CN103214579A - 动物融合重组型干扰素 - Google Patents

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Abstract

本发明关于一种动物融合重组型干扰素，包含一动物干扰素以及一动物免疫球蛋白Fc片段。该动物干扰素以及该动物免疫球蛋白Fc片段进一步可由一连接子所连接。本发明并关于一种编码该动物融合重组型干扰素的多核苷酸、一种制备该动物融合重组型干扰素的方法，以及该动物融合重组型干扰素的用途。

Description

动物融合重组型干扰素
技术领域
本发明关于一种动物融合重组型干扰素，特别是关于一种具有抗动物病毒活性的融合重组型干扰素。
背景技术
干扰素最早是在1957年由英国学者Alick Isaacs和Jean Lindenmann在进行流感病毒试验中所发现，当细胞遭受病毒感染后，会立即制造一种细胞激素，诱发邻近细胞产生抗病毒蛋白，干扰病毒的复制。该细胞激素随后被命名为干扰素(Interferon,IFN)。干扰素的抗病毒作用，主要是由第一型干扰素(IFNα/β)所负责。干扰素除了具有抗病毒作用外，还具有抗肿瘤、促进细胞分化和免疫调节等功用。
目前市面上的干扰素制剂，多为针对人类所开发设计，例如：用来治疗人类B型与C型肝炎等病毒性疾病以及卡波西氏瘤(Kaposi’s sarcoma,KS)、黑色素肿瘤(malignant melanoma)等肿瘤疾病上的干扰素。
至于经济动物方面，以干扰素治疗病毒性疾病的情形并不普遍。若无有效的疫苗来预防某一动物病毒，当畜群受该病毒感染时，只能使用支持性疗法处理，但效果往往不彰，而造成畜牧业重大损失；因此，动物干扰素的开发，对动物保健产业而言，可说是刻不容缓且极为重要的事。
发明内容
本发明于第一部份中提供一种动物融合重组型干扰素。由于干扰素属于小分子蛋白质，在体内半衰期短(约2-8小时)且不稳定，因此本发明所提供的动物融合重组型干扰素是将动物干扰素蛋白与半衰期较长的动物免疫球蛋白IgG-Fc片段融合，而形成较稳定的动物融合重组型干扰素。于一较佳实施例中，该动物干扰素蛋白以及该动物免疫球蛋白IgG-Fc片段是以由甘氨酸(Glycine,G)及丝氨酸(Serine,S)组成的连接子(linker)所连接起来的。
于一实施例中，该干扰素蛋白为猪干扰素α，该猪干扰素α系与如SEQ ID Nos:2、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45及47所示之氨基酸序列其中至少一者具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一较佳实施例中，该猪干扰素α选自于由如SEQ ID Nos:2、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45及47所示之氨基酸序列所组成之群组中至少一者。
于一实施例中，该动物免疫球蛋白IgG-Fc片段为猪免疫球蛋白IgG-Fc片段，该猪免疫球蛋白IgG-Fc片段与如SEQ ID Nos:4、49、51、53及55所示之氨基酸序列其中至少一者具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一较佳实施例中，该猪免疫球蛋白IgG-Fc片段选自于由如SEQ ID Nos:4、49、51、53及55所示之氨基酸序列所组成之群组中至少一者。
于一实施例中，该连接子系与如SEQ ID No:6所示之氨基酸序列具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一较佳实施例中，该连接子具有如SEQ ID No:6所示之氨基酸序列。
于一实施例中，该动物融合重组型干扰素系与如SEQ ID Nos:8、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221及223所示之氨基酸序列其中之一具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一较佳实施例中，该动物融合重组型干扰素系选自于由如SEQID Nos:8、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221及223所示之氨基酸序列所组成之群组。
本发明于第二部分中提供一种编码上述动物融合重组型干扰素的多核苷酸。本发明所提供之动物融合重组型干扰素是藉由基因转殖技术而得。首先将编码动物干扰素蛋白的DNA序列，以及编码动物免疫球蛋白IgG-Fc片段的DNA序列选殖到表现载体系统中，形成含有编码动物融合重组型干扰素之DNA序列的质体，再将该质体转殖到表现系统中，经诱导蛋白质表现后而得到动物融合重组型干扰素。
于一较佳实施例中，除了将编码动物干扰素蛋白的DNA序列以及编码动物免疫球蛋白IgG-Fc片段的DNA序列选殖到表现载体系统中，并将编码由甘氨酸及丝氨酸组成的连接子(linker)的DNA序列选殖到该表现载体系统中，以连接该编码动物干扰素蛋白的DNA序列以及编码动物免疫球蛋白IgG-Fc片段的DNA序列。
于一实施例中，该编码动物干扰素蛋白的DNA序列系与如SEQ ID Nos:1、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44及46所示之DNA序列其中至少一者具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一较佳实施例中，该编码动物干扰素蛋白的DNA序列系选自于由如SEQ ID Nos:1、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44及46所示之DNA序列所组成之群组中至少一者。
于一实施例中，该编码动物免疫球蛋白IgG-Fc片段的DNA序列与如SEQ ID Nos:3、48、50、52及54所示之DNA序列其中至少一者具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一较佳实施例中，该编码动物免疫球蛋白IgG-Fc片段的DNA序列选自于由如SEQ ID Nos:3、48、50、52及54所示之DNA序列所组成之群组中至少一者。
于一实施例中，该编码由甘氨酸及丝氨酸组成的连接子(linker)的DNA序列与如SEQ ID No:5所示之DNA序列具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一较佳实施例中，该编码由甘氨酸及丝氨酸组成的连接子的DNA序列系具有如SEQ ID No:5所示之DNA序列。
于一实施例中，该编码动物融合重组型干扰素的DNA序列与如SEQ ID Nos:7、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220及222所示之DNA序列具有至少80%序列同源性，较佳者，具有85%序列同源性，更佳者，具有90%序列同源性，甚至是91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同源性。于一较佳实施例中，该编码动物融合重组型干扰素的DNA序列具有如SEQ ID Nos:7、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220及222所示之DNA序列。
该表现载体可为原核生物表现载体或真核生物表现载体。该原核生物表现载体包含但不限于pET系列表现载体以及pGEX系列表现载体。该真核生物表现载体包含但不限于pSecTag系列表现载体。
该表现系统可为原核生物表现系统(如：细菌)或真核生物表现系统(如：酵母菌、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞等)。于一实施例中，该表现系统为大肠杆菌(Escherichia coli)。于另一实施例中，该表现系统为哺乳动物细胞。可用于本发明动物融合重组型干扰素表现的哺乳动物细胞包含但不限于3T3细胞、中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO cells)、幼鼠肾细胞(baby hamster kidney cells,BHK cells)、人类子宫颈癌细胞(HeLa cells)，以及人类肝癌细胞(HepG2 cells)等。
本发明于第三部分中提供一种以哺乳细胞产制本发明的动物融合重组型干扰素的优化制程。将带有编码本发明的动物融合重组型干扰素的多核苷酸的哺乳细胞先以含有血清的培养基培养，待该细胞生长稳定后，再改为无血清培养基培养，于每隔1-5天更换新的无血清培养基，并收取细胞培养基，以获得本发明的动物融合重组型干扰素。
该哺乳动物细胞包含但不限于3T3细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO cells)、幼鼠肾细胞(BHKcells)、人类子宫颈癌细胞(HeLa cells)，以及人类肝癌细胞(HepG2 cells)等。于一实施例中，该哺乳细胞为中国仓鼠卵巢细胞(CHO cells)。
该血清包含但不限于牛血清以及马血清。于一实施例中，该血清为胎牛血清(fetal bovineserum,FBS)。该血清在培养基中的含量为0.1-10%(v/v)；于一实施例中，该血清含量为5%(v/v)。
本发明于第四部分中提供一种动物融合重组型干扰素在制备动物抗病毒药物中的用途。经试验证明，本发明所提供的动物融合重组型干扰素具有抗病毒效果。分别以DNA病毒(如：伪狂犬病病毒，pseudorabies virus,PRV)以及RNA病毒(如：猪繁殖与呼吸道综合症病毒，porcinereproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)为体外试验(in vitro)测试对象，测试本发明动物融合重组型干扰素的抗病毒活性。结果显示，本发明动物融合重组型干扰素可以有效抑制DNA病毒以及RNA病毒的宿主细胞内的增殖，且抗病毒效果优于未与动物免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重组的动物干扰素。因此，本发明所提供的动物融合重组型干扰素可用来抑制动物病毒在动物体内增殖。
本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。
本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
附图说明
图1A为带有编码猪融合重组型干扰素基因的质体转染至CHO细胞后，以Zeocin抗生素筛选后以IFA分析的结果；图1B为pSecTag2(B)载体转染至CHO细胞后，以Zeocin抗生素筛选后以IFA分析的结果。
图2为将带有编码猪融合重组型干扰素基因的质体或将pSecTag2(B)载体转染至CHO细胞后，以Zeocin抗生素筛选后以ELISA分析的结果。
图3为以不同抗体侦测带有编码猪融合重组型干扰素基因的CHO细胞所表现的蛋白中是否含有猪融合重组型干扰素的结果；第1道：带有编码猪融合重组型干扰素基因的CHO细胞所表现的蛋白的SDS-PAGE分析图；第2道：以mouse anti IFNα单株抗体分析；第3道：以mouse anti His单株抗体分析；第4道：以goat anti porcine IgG抗体分析。
图4为猪融合重组型干扰素(P IFN-Fc组)及未与猪免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重组的干扰素(P IFN组)的抗PRRS病毒及抗PR病毒的活性比较。
具体实施方式
实施例一猪干扰素α1基因选殖
取三品系杂交猪(L×Y-D)的血液分离外围血液单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，并以异硫氰酸胍(guanidine thiocyanate,GTC)法萃取总RNA(total RNA)。接着将萃取的总RNA进行反转录聚合酶连锁反应(reverse polymerase chain reaction,RT-PCR)；先将萃取的RNA以70℃作用3分钟后，将含有20μl总RNA、10μl5x反应液、8μl1.25mM dNTP、1μl3’端互补引子、11μl蒸馏水、0.5μl RNasin以及0.5μl AMV反转录酶的反应管置于42℃作用30分钟，以进行cDNA合成；再将合成后的cDNA进行聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction,PCR)以增殖猪干扰素α1基因(P IFNα1)，在反应管中加入10μl cDNA、5μl10x PCR反应液、8μl1.25mM dNTP、1μl5’端正向引子、1μl3’端反向引子、24μl蒸馏水、1μl Taq聚合酶，混合均匀后放入PCR反应器中(Applied Biosystems GeneAmp PCR system2400)，反应条件为先以95℃5分钟将DNA变性，接着以95℃1分钟、55℃30秒、72℃30秒进行30个循环，最后以72℃5分钟完成PCR反应。其中，猪干扰素α1基因(P IFNα1)的特异性引子序列如下：
正向引子(IFN-F1)：
5’-CCCAAGCTTATGGCCCCAACCTCAGCC-3’(SEQ ID NO:9)
       HindIII
反向引子(IFN-R1)：
Figure BDA00002752283500041
将PCR反应产物以洋菜胶电泳(agarose electrophoresis)分析确认产物片段大小，接着以DNA纯化套组(台湾波仕特公司)进行PCR产物纯化。再分别将纯化后的PCR产物以及表现载体pET20b以限制酶HindIII以及XhoI进行酶切反应后，再以DNA纯化套组(台湾波仕特公司)纯化酶切后的PCR产物及表现载体，接着进行接合反应，将PCR产物选殖到pET20b载体中形成pET20b-IFNα1质体，并将该质体转殖(transformation)至表现宿主大肠杆菌(E.coli)中，选出
带有pET20b-IFNα1质体的大肠杆菌，并进行定序确认增殖的PCR产物序列确实为猪干扰素α1基因(P IFNα1)，猪干扰素α1基因序列如SEQ ID No:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
实施例二猪免疫球蛋白IgG-Fc 4a片段基因选殖
取新鲜猪脾脏，并以GTC法萃取总RNA。接着以RT-PCR进行cDNA合成；取20μl总RNA、8μl1.25mMdNTP以及1μl3’端互补引子，于70℃作用5分钟后置于冰上，加入1μl灭菌水、8μl5xAMV RTbuffer、1μl RNasin和1μl AMV反转录酶，并置于42℃作用1小时，以进行cDNA合成；再将合成后的cDNA进行PCR反应，在反应管中加入1μl cDNA、5μl10x PCR反应液、8μl1.25mM dNTP、1μl5’端正向引子、1μl3’端反向引子、33μl灭菌水、1μl Taq聚合酶，混合均匀后放入PCR反应器中(Applied Biosystems GeneAmp PCR system2400)，反应条件为先以95℃5分钟将DNA变性，接着以95℃1分钟、55℃30秒、72℃30秒进行30个循环，最后以72℃5分钟完成PCR反应。其中，猪免疫球蛋白IgG-Fc 4a片段基因的特异性引子序列如下：
正向引子(IgG-F1)：
反向引子(IgG-R)：
5’-CCCAAGCTTTTTACCCGGAGTC-3’(SEQ ID NO:13)。
       HindIII
将PCR反应产物以洋菜胶电泳分析确认产物片段大小，接着以DNA纯化套组(台湾Geneaid公司)进行PCR产物纯化。再分别将纯化后的PCR产物以及表现载体pET20b以限制酶BamHI以及HindIII进行酶切反应后，再以DNA纯化套组(台湾Geneaid公司)纯化酶切后的PCR产物及表现载体，接着进行接合反应，将PCR产物选殖到pET20b载体中形成pET20b-IgG-Fc 4a质体，并将该质体转殖至表现宿主大肠杆菌(E.coli)中，选出带有pET20b-IgG-Fc 4a质体的大肠杆菌，并进行定序确认增殖的PCR产物序列确实为猪免疫球蛋白IgG-Fc 4a片段基因(P IgG-Fc 4a)，猪免疫球蛋白IgG-Fc 4a片段基因列如SEQ ID No:3所示，其氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。
实施例三猪融合重组型干扰素(P IFN-Fc)DNA序列的构筑
在本实施例中，将实施例一所得的猪干扰素α1基因(P IFNα1)(SEQ ID No:1)以及实施例二所得的猪免疫球蛋白IgG-Fc 4a片段基因(P IgG-Fc 4a)(SEQ ID No:3)以甘氨酸(Glycine,G)及丝氨酸(Serine,S)组成的连接子(linker)的DNA序列(SEQ ID No:5)连接，以构筑猪融合重组型干扰素(P IFNα1-Fc 4a)的DNA序列(SEQ ID No:7)。
首先，以PCR反应分别增幅猪干扰素α1基因(P IFNα1)(SEQ ID No:1)以及猪免疫球蛋白IgG-Fc4a片段基因(P IgG-Fc 4a)(SEQ ID No:3)，并利用PCR引子设计将甘氨酸及丝氨酸组成的连接子的DNA序列(SEQ ID No:5)分段与猪干扰素α1基因(P IFNα1)以及猪免疫球蛋白IgG-Fc 4a片段基因(PIgG-Fc 4a)一同进行PCR反应增幅。其中，猪干扰素α1基因(P IFNα1)的特异性引子序列如下：
正向引子(IFN-F2)：
5’-GCGATATCATGGCCCCAACCTC-3’(SEQ ID NO:13)
       EcoRV
反向引子(IFN-R2)：
Figure BDA00002752283500052
而猪免疫球蛋白IgG-Fc片段基因的特异性引子序列如下：
Figure BDA00002752283500053
反向引子(IgG-R)：
5’-CCCAAGCTTTTTACCCGGAGTC-3’(SEQ ID NO:12)。
       HindIII
在PCR反应管中加入1μl100倍稀释的质体DNA(pET20b-IFNα质体或pET20b-IgG-Fc质体)、5μl10x PCR反应液、8μl1.25mM dNTP、1μl5’端正向引子、1μl3’端反向引子、33μl灭菌水、1μl Taq聚合酶，混合均匀后放入PCR反应器中(Applied Biosystems GeneAmp PCR system2400)，反应条件为先以95℃5分钟将DNA变性，接着以95℃1分钟、55℃30秒、72℃30秒进行30个循环，最后以72℃5分钟完成PCR反应。
将PCR反应产物以洋菜胶电泳分析确认产物片段大小，接着以DNA纯化套组(台湾Geneaid公司)进行PCR产物纯化。再将纯化后的PCR产物猪干扰素α基因(P IFNα1)以限制酶EcoRV以及BamHI进行酶切反应，将纯化后的PCR产物猪免疫球蛋白IgG-Fc 4a片段基因(P IgG-Fc 4a)以限制酶BamHI以及HindIII进行酶切反应，并将表现载体pET20b以限制酶EcoRV以及HindIII进行酶切反应后，再以DNA纯化套组(台湾Geneaid公司)纯化酶切后的PCR产物及表现载体，接着进行接合反应，将PCR产物选殖到pET20b载体中形成pET20b-IFNα1-Fc 4a质体，并将该质体转殖至表现宿主大肠杆菌(E.coli)中，选出带有pET20b-IFNα1-Fc 4a质体的大肠杆菌，并进行定序确认增殖的PCR产物序列确实为本实施例猪融合重组型干扰素(P IFNα1-Fc4a)的DNA序列(SEQ IDNo:7)，而本实施例猪融合重组型干扰素(P IFNα1-Fc 4a)的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示。
实施例四其它猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)DNA序列的构筑
除了实施例一所得的猪干扰素α1基因(P IFNα1)(SEQ ID No:1)之外，猪干扰素α还有α2至α17等亚型(subtype)，猪干扰素α2至α17的DNA序列分别如SEQ ID Nos:16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44及46所示，其氨基酸序列则分别如SEQ ID Nos:17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45及47所示。
此外，除了实施例二所得的猪免疫球蛋白IgG-Fc 4a片段基因(P IgG-Fc 4a)(SEQ ID No:3)之外，本实施例并以猪免疫球蛋白IgG-Fc 1a、1b、2a、2b及4a片段基因(P IgG-Fc 1a,1b,2a,2b,4a)分别与上述猪干扰素α1至α17的DNA序列构筑形成猪融合重组型干扰素。猪免疫球蛋白IgG-Fc 1a、1b、2a、2b及4a片段基因(P IgG-Fc 1a,1b,2a,2b,4a)的DNA序列分别如SEQ IDNos:48、50、52、54及3所示，其氨基酸序列则分别如SEQ ID Nos:49、51、53、55及4所示。
同实施例三所述，分别将猪干扰素α1至α17基因(P IFNα1-α17)(SEQ ID Nos:1、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44及46)以及猪免疫球蛋白IgG-Fc 1a、1b、2a、2b及4a片段基因(P IgG-Fc 1a,1b,2a,2b,4a)(SEQ ID Nos:48、50、52、54及3)以甘氨酸(G)及丝氨酸(S)组成的连接子的DNA序列(SEQ ID No:5)连接，以构筑形成各种猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)的DNA序列(SEQ ID Nos:7、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220及222)，并以DNA合成仪(应用生物系统公司，美国)合成上述各种猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)的DNA序列；合成DNA时，并于各猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)的DNA序列5’端前加上一个EcoRV(GATATC)限制酶切位，以及在各猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)的DNA序列3’端后加上一个HindIII(AAGCTT)限制酶切位。
将5’端及3’端分别带有EcoRV以及HindIII限制酶切位的合成后的各种猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)的DNA以及表现载体pSecTag2(B)分别以限制酶EcoRV以及HindIII进行酶切反应，再以DNA纯化套组(台湾Geneaid公司)纯化酶切后的DNA片段及表现载体，接着进行接合反应，将各DNA片段选殖到pSecTag2(B)载体中形成各种pSecTag2(B)-IFNα-Fc质体，并将该质体转殖至表现宿主大肠杆菌(E.coli)中，选出带有各种pSecTag2(B)-IFNα-Fc质体的大肠杆菌，各猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)的氨基酸序列分别如SEQ ID Nos:8、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221及223所示。
实施例五猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)的表现
先将实施例四所得到的pSecTag2(B)-IFNα1-Fc4a质体转染(transfection)至中国仓鼠卵巢细胞株(CHO cells)。取4μg pSecTag2(B)-IFNα1-Fc 4a质体DNA加入无抗生素且无血清的VP培养基(Invitrogen)中震荡15秒(混合液A)；另外将4μg Lipofectamine试剂(Invitrogen)加入无抗生素且无血清的VP培养基中(混合液B)，于室温下作用5分钟；接着将混合液A加入混合液B中，震荡15秒后于37℃下作用20分钟。再将上述混合液(A+B)均匀加入经过隔夜培养的CHO细胞中，将细胞置于37℃、5%CO2培养箱内作用6小时后，去除混合液并加入含有10%胎牛血清(FBS)的F12培养基，将细胞置于37℃、5%CO2培养箱内继续培养48小时。
接着，以Zeocin抗生素筛选带有猪融合重组型干扰素基因的CHO细胞。将经过转染的CHO细胞株继代培养于24孔细胞培养盘中，以含有10%FBS、100Units/ml Penicillin、100Units/mlStreptomycin和700μg/ml Zeocin抗生素的F12培养基培养以进行筛选。接着将细胞以磷酸盐缓冲液(PBS)清洗两次后加入0.125%胰蛋白酶(Trypsin)进行消化，待细胞圆化后，摇晃角瓶使细胞脱落，以培养基将细胞冲散悬浮，细胞培养于37℃、5%CO2培养箱，继代两次后，待活着的细胞约剩一至两成时，将细胞培养基替换成含有50μg/ml Zeocin抗生素以及10%FBS的F12培养基，待细胞恢复原来生长速度后，以间接免疫荧光染色(IFA)法、酵素连结免疫分析(ELISA)法以及西方墨点法确认细胞是否带有猪融合重组型干扰素(P IFNα1-Fc 4a)基因并且表现该重组蛋白。
1.以间接免疫荧光染色(IFA)法检测猪融合重组型干扰素的表现
将转染的CHO细胞接种在24孔细胞培养盘内(1×105cells/well)至细胞长到约8-9成满时，以PBS清洗两次后加入80%丙酮(-20℃)，并于4℃下静置30分钟进行细胞固定，再以PBS清洗三次后，加入以PBS稀释1,000倍的rabbit anti Porcine IgG-FITC antibody(300μl/well)置于37℃培养箱中避光作用30分钟，再以PBS清洗三次后，每孔加入250μl PBS，最后以荧光显微镜观察。
荧光显微镜观察结果如图1所示。经过Zeocin抗生素筛选后存活的CHO细胞带有猪融合重组型干扰素基因，以间接免疫荧光染色(IFA)法分析可观察到荧光讯号(如图1A所示)；而只有转染pSecTag2(B)载体的CHO细胞则没有荧光讯号(如图1B所示)。
2.以酵素连结免疫分析(ELISA)法检测猪融合重组型干扰素的表现
将1×105颗待检测细胞接种于25平方公分细胞培养瓶(25T-flask)中，以含有10%FBS的F-12培养基培养72小时后，取其细胞上层培养基以ELISA coating buffer(0.1M NaHCO3以及0.1MNa2CO3pH9.6)进行2、4、8、16、32、64、128倍稀释，每个样本取100μl涂布(coating)于ELISAplate(NUNC)中，置于4℃下作用24小时后，去除上清液，以ELISA washing buffer(0.9%NaCl,0.1%Tween20)清洗三次，加入100μl blocking buffer(1%BSA in ELISA washing buffer)，于室温作用1小时以去除非特异性反应，随后去除blocking buffer并以ELISA washing buffer清洗三次，加入100μl mouse anti IFNα单株抗体(SANTA CRUZ)，该抗体事先以含有1% BSA的ELISA washing buffer稀释500倍；于室温作用1小时后，以ELISA washing buffer清洗6次，加入100μl已标记辣根过氧化物酶(HRP)的goat anti mouse抗体(KPL)，该抗体事先以含有1%BSA的ELISA washing buffer稀释1,000倍；于室温作用1小时后，以ELISA washing buffer清洗六次，加入100μl受质3,3’,5,5’-四甲基联苯胺二盐酸(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)(KPL)呈色10分钟后，再以ELISA reader在吸光值波长(O.D)650nm下读取吸光值。
以ELISA方法检测细胞分泌物含量的结果如图2所示，带有猪融合重组型干扰素基因的CHO细胞分泌物稀释至128倍后仍可测到高量的猪融合重组型干扰素，但带有pSecTag2(B)载体的CHO细胞，其细胞培养基中则测不到猪融合重组型干扰素。
3.以西方墨点法检测猪融合重组型干扰素的表现
取上述细胞上层培养基以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺胶电泳分析(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后，将胶体上的蛋白转印至PVDF膜上，并将转印后的PVDF膜置于blocking buffer(5%Skim milk,in TBST)中，于4℃作用16-24小时，以去除非特异性反应，再以TBST(10mM Tris-HCl pH8.0,150mM NaCl,0.3%Tween20)清洗三次，每次五分钟，随后加入mouse anti IFNα单株抗体(SANTA CRUZ)，该抗体事先以含有0.5%skin milk的TBST稀释500倍，于室温下轻轻摇晃作用1小时后，以TBST清洗六次，每次5分钟，再加入已标记碱性磷酸酶(AP)的goat anti mouse抗体，该抗体事先以含有0.5%skin milk的TBST稀释2000倍，于室温下轻轻摇晃作用1小时后，以TBST清洗6次，每次5分钟，再加AP受质NBT/BCIP(Bio-Rad)呈色约5分钟后，倒掉显色剂以清水冲洗终止呈色反应。另外也使用已标记碱性磷酸酶(AP)的goat anti-Porcine IgG的抗体(KPL)以及已标记碱性磷酸酶(AP)的mouse anti6×His单株抗体(invitrogen)侦测猪融合重组型干扰素。
西方墨点法分析结果如图3所示，带有猪融合重组型干扰素基因的CHO细胞分泌物可被mouseanti IFNα单株抗体、goat anti-Porcine IgG的抗体(KPL)以及mouse anti6×His单株抗体辨认，显示该细胞分泌物含有猪融合重组型干扰素。
实施例六猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)的小量生产及大量生产，以及以PRRS检测该融合重组型干扰素的抗病毒活性
1.猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)的小量生产制程
将带有猪融合重组型干扰素(P INFα1-Fc 4a)基因(SEQ ID No:7)的CHO细胞以2×106颗细胞数接种培养于25平方公分细胞培养瓶(25T-flask)中，并以含有10% FBS以及100Units/mlPenicillin和100Units/ml Streptomycin的F12培养基培养24小时后，去除原培养基，以PBS清洗一次后，加入含有100Units/ml Penicillin和100Units/ml Streptomycin的CHO-S-SFM II无血清培养基(GIBCO)，于更换为无血清培养基后，分别于每隔24小时、48小时、72小时三种不同的时间间隔更换新的无血清培养基(含有100Units/ml Penicillin和100Units/mlStreptomycin)，并且收集被更换的细胞生长液，以1,000rpm离心10分钟，将细胞以及细胞碎片去除，取其上清液，即可获得猪融合重组型干扰素。接着，藉由猪生殖和呼吸道综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRS)以测定该猪融合重组型干扰素的抗病毒活性。
2.测定猪融合重组型干扰素的抗PRRS病毒的活性
将上述收获的猪融合重组型干扰素以含有1%FBS以及100Units/ml Penicillin和100Units/ml Streptomycin的MEM培养基进行10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍、1,280倍、2,560倍序列稀释。并取MARC-145细胞接种至96孔细胞培养盘(1.5×104颗/孔)，培养于37℃、5%CO2培养箱中，培养16-24小时待细胞贴附后，移除培养基，加入上述稀释后的猪融合重组型干扰素，每个样品100μl/well，每个稀释倍数的样品分别接种于4个孔中，于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养细胞24小时后，移除上清液，并于每孔加入100μl含有100TCID50的PRRS病毒；另外，亦有其它不同处理的组别：未攻毒未添加干扰素、有攻毒未添加干扰素、添加干扰素未攻毒处理等其它三组；于37℃、5%CO2培养箱中，当只加病毒组的细胞产生90%以上的细胞病变效应(cytopathic effects,CPE)时，大约是感染病毒后120小时，进行干扰素抗病毒活性的测定。首先将细胞上清液移除，以PBS清洗两次后，加入100μl80%丙酮(-20℃)，并于4℃下固定30分钟，接着移除丙酮以PBS洗三次后，加入1%氯化甲基玫瑰苯胺(methylrosanilinechloride)染色20分钟，再以蒸馏水洗5次，去除未染上细胞的氯化甲基玫瑰苯胺，最后将蒸馏水吸干并加入100%乙醇将氯化甲基玫瑰苯胺的颜色溶出来，作用10分钟后，再以ELISA reader在吸光值波长(O.D)550nm下读取吸光值，并以下列公式计算干扰素抗病毒活性。
公式1： OD max imum + OD min nimum 2 = OD 50 %
Figure BDA00002752283500092
OD maximum：未攻毒未添加干扰素组以及未攻毒添加干扰素组的平均值；
OD minimum：有攻毒未添加干扰素组的平均值；
Tn：大于OD50%的稀释倍数；
Tn+1：小于OD 50%的稀释倍数；
ODn：大于OD 50%的OD平均值；
ODn+1：小于OD 50%的OD平均值。
以小量制程制备的猪融合重组型干扰素，其抗PRRS病毒活性测定的结果如表一所示。结果显示，小量制程所制备的猪融合重组型干扰素皆具抗PRRS病毒活性。
表一以25平方公分细胞培养瓶(25T-flask)生产的猪融合重组型干扰素的抗PRRS病毒活性(IU/ml)
换液间隔 一收 二收 三收 四收 五收 六收
24小时 189.59 249.21 1444.77 1645.70 511.23 1372.38
48小时 215.13 669.09 246.92 278.10 686.99 3434.07
72小时 643.38 1194.90 964.14 2539.12 1931.84 3147.87
由产出的猪融合重组型干扰素的单位活性(结果如表一所示)乘以5毫升(25T-flask收获液总体积)即可得到总活性(抗PRRS)，结果如表二所示。
表二以25平方公分细胞培养瓶(25T-flask)生产的猪融合重组型干扰素的总活性(单位：IU/5ml)
换液间隔 一收 二收 三收 四收 五收 六收
24小时 947.95 1246.05 7223.85 8228.5 2556.15 6861.9
48小时 1075.65 3345.45 1234.6 1390.5 3434.95 17170.35
72小时 3216.9 5974.5 4820.7 12695.6 9659.2 15739.35
3.以转瓶培养生产猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)
将带有猪融合重组型干扰素(P INFα1-Fc 4a)基因(SEQ ID No:7)的CHO细胞继代培养于175平方公分细胞培养瓶(175T-flask)中，待长满后吸弃原培养基，以PBS洗细胞二次后，加入0.125%胰蛋白酶(trypsin)与细胞作用，使细胞由培养瓶表面脱落，并以含有10%FBS以及100Units/mlPenicillin和100Units/ml Streptomycin的F12培养基冲洗培养瓶表面并将脱落的细胞打散，以进行细胞计数。分别于不同的转瓶内接种6.8×107以及8×107颗细胞，并于每支转瓶内加入含有10%FBS的F12培养基使总体积达200mL，将细胞置于37℃培养箱中，以转速6min/圈培养。待培养24小时细胞贴附后，去除转瓶内培养基并以PBS洗细胞1次，去除PBS后加入含有100Units/ml Penicillin和100Units/ml Streptomycin的无血清培养基CHO-S-SFM II(Invitrogen)继续培养，于更换为无血清培养基后，每隔72小时更换新的无血清培养基(含有100Units/mlPenicillin和100Units/ml Streptomycin)，共更换6次；并且收集被更换的细胞生长液，以1,000rpm离心10分钟，将细胞以及细胞碎片去除，取其上清液测猪融合重组型干扰素抗PRRS病毒活性。猪融合重组型干扰素抗PRRS病毒活性系以MTT法测定。
以转瓶培养生产猪融合重组型干扰素的抗病毒活性测定结果如表三所示，结果显示，以转瓶生产(大量制程)的猪融合重组型干扰素具抗PRRS病毒活性，且相较于小量制程，经转瓶生产(大量制程)的猪融合重组型干扰素，其抗PRRS病毒活性更高。
表三以转瓶生产的猪融合重组型干扰素的抗PRRS病毒活性(IU/ml)
细胞数 一收 二收 三收 四收 五收 六收
6.8×107颗 4612.2 20771.0 43389.8 78104.7 68974.8 83194.7
8.0×107颗 10123.6 27704.9 33387.6 43419.6 36846.3 48641.7
另，由转瓶生产(大量制程)的猪融合重组型干扰素的总活性(抗PRRS)如表四所示。
表四以转瓶生产的猪融合重组型干扰素的总活性(单位：IU/200ml)
细胞数 一收 二收 三收 四收 五收 六收
6.8×107颗 922440 4154200 8677960 15620940 13794960 16638940
8.0×107颗 2024720 5540980 6677520 8683920 7369260 9728340
实施例七猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)以及未与猪免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重组的干扰素的抗PRRS病毒活性的比较
将MARC-145细胞以每孔1.5×104细胞的细胞密度培养16-24小时，再分别处理：猪融合重组型干扰素(P IFNα1-Fc 4a组)及未与猪免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重组的干扰素(P IFNα1组)16-24小时，再以PRRS病毒(100TCID50)接种该细胞，经4-5天后，以MTT法判读活性。
如表五及图4所示，结果显示，相较于未与猪免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重组的干扰素(PIFNα1组)，本发明的猪融合重组型干扰素(P IFNα1-Fc 4a组)的抗PRRS病毒活性较高。
表五猪融合重组型干扰素(P IFNα1-Fc 4a组)及未与猪免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重组的干扰素(P IFNα1组)的抗PRRS活性的比较
组别 抗PRRS活性(IU/μg)
P IFNα1-Fc组 350
P IFNα1组 150
实施例八猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)与未与猪免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重组的干扰素(P IFNα)的抗PR病毒活性的比较
将ST细胞以每孔1.5×104细胞的细胞密度培养16-24小时，再分别处理：猪融合重组型干扰素(P IFNα1-Fc 4a组)及未与猪免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重组的干扰素(P IFNα1组)16-24小时，再以伪狂犬病毒(Pseudorabies,PR病毒)(1 TCID50)接种该细胞，经4-5天后，以MTT法判读活性。
如表六及图4所示，结果显示，相较于未与猪免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重组的干扰素(PIFNα1组)，本发明的猪融合重组型干扰素(P IFNα1-Fc 4a组)的抗PR病毒活性较高。
表六猪融合重组型干扰素(P IFNα1-Fc 4a组)及未与猪免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重组的干扰素(P IFNα1组)的抗PR活性比较
组别 抗PR活性(IU/μg)
P IFNα1-Fc 4a组 40
P IFNα1组 9.6
相同地，将实施例四所得之含有其它猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)DNA序列(SEQ ID Nos:7、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220及222)的pSecTag2(B)-IFNα-Fc质体依照实施例五所述之方法转染至CHO细胞株并表达该猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)(SEQ IDNos:8、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221及223)，进而以实施例七、八所述之方式分析各猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)抗PRRS、PR病毒的活性，结果发现，各猪融合重组型干扰素(P IFNα-Fc)皆具有抗病毒活性，且皆较未与动物免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重组之干扰素的抗病毒活性高。
由上述实施例可知，本发明所提供的动物融合重组型干扰素在抗DNA病毒以及抗RNA病毒活性上，皆较未与动物免疫球蛋白IgG-Fc片段融合重组的干扰素的抗病毒活性高出许多。
上列详细说明系针对本发明之一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
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Claims (14)

1.一种动物融合重组型干扰素，包含一动物干扰素以及一动物免疫球蛋白Fc片段。
2.如权利要求1所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该动物干扰素以及该动物免疫球蛋白Fc片段是由一连接子所连接。
3.如权利要求1或2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该动物干扰素具有一氨基酸序列，该氨基酸序列选自于由SEQ ID Nos:2、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45及47所组成之群组中至少一者。
4.如权利要求1或2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该动物干扰素具有一氨基酸序列，该氨基酸序列与选自于由SEQ ID Nos:2、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45及47所组成之群组至少一者的序列具有至少80%序列同源性。
5.如权利要求1或2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该动物免疫球蛋白Fc片段具有一氨基酸序列，该氨基酸序列选自于由SEQ ID Nos:4、49、51、53、及55所组成之群组中至少一者。
6.如权利要求1或2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该动物免疫球蛋白Fc片段具有一氨基酸序列，该氨基酸序列与选自于由SEQ ID Nos:4、49、51、53、及55所组成之群组至少一者的序列具有至少80%序列同源性。
7.如权利要求2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该连接子具有如SEQ ID No:6所示之序列。
8.如权利要求2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该连接子具有一氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No:6所示之序列具有至少80%序列同源性。
9.如权利要求2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该动物融合重组型干扰素具有一氨基酸序列，该氨基酸序列选自于由SEQ ID Nos:8、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221及223所组成之群组。
10.如权利要求2所述之动物融合重组型干扰素，其特征在于，该动物融合重组型干扰素具有一氨基酸序列，该氨基酸序列与选自于由SEQ ID Nos:8、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221及223所组成之群组之一的序列具有至少80%序列同源性。
11.一种编码如权利要求1所述之动物融合重组型干扰素的多核苷酸。
12.一种制备一动物融合重组型干扰素的方法，包含将带有如权利要求11所述之多核苷酸的哺乳细胞以含有血清的培养基培养至该细胞生长稳定后，更换为无血清培养基继续培养，并于每隔1至5天更换新的无血清培养基以及收获该动物融合重组型干扰素。
13.如权利要求12所述之方法，其中该含有血清的培养基的血清含量为0.1至10体积百分比。
14.一种如权利要求1所述之动物融合重组型干扰素在制备动物抗病毒药物中的用途。
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