CN109091671A - 鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及兽医药领域，尤其是鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂及其应用。该免疫佐剂鹅特异性寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)的磷酸二酯骨架全部被硫代修饰。本发明通过合成的鹅种属特异性CpG ODN活性序列，为国内首次报道鹅特异性CpG ODN，活性强，能够有效刺激其外周血淋巴细胞增殖，并提高多种免疫基因包括Th1型和Th2型细胞因子mRNA水平的表达，添加至小鹅瘟病毒灭活苗中可促进其早期抗体的产生并提高抗体效价，极大地提高了鹅的免疫机能。

Description

鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂及其应用
技术领域
本发明涉及兽医药领域，尤其是鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂及其应用。
背景技术
近年，随着我国随着鹅产业规模化养殖的发展，鹅细小病毒、鹅圆环病毒、禽流感病毒和新城疫病毒等重要病毒性病原不断危害着鹅的健康，严重降低了鹅的生产性能和经济效益，极大地阻碍了我国鹅产业的发展。疫苗接种是预防病毒性感染的最主要措施，当前在规模化养殖中需要接种多种疫苗，并同时兼顾保证疫苗效果，因此对机体的免疫机能以及免疫佐剂提出了更高的要求，为在生产实践中增强疫苗免疫效果，免疫增强剂和免疫佐剂是当前最有效的提高机体自身免疫力以及疫苗免疫效果的方法。
CpG是指由胞嘧啶(cytosine)、鸟嘌呤(guanine)及使两者相连的磷酸酯键(phosphodiester bond)组成的二核苷酸，CpG二核苷酸及其5’端和3’端的各两个碱基构成CpG基序(CpG motifs)，一般为5'-X1X2CGY1Y2-3'，X1通常是嘌呤，X2通常是嘌呤或者胸腺嘧啶，Y1Y2通常是嘧啶。CpG ODN是含非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(Oligodeoxynucleotides containing CpG motifs)，合成的CpG ODN具有和细菌DNA类似的免疫刺激作用。CpG ODN能被机体Toll样受体((Toll-like receptors,TLR)识别后能够快速激活多种免疫细胞，很多动物实验和临床研究的结果显示，CpG ODN具有强大的促进体液免疫和细胞免疫应答的作用，近年来已被作为新型佐剂用于研究。
目前，根据化学结构和生物学活性，CpG ODN可分为A,B,C和P这4种类型。A型CpGODN的结构一般为部分硫代修饰，中间一般含有典型的回文结构，3’端为poly G尾,能够刺激浆细胞样树突状细胞产生大量的Ⅰ型干扰素，并且具有强烈的刺激NK细胞活化能力；B型CpG ODN的结构为全硫代修饰，无poly G尾巴，能刺激B细胞的增殖和活化；C型兼有A型及B型的结构和功能，具有全硫代修饰骨架，含有回文序列，序列5'端一般有TCG二聚体，能促进浆细胞样树突状细胞成熟以及B细胞增殖和NK细胞活化；P型也具有硫代磷酸键骨架和多个基序，同时该序列具有两个回文序列，类似于C型，但对树突状细胞的刺激作用稍强于对B细胞。
CpG ODN具有较为严格的种属特异性，不同的动物有不同的最佳刺激基序。研究表明GTCGTT是人敏感基序，GACGTT是鼠敏感基序。除种属特异性外，决定CpG ODN刺激活性强弱的因素还包括：CpG基序及其数量与位置、序列长度、间隔序列，高级结构以及化学修饰等。目前，对鹅的CpG ODN研究较少，尚未见相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为了解决背景技术中描述的技术问题，本发明提供了一种鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂及其应用，通过合成的鹅种属特异性CpG ODN活性序列，为国内首次报道鹅特异性CpG ODN，活性强，能够有效刺激其外周血淋巴细胞增殖，并提高多种免疫基因包括Th1型和Th2型细胞因子mRNA水平的表达，添加至小鹅瘟病毒灭活苗中可促进其早期抗体的产生并提高抗体效价，极大地提高了鹅的免疫机能。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂，鹅特异性寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)的磷酸二酯骨架全部被硫代修饰。
具体地，所述鹅特异性CpG ODN为P型CpG ODN。
具体地，所述鹅特异性CpG ODN含有20-25个核苷酸。
具体地，所述鹅特异性CpG ODN包含2个GTCGTC基序。
具体地，所述鹅特异性CpG ODN包含两个回文序列，分别位于5’端和3’端。
具体地，所述鹅特异性CpG-ODN的5’端包含一个TCG刺激序列。
具体地，所述鹅特异性CpG-ODN为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
一种鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂的应用，鹅特异性CpG ODN作为免疫增强剂和免疫佐剂用于治疗鹅病毒病的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂及其应用，通过合成的鹅种属特异性CpG ODN活性序列，为国内首次报道鹅特异性CpG ODN，活性强，能够有效刺激其外周血淋巴细胞增殖，并提高多种免疫基因包括Th1型和Th2型细胞因子mRNA水平的表达，添加至小鹅瘟病毒灭活苗中可促进其早期抗体的产生并提高抗体效价，极大地提高了鹅的免疫机能。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为本发明对鹅外周血淋巴细胞的刺激指数图；
图2为刺激鹅外周血淋巴细胞后各细胞因子的相对表达量图；
图3为各组非免疫鹅免疫后的HI抗体阳性率。
具体实施方式
现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明对鹅外周血淋巴细胞的刺激指数，图2为刺激鹅外周血淋巴细胞后各细胞因子的相对表达量图，图3为各组非免疫鹅免疫后的HI抗体阳性率。
一种鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂，鹅特异性寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)的磷酸二酯骨架全部被硫代修饰。所述鹅特异性CpG ODN为P型CpG ODN。所述鹅特异性CpG ODN含有20-25个核苷酸。所述鹅特异性CpG ODN包含2个GTCGTC基序。所述鹅特异性CpG ODN包含两个回文序列，分别位于5’端和3’端。所述鹅特异性CpG-ODN的5’端包含一个TCG刺激序列。所述鹅特异性CpG-ODN为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
一种鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂的应用，鹅特异性CpG ODN作为免疫增强剂和免疫佐剂用于预防鹅病毒病的应用。
一、鹅特异性CpG ODN的合成
合成SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.2，SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4四种核苷酸序列，其中，磷酸二酯键均被硫代修饰，分别命名为CpG ODN-1，CpG ODN-2，CpG ODN-3和CpG ODN-4。
表1 CpG ODN序列
二、鹅特异性CpG ODN对鹅外周血淋巴细胞的刺激增殖作用
为了检验CpG ODN的种属特异性及其对鹅细胞的刺激增殖效果，可进行鹅外周血淋巴细胞(PBMC)的刺激增殖试验，具体实验步骤如下:
将密度为4×106个/mL的鹅外周血淋巴细胞(PBMC)加入96孔细胞板，每孔100μL，同时用细胞完全培养液稀释将4条不同的CpG ODN序列，分别加入上述96孔板，每孔终体积为104μL,CpG ODN终浓度为20μg/mL，每条CpG ODN序列3个重复，最后置于37℃、5％C02细胞培养箱中培养48h。同时添加阳性对照conA，使其终浓度为2μg/mL；阴性对照(只加入RPMI-1640完全培养液)；空白对照(不加入细胞只加入RPMI-1640完全培养液)。
培养48h后，每孔加入CCK-8染色液10μL，置于细胞培养箱内染色，在加入CCK-8培养4小时后，用酶标仪上测定450nm处的吸光度。
各CpG ODN作用于PBMC的效果以刺激指数(stimμlation index,SI)来衡量，其计算方法为:
SI CpG ODN＝(OD CpG ODN–OD空白对照)/(OD阴性对照–OD空白对照)
根据公式计算不同CpG ODN刺激下PBMC的OD450平均值以及相应的刺激指数，如下表表2和图1所示：与空白对照和阴性对照相比，CpG ODN-1-CpG ODN-4均可刺激细胞增殖，但CpG ODN-1效果显著，SI指数达到1.999，CpG ODN-2，CpG ODN-3和CpG ODN-4分别为1.142，1.052和1.907。4条CpG ODN序列的主要区别在于化学结构的不同，CpG ODN-1和CpGODN-4为P型，CpG-2为B型，CpG ODN-3为C型，除此之外，CpG ODN-1和CpG ODN-4的主要区别在于基序不同，CpG ODN-4的基序为GACGTT，CpG ODN-1的基序为GTCGTC，说明鹅细胞对GTCGTC更为敏感。目前还没有鹅特异性CpG ODN的相关报道，而本发明设计的CpG ODN-1活性强，对鹅外周血淋巴细胞刺激效果好，为后续的研究应用提供了更好的基础材料。
表2不同序列CpG ODN的刺激指数
三、鹅特异性CpG ODN对Th1型和Th2型细胞因子mRNA表达量的影响
为探究鹅特异性CpG ODN对相关免疫基因包括Th1型和Th2型细胞因子mRNA表达量的影响，如Th1型的IL-2,IFN-α,IFN-γ和Th2型的IL-6,IL-10。以GAPDH为内参基因，采用相对定量方法检测，具体操作步骤如下：
将密度为4×106个/mL的鹅外周血淋巴细胞(PBMC)加入96孔细胞板，每孔100μL，同时将CpG ODN用细胞培养液稀释后分别加入上述96孔板，每孔终体积104μL,CpG ODN终浓度为20μg/mL，重复3个孔，轻轻混匀后置于37℃、5％C02细胞培养箱中培养24h。同时添无CpG ODN的阴性对照。24h后取出，用Trizol法提取RNA。
将所提取的RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR。
各基因PCR反应条件相同，95℃预变性1min；95℃，15s，60℃，15s，72℃，45s；
共40个循环；95℃，15s，60℃，15s，95℃，15s，每个样品3个重复。
获得的实验数据使用2-△△ct方法进行定量，以无CpG ODN刺激的细胞为对照，对照的mRNA的相对表达量为1，CpG ODN处理组的2-△△ct数值即为相对于对照组的相对表达量，结果如表6和图2所示。
表5使用的各基因引物序列
表6 CpG ODN刺激鹅外周血淋巴细胞后各细胞因子的相对表达量
四、鹅特异性CpG ODN对小鹅瘟病毒灭活疫苗HI抗体效价的影响
按照生产规程配制合格的半成品，在其中按每只鹅注射剂量要求加入CpG ODN，配制成小鹅瘟病毒-CpG灭活疫苗，同时设立对照组。
本次体内实验CpG ODN工作浓度为20μg/只，CpG ODN量为10OD/管，用PBS定量为终浓度2000μg/mL。
免疫接种40-42日龄非免疫鹅，按表7进行分组，经胸肌注射，接种剂量为0.2mL/只；于首免后14天加强免疫。
表7免疫分组
组别 内容 接种数量
A 小鹅瘟病毒-CpG灭活疫苗 5
B 小鹅瘟病毒灭活疫苗 5
C 对照 5
每组于首免后14天以及二免后10天，21天，42天采集血液，分离血清，检测HI抗体效价，结果见表8。
表8各组非免疫鹅免疫后HI抗体测定结果
结果如表8所示，表中数据显示，A组在二免后10天抗体效价大幅提高(1:640)，在二免后42天仍保持较高水平(1:320和1:160)，而B组虽然在二免后10天抗体效价提高(1:640,1:160),但持续时间短，二免后42天已降至1:10,1:20和1:40，从而说明CpG ODN的添加有助于小鹅瘟疫苗早期抗体的产生，并有效提高抗体效价。
根据测定的抗体效价，计算效价的几何平均数(GMT)，结果如图3所示，与B组相比，A组的GMT值在二免后10天显著提高，并一直维持到二免后42天，表明CpG ODN可显著提高其抗体效价且维持周期长。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
序列表：
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tcgtcgtcgt cgtcgccgcg cgcgg 25
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tcgtcgtcgt cgtcgtcgtc gtcgtcg 27
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tcgtcgtcgt cgtcgtcgtc gat 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
tcgacgttga cgttccgcgc gcgg 24

Claims (8)

1.一种鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂，其特征在于，鹅特异性寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)的磷酸二酯骨架全部被硫代修饰。
2.根据权利要求1所述的鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂，其特征在于：所述鹅特异性CpG ODN为P型CpG ODN。
3.根据权利要求1所述的鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂，其特征在于：所述鹅特异性CpG ODN含有20-25个核苷酸。
4.根据权利要求1所述的鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂，其特征在于：所述鹅特异性CpG ODN包含2个GTCGTC基序。
5.根据权利要求1所述的鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂，其特征在于：所述鹅特异性CpG ODN包含两个回文序列，分别位于5’端和3’端。
6.根据权利要求1所述的鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂，其特征在于：所述鹅特异性CpG-ODN的5’端包含一个TCG刺激序列。
7.根据权利要求1所述的鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂，其特征在于：所述鹅特异性CpG-ODN为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
8.一种根据权利要求1-7中任一项所述的鹅特异性寡脱氧核苷酸免疫佐剂的应用，其特征在于：鹅特异性CpG ODN作为免疫增强剂和免疫佐剂用于治疗鹅病毒病的应用。
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