CN109010820A - 植物多糖在黏膜免疫佐剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫佐剂领域，具体涉及植物多糖在黏膜免疫佐剂中的用途。本发明公开了植物多糖在黏膜免疫佐剂中的用途，其中，所述植物多糖为淫羊藿多糖、金莲花多糖、黄精多糖和黄芪多糖中的至少一种。本发明还公开了植物多糖在制备用于提高体液中的IgA抗体水平和/或激活TLR2的药物中的用途。本发明使用的植物多糖能够发挥黏膜免疫佐剂作用，并可辅佐保护性抗原对幽门螺杆菌感染起到良好的保护作用。

Description

植物多糖在黏膜免疫佐剂中的用途

技术领域

本发明属于免疫佐剂领域，具体涉及植物多糖在黏膜免疫佐剂中的用途。

背景技术

预防是控制疾病发展的主要手段，而疫苗接种是最重要的措施。减毒活疫苗和灭活疫苗虽然具有良好的免疫原性，但是存在返毒风险，从而制约了它们的广泛应用。随着科学技术迅速发展，重组蛋白疫苗、基因疫苗、多肽疫苗等各种新颖的疫苗形式不断出现，尽管它们具有纯度高、溶解性好等优点，但免疫原性较弱，需要佐剂辅助才能诱导出足够强度的保护性免疫应答，因此新型免疫佐剂的发现日益迫切。

铝佐剂是可用于人体的经典佐剂。尽管铝佐剂能够很好地诱导抗体反应，但其刺激细胞免疫应答的能力有限，在一定程度上限制了铝佐剂的应用。近年来，诸多学者对新型免疫佐剂进行研究。其中MF59是以角鲨烯为油相的乳化剂，可依赖于适调蛋白MyD88的非Toll样受体依赖性的信号通路，提高机体体液免疫反应的水平，同时可刺激机体产生细胞免疫应答。此外，AS03和AS04也被批准应用于人体疫苗。虽然它们均具有一定的佐剂效果，但不能诱导显著的黏膜免疫应答。然而，黏膜是许多病原体入侵机体的门户，因此黏膜免疫佐剂开发是当前疫苗开发的重要领域。

过去几十年间，已经有多种黏膜佐剂正处在研究阶段。大肠杆菌不耐热性肠毒素(LT)及类毒素被证明是有效的黏膜佐剂，但有研究表明贝氏麻痹的发生与使用LT佐剂鼻内接种疫苗有着显著关联。细胞因子白介素-1(IL-1)、白介素-12(IL-12)和白介素-33(IL-33)也已被报道为有效的黏膜免疫佐剂。但该类佐剂的递送通常需要载体，复杂的制备工艺以及潜在的安全性问题是细胞因子作为佐剂的主要问题。脂质体在体内可被抗原递呈细胞内吞，能够将其所携带的抗原送入抗原递呈细胞。但是这类佐剂载体递送系统在临床上的广泛使用还存在一些局限，其中包括其对脂肪酶的敏感性、易泄漏、包封效率低以及在低pH下的稳定性差等问题。因此，寻找安全有效的新型黏膜免疫佐剂迫在眉睫。

已有研究表明，天然植物多糖具有免疫佐剂的作用，可与多种疫苗合用增强其免疫效果。虽然被发现具有佐剂作用的天然植物多糖种类较少，但是因其天然、低毒和无药物残留等优点，已经成为疫苗佐剂研究的一个热点。台湾灵芝多糖PS-F2可以刺激DC成熟、抗体产生、CTL激活和Th1极化免疫应答，对抗肿瘤和细胞内病原体的疫苗效果显著。淫羊藿多糖(Epimedium Polysaccharide，EPS)、黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)用于兔出血性疾病的疫苗佐剂可以提高血清抗体滴度和促进淋巴细胞增殖，佐剂效果略优于铝佐剂。低剂量的黄芪多糖和板蓝根多糖，高剂量牛膝根多糖和山药多糖均能显着增强新城疫抗体滴度、外周血T淋巴细胞增殖活性和CD4+/CD8+比值。从枸杞中分离出一种多糖蛋白复合物能诱导DC功能成熟，上调CD40、CD80、CD86和MHCⅡ类分子的表达。但以上植物多糖仅被报道可以作为系统免疫佐剂，其黏膜免疫佐剂活性的评价尚未见报道。

发明内容

为了实现上述目的，本发明的发明人进行了大量的研究，首先利用卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)作为抗原，通过滴鼻免疫系统评价了四种植物多糖(淫羊藿多糖、金莲花多糖(Trollius chinensis polysaccharide，TCPS)、黄精多糖(Siberian solomonsealrhizome polysaccharide，SSRPS)和黄芪多糖)的黏膜佐剂作用，进而将这四种植物多糖与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)保护性抗原尿素酶B亚单位(UreB)联合使用，评价其对幽门螺杆菌感染的免疫保护作用，进一步考察其黏膜免疫佐剂效果，并探讨了其对细胞免疫平衡的调节作用。

因此，本发明第一方面提供植物多糖在黏膜免疫佐剂中的用途，其中，所述植物多糖为淫羊藿多糖、金莲花多糖、黄精多糖和黄芪多糖中的至少一种。

第二方面提供了植物多糖在制备用于提高体液中的IgA抗体水平和/或激活TLR2的药物中的用途，其中，所述植物多糖为淫羊藿多糖、金莲花多糖、黄精多糖和黄芪多糖中的至少一种。

第三方面提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物含有抗原和免疫佐剂，所述抗原为幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)保护性抗原的至少一种，所述免疫佐剂为淫羊藿多糖、金莲花多糖、黄精多糖和黄芪多糖中的至少一种。

本发明使用的植物多糖能够发挥黏膜免疫佐剂作用，并可以辅佐保护性抗原对幽门螺杆菌感染起到良好的保护作用。

附图说明

图1为四种植物多糖对HK-2的细胞毒性评价结果图；

图2为四种植物多糖对OVA滴鼻免疫小鼠特异性IgG抗体效价的影响结果，该图中，与OVA组相比，^*p<0.05，^***p<0.001；

图3是四种植物多糖对OVA滴鼻免疫小鼠血清中特异性IgG1、IgG2a抗体水平的影响结果，该图中，与OVA组相比，^*p<0.05；

图4是四种植物多糖对OVA滴鼻免疫小鼠唾液中特异性IgA抗体水平的影响结果，该图中，与OVA组相比，^*p<0.05，^**p<0.01；

图5是四种植物多糖对OVA滴鼻免疫小鼠阴道灌洗液中特异性IgA抗体水平的影响结果，该图中，与OVA组相比，^*p<0.05，^***p<0.001；

图6是四种植物多糖对OVA滴鼻免疫小鼠肠道灌洗液中特异性IgA抗体水平的影响结果，该图中，与OVA组相比，^*p<0.05，^**p<0.01；

图7-10分别是OVA与EPS、TCPS、SSRPS和APS间的相互作用检测结果；

图11是四种植物多糖的体外Toll样受体2(TLR2)激活实验结果图；

图12是四种植物多糖对UreB滴鼻免疫小鼠幽门螺杆菌定植量的影响结果，该图中，与UreB组相比，^*p<0.05；与PBS组相比，^##p<0.01，^###p<0.001；

图13是四种植物多糖对UreB免疫小鼠血清中特异性IgG抗体水平的影响结果；

图14是四种植物多糖对UreB免疫小鼠胃组织匀浆液中特异性IgA抗体水平的影响结果，该图中，与UreB组相比，^**p<0.01；

图15是四种植物多糖对UreB免疫小鼠肠道灌洗液中特异性IgA抗体水平的影响结果，该图中，与UreB组相比，^*p<0.05；

图16-18分别是植物多糖对小鼠脾淋巴细胞培养上清IFN-γ、IL-4和IL-17的表达的影响结果，其中，与UreB组相比，^*p<0.05，^**p<0.01。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供了植物多糖在黏膜免疫佐剂中的用途，其中，所述植物多糖为淫羊藿多糖、金莲花多糖、黄精多糖和黄芪多糖中的至少一种。特别地，本发明提供了植物多糖作为唯一活性成分在黏膜免疫佐剂中的用途。

本发明中，所述植物多糖可以通过常规的方式制备得到，也可以商购获得。例如，所述淫羊藿多糖的制备方法可以为淫羊藿叶饮片经粉碎、水提，乙醇分步沉淀，再经过去除蛋白，最后通过离子交换纯化获得。

所述金莲花多糖的制备方法可以为金莲花经水提、脱色、醇沉，再经过去除蛋白，最后通过大孔树脂纯化获得。

所述黄精多糖的制备方法可以为黄精叶经水提、醇沉和除蛋白，最后通过离子交换纯化获得。

所述黄芪多糖的制备方法可以为黄芪根经粉碎、水提，最后通过离子交换获得。

本发明还提供了植物多糖在制备用于提高体液中的IgA抗体水平和/或激活TLR2的药物中的用途，其中，所述植物多糖为淫羊藿多糖、金莲花多糖、黄精多糖和黄芪多糖中的至少一种。特别地，本发明提供了植物多糖作为唯一活性成分在制备用于提高体液中的IgA抗体水平和/或激活TLR2的药物中的用途。根据本发明的另一种实施方式，所述植物多糖与卵清白蛋白联用能够显著提高体液中的IgA抗体水平(如图6所示)，因此，本发明还进一步提供了所述植物多糖与卵清白蛋白在制备用于提高体液(特别是肠道灌洗液)中IgA抗体水平的药剂中的用途。

本发明中，所述体液可以为血清、唾液、阴道灌洗液和肠道灌洗液中的至少一种。所述阴道灌洗液和/或肠道灌洗液可以通过PBS冲洗阴道和/或肠道获得。

其中，本发明的发明人发现，所述金莲花多糖和卵清白蛋白联用能够显著诱导产生较高的IgG抗体效价(如图2所示)，因此，本发明还进一步提供了所述金莲花多糖和卵清白蛋白在制备用于诱导IgG抗体产生的药剂中的用途。

本发明的发明人还发现，所述黄芪多糖和卵清白蛋白联用能够显著提高IgG1和IgG2a抗体水平(如图3所示)，因此，本发明还进一步提供了所述黄芪多糖在制备用于增强卵清白蛋白的特异性Th1应答的药剂中的用途。

本发明的发明人还发现，所述黄芪多糖与卵清白蛋白联用能够显著提高体液中的IgA抗体水平(如图4-6所示)，因此，本发明还进一步提供了所述黄芪多糖与卵清白蛋白在制备用于提高体液(如唾液、阴道灌洗液和肠道灌洗液中的至少一种)中IgA抗体水平的药剂中的用途。

本发明的发明人还发现，所述淫羊藿多糖和金莲花多糖能够吸附卵清白蛋白(如图7和图8所示)，因此，本发明还进一步提供了所述淫羊藿多糖和/或金莲花多糖在体外吸附卵清白蛋白中的用途。

本发明的发明人还发现，所述黄精多糖和/或黄芪多糖能够更强地激活TLR2(如图11所示)，因此，本发明还进一步提供了所述黄精多糖和/或黄芪多糖在制备用于激活TLR2的药物中的用途。

本发明的发明人还发现，所述黄精多糖和/或黄芪多糖能够显著提高UreB对幽门螺杆菌的免疫保护性作用，特别是降低幽门螺杆菌在胃肠道中的定植量(如图12所示)，因此，本发明还进一步提供了所述黄精多糖和/或黄芪多糖与UreB在制备用于提高针对幽门螺杆菌的免疫保护性的药剂中的用途。

本发明的发明人还发现，所述黄芪多糖与UreB联用能够显著提高胃肠道的IgA抗体水平(如图14-15所示)，因此，本发明还进一步提供了所述黄芪多糖与UreB在制备用于提高胃肠道中IgA抗体水平的药剂中的用途。

本发明的发明人还发现，所述黄芪多糖能够显著提高脾淋巴细胞IFN-γ的表达水平(如16图所示)，因此，本发明还进一步提供了所述黄芪多糖在体外提高(脾淋巴细胞)IFN-γ的表达水平中的用途。

本发明的发明人还发现，所述淫羊藿多糖和/或黄精多糖能够显著提高脾淋巴细胞IL-4的表达水平(如17图所示)，因此，本发明还进一步提供了所述淫羊藿多糖和/或黄精多糖在体外提高(脾淋巴细胞)IL-4的表达水平中的用途。

本发明的发明人还发现，所述黄芪多糖能够显著提高脾淋巴细胞IL-17的表达水平(如18图所示)，因此，本发明还进一步提供了所述黄芪多糖在体外提高(脾淋巴细胞)IL-17的表达水平中的用途。

本发明提供的疫苗组合物含有抗原和免疫佐剂，其特征在于，所述抗原为幽门螺杆菌保护性抗原的至少一种，所述免疫佐剂为淫羊藿多糖、金莲花多糖、黄精多糖和黄芪多糖中的至少一种。优选地，所述抗原(或幽门螺杆菌保护性抗原)包括尿素酶B亚单位(UreB)、空泡毒素(VacA)、细胞毒素相关蛋白(CagA)、幽门螺杆菌粘附素A(HpaA)、中性粒细胞激活蛋白(NAP)、过氧化氢酶(KatA)和热休克蛋白(Hsp)中的至少一种。进一步优选地，所述抗原为UreB。

根据本发明，所述抗原和免疫佐剂之间的重量比优选为1:1-20。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例中使用的植物多糖分别为淫羊藿多糖(EPS)、金莲花多糖(TCPS)、黄精多糖(SSRPS)和黄芪多糖(APS)四种植物多糖，其中淫羊藿多糖和金莲花多糖由本实验室制备(淫羊藿多糖提取参考文献：郑晓翠,苏瑛,唐咏,刘鹏举,孙东.淫羊藿多糖的提取及其蛋白的脱除[J].华西药学杂志，2009,2(2):155-157；金莲花多糖提取参考文献:王书华,饶娜,安芳.金莲花多糖的分离纯化及其抗氧化作用研究[J].中草药,2013,35(11):2384-2389)，黄精多糖购自源叶生物，黄芪多糖购自索莱宝生物；

HK-2细胞购自美国ATCC，CRL-2190^TM；

鸡卵清白蛋白(OVA)购自Bellancom Chemistry；

LTK63为去毒大肠杆菌不耐热性肠毒素(第63位丝氨酸突变为赖氨酸)，由本实验室通过基因工程方法制备(参考文献：Pizza,M.,M.R.Fontana,M.M.Giuliani,et al.Agenetically detoxified derivative of heat-labile Escherichia coli enterotoxininduces neutralizing antibodies against the A subunit.J Exp Med,1994,180:2147-2153)；

UreB由本实验室制备(参考文献：Zeng M,Mao XH,Li JX,et al.Efficacy,safety,and immunogenicity of an oral recombinant Helicobacter pylori vaccinein children in China:a randomised,double-blind,placebo-controlled,phase3trial.Lancet.2015,386(10002):1457-64)；

采用国际标准株幽门螺杆菌SS1，SS1是BALB/c小鼠的适应株；

红细胞裂解液购自天根生物；

单位“M”表示“mol/L”。

实施例1

方法

1.植物多糖的安全性评价

1.1植物多糖的体外溶血作用

取脱纤维兔血于离心管中，加入生理盐水混匀后，1500rpm离心10min，弃上清液，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液清洗至上清无色透明。通过将3mL离心的红细胞混入11mL的PBS来制备红血球悬液，并将生理盐水、去离子水和相应浓度的植物多糖与红血球悬液混合，使得各个植物多糖的终浓度分别为2.5mg/mL、5mg/mL和10mg/mL，37℃孵育3h后13000rpm离心15min，UV-可见分析测定上清液394nm下的吸光度值(OD)。使用1毫升PBS作为0％溶血的阴性对照，使用1mL去离子水作为100％溶血的阳性对照。所有溶血数据点以完全溶血的百分比表示。

1.2植物多糖的体外细胞毒性评价

取对数生长期HK-2细胞，0.25％胰蛋白酶消化、收集并离心，用DMEM培养基稀释细胞至密度为5×10 ⁴个/mL，取96孔板，每孔加入180μL细胞悬液，稳定12h后，实验组分别加入系列梯度浓度(2.5mg/mL、5mg/mL和10mg/mL)的植物多糖的溶液20μL，对照组加入等量的PBS，各组平行4孔。48h后每孔加入20μL用PBS稀释的10％MTT溶液(5mg/mL)，继续孵育4h，离心弃上清后加入200μL二甲亚砜，置于振荡器上振荡1min，以570nm为检测波长用酶标仪测定的吸光度(A)，计算细胞存活率(Cell viability)，细胞存活率＝A_实验组/A_对照组×100％。

2.植物多糖的黏膜佐剂作用评价

2.1分组与免疫

2.1.1实验动物：BALB/c小鼠，雌性，6-8周龄。

2.1.2实验分组

共分为7组，每组10只小鼠：①单用OVA组；②OVA+LTK63组；③OVA+EPS组；④OVA+TCPS组；⑤OVA+SSRPS组；⑥OVA+APS组；⑦PBS组。各组OVA终浓度均为500mg/mL，②组为LTK63终浓度为0.0557mg/mL，③-⑥组植物多糖终浓度均为5mg/mL。

2.1.3实验方案

所有小鼠均采用滴鼻免疫，于0、7、14、21和28天免疫小鼠，单次免疫体积为20μL/只。末次免疫后14天，收集小鼠唾液、阴道灌洗液、肠道灌洗液和血液，并分离血清。

2.2体液及血清的收集

2.2.1唾液的收集：小鼠禁食12h后于腹腔注射0.1mL 0.02％毛果云香碱，约1min后小鼠口中见清亮唾液分泌，用微量移液器吸取唾液，每只小鼠收集约300μL。唾液样本于4℃下12000rpm离心10min，吸取上清，-80℃保存。

2.2.2阴道灌洗液的收集：取0.05g酪蛋白溶解于10mL PBS中并加入5μL Tween-20充分混匀配制成抗体稀释液。用移液枪吸取75μL抗体稀释液冲洗小鼠阴道10次并重复该步骤，将两次阴道灌洗液合并置于EP管内，12000rpm离心10min，吸取上清，-80℃保存。

2.2.3血清的收集：小鼠眼眶取血并用无菌离心管收集，4℃下3000rpm离心15min，收集血清于无菌EP管，-80℃保存。

2.2.4肠道灌洗液的收集：开腹暴露小鼠腹腔，取出小肠，平铺于一平皿中，纵行剖开，吸取3mL PBS反复冲洗肠腔表面并用载玻片轻刮黏膜表面黏液，收集粘液置于EP管内，4℃下5000rpm离心10min，吸取上清8000rpm离心10min，吸取上清12000rpm离心10min，取上清液，-80℃保存待测。

2.3ELISA抗体检测

2.3.1溶液配制

包被缓冲液：每升包被缓冲液含1.59g碳酸钠和2.93g碳酸氢钠，pH为9.6；PBST洗液：每升PBS溶液中加入0.5ml的Tween-20；抗体稀释液：0.5％的酪蛋白溶于PBST中；封闭液：1％的酪蛋白溶于PBS中。溶液中所含酪蛋白均需搅拌至完全溶解。

2.3.2抗原包被

在96孔酶标板上，每孔加入100μL的包被液(OVA浓度为5μg/mL的碳酸盐缓冲液)4℃包被24h。使用自动洗板机洗板4次，每次3min。每孔加300μL封闭液封闭4℃孵育24h。使用自动洗板机洗板4次，每次3min。放于4℃冰箱保存。

2.3.3特异性抗体IgG的检测

用抗体稀释液按1:1000稀释小鼠血清。第一列每孔加入200μL血清稀释液，其余每列各孔加入100μL抗体稀释液，进行2倍梯度稀释，7℃孵育1h。自动洗板机洗板4次，每次3min。每孔加入辣根酶标记山羊抗小鼠IgG抗体稀释液(1：5000)100μL，37℃孵育40min。使用自动洗板机洗板4次，每次3min。每孔加入100μL TMB底物显色液，室温避光反应15min。每孔加入50μL 2M的硫酸溶液终止反应并用96孔酶标仪测定各孔的OD_450nm值。

2.3.4特异性IgA抗体的检测

用抗体稀释液按1:5比例稀释小鼠唾液和阴道灌洗液，由于肠道灌洗液抗体滴度不够高因此未进行稀释。第一列每孔加入200μL待测液，其余每列各孔加入100μL抗体稀释液，进行1:1梯度稀释，37℃孵育1h。自动洗板机洗板4次，每次3min。每孔加入辣根氧化酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgA抗体稀释液(1:2000)100μL，37℃孵育40min。使用自动洗板机洗板4次，每次3min。每孔加入100μL TMB底物显色液，室温避光反应15min。每孔加入50μL 2M的硫酸溶液终止反应并用96孔酶标仪测定各孔的OD_450nm值。

2.3.5血清特异性抗体IgG1、IgG2a的检测

用抗体稀释液按1:50比例稀释小鼠血清。每孔加入100μL血清稀释液，37℃孵育1h，自动洗板机洗板4次，每次3min。每孔加入辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG1抗体稀释液(1:20000)或辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG2a抗体稀释液(1:20000)100μL，37℃孵育40min。使用自动洗板机洗板4次，每次3min。每孔加入100μL TMB底物显色液，室温避光反应15min。每孔加入50μL 2M的硫酸溶液终止反应。用96孔酶标仪测定各孔的OD450nm值。

2.4微量热泳动技术(Microscale Thermophoresis，MST)分析多糖与OVA间的相互作用

参照NanoTemper Monolith NT Protein Labeling Kit RED-NHS试剂盒操作步骤将OVA蛋白做荧光标记。标记后在45min内弃去多余染料。随后分别将四种植物多糖溶于缓冲液(50mM Tris(pH 7.4),150mM NaCl,10mM MgCl 2,0.05％Tween-20)做梯度稀释，植物多糖从最高浓度为1250μg/ml依次两倍稀释至最低浓度1.2μg/ml。将10μL梯度稀释的非标记分子和10μL固定浓度的标记分子混合后静置反应后，将混合的样品装载到玻璃毛细管中，然后通过MST-NT.115设备进行分析。

2.5植物多糖TLR2激活活性的评价

2.5.1HEK-Blue Detection溶液的配制

用50mL无内毒素水溶解HEK-Blue Detection，旋涡震荡使其混合均匀，于37℃放置1h，用0.2μm的滤器滤至无菌管中2-8℃保存。

2.5.2TLR2激活活性的测定

在平底96孔板中每孔加入20μL待测样本，以20μL去内毒素水作为阴性对照。将HEK-Blue mTLR2细胞从培养箱取出并倒掉培养基(细胞50-80％贴壁)，并用10mL预热的PBS冲洗。加入3mL预热的PBS并放置于37℃下1-2min，轻轻拍打培养瓶使细胞脱落，重悬细胞并计数。用预热的HEK-Blue Detection溶液制备细胞悬液，使其浓度为2.8×10⁵个细胞/mL，并立即向每孔加入180μL细胞悬液(5×10⁴个细胞)，在37℃、5％CO₂条件下孵育14h，检测OD_620nm值观察分泌型碱性磷酸酶(Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase,SEAP)活性。

3.植物多糖对幽门螺杆菌感染的免疫保护性评价

3.1分组与免疫

3.1.1实验动物：BALB/c小鼠，雌性，6-8周龄。

3.1.2实验分组

共分为7组，每组5只小鼠：①单用UreB组；②UreB+LTK63组；③UreB+EPS组；④UreB+TCPS组；⑤UreB+SSRPS组；⑥UreB+APS组；⑦PBS组。各组UreB终浓度均为3mg/mL，②组LTK63终浓度为60μg/mL，③-⑥组多糖终浓度均为5mg/mL。

3.1.3实验方案

所有小鼠均采用滴鼻免疫，于第0、7、14、21和28天免疫小鼠，单次免疫体积为20μL/只。末次免疫后14天进行幽门螺杆菌感染，感染后28天收集小鼠肠道灌洗液、胃组织和血液，并分离脾淋巴细胞。

3.2幽门螺杆菌感染模型的建立

3.2.1幽门螺杆菌SS1菌株的培养

(1)菌株复苏：于-80℃低温冰箱中取一支幽门螺杆菌SS1菌种，室温自然融化后5000rpm离心5min，弃上清，用接种环挑取部分菌株沉淀于幽门螺杆菌血琼脂平板上三线法分离划线，微需氧条件下(10％CO₂，5％O₂，85％N₂)37℃培养48h。

(2)扩大培养：挑取复苏后的幽门螺杆菌SS1单菌落涂布于新鲜固体平板中(含有7％无菌脱纤维羊血和4种选择性培养抗生素：萘啶酮酸、甲氧苄啶、万古霉素、两性霉素)，微需氧条件下37℃培养至细菌对数生长期。

(3)收集菌液：取第(2)步中已培养好细菌的幽门螺杆菌平板，加入2mL新鲜幽门螺杆菌液体培养基，用L棒轻轻将菌落刮下，待革兰染色检测合格后，取少量菌液在酶标仪上检测OD_600nm，以公式(1OD＝1.0×10⁹CFU/ml)调整菌液浓度为2×10⁹CFU/mL。

3.2.2幽门螺杆菌SS1菌株感染BALB/c小鼠

小鼠断食断水12h后进行首次灌胃感染，连续4天，每天1次。每只小鼠每次灌胃0.2mL幽门螺杆菌SS1株菌液(约4×10⁸CFU)，灌胃后2h进食进水。

3.3体液及血清的收集

末次感染后4周处死小鼠，收集小鼠胃组织、血清和肠道灌洗液，并制备脾淋巴细胞悬液和胃组织匀浆液。

3.3.1小鼠血清和肠道灌洗液的收集方法同2.2。

3.3.2小鼠胃组织的收集

沿胃大弯将小鼠胃剪开，平铺于干净玻璃平皿中并用无菌PBS冲洗去除胃内容物。胃组织沿胃小弯剪成两半，分别置于冻存管中，并将冻存管迅速放入液氮中保存。

3.3.3脾淋巴细胞悬液制备

无菌条件下取出小鼠脾脏，加入10mL PBS缓冲液研磨，以200目不锈钢筛网滤过后移入15mL离心管，1500rpm离心5min，弃上清。加入3mL红细胞裂解液，重悬细胞10min。加入10mL PBS洗涤，1500rpm离心5min，弃上清。加入10mL PBS缓冲液，重悬细胞并计数。于24孔板中每孔加入1mL细胞悬液和100μL UreB溶液(0.25mg/mL)，根据活细胞数目(10⁶/mL)加入细胞培养基(RPMI 1640：FBS＝9：1(体积比))。37℃、5％CO₂培养48h后1500rpm离心5min，吸取上清，于-80℃保存。

3.3.4小鼠胃组织匀浆液的收集

将小鼠1/2胃置于破壁管中，加入500μL抗体稀释液和5粒研磨珠，使用匀浆机8s进行组织破碎，重复7次每次间隔50s。组织破碎液转移至EP管内，8000rpm/min离心5min，取上清，-80℃保存。

3.4实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测幽门螺杆菌的定植量

3.4.1细菌基因组的提取

向存有胃组织的冻存管中加入1mL PBS，用迷你珠组织研磨器对胃组织标本进行破碎后，8000rpm离心5min，弃上清收集沉淀；采用细菌基因组抽提试剂盒提取匀浆沉淀中的基因组DNA，-80℃保存备用。同时抽提新培养的幽门螺杆菌SS1基因组DNA用作标准品的制备。

3.4.2引物和探针的设计

以提取的基因组DNA为模板，定量扩增幽门螺杆菌16S rRNA的DNA片段的保守序列，计算小鼠胃内幽门螺杆菌的拷贝数。根据16s rDNA设计引物和探针如下：

P1:5′-tttgttagagaagataatgacggtatctaac-3′(31bp，SEQ ID NO：1)

P2:5′-cataggatttcacacctgactgactatc-3′(28bp，SEQ ID NO：2)

TaqMan探针:5′-FAM-cgtgccagcagccgcggt-TAMRA-3′(SEQ ID NO：3)

引物和探针均由英骏生物技术有限公司合成，PAGE纯化。

3.4.3实时荧光定量PCR反应条件

反应体系：

反应条件：

95℃预变性30s，随后按95℃变性5s，60℃退火和延长30s，反应重复40个循环。

3.4.4标准品的制备

以新提取的幽门螺杆菌SS1基因组DNA为模板，PCR条件扩增16S rDNA，胶回收PCR产物。通过紫外分光光度计测量回收产物中目的基因的浓度，并计算拷贝数。通过10倍梯度稀释，制备10³拷贝数/μL、10⁴拷贝数/μL、10⁵拷贝数/μL、10⁶拷贝数/μL和10⁷拷贝数/μL的标准品。

3.4.5幽门螺杆菌的定量测定

以提取的细菌总DNA和5个浓度梯度的标准品为模板，利用以上反应条件进行实时荧光定量PCR检测。通过Bio-Rad CFX Manager软件绘制标准曲线，并获得线性回归方程，计算小鼠胃中幽门螺杆菌16S rDNA拷贝数。反应完毕后取9μL反应产物与1μL 10×DNALoading Buffer混匀，1.5％琼脂糖凝胶电泳观察扩增片段。

3.5UreB特异性抗体的ELISA检测

配制溶液：将酪蛋白替换为牛血清白蛋白(BSA)，其余方法同2.3。

抗原包被：包被液为UreB浓度为10μg/mL的碳酸盐缓冲液，其余方法同2.3。

3.5.1特异性抗体IgG的检测：方法同2.3.1。

3.5.2特异性IgA抗体的检测：胃匀浆液、肠道灌洗液均不稀释，其余方法同2.3.2

3.6小鼠脾淋巴细胞IFN-γ、IL-4和IL-17的表达水平

小鼠细胞因子的表达均根据试剂盒(小鼠IL-4检测试剂盒、小鼠IL-17A检测试剂盒、小鼠IFN-盒检测试剂盒，购自达科为生物技术有限公司)说明书进行操作。将标准品倍比稀释，100μL/孔加至标准品孔，100μL/孔将脾淋巴细胞悬液加至样本孔，将稀释缓冲液R(Dilution Buffer R)(1×)作为空白对照。50μL/孔加入1％的生物素化的抗体(Biotinylated antibody)工作液。混匀后，盖上封板膜，37℃孵育90min。自动洗板机洗板4次，每次3min。100μL/孔加入1％的Streptavidin-HRP工作液。盖上封板膜，37℃孵育30min。自动洗板机洗板4次，每次3min。100μL/孔加入TMB显色液，37℃避光反应15min。100μL/孔迅速加入终止液(Stop solution)终止反应，10min内用96孔酶标仪测定各孔的OD450nm值。

4.统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。所有数据均采用均值±标准差的形式表示。组间差异采用单因素方差分析进行比较，检验水准为双侧α＝0.05，若组间差异有统计学意义，则采用SNK法进行两两比较，采用Bonferroni校正检验水准α’＝α/k(k为比较组数)。

结果

1天然植物多糖的初步安全性评价

采用兔红细胞考察四种植物多糖的细胞溶血作用，在多糖浓度低于10mg/mL时红细胞溶血率均小于5％，具有良好的溶血耐受性。采用MTT法测定四种植物多糖对HK-2的细胞毒性，在多糖浓度达到10mg/mL时，HK-2细胞的存活率仍然保持在95％以上，具备良好的体外安全性(见图1)。

2植物多糖的黏膜佐剂作用评价

2.1天然植物多糖可显著提高OVA滴鼻免疫小鼠特异性IgG抗体效价

如图2所示，植物多糖与OVA联用并滴鼻免疫小鼠激发的特异性IgG抗体效价均显著高于OVA单独免疫组，其中TCPS诱导产生的IgG抗体效价与LTK63相当，差异无统计学意义。

2.2天然植物多糖可诱导OVA滴鼻免疫小鼠特异性IgG1和IgG2a抗体应答

小鼠血清中特异性IgG1和IgG2a抗体水平可以间接反应细胞免疫应答的类型。如图3所示，APS和LTK63联用OVA所激发的特异性IgG1抗体水平均显著高于OVA单独免疫组，其它组与OVA组相比无显著差异。TCPS、SSRPS和APS均能够显著提高OVA滴鼻免疫小鼠IgG2a抗体水平，提示可能增强OVA特异性的Th1应答。

2.3天然植物多糖可以显著提高OVA滴鼻免疫小鼠体液中特异性IgA抗体水平

为了系统评价植物多糖的黏膜佐剂作用，进一步检测了小鼠唾液、阴道灌洗液和肠道灌洗液中特异性IgA抗体水平。

与OVA联用滴鼻免疫小鼠，TCPS、APS所激发唾液IgA抗体水平显著高于OVA单独免疫组(见图4)；SSRPS、APS所激发阴道灌洗液IgA抗体水平显著高于OVA单独免疫组(见图5)；四种多糖所激发肠道灌洗液中特异性IgA抗体水平均显著高于OVA单独免疫组(见图6)。上述结果表明以上四种植物多糖均具有一定的黏膜免疫佐剂作用。

2.4微量热泳动技术检测植物多糖对OVA的吸附作用

为了探究植物多糖发挥黏膜免疫佐剂作用的机制，首先检测了这四种植物多糖对抗原OVA的吸附作用。图7-10显示，EPS和TCPS均对OVA有吸附作用，EC₅₀值分别为1.2mg/mL和2.7mg/mL，表明EPS与TCPS对OVA间的吸附能力较强，提示这两种植物多糖发挥黏膜免疫佐剂作用可能与其吸附抗原有关。但未检测到SSRPS和APS与OVA间的吸附作用。

2.5天然植物多糖TLR2激活作用的评价

已有研究表明，植物多糖发挥免疫调节作用可能与其可以激活TLR2(Toll-likereceptor 2)有关。为了进一步阐明植物多糖发挥黏膜免疫佐剂作用的潜在机制，检测了其对TLR2的体外激活活性，结果显示四种植物多糖均能显著激活TLR2，并呈现剂量依赖性，见图11。其中，APS的激活作用最强。这四种植物多糖发挥黏膜免疫佐剂作用可能与其可以激活TLR2有关。

3植物多糖对幽门螺杆菌感染的免疫保护性评价

3.1天然植物多糖对UreB滴鼻免疫小鼠幽门螺杆菌定植量的影响

如图12所示，所有实验组小鼠胃内幽门螺杆菌定植量均显著低于PBS组，其中EPS、TCPS和SSRPS组小鼠胃内幽门螺杆菌定植量与UreB组相当，差异无统计学意义。APS组小鼠胃内幽门螺杆菌胃内定植量显著低于UreB组，并且对幽门螺杆菌感染的保护作用优于LTK63。

3.2天然植物多糖对UreB免疫小鼠血清中特异性IgG抗体水平的影响

为了探究天然植物多糖辅助UreB发挥保护作用的机制，检测了小鼠血清中UreB特异性IgG抗体水平。如图13所示，所有植物多糖与UreB联用所激发小鼠血清中特异性IgG抗体的水平均与UreB组相当，提示植物多糖增强UreB对幽门螺杆菌的保护作用可能不依赖于血清IgG抗体的表达。

3.3天然植物多糖对UreB免疫小鼠胃、肠局部特异性IgA抗体水平的影响

为了进一步研究植物多糖提高UreB对幽门螺杆菌感染的免疫保护性作用机制，检测了胃、肠局部特异性IgA抗体的水平。如图14所示，SSRPS、APS与UreB联用所激发的胃组织匀浆液内特异性IgA抗体效价显著高于UreB单独免疫组。联用LTK63组小鼠胃内IgA抗体水平虽然也有升高的趋势，但无显著差异。

如图15所示，TCPS、APS与UreB联用所激发的肠道灌洗液中IgA抗体水平显著高于UreB单独免疫组及LTK63组，联用EPS、SSRPS组肠道灌洗液中特异性IgA抗体水平也有升高趋势，但均无统计学差异。以上结果提示，APS辅佐UreB对幽门螺杆菌感染发挥显著性免疫保护作用可能与其诱导胃、肠局部特异性IgA有关。

3.4天然植物多糖对UreB免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清细胞因子表达的影响

为了明确细胞免疫应答在植物多糖提高UreB保护幽门螺杆菌感染发挥的作用，评价了小鼠脾淋巴细胞培养上清IFN-γ、IL-4和IL-17的表达水平，如图16-18所示。APS可以显著提高UreB免疫小鼠脾淋巴细胞培养上清IFN-γ和IL-17的表达水平，提示APS可以有效增强特异性Th1型和Th17型细胞因子的表达，已有大量研究表明，特异性的Th1型和Th17型细胞免疫应答对保护幽门螺杆菌感染发挥着至关重要的作用。EPS、SSRPS与UreB联用组小鼠脾淋巴细胞上清中IL-4的表达水平显著高于单用UreB组，但未能观察到更优的保护效果，提示Th2应答对UreB保护幽门螺杆菌感染并无明显相关性。

结论

1.在浓度低于10mg/mL的情况下，淫羊藿多糖(EPS)、金莲花多糖(TCPS)、黄精多糖(SSRPS)和黄芪多糖(APS)均具有良好的溶血耐受性，且无显著细胞毒性，表明其具备良好的体外安全性。

2.四种植物多糖联合OVA均可以诱导特异性血清IgG应答，其中TCPS诱导产生的IgG抗体效价与LTK63组相当。TCPS、SSRPS和APS均可显著提高OVA滴鼻免疫小鼠IgG2a抗体水平，提示可能增强OVA特异性Th1应答。

3.除了提高血清IgG应答以外，四种植物多糖还可以显著激发体液中特异性IgA应答。与OVA联用滴鼻免疫小鼠，EPS可刺激滴鼻免疫小鼠肠道灌洗液中特异性IgA抗体的表达，SSRPS可提高阴道灌洗液和肠道灌洗液中特异性IgA抗体的水平，TCPS可提高唾液和肠道灌洗液中特异性IgA抗体的表达，APS可显著提高以上所有体液中IgA抗体水平，表明四种植物多糖均在不同程度上具有黏膜免疫佐剂作用。

4.四种植物多糖均能显著激活TLR2，并呈现剂量依赖性，其中APS激活作用最强，提示这四种植物多糖可能通过激活TLR2来发挥黏膜免疫佐剂作用。此外，EPS与TCPS对OVA有较强的吸附作用，提示这两种植物多糖发挥黏膜免疫佐剂作用还可能与其抗原吸附能力有关。

5.UreB联用APS组小鼠胃内幽门螺杆菌定植量显著低于UreB组，且优于其它三种多糖组。虽然TCPS、SSRPS和APS与UreB联用均能激发胃、肠局部特异性IgA的应答，但APS还可有效增强特异性Th1型和Th17型细胞因子的表达，提示联用APS对幽门螺杆菌感染的保护作用机制不仅依赖于特异性胃、肠局部体液免疫应答，可能还与其诱导特异性Th1型和Th17型细胞免疫应答密切相关。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军军医大学

<120> 植物多糖在黏膜免疫佐剂中的用途

<141> 2018-08-31

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tttgttagag aagataatga cggtatctaa c 31

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cataggattt cacacctgac tgactatc 28

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cgtgccagca gccgcggt 18

Claims (6)

1.植物多糖在黏膜免疫佐剂中的用途，其中，所述植物多糖为淫羊藿多糖、金莲花多糖、黄精多糖和黄芪多糖中的至少一种。

2.植物多糖在制备用于提高体液中的IgA抗体水平和/或激活TLR2的药物中的用途，其中，所述植物多糖为淫羊藿多糖、金莲花多糖、黄精多糖和黄芪多糖中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述体液为血清、唾液、阴道灌洗液和肠道灌洗液中的至少一种。

4.一种疫苗组合物，该疫苗组合物含有抗原和免疫佐剂，其特征在于，所述抗原为幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）保护性抗原的至少一种，所述免疫佐剂为淫羊藿多糖、金莲花多糖、黄精多糖和黄芪多糖中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述抗原为尿素酶B亚单位、空泡毒素、细胞毒素相关蛋白、幽门螺杆菌粘附素A、中性粒细胞激活蛋白、过氧化氢酶和热休克蛋白中的至少一种。

6.根据权利要求4或5所述的疫苗组合物，其中，所述抗原和免疫佐剂之间的重量比为1:1-20。