg/只)饮水免疫的鸭IgA和IgG(除第7周小肠外)抗体水平与应用禽流感灭活抗原饮水免疫鸭相比均极显著提高(P＜0.01)。

3全身体液免疫水平的检测

1)血清中禽流感特异性HI抗体水平的变化

用血凝抑制试验(HI)检测血清中禽流感特异性HI抗体：用禽流感灭活抗原配制4单位病毒，在96孔反应板上依次加入生理盐水、血清倍比稀释液、4单位病毒和1％鸭红细胞。37℃15min后读数。

从图2中可以看出，应用禽流感灭活抗原配合CpG DNA(20～50μg/只)、黄芪多糖(2～5mg/只)和葡萄糖(70～100mg/只)饮水免疫后，血清中禽流感特异性HI抗体可以在整个免疫期内保持较高水平，首免后2～5周均显著高于单独应用禽流感灭活抗原饮水免疫组(P＜0.05)。尤其是在首免后4周时达到高峰，HI抗体滴度达7.8log2，远远高于国家标准GB/T18936-2003(《高致病性禽流感诊断技术》)中规定的阳性标准5log2。

2)血清中禽流感特异性抗体IgA和IgG水平的变化

应用ELISA试验检测血清中禽流感特异性IgA和IgG抗体：禽流感抗原包被过夜，脱脂乳37℃封闭2h，洗涤后加待检内容物上清37℃作用1h，洗涤加兔抗鸭IgA和IgG抗体，37℃1h，洗涤后加适当稀释后的酶标羊抗兔IgG 37℃作用1h，OPD显色后酶标仪检测。

从图11和12中可以看出，应用禽流感灭活抗原配合CpG DNA(20～50μg/只)、黄芪多糖(2～5mg/只)和葡萄糖(70～100mg/只)饮水免疫的鸭禽流感特异性IgA和IgG抗体水平结果相似，IgA抗体水平均是在首免后第2、3、4、5、6周显著提高(P＜0.05)，IgG抗体水平在第3、4、5、6、7周显著提高(P＜0.05)，在整个免疫期IgA和IgG抗体水平保持在较高水平且稳定，分别于第4和3周时升高至最高点，以后逐渐下降，至首免后第7周，IgA抗体水平虽仍高于单独应用禽流感灭活抗原的水平，但无统计学上的显著差异。

4攻毒保护试验和横向传播试验

1)攻毒保护试验：7日龄雏鸭30只随机分成3组，每组10只。第1组应用生理盐水(0.3ml/只)饮水免疫雏鸭；第2组应用鸭源禽流感灭活抗原(0.3ml/只)饮水免疫雏鸭；第3组应用鸭源禽流感灭活抗原(0.3ml/只)配合CpG DNA(20～50μg/只)、黄芪多糖(2～5mg/只)和葡萄糖(70～100mg/只)饮水免疫雏鸭，首免后第21天用禽流感病毒(病毒为制备灭活抗原用毒株，标准同上)(2ml/只)攻击，攻毒后3、6、9天分别采集泄殖腔棉拭子、空肠和结肠样品，采样后泄殖腔棉拭子放入1.0ml的PBS(含有青霉素和卡那霉素)中，4℃过夜后挤压棉拭子并将其取出，样品置-20℃；小肠和大肠组织样品称重，匀浆，用含上述抗体的PBS配面10％混悬液。在病毒分离前置4℃过夜，按《禽流感病毒控制指导方针》用9～11日龄SPF鸡胚分离病毒。而后测尿囊液HA，HA≥4时判为感染，若无，则进行盲传，盲传至第三代。

病毒分离结果(见表1)：在病毒攻击3天后未免疫鸭有2/3分离到病毒，单独应用禽流感灭活抗原饮水免疫鸭也有1/3分离到病毒，而所有免疫鸭在病毒攻击后均未分离到病毒。结果表明，复合黏膜免疫佐剂配合禽流感灭活抗原饮水免疫鸭虽然没有造成鸭的死亡和明显发病，但可以显著减少禽流感病毒分离阳性率及病毒排出。

2)横向传播试验：7日龄雏鸭24只，12只雏鸭应用生理盐水(0.3ml/只)饮水免疫雏鸭；12只雏鸭应用鸭源禽流感灭活抗原(0.3ml/只)配合CpG DNA(20～50μg/只)、黄芪多糖(2～5mg/只)和葡萄糖(70～100mg/只)饮水免疫雏鸭。抗原及免疫方法与前同。首免后第21日分别取6只用H9N2病毒攻击，攻毒剂量和方法同前。攻毒后取3只免疫未攻毒鸭(C1)与3只免疫攻毒鸭；取3只免疫未攻毒鸭(C2)与3只未免疫攻毒鸭；取3只未免疫未攻毒鸭(D1)与3只免疫攻毒鸭；取3只未免疫未攻毒鸭(D2)与3只未免疫攻毒鸭混合饲养，3天后分开饲养。混合饲养后第3、6、9天采集未攻毒鸭泄殖腔棉拭子。按上述方法对泄殖腔棉拭子进行病毒分离。

结果：从表2可以看出，混合饲养后第3天，分别与免疫攻毒和未免疫攻鸭混合饲养的免疫鸭(即C1和C2组)中，病毒分离阳性鸭数分别为0和1；分别与免疫攻毒和未免疫攻鸭混合饲养的未免疫鸭中，病毒分离阳性鸭数(即D1和D2)分别为1和2。混合饲养后第6天、9天，所有鸭均没分离到禽流感病毒。结果提示：禽流感灭活抗原配合复合佐剂饮水免疫能够在一定程度上减少病毒排出，增强机体对病毒的抵抗力，防止禽流感的传播。

以上两个试验结果表明复合黏膜免疫佐剂配合禽流感灭活抗原饮水免疫可以有效保护鸭群抵抗病毒感染，阻止病毒排出污染环境，进而阻止敏感鸭群感染。

应用

本发明所提供的一种口服黏膜免疫的复合佐剂可用于鸭禽流感灭活抗原口服疫苗，免疫方式相比简单安全，省时省力，减少鸭的应激反应，适于大规模养鸭。显著提高疫苗的免疫效果和降低鸭禽流感病毒向外界的释放。复合佐剂中葡萄糖、黄芪多糖有成品出售，CpG DNA经提取后即可使用。同时，复合佐剂成本较低，免疫时每只需葡萄糖的成本为0.1728分；黄芪多糖的成本为0.018分；CpG DNA的成本为2.1分。每只鸭需佐剂的成本约为2.3分。目前生产中预防禽流感通常都要用灭活油乳佐剂和禽流感抗原肌肉注射进行免疫，每只鸭应用的油乳佐剂(包括白油和乳化剂)成本为1.1分/只，另外还要增加乳化制造过程(需要大型仪器和人员)，成本将为4分/只。因此，应用本发明所提供的复合佐剂预防鸭禽流感不仅方便易行，效果更好，从养殖场的经济上也得到实惠。

表1复合佐剂免疫鸭用禽流感病毒H9N2攻击后病毒分离结果

表2复合佐剂免疫鸭用禽流感病毒H9N2攻击混合饲养后病毒分离结果

Claims (1)

1.一种用于鸭禽流感口服黏膜免疫的复合佐剂，其配方为：20～50μg CpG DNA、2～5mg黄芪多糖和70～100mg葡萄糖。

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